EP2046979A2 - Modulateurs de elovl5 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée - Google Patents

Modulateurs de elovl5 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée

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Publication number
EP2046979A2
EP2046979A2 EP07823604A EP07823604A EP2046979A2 EP 2046979 A2 EP2046979 A2 EP 2046979A2 EP 07823604 A EP07823604 A EP 07823604A EP 07823604 A EP07823604 A EP 07823604A EP 2046979 A2 EP2046979 A2 EP 2046979A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
expression
gene
activity
elovl5
acne
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07823604A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Fernand Labrie
Mohamed El-Alfy
Ezequiel L. Calvo
Pascal Collette
Michel Rivier
Sophie Deret
Van Luu-The
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
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Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2046979A2 publication Critical patent/EP2046979A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
    • G01N2333/91051—Acyltransferases other than aminoacyltransferases (general) (2.3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of modulating compounds of EL0VL5 for the treatment of acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
  • Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum.
  • a level of sebum greater than 200 ⁇ g / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin.
  • Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture.
  • the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions. This stimulation of sebaceous gland production is induced by androgens.
  • Acne is, in fact, a chronic disease of the pilosebaceous follicle under hormonal dependence.
  • a hormonal therapy against acne is a possibility of treatment for women, the goal being to oppose the effects of androgens on the sebaceous gland.
  • estrogens, anti-androgens, or agents that decrease the production of androgens by the ovaries or the adrenal gland are generally used.
  • Antiandrogens used for the treatment of acne include spironolactone, cyproterone acetate, and flutamide. However, these agents have potentially severe side effects. Thus, any pregnancy must be absolutely prevented, particularly because of a risk of feminization for the male fetus. These agents are prohibited in male patients.
  • the Applicant has now discovered that the ELOVL5 gene encoding a fatty acid-CoA elongase, is expressed in the human sebaceous glands, and that its expression is regulated by androgens, in vivo, in a mouse preputial gland model. It therefore proposes to target the ELOVL5 gene or its expression product, to prevent and / or improve acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea, especially the appearance of oily skin.
  • acne we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
  • the Applicant also proposes in vitro diagnostic methods or in vitro prognosis, based on the detection of the level of expression or activity of the enzyme EL0VL5.
  • the enzyme ELOVL5 belongs to the family of enzymes ELOVL (for "Elongation of very long chain fatty acids") which comprises 5 members identified to date in humans. Recently, the gene coding for the ELOVL 3 enzyme has been studied and it has been shown that the expression product of the EL0VL3 gene (mRNA) is found more particularly in the sebaceous glands of the skin and in the epithelial cells of the hair follicles ( Westerberg et al J. Bio Chem., 2004, 279 vol 7, 5621-5629). EL0VL3, however, does not show significant sequence homology with EL0VL5.
  • mRNA the expression product of the EL0VL3 gene
  • EL0VL5 gene or "EL0VL5 nucleic acid” means the gene or nucleic acid sequence that encodes EL0VL5. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention can also use cells expressing a heterologous EL0VL5, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid encoding the enzyme.
  • a human cDNA sequence of EL0VL5 is reproduced in the appendix (SEQ ID No.1). It is the NM021814.3 sequence whose coding portion is from nucleic acid 337 to 1236.
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or the activity of the EL0VL5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by an assay of this protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the EL0VL5 gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of the activity of the EL0VL5 protein can also be envisaged.
  • control is a "healthy” subject.
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ).
  • This measurement of the difference in the expression or the activity of the ELOVL5 notably makes it possible to monitor the efficacy of a treatment, in particular a treatment with a modulator of EL0VL5, as envisaged above or by another treatment. against acne or a skin disorder associated with a hyperseborrhea.
  • follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing the expression or activity of the subject.
  • the expression can be determined by an assay of the ELOVL5 protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the ELOVL5 gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • a dosage of the activity of ELOVL5 can also be envisaged.
  • the subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne.
  • the subject "control” in this method means a "healthy" reference subject or population.
  • the detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum. Screening methods
  • Another subject of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the determination of the capacity of a compound modulating the expression or the activity of EL0VL5 or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • the method therefore makes it possible to select compounds capable of modulating the expression or the activity of EL0VL5, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the ELOVL5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d. selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of the ELOVL5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or the mixture treated in b), relative to the untreated sample or mixture.
  • modulation is meant any effect on the expression or the activity of the enzyme, on the expression of its gene or on the activity of at least one of its promoters, which may be a stimulation, but preferably a partial or complete inhibition.
  • the compounds tested in step d) above preferably inhibit the expression or the activity of the ELOVL5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • the difference in expression obtained with the test compound compared to a control carried out in the absence of the compound is significant from 25% or more.
  • expression of a protein means the amount of that protein;
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the ELOVL5 gene, and step c) described above consists in measuring the expression of said gene. reporter.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or its activity is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescent techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the gene coding for ELOVL5, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the ELOVL5 gene endogenously, such as for example a liver cell, an ovarian cell, or more preferably a sebocyte. Organs can also be used of human or animal origin, such as the preputial gland, clitoral, or the sebaceous gland of the skin.
  • EL0VL5 preferably human, or mammalian.
  • a wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to man. of the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • expression of the EL0VL5 gene can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its translation rate.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium.
  • RNA RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-EL0VL5 antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire enzyme.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general).
  • the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of a hydrolyzate
  • HPLC nano-HPLC
  • step a) described above consists in preparing reaction mixtures each comprising an enzyme EL0VL5 and a substrate of the enzyme, and step c) described above consists in measuring the enzymatic activity.
  • the EL0VL5 enzyme can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • the determination of the enzyme activity preferably comprises the determination of the synthetase activity via the use of radioactive precursors and the synthesis of radioactive products.
  • the enzyme EL0VL5 is incubated in a reaction medium (0.25 ml total) containing 100 ⁇ M of Tris-HCl, pH 7.4, 60 ⁇ M of palmitoyl CoA, 500 ⁇ M NADPH, and 30 ⁇ g of enzyme. After 2 minutes of preincubation at 37 ° C., the reaction is initiated by the addition of 60 ⁇ M of malonyl-CoA (containing 0.037 ⁇ Ci of [2- 14 C] malonyl-CoA) and left for 5 minutes at 37 ° C. Incubation is terminated by the addition of 0.5ml of 15% KOH methanol and saponified at 65 ⁇ O for 45 minutes.
  • the samples are then cooled and acidified with 0.5 ml of ice cold 5N HCl.
  • the free fatty acids are extracted from the mixture three times with 1 ml of hexane.
  • the fractions extracted with hexane are dried under vacuum, and after addition of 3 ml of scintillant, the incorporated radioactivity is counted.
  • the controls are carried out in parallel by incubation without the enzyme.
  • the subject of the invention is also the use of a modulator of the human enzyme EL0VL5 that can be obtained according to one of the methods described above for the preparation of a medicament intended for preventive and / or curative treatment. acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • a method of preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea comprising administering a therapeutically effective amount of a modulator of the human enzyme ELOVL5, to a patient in need of such treatment.
  • the invention finally relates to the cosmetic use of a modulator of the human enzyme EL0VL5, for the aesthetic treatment of oily skin.
  • the modulator is an inhibitor of the enzyme.
  • inhibitor refers to a compound or a chemical substance that substantially eliminates or reduces the enzymatic activity of EL0VL5.
  • substantially means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%. More particularly, it may be a compound which interacts with and blocks the catalytic site of the enzyme (irreversibly or irreversibly) as compounds of the competitive inhibitor type.
  • a preferred inhibitor interacts with the enzyme in solution at inhibitor concentrations of less than 1 ⁇ M, preferably less than 0.1 ⁇ M, more preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the modulator compound may be an anti-EL0VL5 inhibitory antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 ⁇ g per ml to about 100 ⁇ g / ml, preferably from about 1 ⁇ g per ml to about 5 ⁇ g / ml.
  • the modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
  • PNA Peptide nucleic acid
  • the modulating compounds are formulated within a pharmaceutical composition, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • These compositions may be administered, for example, orally, enterally, parenterally, or topically.
  • the pharmaceutical composition is applied topically.
  • the pharmaceutical composition can be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymers for controlled release.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It can also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a modulator content of EL0VL5 ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • osmotic pressure modifying agents emulsifying agents
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figures 1A, 1B and 1C show the expression of ELOVL5 in the sebaceous gland of mouse skin and in the mouse preputial gland by in situ hybridization.
  • Figure 1A in conventional illumination and darkfield illumination is a photograph of a mouse skin section subjected to in situ hybridization using a sense probe of ELOVL5
  • Figure 1B in conventional lighting and dark field illumination is a photograph of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 44). The figure
  • Figures 2A, 2B and 2C show the expression of EL0VL5 in the mouse preputial gland by in situ hybridization.
  • Figure 2A is a photograph in conventional illumination and dark-field illumination of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with a sense probe of ELOVL5 (negative control, animal 43).
  • Figure 2B is a photograph in conventional illumination and darkfield illumination of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 43).
  • Figure 2C is a dark-field illumination photograph of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe in a gonadectomized animal (animal 53).
  • Figures 3A and 3B are graphs that show the extent of expression of the ELOVL5 gene in gonadectomized and vehicle-treated mice, DHT, DHEA or DHEA-Flutamide combination for a period of 7 days once per day (long-term treatment).
  • the results obtained by the Affymetrix technique (FIG. 3A) were confirmed by the RT-PCR technique in real time (FIG. 3B).
  • GDX gonadectomized and vehicle-treated mice
  • DHT gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist)
  • DHEA mice gonadectomized and treated with Dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in preputial glands metabolized to active androgen)
  • DHEA-FIu gonadectomized mice and treated with a combination of Dihydroepiandrosterone and Flutamide (Androgen receptor antagonists, which block the effects DHT and DHEA agonists).
  • Level of expression level of expression of mRNA
  • RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis.
  • RNA expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company.
  • Affymetrix station microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer
  • the total RNA isolated from the tissues is transcribed into cDNA.
  • biotin-labeled cRNA is synthesized using T7 polymerase and a precursor NTP conjugated to biotin.
  • the cRNAs are then fragmented into small fragments. All molecular biology steps are controlled using Agilent's "Lab on a chip" system to confirm the good efficiencies of the enzyme reactions.
  • the Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated cRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After washes, the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the significance of the value obtained. The calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match") versus an oligonucleotide that contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide (see Table 1).
  • Table 1 Measurement of the expression of ELOVL5 in the epidermis and in the human sebaceous gland via the use of the affymetrix flea technology.
  • ELOVL5 is well expressed in both tissues (sebaceous gland, epidermis).
  • the differential analysis between the expression in the human sebaceous gland and the human epidermis shows that the slightly stronger expression in the sebaceous gland does not reach any significance with respect to the value observed in the epidermis (Table 1). .
  • Sense and antisense probes were prepared from the ELOVL5 gene by incubation of the linearized gene (2 ⁇ g) with 63 ⁇ Ci of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of T7 RNA polymerase or T3.
  • In situ hybridization was performed on formaldehyde-fixed mouse tissue wrapped in paraffin. Sections (4 .mu.m wide) were then deparaffinized in toluene and rehydrated with an alcohol gradient. After drying, the different sections were incubated in prehybridization buffer for two hours.
  • Hybridization took place over night in hybridization buffer (prehybridization buffer with DTT and 1 Omm 2X10 6 cpm RNA / .mu.l 35 Smarqué) 53 O.
  • the excess probe was removed and the sections were slanted in an LM1 emulsion (Amersham Biosciences, UK) and exposed in the dark at 4 ° C for at least one month.
  • the sections were then grown and counter stained with hematoxylin and eosin. Hybridization with the sense probe was used as a negative control and only background was detected. These probes were incubated with histological sections of mouse skin or mouse preputial gland.
  • Figure 1 A shows a very strong marking of the sebaceous gland, visible by accumulation of silver grains.
  • Figure 1C also shows a marking of the sebaceous gland.
  • ELOVL5 is well expressed in the basal layers of the sebaceous glands of mouse skin.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland.
  • Figure 2A does not show a mark at the level of the preputial gland which is in agreement with the expectations of the researchers because it corresponds to the negative control.
  • Figure 2B shows a strong labeling of the mouse preputial gland in a normal animal.
  • Figure 2C shows a very strong marking of acini of the preputial gland in a gonadectomized animal.
  • ELOVL5 is expressed in ( Figure 2B) the mouse preputial gland.
  • Figure 2B An analysis of several histological sections from 4 control animals and 4 gonadectomized animals indicates a slightly stronger expression in the preputial glands of the intact animals ( Figure 2B and 2C).

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de ELOVL5 ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de cette enzyme pour le traitement de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de ces pathologies.

Description

Modulateurs de ELOVL5 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de EL0VL5 pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200μg/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnés en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le fœtus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits.
La demanderesse a maintenant découvert que le gène ELOVL5 codant pour une élongase d'acide gras-CoA, était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler le gène ELOVL5 ou son produit d'expression, pour prévenir et/ou améliorer l'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité de l'enzyme EL0VL5.
ELOVL5
L'enzyme ELOVL5 fait partie de la famille des enzymes ELOVL (pour « Elongation of very long chain fatty acids ») qui comprend 5 membres identifié à ce jour chez l'homme. Récemment le gène codant pour l'enzyme ELOVL 3 a été étudié et il a été montré que le produit d'expression du gène EL0VL3 (ARNm) se retrouvait plus particulièrement au niveau des glandes sébacées de la peau et des cellules épithéliales des follicules pileux (Westerberg et al. J. Bio. Chem.,2004, 279 vol 7, 5621 -5629). EL0VL3 ne présente cependant pas d'homologie de séquence significative avec EL0VL5. C'est donc de manière surprenante que les inventeurs ont identifié EL0VL5, et non tant EL0VL3, comme étant impliquée dans les phénomènes d'acné. Dans le contexte de l'invention, le terme « gène EL0VL5 » ou « acide nucléique EL0VL5 » signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la EL0VL5. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une EL0VL5 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme
Une séquence d'ADNc humain de EL0VL5 est reproduite en annexe (SEQ ID No.1 ). Il s'agit de la séquence NM021814.3 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 337 à 1236.
Applications diagnostiques
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine EL0VL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène EL0VL5, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la protéine EL0VL5 peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ». Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié à une hyperséborrhée, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou de l'activité de la ELOVL5 permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la EL0VL5, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine EL0VL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
Là encore, l'expression peut être déterminée par un dosage de la protéine ELOVL5 par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène ELOVL5, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du ELOVL5 peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum. Méthodes de criblage
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la EL0VL5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de la EL0VL5, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par « modulation », on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, sur l'expression de son gène ou sur l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine ELOVL5, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.
Différents techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de EL0VL5.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène ELOVL5, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour ELOVL5, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène ELOVL5 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour EL0VL5, de préférence humain, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène EL0VL5 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie. Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-EL0VL5 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physicochimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme EL0VL5 et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. L'enzyme EL0VL5 peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.
La détermination de l'activité enzymatique comprend de préférence la détermination de l'activité synthétase via l'utilisation de précurseurs radioactifs et la synthèse de produits radioactifs.
Des dosages de l'activité enzymatique de EL0VL5 sont décrits dans la littérature (voir par exemple Westerberg et al. J. Bio. Chem.,2004, 279 vol 7, 5621 -5629 ou Matsuzaka et al. J Lip Re,2002, 43, 91 1 -920).
A titre d'exemple, l'enzyme EL0VL5 est incubée dans un milieu réactionnel (0.25ml total) contenant 100μM de Tris-HCL, pH 7.4, 60μM de palmitoyl CoA, 500μM NADPH, et 30μg d'enzyme. Après 2 minutes de préincubation à 37°C, la réaction est initiée par l'ajout de 60μM de malonyl-CoA (contenant 0.037μCi de [2-14C] malonyl-CoA) et laissée pendant 5 minutes à 37^. L'incubation est terminée par l'ajout de 0.5ml de 15% KOH méthanol et saponifiée à 65 <O pendant 45 minutes. Les échantillons sont ensuite refroidis et acidifiés avec 0.5ml de 5N HCI glacé. Les acides gras libres sont extraits du mélange trois fois avec 1 ml d'hexane. Les fractions extraites avec l'hexane sont séchées sous vide, et après addition de 3 ml de scintillant, la radioactivité incorporée est comptée. Les contrôles sont réalisés en parallèle par incubation sans l'enzyme.
Modulateurs de l'enzyme
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine EL0VL5 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine ELOVL5, à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine EL0VL5, pour le traitement esthétique des peaux grasses.
De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme « inhibiteur » se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de EL0VL5. Le terme « substantiellement » signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme (de manière irréversible ou non), comme des composés du type inhibiteur compétitif.
Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 μM, de préférence moins de 0,1 μM, de préférence encore moins de 0,01 μM. Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-EL0VL5, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 μg par ml à environ 100μg/ml, de préférence d'environ 1 μg par ml à environ 5μg/ml. Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la EL0VL5 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Légende des figures :
Les Figures 1A, 1 B et 1 C montrent l'expression de ELOVL5 dans la glande sébacée de la peau de souris et dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 1A en éclairage classique et en éclairage à fond noir est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde sens de ELOVL5
(contrôle négatif; animal 44, gonadectomisé). La Figure 1 B en éclairage classique et en éclairage à fond noir est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 44). La Figure
1 C en éclairage classique est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53).
Les Figures 2A, 2B et 2C montrent l'expression de EL0VL5 dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 2A est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde sens de ELOVL5 (contrôle négatif; animal 43). La Figure 2B est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 43). La Figure 2C est une photographie en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53).
Les Figures 3A et 3B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression du gène ELOVL5 chez des souris maies gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique Affymetrix (Figure 3A) ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 3B). GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes)
DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-FIu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagonistes du récepteur aux Androgènes; qui bloquent les effets des agonistes DHT et DHEA). Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de ELOVL5 dans la glande sébacée humaine et dans répiderme humain-
Méthodes : Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidic; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip» d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation (« single mismatch ») dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1 ).
Tableau 1 : mesure de l'expression de ELOVL5 dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine via l'utilisation de la technologie des puces affymetrix.
"Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué présence (=1 ) ou absence (=0).
Résultats: ELOVL5 est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression légèrement plus forte dans la glande sébacée n'atteint pas de significativité par rapport à la valeur observée dans l'épiderme (tableau 1 ).
Exemple 2 : Expression de ELOVL5 dans la glande sébacée de la peau de souris par « hybridation in situ »
Méthodes :
Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du gène ELOVL5 par incubation du gène linéarisé (2μg) avec 63μCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4μm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées par un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 1 OmM DTT et 2X106 cpm ARN/μl 35Smarqué) à 53 'O. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. L'hybridation avec la sonde sens a été utilisée comme témoin négatif et on a uniquement détecté le bruit de fond. Ces sondes ont été incubées avec des coupes histologiques de la peau de souris ou de la glande préputiale de souris. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 1 B et Figure 1 C) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 1 A) utilisé comme contrôle négatif.
Résultats:
On observe sur la Figure 1 A qu'il n'y a pas d'accumulations de grains argentés (pas de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des chercheurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 1 B montre un très fort marquage de la glande sébacée, visible par accumulation de grains argentés. La Figure 1 C montre aussi un marquage de la glande sébacée. ELOVL5 est bien exprimée dans les couches basales des glandes sébacées de la peau de souris. Une analyse fine basée sur l'observation de coupes histologiques obtenues pour 4 animaux intacts et 4 animaux gonadectomisés n'indique pas de fortes différences d'expression entre les glandes sébacées des animaux intacts et les glandes sébacées des animaux gonadectomisés.
Exemple 3 : Expression de ELOVL5 dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ
Méthodes :
Les méthodes utilisées dans cet exemple sont identiques à celles de l'exemple 2.
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée.
Résultats :
La Figure 2A ne montre pas de marquage au niveau de la glande préputiale ce qui est en accord avec les attentes des chercheurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 2B montre un fort marquage de la glande préputiale de souris dans un animal normal. La Figure 2C montre un marquage très fort des acini de la glande préputiale dans un animal gonadéctomisé.
ELOVL5 est exprimée dans (Figure 2B) la glande préputiale de souris. Une analyse de plusieurs coupes histologiques provenant de 4 animaux contrôles et 4 animaux gonadectomisés indique une expression légèrement plus forte dans les glandes préputiales des animaux intacts (Figure 2B et 2C).
En résumé, ces résultats d'hybridation in situ indiquent que l'expression de l'enzyme ELOVL5 augmente dans des conditions caractérisées par un manque de stimulation androgénique (animaux gonadectomisés).
Exemple 4 : Expression de ELOVL5 dans la glande préputiale de souris

Claims

Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.
L'analyse de l'expression de EL0VL5 dans les glandes préputiales de souris a été réalisée dans des conditions de déficiences en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA- Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux Androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques.
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci-dessus (Figure 3A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique de PCR en temps réel (Figure 3B). La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la société Applied Biosystems en utilisant le « 7900HT Séquence Détection System ». L'ARN total isolé des tissus est transcrit (RT) en l'ADNc et celui-ci est amplifié par PCR (Réaction en Chaine par Polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en utilisant des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la quantité d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ.
Résultat: L'ARNm de ELOVL5 est diminué par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la protéine ELOVL5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes.
7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour la ELOVL5.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme ELOVL5 et un substrat de l'enzyme, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique.
REVENDICATIONS
1 . Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la EL0VL5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine EL0VL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5 ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine ELOVL5, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour la protéine ELOVL5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
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