ES2204893T3 - Analogos de hormona con multiples prolongaciones ctp. - Google Patents
Analogos de hormona con multiples prolongaciones ctp.Info
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Abstract
LA INVENCION DESCRIBE UN PEPTIDO Y PROTEINAS FARMACEUTICAS CON VIDAS-MEDIAS PROLONGADAS. EL PEPTIDO MODIFICADO Y LAS PROTEINAS DE LA INVENCION CONTIENEN AL MENOS DOS EXTENSIONES EN TANDEM EN SUS TERMINOS-C QUE COMPRENDEN UNA PORCION TERMINAL CARBOXILA DE GONADOTROPINA CROIONICA HUMANA. ESTAS "UNIDADES CTP" CONSISTEN ESENCIALMENTE EN SECUENCIAS HCG-BETA DESDE LA POSICION 112,118 A LA POSICION 145 O SUS MODIFICACIONES CONSERVADORAS.
Description
Análogos de hormona con múltiples prolongaciones
CTP.
La invención se refiere a compuestos
farmacéuticos modificados para ampliar su estabilidad in
vivo. Más especialmente, la invención concierne a las
modificaciones de los péptidos de importancia farmacéutica mediante
una prolongación en tándem con el péptido del carboxi terminal de la
gonadotropina coriónica humana
La solicitud de patente PCT WO 90/09800,
publicada el 7 de Septiembre de 1990 describe diversas
modificaciones de las hormonas reproductoras. Además, esta
publicación describe que las hormonas y los compuestos farmacéuticos
proteicos, en general, pueden modificarse para ampliar sus semividas
biológicas in vivo mediante la ligación de la porción del
carboxi terminal de la subunidad \beta de la HCG o una variante de
la misma al terminal carboxi. La descripción de la solicitud de
patente PCT no aborda específicamente las prolongaciones en tándem
con las porciones múltiples del carboxi terminal (CTP, del inglés
"carboxy terminal portion") de la cadena \beta de la HCG. La
presente invención se dirige a dichas prolongaciones en tándem.
La gonadotropina coriónica humana (HCG, del
inglés "Human Chorionic gonadotropin") es una de al menos
cuatro hormonas reproductoras de una familia que también incluye: la
hormona estimuladora del folículo, la hormona luteinizante y la
hormona estimuladora del tiroides. Todas estas hormonas comprenden
subunidades \alpha que son idénticas entre el grupo, y subunidades
\beta que difieren según el miembro de la familia. La subunidad
\beta de la HCG es sustancialmente mayor que las tres hormonas
restantes, en que contiene aproximadamente 34 aminoácidos
adicionales en el terminal C, referidos en la presente memoria como
la porción carboxi terminal (CTP), el cual se considera responsable
de la comparativamente mayor semivida del suero de la HCG en
comparación con las otras gonadotropinas (Matzuk, M. et al.,
Endocrinol (1989) 126: 376). En la hormona nativa,
esta prolongación CTP contiene cuatro oligosacáridos similares a la
mucina enlazados al O.
La invención proporciona péptidos y proteínas
modificados con semividas biológicas ampliadas, los cuales se
caracterizan por contener, en su terminal carboxi, prolongaciones en
tándem de al menos dos secuencias CTP, en las cuales cada unidad CTP
consiste en la secuencia de aminoácidos encontrada nativamente en
las posiciones 112-118 hasta la posición 145 de la
subunidad \beta de la gonadotropina coriónica humana, o consiste
en una variante de dicha secuencia en la que dicha variante contiene
de 1 a 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos, y en las que
dichas sustituciones, tomadas acumulativamente, no dan como
resultado un cambio sustancial en las propiedades de la subunidad
CTP que confieren estabilidad. Estas proteínas ampliadas son útiles
para las mismas funciones biológicas que sus formas no modificadas,
pero permiten dosificaciones reducidas y otras ventajas debidas a su
semivida biológica ampliada.
Así, en un aspecto, la invención se dirige a un
péptido o una proteína que tienen una función biológica en animales,
donde dicho péptido o dicha proteína se modifican por una
prolongación en tándem en el terminal C con al menos dos unidades
CTP como las anteriormente definidas. En otro aspecto, la invención
se dirige a métodos para ampliar la semivida biológica de un péptido
o una proteína al proporcionar dichas prolongaciones. En otros
aspectos, la invención se dirige a materiales recombinantes y a
métodos para la construcción de los péptidos modificados de la
invención. También describimos anticuerpos inmunoreactivos
específicamente con ellos.
Las Figuras 1A-1C muestran la
construcción de los vectores para la producción recombinante de la
subunidad \beta de la hormona estimuladora del folículo humana
(FSH, del inglés "follicle stimulating hormone") que contiene
una o dos unidades CTP como una prolongación del carboxi
terminal.
La Figura 2 muestra el incremento de la
estabilidad biológica de la FSH que contiene las dos unidades CTP
como prolongaciones del C terminal de su subunidad \beta, en
comparación con la FSH tipo salvaje.
Cualquier péptido o cualquier proteína de
importancia biológica están sujetos a una modificación de acuerdo
con el método de la invención. Por tanto, se incluyen entre dichos
candidatos para la modificación a las hormonas peptídicas, tales
como: las cuatro hormonas "reproductoras" explicadas
anteriormente, especialmente las cadenas \beta de las mismas;
insulina; hormona de crecimiento humana; encefalina; ACTH; glucagón;
y similares. También son útiles como materiales para la modificación
de la invención diversos factores de crecimiento tales como:
factores de crecimiento similares a la insulina; factores de
crecimiento epidérmicos; factores de crecimiento del fibroblasto
ácidos y básicos; factores de crecimiento derivados de plaquetas;
los diversos factores estimuladores de colonias, tales como los CSF
de granulocitos, CSF de macrófagos, y similares; así como las
diversas citoquinas tales como IL-2,
IL-3 y la plétora de proteínas de interleuquina
adicional; los diversos interferones; el factor de necrosis tumoral;
y similares. También son candidatas para el método de la invención
las secuencias de péptidos cortas tales como: la hormona liberadora
de la hormona luteinizante (LHRH, del inglés "Luteinizing
releasing hormone"); la somatostatina; el factor liberador de la
hormona de crecimiento (GHRF, del inglés "Factor releasing hormone
growth"); y las endorfinas. Los medicamentos de proteína
adicionales tales como: proteínas tensioactivas alveolares; factores
natriuréticos; adhesinas, los péptidos del receptor; los ligandos
unidos al receptor, en general; los anticuerpos y fragmentos de los
mismos; y cualquier otro péptido o proteína útil con una función
biológica deseada pueden modificarse de acuerdo con los métodos
descritos en la presente memoria.
Tal como se usa en la presente memoria, la
"unidad CTP" se refiere a una secuencia de aminoácidos
encontrada en el terminal carboxi de la gonadotropina coriónica
humana, la cual se extiende desde el aminoácido
112-118 hasta el residuo 145 en el terminal C. Así,
cada unidad CTP, usada para modificar el terminal carboxi del
péptido o de la proteína, puede contener independientemente
28-34 aminoácidos, dependiendo del terminal N de la
CTP. La "unidad CTP" puede corresponder exactamente a la
secuencia nativa de CTP, o puede ser una variante en la que
1-5 de los aminoácidos contenidos en la secuencia
están sustituidos por un análogo conservador del residuo del
aminoácido nativo en esta posición, y en el que dichas
sustituciones, tomadas acumulativamente, no dan como resultado un
cambio sustancial en las propiedades de la unidad CTP que confieren
estabilidad. Un "análogo conservador" significa, en el sentido
convencional, un análogo en el que el residuo sustituido es de la
misma categoría de aminoácido general que aquel para el cual se
realiza la sustitución. Los aminoácidos se han clasificado en dichos
grupos, como se entiende en la técnica, por ejemplo, por Dayhoff, M.
et al.,
Atlas of Protein Sequences and Structure (1972) 5: 89-99. En general, los aminoácidos ácidos se incluyen en un grupo; los aminoácidos básicos en otro; los aminoácidos hidrófilos neutros en otro; etcétera.
Atlas of Protein Sequences and Structure (1972) 5: 89-99. En general, los aminoácidos ácidos se incluyen en un grupo; los aminoácidos básicos en otro; los aminoácidos hidrófilos neutros en otro; etcétera.
Más específicamente, los residuos de aminoácidos
pueden clasificarse genéricamente en cuatro subclases principales
como sigue:
Ácidos: el residuo tiene una carga negativa
debido a la pérdida del ión H a pH fisiológico y el residuo es
atraído por la disolución acuosa para buscar las posiciones
superficiales en la estructura de un péptido, en las cuales está
contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH
fisiológico.
Básicos: el residuo tiene una carga positiva
debido a la asociación con el ión H a pH fisiológico y el residuo es
atraído por la disolución acuosa para buscar las posiciones
superficiales en la estructura de un péptido, en las cuales está
contenido cuando el péptido está en medio acuoso a pH
fisiológico.
Neutros/no polares: Los residuos no están
cargados a pH fisiológico y el residuo es repelido por la disolución
acuosa para buscar las posiciones internas en la estructura de un
péptido, en las cuales está contenido cuando el péptido está en
medio acuoso. En la presente memoria, estos residuos también se
denominan "hidrófobos".
Neutros/polares: Los residuos no están cargados a
pH fisiológico, pero el residuo es atraído por la disolución acuosa
para buscar las posiciones externas en la estructura de un péptido,
en las cuales está contenido cuando el péptido está en medio
acuoso.
Por supuesto, se entiende que en una recolección
estadística de moléculas individuales de residuos, algunas moléculas
estarán cargadas, y otras no, y habrá una atracción o una repulsión
de un medio acuoso a un mayor o menor alcance. Para corresponderse
con la definición de "cargado", un porcentaje significativo (al
menos aproximadamente el 25%) de las moléculas individuales está
cargado a pH fisiológico. El grado de atracción o repulsión
requerido para la clasificación como polar o no polar es arbitraria
y, por tanto, los aminoácidos específicamente considerados por la
invención se han clasificado como uno o como otro. La mayoría de los
aminoácidos no nombrados específicamente pueden clasificarse en base
al comportamiento conocido.
Además, los residuos de aminoácidos pueden
clasificarse como cíclicos o no cíclicos, y aromáticos o no
aromáticos, clasificaciones auto explicativas con respecto a los
grupos sustituyentes de la cadena lateral de los residuos, y como
pequeños o grandes. El residuo se considera pequeño si contiene un
total de 4 átomos de carbono o menos, incluido el carbono
carboxílico. Por supuesto, los residuos pequeños son siempre no
aromáticos.
Para los aminoácidos de proteínas que se dan de
forma natural, la subclasificación de acuerdo con el precedente
esquema es la siguiente:
Ácidos: ácido aspártico y ácido
glutámico;
Básicos/no cíclicos: Arginina, Lisina;
Básicos/cíclicos: Histidina;
Neutros/polares/pequeños: Glicina, serina,
cisteina;
Neutros/no polares/pequeños: Alanina;
Neutros/polares/grandes/no aromáticos:
Treonina, Asparagina, Glutamina;
Neutros/polares/grandes/aromáticos:
Tirosina;
Neutros/no polares/grandes/no aromáticos:
Valina, Isoleucina, Leucina, Metionina;
Neutros/no polares/grandes/aromáticos:
Fenilalanina y Triptófano.
El aminoácido secundario codificado por gen, la
prolina, aunque está técnicamente dentro del grupo neutros/no
polares/grandes/cíclicos y no aromáticos, es un caso especial debido
a sus efectos conocidos sobre la estructura secundaria de las
cadenas peptídicas, y, por tanto, no se incluye en este grupo
definido.
Si los péptidos modificados de la invención son
construidos mediante la modificación del gen, las unidades CTP
contendrán únicamente sustituciones de aminoácidos codificados por
gen; sin embargo, si la unidad CTP se sintetiza por un método
estándar, por ejemplo, métodos de síntesis de péptidos en fase
sólida y se ligan, por ejemplo, enzimáticamente, al terminal C del
péptido o proteína aceptor, los aminoácidos no codificados por gen
tales como el ácido aminoisobutírico (Aib), la fenilglicina (Phg) y
similares, pueden también ser sustituidos por sus equivalentes
análogos.
Estos aminoácidos no codificados incluyen
también, por ejemplo: beta alanina (beta-Ala), u
otros omega-aminoácidos, tales como el
3-aminopropiónico, 4-aminobutírico,
etcétera, sarcosina (Sar), ornitina (Orn), citrulina (Cit),
t-butilalanina (t-BuA),
t-butilglicina (t-BuG),
N-metilisoleucina (N-MeIle), y
ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle), ácido cisteico (Cya),
2-naftilalanina (2-Nal), ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico
(Tic); ácido mercaptovalérico (Mvl);
\beta-2-tienilalanina (Thi); y
sulfuro de metionina (MSO). Estos también se incluyen
convenientemente en categorías particulares.
En base a las definiciones anteriores:
- -
- Sar y beta-Ala y Aib son neutros/no polares/pequeños;
- -
- t-BuA, t-BuG, N-MeIle, Nle, Mvl y Cha son neutros/no polares/grandes/no aromáticos;
- -
- Orn es básico/no cíclico;
- -
- Cya es ácido;
- -
- Cit, Acetilo Lys, y MSO son neutros/no polares/grandes/no aromáticos; y
- -
- Phg, Nal, Thi y Tic son neutros/no polares/grandes/aromáticos.
Los diversos omega-aminoácidos se
clasifican de acuerdo con el tamaño como neutros/no polares/pequeños
(beta-Ala, es decir,
3-aminopropiónico, 4-aminobutírico)
o grandes (todos los demás).
Otras sustituciones de aminoácidos de aquellos
codificados por gen también pueden incluirse en los compuestos
peptídicos que entran dentro del alcance de la invención y pueden
clasificarse en este esquema general de acuerdo con su
estructura.
Por supuesto, se debería notar que el péptido o
la proteína, a los cuales se unen los residuos CTP en tándem,
podrían estar también en forma modificada respecto de la que, por lo
común, se da biológicamente, en tanto que se retenga la actividad
biológica.
Los péptidos y las proteínas modificados de la
invención pueden modificarse adicionalmente de las maneras
generalmente entendidas para derivar secuencias de aminoácidos,
tales como: fosforilación, glicosilación, desglicosilación de formas
que comúnmente están glicosiladas, modificación de las cadenas
laterales de los aminoácidos (por ejemplo, conversión de la prolina
a hidroxiprolina) y modificaciones similares análogas a aquellos
acontecimientos post-traslacionales que se ha
encontrado que ocurren de manera generalmente.
Los métodos para construir los compuestos
biológicamente activos modificados peptídicos y proteicos de la
invención son bien conocidos en la técnica. Como se explicó
anteriormente, si únicamente se incluyen los aminoácidos codificados
por gen, el enfoque más práctico en actualmente es sintetizar estos
materiales de forma recombinante mediante la modificación del ADN
que codifica el péptido deseado. Las técnicas para la mutagénesis
dirigida a un sitio, la ligación de secuencias adicionales y la
construcción de sistemas adecuados de expresión son todos, por
ahora, bien conocidos en la técnica. El ADN que codifica las
unidades CTP, para añadirse al ADN que codifica el péptido o la
proteína deseados se construye, lo más convenientemente,
sintéticamente usando las técnicas estándar en fase sólida,
preferiblemente para incluir la limitación de sitios para facilitar
la ligación, y se une a la secuencia que codifica el péptido o la
proteína candidatos. Si el ADN que codifica el péptido o la proteína
candidatos no es ya parte de un sistema de expresión que contiene
los elementos de control adecuados para la transcripción y la
translación de la secuencia de codificación incluida, las secuencias
de codificación del ADN modificadas se proporcionan con estas
características. Como es bien sabido, los sistemas de expresión son
ahora adecuadamente compatibles con una amplia diversidad de
hospedantes, incluyendo hospedantes procariotas tales como bacterias
y hospedantes eucariotas tales como levadura, células vegetales,
células de insecto, células de mamífero, células de pájaro, y
similares.
Alternativamente, si el candidato biológico es un
péptido corto o si se puede efectuar la transferencia enzimática de
la subunidad, las unidades CTP de la invención pueden sintetizarse
directamente usando técnicas de síntesis de péptido en fase sólida
in vitro y bajo estas condiciones, si se desea, la subunidad
CTP puede modificarse por aminoácidos análogos que no son
codificados por gen.
Los compuestos biológicos modificados resultantes
contendrán al menos dos unidades CTP en tándem en su terminal C. Las
unidades múltiples de CTP que contienen tres o más unidades CTP
también están previstas y se incluyen dentro del alcance de la
presente invención. Como se indicó anteriormente, las unidades CTP
conjugadas en tándem al terminal C no necesitan ser idénticas entre
sí. Pueden variar en longitud con respecto al aminoácido de partida
del N terminal (posición 112-118 de la subunidad
\beta de la gonadotropina coriónica humana) y las sustituciones de
aminoácidos para los residuos nativos, si hay alguno, pueden variar
de unidad a unidad en las secuencias en tándem incluidas.
Como generalmente se sabe en la técnica, los
péptidos y las proteínas modificados de la invención pueden
acoplarse a marcadores, fármacos, agentes de localización,
vehículos, soportes sólidos, y similares, dependiendo de la
aplicación deseada. Las formas marcadas de los compuestos biológicos
modificados pueden usarse para rastrear su destino metabólico; los
marcadores adecuados para este propósito incluyen, especialmente,
marcadores de radioisótopos tales como yodo 131, tecnecio 99, indio
111, y similares. Los marcadores pueden también usarse para mediar
la detección de los péptidos o las proteínas modificados en los
sistemas de ensayo; en este caso, los radioisótopos pueden también
usarse así como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes,
marcadores cromogénicos, y similares. El uso de dichos marcadores es
especialmente útil si el péptido o la proteína son en sí mismos un
agente de localización tal como un anticuerpo o un ligando del
receptor.
Por el contrario, si el péptido o la proteína
modificados son un ligando de localización, principalmente, y está
relativamente libre de actividad alteradora del metabolismo, el
compuesto modificado de la invención puede conjugarse a un fármaco
apropiado, tal como un fármaco antiinflamatorio, un antibiótico, una
toxina y similares. Los compuestos modificados de la invención
pueden también unirse a vehículos para incrementar su inmunidad en
la preparación de anticuerpos específicamente inmunoreactivos con
estas nuevas formas modificadas. Los vehículos adecuados para este
propósito incluyen la homocianina de la lapa californiana (KLH, del
inglés "Keyhole limpet hemocyanin") albúmina de suero bovina
(BSA, del inglés "bovine serum albumin"), y el toxoide de la
difteria y similares. Pueden emplearse las técnicas estándar de
acoplamiento para enlazar los péptidos modificados de la invención
con los vehículos, incluyendo el uso de enlazadores
bifuncionales.
Pueden emplearse similares técnicas de enlace,
junto con otras, para acoplar los péptidos y las proteínas
modificados de la invención con soportes sólidos. Cuando se acoplan
estos péptidos y proteínas modificados pueden usarse entonces como
reactivos de afinidad para la separación de los componentes deseados
con lo cual se muestra la reacción específica.
Finalmente, los péptidos y las proteínas
modificados de la invención pueden usarse para generar anticuerpos
específicamente inmunoreactivos con estos nuevos compuestos. Estos
anticuerpos son útiles en una diversidad de aplicaciones
terapéuticas y de diagnóstico, dependiendo de la naturaleza de la
actividad biológica del péptido o proteína modificados.
Los péptidos o las proteínas modificados de la
invención se formulan y se administran usando métodos comparables a
aquellos conocidos para el péptido o la proteína no modificados
correspondientes a la forma modificada. Así, los métodos de
formulación y administración variarán de acuerdo con la forma no
modificada candidata. Sin embargo, el nivel y la frecuencia de
dosificación de la administración puede reducirse en comparación con
la forma no modificada en vista de la semivida biológica ampliada
del péptido o proteína modificados.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero
no limitar la invención.
Las Figuras 1A y 1B muestran la construcción de
un vector de expresión en el que se modifica la cadena \beta de la
FSH humana para incluir dos unidades CTP. Como se muestra en la
Figura 1B, el sitio HindIII en el terminal 3' de la subunidad
\beta de la FSH humana, ampliada por una unidad CTP, se usa para
acoplar la unidad CTP del terminal 3' del gen de la
HCG-\beta humana para obtener la subunidad \beta
ampliada. Entonces, el gen de la hFSH-\beta
(CTP)_{2} se liga en el vector de expresión PM^{2} para
obtener un sistema de expresión capaz de producir la forma ampliada
de la cadena \beta de la FSH en células de mamífero. La
construcción de los vectores hospedantes de expresión está descrita
por Matzuk, M. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)
84: 6.354-6.358; Matzuk, M. M. et al., J.
Cell Biol. (1988) 106: 1.049-1.059.
En más detalle, para crear la quimera
hFSH-\beta que porta una unidad sencilla de la
región terminal de la subunidad \beta de la hCG
(hFSH-\beta (CTP)) enlazada al O, se creó un sitio
HindIII en el triplete de parada del gen de la
hFSH-\beta en el triplete 111 y en el gen de la
hCG-\beta en el triplete 118 (Figura 1A). El
fragmento HindIII-HindIII del gen de la
hFSH-\beta se ligó, en estructura, al fragmento
BamHI-HindIII de la CG-\beta. Esta
quimera (hFSH-\beta (CTP)) contenía un cambio de
ser^{118} a Ala^{118} en el punto de ligación, que se corrigió
mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido. La quimera que
contiene dos repeticiones de CTP en tándem (la
hFSH-\beta (CTP)_{2}) se construyó
mediante la creación de un nuevo sitio HindIII en el triplete de
parada de la quimera de la hFSH-\beta (CTP)
(Figura 1B). Se ligó el fragmento HindIII-HindIII al
fragmento BamHI-HindIII de la
hCG-\beta. El triplete de Ala generado puede
reconvertirse en un triplete de serina como se describió
anteriormente.
Para insertar los genes de
hFSH-\beta (CTP) o hFSH-\beta
(CTP)_{2} en el vector de expresión eucariota pM^{2}, los
sitios HindIII en los terminales 5' se convirtieron en sitios BamHI
usando un enlazante de oligonucleótido del fragmento Klenow y BamHI
(Figura 1C), y los fragmentos BamHI-BamHI que
contienen los genes de la hFSH-\beta (CTP) o
hFSH-\beta (CTP)_{2} se insertaron en el
sitio BamHI en el pM^{2}. Se confirmó la orientación correcta
mediante análisis de enzima de restricción y se secuenció la
secuencia entera del exón III para confirmar la especificidad de la
mutagénesis.
Se inyectó, en ratas, la FSH humana que contenía
la subunidad \beta ampliada por dos unidades CTP preparadas como
se explicó anteriormente en el Ejemplo 1. En el estudio, se usaron
24 ratas hembras Sprague-Dawley. Se inyectaron 12
ratas cada una con 10 IU de FSH no modificada formulada en medio
MEM; se inyectaron 12 ratas con 10 IU de FSH que comprendía
hFSH-\beta (CTP)_{2} formulada en medio
MEM. Se retiró el suero inmediatamente y varias veces durante la
primera hora, y luego después de 2, 4 y 8 horas. El suero se ensayó
usando técnicas estándar de radioinmunoensayo para la hormona FSH.
Los resultados se muestran en la Figura 2.
Como se muestra en la figura, mientras la
cantidad de FSH no modificada en suero descendió de aproximadamente
0,5 IU/ml a menos de 0,05 IU/ml durante un periodo de 8 horas, la
FSH modificada de la invención que contenía dos unidades CTP
continuó sustancialmente sin cambios durante este periodo de tiempo,
descendiendo de aproximadamente 0,8 IU/ml a aproximadamente 0,5
IU/ml.
Claims (10)
1. Un péptido o una proteína modificados,
comprendiendo dicho péptido o proteína modificados un péptido o una
proteína que tiene una actividad biológica ampliada en su terminal C
por dos o más unidades CTP en tándem; en los que cada una de dichas
unidades CTP consisten en la secuencia de aminoácidos encontrada
nativamente en las posiciones 112-118 hasta la
posición 145 de la subunidad \beta de la gonadotropina coriónica
humana, o consiste en una variante de dicha secuencia en la que
dicha variante contiene de 1 a 5 sustituciones de conservadoras
aminoácidos, y en la que dichas sustituciones tomadas
acumulativamente no dan como resultado un cambio sustancial en las
propiedades de la subunidad CTP que confieren estabilidad.
2. El péptido o la proteína modificados de la
reivindicación 1, en los que dicha unidad CTP consiste en la
secuencia de aminoácidos encontrada nativamente en las posiciones
112-118 hasta la posición 145 de la subunidad
\beta de la gonadotropina coriónica humana.
3. El péptido o la proteína modificados de la
reivindicación 1, en los que al menos una unidad CTP contiene al
menos una sustitución conservadoras de aminoácidos con respecto a la
secuencia de aminoácidos nativa en las posiciones
112-118 hasta la 145 de la subunidad \beta de la
gonadotropina coriónica humana.
4. Una secuencia de ADN que codifica el péptido o
la proteína modificados de la reivindicación 1.
5. Un sistema de expresión recombinante capaz de
producir, cuando está contenido en una célula hospedante
recombinante, un péptido o una proteína modificados, comprendiendo
dichos péptido o proteína modificados un péptido o una proteína que
tiene una actividad biológica ampliada en su terminal C por dos o
más unidades CTP en tándem, comprendiendo dicho sistema de expresión
un ADN que codifica dicho péptido o proteína modificados enlazado
operativamente a las secuencias control para efectuar su expresión,
en los que cada una de dichas unidades CTP consisten en la secuencia
de aminoácidos encontradas nativamente en las posiciones
112-118 hasta la posición 145 de la subunidad
\beta de la gonadotropina coriónica humana, o consisten en una
variante de dicha secuencia en la que dicha variante contiene de 1 a
5 sustituciones conservadoras de aminoácidos, y en la que dichas
sustituciones tomadas acumulativamente no dan como resultado un
cambio sustancial en la propiedades de la subunidad CTP que
confieren estabilidad.
6. La células hospedantes recombinantes
transfectadas o transformadas con el sistema de expresión de la
reivindicación 5.
7. Un método para producir un péptido o una
proteína modificados, comprendiendo dichos péptido o proteína
modificados un péptido o una proteína que tiene una actividad
biológica ampliada en su terminal C mediante dos o más unidades CTP
en tándem, método que comprende: cultivar las células de la
reivindicación 6 en las condiciones en las que se expresa dicho ADN;
y recuperar dichos péptido o proteína modificados del cultivo.
8. Un método para ampliar la semivida biológica
de un péptido o una proteína biológicamente activos, comprendiendo
dicho método ampliar la secuencia de aminoácidos de dichos péptido o
proteína mediante al menos dos unidades CTP, en los que cada una
estas unidades de CTP consiste en la secuencia de aminoácidos
encontrada nativamente en las posiciones 112-118
hasta la posición 145 de la subunidad \beta de la gonadotropina
coriónica humana, o consisten en una variante de dicha secuencia en
la que dicha variante contiene de 1 a 5 sustituciones conservadoras
de aminoácidos, y en la que dichas sustituciones tomadas
acumulativamente no dan como resultado un cambio sustancial en las
propiedades de la subunidad CTP que confieren estabilidad.
9. El péptido o la proteína modificados de la
reivindicación 1, en los que dichos péptido o proteína modificados
se acoplan además a sustituyentes adicionales que no alteran la
secuencia de aminoácidos.
10. El péptido o la proteína modificados de la
reivindicación 9, en los que dicho sustituyente adicional se
selecciona entre el grupo que consiste en: un soporte sólido, un
marcador, un fármaco, un sacárido y un vehículo que confiere
inmunidad.
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