CN115518206B - 一种自矿化gbr膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种自矿化GBR膜及其制备方法，涉及口腔种植医用材料技术领域，该自矿化GBR膜包括金属支架和设置在金属支架表面的自矿化胶原膜，该自矿化GBR膜的制备方法通过3D打印技术制备金属支架基底，在金属支架表面设置自矿化胶原膜，可以解决使用传统金属网遇到的金属网暴露问题，也可以解决使用胶原膜遇到的机械强度不足及不稳定的问题，实现未来临床的个性化精准治疗。该自矿化胶原膜涂层在结构和组成上与自然骨相似，具有良好的生物相容性和生物响应性，对外可有效防治成纤维细胞的长入、对内可促进成骨细胞的粘附，从而加速早期治愈速度，增加长期稳定性。

Description

一种自矿化GBR膜及其制备方法
技术领域
本申请涉及口腔种植医用材料技术领域，尤其涉及一种自矿化GBR膜及其制备方法。
背景技术
应不同患者的需求，口腔种植的应用越来越广泛，但在实际应用中常常遇到患者的骨量不足、种植体固位不良等问题。根据骨和软组织生长特点，多采用引导骨再生(Guided bone regeneration，GBR)技术进行骨扩增，GBR技术在种植术中增加牙槽骨厚度和牙槽嵴顶高度方面效果稳定。通过利用GBR膜的机械屏障作用阻挡生长速度最快的牙龈上皮细胞和成纤维细胞，使二者无法优先接触骨缺损区，为骨缺损的愈合提供一个相对封闭的组织生长空间和条件，使骨缺损区具有再生能力的成骨细胞最大限度地增殖分化，促进成骨。
临床上应用最为广泛的是Bio-guide等胶原修复膜，然而对于较大面积的不规则骨缺损，由于其难以维持稳定的空间，单纯胶原膜固定的GBR技术进行骨增量效果并不理想。
发明内容
本申请的目的在于提供一种自矿化GBR膜，旨在解决现有GBR技术使用单纯胶原膜对于较大面积的不规则骨缺损，难以维持稳定的空间，骨增量效果不理想的问题。
为实现以上目的，本申请提供一种自矿化GBR膜的制备方法，所述自矿化GBR膜包括金属支架和设置在所述金属支架表面的自矿化胶原膜，所述制备方法包括：
金属支架设计：根据骨缺损区的三维形态数据，建立与所述骨缺损区相匹配的金属支架模型；
金属支架制备：根据所述金属支架模型，3D打印得到金属支架；
胶原蛋白化学沉积：以胶原蛋白溶液为电解液，所述金属支架为阴极，进行电化学沉积将所述胶原蛋白沉积在所述金属支架表面形成胶原蛋白纤维网；
胶原蛋白纤维网自矿化：将沉积了胶原蛋白的金属支架置于矿化前驱体溶液内培养，完成所述胶原蛋白纤维网的自组装过程，使其在所述金属支架的表面形成自矿化胶原膜，得到所述自矿化GBR膜。
优选地，所述矿化前驱体溶液的制备方法包括如下特征中的至少一个：
a.将钙盐无机物离子与聚合物混合均匀制备得到所述矿化前驱体溶液；
b.所述钙盐无机物离子包括：碳酸钙盐无机物离子或磷酸钙盐无机物离子；
c.所述碳酸钙盐无机物离子包括：Ca2+、CO3 2-、HCO3-、Mg2+；
d.所述磷酸钙盐无机物离子包括：Ca2+、PO4 3-；
e.所述钙盐无机物离子中的Ca2+的浓度为1-15mM。
优选地，所述聚合物包括如下特征中的至少一个：
(1)所述聚合物包括聚电解质和/或聚酸类分子；
(2)所述聚合物选自聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚烯丙胺、酪蛋白磷酸肽中的任一种；
(3)所述聚合物的浓度为5-100μg/mL。
优选地，所述矿化前驱体溶液的制备方法为：
将CaCO3粉末悬浮于蒸馏水中，于15-35℃通CO2气体1-4h，以使CaCO3/Ca(HCO3)2平衡反应向Ca(HCO3)2推进；
过滤多余的CaCO3，于15-35℃再通入CO2气体15-60min，以液化残存的CaCO3；
测量并加入蒸馏水以调整Ca2+浓度；
加入所述聚合物和MgCl2粉末，混合均匀得到碳酸钙盐无机物离子制备得到的矿化前驱体溶液。
优选地，所述矿化前驱体溶液的制备方法为：
将CaCl2和所述聚合物粉末悬浮于蒸馏水中，边搅拌边加入Na3PO4粉末，得到磷酸钙盐无机物离子制备的矿化前驱体溶液；
优选地，其中Ca2+、PO4 3-的摩尔比为3:2，所述聚合物的浓度为10-30μg/mL。
优选地，所述胶原蛋白溶液的制备方法包括如下特征中的至少一个：
A.将胶原蛋白溶解于冰醋酸溶液，得到所述胶原蛋白溶液；
B.所述冰醋酸溶液的浓度为80-120mM，PH值为2.0-4.0；
C.将所述胶原蛋白加入所述冰醋酸溶液在转速1000-1400r/min，10℃以下搅拌24-72h，得到所述胶原蛋白溶液；
D.所述胶原蛋白溶液的储存浓度为0.2-2.0mg/ml；所述胶原蛋白溶液的电解浓度为0.1-0.5mg/ml。
优选地，所述金属支架的材料选自钛、锌、镁中的任一种；所述金属支架的厚度为0.1-5mm。
优选地，所述电化学沉积的直流电源的电流强度在0.01A-0.025A范围内，控制沉积时间为3-15min。
优选地，所述胶原蛋白化学沉积之前还包括金属支架的预处理，所述金属支架的预处理包括如下特征中的至少一个：
I.使用砂纸抛光打磨所述金属支架，除去金属支架表面的氧化层；
II.使用浓硫酸和浓盐酸的混合溶液进行酸处理；
III.进行超声清洗；
IV.分别使用丙酮、无水乙醇、蒸馏水依次超声清洗30min。
本申请还提供一种自矿化GBR膜，由上述的自矿化GBR膜的制备方法制备得到。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的自矿化GBR膜包括金属支架和设置在金属支架表面的自矿化胶原膜，该自矿化GBR膜的制备方法通过3D打印技术制备金属支架基底，在金属支架表面设置自矿化胶原膜，可以解决使用传统金属网遇到的金属网暴露问题，也可以解决使用胶原膜遇到的机械强度不足及不稳定的问题，实现未来临床的个性化精准治疗。
本申请的自矿化胶原膜涂层可以通过控制电化学沉积参数如电流强度、溶质浓度、电沉积时间等来调节涂层的厚度、分布、密度等，可以精准调控自矿化胶原膜涂层的性能。
该自矿化胶原膜涂层在结构和组成上与自然骨相似，具有良好的生物相容性和生物响应性，对外可有效防治成纤维细胞的长入、对内可促进成骨细胞的粘附，从而加速早期治愈速度，增加长期稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为本发明的自矿化GBR膜的制备方法的流程示意图；
图2为本发明的金属支架沉积胶原蛋白并进行交联自矿化形成自矿化GBR膜的示意图；
图3为本发明实施例1得到的自矿化GBR膜的扫描电镜图；
图4是本发明实施例1得到的自矿化GBR膜的X线衍射图；
图5是本发明实施例2得到的自矿化GBR膜的红外光谱图；
图6是本发明实施例2得到的自矿化GBR膜的成骨细胞骨架的免疫荧光图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本申请提供一种自矿化GBR膜的制备方法，所述自矿化GBR膜包括金属支架和设置在所述金属支架表面的自矿化胶原膜，其中金属支架用于提供机械支撑力，自矿化胶原膜是由胶原蛋白发生矿化形成的纤维网膜。
请参阅图1，所述自矿化GBR膜的制备方法包括：
S100：金属支架设计：根据骨缺损区的三维形态数据，建立与所述骨缺损区相匹配的金属支架模型。
具体的，将患者术前口腔锥形束CT(Cone beam CT，CBCT)导入Simpleware ScanIP软件生成上、下颌骨三维模型；以修复为导向进行虚拟排牙和虚拟种植体植入；根据虚拟修复设计，进行骨增量设计，根据预期骨增量要求、缺牙区软硬组织形态、金属支架与骨缺损区解剖结构的位置关系，设计金属支架轮廓，金属支架的形状不做具体限定，只要满足使金属支架包覆骨缺损区即可，使用Solidworks软件金属网网孔的单胞结构填充于金属网轮廓面上，导出金属支架模型。
可以理解的是，金属支架优选为多孔的金属支架，也即将金属支架铺展开后呈网状，多孔的金属支架可以在提供机械支撑力的同时，可以让血管神经长入，有助于骨整合。
S200：金属支架制备：根据所述金属支架模型，3D打印得到金属支架。
优选地，所述金属支架的材料选自钛、锌、镁中的任一种；所述金属支架的厚度为0.1-5mm，例如可以为0.1mm、0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm或5.0mm，或0.1-5mm之间的任一值。
具体的，在99.9％高纯氩惰性环境中，使用选择性激光熔融(SLM)技术3D打印步骤S100设计的金属支架，打印参数如下：直径20-30μm的球形雾化金属粉作为原料，300-350W激光功率，700-900mm/s的扫描速度，80-120μm的孵化空间，20-40μm的粉末层厚度。
在一优选实施例中，在得到金属支架之后还包括金属支架的预处理，金属支架的预处理可以包括使用砂纸抛光打磨步骤S200得到的金属支架，除去金属支架表面的氧化层。
打磨之后还可以根据金属支架的材质决定是否使用浓硫酸和浓盐酸的混合溶液进行酸处理，例如钛金属支架通过酸处理可以在金属支架的表面反应形成保护膜阻止进一步反应，因而钛金属支架可以进行酸处理；而锌金属支架与酸反应不会形成保护膜，锌金属支架会被酸腐蚀完，因此，对于锌金属支架不能使用酸进行预处理。酸处理例如可以为将浓硫酸、浓盐酸按1:1比例混合，使用移液枪先将浓盐酸酸转移到烧杯中，再加入浓硫酸，在通风橱中酸处理20-40min。
最后还可以对金属支架进行超声清洗。金属支架预处理之后更方便胶原蛋白的沉积。
优选地，分别使用丙酮、无水乙醇、蒸馏水依次超声清洗30min。
S300：胶原蛋白化学沉积：以胶原蛋白溶液为电解液，所述金属支架为阴极，进行电化学沉积将所述胶原蛋白沉积在所述金属支架表面形成胶原蛋白纤维网。
其中，胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白；胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性。胶原蛋白按功能分为两组，第一组是成纤维胶原蛋白，包括第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅺ、ⅩⅩⅣ和ⅩⅩⅦ型胶原蛋白；其余是第二组，非成纤维胶原蛋白。本申请所用的胶原蛋白为成纤维胶原蛋白，一边形成胶原蛋白纤维网。
所述胶原蛋白溶液的制备方法包括：将胶原蛋白溶解于冰醋酸溶液，得到所述胶原蛋白溶液。优选地，所述冰醋酸溶液的浓度为80-120mM，例如可以为80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、110mM或120mM，冰醋酸溶液的pH值为2.0-4.0，例如可以为2.0、2.5、3.0、3.5或4.0。
更优选地，将所述胶原蛋白加入所述冰醋酸溶液在转速1000-1400r/min，例如可以为1000r/min、1100r/min、1200r/min、1300r/min或1400r/min，10℃以下搅拌24-72h，例如可以为24h、30h、35h、40h、45h、48h、55h、60h、65h或72h，得到所述胶原蛋白溶液。
优选地，所述胶原蛋白溶液的储存浓度为0.2-2.0mg/ml，例如可以为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml或2.0mg/ml。
具体的，请参阅图2，将步骤S200制备的金属支架连接于工作电极(阴极)，阳极为铂板，使用胶原蛋白溶液作为电解液，使用直流电源进行电化学沉积，使胶原蛋白沉积在金属支架表面，并将沉积胶原蛋白的金属支架在黑暗条件下风干过夜。
优选地，所述胶原蛋白溶液的电解浓度为0.1-0.5mg/ml，例如可以为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml或0.5mg/ml。所述电化学沉积的直流电源的电流强度在0.01A-0.025A范围内，例如可以为0.01A、0.015A、0.02A或0.025A，控制沉积时间为3-15min，例如可以为3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min。
进一步地，请继续参阅图2，将沉积胶原蛋白的金属支架风干之后，在金属支架的干燥胶原蛋白涂层表面滴加50μl 0.3M的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，交联3小时充分增加胶原结构的稳定性，于蒸馏水内润洗三次，低温下冷冻干燥。
S400：胶原蛋白纤维网自矿化：请继续参阅图2，将沉积了胶原蛋白的金属支架置于矿化前驱体溶液内培养，完成所述胶原蛋白纤维网的自组装过程，使其在所述金属支架的表面形成自矿化胶原膜，得到所述自矿化GBR膜。
其中，所述矿化前驱体溶液的制备方法包括：将钙盐无机物离子与聚合物混合均匀制备得到所述矿化前驱体溶液。
优选地，所述钙盐无机物离子包括：碳酸钙盐无机物离子或磷酸钙盐无机物离子。所述碳酸钙盐无机物离子包括：Ca2+、CO3 2-、HCO3 -、Mg2+；所述磷酸钙盐无机物离子包括：Ca2+、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -。
优选地，所述钙盐无机物离子中的Ca2+的浓度为1-15mM，例如可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM或15mM。
其中，所述聚合物包括聚电解质和/或聚酸类分子。所述聚合物选自聚丙烯酸(Acrylic acid Polymers，PAA)、聚天冬氨酸(polyaspartic acid，pAsp)、聚烯丙胺(Poly(allylamine)，PASP)、酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides，CPP)中的任一种。
优选地，所述聚合物的浓度为5-100μg/mL，例如可以为(5、6、8、10、15、18、20、22、23、25、29、30、32、35、36、39、40、41、43、45、49、50、55、60、61、65、69、72、75、80、85、90、95、96、99、或100)μg/mL，或5-100μg/mL之间的任一值。
在一实施例中，所述矿化前驱体溶液的制备方法为：
将CaCO3粉末悬浮于蒸馏水中，于15-35℃通CO2气体1-4h，以使CaCO3/Ca(HCO3)2平衡反应向Ca(HCO3)2推进；
过滤多余的CaCO3，于15-35℃再通入CO2气体15-60min，以液化残存的CaCO3；
测量并加入蒸馏水以调整Ca2+浓度；
加入所述聚合物和MgCl2粉末，混合均匀得到碳酸钙盐无机物离子制备得到的矿化前驱体溶液。
在另一实施例中，所述矿化前驱体溶液的制备方法为：
将CaCl2和所述聚合物粉末悬浮于蒸馏水中，边搅拌边加入Na3PO4粉末，得到磷酸钙盐无机物离子制备的矿化前驱体溶液；
优选地，其中Ca2+、PO4 3-的摩尔比为3:2，所述聚合物的浓度为10-30μg/mL，例如可以为10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL或30μg/mL。
本申请还提供一种自矿化GBR膜，由上述的自矿化GBR膜的制备方法制备得到。
本申请提供的自矿化GBR膜包括金属支架和设置在金属支架表面的自矿化胶原膜，该自矿化GBR膜的制备方法通过3D打印技术制备金属支架基底，在金属支架表面设置自矿化胶原膜，可以解决使用传统金属网遇到的金属网暴露问题，也可以解决使用胶原膜遇到的机械强度不足及不稳定的问题，实现未来临床的个性化精准治疗。
本申请的自矿化胶原膜涂层可以通过控制电化学沉积参数如电流强度、溶质浓度、电沉积时间等来调节涂层的厚度、分布、密度等，可以精准调控自矿化胶原膜涂层的性能。
该自矿化胶原膜涂层在结构和组成上与自然骨相似，具有良好的生物相容性和生物响应性，对外可有效防治成纤维细胞的长入、对内可促进成骨细胞的粘附，从而加速早期治愈速度，增加长期稳定性。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)将患者A术前CBCT导入Simpleware ScanIP软件生成上、下颌骨三维模型，根据虚拟修复设计，进行骨增量设计，使用Solidworks软件导出纯钛金属支架模型。
(2)在99.9％高纯氩惰性环境中，使用选择性激光熔融(SLM)技术成型制备上述设计的纯钛金属支架，3D打印生产参数如下：直径27.1μm的球形雾化钛粉作为原料，320W激光功率，800mm/s的扫描速度，100μm的孵化空间，30μm的粉末层厚度。
(3)使用砂纸抛光打磨上述纯钛金属支架，除去表面氧化层后放入250ml烧杯中，将浓硫酸浓盐酸按1:1比例混合加入各30ml，使用移液枪先将盐酸转移到烧杯中，再加入硫酸，在通风橱中酸处理30min；使用超声清洗仪，分别使用丙酮、无水乙醇、蒸馏水依次超声清洗30min。
(4)配制冰醋酸溶液，调节浓度为100mM，PH值为3.0；取来源于牛皮肤的I型胶原蛋白冻干粉，转速1200r/min，4℃搅拌48h，溶于上述冰醋酸溶液中，制备胶原-醋酸溶液，浓度为0.5mg/ml，4℃储存备用。
(5)将步骤(3)制备的纯钛金属支架连接于工作电极(阴极)，阳极为铂板，使用步骤(4)制备的胶原-醋酸溶液作为电解液，使用直流电源进行电化学沉积5min，随后将沉积胶原蛋白纤维网涂层的金属支架在黑暗条件下风干过夜；在金属支架的干燥胶原蛋白涂层表面滴加50μl 0.3M的EDC溶液，交联3小时充分增加胶原结构的稳定性，于蒸馏水内润洗三次，低温下冷冻干燥。
(6)将CaCO3粉末悬浮于蒸馏水中，于室温(15-35℃)通CO2气体1-4h，以使CaCO3/Ca(HCO3)2平衡反应向可溶性的Ca(HCO3)2侧推进；过滤多余的CaCO3，于室温(15-35℃)下再通入CO2气体15-60min来液化残存的CaCO3；测量并加入蒸馏水以调整Ca2+浓度；加入聚合物PAA和MgCl2粉末，并混合均匀，得到“类海水”的矿化前驱体溶液。
(7)胶原蛋白纤维网自矿化
将步骤(5)制备的电化学沉积I型胶原蛋白纤维网的纯钛金属支架置于步骤(6)合成的“类海水”矿化前驱体溶液内，37℃培养7天，完成纤维内自组装过程，冷冻干燥后制备得到实施例1的自矿化GBR膜。
实施例1的自矿化GBR膜的扫描电镜(FE-SEM)图如图3所示，通过扫描电镜检测自矿化GBR膜表面的胶原蛋白纤维网和金属支架的微观形貌，根据图3可知，在金属支架表面上沉积形成了网状的胶原蛋白。
实施例1的自矿化GBR膜(自矿化组)以及实施例1的纯钛金属支架(纯钛组)的X线衍射图(XRD)如图4所示。图4中，上面线条的结果为自矿化组，下面线条的结果为纯钛组，方解石为碳酸钙矿物，金红石为二氧化钛，由于纯钛金属支架表面会形成一层致密的氧化膜。分别对自矿化GBR膜和纯钛金属支架进行物相鉴定，根据图4可知，自矿化GBR膜在纯钛金属支架表面形成了碳酸钙矿物。
实施例2
(1)将患者B术前CBCT导入Simpleware ScanIP软件生成上、下颌骨三维模型，根据虚拟修复设计，进行骨增量设计，使用Solidworks软件导出纯锌金属支架模型。
(2)在99.9％高纯氩惰性环境中，使用选择性激光熔融(SLM)技术成型制备上述设计的纯锌金属支架，3D打印生产参数如下：直径27.1μm的球形雾化锌粉作为原料，320W激光功率，800mm/s的扫描速度，100μm的孵化空间，30μm的粉末层厚度。
(3)使用砂纸抛光打磨上述纯锌金属支架，除去表面氧化层，使用超声清洗仪，分别使用丙酮、无水乙醇、蒸馏水依次超声清洗30min。
(4)配制冰醋酸溶液，调节浓度为100mM，PH值为3.0；取来源于牛皮肤的I型胶原蛋白冻干粉，转速1200r/min，4℃搅拌48h，溶于上述冰醋酸溶液中，制备胶原-醋酸溶液，浓度为0.5mg/ml，4℃储存备用。
(5)将步骤(3)制备的纯锌金属支架连接于工作电极(阴极)，阳极为铂板，使用步骤(4)制备的胶原-醋酸溶液作为电解液，使用直流电源进行电化学沉积5min，随后将沉积胶原蛋白纤维网涂层的金属支架在黑暗条件下风干过夜；在纯锌金属支架的干燥胶原蛋白涂层表面滴加50μl0.3M的EDC溶液，交联3小时充分增加胶原结构的稳定性，于蒸馏水内润洗三次，低温下冷冻干燥。
(6)将CaCl2和PAA粉末悬浮于蒸馏水中，边搅拌边加入Na3PO4粉末，其中Ca：P的摩尔比为3:2，PAA浓度为20μg/mL，制备得到磷酸钙矿化前驱体溶液。
(7)胶原蛋白纤维网自矿化
将步骤(5)制备的电化学沉积I型胶原蛋白纤维网的纯锌金属支架置于步骤(6)合成的磷酸钙矿化前驱体溶液内，37℃培养7天，完成纤维内自组装过程，冷冻干燥后制备得到实施例2的自矿化GBR膜。另外再做两组用于对照的自矿化GBR膜，分别为37℃培养1天的自矿化GBR膜，37℃培养3天的自矿化GBR膜。
实施例2的自矿化GBR膜的红外光谱图(ATR-IR)如图5所示，图5中，自矿化1天GBR膜组为37℃培养1天的自矿化GBR膜的结果，自矿化3天GBR膜组为37℃培养3天的自矿化GBR膜的结果，自矿化7天GBR膜组为37℃培养7天的自矿化GBR膜的结果。根据图5可知，37℃培养1天和37℃培养3天的自矿化GBR膜在其表面没有检测到碳酸根基团，说明在其表面还没有形成矿化物，而37℃培养7天的自矿化GBR膜可以在其表面检测到碳酸根基团，说明在其表面形成了矿化物，说明本申请方案的自矿化天数要大于3天才行。
实施例2的自矿化GBR膜与成骨细胞共培养的免疫荧光图如图6所示，图6中蓝色的是细胞核，红色的是细胞骨架，根据图6可知，成骨细胞在本申请的自矿化GBR膜上的生长形态和生长状态良好，表明本申请的自矿化GBR膜与成骨细胞具有较好的生物相容性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (4)

1.一种自矿化GBR膜的制备方法，其特征在于，所述自矿化GBR膜包括金属支架和设置在所述金属支架表面的自矿化胶原膜，所述制备方法包括：
金属支架设计：根据骨缺损区的三维形态数据，建立与所述骨缺损区相匹配的金属支架模型；
金属支架制备：根据所述金属支架模型，3D打印得到金属支架；
胶原蛋白化学沉积：以胶原蛋白溶液为电解液，所述金属支架为阴极，进行电化学沉积将所述胶原蛋白沉积在所述金属支架表面形成胶原蛋白纤维网；所述电化学沉积的直流电源的电流强度在0.01A-0.025A范围内，控制沉积时间为3-15min；
将沉积胶原蛋白的金属支架风干之后，在金属支架的干燥胶原蛋白涂层表面滴加50μl0.3M的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，交联3小时充分增加胶原结构的稳定性，于蒸馏水内润洗三次，低温下冷冻干燥；
胶原蛋白纤维网自矿化：将沉积了胶原蛋白的金属支架置于矿化前驱体溶液内培养3天以上，完成所述胶原蛋白纤维网的自组装过程，使其在所述金属支架的表面形成自矿化胶原膜，得到所述自矿化GBR膜；
所述矿化前驱体溶液的制备方法为：
将CaCO3粉末悬浮于蒸馏水中，于15-35℃通CO2气体1-4h，以使CaCO3/Ca(HCO3)2平衡反应向Ca(HCO3)2推进；
过滤多余的CaCO3，于15-35℃再通入CO2气体15-60min，以液化残存的CaCO3；
测量并加入蒸馏水以调整Ca2+浓度；
加入聚合物和MgCl2粉末，混合均匀得到碳酸钙盐无机物离子制备得到的矿化前驱体溶液；
或，所述矿化前驱体溶液的制备方法为：
将CaCl2和聚合物粉末悬浮于蒸馏水中，边搅拌边加入Na3PO4粉末，得到磷酸钙盐无机物离子制备的矿化前驱体溶液；Ca2+、PO4 3-的摩尔比为3:2，所述聚合物的浓度为10-30μg/mL；
所述聚合物选自聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚烯丙胺、酪蛋白磷酸肽中的任一种；
所述胶原蛋白溶液的制备方法包括：
将胶原蛋白溶解于冰醋酸溶液，在转速1000-1400r/min，10℃以下搅拌24-72h，得到所述胶原蛋白溶液；
所述冰醋酸溶液的浓度为80-120mM，PH值为2.0-4.0；
所述胶原蛋白溶液的储存浓度为0.2-2.0mg/ml；所述胶原蛋白溶液的电解浓度为0.1-0.5mg/ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金属支架的材料选自钛、锌、镁中的任一种；所述金属支架的厚度为0.1-5mm。
3.根据权利要求1至2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白化学沉积之前还包括金属支架的预处理，所述金属支架的预处理包括如下特征中的至少一个：
I.使用砂纸抛光打磨所述金属支架，除去金属支架表面的氧化层；
II.使用浓硫酸和浓盐酸的混合溶液进行酸处理；
III.进行超声清洗；
IV.分别使用丙酮、无水乙醇、蒸馏水依次超声清洗。
4.一种自矿化GBR膜，其特征在于，由权利要求1至3任一项所述的自矿化GBR膜的制备方法制备得到。
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