JPH07502166A - 複数のｃｔｐ付加を有するホルモンアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 複数のＣＴＰ付加を有するホルモンアナログ技術の分野 本発明はｉｎ　ｖｉｖｏにおける安定性が向上するように修飾を受けた医薬用化 合物に関する。より具体的には本発明はヒト絨毛性血清性性腺刺激ホルモンのカ ルボキシル端ペプチドを直列に付加すること（ｔａｎｄｅｍ　ｅｘｔｅｎｓｉｏ ｎ）による、薬学的に重要なペプチドの修飾に関する。

技術背景 １９９０年９月７日に公開され、本明細書中に参考文献として取り込まれるＰＣ Ｔ出願第ＷＯ９０１０９８００号は、生殖ホルモンの様々な修飾について記載し ている。更に、この公開は、タンパク薬剤及び一般のホルモンの±ｎ　ｖｉｖＯ における生物学的半減期を延長するために、ＨＣＧ−βサブユニットまたはその 変異体のカルボキシル端部位を、該タンパク薬剤等のカルボキシル端に結合する という修飾を行うことができることを開示する。ＰＣＴ出願の開示は多数のＨＣ Ｇ−β鎖カルボキシル端部位（ＣＴＢ）を直列に付加することを特異的に記載す るものではない。本発明はそのような直列の付加を記載する。

ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（Ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｒｉｏｎｊｃ　ｇｏｎａｄ。

ｔｒｏｐｉｎ）（ＨＣＧ）は少な（とも４つの生殖ホルモンからなるファミリー の１つであり、このファミリーには濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び甲 状腺刺激ホルモンを含む。これらのホルモンはすべて、グループ間で同一である αサブユニット及びファミリーのメンバーごとに異なるβサブユニットから成る 。

ＨＣＧのβサブユニットは残りの３つのホルモンのβサブユニットよりもかなり 大きく、本明細書中にはカルボキシル端部位（ＣＴＰ）と記載するおよそ３４の 余分なアミノ酸をＣ端に含んでおり、それが池の性腺刺激ホルモンに比べてｈｃ Ｇが血清中で比較的長い半減期をもつ原因と考えられている（Ｍａ　ｔ　ｚｕｋ 、　Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　（１９８９）１２６：３７６）。天然の ホルモンではこのＣＴＰ付加は４つのムチン様〇−結合オリゴ糖鎖を含む。

発明の概要 本発明はカルボキシル端に少なくとも２つのＣＴＰ配列の直列付加を含むことに より生物学的半減期が延長した、修飾ペプチド及びタンパク質を提供する。これ らの付加タンパク質は未修飾のものと同等の生物学的機能を有するが、生物学的 半減期の延長により投与量を減らすことができるなどの利点を有する。

このように、１つの側面において、本発明はＣ端に少なくとも２つのＣＴＰ配列 の直列付加という修飾を受け、動物体内において生物学的機能を有するペプチド あるいはタンパク質を目的とする。別の側面において、本発明はこのような付加 を与えることにより、ペプチドあるいはタンパク質の生物学的半減期を延長させ る方法を目的とする。さらに別の側面において本発明は本発明の修飾タンパク質 を構築するための組み換え材料及び組み換え方法、そしてこれらと特異的に免疫 反応を起こす抗体を目的とする。

図面の簡単な説明 図ＬＡ−ＩＣは１つまたは２つのＣＴＰユニットをカルボキシル端付加として含 むヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβザブユニット組み換え体の製造のための ベクターのコンストラクションを示す。

図２は野生型ＦＳＨと比較してβサブユニットに２つのＣＴＰユニットＣ端付加 を含むＦＳＨの生物学的安定性の増強を示す。

発明の実施様式 生物学的に重要なペプチドまたはタンパク質はすべて本発明の方法に従った修飾 を受け得る。従って、このような修飾の対象候補に含まれるのは上記の４つのヒ ト”生殖”ホルモン、特にそれらのβ鎖；インスリン；ヒト成長ホルモン；エン ケファリン；ＡＣＴＨ，グルカゴン；等のようなペプチドホルモンである。また 本発明の修飾を受けるものとして有用なものにはインスリン様成長因子：表皮成 長因子；酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子７血小板由来成長因子などの様々な 成長因子、顆粒球Ｃ３Ｆ　；大食細胞Ｃ３Ｆ等のような様々なコロニー刺激因子 、並びにＩＬ−２，ＩＬ−３及びそのほか非常に多くのインターロイキンクン！ ＜り質：様々なインターフェロン；腫瘍壊死因子：等のような様々なサイト力イ ノがある。また本発明の方法を用いる候補として、黄体形成ホルモン放出ホルモ ン（ＬＨＲＨ）：ソマトスタチン；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、及びエ ンドルフィンのような短いペプチド配列がある。肺胞界面活性タンパク質：ナト リウム利尿性因子；アトへシン；受容体ペプチド；一般の受容体結合リガンド： 抗体及びその断片：並びに、所望の生物学的機能を有するその他の有用なペプチ ドまたはタンパク質、等のタンパク質薬剤もまた本明細書中に記載された方法に 従って修飾を受け得る。

本明細書中に使用されている”ＣＴＰユニット“はヒト絨毛性性腺刺激ホルモン のカルボキシル端のアミノ酸１１２−１１８から１４５残基目に存在するアミノ 酸配列に関する。このようにペプチドまたはチンノ（り質のカルボキシル端の修 飾に用いる各ＣＴＰユニットはＣＴＰのＮ端に応じてそれぞれ独立に２８−３４ アミノ酸を含んでいてよい。“ＣＴＰユニツビは天然のＣＴＰ配列に正確に一致 していてもよく、配列中に含まれる１−５のアミノ酸がその位置で保存的なアナ ログに置換されていても良く、この場合置換は累積的に起こり、ＣＴＰユニ・ッ トの特性である安定性には大きな変化は生じない。“保存的なアナログ１は慣用 された意味において、置換後の残基が置換されたアミノ酸残基と同じ一般的アミ ノ酸範鴫に入るようなアナログを意味する。当該技術分野において理解されて０ るように、アミノ酸は例えばＤａｙｈｏｆ　ｆ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｔ　１ａ ｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ（ １９７２）　５：８９−９９　に記載されているようにこのようなグループに分 類されている。一般に酸性アミノ酸が１つのグループをつくり、塩基性アミノ酸 がまた１つのグループをつくり、中性疎水性アミノ酸がまた別のグループをつ（ る、というようになっている。

より具体的には、アミノ酸残基は一般に下記のような主に４つのサブクラスに亜 鈴類される： 酸性：生理的ｐＨにおいて残基は■］イオンを失って負の電荷をもち、水性溶液 に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に 存在する場合、残基はペプチドの構造中、表面に位置しようとする。

塩基性：生理的ｐＨにおいて残基はＨイオンの結合によって正の電荷をもち、水 性溶液に誘引される。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環 境中に存在する場合、残基はペプチドの構造中、表面に位置しようとする。

中性／無極性：生理的ｐＨにおいて残基は電荷をもたず、水性溶液に反発される 。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場合 、残基はペプチドの構造中、内部に位置しようとする。これらの残基は本明細書 中、”疎水性”とも定義される。

中性／極性：生理的ｐＨにおいて残基は電荷をもたないが、水性溶液に誘引され る。このため、この残基を含むペプチドが生理的ｐＨの水性環境中に存在する場 合、残基はペプチドの構造中、外側に位置しようとする。

個々の残基分子の統計的な集合においてはある分子は電荷をもち、他の分子は電 荷をもたず、多かれ少なかれ水性溶液に誘引または反発されるであろうことはも ちろん理解されるであろう。”電荷をもつ”という定義に適合するには個々の分 子の有意の割合（少なくともおよそ２５％）が生理的ｐＨにおいて電荷をもつ。

極性または無極性に分類するために必要な誘引または反発の度合いは独断的なも のであり、従って、本発明において特に意図されるアミノ酸はそのどちらかに分 類される。特に定義されていないアミノ酸の多くは、それらの知られている行動 に基づき分類できる。

アミノ酸残基はさらに、環式または非環式及び、芳香族または非芳香族という残 基の側鎖の置換基による自明のクラス分は及び、小型または大型という亜鈴類が できる。カルボキシル基の炭素を含め合計４つ若しくはそれ以下の炭素原子を含 む場合その残基は小型と考える。小型残基はもちろん常に非芳香族である。

自然界に存在するタンパク質アミノ酸の上記の提案にしたがつた亜鈴類は以下の ようになる。

酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸塩基性／非環式：アルギニン、リジン 塩基性／環式：ヒスチジン 中性／極性／小型：グリシジ、セリン、システィン中性／無極性／小型；アラニ ン 中性／極性／大型／非芳香族：スレオニン、アスノくラギン、グルタミン中性／ 極性／大型／芳香族、チロシン 中性／無極性／大型／非芳香族二ノ（リン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ ン 中性／無極性／大型／芳香族：フェニルアラニン、及びトリプトファン遺伝子に コードされている第２アミノ酸のプロリンは専門的（こ（嘘中性／無極性／大型 ／環式及び非芳香族のグループに入るが、ペプチド鎖の２次構造への既知の効果 のため特別なケースとなり、従って、この定義グループ１こ１よ含まれなＬＮ。

もし本発明の修飾ペプチドが遺伝子の修飾によって構築される場合、ＣＴＰユニ ットは遺伝子にコードされるアミノ酸による置換のみ含むことになる力（、ＣＴ Ｐユニットが標準的なペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法によって合成 され、そして受け手のペプチドまたはチンノ（り質のＣ端（こ、例え１ブ酵素的 １こ結合される場合、アミノイソブチル酸（Ａ　ｉ　ｂ）　、フェニルグリシン （Ｐｈｇ）等のような遺伝子にコードされないアミノ酸も類似の相似物と置換さ れ得る。

これらのコードされないアミノ酸は例えば、ベータアラニン（ｂｅｔａ−ａｌａ ）、または３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸のようなオメガアミノ 酸、及びサルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｑｒｎ）、シトル１ノン（ＣｉＬ ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）　 、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ　Ｍｅ　Ｉ　ｌ　ｅ）　、及びンクロヘキシルア ラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ンステイン酸（Ｃｙａ）　、２− ナフチフレアラニン（２−Ｎａｌ）；１．２．３．４−テトラヒトロイソキノ嘱 ノン−３−カルボキシル酸（Ｔｉｃ’）、メルカプト吉草酸（Ｍｖ　］　）　； ］β−２−チェニルアラニンＴｈｉ）：並びにメチオニンンスル７オキシド（Ｍ ＳＯ）を含む。これらもまた、好都合にもある特定の範鴎にはいる。

上記の定義に基づき、 Ｓａｒ及びｂｅｔａ−Ａｌａ及びＡｉｂは中性／無極性／１１１型；ｔ−ＢｕＡ ｌｔ−ＢｕＧＳＮ−Ｍｅ　Ｉ　Ｉ　ｅ、Ｎｌ　ｅ、Ｍｖｌ及びＣｈａは中性／無 極性／大型／非芳香族： Ｏｒｎは塩基性／非環式； ％式％ Ｃａｔ、アセチルＬｙｓ及びＭＳＯは中性／極性／大型／非芳香族、そしてＰｈ ｇ、ＮａＬ　Ｔｈｉ及びＴｉｃは中性／無極性／大型／芳香族。

さまざまなオメガアミノ酸は大きさによって、中性／無極性／小型（ｂｅｔａ− ＡＩ　ａ、すなわち３−アミノプロピオン酸、４−アミノブチル酸）また（よ大 型（その他もすべて）に分類される。

その他の、遺伝子にコードされるアミノによるアミノ酸置換も本発明の範囲内の ペプチド化合物に含まれ、カリそれらの構造に従ってこの一般的なスキーム（ｓ ｃｈｅｍｅ）により分類され得る。

直列ＣＴＰ残基が結合するペプチドまたはタン／＜り質はまた、生物学的活性が 失われない限り通常生物学的に存在する型から、修飾され得ること（よもちろん 特筆すべきことである。

本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はリン酸化、グリコジル化、通常の糖鎖結 合型の脱グリコリル化、アミノ酸側鎖の修飾（例えばプロリンのヒドロキシルプ ロリンへの転換）及び一般に起こることが知られてＬする転写後の修飾ζ二類似 した同様の修飾のような、一般に理解されている方法によって派生アミノ酸配夕 １ｊへとさらに修飾され得る。

本発明の生物学的に活性な化合物である修飾ペプチド及びチンノくり質を構築す る方法は当該技術分野ではよ（知られている。上記のように、遺伝子１こコード されるアミノ酸のみが含まれる場合、現在量も実際的なアプローチは目的のペプ チドをコードするＤＮＡを修飾することによってこれらの物質を組み換え合成す ることである。部位特異的突然変異誘発、付加配列の結合及び適切な発現システ ムの構築のための技術はすべて、現在では当該技術分野１こお（λでよ（知られ てｌ、Ｘることである。目的のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ１ こ付加されるＣＴＰユニットをコードするＤＮＡは最も好都合には、標準的な固 相技術を用Ｌ１て合成的に構築され、その際、好ましくは結合を簡単にするため υＩ限酵素認識部位を含むように合成され、候補のペプチドまたはタンパク質を コードする配列に結合される。候補のペプチドまたはタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列がそこに含まれているコーディング配列の転写及び翻訳を制御する適切 な要素を含む発現システムの一部にまだなっていない場合、修飾されたＤＮＡコ ーディング配列力（これらの特徴をもって提供される。よく知られているように 、現在、発現システムはバクテリアのような原核宿主、及び酵母、植物細胞、昆 虫細胞、ホニュウ類細胞、鳥類細胞等のような真核宿主を含む、広く多様な宿主 に適合するものが利用可能である。

また、候補となる生化学的薬剤が短いペプチドである場合、または酵素による下 で、もし望むならば、ＣＴＰユニットは遺伝子にコードされないアミノ酸アナロ グによって修飾されてもよい。

得られた修飾生化学的薬剤は少なくとも２つのＣＴＰユニツトをＣ端に直列に含 む。３つ若しくはそれ以上のＣＴＰユニットを含む複数ＣＴＰユニ・ットもまた 考えられ、本発明の範囲に含まれる。上記のように、Ｃ末端に直列に結合された ＣＴＰユニットは互いに同一である必要はない。Ｎ端の初めのアミノ酸（ヒト絨 毛性性腺刺激ホルモンβサブユニットの１１２−１１８位）に応じて、長さが異 なっていてもよいし、天然の残基に対するアミノ酸置換がもしある場合には、含 まれている直列配列の中で、その置換がユニットごとに異なっていてもよい。

本発明タンパク質の結合型 当該技術分野において一般に知られているように、本発明の修飾ペプチド及びタ ンパク質は目的の応用に従って、ラベル、薬剤、標的因子、担体、固相支持体等 に結合していてもよい。ラベルされた型の修飾生化学薬剤は代謝の結果を追跡す るために使用されても良いし；この目的に適したラベルには特にヨウ素１３１、 テクネチウム９９、インジウム１１１等のようなラジオアイソトープラベルが含 まれる。ラベルはまた、分析系において修飾タンパク質またはペプチドの検出を 媒介するのに使用されてもよい：この場合には、酵素ラベル、蛍光ラベル、色原 体ラベル等と同様に、ラジオアイソトープを使用することもできる。このような ラベルの使用はペプチドまたはタンパク質がそれ自身、抗体または受容体リガン ドのような標的因子である場合、特に有用である。

反対に、持に修飾ペプチドまたはタンパク質が標的因子であり、比較的代謝によ る活性の変化がない場合、本発明の修飾された化合物は抗炎症剤、抗生物質、毒 素等のような適切な薬剤と結合してもよい。本発明の修飾化合物はまた、これら の新たな修飾された型に特異的に免疫反応を起こす抗体の調製において、免疫原 性を増幅するために担体と結合してもよい。この目的に適切な担体は、キーホー ルリンベットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎ ｉｎ）（ＫＬＨ）　、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びジフテリアトキソイド 等を含む。本発明の修飾ペプチドを担体へ結合するために、２官能性リンカ−の 使用を含む標準的な結合技術が使用され得る。

他の方法に加えて、同様の結合技術が本発明の修飾ペプチド及びタンパク質を面 相支持体に結合させるのに使用され得る。結合すると、次にこれらの修飾ペプチ ド及びタンパク質は目的の化合物を分離するための特異的反応を引き起こす親和 性試薬として使用され得る。

最後に、本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はこれらの新たな化合物と特異的 に免疫反応をおこす抗体を作成するために使用されてもよい。これらの抗体は未 修飾のペプチド及びタンパク質の生物学的活性の性質に応じて、様々な診断及び 治療への応用に有用である。

本発明の修飾ペプチド及びタンパク質はこれらに対応する未修飾のペプチド及び タンパク質と同様の方法によって調製され、投与される。このように、調製及び 投与方法は候補の未修飾型に従って変わる。しかし、修飾ペプチドまたはタンパ ク質の生物学的半減期の延長を考慮すれば投与の量及び頻度は未修飾型にくらべ て減少してもよい。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、制限するためのものではな い。

実施例１ ２つのＣＴＰユニット直列付加を有するヒトβサブユニットの分離図ＩＡ及びＩ ＢはヒトＦＳＨのβ鎖が２つのＣＴＰユニツトを含むよう１こ修飾されている発 現ベクターのコンストラクションを示す。図ＩＢＩこホされるよう（こ、より付 加されたβサブユニットを得るために、１つのＣＴＰユニツトが付加したヒトＦ ＳＨβ鎖の３゛端のＨｉｎｄｌ　ｌ　１部位をヒトＨＣＧ−β遺伝子の３゛端由 来のＣＴＰユニットを結合するのに用いる。次に付加されｔこ型のＦＳＨ−β鎖 の、ホニュウ類の細胞内での生産を可能にする発現システムを得るため、ｈＦＳ Ｈ−β（ＣＴＰ）２遺伝子を発現ベクターｐＭ２へ結合する。宿主発現ベクター のより詳細には、ｈＣＧβサブユニット（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）’Ｉの〇−結合 末端部位を１ユニツトもつｈＦＳＨβキメラを作成するためζ：、ｈ　Ｆ　Ｓ　 Ｈβ遺伝子のコドン１１１の停止コドン及びｈＣＧＨ遺伝子のコドン１１８１こ Ｈ４ｎｄｌ１１部位を作成した（図ＩＡ）、ｈＦＳＨβ遺伝子由来のＨｉｎｄＩ 　１　ｌ−Ｈ４ｎｄｌｌＩフラグメントをＣＧβ由来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ 　Ｉ　Ｉフラグメントに結合した。このキメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）　）は結 合部位１こ５ｅｒ１１８力）らＡ　ｌａ　ｌ　１　ｍへの変化を含むが、これは オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発番＝よって訂正された。２つの直列ＣＴ Ｐ反復を含むキメラ（ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）？）はｈＦＳ）ｌａ（ＣＴＰ）キメ ラの停止コドン（二新たなＨ４ｎｄＩＩＩ部位を作成することによって構築した （図ＩＢ）。ＨｊｎｄＩ　Ｉ　ｌ−ＨｌｎｄｌＩ　１７ラグメントをｈＣＧβ由 来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄｌｌＩフラグメント１こ結合した。つくられたａｌａ コドンは上記の方法によらてｓｅｔコドンへ再転換され得る。

ｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）またはｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２遺伝子を真核発現ベクタｐ Ｍ”に挿入するために、クレノー酵素及びＢａｍＨＩオＩＪゴヌクレオチドＩＪ ンカーを用いて５°端のＨｉｎｄＩ１１部位をＢａｍＨＩ部位へ転換しく図ＩＣ ）、そしてｈＦｓＨβＣＴＰまたはｈＦＳＨβ（ＣＴＰ）２遺伝子を含むＢａｍ ＨＴ−ＢａｍＨＩフラグメントを９Ｍ２のＢａｍＨ１部位１こ挿入した。正しＬ １方向で挿入されたことを制限酵素解析によって確認し、そして突然変異誘発の 特異性を確かめるためにエクソンｍ全体の配列を塩基配列決定した。

上記の実施例１で示したように作成した、２つのＣＴＰユニットを付加したβサ ブユニットを含むヒトＦＳＨをラットに投与した。２４匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄ ａｗｌｅｙメスのラットをこの実験に使用した。１２のラットにはそれぞれ、Ｍ ＥＭ培地中で作成された１０　１Ｕの未修飾ＦＳＨを投与し、残りの１２のラッ トにはそれぞれ、ＭＥＭ培地中で作成された１０　ＩＵのｈＦＳＨβ（ＣＴＰ） ２付加ＦＳＨを投与した。血清を、投与直後、及び１時間以内に数回、モして２ ．４、及び８時間後に採取した。ＦＳＨホルモンに対する標準的なラジオイムノ アッセイを用いて血清を解析した。結果を図２に示す。

図２に示されるように、血清中の未修飾ＦＳＨの量は８時間の間に０．５ＩＴＪ ／ｍｌから０．０５　ＩＵ／ｍ１未満に減少したが、２つのＣＴＰユニットを含 む本発明の修飾ＦＳＨ量はこの時間を経ても殆ど変化せず、約０．８１Ｕ／ｍ＋ から約０．５　１Ｕ／ｍｌに減少するだけである。

工 工 ｈＦＤ）−１ｂ　（ＣＴＰ）　マタＩ；ｉ　ｈＦＳ）−１ｂ　（ＣＴＰ）２ＦＩ Ｇ、ＩＣ （１ｗｌｎ＋）　＋ｓ＊ 平成　６年り０月／ｌＩ−日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的 活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質 。
2. ２．ＣＴＰユニットが、本質的に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニッ トの１１２−１１８位から１４５位に天然に存在するアミノ酸配列からなる請求 項１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
3. ３．少なくとも１つのＣＴＰユニットがヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユ ニットの１１２−１１８位から１４５位に存在する天然のアミノ酸配列に関して 、少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の修飾ペプチ ドまたはタンパク質。
4. ４．請求項１の修飾ペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
5. ５．修飾ペプチドまたはタンパク質をコードし、発現をもたらすための制御配列 に機能的に結合されているＤＮＡを含み；組み換え宿主細胞内に含まれる場合に 該修飾ペプチドまたはタンパク質を生産できる、組み換え発現システムであって 、該修飾ペプチドまたはタンパク質は、２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニ ットをＣ端に付加された、生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質を含 む、組み換え発現系システム。
6. ６．請求項５の発現システムで形質導入または形質転換された、組み換え宿主細 胞。
7. ７．２つ若しくはそれ以上の直列ＣＴＰユニットをＣ端に付加された、生物学的 活性を有するペプチドまたはタンパク質を含む修飾ペプチドまたはタンパク質の 製造方法であって、 該コーディングＤＮＡが発現される条件下で請求項６の請求の細胞を培養し；そ して 該修飾ペプチドまたはタンパク質を回収する、ことからなる方法。
8. ８．生物学的活性を有するペプチドまたはクンバク質の生物学的半減期を延長す る方法であって、該ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも２つ の直列ＣＴＰユニットを付加することからなる方法。
9. ９．さらにアミノ酸配列は変化させない追加の置換体と結合している、請求項１ に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
10. １０．追加の置換体が固相支持体、ラベル、薬剤、糖質、及び免疫原性を与える 担体から選ばれる、請求項９に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質。
11. １１．請求項１に記載の修飾ペプチドまたはタンパク質と特異的に免疫反応性を もつ抗体。