WO2008009854A2 - Modulateurs du transporteur abcd3 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée - Google Patents

Modulateurs du transporteur abcd3 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée Download PDF

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Fernand Labrie
Mohamed El-Alfy
Ezéquiel L. CALVO
Isabelle Carlavan
Pascal Collette
Sophie Deret
Michel Rivier
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Galderma Research & Development
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    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of modulator compounds of the ABCD 3 transporter (ie the membrane transporter 1 of the peroxisome containing a ATP binding site of type 3 of the subfamily D), for the treatment acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
  • Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum.
  • a level of sebum greater than 200 ⁇ g / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin.
  • Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture.
  • the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions. This stimulation of sebaceous gland production is induced by androgens.
  • Acne is, in fact, a chronic disease of the pilosebaceous follicle under hormonal dependence.
  • a hormonal therapy against acne is a possibility of treatment for women, the goal being to oppose the effects of androgens on the sebaceous gland.
  • estrogens, anti-androgens, or agents that decrease the production of androgens by the ovaries or the adrenal gland are generally used.
  • Antiandrogens used for the treatment of acne include spironolactone, cyproterone acetate, and flutamide. However, these agents have potentially severe side effects. Thus, any pregnancy must be absolutely prevented, particularly because of a risk of feminization for the male fetus. These agents are prohibited in male patients.
  • the Applicant has now discovered that the gene coding for the membrane transporter 1 of peroxisome (ABCD3) was expressed in the human sebaceous glands, and that its expression was regulated by androgens, in vivo, in a mouse preputial gland model. It therefore proposes to target the ABCD3 gene or its expression product for preventing and / or improving acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, especially the appearance of oily skin.
  • acne we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
  • the Applicant also proposes in vitro diagnostic methods or in vitro prognosis, based on the detection of the level of expression or activity of the peroxisome membrane transporter 1 containing a ATP binding site of type 3 of the sub- family D.
  • the ABCD3 transporter refers to the protein having a ATP type 3 binding site of the D family, or also called peroxisome membrane protein 1 (70KD).
  • the ABCD3 transporter is a transporter for transmembrane translocation of a wide variety of substrates, such as antitumour drugs and certain types of lipids (Higgins, C.F. (1992) Annu rev CeII Bio, 67-113). It is composed of two identical parts, each containing a domain with 6 transmembrane segments and an ATP binding domain.
  • the protein ABCD3 is known to transport the substrates of ⁇ -oxidation in the peroxisome.
  • ABCD3 gene or "ABCD3 nucleic acid” means the gene or the nucleic acid sequence that encodes the ABCD3 transporter. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention can also use cells expressing a heterologous ABCD3 transporter, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid encoding the enzyme. .
  • a human cDNA sequence of ABCD3 is reproduced in the appendix (SEQ ID No.1). This is the NM002858 sequence whose coding portion is from nucleic acid 25 to 2004. Diagnostic applications
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or activity of the subject.
  • the expression of the ABCD3 protein can be determined by assaying this protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, in particular for measuring the expression of the ABCD3 gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • an assay of the activity of ABCD3 can also be envisaged.
  • the subject "control” is a "healthy” subject.
  • the “control subject” refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ).
  • This measurement of the difference in the level of expression or activity of ABCD3 or of expression of its gene or activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment, in particular a treatment with a modulator of ABCD3, as envisaged above or by another treatment against acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing the expression or activity of the transporter. 1 membrane of the peroxisome containing a binding site ATP type 3 of the subfamily D (ABCD3), the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a sample of a subject in relation to a biological sample of a control subject.
  • ABCD3 binding site ATP type 3 of the subfamily D
  • the expression of the ABCD3 protein can be determined by assaying this protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, in particular for measuring the expression of the ABCD3 gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of the activity of ABCD3 can also be envisaged.
  • the subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne.
  • the subject "control" in this method means a "healthy" reference subject or population. The detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may nevertheless be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum.
  • An object of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising determining the ability of a compound to modulating the expression or the activity of the transporter ABCD3, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters, said modulation of the expression or activity of the transporter ABCD3 indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • the method therefore makes it possible to select compounds capable of modulating the expression or the activity of the transporter ABCD3, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or activity of the transporter ABCD3, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, d.
  • modulation is meant any effect on the expression or the activity of the protein, on the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, that is to say, a stimulation, but preferably partial or complete inhibition.
  • the compounds tested in step d) above preferably inhibit the expression or the activity of the ABCD3 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • the difference in the level of expression obtained with the test compound compared to a control carried out in the absence of the compound is significant from 25% or more.
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the ABCD3 gene, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene. reporter.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or its activity is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescence techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the ABCD3 gene coding for the ABCD3 transporter, and the step c) consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the ABCD3 gene endogenously, such as for example a liver cell, an ovarian cell, or even better a sebocyte. It is also possible to use organs of human or animal origin, such as, for example, the preputial gland, clitoral gland or the sebaceous gland of the skin.
  • It may also be a cell transformed with a heterologous nucleic acid, encoding a carrier ABCD3, preferably human, or mammalian.
  • a heterologous nucleic acid encoding a carrier ABCD3, preferably human, or mammalian.
  • a wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • the expression of the ABCD3 gene can be determined by evaluating the transcription rate of said gene, or its rate of translation.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • detection markers such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin).
  • the level of expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) tissue where the sequence is to be investigated is incubated with this probe under conditions of slow hybridization in a liquid medium.
  • RNA RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-transporter ABCD3 antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire protein. The antiserum is removed and then exhausted according to methods known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays radioimmunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible by the analysis (determination of mass) of peptides generated by hydrolysis enzymatic proteins (trypsin in general). In general, the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of a hydrolyzate is carried out by separation of the peptides by HPLC (nano-HPLC) based on their physico-chemical properties (reverse phase).
  • HPLC nano-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • step a) described above consists in preparing reaction mixtures each comprising an ABCD3 transporter protein and a substrate of the protein, and step c) above consists in measuring the activity transport.
  • Assays of ABCD3 transport activity are described in the literature (J. Biol. Chem., 1999; 274 (17): 11968-1 1976).
  • the ABCD3 protein can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • bacteria for example E. coli or B. subtilis
  • yeasts for example Saccharomyces, Pichia
  • insect cells such as Sf9 or Sf21.
  • the transporter's activity is evaluated by measuring in peroxisomes the ⁇ -oxidation of fatty acids, directly dependent on the transport in peroxisomes by ABCD3. From a CHO line, stably transfecting ABCD3, the peroxisomes are separated by depositing a cell fraction on a sucrose gradient (1.1 to 1.2 g / ml) of 10 ml. After centrifugation for 90 minutes at 50000 g, 1 ml fractions are harvested and the density of each fraction is measured by refractometry.
  • the peroxisomes thus isolated are incubated in 100 ⁇ l in the presence of 10 ⁇ M [1- 14 C] palmityl-CoA, 2 mM MgCl 2, 0.5 mM CoenzymeA, 2 mM NAD +, 2 mM KCN, 2 mM dithiotreitol, 0.1% BSA, 0.25 mM sucrose 10 mM Tris HCI pH 7.4.
  • the reaction is carried out with or without 2 mM ATP, the reaction without ATP being the negative control of the reaction.
  • the subject of the invention is also the use of a modulator of the human transporter ABCD3 that can be obtained according to one of the above methods, for the preparation of a medicament intended for the preventive and / or curative treatment of cancer. acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • a method of preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with a hyperseborrhoea comprises the administration of a therapeutically effective amount of a modulator of the human transporter ABCD3, to a patient in need of such treatment.
  • the invention finally relates to the cosmetic use of a modulator of the human carrier protein ABCD3, for the aesthetic treatment of oily skin.
  • the modulator is an inhibitor of the transporter protein ABCD3.
  • the term “inhibitor” refers to a compound or chemical substance that substantially eliminates or reduces the activity of the ABCD3 transporter.
  • substantially means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%.
  • a preferred inhibitor interacts with the protein in solution at inhibitor concentrations of less than 1 ⁇ M, preferably less than 0.1 ⁇ M, more preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the modulator compound may be an anti-transporter inhibitory antibody ABCD3, preferably a monoclonal antibody.
  • an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 ⁇ g per ml to about 100 ⁇ g / ml, preferably from about 1 ⁇ g per ml to about 5 ⁇ g / ml.
  • the modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
  • PNA Peptide nucleic acid
  • the modulating compounds are formulated within a pharmaceutical composition, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • These compositions may be administered, for example, orally, enterally, parenterally, or topically.
  • the pharmaceutical composition is applied topically.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles allowing controlled release.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a modulator content of the carrier protein ABCD3 ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • UV-A and UV-B filters and antioxidants, such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figures 1A, 1B and 1C show the expression of the ABCD3 transporter in the sebaceous gland of mouse skin and in the mouse preputial gland by in situ hybridization.
  • Figure 1A is a photograph in conventional illumination and dark field illumination of a mouse skin section subjected to in situ hybridization using the sense probe of ABCD3 (negative control, animal 43, gonadectomized).
  • Figure 1B is a photograph in conventional illumination and dark field illumination of a mouse skin section subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 43).
  • Figure 1C is a photograph in conventional illumination and darkfield illumination of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in a gonadectomized animal (animal 52).
  • Figures 2A, 2B and 2C show the expression of ABCD3 in the mouse preputial gland by in situ hybridization.
  • Figure 2A is a photograph in conventional illumination and dark field illumination of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with a sense probe of ABCD3 (negative control, animal 43).
  • Figure 2B is a photograph in conventional illumination and darkfield illumination of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 43).
  • Figure 2C is a photograph in conventional illumination and darkfield illumination of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in a gonadectomized animal (animal 52).
  • Figure 3 is a graph showing the measurement of ABCD3 gene expression in gonadectomized male mice.
  • Male mice were gonadectomized and treated with the vehicle, DHT, DHEA or the combination of DHEA-Flutamide for a period of 7 days once daily (long-term treatment).
  • the preputial glands were removed, RNA was isolated and gene expression was analyzed by the Affymetrix technique.
  • DHT gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist)
  • DHEA gonadectomized mice treated with Dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in the preputial glands it is metabolized to active androgen)
  • DHEA-FIu gonadectomized mice treated with a combination of Dihydroepiandrosterone and Flutamide (Androgen receptor antagonists, which block the effects of DHT and DHEA agonists).
  • Level of expression level of expression of mRNA
  • Example 1 Expression of the ABCD3 transporter in the human sebaceous gland and in the human epidermis.
  • RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis. Gene expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company. In short, the total RNA isolated from the tissues is transcribed into cDNA. From the double-stranded cDNA, biotin-labeled cRNA is synthesized using T7 polymerase and a precursor NTP conjugated to biotin. The cRNAs are then fragmented into small fragments.
  • Affymetrix station microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer
  • the Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated cRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After washes, the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the significance of the value obtained.
  • the calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match”) versus an oligonucleotide that contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide (see Table 1).
  • Table 1 Measurement of ABCD3 expression in the epidermis and in the human sebaceous gland via the use of the affymetrix flea technology.
  • the ABCD3 transporter is well expressed in both tissues (sebaceous gland, epidermis).
  • the differential analysis between the expression in the human sebaceous gland and the human epidermis shows that the expression is significantly higher in the sebaceous gland compared to the value observed in the epidermis (Table 1).
  • Human sebaceous glands were separated from the human epidermis by dispase treatment and microdissection under a binocular microscope. Protein extracts have been prepared from the sebaceous glands and from the epidermis.
  • the isolated tissues are then milled in the presence of CaCl 2 (2M) and then centrifuged at 4 ° C for 1 min at 13,000 rpm followed by ultracentrifugation at 100,000 rpm for 10 min.
  • the pellet which contains the nuclear fraction and the cytoskeleton is recovered.
  • the peptide belonging to the ATP-binding cassette protein, sub-family D, member 3 (ABCD3) (70 kDa peroxisomal membrane protein) (PMP70) was found in the human sebaceous gland. This study confirms the presence of this protein in the sebaceous gland as suggested by monitoring its expression (mRNA level).
  • EYLDNVQLGHILER Total score Mascot: 26, total score SpetrumMill: 14.16 the score being in the area of significance
  • Sense and antisense probes were prepared from the ABCD3 gene by incubation of the linearized gene (2 ⁇ g) with 63 ⁇ Ci of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of T7 RNA polymerase or T3.
  • In situ hybridization was performed on formaldehyde-fixed mouse tissue wrapped in paraffin. Sections (4 .mu.m wide) were then deparaffinized in toluene and rehydrated with an alcohol gradient. After drying, the different sections were incubated in prehybridization buffer for two hours.
  • Hybridization took place over night in hybridization buffer (prehybridization buffer with DTT and 1 Omm 2X10 6 cpm RNA / .mu.l Smarqué 35) at 53 ° C.
  • the excess probe was removed and the sections were slanted in an LM1 emulsion (Amersham Biosciences, UK) and exposed in the dark at 4 ° C for at least one month.
  • the sections were then grown and counter stained with hematoxylin and eosin. Hybridization with the sense probe was used as a negative control and only background was detected. These probes were incubated with histological sections of mouse skin or mouse preputial gland.
  • Abcd3 is expressed in the sebaceous glands of mouse skin.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland.
  • Figure 2A shows no marking at the level of the preputial gland which is in agreement with the expectations of the researchers because it corresponds to the negative control.
  • Figure 2B shows a very strong labeling of the mouse preputial gland in a normal animal.
  • Figure 2C shows strong labeling of acini of the preputial gland in a gonadectomized animal. ABCD3 is strongly expressed in the mouse preputial gland.
  • An analysis of several histological sections from 4 control animals and 4 gonadectomized animals indicates a very strong expression in the preputial glands of intact animals and a strong expression in the preputial glands of gonadectomized animals.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland. They are of sufficient size to allow isolation of RNA without the use of microdissection technologies.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D (ABCD3), ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de ce transporteur pour le traitement de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de ces pathologies.

Description

Modulateurs du transporteur ABCD3 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs du transporteur ABCD 3 (à savoir le transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D), pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200μg/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnés en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le fœtus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits.
La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour le transporteur 1 membranaire du péroxisome (ABCD3) était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler le gène ABCD3 ou son produit d'expression pour prévenir et/ou améliorer l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle.
La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous- famille D.
ABCD3
Le transporteur ABCD3 désigne la protéine possédant un site de liaison à l'ATP de type 3 de la famille D, ou encore appelée la protéine 1 membranaire du peroxysome (7OkD). Le transporteur ABCD3 est un transporteur permettant une translocation transmembranaire d'une grande variété de substrats, comme des drogues antitumorales et certains types de lipides (Higgins, C. F. (1992) Annu rev CeII Bio. 8 67-113). Il est composé de deux parties identiques, chacune contenant un domaine avec 6 segments transmembranaires et un domaine de liaison à l'ATP. La protéine ABCD3 est connue pour transporter les substrats de la β-oxydation dans le péroxisome. Une déficience dans le gène ABCD3 chez les souris est responsable d'un défaut dans le métabolisme énergétique et la dégradation des acides gras (Tanaka AR, ATP binding/hydrolysis by and phosphorylation of peroxisomal ATP-binding cassette proteins PMP70 (ABCD3) and adrenoleukodystrophy protein (ABCD1 ). J Biol Chem. 2002 Oct 18;277(42):40142-7. Epub 2002 Aug 9.) Dans le contexte de l'invention, le terme « gène ABCD3 » ou « acide nucléique ABCD3 » signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour le transporteur ABCD3. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant un transporteur ABCD3 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme.
Une séquence d'ADNc humain de ABCD3 est reproduite en annexe (SEQ ID No.1 ). Il s'agit de la séquence NM002858 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 25 à 2004. Applications diagnostiques
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous- famille D, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. L'expression de la protéine ABCD3 peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène ABCD3, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du ABCD3 peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ». Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié à une hyperséborrhée, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence du niveau d'expression ou d'activité du ABCD3 ou d'expression de son gène ou d'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du ABCD3, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D (ABCD3), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine ABCD3 peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène ABCD3, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du ABCD3 peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum.
Méthodes de criblage
Un objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du transporteur ABCD3, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation de l'expression ou de l'activité du transporteur ABCD3 indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité du transporteur ABCD3, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité du transporteur ABCD3, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité du transporteur ABCD3 ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par « modulation », on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de la protéine, sur l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine ABCD3, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence du niveau d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.
Différentes techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du transporteur ABCD3.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène ABCD3, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène ABCD3 codant pour le transporteur ABCD3, et l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène ABCD3 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour un transporteur ABCD3, de préférence humain, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293
L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène ABCD3 peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, le niveau d'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens.
Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-transporteur ABCD3 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico- chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une protéine transporteur ABCD3 et un substrat de la protéine, et l'étape c) ci-dessus consiste à mesurer l'activité de transport. Des dosages de l'activité de transport de ABCD3 sont décrits dans la littérature (J.Biol.Chem. 1999 ;274 (17) :11968-1 1976).
La protéine ABCD3 peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. Ainsi l'activité du transporteur ABCD3 peut être évaluée de la manière suivante :
L'activité du transporteur est évaluée en mesurant dans les peroxisomes la β-oxydation des acides gras, directement dépendante du transport dans les peroxisomes par ABCD3. A partir d'une lignée CHO, transfectant de façon stable ABCD3, les peroxisomes sont séparés en déposant une fraction cellulaire sur un gradient de sucrose (1.1 à 1.2 g/ml) de 10ml. Après centrifugation 90 minutes à 50000g, des fractions de 1 ml sont récoltées et la densité de chaque fraction est mesurée par refractométrie.
Les peroxisomes ainsi isolés sont incubés dans 100 μl en présence de 10 μM [1- 14C]palmityl-CoA, 2 mM MgCI2, 0.5 mM CoenzymeA, 2mM NAD+, 2 mM KCN, 2 mM dithiotreitol, 0.1 % BSA, 0.25 mM sucrose, 10 mM Tris HCI pH 7.4. La réaction est réalisée avec ou sans ATP 2 mM, la réaction sans ATP étant le témoin négatif de la réaction. Après incubation 10 minutes à 37°C, la réaction est arrêtée par addition de 70 μL D1H2O glacée, 0.15 ml de BSA 10 % et 0.2 ml d'acide perchlorique 2M. Après incubation 30 minutes sur la glace le mélange est centrifugé et le surnageant est extrait 3 fois avec 3 ml d'hexane pour enlever les acides gras n'ayant pas réagit. La radioactivité acide soluble est ensuite mesurée en scintillation liquide. Modulateurs du transporteur
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du transporteur humain ABCD3 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du transporteur humain ABCD3, à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de la protéine humaine transporteur ABCD3, pour le traitement esthétique des peaux grasses. De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de la protéine transporteur ABCD3. Le terme « inhibiteur » se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité du transporteur ABCD3. Le terme « substantiellement » signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%.
Un inhibiteur préféré interagit avec la protéine en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1μM, de préférence moins de 0,1 μM, de préférence encore moins de 0,01 μM.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-transporteur ABCD3, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 μg par ml à environ 100μg/ml, de préférence d'environ 1μg par ml à environ 5μg/ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la protéine transporteur ABCD3 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légendes des Figures
Les Figures 1A, 1 B et 1C montrent l'expression du transporteur ABCD3 dans la glande sébacée de la peau de souris et dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 1A est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ utilisant la sonde sens de ABCD3 (contrôle négatif; animal 43, gonadectomisé). La Figure 1 B est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 43). La Figure 1C est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 52).
Les Figures 2A, 2B et 2C montrent l'expression de ABCD3 dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 2A est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde sens de ABCD3 (contrôle négatif; animal 43). La Figure 2B est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 43). La Figure 2C est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 52).
La Figure 3 est un graphe qui montre la mesure de l'expression du gène ABCD3 chez des souris mâles gonadectomisées. Des souris mâles ont été gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, la DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). A la fin de l'expérience les glandes préputiales ont été enlevées, l'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix.
GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule
DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes)
DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales il est métabolisé en androgène actif) DHEA-FIu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagonistes du récepteur aux Androgènes; qui bloquent les effets des agonistes DHT et DHEA). Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression du transporteur ABCD3 dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme. L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidic; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip» d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation (« single mismatch ») dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1 ).
Tableau 1 : mesure de l'expression de ABCD3 dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine via l'utilisation de la technologie des puces affymetrix.
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Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1 ) ou absence (=0).
Résultats: Le transporteur ABCD3 est bien exprimé dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression est significativement plus forte dans la glande sébacée par rapport à la valeur observée dans l'épiderme (tableau 1 ).
Exemple 2 : Mise en évidence de la protéine ABCD3 dans la glande sébacée humaine par spectrométrie de masse
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et microdissection sous une loupe binoculaire. Des extraits protéiques ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.
Ces extraits protéiques ont été soumis à l'hydrolyse enzymatique par la trypsine de porc afin de générer des peptides qui ont été séparées par nanobore HPLC puis analysé par spectrométrie de masse electrospray tamdem MS (Q star XL Applied Biosystem). La recherche et l'identification des peptides puis des protéines sont réalisées à partir de la fraction subcellulaire « enrichie en membrane plasmique », et sont faites grâce à l'utilisation de moteur de recherche comme Mascot et SpectrumMill à partir de banque de données protéiques publiques (SwissProt version 08/02/2005). La fraction subcellulaire est obtenue selon le procédé suivant. Les glandes sébacées disséquées ou l'épiderme sont rincés avec du mannitol, et de l'Hépes. Les tissus isolés sont ensuite broyés en présence de CaC^ (2M) puis subissent une centrifugation à 4°C pendant 1 min à 13 000 rpm puis une ultracentrifugation à 100 000 rpm pendant 10 min. On récupère le culot qui contient la fraction nucléaire et le cytosquelette. Le peptide appartenant à la protéine ATP-binding cassette, sub-family D, member 3 (ABCD3) (70 kDa peroxisomal membrane protein) (PMP70) a été retrouvée dans la glande sébacée humaine. Cette étude confirme la présence de cette protéine dans la glande sébacée comme cela est suggéré par le suivi de son expression (taux d'ARNm).
- Code d'accession Uniprot: P28288, ABCD3_HUMAN
- peptide trouvé: EYLDNVQLGHILER (Total score Mascot : 26 ; total score SpetrumMill : 14.16 les score se situant dans la zone de significativité)
- masse moléculaire de la protéine : 75941
- point isoéléctrique : 9.41
Exemple 3 : Expression d'ABCD3 dans la glande sébacée de la peau de souris par « hybridation in situ »
Méthodes :
Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du gène ABCD3 par incubation du gène linéarisé (2μg) avec 63μCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4μm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées par un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 1 OmM DTT et 2X106 cpm ARN/μl 35Smarqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pour au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. L'hybridation avec la sonde sens a été utilisée comme témoin négatif et on a uniquement détecté le bruit de fond. Ces sondes ont été incubées avec des coupes histologiques de la peau de souris ou de la glande préputiale de souris. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisens (Figure 1 B et Figure 1 C) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 1A) utilisé comme contrôle négatif.
Résultat : Abcd3 est exprimé dans les glandes sébacées de la peau de souris. Une analyse fine basée sur l'observation de coupes histologiques obtenues pour 4 animaux intacts et 4 animaux gonadéctomisés n'a pas permis de distinguer une expression différentielle entre les animaux intacts et gonadéctomisés.
Exemple 4 : Expression de ABCD3 dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ
Méthodes :
Les méthodes utilisées dans cet exemple sont identiques à celles de l'exemple 3.
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée.
Résultats : La Figure 2A ne montre pas de marquage au niveau de la glande préputiale ce qui est en accord avec les attentes des chercheurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 2B montre un très fort marquage de la glande préputiale de souris dans un animal normal. La Figure 2C montre un marquage fort des acini de la glande préputiale dans un animal gonadéctomisé. ABCD3 est fortement exprimée dans la glande préputiale de souris. Une analyse de plusieurs coupes histologiques provenant de 4 animaux contrôles et 4 animaux gonadéctomisés indique une expression très forte dans les glandes préputiales des animaux intacts et une expression forte dans les glandes préputiales des animaux gonadéctomisés.
En résumé, ces résultats d'hybridation in situ indiquent que l'expression du transporteur Abcd3 diminue dans des conditions caractérisées par un manque de stimulation androgénique (animaux gonadéctomisés).
Exemple 5 : Expression d'ABCD3 dans la glande préputiale de souris suite à une stimulation androqéniαue
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.

Claims

Les inventeurs ont analysé l'expression du transporteur ABCD3 dans les glandes préputiales de souris dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes (notamment d'hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA-Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux Androgènes, bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques.L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci-dessus (Figure 3).Résultat :L'ARNm du transporteur ABCD3 est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale de souris. REVENDICATIONS
1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D (ABCD3), ou l'expression de son gène, ou l'activité d'un ou plusieurs de ses promoteurs.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous- famille D, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un promoteur, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité du transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un promoteur.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour le transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes.
7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue, codant pour le transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une protéine transporteur 1 membranaire du péroxisome contenant un site de liaison à l'ATP du type 3 de la sous-famille D et un substrat de cette protéine, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité de transport.
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