WO2010031980A1 - Modulateurs de lgr5 dans le traitement de l'alopecie - Google Patents

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WO2010031980A1
WO2010031980A1 PCT/FR2009/051771 FR2009051771W WO2010031980A1 WO 2010031980 A1 WO2010031980 A1 WO 2010031980A1 FR 2009051771 W FR2009051771 W FR 2009051771W WO 2010031980 A1 WO2010031980 A1 WO 2010031980A1
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lgr5
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alopecia
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Sandrine Rethore
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Galderma Research & Development
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of LGR5 receptor modulating compounds for the treatment of alopecia. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of this pathology.
  • hair growth is cyclic and comprises three successive phases: the anagen phase, the catagen phase and the telogen phase.
  • Each follicle of the hair thus renews continuously, cyclically and independently to the adjacent follicles (Kligman 1959, Montagna and Parakkal, 1974).
  • the anagen phase or growth phase during which the hair lengthens, lasts several years. This phase recapitulates hair morphogenesis and is divided into 7 different stages (anagen I to anagen VII) (Muller-Rover et al., 2001).
  • the anagen phase is generally reduced to three stages, each grouping several stages: early for stages I-III, anagen medium for stages IV to V and late anagen for stages VI and VII.
  • the catagen phase that follows in the anagen phase is very short and only lasts a few weeks. This phase is divided into 8 different stages (catagene I to catagen VIII) (Muller-Rover et al., 2001). During this phase, the hair undergoes an involution, the follicle atrophies and its dermal implantation appears more and more. higher.
  • the telogen phase which lasts a few months, corresponds to a rest period of the follicle where the hair eventually falls. After this resting phase a new follicle is regenerated, on the spot, and a new cycle begins again. (Montagna and Parakkal, 1974). At every moment, all the hair is not in the same phase at the same time. Thus, of the approximately 150,000 hairs in the hair, only about 10% of them are at rest and will therefore be replaced in a few months according to a specific biological clock for each hair (Montagna, 1974).
  • the hair follicles In mice and other fur mammals, the hair follicles also have a renewal cycle comprising the three phases anagen, catagen and telogen, cut into different stages.
  • the hair cycles of young animals are often "synchronized", that is to say in the same phase of the cycle at the same time within the same anatomical region (Muller-Rover et al., 2001).
  • alopecia The fall or natural loss of hair is a physiological phenomenon that occurs constantly and can be estimated, on average, a few hundred hairs a day for a normal physiological state. However, it happens that the hair cycle can be disrupted and that hair loss accelerates and leads to a temporary or permanent loss of hair called alopecia. Different causes can cause alopecia. There are different types of alopecia, the main forms are:
  • Hereditary androgenetic alopecia is the most common: it is manifested by a decrease in hair volume, even baldness, and affects 70% of men;
  • acute alopecia it can be related to treatment with chemotherapy, stress, important nutritional deficiencies, iron deficiency, hormonal disorders, AIDS, acute irradiation;
  • alopecia which seems to be of autoimmune origin (cell mediation mechanism), which is characterized by an attack in "patch" more or less large and in one or more places.
  • This form of alopecia can reach the whole head and we talk about alopecia Totalis and sometimes the whole body is alopecia Universalis and in this case there is no hair or hair on the whole body .
  • the hair loss is directly related to the hair cycle, the follicle no longer entering the anagen phase, or the anagen phase is not maintained, which implies that the follicle no longer produces hair shaft so more hair. To fight against alopecia, it is therefore necessary to restart the hair cycle by activating the anagen phase.
  • the Applicant has now found that the gene coding for LGR5 was expressed specifically in the keratinocytes of the hair follicle, and that its expression was induced at the time of entry into anagen, in vivo, in a model of induction of entry into anagen by gonadectomy. It therefore proposes to target this gene or its expression product, to prevent or improve the phenomena of alopecia.
  • alopecia is meant all forms of alopecia, namely including androgenetic alopecia, acute or areata.
  • LGR5 gene codes for an orphan receptor coupled to a G.
  • LGR5 protein also called GPR49, HG38, or FEX, is a protein having an extracellular portion made up of 18 units called LRR (leucine-rich repeat) and a part transmembrane.
  • LGR5 gene or "LGR5 nucleic acid” means the gene or nucleic acid sequence that encodes the LGR5 protein. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention may also use cells expressing the LGR5 receptor, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid encoding the receptor.
  • the human nucleic acid sequence (SEQ ID No.1) and the human protein sequence (SEQ ID No.2) of the LGR5 receptor are reproduced in the appendix.
  • LGR5 is a target gene of the Wnt signaling pathway.
  • the Wnt signaling cascade is a pathway involved in cell proliferation and determination.
  • the cytoplasmic ⁇ -catenin protein associates with a destruction complex containing various proteins, axin, GSK-3 ⁇ kinase (Glycogen Synthase Kmase-3 ⁇ ) and APC (Adeomatosis Polyposis CoIi).
  • GSK-3 ⁇ kinase Glycogen Synthase Kmase-3 ⁇
  • APC Adeomatosis Polyposis CoIi
  • the Wnt pathway is involved in the development of integumentary appendages (feathers hair glands) but also plays a role in the short hair cycle
  • LGR5 specific expression of LGR5 in hair keratinocytes and its induction during the entry into anagen suggests that it plays an important role in the homeostasis of the hair follicle.
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the evolution of alopecia in a subject, comprising comparing the expression or the activity of the LGR5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a control subject
  • the expression of the protein can be determined by an assay of this LGR5 protein by an immunohistochemical test or immunoassay (is it the same thing 7 ), for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of LGR5 receptor activity may also be considered.
  • the subject "control" is a "healthy" subject
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of treatment (To).
  • This measurement of the difference in the expression or activity of the LGR5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment.
  • a treatment with a LGR5 receptor modulator as envisaged above or by another treatment against alopecia
  • Such a follow-up can confirm the patient as to the appropriateness, or necessity, to continue this treatment
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining a susceptibility of a subject to develop alopecia, comprising comparing the expression or activity of the LGR5 protein with the expression of its gene. or the activity of at least one of its promoters in a biological sample of a subject relative to a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by an assay of the LGR5 protein, by an immunohistochemical test or immunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the amount corresponding mRNA by any method as described above An assay of LGR5 receptor activity may also be considered
  • the tested subject is here an asymptomatic subject, presenting no hair disorder related to alopecia
  • the subject "control”, in this method, means a subject or a reference population “healthy”
  • the detection of this susceptibility allows the establishment of preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to alopecia
  • the biological sample may test any sample of biological fluid or a sample of a biopsy
  • the sample may nevertheless be a preparation of skin cells obtained by example by hair removal or biopsy
  • Another object of the invention is an in vitro method of c ⁇ blageing candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of alopecia, comprising determining the ability of a compound to modulate the expression or activity of the alopecia.
  • LGR5 receptor or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of alopecia
  • the method thus makes it possible to select the compounds capable of modulate the expression or the activity of the LGR5 receptor, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters
  • the invention relates to an in vitro method for c ⁇ blageing candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of alopecia, comprising the steps of preparing at least two biological samples or reaction mixtures, b placed in contact with each other.
  • one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds c measuring the expression or the activity of the LGR5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in biological samples or reaction mixtures, for the selection of compounds for which a modulation of the expression or the activity of the LGR5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or the mixture treated in b), relative to the untreated sample or mixture
  • “Modulation” means any effect on the level of expression or activity of the LGR5 receptor, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, that is, possibly an inhibition, but preferably stimulation, partial or complete.
  • the compounds tested in step d) above preferably induce the expression or the activity of the LGR5 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the LGR5 gene, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene. reporter.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or of its activity is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescence techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the gene coding for the LGR5 receptor, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the LGR5 gene endogenously, such as for example a liver cell, a prostate cell, or even better a skin cell, hair follicle keratinocytes or fibroblasts. dermal papilla. It is also possible to use organs of human or animal origin, for example hair, or hair follicles of vibrissae.
  • a hetero logue nucleic acid encoding the LGR5 receptor
  • a wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • the expression of the LGR5 gene can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its translation rate.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • detection markers such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin).
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a labeled complementary RNA (for example radioactive or enzymatic) of the messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium.
  • RNA RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded FARN, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected for example by autoradiography or chemiluminescence.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-LGR5 antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, with the aid of the whole protein. The antiserum is removed and then exhausted according to methods known per se to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, among other things, be obtained by the classical method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays, immunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general).
  • the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of a hydrolyzate
  • HPLC nano-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • the LGR5 receptor can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (e.g. E. coli or B. subtilis), yeasts (e.g. Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or SEl.
  • bacteria e.g. E. coli or B. subtilis
  • yeasts e.g. Saccharomyces, Pichia
  • insect cells such as Sf9 or SEl.
  • Modulators of the LGR5 receptor The subject of the invention is also the use of a LGR5 receptor modulator obtainable by one of the methods described above for the preparation of a medicinal product intended for preventive treatment and / or healing of alopecia.
  • a method of preventive and / or curative treatment of alopecia which method comprises administering a therapeutically effective amount of a LGR5 receptor modulator, to a patient in need of such treatment is described.
  • such modulators are activators (or inductors) of the LGR5 receptor.
  • the invention comprises the use of LGR5 receptor-inducing compounds, such as those identified by the screening method described above, for the preventive and / or curative treatment of alopecia.
  • the modulator compounds are formulated in pharmaceutical compositions, in association with a pharmaceutically acceptable carrier. These compositions may be administered, for example, enterally, parenterally, or topically. Preferably, the pharmaceutical composition is applied topically. Orally, the pharmaceutical composition can be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymers for controlled release. Parenterally, the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of the skin, the mucous membranes and the scalp and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels, sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a LGR5 receptor modulator content ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figure 1 illustrates the induction of passage to anagen by ovariectomy.
  • Female mice with dorsal hair follicles in telogen on Day 0 were ovariotomized or non-ovariotomized (control) on day 1 of the study.
  • a skin sample from the back region of the mice was taken on days 0 and 8 of the study.
  • Figure 1A represents a histological section of skin from the dorsal region of a mouse at day 0 of the study.
  • Figure 1B shows a histological section of skin from the dorsal region of an ovariectomized mouse at day 8 of the study.
  • Figure IC shows a histological section of skin from the dorsal region of a control mouse at day 8 of the study. Histological analysis clearly shows that ovariectomy induced passage to anagen ( Figure IB).
  • FIG. 2 is a table which shows the modulation of the expression level of the LGR5 / GPR49 receptor, expressed with respect to Day 0 of the study, in the skin of the dorsal region of ovariectomized mice at day 8 of the study and in the skin of the dorsal region of mouse control (telogen phase skin) at day 8 of the study using Affymetrix chip technology.
  • Female mice with dorsal hair follicles in telogen on Day 0 were ovariotomized on day 1 of the study. Non-ovariectomized mice were kept as a control group.
  • a skin sample from the dorsal region of the mice was taken on days 0 and 8 of the study.
  • RNAs were isolated and gene expression was analyzed by Affymetrix chip technology.
  • Figure 3 shows the expression of the LGR5 / GPR49 receptor in mouse skin in telogen and early anagen by in situ hybridization.
  • Figure 3A is the photograph of the black-field image of a section of telogen mouse skin subjected to in situ hybridization using an LGR5 / GPR49 receptor anti-sense probe, the radioactively labeled histologic structures. by the probe are revealed by the accumulation of luminous points (silver grains).
  • Figure 3B is the photograph of the same section histology of mouse skin in early anagen precoloured with hematoxylin.
  • FIG. 3C is the photograph of the black-field image of a section of mouse skin in early anagen (III) subjected to in situ hybridization using an anti-sense probe of LGR5 / GPR49 receptor, the histological structures radioactively labeled by the probe are revealed by the accumulation of light spots (silver grains)
  • Figure 3D is the photograph of the same section histology of mouse skin in late anagene versus stained with l 'hematoxylin
  • FIG. 4 shows the expression of the LGR5 / GPR49 receptor in the skin of late anagen and catagen mice by in situ hybridization.
  • FIG. 4A is the photograph of the black-field image of a late anagenous sou ⁇ s skin section. subjected to in situ hybridization using an anti sense probe of the LGR5 / GPR49 receptor, the histological structures radioactively labeled by the probe are revealed by the accumulation of light spots (silver grains).
  • Figure 4B is the photograph of the same section. histology of mouse skin in early anagene counter-stained with hematoxylin
  • FIG. 4C is the photograph of the black-field image of a subsea catageneskin skin section subjected to an in situ hybridization using an LGR5 / GPR49 receptor anti-sense probe, the histological structures radioactively labeled by the probe are revealed by the accumulation of light spots (silver grains)
  • Figure 3D is the photograph of the same section histology of mouse skin in late anagene counter-stained with hematoxylin
  • Example 1 Expression of the LGR5 / GPR49 Receptor During OA Entry by Affymetrix Microarray Technology.
  • mice with dorsal hair follicles in telogen were ova ⁇ ectomized or not on day 1 of the study Ova ⁇ ectomy performed during the telogen phase caused within one week Massive entry of hair follicles from the dorsal region into the anagen phase (Chanda, 2000) while the hair follicles of the dorsal region of the control animals are still in
  • RNA isolated from the tissues are transc ⁇ t in cDNA
  • the biotech-labeled cRNAs are synthesized using T7 polymerase and a biotin-conjugated NTP precursor. The cRNAs are then fragmented into small size fragments.
  • the Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated rRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After several washes, the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the presence or absence of the value obtained.
  • the calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match”) versus an oligonucleotide which contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide.
  • the histological analysis shows that the hair follicles of the dorsal region of the skin of the mice are in the telogen phase (IA).
  • IA telogen phase
  • the hair follicles of the dorsal skin region are in early anagenic phase
  • the LGR5 / GPR49 receptor is expressed in the telogen phase and in the anagen phase of the hair cycle. Differential analysis between expression at the telogenic stage at (OJ) and at anagen (ovariectomized J8) shows that the expression of the LGR5 / GPR49 receptor transcripts is induced in early anagen with respect to the telogenic stage, whereas in the control mice , the expression of the LGR5 / GPR49 receptor is not induced compared to the beginning of study.
  • Sense and antisense probes were prepared from the Sox4 transcription factor by incubation of the linearized gene (2 ⁇ g) with 63 ⁇ Ci of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of RNA. T7 or T3 polymerase. In situ hybridization was performed on formaldehyde-fixed mouse tissue wrapped in paraffin. Sections (4 ⁇ m wide) were then deparaffinized in toluene and rehydrated in an alcohol gradient. After drying, the different sections were incubated in a buffer of prehybridization for two hours.
  • Hybridization was carried out overnight in hybridization buffer (prehybridization buffer with 10mM DTT and 2X10 6 cpm RNA / 35 S labeled) at 53 ° C.
  • the excess probe was removed and the sections were slanted in LM1 photographic emulsion (Amersham Biosciences, UK) and exposed in the dark at 4 ° C for at least one month.
  • the sections were then developed and counter-stained with hematoxylin and eosin. Following the incubation in the presence of a photographic emulsion, the histological structures radiolabelled by the probe are revealed (accumulation of silver grains). A specific signal is shown by positive labeling with the antisense probe ( Figure 4B and Figure 5B) and the absence of labeling with the sense probe ( Figure 3A and Figure 4A) used as a negative control.
  • the images (A to B) show hair follicles of mouse back skin in telogen.
  • the images (C to D) show hair follicles of mouse back skin at the beginning of anagen
  • FIG. 3A shows that the LGR5 / GPR49 receptor is specifically expressed at the level of hair follicles in mouse skin to telogen. More particularly, the LGR5 / GPR49 receptor is present in the keratinocytes in contact with the dermal papilla.
  • FIG. 3C shows that the LGR5 / GPR49 receptor is specifically expressed in the hair follicles at the beginning of anagen in the keratinocytes that will form the new hair follicle
  • the images (A to B) show hair follicles of late-anagenous mouse back skin.
  • the images (C to D) show hair follicles of catagenic mouse back skin.
  • Figure 3A shows that the LGR5 / GPR49 receptor is specifically expressed in the outer epithelial sheath of the hair follicles in late anagenous mouse skin.
  • Figure 3C shows that the LGR5 / GPR49 receptor is specifically expressed in hair follicles in early catagen.
  • Example 1 shows that the LGR5 / GPR49 receptor is expressed in the skin and induced during anagen entry.
  • Example 2 emphasizes that the LGR5 gene is specifically expressed in keratinocytes of hair follicles at different stages of the hair cycle.

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Abstract

L'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur LGR5, ainsi que l'utilisation de modulateurs de l'expression ou de l'activité de ce récepteur pour le traitement de l'alopécie. L'invention concerne aussi des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro de cette pathologie.

Description

Modulateurs de LGR5 dans le traitement de l'alopécie
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs du récepteur LGR5, pour le traitement de l'alopécie. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de cette pathologie.
Chez l'être humain, la croissance des cheveux est cyclique et comporte trois phases successives : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène. Chaque follicule de la chevelure se renouvelle donc en permanence, de façon cyclique et indépendante aux follicules adjacents (Kligman 1959, Montagna et Parakkal, 1974). La phase anagène ou phase de croissance, au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs années. Cette phase récapitule la morphogenèse du cheveux et est divisée en 7 différentes stades (anagène I à anagène VII) (Muller-Rover et col., 2001). Pour simplifier, la phase anagène est généralement réduite à trois étapes qui regroupent chacune plusieurs stades : précoce pour les étapes I-III, milieu d'anagène pour les étapes IV à V et anagène tardive pour les étapes VI et VIL La phase catagène qui succède à la phase anagène est très courte et ne dure que quelques semaines. Cette phase est divisée en 8 différentes stades (catagène I à catagène VIII) (Muller- Rover et col., 2001) Au cours de cette phase, le cheveu subit une involution, le follicule s'atrophie et son implantation dermique apparaît de plus en plus haute. La phase télogène, qui dure quelques mois, correspond à une période de repos du follicule où le cheveu finit par tomber. Après cette phase de repos un nouveau follicule est régénéré, sur place, et un nouveau cycle recommence. (Montagna et Parakkal, 1974). A chaque instant, tous les cheveux ne sont pas dans la même phase au même moment. Ainsi, sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, seuls 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplacés en quelques mois selon une horloge biologique propre à chaque cheveu (Montagna, 1974).
Chez la souris et les autres mammifères à fourrures, les follicules pileux possèdent également un cycle de renouvellement comportant les trois phases anagène, catagène et télogène, découpées en différents stades. Par contre, les cycles pilaires des jeunes animaux sont souvent « synchronisés », c'est-à-dire dans la même phase du cycle au même moment au sein d'une même région anatomique (Muller-Rover et col., 2001).
La chute ou perte naturelle des cheveux est un phénomène physiologique qui se produit en permanence et peut être estimée, en moyenne, à quelques cent cheveux par jour pour un état physiologique normal. Cependant, il arrive que le cycle pilaire puisse se dérégler et que la chute des cheveux s'accélère et conduise à une perte temporaire ou définitive des cheveux appelée alopécie. Différentes causes peuvent être à l'origine d'une alopécie. II existe différentes types d'alopécie, les formes principales sont :
• l'alopécie androgénétique héréditaire est la plus fréquente : elle se manifeste par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes ;
• l'alopécie aiguë : elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, au sida, une irradiation aiguë ;
• l'alopécie Areata qui semble être d'origine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits. Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête et on parle d'alopécie Totalis et parfois l'ensemble du corps c'est l'alopécie Universalis et dans ce cas il n'y a plus aucun poil ni cheveu sur l'ensemble du corps.
Dans tous ces trois cas, la chute des cheveux est en relation directe avec le cycle pilaire, le follicule n'entrant plus dans la phase anagène, ou la phase anagène n'étant pas maintenue, ce qui implique que le follicule ne produit plus de tige pilaire donc plus de cheveux. Pour lutter contre l'alopécie, il est donc nécessaire de relancer le cycle pilaire en activant la phase anagène.
On recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique, des compositions permettant de supprimer ou de réduire l'alopécie, et notamment d'induire ou de stimuler l'entrée en phase anagène ou la croissance des cheveux.
La demanderesse a maintenant trouvé que le gène codant pour LGR5 était exprimé spécifiquement dans les kératinocytes du follicule pileux, et que son expression était induite au moment de l'entrée en anagène, in vivo, dans un modèle d'induction de l'entrée en anagène par gonadectomie. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'alopécie.
Par alopécie, on entend toutes les formes d'alopécie, à savoir notamment les alopécies androgénétiques, aiguë ou areata.
LGR5
Le gène LGR5 code pour un récepteur orphelin couplé à une protéine G. LGR5 aussi appelé GPR49, HG38, ou FEX, est une protéine ayant une partie extra-cellulaire constituée de 18 unités dites LRR (Leucine-rich repeat) et d'une partie transmembranaire.
Dans le contexte de l'invention, le terme « gène LGR5 » ou « acide nucléique LGR5 » signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la protéine LGR5. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant le récepteur LGR5, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour le récepteur. La séquence nucléique humaine (SEQ ID No.1) et la séquence protéique humaine (SEQ ID No.2) du récepteur LGR5 sont reproduites en annexe.
LGR5 est un gène cible de la voie de signalisation Wnt. La cascade de signalisation Wnt est une voie impliquée dans la prolifération et la détermination cellulaire. En absence de signal Wnt, la protéine cytoplasmique β- caténine s'associe avec un complexe de destruction contenant diverses protéines, l'axine, la kinase GSK-3β (Glycogen Synthase Kmase-3β) et l'APC (Adeomatosis Polyposis CoIi). Par fixation sur ce complexe, la β-caténme est phosphorylee et ubiquitinée, ce qui entraîne sa dégradation. La voie Wnt est impliquée dans le développement des annexes tégumentaires (plumes poils glandes) mais joue également un rôle au court du cycle pilaire L'expression spécifique de LGR5 dans les kératinocytes du poil et son induction au cours de l'entrée en anagène suggère qu'il joue un rôle important dans l'homéostasie du follicule pileux.
Applications diagnostiques
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport a un sujet contrôle L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine LGR5 par un test immunohistochimique ou immunoessai (est-ce la même chose 7), par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du récepteur LGR5 peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain »
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution de l'alopécie, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet a un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du récepteur LGR5, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'alopécie Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5 de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport a un sujet contrôle. La encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine LGR5, par un test îmmunohistochimique ou îmmunoessai, par exemple par dosage ELISA Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut Un dosage de l'activité du récepteur LGR5 peut être également envisage
Le sujet teste est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lie a une alopécie Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine » La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes lies a l' alopécie
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic m vitro, l'échantillon biologique teste peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par epilation de cheveux ou biopsie
Méthodes de criblage
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de cπblage de composes candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l' alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un compose a moduler l'expression ou l'activité du récepteur LGR5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du compose pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie La méthode permet donc de sélectionner les composes capables de moduler l'expression ou l'activité du récepteur LGR5, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de cπblage de composes candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l' alopécie, comprenant les étapes suivantes a préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges reactionnels , b mise en contact d'un des échantillons ou mélanges reactionnels avec un ou plusieurs des composes a tester , c mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges reactionnels , d sélection des composes pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traite en b), par rapport a l'échantillon ou au mélange non traite Par « modulation », on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité du récepteur LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine LGR5, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.
Différentes techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du récepteur LGR5.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène LGR5, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le récepteur LGR5, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène LGR5 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou encore mieux une cellule de la peau, des kératinocytes du follicule pileux ou des fibroblastes de papille dermique. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple des cheveux, ou des follicules pileux de vibrisses.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétéro logue, codant pour le récepteur LGR5, de préférence humaine ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène LGR5 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT- PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (par exemple radioactif ou enzymatique) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de FARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéïnisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par exemple par autoradiographie ou chimioluminescence.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-LGR5 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L' antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Le récepteur LGR5 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos- 7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou SEl .
Modulateurs du récepteur LGR5 L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du récepteur LGR5 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie. II est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du récepteur LGR5, à un patient nécessitant un tel traitement.
De préférence, de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) du récepteur LGR5.
L'invention comprend l'utilisation de composés inducteurs du récepteur LGR5, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur du récepteur LGR5 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B ;
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Légende des figures :
La Figure 1 illustre l'induction du passage en anagène par ovariectomie. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude. Un prélèvement de la peau de la région du dos des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. La Figure IA représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris au jour 0 de l'étude. La Figure IB représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 8 de l'étude. La Figure IC représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris contrôle au jour 8 de l'étude. L'analyse histologique montre clairement que l' ovariectomie a induit le passage en anagène (Figure IB).
La Figure 2 est un tableau qui présente la modulation du niveau d'expression du récepteur LGR5/GPR49, exprimés par rapport au Jour 0 de l'étude, dans la peau de la région dorsale de souris ovariectomisées au jour 8 de l'étude et dans la peau de la région dorsale de souris contrôle (peau en phase télogène) au jour 8 de l'étude par utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie au jour 1 de l'étude. Des souris non ovariectomisées ont été conservées pour servir de groupe contrôle. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été analysée par la technologie des puces Affymetrix.
La Figure 3 montre l'expression du récepteur LGR5/GPR49 dans la peau de souris en télogène et début d' anagène par hybridation in situ. La Figure 3 A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en télogène soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histo logiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène précoce contre-colorée à l'hématoxyline. La Figure 3C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène précoce (III) soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés) La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagene tardive contre colorée a l'hematoxyline
La Figure 4 montre l'expression du récepteur LGR5/GPR49 dans la peau de souris en anagene tardive et catagene par hybridation in situ La Figure 4A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souπs en anagene tardive soumise a une hybπdation in situ utilisant une sonde anti sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés) La Figure 4B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagene précoce contre-coloree a l'hematoxyline
La Figure 4C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souπs en catagene soumise a une hybπdation in situ utilisant une sonde anti-sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés) La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagene tardive contre-coloree a l'hematoxyline
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression du récepteur LGR5/GPR49 au cours de l'entrée en anagene induite par l'ovariectomie par la technologie des puces Affymetrix.
Méthodes :
Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en telogene (Chase, 1954) ont ete ovaπectomisees ou non au jour 1 de l'étude L'ovaπectomie pratiquée pendant la phase telogene provoque sous une semaine une entrée massive des follicules pileux de la région dorsale en phase anagene (Chanda, 2000 ) alors que les follicules pileux de la région dorsale des animaux contrôles sont toujours en telogene
Des prélèvements de peau ont ete réalises dans la région dorsale aux jours 0, 6 et 8 de l'étude Une partie du prélèvement a ete utilise pour confirmer le passage en anagene par analyse histologique L'autre partie du prélèvement a ete utilise pour réaliser une analyse du transcnptome par la technologie des puces Affymetπx L'expression des gènes a ete analysée sur une station Affymetrix (module microfluidique, four a hybπdation, scanner, ordinateur) en suivant les recommandations du fournisseur En résume, les ARN totaux isoles des tissus sont transcπts en ADNc A partir d'ADNc double brin, les ARNc marques a la biotme sont synthétises en utilisant la polymerase T7 et un précurseur NTP conjugue a la biotine Les ARNc sont ensuite fragmentes en fragments de petites tailles Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip » d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec FARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après différents lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la présence ou l'absence de la valeur obtenue. Le calcul de la signifïcativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation,(« single mismatch ») dans la région centrale de l' oligonucléotide.
Résultats: Figure 1 :
En début d'étude au jour 0, l'analyse histo logique montre que les follicules pileux de la région dorsale de la peau des souris sont en phase télogène (IA). Chez les souris soumises à une ovariectomie, les follicules pileux de la région dorsale de peau sont en début de phase anagène
(IB). A l'inverse, les follicules pileux de la région dorsale de peau des souris contrôles (non ovariectomisées) sont restés en phase télogène. Ainsi, l' ovariectomie à induit la transition de la phase télogène à la phase anagène. La phase anagène est avérée par l'analyse histologique au jour 8 de l'étude.
Figure 2 :
Le récepteur LGR5/GPR49 est exprimés en phase télogène et en phase anagène du cycle pilaire. L'analyse différentielle entre l'expression au stade télogène à (JO) et anagène (J8 ovariectomisé) montre que l'expression des transcrits du récepteur LGR5/GPR49 est induite en anagène précoce par rapport au stade télogène, alors que chez les souris contrôles, l'expression du récepteur LGR5/GPR49 n'est pas induite par rapport au début d'étude.
Exemple 2 : Expression du récepteur LGR5/GPR49 dans la peau de souris par « hybridation in situ »
Méthodes :
Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du facteur de transcription Sox4 par incubation du gène linéarisé (2μg) avec 63 μCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4μm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 1OmM DTT et 2X106 cpm ARN/μl 35S marqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion photographique LMl (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre-colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 4B et Figure 5B) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A et Figure 4A) utilisé comme contrôle négatif.
Résultats: Figure 3
Les images (A à B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en télogène. Les images (C à D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en début d'anagène
(stade III). La Figure 3A montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé spécifiquement au niveau des follicules pileux dans la peau de souris en télogène. Plus particulièrement, le récepteur LGR5/GPR49 est présent dans les kératinocytes au contact de la papille dermique.
La Figure 3 C montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé de façon spécifique dans les follicules pileux en début d'anagène au niveau des kératinocytes qui formeront le nouveau follicule pileux
Figure 4
Les images (A à B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en anagène tardive. Les images (C à D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en catagène. La Figure 3A montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé spécifiquement dans la gaine épithéliale externe des follicules pileux dans la peau de souris en anagène tardive. La Figure 3 C montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé de façon spécifique dans les follicules pileux en début catagène.
Conclusion:
L'exemple 1 montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé dans la peau et induit au cours de l'entrée en anagène. L'exemple 2 souligne que le gène LGR5 est exprimé de façon spécifique dans les kératinocytes des follicules pileux aux différents stades du cycle pilaires.
L'ensemble de ces travaux permet de soutenir l'utilisation de modulateurs de l'expression du récepteur LGR5/GPR49 chez l'Homme pour obtenir une stimulation de la croissance des follicules pileux en induisant l'entrée en phase anagène. Egalement, ils soutiennent l'intérêt de l'utilisation du récepteur LGR5/GPR49 pour diagnostiquer ou prognostiquer cette pathologie.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de LGR5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) activent l'expression ou l'activité de la protéine LGR5, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour le récepteur LGR5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le récepteur LGR5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont choisies parmi les kératinocytes et les fibroblastes de la papille dermique ou du derme.
7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétéro logue codant pour le récepteur LGR5.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.
10. Utilisation d'un modulateur du récepteur LGR5 susceptible d'être obtenu selon l'une des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le modulateur est un activateur du récepteur LGR5.
12. Utilisation cosmétique d'un modulateur du récepteur LGR5 pour le traitement esthétique du cuir chevelu.
13. Méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, ou de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
14. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'expression de la protéine est déterminée par un dosage de cette protéine par un immunoessai.
15. Méthode selon la revendication 14, dans laquelle Fimmunoessai est un dosage ELISA.
16. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'expression du gène est déterminée par mesure de la quantité d'ARNm correspondant.
17. Méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine
LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.
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