EP2046980A2 - Modulateurs de la lanostérol synthétase dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée - Google Patents

Modulateurs de la lanostérol synthétase dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée

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EP2046980A2
EP2046980A2 EP07823597A EP07823597A EP2046980A2 EP 2046980 A2 EP2046980 A2 EP 2046980A2 EP 07823597 A EP07823597 A EP 07823597A EP 07823597 A EP07823597 A EP 07823597A EP 2046980 A2 EP2046980 A2 EP 2046980A2
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EP
European Patent Office
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expression
gene
activity
lanosterol
synthetase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07823597A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fernand Labrie
Mihamed El-Alfy
Ezequiel L. Calvo
Van Luu-The
Jérôme AUBERT
Pascal Collette
Johannes Voegel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
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Publication date
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Publication of EP2046980A2 publication Critical patent/EP2046980A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/99—Isomerases (5.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of lanosterol synthetase (LSS) modulator compounds for the treatment of acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
  • LSS lanosterol synthetase
  • Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum.
  • a level of sebum greater than 200 ⁇ g / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin.
  • Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture.
  • the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions. This stimulation of sebaceous gland production is induced by androgens.
  • Acne is, in fact, a chronic disease of the pilosebaceous follicle under hormonal dependence.
  • a hormonal therapy against acne is a possibility of treatment for women, the goal being to oppose the effects of androgens on the sebaceous gland.
  • estrogens, anti-androgens, or agents that decrease the production of androgens by the ovaries or the adrenal gland are generally used.
  • Antiandrogens used for the treatment of acne include spironolactone, cyproterone acetate, and flutamide. However, these agents have potentially severe side effects. Thus, any pregnancy must be absolutely prevented, particularly because of a risk of feminization for the male fetus. These agents are prohibited in male patients.
  • LSS lanosterol synthetase
  • acne we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
  • the Applicant also proposes in vitro diagnostic methods or in vitro prognosis, based on the detection of the level of expression or activity of the LSS.
  • LSS lanosterol synthetase, also called 2,3-epoxysqualen-lanosterol cyclase, 2,3-oxidosqualen-lanosterol cyclase, OSC, or Oxidosqualene-lanosterol cyclase.
  • Lanosterol synthetase catalyzes the cyclization of (S) -2,3 oxidosqualene to lanosterol during the reaction that forms the sterol nucleus.
  • the gene encoding lanosterol synthetase is called OSC gene, or, in the context of the present application, LSS gene.
  • the LSS gene is considered an interesting target for the treatment of hypercholesterolemia (Huff and Telford, 2005, Trends Pharmacol Sci., 2005 Jul; 26 (7): 335-40) but also for the treatment of Chagas' disease ( Hankins, Gillesprie, Aikenhead and Buckner, 2005, Mol Biochm Parasitol, 2005 Nov, 144 (1): 68-75).
  • LSS gene or "LSS nucleic acid” means the gene or nucleic acid sequence that encodes lanosterol synthetase. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention may also use cells expressing a heterologous lanosterol synthetase, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid encoding the enzyme. .
  • a human LSS cDNA sequence is reproduced in the appendix (SEQ ID No. 1). It is the NM 002340 sequence whose coding portion is from nucleic acid 33 to 2231.
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or activity of the lanosterol synthetase protein (LSS), the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject.
  • LSS lanosterol synthetase protein
  • the expression of the protein can be determined by an assay of the LSS protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay. Another method, in particular for measuring the expression of the LSS gene, is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above. An assay of the activity of LSS can also be envisaged.
  • control is a "healthy” subject.
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ).
  • This measurement of the difference in expression or activity of the LSS, or of expression of its gene or activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment, in particular a treatment with a LSS modulator, as envisaged above, or another treatment against acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing the expression or activity of the subject.
  • lanosterol synthetase protein LSS
  • the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject.
  • the expression of the LSS protein can be determined by an assay of this protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the LSS gene is to measure the amount of mRNA corresponding by any method as described above.
  • An assay of the activity of LSS can also be envisaged.
  • the subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne.
  • the subject "control” in this method means a "healthy" reference subject or population.
  • the detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum.
  • An object of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne, or any skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising determining the capacity of a compound to modulate the expression or activity of lanosterol synthetase or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of lanosterol synthetase acne, or any skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • the method therefore makes it possible to select the compounds capable of modulating the expression or the activity of the LSS, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the subject of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the lanosterol synthetase protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d.
  • Modulation means any effect on the expression or the activity of the enzyme, the expression of the gene or the activity of at least one of its promoters, that is to say, a stimulation, but preferably a inhibition, partial or complete.
  • the compounds tested in step d) above preferably inhibit the expression or the activity of the lanosterol synthetase protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • the difference in expression obtained with the test compound compared to a control carried out in the absence of the compound is significant from 25% or more.
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds. Various techniques can be implemented to test these compounds and identify compounds of therapeutic interest, modulators of the expression or activity of lanosterol synthetase.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the gene encoding lanosterol synthetase, and step c) described above consists in measuring the expression of said reporter gene.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or its activity is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescent techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the gene encoding lanosterol synthetase, and step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the LSS gene endogenously, such as for example a liver cell, an ovarian cell, or more preferably a sebocyte. It is also possible to use organs of human or animal origin, such as, for example, the preputial gland, clitoral gland or the sebaceous gland of the skin.
  • nucleic acid coding for lanosterol synthetase, preferably human, or mammalian.
  • a wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • the expression of the LSS gene or the reporter gene can be determined by evaluating the transcription rate of said gene, or its translation rate.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of the corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of protein produced.
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of an mRNA known from the poly (A) RNAs of a tissue that can be made using specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium.
  • RNA RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-lanosterol synthetase antibody may, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire enzyme. The antiserum is removed and then exhausted according to methods known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays radioimmunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general). In general, the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of a hydrolyzate is carried out by separation of the peptides by HPLC (nano-HPLC) based on their physicochemical properties (reverse phase).
  • HPLC nano-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI), or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art (MALDI mode analysis).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • step a) described above consists in preparing reaction mixtures each comprising an enzyme lanosterol synthetase and a substrate of the enzyme, and step c) described above consists in measuring the enzymatic activity.
  • the lanosterol synthetase enzyme can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • the determination of the enzyme activity preferably comprises the determination of the synthetase activity, by extraction of the produced sterols and chromatographic analysis.
  • lanosterol synthetase cDNA is expressed under the control of a glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase promoter in yeast deficient in lanosterol synthetase, GIL77 (Kushiro et al., Eur J. Biochem., 256, 238-241, 1998).
  • the acellular extract obtained from the transformed yeast cell is used.
  • the yeast is therefore homogenized in buffer A [0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4), 0.45 M sucrose, 1 mM EDTA and 1 mM dithiothreitol] in the presence of glass beads treated with acid.
  • the supernatant obtained by centrifugation is brought to the concentration of 10 mg / ml by adding buffer A.
  • a substrate 14C (3S) -2,3-oxidosqualene is prepared biosynthetically by culturing GL7 yeast cells deficient in lanosterol (Gollub et al. J. Biol. Chem. 252, 2846- 2854, 1977) in the presence of 14 C sodium acetate, to incorporate the radioactivity into the oxidosqualene.
  • the substrate (final concentration, 0.17-0.42 ⁇ M, 4.5 nCi) and the test compound are added to buffer B [0.1 M potassium-phosphate buffer (pH 7.4) and 0.1% Triton X-100] to obtain a total volume of 900 ⁇ l, preincubated at 37 ° C. for 10 minutes, before adding the enzyme (1 mg) to prepare a 1 ml solution, incubated at 37 ° C. for 60 minutes. 6% potassium hydroxide / ethanol is added to stop the reaction, and the mixture is saponified by incubation at 37 ° C for 10 minutes, before adding cyclohexane (2 ml).
  • buffer B 0.1 M potassium-phosphate buffer (pH 7.4) and 0.1% Triton X-100]
  • the cyclohexane layer is dried, deposited on a thin layer chromatography plate, and developed with a benzene / acetone solvent (19/1, v / v).
  • the amounts of unreacted substrate and 14 C lanosterol are then determined by BAS-1500 analyzer (Fuji Photo Film Co., Japan) to calculate the inhibition rate of lanosterol synthesis.
  • Modulators of the enzyme also relates to the use of a modulator of the human enzyme lanosterol synthetase, obtainable by one of the above methods, for the preparation of a medicinal product intended for the preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea. It is thus described here a method of preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea, a method comprising the administration of a therapeutically effective amount of a modulator of the human enzyme lanosterol synthetase , to a patient in need of such treatment.
  • the invention finally relates to the cosmetic use of a modulator of the human enzyme lanosterol synthetase, for the aesthetic treatment of oily skin.
  • the modulator is an inhibitor of the enzyme.
  • the term "inhibitor” refers to a compound or a chemical substance that substantially eliminates or reduces the enzymatic activity of lanosterol synthetase.
  • the term “substantially” means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%. More particularly, it may be a compound that interacts with, and blocks, the catalytic site of the enzyme, as compounds of the competitive inhibitory type.
  • a preferred inhibitor interacts with the enzyme in solution at inhibitor concentrations of less than 1 ⁇ M, preferably less than 0.1 ⁇ M, more preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the modulator compound may be an anti-lanosterol synthetase inhibitory antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 ⁇ g per ml to about 100 ⁇ g / ml, preferably from about 1 ⁇ g per ml to about 5 ⁇ g / ml.
  • the modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
  • PNA Peptide nucleic acid
  • lanosterol synthetase inhibitors are known, and proposed for the treatment of hypercholesterolemia.
  • the invention comprises the use of such lanosterol synthetase inhibiting compounds for the preventive and / or curative treatment of acne, or cutaneous disorders associated with hyperseborrhoea.
  • Other modulator compounds identified by the screening method described above are also useful.
  • the modulating compounds are formulated within a pharmaceutical composition, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • These compositions may be administered, for example, orally, enterally, parenterally, or topically.
  • the pharmaceutical composition is applied topically.
  • the pharmaceutical composition can be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymers for controlled release.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It can also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a content of LSS modulator ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as
  • osmotic pressure modifying agents emulsifying agents
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figures 1A and 1B are graphs that show the extent of LSS gene expression in gonadectomized and vehicle-treated mice, DHT, DHEA or DHEA-Flutamide combination for a period of 7 days. times a day (long-term treatment).
  • the results obtained by the Affymetrix technique (FIG. 1A) were confirmed by the RT-PCR technique in real time (FIG. 1B).
  • GDX gonadectomized and vehicle-treated mice
  • DHT gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist)
  • DHEA gonadectomized mice treated with dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in the preputial glands metabolized to active androgen)
  • DHEA-FIu gonadectomized mice treated with a combination of dihydroepiandrosterone and flutamide (androgen receptor antagonists, which blocks the effects DHT and DHEA agonists).
  • Figures 2A and 2B are graphs reporting a kinetic study from 15 minutes to 96 hours (Figure 2A) and a kinetic study from 1 hour to 24 hours (Figure 2B).
  • Expression level Square mRNA expression level: expression in gonadectomized mice following treatment with DHT at zero time.
  • Rhombus expression in gonadectomized mice without DHT treatment.
  • the Ctrl-24h point shows the level of expression of lanosterol synthetase of gonadectomized mice not treated with DHT at the 24 hour point.
  • the following points come from gonadectomized mice and treated with DHT and indicate the successive times (in hours) of the kinetic study.
  • Level of expression level of expression of mRNA
  • Figures 3A, 3B and 3C show the expression of LSS in the sebaceous gland of mouse skin by in situ hybridization.
  • Figure 3A is a photograph in conventional illumination and dark field illumination of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization using a sense probe of LSS (negative control, intact animal 44).
  • Figure 3B is a photograph in conventional illumination and dark field illumination of a mouse skin section subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 44).
  • Figure 3C is a photograph in conventional illumination and dark field illumination of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in a gonadectomized animal (animal 53).
  • Figures 4A, 4B and 4C show the expression of LSS in the mouse preputial gland by in situ hybridization.
  • Figure 4A is a photograph in conventional lighting and dark-field illumination of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with a sense probe of LSS (negative control, animal 45).
  • Figure 4B is a photograph in conventional lighting and dark field illumination of a foreskin section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 45).
  • Figure 4C is a photograph in conventional illumination and dark field illumination of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in a gonadectomized animal (animal 53).
  • RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis.
  • RNA expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company.
  • Affymetrix station microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer
  • the total RNA isolated from the tissues is transcribed into cDNA.
  • biotin-labeled cRNA is synthesized using T7 polymerase and a precursor NTP conjugated to biotin.
  • the cRNAs are then fragmented into small fragments. All molecular biology steps are controlled using Agilent's "Lab on a chip" system to confirm the good efficiencies of the enzyme reactions.
  • the Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated cRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After washes, the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the significance of the value obtained. The calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match") versus an oligonucleotide that contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide (see Table 1).
  • Table 1 Measurement of the expression of lanosterol synthetase in the epidermis and in the human sebaceous gland via the use of the affymetrix flea technology.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland. They are of sufficient size to allow isolation of RNA without the use of microdissection technologies.
  • Lanosterol synthetase in the mouse preputial glands was carried out under conditions of steroid hormone deficiencies (in particular in androgenic hormones) following gonadectomy.
  • the gonadectomized animals were then treated with physiological amounts of Dihydrotestosterone (DHT) or Dihydroepiandrosterone (DHEA) to restore a physiological level of the androgenic hormones, or as a control experiment with a combination of DHEA-Flutamide in which Flutamide, a Androgen receptor antagonist blocks the effect of DHEA.
  • DHT Dihydrotestosterone
  • DHEA Dihydroepiandrosterone
  • the comparison of the gene expression under these experimental conditions makes it possible to unambiguously identify the modulation or not of the gene expression of a gene in question by the androgenic hormones.
  • RNA isolated from the tissues is transcribed (RT) into the cDNA and this is amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the progress of the PCR is monitored in real time using fluorescent TaqMan probes, allowing precise quantification of the amount of mRNA of a given gene present in the biological sample at the start.
  • the mRNA of lanosterol synthetase is induced by chronic treatment for 7 days with androgens in the preputial gland.
  • Figure 2A and Figure 2B show the level of relative expression of mRNA as a function of time.
  • Gonadectomy which causes steroid hormone deficiency induces a decrease in the amount of lanosterol synthetase mRNA in the mouse preputial gland.
  • the mRNA of lanosterol synthetase in the mouse preputial gland is induced by a short-term treatment with DHT (visible effect at 18, 24 and 96 hours).
  • Sense and antisense probes were prepared from the LSS gene by incubation of the linearized gene (2 ⁇ g) with 63 ⁇ Ci of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of T7 RNA polymerase or T3.
  • In situ hybridization was performed on formaldehyde-fixed mouse tissue wrapped in paraffin. Sections (4 ⁇ m wide) were then deparaffinized in toluene and rehydrated in an alcohol gradient. After drying, the different sections were incubated in prehybridization buffer for two hours.
  • Hybridization took place over night in hybridization buffer (prehybridization buffer with DTT and 1 Omm 2X10 6 cpm RNA / .mu.l Smarqué 35) to 53 ⁇ .
  • the excess probe was removed and the sections were slanted in an LM1 emulsion (Amersham Biosciences, UK) and exposed in the dark at 4 ° C for at least one month.
  • the sections were then grown and counter stained with hematoxylin and eosin. Hybridization with the sense probe was used as a negative control and only background was detected. These probes were incubated with histological sections of mouse skin or mouse preputial gland.
  • Figure 3A shows a strong marking of the basal layer of the sebaceous gland, visible by accumulation of silver grains.
  • Figure 3C also shows a marking of the basal layer of the sebaceous gland.
  • LSS is expressed in the basal layers of the sebaceous glands of mouse skin.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland.
  • Figure 4A shows no marking at the level of the preputial gland which is consistent with the expectations of the inventors because it corresponds to the negative control.
  • Figure 4B shows a very strong labeling of the mouse preputial gland in a normal animal.
  • Figure 4C shows a more moderate labeling of acini of the preputial gland in a gonadectomized animal.
  • LSS is expressed in the preputial gland of mice, particularly in the basal layers of acini.
  • An analysis of several histological sections from 4 control animals and 4 gonadectomized animals indicates a significantly stronger expression in the preputial glands of the intact animals.
  • in situ hybridization results in the mouse preputial gland indicate that expression of the LSS enzyme increases under conditions characterized by androgenic stimulation (intact animals). These observations are consistent with data obtained by Affymetrix technologies and real-time PCR.
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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la lanostérol synthétase (LSS), ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de cette enzyme pour le traitement de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de ces pathologies.

Description

Modulateurs de la lanostérol synthétase dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de lanostérol synthétase (LSS) pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200μg/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnés en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le fœtus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits.
La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour la lanostérol synthétase (LSS) était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler le gène LSS ou son produit d'expression, pour prévenir et/ou améliorer l'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse.
Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité de la LSS.
LSS L'enzyme LSS désigne la lanostérol synthétase, encore appelée 2,3-epoxysqualène- lanostérol cyclase, 2,3-oxidosqualène-lanostérol cyclase, OSC, ou encore Oxidosqualene-lanostérol cyclase.
La lanostérol synthétase catalyse la cyclisation du (S)-2,3 oxydosqualène en lanostérol au cours de la réaction qui forme le noyau stérol. Le gène codant la lanostérol synthétase est appelé gène OSC, ou, dans le contexte de la présente demande, gène LSS. Le gène LSS est considéré comme une cible intéressante pour le traitement de l'hypercholestérolémie (Huff et Telford, 2005, Trends Pharmacol Sci. 2005 Jul;26(7):335-40) mais aussi pour le traitement de la maladie de Chagas (Hankins, Gillesprie, Aikenhead et Buckner, 2005, Mol Biochm Parasitol. 2005 Nov ;144(1 ) : 68-75). L'inhibition de la lanostérol synthétase permet de diminuer la production de lanostérol et donc la synthèse de cholestérol. Elle provoque également une augmentation de la synthèse d'oxystérols. Cette double action permet d'amplifier la diminution du cholestérol lors d'un traitement (Telford et al, 2005, Arteriocler Thromb Vase Biol. 2005 Dec ; 25 (12) :2608-14). Les inhibiteurs impliqués sont nombreux et ont été produits à partir d'extraits de champignons (Sakano, Shibuya, Yamaguchi, Masuma, Tomoda, Omura, Ebizuka, 2004, J Antibiot. 2004 Sep ;57(9) :564- 8), de végétaux, ou dérivés du ligand endogène et de sucres comme des mono- et digalactosides (Tanaka, Sakano, Nagatsu, Shibuya, Ebizuka, Goda, 2005, Bioorg Med Chem Lett. 2005 Jan 3 ;15 (1 ) :159-62) ou l'inhibiteur Ro 48-8071 cité dans les publications : Morand, Aebi, Dehmlow, Ji, Gains, Lengsfeld, Himber, 1997 J Lipid Red 38, 373-390 et Thoma et al., 2004 Nature Nov 4 ; 432, 1 18-122.
Dans le contexte de l'invention, le terme « gène LSS » ou « acide nucléique LSS » signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la lanostérol synthétase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une lanostérol synthétase hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme. Une séquence d'ADNc humain de LSS est reproduite en annexe (SEQ ID No.1 ). Il s'agit de la séquence NM 002340 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 33 à 2231.
Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou d'activité de la protéine lanostérol synthétase (LSS), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine LSS par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène LSS, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la LSS peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ». Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié à une hyperséborrhée, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence d'expression ou d'activité de la LSS, ou d'expression de son gène ou d'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la LSS, tel qu'envisagé plus haut, ou un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine lanostérol synthétase (LSS), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine LSS peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène LSS, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la LSS peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet « contrôle » dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum.
Méthodes de criblage Un objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la lanostérol synthétase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de la LSS, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine lanostérol synthétase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine lanostérol synthétase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par « modulation », on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, l'expression du gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine lanostérol synthétase, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. Différents techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de la lanostérol synthétase.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour la lanostérol synthétase, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la lanostérol synthétase, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène LSS de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour la lanostérol synthétase, de préférence humaine, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène LSS ou du gène rapporteur peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité l'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-lanostérol synthétase peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leur propriétés physicochimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI), soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme lanostérol synthétase et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. L'enzyme lanostérol synthétase peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21 . La détermination de l'activité enzymatique comprend de préférence la détermination de l'activité synthétase, par extraction des stérols produits et analyse chromatographique.
Des dosages de l'activité enzymatique de la LSS sont décrits dans la littérature (voir par exemple Kusano et al, 1991 , Chem. Pharm. Bull. 39, 239-241 , ou Morand et al, Journals of Lipid Research, 1997, 38:373-390). Ainsi, l'activité de la lanostérol synthétase peut être évaluée de la manière suivante : l'ADNc de la lanostérol synthétase est exprimé sous le contrôle d'un promoteur glyceraldehydes-3-phosphate déshydrogénase dans une levure déficiente en lanostérol synthétase, GIL77 (Kushiro et al., Eur. J. Biochem., 256, 238-241 , 1998). L'extrait acellulaire obtenu de la cellule de levure transformée est utilisé. La levure est pour cela homogénéisée dans un tampon A [0.1 M tampon potassium-phosphate (pH 7.4), 0.45 M saccharose, 1 mM EDTA et 1 mM dithiothreitol] en présence de billes de verres traitées à l'acide. Le surnageant obtenu par centrifugation est amené à la concentration de 10 mg/ml par addition du tampon A.
Un substrat 14C(3S)-2,3-oxydosqualène est préparé de manière biosynthétique par culture de cellules de levure GL7 déficientes en lanostérol (Gollub et al. J. Biol. Chem. 252, 2846- 2854, 1977) en présence d'acétate 14C de sodium, pour incorporer la radioactivité dans l'oxydosqualène.
Le substrat (concentration finale, 0.17-0.42 μM, 4.5 nCi) et le composé à tester sont ajoutés au tampon B [0.1 M tampon potassium-phosphate (pH7.4) et 0.1% Triton X-100] pour obtenir un volume total de 900 μl, préincubé à 37^ pendant 10 minutes, avant l'ajout de l'enzyme (1 mg) pour préparer une solution de 1 ml, incubée à 37^ pendant 60 minutes. 6% potassium hydroxyde/ethanol est ajouté pour arrêter la réaction, et le mélange est saponifié par incubation à 37°C, pendant 10 minutes, avant ajout de cyclohexane (2 ml). La couche de cyclohexane est séchée, déposée sur plaque de chromatographie sur couche mince, et développée par un solvant benzène/acétone (19/1 , v/v). Les quantités de substrat n'ayant pas réagi et de lanostérol 14C sont ensuite déterminées par analyseur BAS-1500 (Fuji Photo Film Co., Japon), pour calculer le taux d'inhibition de la synthèse de lanostérol.
Modulateurs de l'enzyme L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine lanostérol synthétase, susceptible d'être obtenu par l'une des méthodes ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine lanostérol synthétase, à un patient nécessitant un tel traitement.
L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine lanostérol synthétase, pour le traitement esthétique des peaux grasses. De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme « inhibiteur » se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la lanostérol synthétase. Le terme « substantiellement » signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement, il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés du type inhibiteur compétitif. Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 μM, de préférence moins de 0,1 μM, de préférence encore moins de 0,01 μM.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-lanostérol synthétase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 μg par ml à environ 100μg/ml, de préférence d'environ 1 μg par ml à environ 5μg/ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Plusieurs inhibiteurs de la lanostérol synthétase sont connus, et proposés pour le traitement de l'hypercholestérolémie. L'invention comprend l'utilisation de tels composés inhibiteurs de la lanostérol synthétase pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. A titre non limitatif, on peut citer le Ro 48-8071 (ou [4'-(6-allyl-methyl-amino-hexyloxy)-2'-fluoro-phenyl]-(4- bromophenyl)-methanone fumarate) comme inhibiteur de la lanostérol synthétase. D'autres composés modulateurs identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut sont également utiles.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la LSS allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Légende des figures :
Les Figures 1A et 1 B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression du gène LSS chez des souris maies gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, la DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique Affymetrix (Figure 1A) ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 1 B). GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec la Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-FIu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagonistes du récepteur aux Androgènes; qui bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm
Les figures 2A et 2B sont des graphes rapportant une étude cinétique de 15 minutes à 96 heures (Figure 2A) et une étude cinétique de 1 heure à 24 heures (Figure 2B). Dans la Figure 2A, les points 124a et 124b montrent le niveau d'expression de la lanosterol synthétase de souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicat) au point 24 heures. Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique.
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm Carré: expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le DHT à temps zéro.
Losange: expression dans les souris gonadectomisées sans traitement DHT.
Dans la Figure 2B, le point Ctrl-24h montre le niveau d'expression de la lanosterol synthétase de souris gonadectomisées non traitées par le DHT au point 24 heures. Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et traitées avec le DHT et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique. Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm
Les Figures 3A, 3B et 3C montrent l'expression de la LSS dans la glande sébacée de la peau de souris par hybridation in situ. La Figure 3A est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde sens de LSS (contrôle négatif; animal intact 44). La Figure 3B est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 44). La Figure 3C est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53).
Les Figures 4A, 4B et 4C montrent l'expression de LSS dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 4A est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde sens de LSS (contrôle négatif; animal 45). La Figure 4B est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 45). La Figure 4C est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53).
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de la lanosterol svnthétase dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip» d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation (« single mismatch ») dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1 ).
Tableau 1 : mesure de l'expression de la lanosterol synthétase dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine via l'utilisation de la technologie des puces affymetrix.
indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1 ) ou absence (=0).
Résultats: La lanosterol synthétase est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et répiderme humain montre que l'expression légèrement plus forte dans la glande sébacée n'atteint pas de significativité par rapport à la valeur observée dans répiderme (tableau 1 ).
Exemple 2 : Expression de la lanosterol svnthétase dans la glande préputiale de souris
A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.
L'analyse de l'expression de la Lanosterol synthétase dans les glandes préputiales de souris a été réalisée dans des conditions de déficiences en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA-Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux Androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'une gène en question par les hormones androgéniques.
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci-dessus (Figure 1 A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique de PCR en temps réel (figure 1 B).
La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la société Applied Biosystems en utilisant le « 7900HT Séquence Détection System ». L'ARN total isolé des tissus est transcrit (RT) en l'ADNc et celui-ci est amplifié par PCR (Réaction en Chaine par Polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en utilisant des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la quantité d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ.
Résultat: L'ARNm de la lanosterol synthétase est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.
B. Des souris mâles ont été gonadectomisées et ensuite étaient traitées avec le véhicule, ou le DHT. Les glandes preputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4 jours (traitement androgénique unique - observation d'une cinétique de court terme). L'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix. Les Figure 2A et Figure 2B représentent le niveau d'expression relative de l'ARNm en fonction du temps.
Résultats:
La gonadectomie (qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes) induit une diminution de la quantité d'ARNm de la lanosterol synthétase dans la glande préputiale de la souris.
L'ARNm de la lanosterol synthétase dans la glande préputiale de la souris est induit par un traitement court terme avec le DHT (effet visible à 18, 24 et 96 heures).
Exemple 3 : Expression de LSS dans la glande sébacée de la peau de souris par « hybridation in situ »
Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du gène LSS par incubation du gène linéarisé (2μg) avec 63μCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4μm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 1 OmM DTT et 2X106 cpm ARN/μl 35Smarqué) à 53^. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4*O pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. L'hybridation avec la sonde sens a été utilisée comme témoin négatif et on a uniquement détecté le bruit de fond. Ces sondes ont été incubées avec des coupes histologiques de la peau de souris ou de la glande préputiale de souris. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisens (Figure 3B et Figure 3C) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A) utilisé comme contrôle négatif.
RESULTATS:
On observe sur la Figure 3A qu'il n'y a pas d'accumulation de grains argentés (pas de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 3B montre un fort marquage de la couche basale de la glande sébacée, visible par accumulation de grains argentés. La Figure 3C montre aussi un marquage de la couche basale de la glande sébacée.
LSS est exprimé dans les couches basales des glandes sébacées de la peau de souris. Une analyse fine basée sur l'observation de coupes histologiques obtenues pour 4 animaux intacts et 4 animaux gonadéctomisés montre une expression plus forte dans les glandes sébacées des animaux intacts que dans les animaux gonadéctomisés. Ce résultat est en accord avec l'induction du gène par une stimulation androgénique observé dans les expériences Affymetrix et RT-PCR.
Exemple 4 : Expression de LSS dans la glande préputiale de souris par « hybridation in situ » Méthodes :
Les méthodes utilisées dans cet exemple sont identiques à celles de l'exemple 3.
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée.
RESULTATS:
La Figure 4A ne montre pas de marquage au niveau de la glande préputiale ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 4B montre un très fort marquage de la glande préputiale de souris dans un animal normal. La Figure 4C montre un marquage plus modéré des acini de la glande préputiale dans un animal gonadéctomisé.
LSS est exprimé dans la glande préputiale de souris, en particulier dans les couches basales des acini. Une analyse de plusieurs coupes histologiques provenant de 4 animaux contrôles et 4 animaux gonadéctomisés indique une expression nettement plus forte dans les glandes préputiaux des animaux intacts.
En résumé, les résultats d'hybridation in situ dans la glande préputiale de souris indiquent que l'expression de l'enzyme LSS augmente dans des conditions caractérisées par une stimulation androgénique (animaux intacts). Ces observations sont en accord avec les données obtenues par les technologies Affymetrix et la PCR en temps réelle.
Exemple 5 : Exemples de Compositions
A- VOIE ORALE
Comprimé de 0,2 g
- Ro 48-8071 0,001 g - Amidon 0,1 14 g
- Phosphate bicalcique 0,020 g - Silice 0,020 g
- Lactose 0,030 g - Talc 0,010 g
- Stéarate de magnésium 0,005 g
B- VOIE TOPIQUE
(a) Onguent
- Ro 48-8071 0,300 g
- Vaseline blanche codex qsp 100 g
(b) Lotion
- Ro 48-8071 0,100 g
- Polyéthylène glycol (PEG 400) 69,900 g
- Ethanol à 95% 30,000 g

Claims

REVENDICATIONS
1 . Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la lanostérol synthétase (LSS) ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine lanostérol synthétase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine lanostérol synthétase, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine lanostérol synthétase, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour la lanostérol synthétase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la lanostérol synthétase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes.
7. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue, codant pour la lanostérol synthétase.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme lanostérol synthétase et un substrat de l'enzyme, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique.
1 1. Méthode selon la revendication 10, dans laquelle la détermination de l'activité enzymatique comprend la détermination de l'activité synthétase par extraction des stérols produits et analyse chromatographique.
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