ES2203565T3 - Revestimiento analogo a hueso para materiales de implante metalicos. - Google Patents

Abstract

Revestimiento análogo a huesos constituido por un componente principal orgánico e inorgánico para materiales de implantes metálicos de cualquier geometría superficial, caracterizado porque está constituido esencialmente por una matriz de colágeno mineralizada con fosfato de calcio.

Description

Revestimiento análogo a huesos para materiales de implante metálicos.

La invención se refiere a un revestimiento análogo a huesos generado por vía biomimética, constituido por un componente principal orgánico e inorgánico para materiales de implante metálicos de cualquier geometría superficial, así como a un procedimiento para su obtención. Los componentes esenciales de este revestimiento son colágeno y fases de fosfato de calcio que forman el componente principal orgánico e inorgánico del hueso. El revestimiento según la invención es apropiado en medida especial como matriz para la integración de otras substancias inductivas, como por ejemplo factores de crecimiento, proteínas de adhesión o productos activos farmacológicos.

Con relación a la cuestión de conseguir una adaptación mejorada de las propiedades fisicoquímicas y bioquímicas de las superficies de los implantes con respecto al tejido circundante, local, con el fin de optimizar la biocompatibilidad y la biofuncionalidad, se siguen planteamientos diferentes.

Además de modificaciones puras de la topografía de la superficie de implante, como por ejemplo corrosión o chorreo con arena, momentáneamente juegan un papel decisivo revestimientos con fases de fosfato de calcio (CPP). El más avanzado en la aplicación es el revestimiento de implantes en contacto con hueso con hidroxilapatita, y de manera creciente también fases de fosfato de calcio fácilmente solubles [Yang et al, J. Mater. Sci. Mater. in Med. 6, 258-65 (1995); Remer, P. Schwerpunktprogramm Gradientenwerkstoffe, 3ª edición. Darmstadt 31.3.1998; Floquet et al., Rev Stomatol. Chir. Maxillofac. 98, 47-9 (1977)]. Estos métodos de revestimiento de implantes con el componente principal inorgánico de huesos, y compuestos derivados del mismo, persiguen especialmente una infiltración más rápida del implante debido a una oferta local elevada de iones calcio y fosfato. El revestimiento de superficies de implante con CPP se efectúa actualmente mediante procedimientos de inyección de plasma de modo predominante. Debido a las condiciones de proceso, estas capas presentan propiedades que difieren en gran medida de la fase mineral en cristalinidad y comportamiento en disolución de la fase mineral del hueso, y pueden conducir al fallo mecánico de las capas debido a los altos grosores de capa [Filiaggi et al., J. Biomed Mat. Res. 27(2), 191-8 (1993); Gross et al., Int. J. Oral Maxillofac. Implants 12(5), 589-97 (1997); Posner et al., Phosphate Minerals, Springer Verlag, Berlin/Heidelberg (1984)].

Los procedimientos de base electroquímica [Shirkhanzadeh, J. Mater. Sci.: Master. in Med. 9 76-72 (1998); Szmukler-Moncler et al., Biological Mech. Of Tooth Eruption, Resorption and Replacement by implants, (Eds. Z. Davidovitch and J. Mas), 481-85 Harvard Society for the Advancement of Otrhodontics, Boston, USA (1998)] ofrecen la posibilidad de generar CPP con grosores de capas más reducidos. La precipitación de CPP se realiza mediante polimerización catódica del implante en disolución que contiene Ca^{2+}/H_{x}PO_{4}^{(3-x)-}. La polarización del implante conduce a un alcalinizado del electrolito próximo a la superficie (2H_{2}O + 2e^{-} \rightarrow H_{2} + 2OH^{-}), mediante lo cual se desencadena una reacción de precipitación ante la superficie de muestra, y el producto de precipitación formado se separa sobre la superficie de implante metálica.

Otro planteamiento en el campo de la modificación superficial de materiales de implante consiste en conseguir un biologizado de superficies de implante, utilizándose compuestos orgánicos presentes en el tejido circundante para la modificación superficial. En este caso se emplean por una parte proteínas inmovilizadas y secuencias de proteínas que ejercen su acción en estado inmovilizado (colágeno, proteínas de adhesión, secuencias de RGD), o bien proteínas que se liberan durante un intervalo de tiempo determinado. Según substancia inmovilizada, en este caso se pretende una acción sensiblemente general, positiva, sobre la biocompatibilidad de la superficie de implante (colágeno, proteínas de adhesión determinadas) o la adhesión de determinados tipos de células (secuencias de RGD empleadas) [Schaffner et al., J. of Mat. Sci.: Mat. in Med. 10, 837-39 (1999)].

El estado de la técnica citado anteriormente muestra que aún no se conocen procedimientos que se hayan planteado como objetivo la generación de una fase compuesta análoga a huesos a partir de los componentes minerales y orgánicos de hueso para el revestimiento de implantes metálicos. Los métodos que comprenden tanto hidroxilapatita, como también colágeno, se limitan únicamente a mezclas de componentes que dependen además de otras substancias exógenas como materiales soporte.

La WO 99/30672 (Uni Tübingen) describe un revestimiento para prótesis de material polímero orgánico, en cuya superficie se puede integrar hidroxilapatita o colágeno. En este caso, el material polímero representa únicamente el agente adhesivo, no se puede hablar de una unión similar a hueso de colágeno y una fase de fosfato de calcio.

Otra posibilidad de integración de escleroproteínas y fosfato de calcio se presenta en la DE 19811900 (Feinchemie). Se describe un material compuesto biocompatible, constituido por un gel inorgánico y un componente bioactivo (colágeno, elastina, fibrina). Además pueden estar contenidos fosfatos de calcio o sus precursores en forma disuelta. Por consiguiente, este material compuesto constituye sólo una mezcla de los componentes principales del hueso, que requiere además un gel inorgánico como soporte.

En la WO 92/13984 (Queen's University of Kingston) se describe un procedimiento para la generación electroquímica de los revestimientos cerámicos a partir de compuestos de fosfato de calcio. En este caso no se excluye que el electrolito contenga también compuestos biológicos no tóxicos, como colágeno o impurezas. El revestimiento constituye un material cerámico microporoso homogéneo a partir de cristalitas unidas no orientadas. Esta capa puede contener también compuestos con actividad biológica como productos de precipitación. Por consiguiente, el revestimiento descrito se diferencia de una matriz de colágeno -fosfato de calcio mineralizada como revestimiento de fosfato de calcio.

Los implantes para el empleo en la zona maxilar o prótesis de articulación se elaboran preferentemente a partir de materiales mecánicos, para cumplir los requisitos mecánicos. En este caso se desprende frecuentemente la superficie inmediata, que se diferencia en sus propiedades en gran medida del material base. No obstante, se sabe que precisamente las propiedades de la superficie son de importancia decisiva para las interacciones entre implante y tejido circundante. De este modo, modificaciones de conformación de proteínas adsorbidas contribuyen especialmente a la formación de una capa intermedia fibrosa, que puede resultar a su vez en una estabilidad insuficiente del implante.

La enseñanza de la presente invención parte de la tarea de modificar superficies de implante selectivamente con informaciones bioquímicas, para conseguir, tras el implante, una osteointegración rápida bajo formación de tejido óseo de alto valor.

Este problema se soluciona mediante un revestimiento análogo a huesos constituido por un componente principal orgánico e inorgánico para materiales de implante metálicos de cualquier geometría superficial, estando constituido el revestimiento esencialmente por una matriz de colágeno mineraliza con fosfato de calcio.

Como materiales de implante metálicos entran en consideración generalmente todos los metales empleados en la técnica dental o en los sectores endoprótesis y traumatismo. Son especialmente preferentes titanio y aleaciones de titanio, como por ejemplo TiAI6V4.

El revestimiento según la invención se genera bajo condiciones que hace posible la integración de componentes orgánicos. La invención para la generación biomimética de una matriz análoga a hueso, por lo tanto, utiliza procesos de base electroquímica, que se pueden llevar a cabo en condiciones de pH y temperatura casi fisiológicas, y con ello posibilita la integración de biomoléculas. Estas se pueden presentar en la disolución de electrolito o en forma inmovilizada en la superficie de implante. Los componentes principales de la capa están constituidos por colágeno e hidroxilapatita, el componente principal orgánico, o bien inorgánico del hueso. Mediante el objeto según la invención es posible por primera vez reproducir in vitro una estructura de penetración análoga a la estructura ósea generada in vivo en los rasgos esenciales, y generar la misma con buena adherencia sobre una superficie de implante metálica.

La estructura de la matriz de colágeno mineral se efectúa en forma de capas. Esto tiene la ventaja de que, de este modo, también es posible la generación de capas graduadas con grado de mineralizado variable de la matriz de colágeno.

El componente principal orgánico o bien la fase de fosfato de calcio (CPP) está constituida preferentemente por fosfato de calcio amorfo (Ca_{9}(PO_{4})_{6} \cdot nH_{2}O), hidroxilapatita (Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2}), fosfato de octacalcio (Ca_{8}H_{2}(PO_{4})_{6} \cdot H_{2}O) o brushita (CaHPO_{4} \cdot 2H_{2}O). No obstante, también son posibles mezclas de las fases citadas anteriormente.

La fase de fosfato de calcio puede estar dopada adicionalmente con aniones, como fluoruro, plata, magnesio o carbonato.

Es preferente el empleo de colágeno tipo I, que es responsable de las propiedades elásticas en el hueso y, en estado mineralizado junto con las cristalitas de hidroxilapatita, ocasiona la alta resistencia del hueso. Además, el colágeno puede estar constituido también por una mezcla de los tipos I a III. Los tipos I a III pertenecen al grupo de colágenos que forman fibrillas. Adicionalmente, se puede añadir gelatina al colágeno. Además de colágeno, que también puede proceder de la producción recombinante, también es posible la integración de otras proteínas matriz.

Otra ventaja de la invención consiste en la posibilidad de utilizar las capas revestidas como matriz para proteínas específicas para huesos (BMP, TGF\beta, etc.). Además de factores de crecimiento y péptidos de adhesión específicos celulares, también es posible la integración de productos activos farmacológicos, como por ejemplo antibióticos.

Además es objeto de la invención un implante metálico constituido por un cuerpo base y una capa externa soportada por el mismo, estando constituida la capa externa por el revestimiento según la invención según una de las reivindicaciones 1 a 8.

También es objeto de la invención un procedimiento para el revestimiento de base electroquímica de materiales de implante metálicos de cualquier superficie, con colágeno y CPP según la reivindicación 11.

Se lleva a cabo el revestimiento en una pila electrolítica en la que se polariza por vía catódica el implante metálico. La precipitación de capas se efectúa casi en condiciones de pH y temperatura fisiológicas. El electrolito está constituido por una disolución que contiene Ca^{2-}/H_{x}PO_{4}^{(3-x)-}, que puede contener adicionalmente colágeno, o bien otras substancias (factores de crecimiento, antibióticos). La superficie de implante puede presentar cualquier geometría superficial (estructura; rugosa, pulida, decapada), una modificación química (generación de grupos funcionales) una capa de fosfato de calcio, una capa de proteína, así como una capa obtenida según la patente Nº WO 98/17844 (TU Dresden) o DE 19504386 (TU Dresden), o una combinación de las mismas. Mediante un proceso, controlado simultáneamente, de precipitación de fosfato de calcio y de inmovilizado de colágeno bajo condiciones de pH y temperaturas fisiológicas, se puede generar una capa de colágeno mineralizada sobre la superficie de titanio. El grado de mineralizado, es decir, tipo de CPP y grado de recubrimiento se predeterminan en este caso mediante los parámetros electroquímicos. Se puede apoyar este proceso mediante la adición de grupos de substancias que influyen sobre el mineralizado (por ejemplo bonesialoproteína, osteopontina).

Además es preferente un procedimiento de revestimiento según la reivindicación 12, efectuándose en primer lugar un revestimiento de la muestra con CPP en un proceso electroquímico a través de polarización galvanoestática en una disolución electrolítica que contiene iones calcio e iones fosfato con densidad de corriente y temperatura definidas exactamente, seguido de un revestimiento de la muestra recubierta con CPP mediante inmersión en una disolución de colágeno a un valor de pH menor que 8 y a una temperatura entre 4 y 40ºC durante algunos minutos, y subsiguiente revestimiento de la muestra recubierta con colágeno-CPP con CPP adicional en un nuevo proceso electroquímico a través de polarización galvanoestática bajo densidad de corriente y temperatura definida exactamente.

Los pasos de procedimiento antes citados se pueden desarrollar preferentemente también de modo alternante reiteradamente, es decir, una secuencia de pasos de procedimiento a) y b) según la reivindicación 11 conforme al esquema a-b-a-b-a-b, etc..

También es preferente un procedimiento según la reivindicación 14, reuniéndose los pasos de procedimiento a) y b) en un paso, polarizándose por vía catódica electroquímica el material de implante metálico a revestir en una disolución de colágeno que contiene iones calcio e iones fosfato.

Aún es más preferente un procedimiento en el que, durante la polarización galvanoestática en el paso de procedimiento b), fluye una corriente catódica de -0,5 a -20 mA/cm^{2} durante aproximadamente 30 minutos.

Las ventajas de la matriz de colágeno mineralizada análoga a huesos según la invención se pueden mostrar eficazmente en el ensayo celular. Mientras que la adhesión celular para osteoblastos después de una hora muestra aún valores relativamente buenos con capas de hidroxilapatitas generadas por vía biomimética, es claramente preferente la proliferación celular sobre las capas según la invención. El aumento de número de células se efectúa en este caso en un momento sensiblemente más temprano, y el valor máximo de número de células se alcanza mucho más rápidamente que para capas de hidroxilapatita puras. La figura 1 muestra una correspondiente curva de medida para un ensayo de proliferación durante 17 días con osteoblastos de ratón MC3T3.

A continuación se describe más detalladamente y se explica la invención por medio de ejemplos de realización, bajo referencia a la figura 1.

Ejemplo 1

Se prepara un cilindro de TiAl6V4 (h = 2 mm, \diameter 10 mm) por vía metalográfica con un pulido de TiO_{2} final. A continuación se limpia el cilindro en acetona y etanol en el baño ultrasónico, y se lava con agua destilada.

A continuación se sumerge la muestra en una disolución de colágeno que se obtiene de la siguiente manera: se disuelve colágeno de piel de ternera soluble en ácido liofilizado de tipo I en ácido acético 0,01 M y se ajusta a una concentración de 0,1 mg/ml a 4ºC. La reconstitución de las moléculas de colágeno se efectúa en los pasos de proceso; el ajuste de valor de pH a 7,4 con tampón fosfato doblemente concentrado, y el aumento de temperatura a 36ºC. Después de 3 horas, la disolución está constituida por fibrillas reconstituidas de manera nativa. La muestra permanece durante 10 minutos en esta disolución, después se lava con agua desionizada.

Se introduce la muestra revestida con colágeno como electrodo de trabajo en una disposición de tres electrodos, constituida por un electrodo de calomelanos saturado como electrodo de referencia, y una chapa de platino como contraelectrodo en una célula electrolítica termostatada. Como disolución electrolítica sirve una disolución madre que se obtiene de la siguiente manera: se diluye y se mezcla respectivamente 10 ml de disolución madre de CaCl_{2} y NH_{4}H_{2}PO_{4} en las concentraciones 33 mM y 20 mM, de modo que se producen 200 ml; 1,67 mM en iones calcio y 1,0 mM en iones fosfato. Se ajusta el valor de pH a 6,4 con disolución de NH_{4}OH diluida.

Tras unión con el potenciostato se efectúa el mineralizado/revestimiento con fases de fosfato de calcio (CPP) a través de polarización galvanoestática bajo flujo de corriente catódico a -1 mA/cm^{2}. Después de 30 minutos se concluye la polarización catódica, se extrae la muestra de la disolución electrolítica y se lava con agua desionizada. La capa precipitada se presenta blanquecina. La observación al microscopio electrónico muestra una capa constituida por un retículo de colágeno y clusters de CP esféricos. Las investigaciones por espectroscopia IR proporcionan la identificación de que la fase mineral está constituida por fosfato de calcio amorfo.

Ejemplo 2

Se obtiene un cilindro a partir de TiAl6V4 como en el ejemplo 1. La estructura de la pila electrolítica y del electrolito para la precipitación de fosfato de calcio son idénticas a las del ejemplo 1.

Tras unión con el potenciostato se efectúa el revestimiento con CPP a través de polarización galvanoestática bajo flujo de corriente catódico a -10 mA/cm^{2}. Después de 30 minutos se interrumpe la polarización catódica, se extrae la muestra de la disolución de electrolito y se lava con agua desionizada. Sobre la superficie de TIAl6V4 se presenta ahora una hidroxilapatita cristalina CPP. Ahora se sumerge la muestra en una disolución de colágeno, que es idéntica a la del ejemplo 1. En esta disolución, la muestra revestida con hidroxilapatita permanece durante 10 minutos, después se lava con agua desionizada y se introduce de nuevo en la pila electrolítica. Tras unión con el potenciostato se efectúa de nuevo una precipitación de hidroxilapatita a través de polarización galvanoestática bajo flujo de corriente catódico en -10 mA/cm^{2}. Después de 20 minutos se extrae la muestra y se lava con agua desionizada. La capa precipitada se presenta blanquecina. La observación al microscopio electrónico muestra una capa cerrada que está constituida por aglomerados de agujas pequeñas. Sobre esta capa se encuentra un retículo constituido por fibrillas de colágeno mineralizadas. Las investigaciones por espectroscopia IR y difracción de rayos X proporcionan la identificación de que la fase mineral está constituida por hidroxilapatita. Las bandas de amida características en el espectro IR muestran además que el colágeno se presenta no desnaturalizado, más bien existe una buena coincidencia entre la capa mineral y un espectro para huesos nativos.

Ejemplo 3

Se obtiene un cilindro a partir de TiAl6V4 como en el ejemplo 1. La estructura de la pila electrolítica es idéntica a la del ejemplo 1.

Se obtiene una disolución de colágeno con fibrillas de colágeno ensambladas de manera nativa como en el ejemplo 1. Se centrífuga esta disolución durante 15 min a 5.000 g y 4ºC, se absorbe con agua desionizada y se dispersa mediante agitación. A continuación se centrífuga de nuevo la disolución durante 15 min a 5.000 g y 4ºC. Ahora se absorbe el comprimido obtenido mediante centrifugado en los electrolitos para la precipitación de fosfato de calcio, descrita en el ejemplo 1, y se homogeneiza mediante un dispersador. Esta disolución sirve como electrolito para un proceso, controlado simultáneamente, de precipitación y mineralizado de colágeno. Tras unión con el potenciostato se efectúa el mineralizado a través de polarización galvanoestática bajo flujo de corriente catódico en -10 mA/cm^{2}. Después de 30 minutos se concluye la polarización catódica, se extrae la muestra de la disolución electrolítica y se barre con agua desionizada. La capa precipitada se presenta blanquecina. La observación al microscopio electrónico muestra una unión de fibrillas de colágeno y CPP. Las investigaciones por espectroscopia IR y difracción de rayos X proporciona la identificación de que el mineralizado de fibrillas se efectúa principalmente a través de la fase cristalina hidroxilapatita. Parcialmente se puede encontrar también la fase de fosfato de calcio amorfa más fácilmente soluble. Las bandas de amida características en el espectro IR muestran además que el colágeno se presenta no desnaturalizado, más bien existe una buena coincidencia entre la capa mineral y un espectro para huesos nativos.

Ejemplo 4

Se obtiene un cilindro a partir de TiAl6V4 como en el ejemplo 1. La estructura de la pila electrolítica y del electrolito para la precipitación de fosfato de calcio son idénticas a las del ejemplo 1.

Tras unión con el potenciostato se efectúa el revestimiento con CPP a través de polarización galvanoestática bajo flujo de corriente catódico a -10 mA/cm^{2}. Después de 30 minutos se interrumpe la polarización catódica, se extrae la muestra de la disolución de electrolito y se lava con agua desionizada. Sobre la superficie de TIAl6V4 se presenta ahora una hidroxilapatita cristalina CPP. Ahora se sumerge la muestra en una disolución de colágeno, que es idéntica a la del ejemplo 1. En esta disolución, la muestra revestida con hidroxilapatita permanece durante 10 minutos, después se lava con agua desionizada y se introduce de nuevo en la pila electrolítica. Tras unión con el potenciostato se efectúa un mineralizado parcial de colágeno bajo flujo de corriente catódico en -10 mA/cm^{2} durante 15 min. A continuación se lava la muestra con agua desionizada. La capa precipitada se presenta blanquecina. En un segundo paso de procedimiento se efectúa la unión de secuencias de péptidos específicas de integrina selectivas celularmente en la capa de colágeno inmovilizada. La unión se efectúa por enlace covalente a través de un ancla de tiol y SMPB (sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato) en los grupos fosfato de colágeno.

La observación al microscopio electrónico muestra una capa homogénea constituida por agujas de hidroxilapatita, sobre la que se presenta un retículo mineralizado parcialmente a partir de fibrillas de colágeno. La actividad de las secuencias de RGD se desprende de los experimentos de adhesión y proliferación con células MC3T3-E1. Frente a las capas de colágeno puras comparables, las superficies revestidas con RGD muestran una adherencia celular elevada y una proliferación celular incipiente después de tiempos breves.

Figura 1

Muestra la proliferación celular de osteoplastos de ratón MC3T3 sobre hidroxilapatita y sobre la matriz de colágeno-hidroxilapatita análoga a huesos respectivamente sobre substratos de TiAl6V4. La absorción es proporcional al número de células (ensayo WST-1).

1

Claims (17)

1. Revestimiento análogo a huesos constituido por un componente principal orgánico e inorgánico para materiales de implantes metálicos de cualquier geometría superficial, caracterizado porque está constituido esencialmente por una matriz de colágeno mineralizada con fosfato de calcio.

2. Revestimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la estructura de la matriz de colágeno mineralizada presenta forma de capas.

3. Revestimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la fase de fosfato de calcio está constituida por fosfato de calcio amorfo (Ca_{9}(PO_{4})_{6} \cdot nH_{2}O), hidroxilapatita (Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2}), fosfato de octacalcio (Ca_{8}H_{2}(PO_{4})_{6} \cdot 5H_{2}O) o brushita (CaHPO_{4} \cdot 2H_{2}O).

4. Revestimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la fase de fosfato de calcio está dopada con iones adicionales, como fluoruro, plata, magnesio o carbonato.

5. Revestimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el colágeno está constituido por colágeno tipo I.

6. Revestimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el colágeno constituye una mezcla de colágeno de los tipos I a III.

7. Revestimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se añade gelatina al colágeno.

8. Revestimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque contiene substancias bioactivas como factores de crecimiento, secuencias de péptidos, hormonas, antibióticos, o clases de substancias que influyen sobre el mineralizado.

9. Implante metálico constituido por un cuerpo base y una capa externa soportada sobre el mismo, caracterizado porque la capa externa está constituida por un revestimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Implante metálico según la reivindicación 9, caracterizado porque está constituido por titanio o aleaciones de titanio.

11. Procedimiento para el revestimiento electroquímico de materiales de implante metálicos de cualquier geometría superficial con colágeno y fases de fosfato de calcio (CPP), caracterizado por los siguientes pasos de procedimiento:

a)

revestimiento del material de implante metálico mediante inmersión en una disolución de colágeno a un valor de pH menor que 8 y a una temperatura entre 4 y 40ºC durante pocos minutos,

b)

revestimiento de la muestra cubierta con colágeno con CPP en un proceso de base electroquímica a través de polarización galvanoestática en una disolución electrolítica que contiene iones calcio e iones fosfato en densidad de corriente y a temperatura definidas exactamente.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se efectúa un paso de procedimiento adicional b) antes del paso de procedimiento a).

13. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque los pasos de procedimiento a) y b) se desarrollan de manera alternante reiteradamente.

14. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se reúnen los procedimientos a) y b) en un paso, polarizándose catódicamente por vía electroquímica el material de implante metálico a revestir en una disolución de colágeno que contiene iones calcio e iones fosfato.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque, durante la polarización galvanoestática en el paso de procedimiento b), fluye una corriente catódica de -0,5 a -30 mA/cm^{2}aproximadamente durante 30 minutos.

\newpage

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la estructura de la matriz de colágeno mineralizada se efectúa en forma de capas.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque se añade gelatina al colágeno.