KR20010043968A - 유전자 치료법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간을 포함하는 포유류의 상처 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편의 용도, 및 그러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간의 전사 인자 Egr-1의 전사 및 그 조절에 관련된 중요 지역을 포함하는 것으로 생각되는 서열에 관한 것이다. 이 서열을 사용하여 상처 치료 및 기타 치료에 사용 가능한 적합한 핵산 분자 및 벡터를 디자인할 수 있다.
Description
본 발명은 상처 치유 및 관련 상태에 사용되는 유전자 치료 기술에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 초기성장응답-1(early growth response-1; Egr-1)을 코딩하는 폴리펩티드를 사용하여 상처의 치료, 상처 치유, 및 당뇨병으로 인한 국소빈혈 및 신경장애로 발생하는 피부 궤양, 말초 동맥 폐색증, 심정맥 혈전증(deep vein thrombosis), 만성 정맥 부전증(chronic venous insufficiency), 욕창의 치료, 예를 들어 백내장 등과 관련된 수술후 상처의 감소, 피부이식 절차, 화상, 건선, 조직 재모델링 및 재생의 가속화; 예를 들어 뼈(bone)과 같은 경조직 복구; 예를 들어 건, 인대, 근육과 같은 연조직 복구, 맥관형성의 촉진, 경피적 경강적 관상 동맥 형성술(percutaneous tran-luminal coronary angioplasty) 후의 재내피세포화, 좌심실 심장 비대증의 억제, 관벽 석화의 조절 및 신경재생성의 촉진과 같은 관련된 상태의 치료하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 용도로는 예를 들어 폐 섬유증 및 간 섬유증과 같은 섬유성 상태의 방지, 및 탈모증의 예방 등이 있다.
본 발명은 또한 Egr-1의 전사 및 이의 조절에 관한 것이기도 하다.
피부 치유에는 광범위한 세포적, 분자적, 생리학적 및 생화학적 사건들이 수반된다. 치료과정 중, 세포들이 상처 부위로 이동하여, 증식하고 상처입지 않은 원래와 유사한 조직을 재구성하기 위하여 세포외 매트릭스 성분들을 합성한다. 이 활성은 상처 주변 세포들이 분비하는, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 상피성장인자(EGF), 형질전환 성장인자(TGF) 베타 및 기타 사이토카인과 같은 매개자에 의해 조절된다. 세포에 미치는 이들 인자들의 유익한 효과들은 생체외 및 생체내적으로 모두 증명되었고[Moulin, Eur. J. Cell Biol. 68; 1-7, 1995에 요약 정리됨], 한 예로 당뇨병에 걸린 쥐 모델에서의 PDGF의 유익한 효과가 있다[Brown et al. J. Surg. Res. 56; 562-570, 1994].
지난 5년에 걸쳐 수많은 성장 인자들이 생체외 실험에서 세포 증식을 가속화하고 동물 모델에서 상처 치유를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. TGF 베타는 세포 증식, 분화 및 매트릭스 생산을 촉진하기 때문에, 상처 복구 관점에서 가장 큰 주목을 받아왔다. 동물 모델에서 국부적으로 또는 계통적으로 투여된 TGF 베타는 각질 상처 회복율을 가속화한다[Ashcroft et al Nature Medicine, 3: 1209-1215, 1997; Sporn and Roberts J. Cell Biol. 119;1017-1021, 1997; Beck et al J. Clin. Invest. 92; 2841-2849, 1993]. 마찬가지로 PDGF도 국소 빈혈 조직 및 당뇨성 동물에게서 상피재형성 및 맥관재형성을 촉진한다고 보고되어 있다[Uhl et al Langenbecks Archiv fur Chirurgie-Supplement-Kongressband 114; 705-708, 1997; Dirks and Bloemers Mol. Biol. Reports 22; 1-24, 1996에 요약정리됨].
전사인자 Egr-1은 30개 이상의 유전자의 잠재적 조절자이고, 성장, 발생 및 분화에 기여한다[Liu et al. Crit. Rev. Oncogenesis 7;101-125, 1996; Khachigian and Collins Circ. Res. 81; 457-461, 1997에 요약 정리됨]. Egr-1은 맥관 내피세포 손상으로 유도되고[예를 들어, Khachigian et al. Science; 271, 1427-1431, 1996], 전사를 활성화시키는 표적은 상피성장인자(EGF), 혈소판 유래 성장인자-A(PDGF-A), 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF), PDGF A, PDGF B, TGF베타, bFGF의 유도, 우로-플라즈미노겐 활성자(u-PA), 조직 인자 및 인슐린유사 성장인자-2(IGF-2)등을 포함하는 다양한 유전자이다.
맥관 내피 성장인자(VEGF) 유도를 매개하는 전사 복합체는 AP2에 의존적이고 Egr-1에 직접 의존적이지는 않다[Gille et al. EMBO J 16; 750-759, 1997]. 그러나, PDGF B는 VEGF 발현을 직접 상향 조절한다[Finkenzeller Oncogene 15; 669-676, 1997]. VEGF mRNA의 전사는 PDGF B, bFGF, 케라티노사이트 성장인자(KGF), EGF, 종양괴사인자(TNF) 알파 및 TGF 베타1을 포함하는 다양한 인자들에 의해 향상된다. VEGF는 벌룬(balloon) 상해 동맥내 재내피세포화(re-endothelialisation)을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 토끼에서 얻은 결과는 맑은(clear) 금속 스텐트(stent)의 VEGF 구동 수동화(passivation)는 인-스텐트(in-stent) 신생-최내부(neo-intima)형성의 억제, 응고성 폐색의 발생율 감소, 인공기구의 재-내피세포화의 가속화 및 혈관운동 활성의 증가를 가져옴을 증명하였다[van Belle, E. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 235; 311-316, 1997; van Belle E. et al. J. Am. Coll. Cardiol., 29; 1371-1379, 1997; Asahara, T., et al, Circulation, 94; 3291-3302, 1997]. 인간에게서 재-내피세포화를 촉진하기 위한 VEGF의 파일럿 연구에 대한 NIH 승인은 1996년 허가되었다. 또한, HGF는 경동맥 손상된 쥐 모델에서 벌룬 혈관확장술 후 재-내피세포화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다[Nakamura et al. Abstract 1681, American Heart Association Meeting; Dallas, 1998]. 동물 모델에서, 금속성 스텐트의 VEGF-구동 수동화는 신생-최내부(neo-intima)형성을 억제하고, 재-내피세포화의 가속화 및 혈관운동 활성의 증가를 가져오는 것으로 밝혀졌다[Asahara et al Circulation; 94, 3291-3302].
VEGF 발현은 상처 및 건선 피부 치유에서 보고되어 왔는데, 이 두 상태는 모두 TGF 알파 및 그 리간드인 EGF 수용체(EGFr)가 모두 상향 조절된다. EGF의 발현은 Egr-1을 유도한다[Iwami et al. Am. J. Physiol. 270; H2100-2107, 1996; Fang et al. Calcified Tissue International 57; 450-455, 1995; J. Neuroscience Res. 36; 58-65, 1993]. 현재, 포볼 에스테르 자극된 B-림프구[Maltzman et al Mol. Cell. Bio. 16; 2283-2294, 1996]에서 Egr-1이 세포간 결합 분자-1(ICAM-1)의 발현을 활성화시킬 수 있고, TNF 알파 프로모터내에 Egr-1 결합 자리의 존재로 인하여[Kramer et al Biochim. Biophys. Acta 1219; 413-421, 1994] TNF 알파의 발현을 촉진할 수 있다는 발표되지 않은 증거들이 있다. 마지막으로, Egr-1 녹아웃 생쥐는 생식능을 상실하고 황체 형성 호르몬(LH)을 결핍하고 있는데(Lee et al, Science 273; 1219-1221, 1996) 이는 LH 프로모터도 Egr-1 활성화에 대한 표적인 것을 의미한다.
골조직 로딩(bone loading), 유사골아세포 MC3T3E1세포들의 기계적 신장 및 유체 흐름 (fluid flow)은 Egr-1을 유도하고 곧이어 성장 인자들의 활성화를 유도한다[Dolce et al Archs. Oral Biol. 41; 1101-1118, 1996; Ogata J. Cell Physiol. 170; 27-34, 1997]. Egr-1의 발현은 발생중 생쥐의 연골조직 및 골조직에서 우세하고[McMahon et al. Development 108; 281-287], 골아세포의 성장 및 분화의 조절에 관여해 왔다[Chauhary et al Mol. Cell. Biochem. 156; 69-77, 1996]. Egr-1 및 매우 관련된 징크핑거 전사 인자인 윌름 종양1(Wilm's Tumour 1)은 골거대세포 종양화(osteoclastogenesis)에 관여하여 왔고[Kukita et al Endocrinology 138; 4384-4389, 1997], 프로스타시클린 E2(PGE2) 및 EGF가 모두 Egr-1에 의해 유도된다 [Fang et al Calcified Tissue International 57; 450-455, 1995; Fang et al Prostogladins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 54; 109-114, 1996]. 맥관 석화(calcification)은 골조직 형성과 유사하게 골조직 대사의 조절에 중요한 것으로 알려진 세포들 및 인자들이 관여하는 능동적으로 조절되는 과정이다[Dermer et al Trends Cardiovasc. Med. 4; 45-49, 1994에 요약 정리됨]. 골아세포생성 및(또는) 골거대세포종양화의 조절자들은 관벽 석화의 정도를 조절할 수도 있다.
헤모다이나믹 로드(haemodynamic load) 및 안지오텐신II와 같은 과도한 자극을 사용하여 근세포 특이 프로모터의 조절하에 egr-1 우성 음성의 생성을 가져와 심부전증의 치료에 사용될 수도 있다.
Egr-1은 p75 신경 성장 인자(NGF)수용체의 쉬반 세포 발현에 필수적이다[Nikam et al Mol Cell. Neurosciences 6; 337-348, 1995]. NGF는 Egr-1의 발현 및 동시적인 성장 인자들을 유도한다[Kendall et al Brain Research. Molecular Brain Research . 25; 73-79, 1994; Kujubu et al Journal of Neuroscience Research 36; 58-65, 1993].
본 발명에서는 상처 부위에 전사 인자 Egr-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여 및 후속하는 이의 발현이 치유를 가속화한다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 제1 측면에서는, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드를 암호화하는 서열 및 생물학적으로 활성인 이의 단편을 포함하는 핵산 분자의, 인간을 포함하는 포유동물의 상처 치료를 위한 의약 제조에의 용도를 제공한다.
의심을 피하는 의미에서, 폴리뉴클레오티드에 대한 지칭은 핵산분자에 대한 것과 등가적이다.
본 발명의 제2 측면에서는, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드를 코딩하는 서열 및 생물학적으로 활성인 이의 단편을 포함하는 핵산 분자의 포유동물에의 투여를 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물에서의 상처 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 측면에서는, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드를 코딩하는 서열 및 생물학적으로 활성인 이의 단편을 포함하는 핵산 분자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다.
제4 측면에서는, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 생물학적으로 활성인 이의 단편과 함께 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약조성물을 제공한다.
따라서 본 발명은 Egr-1 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상처 치료에의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이하 상술하는 바와 같이, Egr-1 전사 인자 자체의 상처 치료에의 치료적 용도에 관계되기도 한다.
본 발명은 모든 기원의 또는 모든 종으로부터의 Egr-1 폴리펩티드 및 Egr-1을 코딩하는 핵산 서열의 사용도 관계있다. 단백질 서열은 예를 들어, 랫와 생쥐 사이에 98% 상동성을 가질 정도로 종간에 매우 보존적이다. 쥐과 Egr-1 DNA는 공지이다[Cell, 53 37-43(1988)], 연역된 아미노산 서열은 위치 1858에서 정지 코돈(TAA)를 갖는 하나의 긴 개방 독출 프레임을 보인다. 연역된 아미노산 서열은 분자량 56,596을 갖는 533개 아미노산의 폴리펩티드를 예상하게 한다. 다른 종으로부터의 상응하는 서열은 당업계에 공지인 방법, 예를 들어 쥐과 Egr-1 서열로부터 얻어진 또는 이로부터 유도된 올리고뉴클레오티드 서열 프로브를 이용하여 유전체 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 인간 Egr-1은 5번 염색체, 더욱 정확히는 5q23-31에 위치하는 것으로 알려졌다[Cell 53, 37-43]. 인간 Egr-1 cDNA의 서열은 문헌[Nucleic Acid Research 18 p4283, 1990]에 기재되어 있다. 쥐와 인간 사이의 뉴클레오시드 및 단백질 서열의 상동성은 각각 87% 및 94%이다.
이하 본 발명에서 기술된 Egr-1 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 대한 지칭은 문헌[Cell, 53, 37-43(1988)]에 공개된 쥐과 Egr-1 DNA 및 상응하는 아미노산 서열 및 문헌[Nucleic Acids Research 18 p4283, 1990]에 공개된 인간 서열 뿐만 아니라, 다른 종으로부터의 서열도 포함하는 임의의 기원의 서열에 일반적으로 적용가능하다. 하기에서 Egr-1이란 용어는 Egr-1의 변이체, 단편 및 유사체를 또한 포함한다. 가장 바람직하게는 인간 서열이 사용된다.
하기 예시적인 설명들은 본문에 사용된 특정 용어들의 이해를 용이하게 하기 위하여 제공된다. 이 설명은 편의를 위하여 제공된 것이지 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
"상처의 치료"란 상처(wounds)와 관련된 상태의 치료, 상처 치유 및 관련된 상태 및 조직의 치유를 촉진, 증가 또는 가속화하는 치료 및, 당뇨병 및 말초 혈관 폐색성 질환에서 지절(limb) 궤양의 치료 및 수술후 상처, 화상, 건선, 조직 재모델링의 가속화 및 골 복구 및 맥관형성의 촉진, 경피 경강 관상 혈관확장술 후 재-내피세포화, 좌심실 심장 비후증의 억제, 관벽 석화의 조절 및 신경재생성의 촉진을 포함한다. 또한, 섬유성 상태, 예를 들어, 폐 및 간 섬유증의 억제 및 탈모증의 예방을 더 포함한다.
본문에서 Egr-1의 "생물학적으로 활성인 단편"이란, 본 발명에 따른 상처 치유 특성을 포함하는 Egr-1 활성을 갖는 단편이다.
"유전자 엘리먼트"란, 일반적으로 폴리펩티드를 코딩하는 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 복제, 전사 또는 번역 또는 기타 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현에 중요한 과정을 조절하는 폴리뉴클레오티드 부위, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 부위 및 이에 작동가능하게 연결된 발현을 조절하는 부위를 모두 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 유전자 엘리먼트는 에피좀 엘리먼트로서 복제되는, 즉 숙주 세포 유전체와는 물리적으로 독립적인 분자로서 복제되는 벡터내에 포함될 수도 있다. 이들은 플라스미드내에 포함될 수도 있다. 유전자 엘리먼트는 숙주세포의 유전체내에, 이들의 천연 상태가 아니라, 단리, 클로닝 및 정제된 DNA 또는 벡터 등의 형태로 숙주 세포내로의 도입과 같은 조작 후 숙주세포의 유전체내에 포함될 수도 있다.
"숙주 세포"란 형질전환된 또는 형질감염된 세포 또는 외부 폴리뉴클레오티드 서열로 형질감염 또는 형질전환될 수 있는 세포를 의미한다.
"상동성(identity)"이란, 당업계에 공지인 바와 같이, 서열 비교에 의해 결정되는 바와 같은, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, 상동성은 사건마다 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 일치도로 결정되는 서열 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 연관도를 의미한다. 상동성은 쉽계 계산할 수 있다[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Ananlysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molucular BIology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]. 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 서열 사이의 상동성을 측정하는 수많은 방법들이 존재하고, 상동성이란 용어는 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있다[Sequence Analysis in Molucular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1998)]. 서열간의 상동성을 측정하기 위하여 일반적으로 사용되는 방법들은 카릴로 및 립만[Carillo, H., 및 Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1998)]에 개시된 것을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 상동성을 측정하는 바람직한 방법은 검사하는 서열 사이에 최대의 일치도를 부여하도록 설계된다. 상동성 측정방법들은 컴퓨터 프로그램에 코드화된다. 두 서열 사이의 상동성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램은, GCG 프로그램 패키지[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)], BLASTP, BLASTN, 및 FASTA[Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403(1990)]를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
"단리된"이란 그 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경됨을 의미한다. 즉, 자연상태에서 생성된다면, 이를 그 원래 환경으로부터 변화시키거나 또는 제거한 것, 아니면 그 모두를 거치는 것을 의미한다. 예를 들어, 천연상태에서 생물체내에 자연적으로 존재하는 자연 생성적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그 천연 상태에서 공존하는 물질들로부터 격리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 본 발명에서 정의된 단리된 것이다. 단리의 일부로서 또는 그 후속으로서 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 돌연변이화, 융합 단백질의 형성 및 숙주내 전파 또는 숙주내에서의 발현을 위하여 DNA와 같은 다른 폴리뉴클레오티드와 결합될 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드는, 이 자체로 또는 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 벡터의 형태내로의 결합으로 숙주 세포내, 배양물 또는 전체 유기체내로 도입될 수 있다. 배지중 또는 전체 유기체내 숙주 세포에 도입된 후 이러한 DNA는 여전히 본 발명에서 정의된 단리된 것일 것이다. 왜냐하면, 이들은 천연적으로 생성된 형태로 있지 않거나 천연적으로 생성되는 조성물이 아닌 환경에 있고, 여기서는 본 발명에서 사용된 정의의 의미내에서 단리된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로 남아있기 때문이다.
"폴리뉴클레오티드"란, 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미하고,이는 비개질된 RNA 또는 DNA 또는 개질된 RNA 또는 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본문에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 무엇보다도, 단일가닥 및 이중가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 부위들 또는 단일, 이중 및 삼중가닥 부위들의 혼합물인 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 RNA, 및 단일가닥 및 이중가닥 부위들의 혼합물 RNA, 단일가닥이거나 또는 보다 전형적으로 이중가닥 또는 삼중가닥 또는 단일 및 이중가닥 부위의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 의미한다. 또한, 본원에서 폴리뉴클레오티드란 RNA 또는 DNA 또는 DNA 및 RNA 모두를 포함하는 3중가닥 부위를 의미할 수 있다. 상기 부위의 가닥들은 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터의 것일 수 있다. 이 부위들은 하나 이상의 분자들의 전부를 포함하지만, 더욱 전형적으로는 일부 분자들의 부위만을 포함하는 것일 수 있다. 3중 나선 부위의 분자들의 하나는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 본원에서 폴리뉴클레오티드란 상기한 바와 같이 하나 이상의 개질된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 기타 이유로 개질된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도하는 의미의 "폴리뉴클레오티드"이다. 더우기, 본 발명의 두 실시예인, 이노신과 같은 비정상적 염기 또는 트리틸레이티드 염기와 같은 개질된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA들은 본원에서 사용된 의미의 폴리뉴클레오티드이다. 많은 유용한 목적을 위하여 DNA 및 RNA에 다양한 개질을 할 수 있음을 당업계의 숙련가는 이해할 수 있을 것이다. 본원에서 사용된 의미의 용어 폴리뉴클레오티드는 상기 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 개질된 형태의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 특히 단세포 및 복합세포를 포함하는 바이러스 및 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드라고 종종 불리기도 하는 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"폴리펩티드"란, 하기 기술된 바와 같이 모든 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 기본 구조는 잘 알려져 있고, 수많은 교과서 및 간행물에 기재되어 있다. 이러한 문맥에서, 상기 용어는 둘 이상의 아미노산이 펩티드 결합으로 선형 사슬로 서로 연결된 것을 포함하는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 본문에서, 상기 용어는 보통 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라고 사용되는 짧은 사슬에서 부터 당업계에서 일반적으로 단백질이라고 불리는(이중에는 많은 유형들이 있음) 긴 사슬을 지칭한다. 폴리펩티드는 종종 천연적으로 생성되는 20개의 아미노산 이외에 다른 아미노산을 포함하고, 말단 아미노산을 포함하는 많은 아미노산들이 소정의 폴리펩티드내에서 프로세싱 및 기타 번역후 개질과 같은 자연적 과정 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 개질 기술에 의해 개질될 수 있음을 이해할 것이다. 폴리펩티드내에 천연적으로 발생할 수 있는 통상적인 개질이 본문에 열거하기에는 너무 많고 부질으나, 이들은 기본 교과서 및 더욱 상세한 전공논문 뿐만 아니라, 수많은 연구문헌에 잘 기재되어 있고, 이 기술분야의 당업자에게는 잘 알려져 있다.
본 발명에 사용될 폴리펩티드내에 존재할 수 있는 공지된 개질로는, 단지 예시적으로 일부만을 명명하면, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴기의 공유적 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유적 부착, 가교연결, 고리화, 2황결합형성, 디메틸화, 공유적 가교연결의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 가수분해적 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황화, 아르긴화와 같은 t-RNA 매개의 단백질에 아미노산의 첨가, 및 유비퀴틴화 등이 있다. 상기 개질들은 당업계의 숙련가에게는 잘 알려져 있으며, 과학 문헌에 상세히 기재되어 있다. 특히 흔한 개질인, 예를 들어 글리코실화, 지질 부착, 황화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 수산화 및 ADP-리보실화는 대부분의 기본 교과서[예를 들어, Proteins structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Comapany, New York(1993)]에 기재되어 있다. 이 주제에 관하여 상세한 리뷰 논문들이 많이 있다[예를 들어, Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects pgs1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York(1983); Seifter et al., Meth. Ezymol. 182: 626-646(1990) 및 Rattan et al., Protein Synthesis: Posttanslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62(1992)]. 잘 알려져 있고 상기 언급한 바와 같이, 폴리펩티드는 항상 전체적으로 선형은 아님을 이해할 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 일반적으로 번역후 사건의 결과, 자연적 프로세싱 사건 및 자연적으로는 발생하지 않는 인간 조작에 의하여 일어나는 사건들의 결과이다. 원형, 분지쇄 및 분지쇄 원형 폴리펩티드는 비-번역 자연적 과정에 의하거나 전적으로 합성법에 의해서도 합성될 수 있다. 개질은 펩티드 주쇄, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하는 폴리펩티드내 어디에서도 일어날 수 있다. 실제로, 폴리펩티드내 아미노기 또는 카르복실기 또는 둘 다를 공유적 개질로 봉쇄하는 것이 천연적으로 생성되는 폴리펩티드 및 합성 폴리펩티드에서 흔한 것이고, 이러한 개질은 본 발명의 폴리펩티드내에서도 또한 존재할 수 있다. 예를 들어, E. coli 및 기타 세포에서 제조된 폴리펩티드의 아미노 말단 잔기는 단백질분해적 프로세싱 전에는 거의 변함없이 N-포밀화 메티오닌이다. 이 펩티드의 번역후 개질 도중에, NH2-말단의 메티오닌 잔기가 결실될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 단백질의 메티오닌 함유 및 메티오닐 결실의 아미노 말단을 갖는 변이체 모두의 사용을 상정한다. 폴리펩티드 내에 이루어지는 개질은 폴리펩티드가 어떻게 제조되는가에 달려있을 것이다. 예를 들어, 클로닝된 유전자의 숙주 내 발현에 의해 제조되는 폴리펩티드의 경우, 개질의 특성 및 정도는 대부분 숙주 세포의 번역후 개질능력 및 폴리펩티드 아미노산 서열내에 존재하는 개질 신호에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 잘 알려진 바와 같이, 글리코실화는 종종 예를 들어 E.coli와 같은 균주 숙주에서는 일어나지 않을 것이다. 따라서, 글리코실화가 요망된다면, 폴리펩티드를 글리코실화 숙주, 일반적으로 진핵 세포내에서 발현시켜야 한다. 곤충세포는 종종 진핵 포유류 세포에서와 동일한 번역후 글리코실화를 수행하기 때문에, 천연적인 유형의 글리코실화를 갖는 포유류 단백질을 효과적으로 발현시키기 위하여 곤충 세포 발현 시스템을 개발하여 왔다. 다른 개질에 대하여도 동일한 고려가 적용된다. 동일한 유형의 개질이 소정의 폴리펩티드 내에 수개의 부위에서 동일한 정도 또는 다양한 정도로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 소정의 폴리펩티드는 많은 유형의 개질을 포함할 것이다. 일반적으로, 본문에서 사용된 용어, 폴리펩티드는 이러한 개질 모두 특히, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내에 발현시켜 재조합적으로 합성된 폴리펩티드내에 존재하는 개질들을 모두 포함한다.
본 발명에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 "변이체(들)"이란 각각 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와는 상이한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 상기 의미에서의 변이체들은 하기 및 본원의 타 기재부분에서 더욱 상세히 기술된다. (1) 다른 기준 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이한 폴리뉴클레오티드. 일반적으로, 상이정도는 기준 뉴클레오티드 서열과 변이체의 것이 전체적으로 아주 유사하고, 많은 부분에서 동일한 것에 국한된다. 하기 언급하는 바와 같이, 변이체에서 뉴클레오티드 서열의 변화는 사이런트(silent)이다. 즉, 이들의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 아미노산은 변하지 않을 것이다. 상기 유형의 사이런트 변화에 국한된 변경에서는, 변이체 뉴클레오티드가 기준과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 것이다. 또한, 하기 언급하는 바와 같이, 변이체 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 변화는 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시킬 수도 있다. 이러한 뉴클레오티드 변화는 하기 논의되는 바와 같이, 기준 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 추가, 결실, 융합 및 중단(truncation)을 야기할 수 있다. (2) 다른 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이한 폴리펩티드. 일반적으로 상이 정도는 기준 서열과 변이체의 것이 전체적으로 아주 유사하고, 많은 부분에서 동일한 것에 국한된다. 변이체와 기준 폴리펩티드는 아미노산 서열상에서, 하나 이상의 치환, 첨가, 결실, 융합 및 중단이 임의의 조합으로 존재할 수 있는 점에서 차이가 있다.
"치료"란, 인간 또는 비인간 동물에게 이익될 수 있는 임의의 계획을 포함한다. 치료는 기존에 상태에 관한 것이거나 또는 예방적인 것(예방적 치료)일 수 있다.
"포함하는/가지는"이란, 특정의 성질/특성으로 이루어지는 임의의 것 뿐만 아니라 그러한 성질/특성을 갖는 임의의 것, 그러나 또한 하나 이상의 추가적인 성질/특성을 갖는 것을 포함한다. 따라서, 소정 서열을 포함하는(또는 가지는) 핵산(또는 단백질) 서열의 경우, 그 서열 자체 뿐만 아니라 더 긴 서열도 포함하는 개념이다.
"상동물(homologue)"이란 특정의 생물학적으로 활성인 분자의 생물학적 활성 하나 이상을 가지는 임의의 변이체를 포함하는 것으로 사용된다.
본 발명은 Egr-1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자의 치료적 이용에 관계된다. 본 발명은 또한 생물학적으로 활성인 Egr-1의 단편을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 단편의 치료적 용도 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 기능적인 즉, 생물학적으로 활성인 Egr-1의 단편을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체의 치료적 용도, 및 기능적으로 등가적인 대립 유전자 변이체 및 하나 또는 다수 염기 치환, 첨가 및(또는) 결실에 의해 개질된 Egr-1 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 연관된 서열에 관한 것이다.
상기의 것은 이 기술분야의 숙련가에게 공지인 표준적인 클로닝 방법으로 얻을 수 있다.
Egr-1 전사인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 또는 RNA, 예를 들면 화학적 합성 기술로 클로닝 또는 생산될 수 있는 mRNA의 형태일 수 있다. DNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 단일가닥 DNA는 코딩 가닥 또는 센스 가닥이거나, 또는 비코딩 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 치료적 이용을 위하여, 상기 폴리뉴클레오티드는 치료되어질 환자의 상처 부위에서 기능적인 Egr-1 전사 인자를 발현시킬 수 있는 형태이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 하기 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 또다른 치료적 측면에서, 투여를 위한 Egr-1 폴리펩티드의 실험실적 생산을 위하여 사용될 수도 있다.
Egr-1 전사인자 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Egr-1 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 이의 단편의 코딩 서열을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전사되지만 번역되지 않고 전사(예를 들어 종결신호를 포함), 리보좀 결합, mRNA 안정성에 기여하는 비코딩 5' 및 3' 서열 및 추가적인 기능성을 제공하는 것과 같은 추가적인 아미노산을 코딩하는 추가 코딩 서열을 비제한적으로 포함하는 추가의 비코딩 서열들과 함께 제공될 수도 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 Egr-1의 구조 유전자 및 그와 자연적으로 연결된 유전자 엘리먼트들을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
상술한 바에 따라, "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"란 Egr-1 전사인자의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 단일의 연속적 영역 또는 비연속적 영역들 및 코딩 및(또는) 비코딩 서열을 포함할 수 있는 추가의 부위들을 함께 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체들을 코딩하는 논문에서 상기 기술한 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체와 같은 자연 발생적인 것이거나 또는 자연적으로 생성되는 것으로 알려져 있지 않은 변이체일 수 있다. 이러한 비자연적으로 생성되는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드, 세포 또는 유기체에 응용되는 것들을 포함하는 돌연변이 기술에 의해 제조될 수 있다.
상기 변이체들 중에는 상기 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 추가에 의해 상이한 변이체들이 있다. 상기 치환, 결실 또는 추가는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 변이체들은 코딩 또는 비코딩 부위 또는 이 둘 모두에서 변경될 수 있다. 코딩 부위에서의 변경은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 생성할 수 있다.
본 발명의 추가적인 바람직한 실시태양은 문헌[Cell 53 37-43(1988)]에 개시된 생쥐 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 전체 길이에서 70% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 문헌[Nucleic Acid Research 18 4283, 1990]에 개시된 인간 cDNA 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이에(인간 서열) 상보적인 폴리뉴클레오티드와 전체 길이에서 70% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 및 이들 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 별법으로, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 전체 길이에서 80% 이상의 상동성을 갖는 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 가장 바람직하다. 관련하여, 상기 서열과 전체 길이에서 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 특히 바람직하고, 이들 중 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 더욱 특히 바람직하다. 나아가, 97% 이상의 상동성을 갖는 것들이 고도로 바람직하고, 이들 중 98% 이상 및 99% 이상을 갖는 것들이 더욱 바람직하고, 이 중에는 99% 이상을 갖는 것이 더 바람직하다.
또한, 상기 관점에서 바람직한 실시태양은, 쥐과 DNA 서열[Cell 53 37-43(1988)] 및 더욱 바람직하게는 인간 서열[Nucleic Acid Research 18 4283, 1990]이 코딩하는 성숙 Egr-1 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명은 추가로 상기한 서열들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관계된다. 이 관점에서, 본 발명은 특히 엄격한 조건에서 상기 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관계된다. 여기서 "엄격한 조건"이란 서열간 상동성이 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상일 때 혼성화가 일어날 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 서열에 이러한 방법으로 혼성화하는 서열은 Egr-1의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질과 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 추가의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 추가 서열은 무엇보다도 예를 들어 단백질의 반감기 수명을 연장 또는 단축시키거나, 또는 검사 또는 생산을 위한 단백질의 조작을 용이하게 하는 기능을 할 수 있다. 일반적으로 생체내에서와 같이, 추가된 아미노산은 세포내 효소에 의해 성숙 단백질로부터 프로세싱되어 제거될 수 있다.
본 발명의 유전자 치료적 측면에서의 응용을 위한 폴리뉴클레오티드는 그 자체로, 또는 발현벡터와 같은 그 예가 당업계에 잘 알려진 벡터의 일부로서 제공될 수 있다.
Egr-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Egr-1의 생산을 인도할 수 있는 형태 또는 그 자체로 생물학적으로 활성인 단편인 형태로 상처 부위 또는 치유를 필요로 하는 다른 조직에 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것인 유전자 치료의 방법을 통하여 본 발명의 방법에서 치료적으로 사용될 수 있다. Egr-1은 상처 치유에 관여하는 유전자들, 예를 들어 VEGF, PDGF, EGF, TGF베타, 염기성 섬유아세포 성장 인자, UPA 및 조직 인자의 유전자들을 활성화시킴으로써 상처 치유를 촉진하는 작용을 하는 것으로 믿어진다.
바람직하게는 유전자 치료시 Egr-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 분자를 발현을 조절하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결한 형태, 예를 들어 발현벡터의 형태로 치료대상 환자내에서 이것이 발현되도록 상기 폴리뉴클레오티드를 투여한다. 상기 벡터는 따라서 코딩 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터 부위를 포함하는 적당한 전사 조절 신호를 포함하고, 상기 프로모터는 치료되어질 환자내에서 작동가능한 것일 것이다. 따라서, 인간 유전자 치료용으로, RNA 폴리머라제를 전사 개시 부위로 인도하는데 필요한 서열 뿐만 아니라, 적당하다면 인헨서를 포함하는 다른 작동 서열 또는 조절 서열들을 포함하는 용어인 프로모터는, 바람직하게는 인간 유전자로부터의 인간 프로모터 서열 또는 일반적으로 인간에게서 발현되는 유전자로부터의 인간 프로모터 서열, 예를 들어 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 프로모터이다. 이러한 관점에서 적당한 공지된 진핵 프로모터 중에서 CMV 즉초기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 루 육종 바이러스("RSV")의 것들과 같은 레트로바이러스 LTR 프로모터, 및 생쥐 메탈로티오네인-1 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터가 적합하다.
하기 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 천연 Egr-1 프로모터가 사용될 수 있다. 본 발명자들은 인간 Egr-1 프로모터 서열로 공개된 서열이 정확하지 않음을 발견하고 상기 공개된 서열과는 많은 차이가 나는 새로운 서열을 제공하였다.
폴리뉴클레오티드 서열 및 전사 조절 서열은 상업적으로 입수 가능한 pBR322와 같은 플라스미드에 기초하여 복제가능한 플라스미드 벡터내에 클로닝되어 제공되거나 또는 잘 알려진 공개된 절차의 일상적인 응용에 의해 입수가능한 플라스미드로부터 구축될 수도 있다.
상기 벡터는 또한 Egr-1 코딩 서열의 3'에 위치하는 전사 조절 서열, 및 인간 치료로 사용될 때 SV40 바이러스와 같은 바이러스로부터의 상응하는 서열과 같이 치료되어질 환자에게서 인식가능한 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 기타 전사 조절 서열이 이 기술분야에 잘 알려져 있고 이용가능하다.
상기 발현벡터는 또한 상기 벡터가 전파될 수 있도록 항생제 저항성과 같은 선택가능한 마커를 포함할 수 있다.
그 자체로 Egr-1을 합성할 수 있는 발현 벡터들을 물리적 방법으로 직접적으로 상처 부위에 도입시킬 수 있다. 이들의 예로는 예를 들어 인산 완충 염수(PBS)와 같은 제약학적으로 허용되는 부형제 중의 용액내에 적당합 비히클 내의 "네이키드" 핵산 벡터를 국부적으로 적용하는 것, 또는 당업계에 알려진 방법에 따라 "유전자 총"기술로도 알려진 입자 총알과 같은 물리적 방법으로 벡터를 투여하는 것을 포함한다. "유전자 총" 기술은 미국특허번호 제5371015호에 기술된 바와 같이, 추진 장치로부터의 고압력하에서 방출시키는 방법으로, 벡터로 코팅된 금 비드와 같은 불활성 입자를 상처 부위, 예를 들어 피부 세포의 표면을 통과할 수 있을 정도로 충분한 속력으로 가속하는 것이다. (본 발명의 핵산 분자로 코팅된 입자는 본 발명의 범주내이고, 이러한 입자를 포함하는 장치도 마찬가지이다.)
DNA를 직접 수용체에 투여하는 기타 물리적 방법으로는 초음파, 전기적 자극, 전기투과 및 마이크로시딩(microseeding) 등이 있다.
특히 바람직한 것은 마이크로시딩 유형의 수송법이다. 이는 유전 물질을 환자내 세포내로 그 자체로 전달하는 시스템이다. 상기 방법은 미국특허 제5,697,901호에 기재되어 있다.
본 발명의 치료적 사용을 위한 Egr-1을 코딩하는 핵산 서열은 또한 수송 벡터의 수단으로 투여될 수 있다. 그 예로는 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 수송 벡터와 같은 당업계에 공지인 바이러스성 수송 벡터 등이 있다.
기타 비바이러스성 수송 벡터로는 당업계에 알려진 리포좀 수송 벡터 등을 포함하는 지질 수송 벡터가 있다.
Egr-1 코딩 핵산 서열은 또한 형질전환된 숙주 세포의 수단으로 상처 부위에 투여될 수 있다. 세포는 환자로부터 수거된 세포를 포함하며, 상기 핵산 서열을 이 세포내로 당업계에 공지인 유전자 도입 방법에 의해 도입하여 형질전환된 세포를 배양액중에 성장시켜 환자에게 이식한다.
상기 기술한 바와 같은 발현 구조체를 본 발명의 치료에 다양한 방법으로 사용할 수 있다. 따라서, 상기 발현 구조체들은 환자의 상처 부위에 직접 투여될 수 있고, 또는 하기 상술하는 바와 같이 상처 부위에 투여될 수 있는 재조합 Egr-1 전사인자 자체를 생산하는데 사용될 수도 있다. 본 발명은 또한 Egr-1 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 정의된 유전자 엘리먼트들을 포함하는 구성체로 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 상기 벡터 및 세포들의 본 발명의 치료적 방법에의 이용에 관한 것이다. 상기 구성체는 본 발명의 치료적 방법내에 그 자체로 사용될 수도 있고 또는 하기 상술하는 바와 같이 본 발명의 치료법에 사용되는 Egr-1 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다.
상기 벡터는 상처 부위에 직접 투여되는지(즉, Egr-1의 생체내 합성을 위함) 또는 재조합 Egr-1의 합성에 사용되는 지에 따라, 예를 들어 플라스미드 벡터, 단일가닥 또는 이중가닥 파지 벡터, 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA 바이러스성 벡터일 수 있다. 본문에 개시된 출발 플라스미드는 상업적으로 입수가능하거나 공개적으로 이용가능하거나 또는 입수가능한 플라스미드로부터 공지의 공개된 방법의 일상적인 응용으로 제조될 수 있는 것들이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 많은 플라스미드 및 기타 클로닝 및 발현 벡터들이 잘 알려져 있고, 당업계의 숙련가들은 쉽게 얻을 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 사용되는 Egr-1 폴리펩티드를 발현시키는 벡터들은 발현될 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 숙주내 발현에 효과적인 시스-작용의 조절 부위를 포함한다. 적당한 트란스-작용 인자들은 숙주에 의해 제공되거나 또는 보충적 벡터에 의해 공급되거나 또는 숙주에의 도입시 벡터 자체에 의해 공급된다.
상기 관점의 본 발명의 특정 실시태양에서, 상기 벡터들은 특이적 발현을 제공한다. 재조합 Egr-1의 발현에 있어서, 상기 특이 발현은 유도성 발현 또는 특정 세포 유형에서만의 발현이거나 또는 유도성이고 세포특이적 발현 모두일 수 있다. 유도성 벡터 중 바람직하기로는 온도 및 영양소 첨가와 같은 조작하기 쉬운 환경적 인자에 의해 발현이 유도될 수 있는 벡터이다. 원핵숙주 및 진핵숙주에서 사용될 수 있는 본 발명의 상기 특성에서 적합한 다양한 벡터는 항상성 및 유도성 발현벡터를 포함하여 잘 알려져 있고 당업계의 숙련된 기술자라면 일상적으로 이용하는 것이다.
다양한 발현 벡터들이 본 발명에 사용되기 위한 Egr-1의 발현에 사용될 수 있다. 그 예로는, 무엇보다도, 염색체 유래, 에피좀 유래 및 바이러스 유래 벡터들, 예를 들어, 세균성 플라스미드 유래 벡터, 박테리오파지 유래 벡터, 트랜스포존 유래 벡터, 효모 에피좀 유래 벡터, 삽입 요소(insertion elements) 유래 벡터, 효모 염색체성 요소(chromosomal elements) 유래 벡터, 바쿨로바이러스, SV40와 같은 파포바바이러스, 바씨니아바이러스(우두바이러스), 아데노바이러스, 계두바이러스, 슈도레이비스바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스 유래 벡터 및 이들의 조합으로 부터 유래된 벡터들, 예를 들어 코스미드 및 파지미드와 같은 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 엘리먼트들로부터 유래된 것들이 있고, 이들은 모두 본 발명의 상기 측면에 따른 발현에 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주내에서 폴리뉴클레오티드의 유지, 전파 또는 폴리펩티드로의 발현에 적합한 모든 벡터가 상기 관점에서의 발현을 위하여 사용될 수 있다.
예를 들어 삼브루크 등의 문헌[Molecular Cloning A Laborotary Manual 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laborotory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)]에 개시된 바와 같은 다양한, 잘 알려진, 그리고 일상적인 기술에 의해 적당한 DNA 서열을 상기 벡터내로 삽입시킬 수 있다.
발현벡터내 핵산 서열은 예를 들어 mRNA 전사를 지시하는 프로모터를 포함하는 적당한 발현 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결된다. 상기 프로모터의 비제한적인 대표적인 예로는, 재조합 발현용의 파지 람다 PL 프로모터, E. coli lac, trp 및 tac 프로모터, 및 생체내 발현용의 SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터 등이 있다.
일반적으로, 발현 구조체는 전사 개시 및 종결을 위한 부위를 포함하고, 전사된 영역에는 번역을 위한 리보좀 결합부위를 포함할 것이다. 상기 구조체에 의해 발현되는 성숙 전사체의 코딩 부위는 시작하는 부위에 전사 개시 AUG 및 대략 전사될 폴리펩티드의 말단에 위치하는 종결 코돈을 포함할 것이다.
또한 상기 구조체는 발현을 발생시킬 뿐만 아니라 조절하는 조절 부위를 포함할 수 있다. 통상적으로 실시되는 많은 절차에 따르면, 일반적으로 상기 조절 부위는 무엇보다도 전사 인자들, 억제자 결합 자리 및 종결과 같은 전사를 조절하여 작동할 것이다.
전파 및 발현을 위한 벡터들은 일반적으로 예를 들어 삼브루크 등의 문헌[Molecular Cloning A Laborotary Manual 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laborotory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)]에 개시된 바와 같은 선택성 마커들 및 증폭 부위를 포함할 것이다.
Egr-1의 재조합적 발현을 위하여 적당한 숙주의 대표적인 예로는, 스트렙토코씨, 스타필로코씨, 이 콜라이, 스트렙토미체스 및 바실러스 섭틸리스 세포와 같은 세균성 세포, 효모 세포 및 아스페르길루스 세포와 같은 진균류 세포, 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포와 같은 곤충세포, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 및 Bowes 흑색종 세포와 같은 동물세포, 및 식물 세포 등이 있다.
상업적으로 시판되는 하기의 벡터들은 예로서 제공된다. 세균류에 사용하기에 바람직한 벡터로는, pQE70, pQE60 및 pQE-9(Qiagen에서 제조); pBS 벡터들, 파지스크립트 벡터들, 블루스크립트 벡터들, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A(스트라타진에서 제조); 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(파마시아에서 제조); pBR322(ATCC 37017)가 있다. 진핵세포 벡터로는, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG(스트라타진에서 제조); pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(파마시아에서 제조)가 바람직하다. 재조합 발현 및 생체내 발현 모두에 사용될 수 있는 상기 벡터들은 본 발명의 상기 측면에 따라 사용되기 위하여 당업계의 숙련가들이 입수가능한 잘 알려진 벡터들 및 많은 시판되는 것들 중에서 오직 예시적으로 열거된 것이다. 숙주내에 본 발명의 치료적 사용을 위한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 예를 들어, 도입, 유지, 전파 또는 발현시키기에 적합한 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터도 본 발명의 상기 측면에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 상기 측면에 사용되기 위한 벡터의 예들은 Egr-1 cDNA 서열들이 플라스미드에 삽입되어 유전자 발현이 인간 즉초기 사이토메갈로바이러스 인핸서-프로모터로부터 구동되는 것인 발현 벡터들을 포함한다[Foeking and Hofstetter, Cell, 45, 101-105, 1986]. 상기 발현 플라스미드는 폴리아데닐화 및 종결 신호들과 같은 SV40 RNA 프로세싱 신호들을 포함할 수도 있다. CMV 프로모터를 사용하고 상업적으로 입수가능한 발현 구조체는 pCDM8, pcDNA1 및 유도체, pcDNA3 및 유도체(Invitrogen)이다. 기타 사용될 수 있는 입수가능한 발현벡터들은 SV40 프로모터 및 mRNA 스플라이스 부위 및 SV40(pSVK3)로부터의 폴라아데닐화 신호 및 SV40 VP1 프로세싱 신호를 포함하는 pSVK3 및 pSVL이다(pSVL; 파마시아사 벡터들).
후보 프로모터 단편, 즉 프로모터를 포함할 수 있는 단편의 도입을 위한 제한효소 부위(들)의 하류에 프로모터 부위를 결한 리포터 전사 단위, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제("CAT") 전사 단위를 포함하는 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 프로모터 부위를 선택할 수 있다. 잘 알려진 바와 같이, 프로모터 함유 단편이 벡터의 cat 유전자의 상류 제한 효소 부위에 도입되면 CAT 활성을 발생시킬 것이고, 이는 표준적인 CAT 검사에 의해 검출될 수 있다. 상기 목적에 적합한 벡터는 잘 알려져 있고, pKK232-8 및 pCM7과 같이 쉽게 입수가능하다. 본 발명의 치료에 사용되기 위한 폴리뉴클레오티드의 발현용 프로모터는 공지의 용이하게 입수 가능한 프로모터들 뿐만 아니라, 리포터 유전자를 이용한 상기 기술에 의해 쉽게 얻어질 수 있는 것을 포함한다. 생체내 발현을 위하여는 이러한 프로모터들이 치료될 환자내에서 인식될 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료에 사용되기 위한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 발현에 적합한 공지의 원핵 세포 프로모터중에는 이 콜라이 lacI 및 lacZ 프로모터들, T3 및 T3 프로모터들, gpt 프로모터, 람다 PR, PL 프로모터들 및 trp 프로모터가 있다.
재조합 발현 벡터들은 예를 들어, 복제원점, 하류의 구조 서열의 전사를 지시하기 위한 바람직하게는 다발현 유전자로부터 유도된 프로모터 및 벡터에의 노출 후 벡터 함유 세포를 단리하기 위한 선택성 마커를 포함할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 이질적 구조 서열을 코딩하는 본 발명의 치료에 사용되기 위한 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 표준적인 기술을 이용하여 그 발현을 위한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있도록 벡터내로 삽입될 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 전사 개시 부위가 대략 리보좀 결합 자리의 5'에 위치하도록 자리잡을 것이다. 상기 리보좀 결합 자리는 발현될 폴리펩티드의 번역을 개시하는 AUG의 5'일 것이다.
일반적으로, 주로 AUG인 개시 코돈으로 시작하는 다른 개방 판독 프레임은 없을 것이고, 이는 리보좀 결합 부위와 개시 코돈 사이에 놓여질 것이다. 또한, 일반적으로, 폴리펩티드의 말단에 번역 종결 코돈이 있을 것이고, 진핵 숙주에서의 이용을 위하여는 구조체내에 폴리아데닐화 신호가 존재할 것이다. 대략 전사된 부위의 3'말단에 놓여지는 전사 종결신호가 또한 폴리뉴클레오티드 구조체내에 포함될 수도 있다.
재조합적으로 합성될 때 번역된 단백질의 소포체내, 페리플라즘 영역 및 세포밖 환경으로의 분비를 위하여 발현된 폴리펩티드내에 적당한 분비 신호를 포함시킬 수 있다. 상기 신호는 폴리펩티드 자신의 것일 수도 있고 또는 이종적 신호일 수도 있다.
상기 폴리펩티드는 융합 단백질과 같이 개질된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호 뿐만 아니라 이질적인 기능 부위를 더 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 후속하는 처리 및 저장 동안 또는 정제 동안의 숙주세포내 안정성 및 지속성을 향상시키기 위하여 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 부가적인 아미노산, 특히 하전된 아미노산 부위를 첨가할 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위하여 폴리펩티드에 영역이 첨가될 수도 있다. 이러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조 이전에 제거될 것이다. 무엇보다도, 분비 또는 방출을 위하여, 안정성을 향상시키거나 또는 정제를 용이하게 하기 위하여 펩티드 부분을 첨가하는 것은 이 기술분야에서는 친숙하고 일상적인 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 폴리펩티드의 용해 및 정제에 유용한 면역글로부린으로부터의 이종적 부위를 포함한다. 세포들은 일반적으로 원심분리로 수거하여, 물리적 또는 화학적 수단으로 파괴하고, 얻어진 조 추출물은 추가적 정제를 위하여 보관한다.
단백질의 발현에 사용된 세균성 세포들은 냉동-해동 사이클링, 소니케이션, 기계적 파괴 또는 세포 용혈제를 포함하는 임의의 통상적인 방법으로 파괴시킬 수 있고, 이 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다.
포유동물 발현 벡터들은 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 부위 및 수용 부위, 전사 종결 서열, 및 발현에 필요한 5'인접 비전사 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용될 Egr-1 폴리펩티드를 제조하기 위하여, 유전적으로 조작된 숙주 세포를 사용할 수도 있다. 숙주 세포내로 폴리뉴클레오티드의 도입은 인산칼슘 형질도입, DEAE-덱스트란 매개 형질도입, 트랜스벡션(transvection), 미세주입, 양이온성 지질 매개 형질도입, 전기투과, 트랜스덕션(trasduction), 스크라페 로딩(Scrape loading), 총알식 도입, 감염 또는 기타 방법에 의해 이루어질 수 있다. 상기 방법들은 많은 교과서적인 실험 매뉴얼 예를 들어, 데이비스 등의 서적[Basic Methods in Molecular Biology, (1986)] 및 삼브루크 등의 문헌[Molecular Cloning A Laborotary Manual 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laborotory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)]에 기재되어 있다.
성숙 단백질은 적당한 프로모터의 조절하에 CHO 세포와 같은 포유동물 세포, 효모, 박테리아를 포함하는 숙주세포 또는 기타 세포내에서 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 구조체로부터 유도된 RNA를 이용하여 세포제외(cell free) 번역 시스템으로 상기 단백질을 생산할 수도 있다. 원핵 및 진핵 숙주에 사용될 적합한 클로닝 및 발현 벡터들은 삼브루크 등의 문헌[Molecular Cloning A Laborotary Manual 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laborotory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)]에 기재되어 있다.
폴리펩티드는 재조합 세포 배양물로부터, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시 아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지의 방법으로 회수 및 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능액체 크로마토그래피를 이용하는 정제이다. 폴리펩티드가 단리 및(또는) 정제 도중에 변성될 때는 단백질의 재폴딩을 위한 공지된 기술들을 사용하여 활성 구조를 재생성시킬 수 있다.
치료용으로, Egr-1 코딩 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 벡터 형태의 것은 삼브루크 등의 문헌[Molecular Cloning A Laborotary Manual 2nd Ed; Cold Spring Harbor Laborotory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)]에 기재된 바와 같이 칼럼 크로마토그래피의 수단 등 당업계에 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다.
상기 지적한 바와 같이, Egr-1은 상처 부위에 유전자 치료의 형태로 상처 부위에서 Egr-1으로 전사 및 번역될 Egr-1 코딩 핵산으로서 투여되거나 또는 전사 인자 자체로서 직접적으로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제5 측면에서 본 발명은, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 및 이의 생물학적으로 활성인 단편의 인간을 포함하는 포유동물의 상처 치유용 의약 제조에의 용도를 제공한다.
본 발명의 제6 측면에 따르면, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 및 생물학적으로 활성인 이의 단편의 치료적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 인간을 포함하는 포유동물의 상처의 치료방법을 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 Egr-1 전사 인자 및 생물학적으로 활성인 이의 단편의 상처 치료 및 상처 치유를 위한 용도를 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은 Egr-1 전사 인자 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편과 함께 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약조성물을 제공한다.
본문에서 용어 "Egr-1 전사 인자 폴리펩티드"는 천연적으로 및 재조합적으로 생산된 Egr-1 전사인자, 이의 천연의, 합성된 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 유사체 또는 변이체 또는 유도체 또는 생물학적으로 활성인 이의 단편들 및 단편들의 변이체, 유도체 및 유사체를 포함한다.
Egr-1 전사인자의 생물학적으로 활성인 단편들을 포함하는 Egr-1 전사인자 단백질 산물은 당업계에 공지인 일반적인 기술로 생성 및(또는) 단리될 수 있다.
본 발명의 치료에 사용되기 위한 Egr-1 및 이의 상기한 단편들 및 유도체들은 천연 재료로부터 당업계에 공지인 방법으로 추출될 수 있다. 이러한 방법의 예로는 Egr-1을 인식하는 DNA 결합 올리고뉴클레오티드를 이용하여 문헌[Briggs et al., Science 234, 47-52, 1986]에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 서열 특이적 DNA 친화성 크로마토그래피 수단에 의한 정제법이 있다. 상기 폴리펩티드는 또한 상기한 바와 같이 당업계에 공지인 재조합 DNA 기술, 즉 기술된 구조체를 숙주세포내에서 발현시키는 방법으로 제조될 수도 있다. 별법으로 본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 펩티드 합성장치를 이용하여 합성적으로 생산될 수도 있다.
본 발명은 또한 Egr-1의 단편, 유사체 및 유도체의 사용에 관계된다. "단편", "유사체" 및 "유도체"란 용어는 본질적으로 상기 폴리펩티드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 유사체는 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성형의 성숙 폴리펩티드를 생성할 수 있는 프로단백질을 포함한다.
상기 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)로 치환되고 상기 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코딩되는 것이거나 또는 그렇지 않은 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것인 것, 또는 (iii) 성숙 폴리펩티드가 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위한 화합물(예를 들어 폴리에틸렌글리콜)과 같은 다른 화합물과 융합된 것, 또는 (iv) 성숙 폴리펩티드에 리더 또는 분비 서열 또는 성숙 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제를 위하여 이용되는 서열과 같은 추가적인 서열과 융합된 것이다. 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본 명세서의 교시로부터 당업계의 숙련가들의 범주내에 있다.
바람직한 변이체는 천연적으로 생성되는 Egr-1으로부터 보존적 아미노산 치환에 의해 변화된 것이다. 상기 치환은 폴리펩티드내 소정의 아미노산을 유사한 특성의 또다른 아미노산으로 치환한 것들이다. 일반적으로 나타나는 보존적 치환은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 사이에서 하나의 다른 하나로의 치환; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr 사이의 상호교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe, Thy 사이의 치환이다.
상기 관점에서 더욱 특히 바람직한 변이체, 유사체, 유도체 및 단편, 및 단편들의 변이체, 유사체, 및 유도체는 수개의, 몇개, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 2개, 1개 또는 0개의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환되거나 결실되거나 또는 첨가된 폴리펩티드의 아미노산을 갖는 것들이다. 이들 중 특히 바람직한 것은 침묵(silent) 치환, 부가 및 결실로서, 본 발명의 폴리펩티드의 특성 및 활성을 변경시키지 않는 것이다. 또한 상기 관점에서 특히 바람직하게는 보존적 치환된 것이다.
특히 바람직한 단편들은 생물학적으로 활성인 단편, 즉 선친 폴리펩티드의 상처 치유 특성을 보유하는 단편들이다.
본 발명에서 유용한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된 형태 및 바람직하게는 균질하게 정제된 것으로 제공된다.
본 발명에서 사용되기 위한 Egr-1 폴리펩티드는 Egr-1 폴리펩티드 및 문헌[Cell 53 37-43(1988)]에 개시된 쥐과 폴리펩티드 서열 및 인간 서열이 코딩하는 폴리펩티드와 70% 이상 상동성, 바람직하게는 80% 이상의 상동성, 및 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성 및 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성(더욱 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성)을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 또한 일반적으로 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함하는 상기 폴리펩티드의 부분들을 포함한다.
본 발명의 치료에 유용한 폴리펩티드의 단편 또는 부분들을 사용하여 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 따라서, 상기 단편들은 전장 폴리펩티드를 생산하는 중간체로서 이용될 수 있다. 본 발명에 유용한 폴리뉴클레오티드의 단편들 또는 부분들은 본 발명에 유용한 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 Egr-1 폴리펩티드 및 이의 변이체 및 유도체의 단편들의 이용에 관한 것이다.
상기 관점에서, 단편들은 Egr-1 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 유도체의 전체 아미노산 서열과는 아니나 일부와는 그 전체가 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.
상기 단편들은 다른 아미노산 또는 폴리펩티드의 일부이거나 또는 이와 융합되지 않은 "자유존재(free-standing)"일 수도 있고, 또는 이들 단편들이 더 큰 폴리펩티드내에 포함되어 일부 또는 부분을 형성하는 것일 수도 있다. 더 큰 폴리펩티드내에 포함될 경우, 현재 논의되는 단편은 가장 바람직하게는 하나의 연속적 부위를 형성한다. 그러나, 수개의 단편들이 하나의 더 큰 폴리펩티드내에 포함될 수도 있다. 예를 들어, 바람직한 특정의 실시태양은 본 발명의 폴리펩티드의 단편이 숙주내에서 발현되도록 설계된 전구체 폴리펩티드내에 포함되고, 이종적인 프리- 및 프로- 폴리펩티드 부위가 상기 단편의 아미노 말단에 융합되고, 부가적인 부위가 상기 단편의 카르복시 말단에 융합된 것에 관한 것이다. 따라서, 본문에서 의도되는 의미의 한 측면에서 단편들은 본 발명의 폴리펩티드로부터 유래된 융합 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 일부 또는 일부분들을 의미한다.
또한 본 발명의 상기 측면에서 바람직한 단편들은 본 발명의 치료에 유용한 폴리펩티드의 구조적 및 기능성 특성들의 특징을 갖는 단편들이다. 상기 관점에서 본 발명의 바람직한 실시 태양은 본 발명의 폴리펩티드의 알파-헬릭스 및 알파-헬릭스 형성 부위, 베타-쉬트 및 베타-쉬트 형성 부위, 턴(turn) 및 턴-형성 부위, 코일 및 코일 형성부위, 친수성 부위, 소수성 부위, 양쪽성(amphipathic) 부위, 기질 결합 부위 및 고항원지수(high antigenic index)부위 및 이러한 단편들의 조합을 포함한다.
바람직한 부위는 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 매개하는 부위들이다. 이러한 관점에서 가장 바람직한 것은, 유사한 활성, 또는 향상된 활성 또는 감소된 바람직하지 않은 활성을 갖는 것들을 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드의 화학적, 생물학적 및 기타 활성을 갖는 단편들이다. 더욱 바람직한 폴리펩티드 단편들은 동물내 특히 인체내에서 항원성 또는 면역생성의 결정인자(determinant)를 포함하는 것들이다.
본 발명은 또한, 무엇보다도 상기 단편들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 단편들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 특히 엄격한 조건에서 혼성화하는 것들, 및 상기 단편들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 관점에서, 바람직한 폴리뉴클레오티드는 상기한 바와 같이 바람직한 단편들에 해당하는 폴리뉴클레오티드들이다.
본 발명의 본 측면의 추가적인 실시태양은 생물학적으로, 예방적으로, 임상적으로 또는 치료적으로 유용한 이의 변이체, 유사체 또는 유도체, 또는 변이체, 유사체 및 유도체의 단편들을 포함하는 이의 단편 및 이를 함유하는 조성물을 포함한다. 생물학적으로 활성인 변이체, 유사체, 또는 단편들은 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 또한 상기한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관계된다. 따라서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제약학적으로 허용되는 담체 또는 담체들과 조합하여 사용될 수 있다.
상기 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서 이용되는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 치료를 위한 화합물과 같은 다른 화합물과 함께 사용될 수 있다.
제약 조성물은 상처 부위로의 표적화에 효과적인 임의의 효과적이고 편리한 방법, 예를 들어 무엇보다도 국부적, 정맥내, 근육내, 비내 또는 피하 경로로의 투여를 포함하는 방법으로 투여될 수 있다. 일반적으로 상기 조성물은 상처 또는 관련된 상태에 국부적으로 가해질 것이다.
치료에서 또는 예방으로서, 활성 제제는 주사가능한 조성물, 예를 들어 바람직하게는 등장성인 멸균 수분산제로서 개체에게 투여될 수 있다.
별법으로, 본 조성물은 예를 들어 연고, 크림, 로션, 안연고, 점안액, 점이액, 구강세척제, 침투 드레싱 및 봉합제(suture) 및 에어로졸의 형태로 국부적으로 응용되도록 제제화될 수 있고, 이는 적합한 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있다. 상기 국부 제제는 또한 상용가능한 통상적 담체, 예를 들어, 크림 또는 연고 베이스, 및 로션용으로는 에탄올 또는 올레일 알코올을 함유할 수 있다. 상기 담체는 제제의 약 1 내지 약 98%를 구성할 수 있고, 더욱 일반적으로는 제제의 약 80% 까지를 구성할 것이다.
포유동물, 특히 인간 투여용으로는, 활성 제제의 일일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 전형적으로는 약 1 mg/kg일 것으로 예상된다. 어떤 경우에든 의사가 개인에게 가장 적합한 실제 투여량을 결정할 것이고, 이는 연령, 체중 및 특정 개인의 응답에 따라 달라질 것이다. 상기 복용량은 평균의 경우의 예시적인 것이다. 물론 더 많은 투여 및 더 적은 투여가 좋은 개인의 경우가 있을 것이나, 이러한 경우도 본 발명의 범주에 속한다.
제9측면에서 , 본 발명은 Egr-1 전사인자 또는 Egr-1을 코딩하는 서열을 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 핵산분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
전사인자를 이용하여 상처 치유를 가속화하는 치료적 잇점은 가속화된 치유를 촉진하는 다수의 표적 유전자의 활성화에 의한다. Egr-1은 상처에 응답하여 자연적으로 활성화되는데, 자연적 응답을 증폭시키는 것이 또한 유리하다. 상기 치료는 DNA에 기초하고 있고, 이는 믿을 수 있고 재현가능한 전달시스템을 제공한다.
Egr-1 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 치료적 방법에 사용될 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 구조체, 예를 들어 발현 벡터의 일부로서 사용될 수 있다. 이 방법에서, 상기 구조체는 상처 부위에 도입되고 여기서 Egr-1이 본래적으로 생산된다. 사용되는 구조체는 표준적인 벡터들 및(또는) 유전자 전달 시스템, 예를 들어 리포좀, 수용체 매개 전달 시스템 및 바이러스성 벡터일 수 있다.
본 발명은 당뇨병 및 말초 동맥 폐색증에서의 지절 괴양, 수술후 상처, 화상 및 건선을 포함하는 모든 양상의 상처 치유에 적합하다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 Egr-1 폴리펩티드 또는 핵산은 임의의 편리한 방법, 예를 들어, 국부투여로 조직 손상 부위에 지역적으로 투여될 수 있다. 핵산 산물의 전달 방법 중 하나는 cDNA 또는 발현벡터중의 형태인 금입자중에 고정된 단리된 Egr-1 핵산 분자를 상처 부위에 직접 쏘는 유전자 총 기술을 이용하는 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 태양으로서, 상처 치료용 유전자 총내에 Egr-1을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산분자를 사용하는 것을 제공한다. 또한, Egr-1 전사인자 코딩 서열 및 금 입자를 포함하는 유전자 총 치료에 적합한 조성물을 제공한다.
그러나 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 바람직한 전달은 미국특허 제5,697,901호에 개시된 바와 같은 마이크로시딩법에 의하는 것이다.
상기 언급한 바와 같이, Egr-1 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 최소한 천연 Egr-1 프로모터, 바람직하게는 인간 Egr-1 프로모터의 일부의 조절하게 있을 것이다.
쥐과 Egr-1 프로모터가 단리 및 서열결정되어 있다[Morris, Nucleic Acid Research, 16:8835-3346]. 잠재적 조절 서열은 -26 내지 -22 위치에 AAATA 엘리먼트("TATA" 와 같은 유사성); -337 내지 -333 위치에 CCAAT 박스; -110 내지 -91, -342 내지 -324, -358 내지 -339, -374 내지 -355 및 -412 내지 -393 위치에 다섯개의 혈청 응답 엘리먼트(SRE); -610 내지 -603 및 -867 내지 -860 위치에 두 개의 Ap1 자리; -285 내지 -280, -649 내지 -644, -700 내지 -695, -719 내지 -714 위치에 4개의 Sp1자리; 및 -138 내지 -131 및 -631 내지 -624 부위에 두개의 cAMP 응답 엘리먼트를 포함한다. Egr-1은 쥐과 Egr-1 프로모터에 결합하여 자신의 발현을 하향조절하는 것으로 알려졌다. 이러한 프로모터의 서열은 첨부도면 제9도에 제공된다.
인간 Egr-1 프로모터의 조절에 대하여는 알려진 바가 적다. 알려진 인간 Egr-1 서열이 제공되었다. +1에서의 mRNA 개시 부위에 대하여 상류의 695 뉴클레오티드의 서열이 동정되었다. 이 상류 서열은 -26 내지 -22 부위에서 AAATA 엘리먼트('TATA'같은 유사성) 및, -505 내지 -499 및 -647 내지 -642 부위에서 두개의 Sp1 자리, -134 내지 -127 및 -630 내지 -623 부위에서 두개의 사이클릭 AMP 응답성 엘리먼트, -108 내지 -89, -344 내지 -326, -359 내지 -340, -376 내지 -357 및 -410 내지 -394 부위에서 다섯개의 혈청 응답 엘리먼트(SRE), -597 내지 -589 부위에서 Egr-1 결합 자리(EBS) 및 -609 내지 -602 부위에서 테트라데카노일 포볼 아세테이트(TPA) 응답성 엘리먼트(Ap1 결합 부위)를 포함하는 수많은 잠정적인 조절 엘리먼트들을 포함한다. TPA 결합 부위는 TPA가 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자를 발현시키는 플라스미드로부터의 발현을 자극하기 때문에 기능적이라고 알려졌다. SRE3 및 4는 Egr-1 프로모터의 전단응력(shear stress)에 대한 응답을 매개하고 SV40 프로모터상에 전단응력 응답을 부여할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 인간 프로모터 엘리먼트로부터 EBS를 결실시키면 이 프로모터의 전단응력 응답성이 증가하는데, 이는 인간 프로모터에서 활성의 하향 조절에의 Egr-1의 역할에 대하여 논박거리가 된다.
본 발명자들은 인간 Egr-1 프로모터로 공개된 서열이 정확하지 않음을 발견하고, 상기 공개된 서열과 많이 차이나는 새로운 서열을 제공하였다. 이들 서열의 차이는 미리 예상할 수 없는 것이고 이들 중 일부는 기능적으로 중요한 것으로 여겨진다. 또한 보고된 인간 Egr-1 프로모터 서열은 많은 빈공간을 포함하는데 반해, 본 발명자들은 완전한 서열을 제공하였다.
따라서, Egr-1 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자는 하기의 특성을 갖는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
a) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대한 도7에 제공된 서열을 포함하는 가닥을 가지거나 또는
b) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 비하여 하나 이상의 결실, 삽입 및(또는) 치환을 포함하나 ON SEQ(서열 동정 번호 1)로서 도7에 도시된 서열을 포함하지 않고 또한 도9에 도시된 서열을 포함하지 않는 서열을 포함하는 가닥을 갖는 것.
본 발명의 제10 측면에 따르면,
a) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대한 도7에 제공된 서열을 포함하는 가닥을 가지거나;
b) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 비하여 하나 이상의 결실, 삽입 및(또는) 치환을 포함하나 ON SEQ(서열 동정 번호 1)로서 도7에 도시된 서열을 포함하지 않고 또한 도9에 도시된 서열을 포함하지 않는 서열을 포함하는 가닥을 가지거나; 또는
c) 상기 a) 또는 b)에 기술된 가닥과 혼성화하는 가닥을 갖는 핵산분자를 제공한다.
상기 a), b) 또는 c)의 범위내에 포함되는 분자들을 더욱 상세히 설명할 것이다.
a) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대한 도7에 제공된 서열을 갖는 핵산 분자
도7에 도시된 GW SEQ(서열 동정 번호 2)는 다양한 박스친 부위를 갖는 것을 알 수 있다. 이들은 기능적으로 중요한 것으로 믿어진다. 이론에 구속됨이 없이, 도7에 도시된 다양한 박스친 부위의 예상되는 기능을 이하 기술한다.
Sp1 (2개 부위)
Sp1은 전사인자 Sp1 및 상동물이 결합하는 서열을 나타낸다
cAMP RE (2개 부위)
cAMP RE는 전사인자 ATF 및 상동물이 결합하는 서열을 나타낸다. 이것은 cAMP에 의해 유도되기 때문에 이 서열을 cAMP 응답성 엘리먼트라 부른다.
TPA RE
TPA RE는 전사인자 AP1 및 상동물이 결합하는 서열을 나타낸다. 이것은 예를 들어 포볼에스테르 TPA에 의해 유도되기 때문에 이 서열을 TPA 응답성 엘리먼트라 부른다.
EBS
EBS는 전사인자 Egr-1 및 상동물이 결합하는 서열을 나타낸다.
SRE(SRE5, SRE4, SRE3, SRE2, SRE1)
SRE는 혈청 응답성(즉, 혈청 응답성 엘리먼트)을 제공하는 서열을 나타낸다. 연결된 Ets(E26-형질전환 특이적) 결합부위와 함께 혈청 응답성 엘리먼트는 SRF, Elk-1 및(또는) F-ACT1, 및 이의 상동물과 결합한다.
TATA
TATA 박스는 전사개시에 필요한 많은 전사인자들을 포함하는 전사 복합체의 조립에 필요하다고 믿어진다. "TATA" 서열은 콘센서스(consensus) 서열이기 때문에 이것은 정확한 "TATA" 서열을 포함할 필요는 없고 어느 정도의 변화가 일어날 수 있다.
GW SEQ(서열 동정 번호 2)는 문헌 공지된 인간 Egr-1 서열("ON SEQ"라 명명함)과 비교하여 다양한 서열 차이를 갖는다. 그 차이는 도 7에 나타난 서열 GW SEQ(서열 동정 번호 2) 및 ON SEQ(서열 동정 번호 1)의 정렬에 관해 이하 논의될 것이다.
도 7에서 볼 수 있듯이, GW SEQ(서열 동정 번호 2)는 ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 대한 상응 위치에서 제공되는 특정 뉴클레오티드로부터 변화된 다섯 개의 뉴클레오티드를 갖는다. 이들은 ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 대한 치환으로서 간주될 수 있다. 이들 중 둘은 박스 지역 내에 존재한다. 이들 두 치환은 G를 T로 치환하고 G를 C로 치환한 것이다. 이들은 각각 제1 cAMP RE 박스 및 SRE3 박스 내에 존재한다.
GW SEQ(서열 동정 번호 2)는 또한 ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 비해 다양한 추가적인 뉴클레오티드 (즉, ON SEQ(서열 동정 번호 1)에서 구체적으로 확인되지 않는 뉴클레오티드)를 갖는다. 이들은 ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 비한 삽입으로서 간주될 수 있다. 이들 중 넷은 SRE5 박스에 존재한다 (이들 중 셋은 A의 삽입이고 하나는 C의 삽입임).
GW SEQ(서열 동정 번호 2)는 ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 비해 하나의 결실을 갖는다. 이는 G의 결실이다. 이것은 박스 지역에 있지 않다. 이것은 제2 Sp1 박스 및 SRE5 박스 사이에 위치한다.
상기 a) 범위 내의 분자는 물론 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 비해 추가적인 상류 및(또는) 하류 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 전사/번역 또는 그 조절에 관련된 하나 이상의 지역이 제공될 수 있다. 암호화 (바람직하게는 Egr-1 또는 생물학적으로 활성인 그 단편의 암호화) 지역 또한 제공될 수 있다. 추가적인 지역은 후에 더욱 상세히 논의한다.
b) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 비해 하나 이상의 결실, 삽입 및(또는) 치환을 포함하는 가닥을 갖으나 도 7에 ON SEQ(서열 동정 번호 1)로서 나타난 서열을 포함하지 않고 도 9에 나타난 서열을 포함하지 않는 핵산 분자
GW SEQ(서열 동정 번호 2)를 포함하는 분자에 비해 뉴클레오티드 서열을 변화시켜 여전히 유용성이 있는 기타 분자를 제공할 수 있다. 그러한 변화는 본 발명의 범위 내이다. 이들은 대립유전자성 및 비대립유전자성 변이체를 포함한다.
상기 b)의 범위 내의 바람직한 변이체는 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타난 하나 이상의 박스 지역의 기능에 상응하는 기능을 가지는 하나 이상의 조절 지역을 통상적으로 포함할 것이다 (비록 기능이 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타난 하나 이상의 박스 지역에 비해 상향 또는 하향 조절되더라도). 가장 바람직하게는, 그러한 분자는, GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타난 하나 이상의 박스 지역과 동일한 서열을 가지는 하나 이상의 지역을 가질 것이다.
요망되기로는 상기 b) 범위 내의 변이체는 상기 GW SEQ(서열 동정 번호 2)의 길이 또는 그 일부분에 걸쳐 상기 GW SEQ(서열 동정 번호 2)의 전체 또는 일부분과 실질적인 서열 상동성을 가질 것이다.
변이체가 도 7에서 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 하나 이상의 박스 지역에 해당하는 하나 이상의 지역을 갖는다면, 상기 박스 지역에 비해 차이가 없거나 단지 몇몇 그러한 차이가 있는 것이 바람직하다 (예. 주어진 박스 지역의 면에서 단지 최대 1, 2 또는 3의 차이를 가지는 것이 일반적으로 바람직할 수 있다). 박스 지역 외부에는 더 많은 서열 변화가 있을 수 있다. 따라서, 변이체는 도 7의 박스 지역이 아닌 곳에서는 GW SEQ(서열 동정 번호 2)의 상응 부분과 상대적으로 낮은 정도의 서열 일치성을 가질 수 있다. 사실, 어떤 변이체는 GW SEQ(서열 동정 번호 2)의 상기 박스 지역 외부의 하나 이상의 지역에 상응하는 하나 이상의 지역을 가질 수 없다.
본 발명의 제10 측면의 바람직한 핵산 분자는 생체내 조건에 응답하여 포유류(가장 바람직하게는 인간)에서 Egr-1의 전사 수준을 변경시킬 수 있는 하나 이상의 조절 지역을 포함할 것이다. 따라서, 그러한 핵산 분자를 포유류에 투여하여 그 발현이 전사의 수준에서 조절되도록 포유류에 Egr-1을 제공하는 방식으로 할 수 있다 (이들 핵산 분자는 따라서 Egr-1 활성을 가지는 물질을 암호화하는 지역을 일반적으로 포함할 것이다).
하나 이상의 혈청 응답 성분(SRE)이 존재할 수 있다. 바람직하게는 이들 중 하나 이상이 전단응력 응답 성분(SSRE)일 것이다. 이들은 전사에 전단 응력 응답성을 부여하는 지역이다.
복수의 SSRE가 협동 작업하여 전단 응력 응답성을 촉진시킬 수 있다. 바람직하게는 이들은 하나 이상의 Ets 자리와 연관되거나 하나 이상의 Ets 자리를 포함한다. 그러나, 특정 경우, 일정 정도의 전단 응력 응답성을 제공하기 위해 단 하나의 SSRE (바람직하게는 Ets 자리와 함께)가 존재할 필요가 있을 수 있다.
바람직한 SSRE가 도 7에 "GW SEQ(서열 동정 번호 2)"에 대한 SRE5로서 나타나 있다. 본 발명자들은 이것은 기능성인 반면, ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 대해 나타낸 SRE5는 비기능성임을 밝혔다. SRE5 자체 뿐 아니라 전단 응력 응답성을 제공할 수 있는 SRE5의 변이체도 본 발명의 범위 내이다. 그러한 변이체는 바람직하게는, ON SEQ(서열 동정 번호 1) SRE5에 비해 GW SEQ(서열 동정 번호 2) SRE5에 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 포함한다.
기타 바람직한 SSRE는 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 SRE3 및 SRE4 및, 전단 응력 응답성을 제공할 수 있는 그 변이체이다.
가장 바람직하게는, 세 개의 SRE3, SRE4 및 SRE5 (또는 전단 응력 응답성을 제공할 수 있는 그 변이체) 모두가 존재한다.
특정 SRE가 존재하는지 여부에 무관하게, 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자는 바람직하게는 TATA 박스를 포함할 것이다 (이는 반드시 콘센서스 서열 "TATA"를 포함해야 하는 것은 아니다). 이는 또한 통상적으로 CCAAT 박스를 포함할 것이다 (이는 반드시 콘센서스 서열 "CCAAT"를 포함해야 하는 것은 아니다).
하나 이상, 바람직하게는 두 개의 Sp1 결합 지역이 또한 통상적으로 존재할 것이다. Sp1 결합 지역은 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 관해 나타낸 Sp1 결합 서열 중 하나 또는 둘 모두일 수 있다.
cAMP 응답 지역이 존재할 수 있다. 바람직한 그러한 지역은 도 7에 나타난 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 관한 cAMP RE로 명명된 서열을 포함한다. 가장 바람직한 것은 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 관해 도 7에 나타낸 제1 cAMP RE이다. 이들은 cAMP에 의한 전사의 조절을 가능하게 할 수 있다.
Egr-1 결합 자리(EBS)가 존재할 수 있다. 이는, 일단 Egr-1의 수준이 일정 문턱을 넘으면 전사의 하향 조절에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서, Egr-1은 전단 응력 자극에 따른 그 자체의 발현을 제한할 수 있다. 이 방식으로 Egr-1 수준을 제한하는 것이 바람직하다면 EBS가 일반적으로 포함될 것이다. EBS는 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)를 위한 EBS로서 나타난 서열을 가질 수 있다. 주어진 EBS에 뉴클레오티드가 변화되어 그 변이체를 제공할 수 있다. 예를 들어, GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 관해 도 7에 나타낸 EBS에 비해 Egr-1에 대한 친화성이 감소된 변이체가 제공될 수 있다. 그러한 하나의 변이체는 도 8에 나타난 EBS(서열 동정 번호 3)이다. 특정 경우, 기능성 EBS가 존재할 수 없으며 따라서 Egr-1에 의한 조절은 완전히 폐지될 수 있다 (예. EBS의 완전한 결실이 일어날 수 있음). EBS에 대한 뉴클레오티드가 또한 변화되어 Egr-1에 대한 증가된 친화성을 제공할 수 있다. Egr-1 발현의 자가 조절의 증가가 요망된다면 이것은 유용하다.
c) 상기 a) 또는 b)에서 기술된 가닥과 혼성화하는 가닥을 가지는 핵산 분자
상기 논의된 하나 이상의 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 핵산 분자 또한 본 발명의 제10 측면에 포함된다. 그러한 핵산 분자는 본 명세서에서 "혼성화" 핵산 분자라고 언급된다. 바람직하게는, 본 발명의 혼성화 분자는 10 이상의 뉴클레오티드 길이이고 바람직하게는 25 이상, 50 이상, 100 이상 또는 200 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명의 혼성화 핵산 분자는, 비록 필수적은 아닐지라도, 그 길이를 따라 상기 a) 또는 b) 범위 내의 핵산에 상보적인 핵산 분자와 높은 정도의 서열 일치성 (예. 50% 이상, 75% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 일치성)을 가질 수 있다. 주어진 단일 가닥 핵산 분자와 다른 단일 가닥 핵산 분자의 서열 일치성의 정도가 클수록, 적합한 조건 하에서 다른 단일 가닥 핵산 분자에 상보적인 단일 가닥 핵산 분자에 혼성화될 가능성이 크다.
바람직한 혼성화 분자는 보통 또는 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화한다. 혼성화 조건은 샘브룩 등의 문헌 [Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]의 제1.101 - 1.110 및 11.45 - 11.61면에 상세히 논의된다. 사용 가능한 혼성화 조건의 일 예로는, 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 예비 세척 용액을 사용하고 55℃에서 5 X SSC를 사용하여 일야 혼성화를 시도하는 것을 포함한다. 그러나, 기타 많은 가능성들이 있다. 이들 중 일부는 예를 들어 WO98/45435의 표 1에 열거되어 있다 (특히 표의 A-F 하에 개시된 조건, 및 덜 바람직하게는 G 내지 L 또는 M 내지 R 하에 열거된 조건 참조).
또다른 접근법은 주어진 조건 하에서 주어진 특정 길이의 완전한 듀플렉스(즉, 미스매치가 없는)에 대한 Tm을 결정한 후, 그 조건 하, 단 수용 가능한 속도로 일정 범위의 안정한 혼성화물을 형성하도록 하면서 타당한 정도의 혼성화 특이성을 여전히 요구할 수 있도록 Tm보다 충분히 낮은 온도에서, 듀플렉스의 단일 가닥과의 시도된 혼성화를 수행하는 것이다. 그러한 듀플렉스에 대한 Tm은, 듀플렉스를 제공하고 Tm이 얻어질 때까지 점진적으로 온도를 증가시킴으로써 실험적으로 결정할 수 있다. Tm은 식, Tm = 81.5 + 16.6 (log10[Na+]) + 0.41(분획 G + C) - (600/N)을 이용하여 측정할 수도 있다. 상기 식에서 N은 사슬 길이이다 (상기 식은 Na+농도가 1M 이하이고 폴리뉴클레오티드 길이가 14 내지 70인 경우에는 상당히 정확하지만 이들 변수가 만족되지 않으면 덜 정확함). 길이가 200 뉴클레오티드를 초과하는 핵산 분자의 경우, 혼성화는 예를 들어 주어진 조건 하에서 완전한 혼성화(즉, 미스매치가 없는)의 Tm보다 15 내지 25℃ 낮은 온도에서 수행될 수 있다. 그러나, 길이가 감소함에 따라 Tm도 낮아져서 언젠가는 Tm - 25℃에서 혼성화를 수행하는 것이 불편해진다. 따라서 더 짧은 핵산 분자와의 혼성화는 Tm보다 5 내지 10℃만 낮은 온도에서 종종 수행된다. 중간 또는 높은 엄격성 조건은 단지 작은 비율의 미스매치만을 통상적으로 허용할 것이다. 경험상, 미스매치의 각각의 1%에 대해 Tm이 1 내지 1.5℃ 감소한다. 바람직하게는, 혼성화 조건은 25% 미만의 미스매치, 더욱 바람직하게는 10% 미만 또는 5% 미만의 미스매치를 허용하도록 선택된다. 혼성화에 이허 증가된 엄격도로 세척할 수 있다. 따라서, 초기 세척은 낮은 엄격성 조건 하에서 가능하지만, 이들 후에 더 높은 엄격성 세척, 최대로는 혼성화가 수행되는 조건으 엄격성 세척을 할 수 있다.
혼성화 조건에 관한 상기 논의는 일반적인 안내를 위해 제공된 것이며 제한하려는 의도는 아니다. 이는, 당업자라면 적합한 혼성화 조건을 제공하기 위해 변수를 적합하게 변화시킬 수 있을 것이며 폴리뉴클레오티드 길이, 염기 조성, 듀플렉스의 성질 (즉, DNA/DNA, RNA/RNA 또는 DNA/RNA), 존재하는 이온의 유형 들을 고려할 수 있을 것이기 때문이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 제10 측면의 혼성화 핵산 분자는 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타난 서열 또는 도 7에 나타난 하나 이상의 박스 구역의 서열을 가지는 DNA 분자에 혼성화한다.
혼성화 핵산 분자는 예를 들어 프로브 또는 프라이머로서 유용할 수 있다.
프로브는 핵산을 정제 및(또는) 동정하는 데 사용할 수 있다. 이들은 진단에 사용할 수 있다. 예를 들어, 프로브를 사용하여 개체가 Egr-1의 전사 또는 그러한 전사의 조절에 영향을 줄 수 있는 게놈에 결함이 있는지 여부를 결정할 수 있다. 그러한 결함은 개체로 하여금 본 발명의 치료를 사용하여 치료 가능한 다양한 질병에 걸리기 쉽게 한다. 예를 들어, 상처 치료는 하나 이상의 SRE들 중의 돌연변이에 의해 손상될 수 있다. 그러한 돌연변이는, 상응하는 돌연변이 SRE보다 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 하나 이상의 SRE에 더 큰 정도의 특이성으로 혼성화하는 (또는 그 반대) 프로브를 사용하여 동정할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제10 측면의 혼성화 분자는, 도 7에 ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 대해 나타낸 서열 또는 그것의 하나 이상의 박스 지역의 서열을 가지는 DNA 분자보다 도7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 서열 또는 그것의 하나 이상의 박스 지역의 서열을 가지는 DNA 분자에 더욱 엄격하게 혼성화한다. 예를 들어, 도 7의 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 SRE3, SRE5 및 cAMP 지역 (이들 지역 모두는 서열 면에서 ON SEQ(서열 동정 번호 1)의 상응하는 지역과 차이가 있음) 중 하나 이상과 고도의 특이성을 지닌 혼성화 분자를 디자인할 수 있다.
본 발명의 제10 측면의 범위 내의 혼성화 핵산 분자는 프라이머를 포함한다. 프라이머는 예를 들어 PCR 기술에 의해 핵산 또는 그 일부를 증폭시키는 데 유용하다.
프로브 또는 프라이머로서 유용한 것 외에, 본 발명의 제10 측면의 혼성화 분자는 안티센스 분자로 사용되어 발현을 변경시킬 수 있다. 이 기술은 안티센스 치료에 사용할 수 있다. 안티센스 분자는 예를 들어, 전사를 막거나 그 수준을 감소시킴으로써 Egr-1의 발현을 차단하거나 감소시키는 데 사용할 수 있다. 별법으로는, 조절체가 정상적으로 결합할 지역에 결합함으로써 주어진 조절체에 의한 Egr-1 전사의 조절을 방지하거나 감소시키는 데 사용할 수 있다.
본 발명에 사용될 핵산 분자에는 고전적인 DNA 또는 RNA 구조를 가진 것 뿐 아니라, 예를 들어 N-(2-아미노에틸)글리신-기재 슈도펩티드 백본을 함유하는 모르폴리노 유도체 및 펩티드 핵산(PNA)과 같이 변형된(비-포스포디에스테르) 백본을 가지는 변이체들도 포함된다는 사실을 주목하는 것이 중요하다 (닐슨, 피.이.의 문헌 [Annual Review of Biophysics ＆ Biomolecular Structure, 24 167-83 (1995)] 참조). 변형된 백본을 가지는 핵산 변이체는 변형되지 않은 핵산에 비해 증가된 안정성을 가질 수 있으며 장기간의 혼성화가 요망되는 경우(예. 안티센스 치료) 특히 유용하다.
앞의 논의로부터, 다수의 핵산이 본 발명의 제10 측면의 범위 내에 속한다는 것이 이해될 것이다. 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자는 따라서 하나 이상의 하기 특성을 가질 수 있다:
1) DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다 (자연 발생적이지 않은 염기 및(또는) 자연 발생적이지 않은 백본을 가지는, 자연 발생 DNA 또는 RNA 구조의 변이체 포함).
2) 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다 (연관되어 있는지 여부에 무관하게 주어진 가닥 및 그 상보체 모두가 포함됨).
3) 재조합 형태로 제공될 수 있다. 즉, 이형 5' 및(또는) 3' 플랭킹 서열에 공유결합적으로 연결되어 자연발생적이지 않은 키메라 분자(예. 벡터)를 제공할 수 있다.
4) 통상적으로 자연발생하는 5' 및(또는) 3' 플랭킹 서열 없이 제공될 수 있다.
5) 실질적으로 순수한 형태(예. 단리 형태)로 제공될 수 있다. 이는 예를 들어 프로브를 사용하여 요망되는 표적 서열을 가진 클로닝된 분자를 단리하거나 또는 화학 합성 기술을 사용함으로써 가능하다. 따라서, 핵산은 오염 단백질 및(또는) 기타 핵산이 실질적으로 없는 형태로 제공될 수 있다.
6) 인트론이 있거나(예. 전장 유전자로서) 또는 없이 제공될 수 있다.
본 발명의 제10 측면의 다양한 용도를 이하 더욱 상세히 설명할 것이다.
본 발명의 제10 측면의 핵산 분자는 임의의 요망 암호화 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 혈청 응답 성분이, 통상적으로는 그러한 성분과 연관되지 않는 암호화 서열에 효과적으로 연결될 수 있다. 이는 예를 들어, 통상적으로 혈청 응답성을 나타내지 않는 암호화 서열에 의해 암호화되는 주어진 치료제에 관해 혈청 응답성을 제공하는 것이 요망되는 경우에 상처 치유에 유용할 수 있다.
그러나 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자가 Egr-1에 대한 암호화 서열 또는 생물학적으로 활성인 그 단편을 포함하는 것이 바람직하다.
요망되기로는, 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자는 프로모터 지역을 포함하며, Egr-1 mRNA의 전사를 허용함으로써 Egr-1을 제공하는 데 유용할 수 있다. 이는 이어 숙주 내에 존재하는 리보좀에 의해 번역될 수 있다. 따라서, 핵산 분자를 대상(바람직하게는 인간 또는 기타 포유류)에게 투여하여 대상 내에서 추가적인 Egr-1이 합성되게 하거나 또는 (덜 바람직하게는) 핵산 분자를 Egr-1 자체의 제조에 사용하고 이어 생산된 Egr-1을 대상에게 투여할 수 있다.
대상에게 투여하기 위한 본 발명의 제10 측면의 바람직한 핵산 분자는, 대상의 Egr-1 전사를 조절하는 하나 이상의 요소에 의해 전사가 조절될 수 있는 방식으로 전사될 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 SSRE를 제공하여(상기한 바와 같이) 전단 응력 응답성을 가진 Egr-1 전사를 제공할 수 있다. 이는, 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자를 환자에게 투여하는 경우에(Egr-1 자체를 투여하는 경우보다) 특히 유용하다. 전단 응력 응답성은 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자를 생체 내 사용하여 상처를 치료하는 데 유익하다. 이는, 상처 부위의 전단 응력에 의해, Egr-1의 증가된 전사를 자극할 수 있는 SSRE 결합 요소가 생성될 수 있기 때문이다. 발생된 증가된 수준의 Egr-1은 상처 치료를 가속화시킬 수 있다.
특정 경우, 전단 응력 응답성의 수준을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이 경로에 의한 상처 치료의 속도를 늦추는 것이 바람직할 수 있다 (가능하게는 반흔을 줄이기 위해). 또는, 전단 응력 응답성과 연관된 심혈관 문제의 위험을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 제10 측면은 또한 여기에서도 유용하다. 이는, 인간 Egr-1 전사의 조절과 연관된 다섯개의 인간 SRE의 전체 서열을 최초로 제공한다. 이들 중 하나 이상이 돌연변이되어, 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 SRE 하나 이상을 사용하여 얻을 수 있는 것에 비해 전단 응력 응답성의 수준을 감소시킬 수 있다.
다른 경우, 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 SRE를 사용하여 얻을 수 있는 것에 비해 전단 응력 응답성의 수준을 증가시키기 위해 다섯개의 SRE 중 하나 이상에 돌연변이를 제공함으로써 전단 응력 응답성의 수준을 증가시키는 것이 요망될 수 있다. 그러한 돌연변이는 예를 들어 상처 치료의 속도를 높이는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 제10 측면의 핵산 분자는, 필수적이지는 않더라도, 벡터의 형태일 수 있다. 이를 물리적인 방법으로 환자에게 투여할 수 있다. 그러한 방법으로는 적합한 비히클 중의 '네이키드' 핵산 벡터의 국소 투여를 포함한다(예. 인산염 완충 염(PBS)와 같은 제약학상 허용 가능한 부형제 중의 용액). 그러한 방법은 입자 포격 ("유전자 총" 기술로도 알려져 있으며, 미국특허 US-5371015에 기술되어 있음. 여기서는 핵산으로 코팅된 금 비드과 같은 불활성 입자가, 분사 기구로부터의 고압 하의 발사에 의해 상처 부위(즉. 피부)의 표면을 관통할 정도로 충분한 속도로 가속화됨. 본 발명의 핵산 분자로 코팅된 입자는 그러한 입자를 포함하는 기구와 마찬가지로 본 발명의 범위에 속함)을 포함한다. DNA를 수용체에 직접 투여하는 기타 물리적 방법으로는 초음파, 전기 자극, 일렉트로포레이션(electroporation) 및 마이크로시딩(microseeding)을 포함한다. 마이크로시딩 모드의 전달이 특히 바람직하다. 이는 미국특허 US-5697901에 기술되어 있다.
본 발명의 제10 측면의 핵산 분자는 또한 전문화된 전달 벡터에 의해 투여될 수도 있다.
유전자 치료법에 적합한 임의의 벡터를 사용할 수 있다. 유전자 치료 접근법은 예를 들어 베르나 등의 문헌 [Nature 389: 239-242]에 기술된다. 바이러스 및 비바이러스 시스템 모두 사용 가능하다.
바이러스 기재 시스템은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 박시나-바이러스 기재 시스템을 포함한다.
비바이러스 기재 시스템은 핵산 및 리포좀-기재 시스템의 직접 투여를 포함한다.
본 발명의 제10 측면의 핵산 서열은 형질전환된 숙주 세포에 의해서도 투여될 수도 있다. 그러한 세포로는 투여대상으로부터 수확된 세포를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 그러한 세포 내로 시험관 내 도입되고 형질전환된 세포는 후에 대상에게로 돌아갈 수 있다. 비벡터 핵산 분자를 도입할 수 있기 때문에 핵산 분자는 벡터로서 도입될 필요가 없다. 그러한 분자 중 일부는 동형 재조합 이벤트에 의해 숙주 세포에 이미 존재하는 핵산 내로 통합될 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드(예. Egr-1)를 제공하기 위해 사용 가능한 발현 시스템을 또한 그 범위 내에 포함한다. 그러한 폴리펩티드는 이어 치료에 사용할 수 있다.
바람직한 발현 벡터는 진핵 벡터이다. 그러나 원핵 벡터도 사용할 수 있다. 적합한 벡터로는 하나 이상의 조절 서열에 효과적으로 연결된 암호화 서열을 일반적으로 포함할 것이다. 바람직하게는, 암호화 서열은 Egr-1을 암호화한다.
많은 상이한 발현 시스템이 알려져 있으며 예를 들어 샘브룩 등의 문헌 [Molecular Cloning; 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 논의된다.
본 발명의 제10 측면의 핵산 (벡터의 형태로 존재할 수 있음)이, 그러한 핵산을 사용하여 생산된 폴리펩티드와 마찬가지로, 다양한 치료 분야에 사용될 수 있다는 것이 앞서의 논의로부터 이해될 것이다. 따라서 본 발명은 제약학상 허용되는 담체(들)과 임의적으로 조합된 상기 핵산 또는 폴피펩티드를 포함하는 제약학상 허용되는 조성물을 그 범위 내에 포함한다.
그러한 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그 조합을 포함할 수 있으나 이로 제한되지는 않는다.
폴리펩티드 및 핵산은 단독으로 또는 치료 물질과 같은 기타 물질과 함께 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어 Egr-1 리프레서는 특정 환경(예. 반흔의 최소화, 재협착의 억제, 맥관벽 석회화의 조절 및(또는) 세포 증식의 억제(예. 암의 경우)가 요망되는 경우)에서 투여 가능하다(NAB1 및(또는) NAB2 등). 둘 이상이 유효 제제를 투여하려는 경우, 이는 동시, 별도 또는 연속적인 사용을 위한 조합 제제로서 가능하다.
본 발명의 제약 조성물은 다른 것들 중 예를 들어 국소, 혈관내, 근육내, 비강내 또는 피부내 경로에 의한 투여를 포함하여, 임의의 효과적인 방법으로 투여할 수 있다. 일반적으로 조성물이 국소적으로 적용되는 것(예. 상처 부위 또는 관련 증상에 또는 거기에 가깝게)이 바람직하다. 그러나 전신 투여도 가능하다.
유효 제제를 주사 가능한 조성으로서, 예를 들어 멸균 수성 분산액으로서, 개인에게 투여할 수 있다. 바람직하게는, 이는 환자의 체액(예. 환자의 혈액)과 실질적으로 등장이다.
별법으로는 조성물을 예를 들어 연고, 크림, 로션, 안 연고, 점안액, 점이액, 마우스워시, 주입 드레싱 및 봉합 및 에어로졸의 형태로 국소 투여용으로 제형할 수 있다. 이는 예를 들어 보존제, 약 침투를 보조하기 위한 용제, 및 연고 및 크림의 경우의 연화제를 포함하는 첨가제를 함유할 수 있다. 그러한 국소 제제는 예를 들어 크림 또는 연고 기재, 및 로션의 경우 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 적합한 담체도 함유할 수 있다. 그러한 담체는 제제의 약 1 중량% 내지 약 98 중량%를 구성할 수 있다. 더욱 통상적으로는 이는 제제의 최대 약 80 중량%를 구성할 것이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산을 함유하는 제약 조성물은 "유전자 총" 기술로써 투여되도록 적합화된다. 따라서 핵산은 발사체로 사용 가능한 입자(예. 금 비드)와 연관될 수 있다.
포유류, 특히 인간에 투여하기 위해, 유효 제제의 일일 용량 수준이 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 전형적으로는 약 1 mg/kg일 것이 예측된다. 실제, 의사가 개인에 가장 적합한 실제 용량을 결정할 것이며 이는 특정 개인의 연령, 체중 및 증상에 따라 다를 수 있다. 부작용이 나타나면, 양호한 임상 실무에 따라 용량을 감소시킬 수 있다.
치료 용도 외에, 본 발명은 진단에도 사용할 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명은 다양한 질병의 진단에 사용될 수 있는 프로브를 제공한다. 이들은, 예를 들어 하나 이상의 세정액, 혼성화 검출 수단, 사용 지시서 등의 기타 성분을 포함할 수 있는 진단 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 프로브를 검출 가능한 표지(예. 형광 표지 또는 방사능 표지)로 표지할 수 있다.
본 발명은 스크리닝에 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자(도 7에 나타난 GW SEQ(서열 동정 번호 2)를 포함하는 분자 또는 그 일부 등)를 사용하여 그것에 결합하는 물질들을 스크리닝할 수 있다. 그러한 물질들을 분석하여 그들이 Egr-1의 전사에 영향을 주는지를 알 수 있다. 따라서 이들은 상기 치료를 위한 의약을 디자인하는 데 유용할 수 있다. 별법으로는 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자를 사용하여 또다른 물질이 핵산 분자에 결합하는 것을 차단할 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있다. 그 다른 물질이 Egr-1 전사의 조절체인 경우, 상기 결합을 차단하는 물질은 하나 이상의 상기 치료에 사용하기 위한 의약을 디자인하는 데 또한 유용할 수 있다.
본 발명은 연구에 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 제10 측면의 핵산 분자를 연구에 출발점으로서 사용함으로써 주어진 핵산 분자에 대해 하나 이상의 변화를 일으킬 수 있다. 이를 행하여 그 중 어느 부분이 Egr-1의 전사에 중요한지 또는 그러한 전사의 조절에 중요한지를 결정할 수 있다. 예를 들어 삽입/결실/치환을 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 하나 이상의 박스 지역에 대해 일으킬 수 있으며 그러한 삽입/결실/치환의 효과를 이어 조사할 수 있다. 변화를 일으켜 증가 또는 감소된 수준의 Egr-1 전사를 제공할 수 있는 핵산 분자를 동정하려 시도할 수 있다.
본 발명의 각 면의 바람직한 특징은 필요한 변경을 가하여 각각의 다른 면에 대해서도 마찬가지이다. 여기에 언급된 선행문헌들은 법에 의해 허용되는 최대 한도로 인용된다.
본 발명은 첨부 도면을 단지 참고로만 하여 예로써 이하 설명될 것이며,
도 1a 및 b는 VEGF의 Egr-1 발현을 나타내고,
도 1c 및 d는 TGF-B1의 Egr-1 발현을 나타내고,
도 1e 및 f는 PDGF A의 Egr-1 발현을 나타내고,
도 2a는 쥐 절제 상처 수축에 대한 Egr-1의 효과를 나타내고,
도 2b는 쥐 절제 상처 치유의 조직학에 대한 Egr-1 DNA 형질감염의 영향을 나타내고,
도 2c는 쥐 절제 상처 상의 콜라겐 축적에 대한 Egr-1의 영향을 나타내고,
도 2d는 vWF 면역착색을 사용한 쥐 절제 상처에서 맥관형성 프로필에 대한 Egr-1의 영향을 나타내고,
도 3a는 미러스 트랜짓(Mirus TransIT; 캠브리지 바이오싸이언스)을 사용한 pGL3 루시퍼라제 대조군 플라스미드의 맥관형성 공동 배양 시스템 내로의 형질감염을 위한 지질: DNA 비율(v/w)의 최적화를 나타내고,
도 3b는 맥관형성에 대한 Egr-1의 영향을 나타내고,
도 4a는 웨스턴 블롯 분석을 사용하는 골 로딩용 샘플을 나타내고,
도 4b는 로딩에 노출된 인간 TE85 골 세포에서 Egr-1 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타내고,
도 4c는 로딩에 노출된 후 TE85 골 세포로부터 생성된 PDGF BB의 ELISA 분석을 나타내고,
도 4d는 ROS 세포 중의 CMV-TGF-B1의 형질감염 후의 VEGF 및 TGF-B1의 검출을 나타내고,
도 4e는 MC3tE1 세포 중 CMV-TGF-B1 의 형질감염 후의 VEGF 및 TGF-B1의 검출을 나타내고,
도 5는 이소적 골 형성의 설치류 모델에서 알칼리성 포스파타제에 대한 Egr-1의 영향을 나타내고,
도 6a는 CMV Egr-1으로 형질감염된 인간 평활근 세포의 항-Egr-1 항체 착색을 나타내고,
도 6b는 CMV Egr-1 DNA로 형질감염된 돼지 평활근 세포의 항-Egr-1 항체 염색을 나타내고,
도 6c는 푸진(Fugene)에 의한 인간 SMC 중 pGL3 루시퍼라제 대조군의 형질감염의 최적화를 나타내고,
도 6d는 푸진(Fugene)에 의한 돼지 SMC 중 pGL3 루시퍼라제 대조군의 형질감염의 최적화를 나타내고,
도 6e는 CMV-Egr-1의 인간 SMC 내로의 형질감염에 의한 VEGF 생산/분비의 활성화를 나타내고,
도 6f는 CMV-Egr-1의 인간 SMC 내로의 형질감염에 의한 HGF 생산/분비의 활성화를 나타내고,
도 6g는 CMV-Egr-1의 인간 SMC 내로의 형질감염에 의한 PDGF 생산/분비의 활성화를 나타내고,
도 6h는 상해 전후의 맥관벽의 Egr-1 단백질의 면역착색을 나타내고,
도 7은 각각 GW SEQ(서열 동정 번호 2) 및 ON SEQ(서열 동정 번호 1)로 나타낸 두 뉴클레오티드 서열의 비교를 나타낸다. ON SEQ(서열 동정 번호 1)는 문헌공지된 조기 성장 응답-1 프로모터(사카모토 등의 문헌 [Oncogene 6; 867-871, 1991] 참조)이고, GW SEQ(서열 동정 번호 2)는 본 발명에 따른 서열로서, 나타낸 바와 같은 일정 수의 염기 삽입/결실, 및 치환(굵은 밑줄)을 함유한다.
도 8은 도 7에 나타낸 서열의 변이체(서열 동정 번호 3)를 나타내며, 이 변이체는 변형된 EBS 지역을 갖는다. Egr-1 결합 자리(EBS) 중의 돌연변이를 굵은 밑줄로 나타내었다.
도 9는 쥐 Egr-1 유전자의 문헌공지된 5' 상류 서열을 나타낸다 (모리스의 문헌 [Nucleic Acids Research, 16: 8835-8846] 참조). 이 뉴클레오티드는 캡 부위( = +1)로부터 번호를 매겼다. 추정적인 TATA 및 CCAAT 성분들을 박스로 표시하였다. 잠재적인 조절 성분들에 밑줄 긋고 도에 표시하였다. 점선 밑줄은 프라이머 확장 연구에 사용된 29-머 위치를 나타낸다.
도 10은 pFA-MEK1의 일시적인 형질감염에 의한 SRE5의 활성화를 나타낸다.
실시예 1 및 2는 금 입자에 복합화된 β-갈락토시다제 및 Egr-1 발현 플라스미드 DNA를 설치류 피부에 유전자 총으로 전달하는 것을 설명한다.
a) 튜빙 스테이션의 제조
튜빙 제조 장치를 멸균 공기 라미나 유동 캐비넷에 설치하고 70% I.M.S.로 스웝한 후 캐비넷에서 공기 건조시켰다. 질소 실린더로부터 튜빙 제조 장치까지의 가스 선 튜빙을 가압멸균하고 젤맨(Gelman) 인라인(in-line) 0.2 ㎛ 필터를 부착하였다. 가압멸균된 튜빙을 루어(luer) 록 커넥터에 의해 제조 장치 상의 가스 주입구에 연결시키고, 가스를 0.2 리터/분으로 흘러 통과하도록 하여 튜빙을 완전히 건조시켰다.
입자 전달 튜빙을 제조 장치에 부착시키고 가스를 상기한 바와 같이 흐르도록 하여 튜빙의 내부를 완전히 건조시켰다. 튜빙 내의 임의의 잔류 습기는 금 입자가 튜빙 벽에 부착되는 것을 불량하거나 고르지 못하게 할 것이며 모든 실험의 결과에 악영향을 미칠 수 있다.
b) DNA-금 마이크로캐리어 비드 제조
1.0 ㎛의 금 비드를 바이오-라드 유케이(Bio-Rad UK)로부터 얻었다. 금 비드 분취량(53 mg)을 마이크로퓨즈 튜브 내로 칭량하고 100㎕의 0.05 M 스페르미딘을 첨가하고 튜브를 부드럽게 와류시켰다.
Egr-1 또는 β-갈락토시다제를 발현시키는 플라스미드 100 - 120μg을 함유하는 100㎕의 DNA 용액을 첨가한 후 100㎕의 1M CaCl2를 와류시키며 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 10분간 정치시킨 후 스핀 다운시켰다. 상청액을 제거하고 금 펠릿을 무수 EtOH 중에서 3회 세척하였다.
0.1 mg/ml 폴리비닐 피롤리돈(PVP)을 함유하는 무수 에탄올 중에 금 입자를 최종적으로 재현탁시켰다.
DNA의 금 마이크로캐리어에 대한 코팅 효율 및 수용액 중 방출의 측정: 모든 샘플(출발 물질, DNA/금 복합체 형성 후의 후-침전 상청액 및 용출 물질)을 "진퀀트(GeneQuant; Pharmacia)" 중에서 DNA에 대해 검정분석하였다. 잔류 후-침전 DNA에 의해 비결합 물질을 측정하였으며, 결합: 출발 물질의 비는 코팅 효율인 것으로 간주되었다.
c) DNA/마이크로캐리어 현탁액의 금 전달 튜빙으로의 로딩: 23에탄올/PVP 중의 금 입자 현탁액을 이어 시린지를 사용하여 전달 튜빙 내로 로딩하고, 현탁액을 튜빙 중에서 3 내지 5분간 정치시켰다. 이 시간 동안 입자들은 튜빙의 내부표면에 침전되고 에탄올은 시린지로 제거하였다. 에탄올이 제거되었으면, 튜빙을 회전시켜 금 입자를 튜빙의 내부 표면에 고르게 분포시킨다. 2 - 3분간 회전 후, 질소 기체를 0.1 리터/분의 속도로 튜빙을 통과시켜 잔류 에탄올을 제거하고 금 입자를 부착시킨다. 10분 후, 튜빙을 제거하고 제공된 커터(바이오-래드 유케이)를 사용하여 적합한 길이로 절단하고 절단된 튜빙을 유전자 총에 장전시킨다.
Egr-1 검출을 위한 시판 항체 제제(산타 크루즈)로 표준 면역조직화학을 사용하여 Egr-1 발현 및 활성을 측정하였으며, Egr-1 표적 유전자 생성물 (산타 크루즈 또는 R＆D 시스템) 및 발현을 1 - 7일간 모니터하였다. 음성 대조군은 영(null) DNA였다.
실시예 1
Egr-1 DNA의 상처입지 않은 설치류 피부로의 전달
1.1 방법
인간 시토메갈로바이러스 프로모터(hCMV; 휴스턴 등의 문헌 [Arterioscler. Thrombo. Vasc. Biol., 19; 281-289, 1999] 참조)로부터 유래한 Egr-1 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드를 유전자 총 매개 입자 전달을 통해 상처입지 않은 쥐의 등으로 전달하였다. 금/DNA 복합체를 상기한 바와 같이 제조하고 350 psi의 유전자 총 압력 및 1.6 마이크론의 금 입자 크기를 사용하여 동물 당 0.5 - 1.0 μg의 DNA를 전달하였다. 동불들을 DNA 전달 후 0, 1, 2 및 6일째 희생시켰으며, 피부를 OCT에 묻고 드라이 아이스/헥산 중에서 스냅 동결시켰다. 0.7 ㎛로 절단하고 VEGF, PDGF A, TGFβ 및 Egr-1에 대항하는 항체를 사용하는 면역착색법에 의해 Egr-1 표적 성장 인자를 검사하였다.
1.2 결과
VEGF(도 1a 및 1b), TGFβ(EH 1c 및 1d), PDGF A(도 1e 및 1f)의 Egr-1 활성화에 대한 면역조직화학 데이터를 나타내었다. 결과는 제1 및 2일째 VEGF 단백질의 급격한 상향조절, 제6일째 감소, 제6일째(단 제1 및 제2일째는 아님) TGFb의 상향조절 및 Egr-1 DNA 전달(제0일로 명명) 후 2시간째 PDGF A의 급격한 상향 조절을 보여준다.
1.3 결론
이들 데이터는 그 중 몇몇이 본 명세서에 기술된 표적 성장 인자의 생체 내 발현의 활성화할 수 있음을 확인한다. 이들 데이터는 Egr-1에 의한 성장 인자 활성화가 일시적으로 분리된 시간 척도에 걸쳐 발생함을 나타낸다.
상처받지 않은 설치류 피부를 사용하여 Egr-1 표적 유전자의 활성화를 확인(실시예 1)한 후, 절제 쥐 상처의 Egr-1 및 β-갈락토시다제 유전자 총 전달을 수행하여 치유 속도에 대한 Egr-1의 효과를 평가하였다.
실시예 2
설치류에서 상처 회복을 촉진시키기 위한 Egr-1 전사 인자의 용도
2.1 방법
2.1.1 플라스미드 구축:
이 연구에 사용된 발현 플라스미드는 CMV 유래 β-갈락토시다제 및 CMV 유래 Egr-1이었다 (휴스턴 등의 문헌 [Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 19; 281-289, 1999] 참조). 플라스미드를 E. coli XL-2 Blue MR 중에서 증식시키고 퀴아겐 맥시 키트(Quiagen maxi kit)를 사용하여 DNA를 제조하였다.
2.1.2 입자 매개 유전자 이동
체중이 250 g인 18마리의 수컷 스프라그 돌리 쥐를, 산소/산화질소 2:1 혼합물 중에서 이소플로란 하에 마취시켰다. 쥐 등의 두 군데의 형질감염부위(두개골로부터 8cm, 척추의 양쪽으로부터 1.5cm)를, 먼저 가죽을 자른 후 면도기로 면도함으로써 준비하였다. Egr-1 또는 β-갈락토시다제의 플라스미드/금 복합체를 350 psi에서 피부내로 가속화함으로써, 상처당 8 mm 떨어진 두 형질감염을 수행하였다. DNA의 총량은 형질감염당 1.7 μg 이상이었다 (상처당 3.4 μg).
2.1.3 절제 상처 치유 모델:
형질감염 후 24 시간 후에 동물을 마취시키고 형질감염의 정확한 부위에 생체검사 칼날을 사용하여 2개의 완전한 두께의 절제 상처(8 mm 직경)를 만들었다 (하기 참조). 상처를 낸 직후에 카메라/비디오 장비를 사용하여 각 상처를 포착하였으며 동물을 마취로부터 회복되도록 두었다. 상처 후 2, 4 및 6일 후에 6 동물을 죽이고 동일한 카메라/비디오 장비를 사용하여 각 상처를 다시 포착하였다. 포착 후, 상처를 절개해내고 통상적인 조직학 및 면역조직화학을 위해 수확하였다.
2.1.4 치유 분석:
i) 거시적 분석
상 분석을 이용하여 상처 부위를 결정하였으며 원래 상처 부위의 증가(백분율)로서 치유를 표현하였다. 한 쌍의 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험을 사용하여 치료군 및 대조군 사이의 차이의 통계학적 중요성을 평가하였다.
ii) 미시적 분석
조직학적 분석:
절개 후 매 시간점에 각 상처를 수평으로 절개하였다. 반을 4% 파라포름알데히드 중에 24시간 동안 두었으며 왁스 조직학을 위해 처리하였다. 마이크로톰을 사용하여 각 상처로부터 5μm 조각을 잘라내고 조각을 반 게이슨(van Geison)으로 염색하였다. 이 조직학적 염색을 사용하여, 상피재형성 및 콜라겐 함량을 포함하는 상처 치유의 핵심 마커를 평가하였으며, 치료 및 대조군 조각 사이를 비교하였다.
면역세포화학:
통상적인 조직학을 사용하여 나타나는 차이를 정량화하기 위해 면역세포화학 및 상 분석을 수행하였다. OCT 중에 동결시킨 후, 저온유지장치를 사용하여 각 상처의 두번째 반을 7 μm로 조각내었다. 각 상처로부터의 두 조각을 빙냉 아세톤 중에 고정시키고, 콜라겐 I 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor; vWF)에 대한 형광 면역착색을 프라이머리를 가지고 수행하였다. 면역착색 직후에 각 슬라이드를 형광 현미경 아래에 두고 x25 배율을 사용하여 상처 부위를 포착하였다. 상을 조정하고 배경을 최소화하는 경계를 결정하였다. 상 분석을 이용하여 착색의 면적 및 강도를 측정하고 그래프로 그렸다. 만-휘트니 비변수 시험을 사용하여 치료군 및 대조군 사이의 차이의 통계학적 중요성을 평가하였다.
2.2 결과
2.2.1 쥐 절제 상처 치유에 대한 Egr-1의 효과
(i) 상처 수축:
직경이 8 mm인 전체 두께의 쥐 피부 절제 상처가 대조군(β-갈락토시다제)에 비해 Egr-1 형질감염에 응답하여 상처 후 최대 6일까지 더 빨리 가장자리가 수축하였다. 통계학적으로 중요한 수축의 고양(p＜0.05)은 상처 후 6일째 발생하였으며 이때 Egr-1 치료된 상처는 대조군에 비해 면적이 7% 적게 수축하였다 (도 2a).
(ii) 조직학적 분석:
반 게이슨으로 착색된 상처 조각은 상처 후 4일 및 6일에 상처 조직학상 현저한 차이를 나타내었다. 상처 후 2일에 Egr-1 및 β-갈락토시다제 형질감염 상처 사이에는 차이가 거의 없었다. 양 치료 모두, 조리 염증성 응답을 지시하는 상처 부위의 단일핵 세포 및 조기 딱지 형성을 나타내었으나 상피재형성은 나타내지 않았다. 상처 후 4일째, 상피재형성이 여전히 시작되지 않았지만, Egr-1으로 형질감염된 상처는 β-갈락토시다제에 비해 상처 부위 내에 더 많은 콜라겐이 있었다. 상처 후 6일째, Egr-1로 치료된 상처에는, β-갈락토시다제에 비해 상처 부위 내에 투명하고 두꺼운 콜라겐 섬유가 보일 수 있을 정도로 현저히 더 많은 콜라겐을 나타내는 더욱 성숙한 입자화 조직이 있었다. 상피재형성은 Egr-1로 치료된 상처의 경우 50%가 완료된 반면, β-갈락토시다제에는 0%이었다. 조직학적으로, Egr-1 치료 상처는 β-갈락토시다제에 비해 가속화된 치유를 나타내었다 (도 2b).
(iii) 면역조직화학 및 상 분석을 사용한, 콜라겐 침적에 대한 Egr-1 효과의 정량:
Egr-1 또는 β-갈락토시다제로 치료한 상처의 7 μm 세포조각에 대해 콜라겐 I 면역착색을 수행하였으며 상 분석을 이용하여 착색을 정량하였다. β-갈락토시다제로 치료된 상처는 Egr-1에 비해 상처 후 2일째 상당히 더 많은 콜라겐을 가졌다. 상처 후 4 및 6일째, Egr-1 형질감염 상처는 대조군(β-갈락토시다제)보다 더 많은 콜라겐 침적을 가졌으며, 이는 통상적인 왁스 조직학을 사용하여 나타나는 발견을 확인한다. Egr-1 형질감염은 상처 후 4 및 6일째의 콜라겐 침적의 양을 증가시켰다 (도 2c).
(iv) 면역조직화학 및 상 분석을 이용한 맥관형성에 대한 Egr-1의 효과의 정량:
상처 저온조각에 대해 면역착색을 하는 폰 빌레브란트 인자를 사용하여 맥관형성을 정량하고 상 분석을 이용하여 상처 부위 내의 양성 염색 면적을 측정하였다. 상처 후 2일째, Egr-1 형질감염 상처는 대조군(β-갈락토시다제)에 비해 상당히(p＜0.01) 더 많은 새로운 혈관을 가졌다. 상처 후 4 및 6일째, Egr-1 및 β-갈락토시다제 형질감염 상처 모두 비슷한 수준의 맥관형성을 나타내었다. Egr-1 발현 DNA의 형질감염은 대조군에 비해 2일 먼저 맥관형성을 촉진시켰다 (도 2d).
2.3 결론
쥐 절제 상처의 Egr-1 형질감염은, 수축, 상피재형성 및 콜라겐 침적의 속도를 가속화시킴으로써 치유를 가속화시켰다. Egr-1 형질감염은 또한 상처 후 2일째에 맥관형성을 촉진시켰다.
실시예 3
맥관형성을 촉진시키기 위한 Egr-1 전사 인자의 용도
3.1 방법
hCMV 프로모터(휴스턴 등의 문헌 [Arterioscler Thromb. Vasc. Biol., 19; 281-289, 1999] 참조) 제어 하의 Egr-1을, 시험관내 맥관형성을 측정하기 위해 디자인된 인간 세포 공동 배양 시스템으로 형질감염시켰다. VEGF 단백질(2 ng/ml) 및 수라민(20 μM)을 맥관형성에 대한 양성 및 음성 대조군으로서 각각 사용하여 제조자의 지시에 따라 기술된 대로 맥관형성 키트(TCS Biologicals)를 사용하였다.
형질감염 대조군을 위한 표준화 플라스미드로서의 1.0 μg 및 0.5 μg CMV-β 갈과 함께 pGL3 대조군 루시퍼라제(프로메가)를 사용하여 공동 배양 시스템 중의 형질감염의 최적화를 수행하였다. 2:1 및 4:1의 두 가지의 지질: DNA (v/w) 비율을 사용하였다 (도 3a). 2:1 v/w DNA의 비율에서 미러스 트랜짓 시약(캠브리지 바이오사이언스)을 사용하여 24 웰 미세역가 플레이트에서 웰당 0.5, 1.0, 1.5 및 2.5 μg으로 3중으로(in triplicate) CMV Egr-1 DNA를 형질감염시켰다. VEGF 단밸질 양성 대조군 및 수라민 음성 대조군을 3중 웰에 첨가하였다. 11일 후, 내피 세포 마커 PECAM-1에 대한 세포의 착색 및 BCIP/NBT 기질을 사용한 시각화에 의해 공동 배양 맥관형성을 측정하였다.
모든 네가지 용량의 Egr-1 발현 플라스미드를 VEGF(양성 대조군) 및 수라민(음성 대조군)을 사용한 튜뷸 형성의 대표적인 상을, 퀀티멧(Quantimet)600 상 분석기 및 관련 소프트웨어를 사용하여 상 분석에 의해 포착 및 처리하였다.
3.2 결과
광 현미경 하에서 보이는 튜뷸 형성에 의한 기술된 맥관형성을 공동 배양 11일 후에 검출할 수 있었다. 전체 웰에 대해 기술된 대로 상 분석을 사용하여 맥관형성의 점수를 매겼으며 결과를 단위 면적 당 튜뷸 대 치료로서 나타내었다 (도 3b).
감소된 튜뷸 형성(수라민으로 치료된 세포) 및 증가된 튜뷸 형성(VEGF 단백질로 치료된 세포)을 나타내었다. Egr-1은 용량의 역수에 의존하는 방식으로 고양된 튜뷸 형성을 촉진시키는 것으로 나타났다.
3.3 결론
공동 배양 시스템에서, Egr-1 전사 인자 발현은 맥관형성성이다. 이는 실시예 1의 데이터를 뒷받침하며 또한 이 데이터에 의해 뒷받침되고, 이로써 Egr-1은 유전자 총에 의해 쥐의 피부로 전달되었을 때 성장 인자 발현(예. VEGF)을 상향조절하는 것으로 나타났으며, 여기서 Egr-1의 형질감염은 인간 맥관 평활근 세포에서 생산된 VEGF의 양을 증가시키는 것으로 나타났다. 후-맥관형성성 자극으로서의 Egr-1의 역 용량 응답은 실시예 6에서 얻은 결과 및 Egr-1이 그 자체의 생산을 하향조절할 수 있다는 의견(카오, 엑스. 등의 문헌 [J. Biol. Chem., 268; 16949-16957, 1993] 및 슈바흐트겐, 제이.-엘. 등의 문헌 [J. Clin. Invest., 101, 254-2549, 1998] 참조)과 일치한다.
실시예 4
생체내 골형성을 촉진시키기 위한 Egr-1 전사 인자의 용도
4.1 골 로딩 및 성장 인자의 결정
4.1.1 방법:
사용한 세포는 TE85, 즉 골육종에서 유래된 조골세포와 유사한 세포주이었다. 서브-콘플루언트(sub-confluent) 세포층을 트립신처리하고 10% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS) 항생제를 함유하는 DMEM 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 로딩 기판(18 x 18 mm 정사각형의 조직 배양-처리된 플라스틱) 상에 파종하였다. 세포를 일야 부착되게 두었다. 일단 부착되면, 로딩 자극 전 추가로 24시간 전에 로딩 기판 및 부착된 세포를 2% FCS 및 1% PS와 함께 DMEM을 함유하는 플라스크에 옮겼다.
도 4a에 기술된 각 시간점에 대한 네 세트의 조건이 있었다.
[1]. 로딩 (초당 3232 마이크로스테인에서 200 사이클의 2000 마이크로스테인).
[2]. 대조군 (로딩하지 않음).
[3]. 양성 대조군 (1시간 동안 100 ng/ml PMA).
[4]. 용질 대조군.
세포 로딩을 위해, 세포를 표준 조직 배양 조건으로부터 로딩 챔버 중으로 무균적으로 옮겼다. 챔버 중에서 세포를 로딩하는 지속기간은 4분이었다. 로딩 후, 세포를 이전 배양 조건으로 회복시켰다. 대조군 처리 세포는 챔버에 로딩을 하지 않은 것 외에는 완전히 동일한 방법으로 처리하였다.
두 가지 다른 방법으로 결과를 분석하였다. 먼저, Egr-1 전사 인자의 존재를 로딩 실험 후 수집한 세포 펠릿의 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다 (도 4b). 두번째, 분비된 성장 인자의 존재를 조직 배양 매질의 ELISA 분석에 의해 결정하였다 (도 4c).
4.1.2 결론:
이들 결과는 골 로딩 조건 하에서 전사 인자 Egr-1이 인간 골육종 유래 조골세포 유사 세포에서 생산된다는 것을 보여준다. 골을 인간 TE85 세포에 로딩하면 성장 인자의 생산 및 분비가 자극되며, 그 예는 PDGF B이다.
4.2 CMV TGF-β1의 MC3T3E1 및 ROS 세포 내로의 형질감염 및 후속적인 세포 배양 상청액의 인간 TFG-β1 및 쥐 VEGF ELISA 분석
4.2.1 재료:
(i) 형질감염
쥐 조골세포(MC3T3E1) 및 쥐 골육종 세포(ROS17/2.8)를 사용하여 6 웰 플레이트에서 파종하였다.
MC3T3E1 세포를 MEM-α, 최소 필수영양 배지 이글, 알파 변형(시그마), 10% 태아 소 혈청(라이프 테크놀로지스), 1% L-글루타민(라이프 테크놀로지스), 1% 페니실린-스트렙토마이신(라이프 테크놀로지스) 중에 배양하였다.
ROS 세포를 F12 HAM, 글루타민이 든 F-12 HAM(라이프 테크놀로지스), 10% 태아 소 혈청(라이프 테크놀로지스), 1% 페니실린-스트렙토마이신(라이프 테크놀로지스) 중에 배양하였다.
푸진(뵈링거 만하임) 및 상기한 CMV TGF-β1 발현 플라스미드를 사용하여 세포를 형질감염시켰다 (벤, 에스.아이. 등의 문헌 [J. Clin. Invest., 98; 2894-2902, 1996] 참조). 세포 내로의 형질감염을 기술하는 바와 같이 수행하였다.
1) 웰 당 2 x 105 세포로 하여 6 웰 플레이트를 준비하고 50 내지 70% 조밀해질 때까지 밤새 두었다.
2) 다음 날 94 ㎕의 무혈청 배지(SFM) 및 6 ㎕의 푸진을 각각의 6 에펜도르프 튜브에 추가하고 실온에서 5분간 두었다.
3) 6 개의 개별 튜브 중에, 2 튜브에는 DNA를 첨가하지 않고 나머지 4 튜브에는 4 μg의 CMV-TGF-β1 DNA를 첨가하였다.
4) 단계 2)로부터늬 푸진/SFM 믹스를 단계 3)부터 튜브에 적가하고 튜브를 수 회 손 끝으로 튀긴 후 실온에서 15분간 배양하였다.
5) 푸진/SFM/DNA 형질감염 믹스를 각각의 웰에 적가하며 6 웰 플레이트를 회전시켰으며, 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
6) 세포 배양 상청액을 분취하여 -20℃에서 저장하였다.
상기 프로토콜을 MC3T3E1 세포 및 ROS 세포 모두에 대해 수행하였다. 세포 배양 상청액 중의 TGF-β1 및 VEGF의 존재를, 스트렙트아비딘-HRP 기재 컬러 검출 시스템을 사용하여 ELISA(R＆D System)에 의해 검출하였다.
4.2.2 결과:
CMV-TGF-β1의 형질감염에 이은 TGF-β1 및 VEGF의 생산 및 검출이 ROS 세포(도 3) 및 MC3T3E1 세포(도 4)에 나타난다. 이들 데이타는 Egr-1 표적 유전자, 이 예의 경우 TGF-β1이 VEGF의 생산을 활성화시켰음을 나타낸다.
4.3 결론
Egr-1의 발현 및 Egr-1 표적 유전자의 활성화는 VEGF를 상승적으로 활성화시킬 수 있다.
실시예 5
생체내 골형성을 촉진시키기 위한 Egr-1 전사 인자의 용도
5.1 쥐의 이소적 골 형성
설치류에서 가능한 골 유도 화합물의 피하 주입은 현재 용도상 가장 광범위하게 연구되는 생물학적 분석법을 나타낸다 (워즈니, 제이. 엠.의 문헌 [Cell. Mol. Biol., 131-167, 1993] 참조). 캐리어 매트릭스의 사용은 골 유도 응답의 재현성 및 감수성을 증진시킨다. 이 분석 시스템에서(레이, 에이. 에이치. 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69; 1601-1605, 1972] 및 삼파스, 티.케이.의 상기 문헌(78; 7599-7603, 1981) 참조), 캐리어 매트릭스는, 특정 크기의 입자로 분쇄된 쥐의 긴 뼈의 골체부 부분으로부터 유래되며, 후속적으로 탈미네랄화되고 생물학적 활성은 구아니딘 추출에 의해 제거된다. 잔류 캐리어는 골유도능이 없는 골 콜라겐으로 주로 구성된다. 이어 분석할 화합물 또는 물질을 알코올로의 침전, 물에 대한 투석 또는 동결건조에 의해 매트릭스에 퇴적시킨다. 이어 매트릭스 조합을 며칠간(이 실험에서 12일간) 쥐의 피하 조직에 이식시킨다. 이어 이식물을 골 형성 유도능에 대해 조직학적 및 생화학적으로 분석한다 (삼파스, 티.케이. 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 6591-6595, 1983], 삼파스, 티.케이. 등의 상기 문헌 [84; 7109-7113, 1987], 왕, 이.의 상기 문헌 [85; 9484-9488], 왕, 이.의 상기 문헌 [87; 2220-2224] 및 삼파스, 티.케이. 등의 문헌 [J. Cell Biol., 98; 2192-2197, 1984] 참조).
5.1.1 실험 방법:
준비된 20 마리의 수컷 스프라그 돌리 쥐(42 내지 49일 됨, 체중 170 내지 220 g)를 무작위로 배치하고 핼로세인 마취 하에 배면 가슴(dorsal thorax) 상에 두 개의 이식물을 피하에 삽입하였다. 이식물은 하기 4 처리 중 하나를 포함하였다.
· 음성 대조군 - 캐리어 단독 (탈미네랄화된 구아니딘 추출 골 매트릭스 dgbm)
· CMV Egr 1 DNA; 캐리어 DGBM 상에 500μg
· CMV Egr 1 DNA; 500μg + 재조합 골 형태발생 단백질(BMP) 4; 캐리어 DGBM 상에 5μg, (수화(chemotactic) 효과를 위해 BMP 4가 사용됨)
· 캐리어 DGBM 상에 재조합 BMP4 단백질 5μg
삽입 당일을 0일로 하고 12일 후 수술로 모든 쥐를 스케줄 1 인가 방법을 사용하여 죽이고, 이식물을 제거하고 소프트 티슈로 닦아내고 똑같은 반으로 이분하였다. 반쪽을 조직학 검사를 위해 10% 포르말린에 넣고 나머지 반을 -20℃에서 동결 및 저장하였다. 이어 이 샘플을 칼슘 함량 및 알칼리성 포스파타제 활성에 대해 분석하였다.
5.1.2 탈미네랄화 쥐 뼈의 제조
성인 스프라그 돌리 쥐의 대퇴, 경골 및 상완골의 골간(diaphyseal shaft)을 제거하고 연질 조직을 스트립핑하고 골수강(marrow cavity)을 정상 염수로 관수하였다. 이어 뼈를 100 ml의 클로로포름: 메탄올 (2:1) 중에서 30분간 교반하여 탈지하였다. 이 단계를 한 번 더 반복한 후 건조 오븐에서 공기 건조시켰다. 이어 골간을 액체 질소 중에서 동결시키고 CRC 마이크로밀로 분쇄하였다. 생성된 분말을 체로 걸러 75 내지 425μm의 불연속적인 입자 크기를 남긴 후 0.5 HCl 중에서 3시간 동안 연속하여 교반하며 탈미네랄화하였다. 이어 혼합물을 15℃에서 19,000 rpm으로 30분간 원심분리시켰다 (Kontron Centriks T124, Rotor A8.24). 펠릿을 100 ml의 물 중에 재현탁시키고 1시간 동안 교반하고 원심분리하였다. 이 단계를 반복하였다. 이어 펠릿을 100 ml의 에탄올 중에 재현탁하고 1시간 동안 교반하고 원심분리하였다. 에탄올을 증발시켜 제거하고 샘플을 4M 구아니딘 염산염/50 mM Tris, pH 7.4 중에 재현탁하고 일야 교반하였다. 이어 원심분리를 수행하고 펠릿을 50 ml 물 중에 재현탁하고 1시간 동안 교반하고 원심분리하였다. 이 단계를 추가로 2회 반복하였다. 이어 샘플을 건조 오븐 중에서 일야 건조시켰다. 기계적인 혼합 및 동결건조에 의해 DNA를 뼈에 첨가하였다.
5.2 조직학 검사
포르말린 중에 초기 고정 후, 샘플을 메틸 메타크릴레이트 중에 묻고 1μm 조각을 잘라 폰 코사 앤드 톨루이딘 블루(Von Kossa and Toluidine Blue)로 염색하였다. 각각의 이식물로부터의 세개의 비인접 조각을 시험 물질에 결합된 고문 조직병리학자에 의해 평가받고 점수를 평균하였다.
연골 및 뼈에 대한 표준 점수 시스템을 사용하였다;
뼈 또는 연골의 +/- 시험적인 동정
1. ＞10% 각 조각 신규 연골 또는 뼈
2. ＞25% 각 조각 신규 연골 또는 뼈
3. ＞50% 각 조각 신규 연골 또는 뼈
4. ＞75% 각 조각 신규 연골 또는 뼈
5. ＞80% 각 조각 신규 연골 또는 뼈
5.3 생화학 시험
조직을 2ml의 빙냉 0.25 M 수크로스-3 mM NaHCO3 중에서 균질화하였다. 균질액을 2℃에서 12,000g로 15분간 원심분리하고 상청액을 수집하여 효소 검정분석하였다. p-니트로페닐 포스페이트(PNP)를 기질로 하여 비색 검정분석법을 사용하여 알칼리성 포스파타제 활성을 측정하였다. 37℃에서 PNP와 함께 시험 샘플을 배양한 후, 표준 역가 플레이트 판독기로 405 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
5.4 결과
결과를 도 5에 나타내었다. 서로에 대해 독립적인 각 쥐에 대한 두 개의 이식 부위를 처리하는 데이터를 분석하였다. 적은 숫자 및 데이터의 비스듬한 분포 때문에 중수 및 4분위간 범위(IQR)를 제시하였다. 상기 변수들에 대해 크루스칼 월리스(Kruskal Wallis) 시험을 수행하였으며 알칼리성 포스파타제 수준이 서로서로 상당히 상이함을 발견하였다.
골 형성은 단 하나의 군에서 다섯개의 이식 부위 중 하나이 이식체에 대해 양성이었다 (CMV EGr-1 DNA/BMP). 초기 실험은 12일간의 검정분석에 대해 단일의 시간점을 사용하였으며, 이를 선택하여 조기의 예언적인 결과를 생성하였다. 이 시간점에서 알칼리성 포스파타제 활성의 수준은 대조군에 비해 CMV Egr-1 DNA 및 CMV Egr-1 DNA/BMP4 그룹에서 상당히 향상되었다. 알칼리성 포스파타제 활성의 그러한 일시적인 증가는 골 형성을 자극하는 BMP와 같은 물질에 대해 (골 형성의 전구체로서) 전형적으로 나타나며, 10 - 15일에 피크로 올라가고 그 후 떨어진다. 이는 연골 내골화의 조기 상태에서 나타나는 상승을 나타낸다. 비록 CMV-Egr-1/BMP4 군에서 수 개의 조직학적 샘플에서 조기 석회화가 관찰되었지만 칼슘 함량은 지금까지 시험한 샘플에 대해서는 심각한 차이를 보이지 않는다. 이는 석회화가 단지 막 시작되는 생체검사의 시간척도에 기인하는 것으로 설명할 수 있다.
5.5 결론
Egr-1은 이소적 골 형성의 설치류 모델에서 알칼리성 포스파타제 수준을 증가시키며 국소화된 골 형성을 촉진시킬 수 있다.
실시예 6
시험관내 경피 경강적 관상동맥 혈관형성술 후의 상피재형성을 촉진시키기 위한 Egr-1 전사 인자의 용도
6.1 방법
인간 또는 돼지의 맥관 평활근 세포(SMC; 클로네틱스)를 녹이고 매질 중에 유지시키고 제조자의 지시에 따라 패시지 4가 되자마자 통과시켰다. CMV 프로모터로부터 발현된 Egr-1 cDNA를 포함하는 발현 플라스키드로 SMC를 형질감염시켰다 (휴스턴 등의 문헌 [Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19; 218-289, 1999] 참조). 루시퍼라제 리포터 벡터 pGL3 대조군(프로메가) 또는 미러스 트랜짓(캠브리지 바이오싸이언스)와 함께 SMC의 최적화 후에 푸진(뵈링거 만하임)을 사용하여 Egr-1 발현 DNA를 SMC 내로 형질감염시켰다. 양 형질감염 프로토콜 모두 형질감염 대조군을 위한 표준화 플라스미드로서 β-갈락토시다제를 사용하였다.
6.2 결과
CMV Egr-1 DNA를 인간 SMC 내로 형질감염시키고 폴리클로날 항체(산타 크루즈) 및 퍼옥시다제 검출(시그마 앤드 벡터 러보러토리즈)을 사용하여 면역조직화학에 의해 Egr-1 단백질을 검출하였다. CMV Egr-1 DNA로 형질감염된 인간 SMC(오른쪽 패널) 또는 모조 형질감염(왼쪽 패널)을 도 6a에 나타내었으며, CMV Egr-1 DNA로 형질감염된(오른쪽 패널), 또는 모조 형질감염된(왼쪽 패널) 돼지 SMC를 도 6b에 나타내었다. Egr-1 단밸질 발현은 갈색 착색으로 검출 가능하다. DNA 형질감염의 최적화는 푸진 6 (추가적인 시험관내 특성화를 위해, 도 6c.) 및 미러스 트랜짓(후속적인 생체내 연구를 위해, 도 6d.)을 사용하여 이루었다. 이들 데이터로부터, 3:1의 지질:DNA 비율을 사용하는 성장 인자 활성화 실험을 위해 4 μg의 CMV-Egr-1 DNA를 통상적으로 사용하였다. 3:1의 지질:DNA 비율은 생체내 유전자 전달 실험을 위해서도 또한 사용되었다.
세 개의 성장 인자의 Egr-1 활성화를 세포 상청액의 ELISA 검정에 의해 분석하였다. VEGF(도 6e), HGF(도 6f) 및 PDGF-AB(도 6g) 생산 모두가 Egr-1 활성화의 결과로서 증가되었다. 이전에 실시예 3에서 나타난 바와 같이 활성화의 용량 응답 및 특정 [Egr-1] DNA 농도 위로 역 용량 응답이 있었다.
6.3 결론
CMV Egr-1 DNA의 형질감염 후 Egr-1 단백질이 SMC 중에서 발현된다. Egr-1의 형질감염은 SMC 유래 PDGF, HGF 및 VEGF의 생산/분비를 증가시킨다.
실시예 7
EGR-1 프로모터 서열
주형으로서의 0.5 μg의 인간 태반 게놈 DNA, 0.4 mM의 dATP, dCTP, 및 dTTP, 25 pmole의 정방향 프라이머(5'-GGC CAC GCG TCG TCG GTT CGC TCT CAC GGT CCC-3', Mlu I 제한 자리에 밑줄 표시함), 25 pmole의 역방향 프라이머 5'-GCA GCT CGA GGC TGG ATC TCT CGC GAC TCC-3'(Xho I 자리에 밑줄 표시함) 및 벤트 DNA 폴리머라제(NEB)를 함유하는 반응 중에서 PCR에 의해 뉴클레오티드 -674 내지 +12에 걸치는 인간 Egr-1 프로모터 단편을 합성하였다. PCR 단편을 Mlu I 및 Xho I으로 절단하고 아가로스 겔로 정제하고 벡터 pGL3 베이직(프로메가)의 다중 클로닝 자리 중 Miu I 및 Xho I 자리 사이를 클로닝하였다.
이제 전체 서열이 유도되어 문헌공지된 서열 내의 '갭'을 완성할 수 있게 되었다. 이는 도 7에 나타나며, 여기서 발명자에 의해 유도된 완전한 서열(GW SEQ(서열 동정 번호 2))을 전에 문헌공지된 서열(ON SEQ(서열 동정 번호 1))과 비교한다. 이 프로모터 서열은 기능적이며 내피세포에의 전단 응력의 연구에서 조사되어왔다.
인간 Egr-1 프로모터의 문헌공지된 서열 및 우리가 기술하는 서열(도 8) 사이의 중요한 차이점은 두 개의 미처 인식하지 못했던 SRE에 있다. 공지된 SRE5 및 SRE1의 서열이 혈청 응답 인자(SRF)에 결합하지 않고 기능적이지 않은 반면(너리쉬 에스제이, 트레이스만 알의 문헌 [Mol Cell Biol 1995, 15(8): 4076-85] 참조), 우리는 그것이 SRE 콘센서스 서열과 일치함을 밝혀내었다 (도 7).
우리는 SRE 5에 집중하였다. 연관된 Ets 전사 인자 결합 자리를 가진 신규 SRE5를 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로서 합성하였으며 SV40 최소 프로모터 벡터(pSV40)의 상류의 Nhe I 자리에 삽입하였다.
SRE5는 다음 서열을 갖는다.
AG
GCTGCGACCCGGAAATGCCATATAAGGAGCAGGAAGGATCCCCCCGCCG
G
CGACGCTGGGCCTTTACGGTATATTCCTCGTCCTTCCTAGGGGGGCGGCC
GA
2 Ets 자리는 굵게 표시하고, SRE는 밑줄그었다. 맨 위의 AG는 pGLE 프로모터의 부분적으로 채워진 Nhe 자리 내로 클로닝되는 데 사용되었다.
생성된 리포터 플라스미드 pSVSRE5를 플라스미드 pFA-DBD(Gal4 DNA 결합 도메인(dbd)를 암호화하는 구축물) 또는 pFA-MEK1(Gal4 DNA 결합 도메인(dbd)의 융합 단백질을 암호화하는 구축물)과 함께 HeLa 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. Gal4-MEK1 융합 단백질은 구조적으로 활성이며 SRE5에 결합된 Elk1 및 SRF를 인산화시킨다.
도 10에 나타난 결과는 단리된 SRE5 서열이 MDK의 존재에 의해 3배 활성화되는 반면, SV40 프로모터는 단지 극소의 활성화를 나타낸다는 것을 보여준다.
그 결과는 신규 SRE5가 기능적이라는 것을 나타낸다.
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＜210＞ 1
＜211＞ 703
＜212＞ DNA
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 1
cggttcgctc tcacggtccc tgaggtgggc gggcgggccn tggaggacag cgatagaacc 60
ccggcccgac tcgccctcgc ccccgctctg ggtctgggct tccccagcct agttcacgcc 120
taggagccgc ctgagcagcc gcgcncanag cgccacacgc cacgagccct ccccgcctgg 180
gcgtccccgg atcccgcgag cgctcgggct cccggcttgg aaccagggag gagggaggga 240
gcgagggagc aaccagctnc ggaccnggaa ntgcnatata ngnagcagga aggatccccc 300
gccggaacaa cccttatttg ggcagcacct tatttggagt ggccggatat ggcccggcng 360
cttccgcctc tgggaggagg gaagaaggcg gagggagggg caacgcggga actccggagc 420
tgcncggntc ccggaggccc cggcggcggc tagagctcta ggcttccccg aagcntgggc 480
gcctgggatg cgggcncggg cncgggccct agggtgcagg atggaggtgc cgggcgctgt 540
cggatggggg gcttcacgtc actccgggtc ctcccnnccg gtcctgccat attagggctt 600
cntgcttccc atatatgncc atgtacgtca cgacggaggc ggacccgtgc cgttccagac 660
ccttcaaata gaggcggatc cggggagtcg cgagagatcc agc 703
＜210＞ 2
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gcgtccccgg atcccgcgag cgctcgggct cccggcttgg aaccagggag gagggaggga 240
gcgagggagc aaccagctgc gnacccggaa atgccatata agaagcagga aggatccccc 300
gccggaacaa cccttatttg ggcagcacct tatttggagt ggcccgatat ggcccggccg 360
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Claims (53)
- Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자의, 인간을 포함하는 포유류의 상처 치료용 의약 제조에 있어서의 용도.
- 제1항에 있어서, Egr-1이 인간 Egr-1인 것의 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편을 암호화하는 상기 서열을 포함하는 핵산 분자가, 발현을 제어하는 핵산 서열에 효과적으로 연결되어 있는 것의 용도.
- 제3항에 있어서, 발현을 제어하는 핵산 서열이a) 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 제공된 서열을 포함하는 가닥을 가지거나, 또는b) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 비해 하나 이상의 결실, 삽입 및(또는) 치환을 포함하지만 도 7에 ON SEQ(서열 동정 번호 1)에 대해 나타난 서열은 포함하지 않고 또한 도 9에 나타난 서열도 포함하지 않는 가닥을 가지는 것인 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 물리적 방법에 의해 포유류에 투여되도록 배열된 것인 용도.
- 제5항에 있어서, 핵산 분자가 입자 포격에 의해 포유류에 투여되도록 배열된 것인 용도.
- 제6항에 있어서, 핵산 분자가 금 입자 상에 고정화된 것인 용도.
- 제5항에 있어서, 핵산 분자가 마이크로시딩에 의해 투여되도록 배열된 것인 용도.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 벡터인 것의 용도.
- 제9항에 있어서, 핵산 분자가 세포인 것의 용도.
- 상처 치료에 사용하기 위한, Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
- Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자 및 하나 이상의 제약학상 허용되는 그 담체를 함께 포함하는 제약 조성물.
- Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 포유류의 상처 치료 방법.
- Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편의, 인간을 포함한 포유류의 상처 치료용 의약의 제조에 있어서의 용도.
- 제14항에 있어서, Egr-1 또는 생물학적으로 활성인 그 단편이 자연적으로, 합성에 의해 또는 재조합으로 생산되는 것인 용도.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, Egr-1이 인간 Egr-1인 것의 용도.
- 상처 치료에 사용하기 위한 Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편.
- 포유류에게 치료학상 유효한 양의 Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 포유류의 상처 치료 방법.
- Egr-1 전사 인자 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 그 단편 및 하나 이상의 제약학상 허용되는 그 담체를 함께 포함하는 제약 조성물.
- a) 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 제공된 서열을 포함하는 가닥을 가지거나,b) GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 비해 하나 이상의 결실, 삽입 및(또는) 치환을 포함하지만 도 7에 ON SEQ(서열 동정 번호 1)로서 나타낸 서열은 포함하지 않고 또한 도 9에 나타낸 서열도 포함하지 않는 가닥을 가지거나, 또는c) 상기 a) 또는 b)에 기술된 가닥과 혼성화하는 가닥을 가지는핵산 분자.
- 제20항에 있어서, 분자가 하나 이상의 혈청 응답 성분(SRE)를 포함하는 핵산 분자.
- 제21항에 있어서, 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대한 SRE5로서 나타낸 서열 또는 그 기능적 변이체를 포함하는 핵산 분자.
- 제22항에 있어서, 상기 변이체가 도 7에 나타난 ON SEQ(서열 동정 번호 1) SRE5에 비해 GW SEQ(서열 동정 번호 2) SRE5에 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 가지는 것인 핵산 분자.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 도 7에 SRE3 및 SRE4로서 지시된 혈청 응답 성분 또는 그 기능적 변이체를 포함하는 핵산 분자.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, TATA 박스를 포함하는 핵산 분자.
- 제25항에 있어서, TATA 박스가 서열 AAATA를 포함하는 것인 핵산 분자.
- 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Egr-1 결합 자리(EBS)를 포함하는 핵산 분자.
- 제27항에 있어서, Egr-1 결합 자리가 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대한 EBS로서 나타낸 서열을 가지거나 또는 상기 서열의 변이체를 가지는 것인 핵산 분자.
- 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대한 EBS로서 나타낸 서열에 비해 Egr-1에 대한 감소된 친화성을 가지는 것인 핵산 분자.
- 제29항에 있어서, 상기 변이체가 도 2에 EBS에 관해 나타낸 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
- 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Egr-1 결합 자리를 갖지 않는 핵산 분자.
- 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, Sp1에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제32항에 있어서, Sp1에 결합할 수 있는 두 개의 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 Sp1 결합 서열 하나 또는 둘 모두를 포함하는 핵산 분자.
- 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, cAMP 응답 성분을 포함하는 핵산 분자.
- 제35항에 있어서, 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대한 cAMP RE로서 나타낸 하나 이상의 cAMP 응답 성분을 포함하는 핵산 분자.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타낸 제1 cAMP RE를 포함하는 핵산 분자.
- EBS 서열을 임의적인 예외로 하고 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 나타난 모든 박스 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 지시된 분자에 비해 Egr-1 전사의 증가된 수준을 허용할 수 있는 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 지시된 분자의 변이체를 포함하는 핵산 분자.
- 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 지시된 분자에 비해 Egr-1의 전사의 감소된 수준을 허용할 수 있는 도 7에 GW SEQ(서열 동정 번호 2)에 대해 지시된 분자의 변이체를 포함하는 핵산 분자.
- 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, Egr-1을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제20항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 분자를 포함하는 핵산 벡터.
- 제20항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제42항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
- 제20항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제42항에 따른 벡터 또는 제43항에 따른 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자 치료 방법.
- 제20항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 사용, 제42항에 따른 벡터의 사용 또는 제43항에 따른 세포의 사용에 의해 생산된 Egr-1을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 환자 치료 방법.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, 치료가 상처의 치료(상처 및 관련 증상 치유 및 조직 치유를 촉진, 증대 또는 가속화시키는 치료법을 포함하며, 당뇨병 및 말초 동맥 폐색성 질환의 지절 궤양화, 수술 후의 반흔화, 화상, 건선의 치료, 조직 리모델링 및 골 회복의 가속화 및 맥관형성의 촉진, 경피 경강적 관상동맥 혈관형성술 후의 상피재형성을 포함함)인 방법.
- 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자 또는 Egr-1을 상처에 또는 상처 근처에 투여하는 방법.
- 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 프로브로서 사용하여 유전적 결함이 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 진단 방법.
- 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 사용하여 결합 연구에 의해 잠재적인 치료제를 동정하는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
- 제20항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자에 비해(예. 도 7에 나타난 GW SEQ(서열 동정 번호 2)를 포함하는 분자에 비해) 하나 이상의 뉴클레오티드 변화를 가지는 핵산 분자를 제공하고 상기 변화가 Egr-1의 전사 수준에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, Egr-1 전사를 상향 또는 하향 조절할 수 있는 제제의 동정 방법.
- 제49항 또는 제50항에 따른 방법에 의해 동정되는 제제.
- 제약학상 허용되는 담체 및 제20항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제42항에 따른 벡터 또는 제43항에 따른 세포를 포함하는 제약 조성물.
- 제약학상 허용되는 담체 및 제20항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제42항에 따른 벡터 또는 제43항에 따른 세포를 사용하여 생산된 Egr-1을 포함하는 제약 조성물.
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| KR20160118991A (ko) * | 2015-04-03 | 2016-10-12 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 지방유래 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발모촉진용 조성물 |
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