EP2046975A2 - Modulateurs de hsd17b7 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée - Google Patents

Modulateurs de hsd17b7 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée

Info

Publication number
EP2046975A2
EP2046975A2 EP07823602A EP07823602A EP2046975A2 EP 2046975 A2 EP2046975 A2 EP 2046975A2 EP 07823602 A EP07823602 A EP 07823602A EP 07823602 A EP07823602 A EP 07823602A EP 2046975 A2 EP2046975 A2 EP 2046975A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
expression
gene
activity
beta
hydroxysteroid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07823602A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fernand Labrie
Ezéquiel L. CALVO
Michel Rivier
Van Luu-The
Jérôme AUBERT
Johannes Voegel
Sophie Deret
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2046975A2 publication Critical patent/EP2046975A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7 (HSD17b7) modulator compounds for the treatment of acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
  • HSD17b7 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7
  • Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum.
  • a level of sebum greater than 200 ⁇ g / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin.
  • Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture.
  • the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions. This stimulation of sebaceous gland production is induced by androgens.
  • Acne is, in fact, a chronic disease of the pilosebaceous follicle under hormonal dependence.
  • a hormonal therapy against acne is a possibility of treatment for women, the goal being to oppose the effects of androgens on the sebaceous gland.
  • estrogens, anti-androgens, or agents that decrease the production of androgens by the ovaries or the adrenal gland are generally used.
  • Antiandrogens used for the treatment of acne include spironolactone, cyproterone acetate, and flutamide. However, these agents have severe side effects. Thus, any pregnancy must be absolutely prevented, particularly because of a risk of feminization for the male fetus. These agents are prohibited in male patients.
  • the Applicant has now discovered that the HSD17b7 gene is expressed in the human sebaceous glands, and that its expression is regulated by androgens, in vivo, in a mouse preputial gland model. It therefore proposes to target this gene, or its expression product, the hydroxysteroid enzyme (17-beta) dehydrogenase 7, to prevent or improve acne phenomena, as well as skin disorders associated with a hyperseborrhoea, especially the oily skin appearance.
  • acne we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
  • the Applicant also proposes in vitro diagnostic methods or prognostic in vitro, based on the detection of the expression or activity of the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase type 7.
  • the protein HSD17b7 which refers to the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase type 7, belongs to the family of hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenases, which catalyze the last reaction of the biosynthesis of several estrogens and androgens, such as estradiol, 5 ⁇ -androstane-3 ⁇ , 17 ⁇ -diol, testosterone, and dihydrotestosterone. Twelve isoforms are known to have specific reducing or oxidizing activities (Poirier, Current Medicinal Chemistry, 2003, 10: 453-477, Thiboutot et al, J. Invest Dermatol, 1998, 11: 390-395).
  • HSD17b As an androgenic stimulation is responsible for an increase in sebum production, which can induce acne lesions, the inhibition of 17beta- hydroxysteroid dehydrogenases, key enzymes in androgen metabolism, has been indicated as a treatment potential of acne. In these cases, a non-specific inhibition of one or more hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenases is sought.
  • Members of the HSD17b family have less than 30% primary structure homology to each other. The different types of HSD17b differ in their substrate and cofactor specificities (Labrie et al (2000) Trends Endocrinol Metab., 1: 421-7). In addition, certain types of HSD 17b are involved in the pathogenicity of certain human disorders.
  • HSD17b-3 is known to be involved in the development of pseudohermaphroditism
  • HSD17b-8 plays a role in multiple cystic kidney disease
  • HSD17b-4 is related to the occurrence of bifunctional enzyme deficiency.
  • By modulating a particular HSD17b it is possible to influence or control the local and paracrine concentration of estrogens and androgens in different tissues.
  • Several reversible and irreversible inhibitors of HSD17b-2 enzymes of steroidal or nonsteroidal origin are already known in the literature (Poirier D. (2003) Curr Med Chem 10: 453-77).
  • the application WO 02/26706 which describes inhibitors of HSD17b-2 of non-steroidal origin.
  • JP48042271 discloses compounds used as an anti-inflammatory compound.
  • US Pat. No. 5,597,823 describes, for its part, adrenergic antagonists that are useful for the treatment of hyperplasia. benign prostate.
  • Patent application JP62132884 discloses benzylthienopyrimidinones for the treatment of cardiovascular disorders.
  • WO2005032527 relates to the use of thiophenepyrimidinone derivatives, for the treatment or prevention of steroid hormone-dependent diseases by the inhibition of 17 ⁇ -HSD-1. Since each subtype of HSD17b has a selective substrate affinity, a particular tissue distribution, the selectivity of the action can be achieved by targeting a particular HSD17b isozyme.
  • HSD17b7 In addition to its ability to synthesize 17 ⁇ -estradiol in vitro for which there is no evidence of physiological relevance to date, the protein HSD17b7 also has 3-ketosteroid reductase activity, which is the aspect of interest. in the present invention: HSD17b7 is capable of complementing a deficiency of 3-ketosteroid reductase activity in Erg27p-deficient yeasts and thus allows cell growth in a sterol-free medium.
  • HSD17b7 is localized in the endoplasmatic reticulum, which is the site of the postsqualene part of cholesterol synthesis, and is expressed specifically in tissues involved in congenital cholesterol deficiency disorders (Marijanovic et al, Molecular Endocrinology 2003, 17 (9 ): 1715-1725).
  • HSD17b7 gene or "HSD17b7 nucleic acid” means the gene or nucleic acid sequence that encodes the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase type 7. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention may also use cells expressing a heterologous type 7 hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid coding for the enzyme (for example an enzyme from another organism).
  • a human cDNA sequence of HSD17b is reproduced in the appendix (SEQ ID No. 1). ). It is the NM016371 sequence whose coding portion is from nucleic acid 96 to 1121.
  • Another subject of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or a skin disorder associated with a hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or the activity hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase type 7 (HSD 17B7), the expression of its gene or activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject compared to a biological sample of a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by assaying the protein (HSD17B7) by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of the activity of the enzyme can also be envisaged.
  • control is a "healthy” subject.
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ).
  • This measurement of the difference in the expression or activity of the protein or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters notably makes it possible to monitor the efficacy of a treatment, in particular a treatment. by a modulator of the enzyme, as envisaged above or by another treatment against acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing the expression or activity of the subject.
  • HSD17b7 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject.
  • the expression of the HSD17b7 protein can be determined by assaying this protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of its gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of the activity of the enzyme can also be envisaged.
  • the subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne.
  • the subject "control" in this method means a "healthy" reference subject or population.
  • the detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum.
  • An object of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising determining the ability of a compound to modulate the expression or the activity of the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase type 7 or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, a modulation of the expression or of the activity of the enzyme indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • the method therefore makes it possible to select compounds capable of modulating the expression or the activity of HSD17b7, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the hydroxysteroid protein
  • (17-beta) dehydrogenase type 7 the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters
  • “Modulation” means any effect on the expression or the activity of the enzyme, the expression of the gene or the activity of at least one of its promoters, that is to say, a stimulation, but preferably a inhibition, partial or complete. The difference in expression obtained with the test compound compared to a control carried out in the absence of the compound is significant from 25% or more.
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the HSD17b7 gene, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene. reporter.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or of its activity is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescence techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the HSD17b7 gene coding for the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase type 7, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the HSD17b7 gene endogenously, such as for example a liver cell, an ovarian cell, or even better a sebocyte. It is also possible to use organs of human or animal origin, such as, for example, the preputial gland, clitoral gland or the sebaceous gland of the skin.
  • It may also be a cell transformed with a heterologous nucleic acid, encoding a hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7, preferably human, or mammalian.
  • a heterologous nucleic acid encoding a hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7, preferably human, or mammalian.
  • host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • the level of expression of the HSD17B7 gene can be determined by evaluating the transcription rate of said gene, or its rate of translation.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA among the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium.
  • RNA RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-hydroxysteroid antibody (17-beta) dehydrogenase 7 may, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire enzyme, sampling and then depleting the antiserum according to methods in themselves known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • microplates in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays, radioimmunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general).
  • the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of a hydrolyzate
  • HPLC nano-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (ESI electrospray mode) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art (analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • step a) described above consists in preparing reaction mixtures comprising a hydroxysteroid enzyme (17-beta) dehydrogenase 7 and a substrate of the enzyme, and step c) described above. above is to measure enzymatic activity.
  • step a) consists of preparing reaction mixtures comprising a hydroxysteroid enzyme (17-beta) dehydrogenase 7 and a substrate of the enzyme, and a reductase system, and step c) consists in measuring the activity enzyme.
  • the enzyme can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • bacteria for example E. coli or B. subtilis
  • yeasts for example Saccharomyces, Pichia
  • insect cells such as Sf9 or Sf21.
  • An example of measurement of the enzymatic activity can be done according to the classical method of Marijanovic et al. Mol Endocrinol, September 2003, 17 (9): 1715-1725. It consists of measuring the conversion of zymosterone to zymosterol by the hydroxysteroid (17 beta) dehydrogenase.
  • the enzyme is incubated for 90 min at 37 ° C. in a reaction medium containing 880 ⁇ l of buffer (10 mM KPI, 0.05% BSA, and 1 mM EDTA pH8), 10 ⁇ L of bacterial lysate, 10 ⁇ L of NADPH (5 mg / ml), 10 ⁇ l of substrate (zymosterone, or 17 ⁇ estradiol, or androsterone).
  • the steroids produced during the reaction are extracted by RP18 column chromatography and eluted twice with a 1: 1 solution of methanol: chloroform and once with chloroform alone. After evaporation of the solvent, the steroids are solubilized in chloroform, separated by thin layer chromatography (Merck) using an 80:20 solution of toluene: ethyl acetate as a mobile phase and detected by spraying with a solution of 30% H 2 SO 4 in ethanol and developed at 135 9 C. Identification of substrates and metabolites is done by comparison with reference steroids.
  • the subject of the invention is also the use of a modulator of the human hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7 enzyme that can be obtained by one of the above methods for the preparation of a medicament intended for preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea. It is thus described here a method of preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with a hyperseborrhea, a method comprising administering a therapeutically effective amount of a modulator of the human hydroxysteroid enzyme (17-beta) dehydrogenase 7, to a patient in need of such treatment.
  • the invention finally relates to the cosmetic use of a modulator of the human hydroxysteroid enzyme (17-beta) dehydrogenase 7, for the aesthetic treatment of oily skin.
  • the modulator is an inhibitor of the enzyme.
  • inhibitor refers to a compound or a chemical substance that substantially eliminates or reduces the enzymatic activity of the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7.
  • substantially means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%. More particularly it may be a compound that interacts with, and blocks, the catalytic site of the enzyme, as competitive inhibitory type compounds.
  • a preferred inhibitor interacts with the enzyme in solution at inhibitor concentrations of less than 1 ⁇ M, preferably less than 0.1 ⁇ M, more preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the modulator compound may be an anti-hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 7 inhibitory antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 ⁇ g per ml to about 100 ⁇ g / ml, preferably from about 1 ⁇ g per ml to about 5 ⁇ g / ml.
  • the modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
  • PNA Peptide nucleic acid
  • hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase inhibitors are known, but the invention preferably targets the use of specific inhibitors of isoform 7.
  • the invention comprises the use of such hydroxysteroid-inhibiting compounds (17-beta ) dehydrogenase 7 for the preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • the modulator compounds are formulated in pharmaceutical compositions, in association with a pharmaceutically acceptable carrier. These compositions may be administered, for example, orally, parenterally, or topically. Preferably, the pharmaceutical composition is applied topically. Orally, the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, capsules, lozenges, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles allowing controlled release. Parenterally, the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a modulator content of HSD17b7 ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • osmotic pressure modifying agents emulsifying agents
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figs. 1A and 1B are graphs which show the extent of expression of the HSD17B7 gene in male gonadectomized and vehicle-treated mice, DHT, DHEA or the combination of DHEA-Flutamide for a period of 7 days. times a day (long-term treatment).
  • the results obtained by the Affymetrix technique (FIG. 1A) were confirmed by the RT-PCR technique in real time (FIG. 1B).
  • GDX gonadectomized and vehicle-treated mice
  • DHT gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist)
  • DHEA mice gonadectomized and treated with Dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in preputial glands metabolized to active androgen)
  • DHEA-FIu gonadectomized mice and treated with a combination of Dihydroepiandrosterone and Flutamide (Androgen receptor antagonists, which block the effects DHT and DHEA agonists).
  • Figures 2A and 2B are graphs reporting a kinetic study from 15 minutes to 96 hours using two different sets of primers ("probe sets") hybridizing to different regions of the HSD17B7 gene.
  • the set of primers used is 1417871_at
  • the set of primers used is 1448865_at.
  • Figures 2C and 2D are graphs reporting a 1 hour to 24 hour kinetic study using two different probe sets that hybridize to different regions of the HSD17B7 gene.
  • Figure 2C shows the level of expression of HSD17B7 using the primer series 1417871_at
  • Figure 2D represents the level of expression of HSD17B7 using the primer series 1448865_at.
  • the points Veh-24h-a and Veh-24h-b show the level of HSD17B7 expression of gonadectomized mice not treated with DHT.
  • RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis. Gene expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company. In short, the total RNA isolated from the tissues was transcribed into cDNA. From the double-stranded cDNA biotin-labeled cRNA was synthesized using T7 polymerase and a precursor NTP conjugated to biotin. The cRNAs were then fragmented into small fragments.
  • the calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match”) versus an oligonucleotide that contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide (see Table 1).
  • Table 1 Measurement of the Expression of HSD17B7 in the Epidermis and the Sebaceous Gland by Using Affymetrix Technology
  • HSD17B7 is well expressed in both tissues (sebaceous gland, epidermis).
  • the differential analysis between the expression in the human sebaceous gland and human repornm shows that the slightly stronger expression in the sebaceous gland does not reach any significance with respect to the value observed in the epidermis.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland. They are of sufficient size to allow isolation of RNA without the use of microdissection technologies.
  • the inventors analyzed the expression of HSD17B7 in the preputial glands of mice under conditions of steroid hormone deficiency (especially in androgenic hormones) following gonadectomy.
  • the gonadectomized animals were then treated with physiological amounts of Dihydrotestosterone (DHT) or Dihydroepiandrosterone (DHEA) to restore a physiological level of the androgenic hormones, or as a control experiment with a combination of DHEA-Flutamide in which Flutamide, a Androgen receptor antagonist blocks the effect of DHEA.
  • DHT Dihydrotestosterone
  • DHEA Dihydroepiandrosterone
  • the comparison of the gene expression under these experimental conditions makes it possible to unambiguously identify the modulation or not of the gene expression of a gene in question by the androgenic hormones.
  • Gene expression was analyzed using the Affymetrix technology described above ( Figure 1A) and the results were then confirmed by the real-time PCR technique ( Figure 1
  • RNA isolated from the tissues is transcribed (RT) into the cDNA and this is amplified by PCR (polymerase chain reaction).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the progress of the PCR is monitored in real time using fluorescent TaqMan probes, allowing precise quantification of the amount of mRNA of a given gene present in the biological sample at the start.
  • the mRNA of HSD17B7 is induced by chronic treatment for 7 days with androgens in the preputial gland.
  • Figures 2A, 2B, 2C and 2D represent the level of relative expression of mRNA as a function of time.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de l'hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase de type 7, ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de cette enzyme pour le traitement de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.

Description

Modulateurs de HSD17B7 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase 7 (HSD17b7), pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200μg/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnés en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le fœtus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits.
La demanderesse a maintenant découvert que le gène HSD17b7 était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler ce gène, ou son produit d'expression l'enzyme hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase 7, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection de l'expression ou d'activité du l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7.
HSD17b7
La protéine HSD17b7, qui désigne l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7, appartient à la famille des hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénases, qui catalysent la dernière réaction de la biosynthèse de plusieurs oestrogènes et androgènes, tels que l'oestradiol, la 5α-androstane-3β,17β-diol, la testostérone, et la dihydrotestostérone. Douze isoformes sont connues, présentant des activités spécifiques, réductrices ou oxydantes (Poirier, Current Médicinal Chemistry, 2003, 10 :453-477 ; Thiboutot et al, J . Invest Dermatol, 1998, 1 1 1 :390-395).
Comme une stimulation androgénique est à l'origine d'une augmentation de la production de sébum, ce qui peut induire des lésions acnéiques, l'inhibition des 17beta- hydroxysteroid dehydrogénases, enzymes clefs dans le métabolisme des androgènes, a été indiqué comme un traitement potentiel de l'acné. Dans ces cas, une inhibition non spécifique d'une ou plusieurs hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénases est recherchée. Les membres de la famille des HSD17b ont moins de 30% d'homologie de structure primaire entre elles. Les différents types de HSD17b diffèrent par leur substrat, leurs spécificités de cofacteurs (Labrie et al. (2000) Trends Endocrinol Metab., 1 1 :421 -7). En outre, certains types de HSD 17b sont impliqués dans la pathogénicité de certains désordres humains. HSD17b-3 est connu comme étant impliqué dans le développement du pseudohermaphrodisme, le HSD17b-8 joue un rôle dans la maladie du rein à plusieurs kystes et le HSD17b-4 est lié à la survenue à la déficience des enzymes bifonctionnelles. Par la modulation d'un HSD17b particulier, il est possible d'influencer ou de contrôler la concentration locale et paracrine d'oestrogènes et d'androgènes dans différents tissus. Plusieurs inhibiteurs réversibles et irréversibles d'enzymes HSD17b-2 d'origine stéroïdienne ou non stéroïdienne sont déjà connus dans la littérature (Poirier D. (2003) Curr Med Chem. 10:453-77). Comme par exemple la demande WO 02/26706 qui décrit des inhibiteurs de la HSD17b-2 d'origine non-stéroïdienne. Le brevet JP48042271 décrit des composés utilisés comme composé anti-inflammatoire. Le brevet US5, 597,823 décrit quant à lui des antagonistes adrénergiques utiles pour le traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate. La demande de brevet JP62132884 divulgue des benzylthieno- pyrimidinones pour le traitement des désordres cardiovasculaires. La demande WO2005032527 concerne l'utilisation des dérivés thiophenepyrimidinones, pour le traitement ou la prévention des maladies dépendants des hormones stéroïdiennes par l'inhibition de la 17β-HSD-1. Du fait que chaque sous-type de HSD17b a une affinité sélective d'un substrat, une distribution particulière de tissu, la sélectivité de l'action peut être réalisée en visant un isozyme de HSD17b particulier.
Outre sa capacité à synthétiser du 17β-oestradiol in vitro pour laquelle il n'y a aucune preuve d'une relevance physiologique à ce jour, la protéine HSD17b7 présente également une activité de 3-cétostéroïde réductase, qui est l'aspect d'intérêt dans la présente invention : HSD17b7 est capable de complémenter une déficience de l'activité 3- cétostéroïde réductase dans des levures Erg27p-déficientes et permet ainsi la pousse des cellules dans un milieu sans stérol. HSD17b7 est localisée dans le réticulum endoplasmatique, qui est le site de la partie postsqualene de la synthèse du cholestérol, et est exprimée spécifiquement dans les tissus impliqués dans les désordres congénitaux de déficience en cholestérol (Marijanovic et al, Molecular Endocrinology 2003, 17(9) :1715-1725).
C'est donc cette activité de l'enzyme dans la biosynthèse du cholestérol qui est d'intérêt dans la présente invention, ainsi que la modulation sélective de cette enzyme.
Dans le contexte de l'invention, le terme « gène HSD17b7» ou « acide nucléique HSD17b7» signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme (par exemple une enzyme d'un autre organisme). Une séquence d'ADNc humain de HSD17b est reproduite en annexe (SEQ ID No.1 ). ). Il s'agit de la séquence NM016371 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 96 à 1 121.
Applications diagnostiques
Un autre objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7 (HSD 17B7), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine (HSD17B7) par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de l'enzyme peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ». Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié à une hyperséborrhée, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine ou d'expression de son gène ou d'activité d'au moins un de ses promoteurs permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de l'enzyme, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine HSD17b7, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine HSD17b7 peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression de son gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de l'enzyme peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum.
Méthodes de criblage
Un objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, une modulation de l'expression ou de l'activité de l'enzyme indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de la HSD17b7, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde
(17-beta) déshydrogénase de type 7, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Par « modulation », on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, l'expression du gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.
Différentes techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène HSD17b7, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène HSD17b7 codant pour l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène HSD17b7 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour une hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, de préférence humaine, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293.
L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, le niveau d'expression du gène HSD17B7 peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou d'autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d' un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière, prélèvement puis épuisement de l'antisérum selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physicochimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant une enzyme hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. De préférence, l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant une enzyme hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 et un substrat de l'enzyme, et un système réductase, et l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique.
L'enzyme peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21 .
Un exemple de mesure de l'activité enzymatique peut se faire selon la méthode classique de Marijanovic et al. Mol Endocrinol, September 2003, 17(9) :1715-1725. Elle consiste à mesurer la conversion de zymostérone en zymostérol par l'hydroxystéroide (17 beta) deshydrogénase. L'enzyme est incubée pendant 90 min à 37°C dans un milieu réactionnel contenant 880μL de tampon (10 mM KPI, 0.05% BSA, et 1 mM EDTA pH8), 10OμL de lysat bactérien, 10μL de NADPH (5mg/ml), 10μL de substrat (zymostérone, ou 17βoestradiol, ou androstérone). Les stéroïdes produits pendant la réaction sont extraits par une chromatographie en phase inverse dans une colonne RP18 et élues deux fois avec une solution 1 :1 de méthanol :chloroforme et une fois avec du chloroforme seul. Après évaporation du solvant, les stéroïdes sont solubilisés dans du chloroforme, séparés par une chromatographie sur couche mince (Merck) en utilisant une solution 80 : 20 de toluène : éthylacétate comme phase mobile et détectés par pulvérisation d'une solution de 30% de H2SO4 dans de l'éthanol et développé à 1359C. L'identification des substrats et des métabolites se fait par comparaison avec les stéroïdes références.
Modulateurs de l'enzyme
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, pour le traitement esthétique des peaux grasses.
De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme « inhibiteur » se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7. Le terme « substantiellement » signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés de type inhibiteur compétitif. Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 μM, de préférence moins de 0,1 μM, de préférence encore moins de 0,01 μM.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 μg par ml à environ 100μg/ml, de préférence d'environ 1 μg par ml à environ 5μg/ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Plusieurs inhibiteurs de hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénases sont connus, mais l'invention vise préférentiellement l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de l'isoforme 7. L'invention comprend l'utilisation de tels composés inhibiteurs de la hydroxystéroïde (17- beta) deshydrogénase 7 pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la HSD17b7 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légendes des figures :
Les Figure 1A et 1 B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression du gène HSD17B7 chez des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique Affymetrix (Figure 1A) ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 1 B). GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes)
DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-FIu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagonistes du récepteur aux Androgènes; qui bloquent les effets des agonistes DHT et DHEA).
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm
Les Figures 2A et 2B sont des graphes rapportant une étude cinétique de 15 minutes à 96 heures utilisant deux séries d'amorce (« probe sets ») différentes s'hybridant sur différentes régions du gène HSD17B7. Concernant la Figure 2A la série d'amorces utilisée est la 1417871_at, pour la Figure 2B la série d'amorces utilisée est la 1448865_at.
Les différents temps d'observations sont identiques pour les deux expériences.
Dans la Figure 2A, les points ctrl-a-24h et ctrl-b-24 montrent le niveau d'expression de
HSD17B7 de souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicat) au point 24 heures. Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique.
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm
Carré: expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le DHT au temps zéro. Cercle: expression dans les souris gonadectomisées sans traitement DHT au temps zéro.
Les Figures 2C et 2D sont des graphes rapportant une étude cinétique de 1 heure à 24 heures utilisant deux séries d'amorce (« probe sets ») différentes s'hybridant sur différentes régions du gène HSD17B7. La Figure 2C représente le niveau d 'expression de HSD17B7 utilisant la série d'amorce 1417871_at, la Figure 2D représente le niveau d'expression de HSD17B7 utilisant la série d 'amorce 1448865_at. Les points Veh-24h-a et Veh-24h-b montrent le niveau d'expression de HSD17B7 de souris gonadectomisées non traitées avec le DHT.
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : expression de HSD17B7 dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et microdissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme. L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fourni par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus a été transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin on a synthétisé un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc ont été ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip » d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation (« single mismatch ») dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1 ).
Tableau 1 : Mesure de l'expression de HSD17B7 dans l'épiderme et dans la glande sébacée par utilisation de la technologie Affymetrix
"Indicateur de le significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1 ) ou absence (=0).
Résultats: La HSD17B7 est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et répiderme humain montre que l'expression légèrement plus forte dans la glande sébacée n'atteint pas de significativité par rapport à la valeur observée dans répiderme.
Exemple 2 : expression de la HSD17B7 dans la glande préputiale de souris
A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.
Les inventeurs ont analysé l'expression de la HSD17B7 dans les glandes préputiales de souris dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques), suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA- Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques. L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrite ci- dessus (Figure 1A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique de PCR en temps réel (Figure 1 B).
La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la société Applied Biosystems en utilisant le « 7900HT Séquence Détection System ». L'ARN total isolé des tissus est transcrit (RT) en l'ADNc et celui-ci est amplifié par PCR (réaction en chaîne par polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en utilisant des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la quantité d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ.
Résultat:
L'ARNm de la HSD17B7 est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.
B. Des souris mâles ont été gonadectomisées et ensuite étaient traitées avec le véhicule, ou le DHT. Les glandes préputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4 jours (traitement androgénique unique - observation d'une cinétique de court terme). L'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix utilisant deux séries d'amorce différentes : 1417871 _at (Figure 2A et 2C) et 1448865_at (Figure 2B et 2D). Les Figures 2A, 2B, 2C et 2D représentent le niveau d'expression relative de l'ARNm en fonction du temps.
Résultat :
La gonadectomie qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes induit une répression de la quantité d'ARNm de la HSD17B7 dans la glande préputiale de la souris
(figure 2A et 2B). L'ARNm de la HSD17B7 dans la glande préputiale de la souris est induit modérément par un traitement court terme avec la DHT (effet visible à 24 et 96 heures)
(Figure 2A et 2B).
L'ARNm de la HSD17B7 dans la glande préputiale de la souris est induit par un traitement court terme avec le DHT (effet débutant à 12h et bien visible à 18 et 24 heures) (Figure
2C et Figure 2D).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17- beta) deshydrogénase 7, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène HSD17B7, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène HSD17B7, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes.
7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue, codant pour l'hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant une enzyme hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 et un substrat de l'enzyme, et un système réductase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique.
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