EP2340316A1 - Modulateurs de sox dans le traitement de l'alopecie - Google Patents

Modulateurs de sox dans le traitement de l'alopecie

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Publication number
EP2340316A1
EP2340316A1 EP09748416A EP09748416A EP2340316A1 EP 2340316 A1 EP2340316 A1 EP 2340316A1 EP 09748416 A EP09748416 A EP 09748416A EP 09748416 A EP09748416 A EP 09748416A EP 2340316 A1 EP2340316 A1 EP 2340316A1
Authority
EP
European Patent Office
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sox
expression
gene
activity
transcription factor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09748416A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sandrine Rethore
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
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Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2340316A1 publication Critical patent/EP2340316A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of modulating compounds of a SOX transcription factor for the treatment of alopecia. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of this pathology.
  • hair growth is cyclic and comprises three successive phases: the anagen phase, the catagen phase and the telogen phase.
  • Each follicle of the hair thus renews continuously, cyclically and independently to the adjacent follicles (Kligman 1959, Montagna and Parakkal, 1974).
  • the anagen phase or growth phase during which the hair lengthens, lasts several years. This phase recapitulates hair morphogenesis and is divided into 7 different stages (anagen I to anagen VII) (Muller-Rover et al, 2001).
  • the anagen phase is generally reduced to three stages, each grouping several stages: early for stages I-III, anagen medium for stages IV to V and late anagen for stages VI and VII.
  • the catagen phase that follows the anagen phase is very short and lasts only a few weeks. This phase is divided into 8 different stages (catagene I to catagen VIII) (Muller-Rover et al, 2001) During this phase, the hair undergoes an involution, the follicle atrophies and its dermal implantation appears more and more. high.
  • the telogen phase which lasts a few months, corresponds to a rest period of the follicle where the hair eventually falls. After this resting phase a new follicle is regenerated, on the spot, and a new cycle begins again. (Montagna and Parakkal, 1974). At every moment, all the hair is not in the same phase at the same time. Thus, of the approximately 150,000 hairs in the hair, only about 10% of them are at rest and will therefore be replaced in a few months according to a specific biological clock for each hair (Montagna, 1974).
  • the hair follicles In mice and other fur mammals, the hair follicles also have a renewal cycle comprising the three phases anagen, catagen and telogen, cut into different stages.
  • the hair cycles of young animals are often "synchronized", that is, in the same phase of the cycle at the same time within the same region (Muller-Rover et al., 2001).
  • the fall or natural loss of hair is a physiological phenomenon that occurs constantly and can be estimated, on average, a few hundred hairs a day for a normal physiological state. However, it happens that the hair cycle can be disrupted and that hair loss accelerates and leads to a temporary or permanent loss of hair called alopecia. Different causes can cause alopecia.
  • alopecia There are different types of alopecia, the main forms are:
  • hereditary androgenetic alopecia which is the most common: it is manifested by a decrease in hair volume, even baldness, and affects 70% of men;
  • acute alopecia it can be related to treatment with chemotherapy, stress, important nutritional deficiencies, iron deficiency, hormonal disorders, AIDS, acute irradiation;
  • alopecia areata which appears to be of autoimmune origin (cell-mediated mechanism), which is characterized by an attack in "patch" more or less large and in one or more places.
  • This form of alopecia can reach the whole head and we talk about alopecia Totalis and sometimes the whole body is alopecia Universalis and in this case there is no hair or hair on the whole body .
  • the hair loss is directly related to the hair cycle, the follicle no longer entering the anagen phase, or the anagen phase is not maintained, which implies that the follicle no longer produces hair shaft so more hair. To fight against alopecia, it is therefore necessary to restart the hair cycle by activating the anagen phase.
  • the Applicant has now found that the SOX gene is expressed specifically in keratinocytes of the hair follicle, and that its expression was induced at the time of entry into anagen, in vivo, in a model of induction of anagen entry by Gonadectomy. It therefore proposes to target this gene or its expression product, to prevent or improve the phenomena of alopecia.
  • alopecia is meant all forms of alopecia, namely including androgenetic alopecia, acute or areata.
  • Sox genes for "Sry-related high mobility group (HMG) box" takes its name from the first isolated member, the Sry gene of sex determination linked to the Y chromosome in mammals.
  • the Sox genes are characterized by a conserved DNA sequence encoding a 79 amino acid "HMG" domain responsible for sequence-specific DNA binding.
  • the SOX proteins can be classified into eight groups, reviewed in Lefebvre et al, International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2007, 39: 2195-2214. Most have a transactivation domain or a transrepression domain, and act as transcription factors. Each gene has a particular expression profile, and distinct molecular properties.
  • the SOX transcription factor referred to herein is selected from the group consisting of Sox 4, Sox 10, Sox 13, and Sox 18.
  • the most preferred target is Sox 10.
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the evolution of alopecia in a subject, comprising comparing the expression or the activity of a SOX transcription factor, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject relative to a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by an assay of this SOX protein by an immunohistochemical or immunoassay test, for example by ELISA assay. Another method, especially for measuring the expression of the gene, is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above. An assay for the activity of the SOX transcription factor can also be envisaged.
  • the subject "control” is a "healthy” subject.
  • the "control subject” refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of treatment (To).
  • This measurement of the difference in the expression or activity of the SOX protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment. , in particular treatment with a modulator of the SOX transcription factor, as envisaged above or by another treatment against alopecia. Such follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining a susceptibility of a subject to develop alopecia, comprising comparing the expression or activity of the transcription factor (SOX), the expressing its gene or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject relative to a control subject.
  • SOX transcription factor
  • the expression of the protein can be determined by an assay of the protein
  • SOX by an immunohistochemical test or immunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene, is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay for the activity of the SOX transcription factor can also be envisaged.
  • the tested subject is here an asymptomatic subject, having no hair disorder related to alopecia.
  • the subject "control" in this method means a "healthy" reference subject or population.
  • the detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of the signs related to alopecia.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may be a preparation of skin cells, obtained for example by hair removal or biopsy.
  • Another subject of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of alopecia, comprising determining the ability of a compound to modulate the expression or the activity of alopecia.
  • a SOX transcription factor or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of alopecia.
  • the method therefore makes it possible to select compounds capable of modulating the expression or the activity of a SOX transcription factor, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of alopecia, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the SOX protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d. selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of the SOX protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or the mixture treated in b), relative to the untreated sample or mixture.
  • Modulation means any effect on the level of expression or activity of a SOX transcription factor, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, namely optionally inhibition, but preferably stimulation, partial or complete.
  • the compounds tested in step d) above preferably induce the expression or the activity of the SOX protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds. Various techniques can be implemented to test these compounds and identify compounds of therapeutic interest, modulators of the expression or activity of the SOX transcription factor.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the SOX gene promoter, and step c) described above consists in measuring the expression of said gene. reporter.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or of its activity, is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescence techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the gene coding for the SOX transcription factor, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the SOX gene endogenously, such as for example a liver cell, a prostate cell, or even better a skin cell, hair follicle keratinocytes or dermal papilla fibroblasts. . It is also possible to use organs of human or animal origin, for example hair, or hair follicles of vibrissae.
  • a heterologous nucleic acid encoding the SOX transcription factor
  • a wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or micro injection.
  • SOX gene expression can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its translation rate.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • detection markers such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin).
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a labeled complementary RNA (for example radioactive or enzymatic) of the messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium.
  • RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, such as so that only hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected for example by autoradiography or chemiluminescence.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • An anti-SOX polyclonal antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse with the aid of the whole protein. The antiserum is removed and then exhausted according to methods known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays immunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general). In general, the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of a hydrolyzate is carried out by separation of the peptides by HPLC (nano-HPLC) based on their properties physico-chemical (reverse phase).
  • HPLC high-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • the SOX transcription factor can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (e.g. E. coli or B. subtilis), yeasts (e.g. Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • bacteria e.g. E. coli or B. subtilis
  • yeasts e.g. Saccharomyces, Pichia
  • insect cells such as Sf9 or Sf21.
  • Transcription factor modulators The subject of the invention is also the use of a modulator of the SOX transcription factor for the preparation of a medicament for the preventive and / or curative treatment of alopecia.
  • a method of preventive and / or curative treatment of alopecia comprising administering a therapeutically effective amount of a SOX transcription factor modulator, to a patient in need of such treatment is described herein.
  • such modulators are activators (or inducers) of the SOX transcription factor.
  • the invention includes the use of SOX transcription factor inducing compounds, such as those identified by the screening method described above, for the preventive and / or curative treatment of alopecia.
  • the modulator compounds are formulated in pharmaceutical compositions, in association with a pharmaceutically acceptable carrier. These compositions may be administered, for example, enterally, parenterally, or topically. Preferably, the pharmaceutical composition is applied topically. Orally, the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymers for controlled release. Parenterally, the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of the skin, the mucous membranes and the scalp and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels, sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a modulator content of the SOX transcription factor ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • UV-A and UV-B filters include antioxidants, such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figure 1 illustrates the induction of passage to anagen by ovariectomy.
  • Female mice with dorsal hair follicles in telogen on Day 0 were ovariotomized or non-ovariotomized (control) on day 1 of the study.
  • a skin sample from the back region of the mice was taken on days 0 and 8 of the study.
  • Figure 1A represents a histological section of skin from the dorsal region of a mouse at day 0 of the study.
  • Figure 1B shows a histological section of skin from the dorsal region of an ovariectomized mouse at day 8 of the study.
  • Figure IC shows a histological section of skin from the dorsal region of a control mouse at day 8 of the study. Histological analysis clearly shows that ovariectomy induced passage to anagen ( Figure 1B).
  • FIG. 2 is a table which shows the modulation of the level of expression of Sox transcription factors 4, 10, 13 and 18, expressed with respect to Day 0 of the study, in the skin of the dorsal region of ovariectomized mice at day 8 of the study and in the skin of the dorsal region of mouse control (telogen phase skin) at day 8 of the study using the Affymetrix chip technology.
  • Female mice with dorsal hair follicles in telogen on Day 0 were ovariotomized on day 1 of the study.
  • Non-ovariectomized mice were kept as a control group.
  • a skin sample from the dorsal region of the mice was taken on days 0 and 8 of the study.
  • RNAs were isolated and gene expression was analyzed by Affymetrix chip technology.
  • FIG. 3 shows the expression Sox 4 in mouse skin at the beginning of anagen and late anagen by in situ hybridization.
  • FIG. 3A is the photograph of the black-field image of a section of mouse skin in early anagen subjected to in situ hybridization using a Sox 4 antisense probe, the histological structures radioactively labeled by the probe are revealed by the accumulation of bright spots
  • Figure 3B is the photograph of the same section histology of mouse skin in early anagen precoloured with hematoxylin.
  • FIG. 3C is the photograph of the black-field image of a slice of late-agar mouse skin subjected to in situ hybridization using a Sox4 antisense probe, the histological structures radiolabeled by the probe are revealed by the accumulation of luminous points (silver grains).
  • Figure 3D is the photograph of the same section histology of mouse skin in late anagen, counter-stained with hematoxylin.
  • Figure 4 is a graph showing the modulation of the level of expression of Sox transcription factors 4, 10 and 13 in the dorsal region of minoxidil-treated telogen-treated mice expressed relative to expression level in the dorsal region of telogen mouse treated with ethanol vehicle.
  • a skin sample from the dorsal region of the mice was taken hour after treatment. RNAs were isolated and gene expression was analyzed by kRT-PCR technology.
  • telogen 42 day old female C57BL / 6 mice with dorsal hair follicles in telogen (Chase, 1954) were ovariectomized or not on day 1 of the study. Oophorectomy performed during the telogen phase causes a massive entry of dandal follicles in the anagen phase within a week (Chanda, 2000.) while the hair follicles of the dorsal region of the control animals are still in telogen. Skin samples were taken in the dorsal region on days 0, 6 and 8 of the study. Part of the sample was used to confirm the passage to anagen by histological analysis. The other part of the sample was used to perform transcriptome analysis by Affymetrix chip technology.
  • RNA expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) according to the supplier's recommendations.
  • Affymetrix station microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer
  • total RNAs isolated from tissues are transcribed into cDNA.
  • biotin-labeled cRNAs are synthesized using T7 polymerase and a biotin-conjugated NTP precursor. The cRNAs are then fragmented into small fragments. All stages of Molecular biology is controlled using Agilent's "Lab on a chip" system to confirm the efficacy of enzymatic reactions.
  • the Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated cRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After several washes, the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the presence or absence of the value obtained. The calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match") versus an oligonucleotide that contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide.
  • Figure 1 At the beginning of the study at day 0, the histological analysis shows that the hair follicles of the dorsal region of the skin of the mice are in the telogen phase (IA). In ovariectomized mice, the hair follicles of the dorsal skin region are at the beginning of the anagen (IB) phase. In contrast, the hair follicles of the dorsal skin region of the control (non-ovariectomized) mice remained in the telogen phase. Thus, ovariectomy induces the transition from the telogen phase to the anagen phase. The anagen phase is proven by histological analysis at day 8 of the study.
  • the Sox4 transcription factor is not or little expressed in the telogen phase and becomes expressed in the anagen phase of the hair cycle.
  • the Sox10, Sox13 and Sox 18 transcription factors are expressed in the telogen phase and in the anagen phase of the hair cycle.
  • Differential analysis between expression at the telogenic stage at (OJ) and anagen (O8 ovariectomized) shows that the expression of the transcripts of the Sox4, Sox10, Sox13 and Sox18 genes is induced in early anagen with respect to the telogenic stage, whereas that in the control mice, the expression of these factors is not induced compared to the beginning of study.
  • EXAMPLE 2 Expression of Sox 4 in the Skin of Mice by In Situ Hybridization
  • Sense and antisense probes were prepared from the Sox4 transcription factor by incubation of the linearized gene (2 ⁇ g) with 63 ⁇ Ci of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of T7 or T3 RNA polymerase. In situ hybridization was performed on formaldehyde-fixed mouse tissue wrapped in paraffin. Sections (4 ⁇ m wide) were then deparaffinized in toluene and rehydrated in an alcohol gradient. After drying, the different sections were incubated in prehybridization buffer for two hours.
  • Hybridization was carried out overnight in hybridization buffer (prehybridization buffer with 10mM DTT and 2X10 6 cpm RNA / 35 S labeled) at 53 ° C.
  • the excess probe was removed and the sections were slanted in LM1 photographic emulsion (Amersham Biosciences, UK) and exposed in the dark at 4 ° C for at least one month.
  • the sections were then developed and counter-stained with hematoxylin and eosin. Following the incubation in the presence of a photographic emulsion, the histological structures radiolabelled by the probe are revealed (accumulation of silver grains). A specific signal is shown by positive labeling with the antisense probe ( Figure 4B and Figure 5B) and the absence of labeling with the sense probe ( Figure 3A and Figure 4A) used as a negative control.
  • Figure 3 The images (A to B) show hair follicles of mouse back skin at the beginning of anagen.
  • Figure 3A shows that the Sox4 transcription factor is expressed in the skin of mice. Transcripts are specifically present in hair follicles at the beginning of anagen. More particularly, Sox4 is present in the internal epithelial sheath of hair follicles.
  • Figure 3C shows that the Sox4 transcription factor is specifically expressed in hair follicles in anagenic media. More particularly, Sox4 is present in the inner and outer epithelial sheath of hair follicles.
  • EXAMPLE 3 Demonstration of Minoxidil Activity on SOX4 Expression
  • RNA expression was analyzed by kRT-PCR according to the supplier's recommendations (Applied Biosystem). In summary, total RNAs isolated from tissues are transcribed into cDNA. The DNAs are incubated with primers specific for the Sox 4, Sox 10 and Sox 13 genes that were obtained from Applied Biosystem. KRT-PCR takes place according to the conditions recommended by the supplier. Each point was made in duplicate and each Ct value was normalized with respect to the Ct of the 18S gene. For each time the level of expression is calculated relative to the level of expression in the control individuals.
  • Graph 1 shows that the Sox 4, Sox 10 and Sox 13 transcription factors are induced 6 h after the minoxidil treatment. From 24 h, the level of expression of the Sox 4, Sox 10 and Sox 13 transcription factors returns to the level of expression in the skin of the control individuals.
  • Example 1 shows that the Sox4, Sox18 and Sox10 genes are expressed in the skin and induced during anagen entry.
  • Example 2 emphasizes that the Sox4 gene is specifically expressed in the keratinocytes of hair follicles in anagen.
  • Example 3 indicates that treatment with minoxidil induces the expression of Sox4, Sol3 and Sox10. All of this work supports the use of modulators of the expression of Sox transcription factors in humans to obtain a stimulating the growth of hair follicles by inducing entry into the anagen phase. Also, they support the interest of the use of Sox transcription factors to diagnose or prognose this pathology.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité d'un facteur de transcription SOX, ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de ce facteur de transcription pour le traitement de l'alopécie. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de cette pathologie.

Description

Modulateurs de Sox dans le traitement de l'alopécie
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs d'un facteur de transcription SOX, pour le traitement de l'alopécie. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de cette pathologie.
Chez l'être humain, la croissance des cheveux est cyclique et comporte trois phases successives : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène. Chaque follicule de la chevelure se renouvelle donc en permanence, de façon cyclique et indépendante aux follicules adjacents (Kligman 1959, Montagna et Parakkal, 1974). La phase anagène ou phase de croissance, au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs années. Cette phase récapitule la morphogenèse du cheveux et est divisée en 7 différentes stades (anagène I à anagène VII) (Muller-Rover et col, 2001). Pour simplifier, la phase anagène est généralement réduite à trois étapes qui regroupent chacune plusieurs stades : précoce pour les étapes I-III, milieu d'anagène pour les étapes IV à V et anagène tardive pour les étapes VI et VII.
La phase catagène qui succède à la phase anagène est très courte et ne dure que quelques semaines. Cette phase est divisée en 8 différentes stades (catagène I à catagène VIII) (Muller-Rover et col, 2001) Au cours de cette phase, le cheveu subit une involution, le follicule s'atrophie et son implantation dermique apparaît de plus en plus haute. La phase télogène, qui dure quelques mois, correspond à une période de repos du follicule où le cheveu finit par tomber. Après cette phase de repos un nouveau follicule est régénéré, sur place, et un nouveau cycle recommence. (Montagna et Parakkal, 1974). A chaque instant, tous les cheveux ne sont pas dans la même phase au même moment. Ainsi, sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, seuls 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplacés en quelques mois selon une horloge biologique propre à chaque cheveu (Montagna, 1974).
Chez la souris et les autres mammifères à fourrures, les follicules pileux possèdent également un cycle de renouvellement comportant les trois phases anagène, catagène et télogène, découpées en différents stades. Par contre, les cycles pilaires des jeunes animaux sont souvent « synchronisés », c'est-à-dire dans la même phase du cycle au même moment au sein d'une même région (Muller-Rover et col., 2001). La chute ou perte naturelle des cheveux est un phénomène physiologique qui se produit en permanence et peut être estimée, en moyenne, à quelques cent cheveux par jour pour un état physiologique normal. Cependant, il arrive que le cycle pilaire puisse se dérégler et que la chute des cheveux s'accélère et conduise à une perte temporaire ou définitive des cheveux appelée alopécie. Différentes causes peuvent être à l'origine d'une alopécie.
II existe différentes types d'alopécie, les formes principales sont :
• l'alopécie androgénétique héréditaire, qui est la plus fréquente : elle se manifeste par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes ;
• l'alopécie aiguë : elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, au sida, une irradiation aiguë ;
• l'alopécie areata qui semble être d'origine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits. Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête et on parle d'alopécie Totalis et parfois l'ensemble du corps c'est l'alopécie Universalis et dans ce cas il n'y a plus aucun poil ni cheveu sur l'ensemble du corps.
Dans tous ces trois cas, la chute des cheveux est en relation directe avec le cycle pilaire, le follicule n'entrant plus dans la phase anagène, ou la phase anagène n'étant pas maintenue, ce qui implique que le follicule ne produit plus de tige pilaire donc plus de cheveux. Pour lutter contre l'alopécie, il est donc nécessaire de relancer le cycle pilaire en activant la phase anagène.
On recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique, des compositions permettant de supprimer ou de réduire l'alopécie, et notamment d'induire ou de stimuler l'entrée en phase anagène ou la croissance des cheveux.
La demanderesse a maintenant trouvé que le gène SOX était exprimé spécifiquement dans les kératinocytes du follicule pileux, et que son expression était induite au moment de l'entrée en anagène, in vivo, dans un modèle d'induction de l'entrée en anagène par gonadectomie. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'alopécie.
Par alopécie, on entend toutes les formes d'alopécie, à savoir notamment les alopécies androgénétiques, aiguë ou areata.
Les gènes Sox :
La famille des gènes Sox (pour "Sry-related high mobility group (HMG) box") tient son nom du premier membre isolé, le gène Sry de détermination du sexe lié au chromosome Y chez les mammifères. Les gènes Sox sont caractérisés par une séquence d'ADN conservée codant pour un domaine « HMG » de 79 acides aminés responsables d'une liaison à l'ADN spécifique de la séquence. Les protéines SOX peuvent être classées en huit groupes, revus dans Lefebvre et al, the International Journal of Biochemistry & CeIl biology, 2007, 39: 2195-2214. La plupart présentent un domaine de transactivation ou un domaine de transrépression, et agissent comme des facteurs de transcription. Chaque gène a un profil d'expression particulier, et des propriétés moléculaires distinctes.
Les séquences des gènes Sox et des protéines codées par ces gènes sont connues. De nombreuses références décrivent en outre leurs propriétés (voir Tableau 1). Tableau 1 : Classification des gènes Sox
Voir également la demande US2002/142415 qui décrit les séquences de Soxl8.
De manière préférentielle, le facteur de transcription SOX visé ici est choisi dans le groupe constitué de Sox 4, Sox 10, Sox 13, et Sox 18. La cible plus particulièrement préférée est Sox 10.
Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité d'un facteur de transcription SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.
L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine SOX par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du facteur de transcription SOX peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ». Dans le cadre d'un suivi de l'évolution de l'alopécie, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du facteur de transcription SOX, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'alopécie. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du facteur de transcription (SOX), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine
SOX, par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du facteur de transcription SOX peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lié à une alopécie. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'alopécie. Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par épilation de cheveux ou biopsie.
Méthodes de criblage
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité d'un facteur de transcription SOX ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité d'un facteur de transcription SOX, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par « modulation », on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité d'un facteur de transcription SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine SOX, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. Différentes techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du facteur de transcription SOX.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène SOX, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimio luminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le facteur de transcription SOX, et l'étape c) décrite ci- dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène SOX de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou encore mieux une cellule de la peau, des kératinocytes du follicule pileux ou des fïbroblastes de papille dermique. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple des cheveux, ou des follicules pileux de vibrisses.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour le facteur de transcription SOX, de préférence humaine ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou micro injection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène SOX peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (par exemple radioactif ou enzymatique) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN: ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéïnisé et repurifïé, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par exemple par autoradiographie ou chimioluminescence.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-SOX peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Le facteur de transcription SOX peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.
Modulateurs du facteur de transcription L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du facteur de transcription SOX pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du facteur de transcription SOX, à un patient nécessitant un tel traitement.
De préférence, de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) du facteur de transcription SOX.
L'invention comprend l'utilisation de composés inducteurs du facteur de transcription SOX, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur du facteur de transcription SOX allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B ; - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légende des figures:
La Figure 1 illustre l'induction du passage en anagène par ovariectomie. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude. Un prélèvement de la peau de la région du dos des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. La Figure IA représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris au jour 0 de l'étude. La Figure IB représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 8 de l'étude. La Figure IC représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris contrôle au jour 8 de l'étude. L'analyse histologique montre clairement que l'ovariectomie a induit le passage en anagène (Figure IB).
La Figure 2 est un tableau qui présente la modulation du niveau d'expression des facteurs de transcription Sox 4, 10, 13 et 18, exprimés par rapport au Jour 0 de l'étude, dans la peau de la région dorsale de souris ovariectomisées au jour 8 de l'étude et dans la peau de la région dorsale de souris contrôle (peau en phase télogène) au jour 8 de l'étude par utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie au jour 1 de l'étude. Des souris non ovariectomisées ont été conservées pour servir de groupe contrôle. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été analysée par la technologie des puces Affymetrix.
La Figure 3 montre l'expression Sox 4 dans la peau de souris en début d'anagène et anagène tardive par hybridation in situ. La Figure 3 A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène précoce soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens de Sox 4, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux
(grains argentés). La Figure 3B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène précoce contre-colorée à l'hématoxyline.
La Figure 3C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène tardive soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens de Sox4, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène tardive contre- colorée à l'hématoxyline.
La Figure 4 est un graphe qui présente la modulation du niveau d'expression des facteurs de transcription Sox 4, 10 et 13 dans de la région dorsale de souris en télogène traitées par minoxidil exprimés par rapport niveau d'expression dans de la région dorsale de souris en télogène traitées par le véhicule éthanol. Des souris mâles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène, ont été traitées par de l' éthanol absolu ou minoxisil à 2.5% dans de l'éthanol absolu. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectuée heure après le traitement. Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été analysée par la technologie de kRT-PCR.
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de SOX au cours de l'entrée en anagène induite par l'ovariectomie par la technologie des puces Affymetrix.
Méthodes :
Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène (Chase, 1954) ont été ovariectomisées ou non au jour 1 de l'étude. L'ovariectomie pratiquée pendant la phase télogène provoque sous une semaine une entrée massive des follicules pileux de la région dorsale en phase anagène (Chanda, 2000.) alors que les follicules pileux de la région dorsale des animaux contrôles sont toujours en télogène. Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale aux jours 0, 6 et 8 de l'étude. Une partie du prélèvement a été utilisé pour confirmer le passage en anagène par analyse histologique. L'autre partie du prélèvement a été utilisé pour réaliser une analyse du transcriptome par la technologie des puces Affymetrix. L'expression des gènes a été analysée sur une station Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les recommandations du fournisseur. En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc. A partir d'ADNc double brin, les ARNc marqués à la biotine sont synthétisés en utilisant la polymérase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip » d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après différents lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la présence ou l'absence de la valeur obtenue. Le calcul de la signifîcativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation, (« single mismatch ») dans la région centrale de l' oligonucléotide.
Résultats: Figure 1 : En début d'étude au jour 0, l'analyse histologique montre que les follicules pileux de la région dorsale de la peau des souris sont en phase télogène (IA). Chez les souris soumises à une ovariectomie, les follicules pileux de la région dorsale de peau sont en début de phase anagène (IB). A l'inverse, les follicules pileux de la région dorsale de peau des souris contrôles (non ovariectomisées) sont restés en phase télogène. Ainsi, l'ovariectomie à induit la transition de la phase télogène à la phase anagène. La phase anagène est avérée par l'analyse histologique au jour 8 de l'étude.
Figure 2 :
Le facteur de transcription Sox4 n'est pas ou peu exprimé en phase télogène et devient exprimé en phase anagène du cycle pilaire. Les facteurs de transcription SoxlO, Soxl3 et Sox 18 sont exprimés en phase télogène et en phase anagène du cycle pilaire. L'analyse différentielle entre l'expression au stade télogène à (JO) et anagène (J8 ovariectomisé) montre que l'expression des transcrits des gènes Sox4, SoxlO, Soxl3 et Sox 18 est induite en anagène précoce par rapport au stade télogène, alors que chez les souris contrôles, l'expression de ces facteurs n'est pas induite par rapport au début d'étude. Exemple 2 : Expression de Sox 4 dans la peau de souris par « hybridation in situ »
Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du facteur de transcription Sox4 par incubation du gène linéarisé (2μg) avec 63 μCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4μm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 1OmM DTT et 2X106 cpm ARN/μl 35S marqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion photographique LMl (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre-colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 4B et Figure 5B) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A et Figure 4A) utilisé comme contrôle négatif.
Résultats: Figure 3 Les images (A à B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en début d'anagène. Les images (C à D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en milieux d'anagène. La Figure 3A montre que le facteur de transcription Sox4 est exprimé dans la peau de souris. Les transcrits sont spécifiquement présent au niveau des follicules pileux en début d'anagène. Plus particulièrement, Sox4 est présent dans la gaine épithéliale interne des follicules pileux. La Figure 3C montre que le facteur de transcription Sox4 est exprimé de façon spécifique dans les follicules pileux en milieux d'anagène. Plus particulièrement, Sox4 est présent dans la gaine épithéliale interne et externe des follicules pileux. Exemple 3 : Mise en évidence de l'activité de minoxidil sur l'expression de SOX4,,
10 et 13 dans la peau de souris par la technologie des kRT-PCR (Applied
Biosvstem).
Méthodes : Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène ont été traitées avec 50 μl d'éthanol minoxidil 2.5%. Le traitement par minoxidil 2.5% pendant la phase télogène provoque une entrée rapide des follicules pileux de la région dorsale en phase anagène par rapport aux animaux contrôles. Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale aux temps 6 h, 24 h et 48 h de l'étude.
L'expression des gènes a été analysée par kRT-PCR en suivant les recommandations du fournisseur (Applied Biosystem). En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc. Les ANDc sont incubés avec des primers spécifiques pour les gènes de Sox 4, Sox 10 et Sox 13 qui ont été obtenus auprès d' Applied Biosystem. La kRT-PCR se déroule selon les conditions recommandées par le fournisseur. Chaque point a été fait en duplicate et chaque valeur de Ct a été normalisée par rapport au Ct du gène 18S. Pour chaque temps le niveau d'expression est calculé par rapport au niveau d'expression chez les individus contrôles.
Résultats: Figure 4
Le graphe 1 montre que les facteurs de transcription Sox 4, Sox 10 et Sox 13 sont induit 6 h après le traitement minoxidil. A partir de 24 h, le niveau d'expression des facteurs de transcription Sox 4, Sox 10 et Sox 13 reviens au niveau d'expression dans la peau des individus contrôles.
Conclusion: L'exemple 1 montre, que les gènes Sox4, Soxl8 et SoxlO sont exprimés dans la peau et induits au cours de l'entrées en anagène. L'exemple 2 souligne que le gène Sox4 est exprimé de façon spécifique dans les ans les kératinocytes des follicules pileux en anagène. L'exemple 3 indique que le traitement par minoxidil induit l'expression des Sox4, Sol3 et SoxlO. L'ensemble de ces travaux permet de soutenir l'utilisation de modulateurs de l'expression des facteurs de transcription Sox chez l'Homme pour obtenir une stimulation de la croissance des follicules pileux en induisant l'entrée en phase anagène. Egalement, ils soutiennent l'intérêt de l'utilisation des facteurs de transcription Sox pour diagnostiquer ou prognostiquer cette pathologie.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité d'un facteur de transcription SOX ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité d'une protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité d'une protéine SOX, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) activent l'expression ou l'activité d'une protéine SOX, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour un facteur de transcription SOX, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour un facteur de transcription SOX, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont choisies parmi les kératinocytes et les fîbroblastes de la papille dermique ou du derme.
7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétéro logue codant pour un facteur de transcription SOX.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle le facteur de transcription est choisi dans le groupe constitué de Sox 4, Sox 10, Sox 13 et Sox
18.
11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle le facteur de transcription est Sox 10.
12. Utilisation d'un modulateur d'un facteur de transcription SOX pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que le modulateur est un activateur d'un facteur de transcription SOX.
14. Utilisation cosmétique d'un modulateur d'un facteur de transcription SOX pour le traitement esthétique du cuir chevelu.
15. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 14, dans laquelle le facteur de transcription est choisi dans le groupe constitué de Sox 4, Sox 10, Sox 13 et Sox 18.
16. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 15, dans laquelle le facteur de transcription est Sox 10.
17. Méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité d'une protéine SOX, ou de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
18. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle l'expression de la protéine est déterminée par un dosage de cette protéine par un immunoessai.
19. Méthode selon la revendication 18, dans laquelle l'immunoessai est un dosage ELISA.
20. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle l'expression du gène est déterminée par mesure de la quantité d' ARNm correspondant.
21. Méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité d'une protéine SOX, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
22. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le facteur de transcription est choisi dans le groupe constitué de Sox 4, Sox 10, Sox 13 et Sox
18.
23. Méthode selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le facteur de transcription est Sox 10.
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