ES2201187T3

ES2201187T3 - Uso de la escualamina para la fabricacion de un medicamento para inhibir el nhe.

Info

Publication number: ES2201187T3
Application number: ES96919096T
Authority: ES
Inventors: Michael Zasloff
Original assignee: Genaera Corp
Current assignee: Genaera Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: EP0831837A1; AU6152896A; CA2223908C; JPH11506775A; AU712436B2; EP0831837B1; WO1996040151A1; DK0831837T3; ATE238800T1; US5792635A; JP4077512B2; ZA964819B; DE69627853T2; PT831837E; DE69627853D1; CA2223908A1

Abstract

SE DESCRIBEN COMPUESTOS DE AMINOESTEROL QUE RESULTAN UTILES COMO INHIBIDORES DEL INTERCAMBIADOR DE SODIO/PROTON (NHE). TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA UTILIZAR DICHOS COMPUESTOS DE AMINOESTEROLES, INCLUYENDO AQUELLOS QUE EMPLEAN COMPUESTOS QUE SON INHIBIDORES DE UN ESPECTRO DE NHE, ASI COMO AQUELLOS QUE UTILIZAN COMPUESTOS QUE SON INHIBIDORES SOLO DE UN NHE ESPECIFICO. TAMBIEN SE DESCRIBEN TECNICAS Y ENSAYOS DE EVALUACION VENTAJOSOS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD TERAPEUTICA DE UN COMPUESTO.

Description

Uso de escualamina para la fabricación de un medicamento para inhibir el NHE.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de escualamina o de una sal derivada farmacéuticamente aceptable como inhibidores del intercambiador sodio/protón (NHE).

Antecedentes de la invención

Cada una de las células del cuerpo debe mantener su equilibrio ácido base o, más específicamente, su concentración de iones hidrógeno o protones. Pequeños cambios en la concentración de ión hidrógeno causan fuertes alteraciones en las velocidades de las reacciones químicas en las células, algunas viéndose frenadas y otras aceleradas. En términos muy amplios y generales, si una persona tiene una alta concentración de iones hidrógeno (acidosis), esa persona probablemente entre en coma y muera, y si una persona tiene una baja concentración de iones hidrógeno (alcalosis), él o ella puede morir de tétanos o de convulsiones. Entre estos extremos existe un intervalo enorme de enfermedades y condiciones que dependen de las células involucradas y del nivel de concentración de ión hidrógeno que se experimente. Por tanto, la regulación de la concentración de ión hidrógeno es uno de los aspectos más importantes de la homeostasis.

Un método sencillo para expresar la concentración de ión hidrógeno es el pH: pH = log 1/(concentración de H^{+}). El pH normal de las células es de 7,4, pero una persona sólo puede sobrevivir durante unas pocas horas con un pH inferior a 7,0 o superior a 7,7. Por tanto, mantener el pH es crítico para la supervivencia.

Hay varios mecanismos para mantener el equilibrio de pH. Por ejemplo, durante la quiescencia y el crecimiento constitutivo, las células parecen utilizar el intercambiador cloruro/bicarbonato, un dispositivo bien estudiado que proporciona un intercambio de protones a través de células tales como las células rojas.

Además, durante los periodos acelerados de crecimiento, que están inducidos por mitógenos, factores de crecimiento, esperma, etc., las células establecen otra pieza de equipamiento celular para tratar el inminente estallido metabólico. Este es el intercambiador sodio/protón (Na^{+}/H^{+}), el "NHE", que también se conoce como "antiportador". Debido a las funciones del NHE en un número de papeles y en un número de tejidos, el cuerpo ha desarrollado una familia de NHEs, y el trabajo reciente ha elucidado una familia de "isoformas" de NHE que se localizan en determinados tejidos y que se asocian a diversas funciones. Las isoformas de NHE listadas más adelante con toda probabilidad son significativas.

El NHE1 es un intercambiador interno y se cree que está sin regular durante la hipertensión. Se piensa que juega un papel en el comportamiento del pH intracelular. También, se cree que el control de este intercambiador protegerá a un paciente frente a heridas isquémicas.

El NH1 se asocia genéticamente con la diabetes y, por tanto, la inhibición podría alterar la evolución de la diabetes vía efectos en células beta del páncreas. Además, la proliferación de músculo liso vascular, que reacciona frente a la glucosa, se asocia a la expresión aumentada de NHE1a.

El NHE1\beta está presente en los eritrocitos nucleados. Es inhibido por altas concentraciones de amiloride. Esta isoforma de NHE está regulada por los agentes adrenérgicos en una moda dependiente de cAMP.

El NHE2 está asociado a numerosas células del tracto de intestino grueso y del músculo esquelético. La inhibición podría alterar el crecimiento de estados hiperplásticos o de estados hipertróficos, tales como la hipertrofia de músculo liso vascular o la hipertrofia cardiaca. Los cánceres de origen muscular tales como el rabdomiosarcoma y el leiomioma son objetivos terapéuticos razonables.

El NH3 se asocia al colon. El trabajo descrito más adelante muestra que está asociado a células endoteliales. La inhibición afectaría a funciones tales como el intercambio de agua en el colon (aumento del flujo de fluido intestinal, que es la base de, por ejemplo, el estreñimiento), el cáncer de colon, etc. En las células endoteliales, el crecimiento normal estaría inhibido por la inhibición del intercambiador.

El NHE4 se asocia a determinadas células del riñón. Parece jugar un papel en la regulación del volumen celular. Inhibidores específicos podrían afectar a la función del riñón, y por lo tanto proporcionar un beneficio terapéutico en la hipertensión.

El NHE5 se asocia al tejido linfoideo y a las células del cerebro. La inhibición de NHE5 causaría la inhibición de desórdenes proliferativos en los que intervengan estas células. El NHE5 es un candidato probable para la proliferación de células gliales en respuesta al HIV y a otras infecciones víricas.

Como se ha indicado antes, aunque las funciones de NHE son para ayudar al cuerpo, la inhibición de la función de NHE podría proporcionar unas tremendas ventajas terapéuticas. Por ejemplo, aunque el NHE normalmente opera sólo si el pH intracelular cae por debajo de un determinado nivel de acidez, a través de la estimulación del factor de crecimiento los NHEs de la célula son activados incluso aunque la célula esté equilibrada a un pH de descanso "normal". Como consecuencia, los NHEs comienzan a bombear protones de la célula a un pH al que normalmente estarían inactivos. La célula sufre una pérdida progresiva de protones, incrementando su capacidad de tamponamiento de red o, en algunos casos, realmente alcalinizándose. En escenarios en los que el funcionamiento de la bomba está impedido, el estímulo de crecimiento no da como resultado un efecto celular. Por tanto, los inhibidores de la familia de NHEs probablemente ejercen efectos de inhibición del crecimiento.

Durante un estrés ácido severo, la condición en la que podría encontrarse un tejido si es privado de oxígeno (o de suministro sanguíneo), se cree que la familia de NHEs contribuye a un subsiguiente daño irreversible. Por ejemplo, si el flujo sanguíneo al corazón se ve perjudicado, se produce una acidosis local. Las células musculares del corazón desarrollan una profunda acidez interna. La acidez, a su vez, activa a los en otra situación latentes NHEs. Estos intercambiadores eliminan fácilmente protones de la célula, pero mediante intercambio con sodio. Como consecuencia, las concentraciones de sodio intracelular aumentan. Posteriormente, el intercambiador de sodio- calcio es activado, intercambiando sodio interno por calcio externo. El aumento de las concentraciones internas de Ca^{+} conduce a la muerte celular, a una contractilidad disminuida, y a arritmias. Por tanto, se cree que el daño isquémico de miocardio y las arritmias asociadas surgen de un mecanismo dependiente de NHE, y por lo tanto la inhibición de este NHE prevendría tales sucesos. Si el NHE inhibía la internalización del Na^{+} y frenaba la actividad metabólica como consecuencia del pH disminuido, el daño de la célula podría evitarse. Por ello, existe interés en el desarrollo de inhibidores de NHE para uso en isquemia cardiaca.

Otros miembros de la familia NHE parecen jugar un papel más clásico en el transporte de agua y de sodio a través de las superficies epiteliales. Específicamente, se cree que la isoforma NHE3 encontrada en el colon juega un papel en la regulación del contenido de fluido del lumen del colon. Esta bomba es inhibida en los casos de diarrea. Se cree que la isoforma NHE3 presente en los túbulos próximos del riñón juega un papel similar con respecto a la sal renal y al intercambio ácido. Del mismo modo, los inhibidores de la familia de NHEs han sido considerados como modalidades terapéuticas para tratar la hipertensión.

En vista del valor esperado de la acción de la inhibición de NHE, los científicos han fijado su interés en los inhibidores de NHE. El inhibidor de NHE más ampliamente estudiado es el amiloride, una pirazina modificada con guanidina usada clínicamente como diurético. Se ha generado un número de derivados, incorporando diversas sustituciones alquilo. Estos derivados han sido estudiados con las diferentes isoformas de NHE que se conocen y que se han descrito anteriormente, excepto para el NHE5, para el que no se conoce ningún inhibidor.

Las actividades de estos inhibidores frente a estos intercambiadores específicos han sido determinadas previamente. Como se observa en la Tabla A siguiente, cada intercambiador exhibe un espectro diferente de respuesta para cada inhibidor:

TABLA A

	Amiloride	DMA	MPA
	K_{i}(\muM)	K_{i}(\muM)	K_{i}(\muM)
NHE1	3	0,1	0,08
NHE2	3	0,7	5,0
NHE3	100	11	10

Notas: DMA = dimetilamiloride; MPA = metilpropilamiloride.

Véase Counillon y col., Molecular Pharmacology 44, 1993, 1041-1045.

Los inhibidores de NHE descritos por Counillon y col. Exhiben especificidad para el NHE1. Por lo tanto, tienen un valor terapéutico en el tratamiento de condiciones en las que la inhibición de esta isoforma es beneficiosa. Sin embargo, estos inhibidores no afectan a las otras isoformas de NHE conocidas, por ejemplo, el NHE3 no se ve afectado.

El NHE3, como se demuestra más adelante, está expresado en las células endoteliales, y su inhibición da como resultado efectos antiangiogénicos. El espectro de isoformas de NHE inhibidas por los compuestos de aminosterol según la invención es diferente a aquellos inhibidos por el amiloride o por los compuestos de Counillon y col., y tienen diferentes, distintos efectos farmacológicos.

Además, Counillon y col. También informaron de que determinados derivados de la benzoilguanidina inhiben otras isoformas de NHE. En particular, el metanosulfonato de (3-metilsulfonil-4-piperidinobenzoil)guanidina exhibe una particular selectividad hacia el NHE1 como se muestra en la tabla siguiente.

\newpage

TABLA B

Isoforma de NHE	K_{i} (\muM)
NHE1	0,16
NHE2	5,0
NHE3	650

Estos compuestos de benzoilguanidina, que están basados en la estructura química del amiloride, exhiben la mayor especificidad para inhibir NH1 mientras que retienen una considerable actividad frente al NHE2 y al NHE3. Para alcanzar la inhibición farmacológica de NHE1, la isoforma "casera" ampliamente distribuida, se produce una desactivación no deseada de NHE2 y de NHE3.

Por lo tanto, aquellos con conocimientos en la técnica han continuado buscando inhibidores de NHE que exhiban una acción selectiva contra un único y específico NHE. Tales inhibidores permitirían una inhibición más precisa de un tejido perturbando el efecto del NHE sobre su crecimiento.

De este modo, los artesanos han reconocido que el desarrollo de varios inhibidores de NHE específicos permitiría el desarrollo de nuevas terapias para una multitud de enfermedades y condiciones, que incluyen: el tratamiento de arritmias; el tratamiento y la prevención del infarto cardiaco; el tratamiento y la prevención de la angina de pecho y de los desórdenes isquémicos del corazón; el tratamiento y la prevención de los desórdenes isquémicos del sistema nervioso central y periférico; el tratamiento y la prevención de los desórdenes isquémicos de miembros y órganos periféricos; el tratamiento del shock; el suministro de agentes antiarterioscleróticos; el tratamiento de complicaciones diabéticas; el tratamiento de cánceres; el tratamiento de enfermedades fibróticas, incluyendo fibrosis de pulmón, de hígado y de riñón; y el tratamiento de la hiperplasia prostática. Otros objetivos terapéuticos incluyen: el tratamiento de enfermedades víricas, tales como el VIH, el HPV y el HSV; la prevención de malignidades; la prevención de diabetes (es decir, heridas de células de islote); la prevención de complicaciones vasculares de la diabetes; el tratamiento de desórdenes de neovascularización anormal, por ejemplo, degeneración macular, artritis reumatoide, soriasis, cáncer, hemangiomas malignos; la prevención de retenosis vascular; la prevención de daño vascular asociado a la hipertensión; la inmunosupresión; y el tratamiento de desórdenes vasculares de colágeno.

Los inhibidores de NHEs de bacterias, hongos y protozoos también serían valiosos como antimicrobianos específicos. Se sabe que todas las células vivas usan un NHE de una u otra forma par mantener el Na^{+} intracelular y la homeostasis del pH. Se han clonado NHEs a partir de numerosas bacterias y hongos, y tienen una cierta homología de secuencia con las isoformas de mamíferos. Usando como objetivo un NHE de bacteria o de hongo altamente específico, debería ser posible desarrollar un inhibidor altamente específico de dicho intercambiador, uno que sea particularmente ventajoso o que carezca de actividad contra las isoformas de mamífero. Tales compuestos serían útiles como antibióticos de un mecanismo diferente.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de inhibidores específicos de NHEs. Aún más, existe una necesidad de desarrollar inhibidores de NHE para diversos usos terapéuticos.

Sumario de la invención

La invención está dirigida a usos farmacéuticos y a terapias que emplean los compuestos de la invención. La invención está dirigida a nuevos usos farmacéuticos para la escualamina y para las sales derivadas farmacéuticamente aceptables, que habían sido aisladas y caracterizadas previamente.

La invención está dirigida a un método para inhibir NHE3, preferiblemente a un método para inhibir específicamente esta isoforma de NHE que es expresada en un proceso patológico, que comprende la administración de una cantidad eficaz de escualamina (o de su sal farmacéuticamente aceptable). Otro método de acuerdo con la invención incluye la inhibición del crecimiento de células endoteliales, especialmente las de nuevos capilares, que comprende la administración de una cantidad eficaz de escualamina.

Otros aspectos, objetivos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción detallada presentada a continuación, que ilustra, junto con las figuras anexas, las características y realizaciones preferidas de la invención.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B muestran la inhibición por escualamina de la isoforma 3 del intercambiador sodio/protón de conejo. La Figura 1A es una representación de la velocidad de recuperación del pH (eje y) en función de la concentración extracelular de ión sodio restaurada (eje x) para células precargadas con ácido por exposición a NH_{4}Cl 40 mM, siendo la curva marcada con un "+" el control (sin fármaco) y siendo la curva marcada con un "\triangle" para la escualamina. La Figura 1B muestra el pH interno real (eje y) en función del tiempo (eje x) después de la adición de 5 \mug/ml de escualamina para las células no precargadas con ácido.

La Figura 2A muestra la falta de inhibición por escualamina de la isoforma 1 del intercambiador sodio/protón (NHE1) de conejo. La Figura 2B muestra la falta de inhibición por escualamina del NHE1 humano. En estas representaciones de pH interno frente a tiempo, la curva marcada con "o" es para la escualamina y la marcada con "+" es el control (células incubadas en ausencia de escualamina).

Las Figuras 3A, 3B y 3C ilustran que las células endoteliales exhiben una mayor sensibilidad a la escualamina (barra por encima de 3 en el eje x) que a otros agentes membrano-activos, y que las células endoteliales son más sensibles a la escualamina que las células epiteliales y los fibroblastos. La Figura 3A corresponde a la administración de 1 \mug/ml del agente a células pulmonares bovinas endoteliales, mientras que las Figuras 3B y 3C corresponden a la administración de 10 \mug/ml de los agentes membrano-activos a células epiteliales humanas y a fibroblastos de prepucio humano, respectivamente.

Las Figuras 4A, 4B y 4C muestran la supresión del crecimiento de melanoma de murina, respectivamente a través de administración subcutánea, intraperitoneal y oral de escualamina.

La Figura 5 demuestra la supresión del crecimiento de melanoma humano 1205Lu en ratones inmunocomprometidos (RAG-1) por escualamina en diferentes dosificaciones ("o" = 10 mg/Kg\cdotd, "+" = 20 mg/Kg\cdotd, "o" = 40 mg/Kg\cdotd; d = día).

La Figura 6 ilustra la supresión de melanoma de murina en ratones por administración intraperitoneal del compuesto 319.

La Figura 7 muestra la compensación farmacocinética del compuesto 319 de un estudio sobre ratón IV PK.

La Figura 8 muestra la compensación farmacocinética del compuesto 319 de un estudio sobre ratón IV PK.

La Figura 9 es un perfil de HPLC para aminosteroles derivados del hígado de un tiburón cazón, que ilustra la diversidad de estos compuestos.

La Figura 12 ilustra que la escualamina y el compuesto 1436 exhiben sinergia en la supresión del crecimiento de melanoma de murina en ratones.

Las Figuras 13 y 14 muestran la supresión in vitro del crecimiento de músculo liso de arteria coronaria humana por el compuesto 1436 (Figura 13) y por escualamina (Figura 14), con la absorbancia representada frente a la concentración en \mug/ml.

La Figura 15 es una ampliación de los datos mostrados en las Figuras 14A y 14B, que evidencia que tanto el compuesto 1436 como la escualamina suprimen in vitro el crecimiento de músculo liso de arteria coronaria humana.

Las Figuras 17A y 17B muestran el efecto del compuesto 353 frente al de la escualamina sobre el melanoma humano.

Descripción detallada de la invención Síntesis de compuestos de aminosterol

El esteroide conocido como escualamina es el sujeto de la Patente de EE.UU. Nº 5 192 756 de Zasloff y col. Este compuesto es un antibiótico de amplio espectro, que mata bacterias, hongos y protozoos. La esteroquímica absoluta de la escualamina, el compuesto 1256, se muestra más adelante. La síntesis química completa de la escualamina fue publicada en 1994.

Ejemplo 1 Preparación de aislados de hígado de tiburón

Además de la escualamina, al menos otros diez aminosteroles distintos han sido recuperados a partir de los extractos de hígado de tiburón cazón. Para preparar los aminosteroles, el hígado de tiburón fue extraído con metanol:ácido acético. El extracto acuoso fue adsorbido con sílice C18 y fue eluido con acetonitrilo al 70%, y el eluato fue adsorbido sobre SP-sephadex y eluido con NaCl 1,5 M. Se ajustó el eluato a NaCl 5 M, y los esteroides salieron. Se filtró el precipitado sobre Celite y fue eluido con agua caliente, seguida de metanol. Se redujo el eluato en volumen y se aplicó a una columna C18 de 1 pulgada, y se sometió a cromatografía utilizando un gradiente creciente de acetonitrilo. Se recogieron fracciones, fueron concentradas por evaporación, y analizadas por separado mediante cromatografía de capa fina (TLC, del inglés "Thin Layer Chromatography").

En la Figura 9 se muestra el perfil de HPLC de los aminosteroles aislados a partir de 40 Kg de hígado de tiburón. Se llevó a cabo una purificación final con HPLC como se ha descrito en Moore y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1993, 1354-1358. Las fracciones de HPLC fueron resueltas de forma individual mediante cromatografía de capa fina sobre sílice (6:3:1 CH_{2}Cl_{2}:MeOH:NH_{4}OH) visualizada en vapor de yodo. La fracción 40 representa la porción más hidrofílica del perfil de elución, y la fracción 66 representa la porción más hidrofóbica.

La escualamina eluida comienza aproximadamente en la fracción 62 y continua hasta la fracción 80. Además, pueden verse otros esteroides eluyendo entre las fracciones 43-47 (R_{f} 82), 53-55 (R_{f} 1,02), 56-59 (R_{f} 0,51), 57-62 (R_{f} 0,96), 60-64 (R_{f} 0,47), 61-66 (R_{f} 1,06), como se describe a continuación en la Tabla 1.

TABLA 1 Caracterización química y estructural de los aminosteroles aislados a partir de hígado de tiburón

FRACCIÓN	TLC R_{f}	Compuesto Nº	Masa
43 - 47	0,82	FX 1A	664,5
		FX 1B	641,5
53 - 55	1,02	1360	641,49
56 - 59	0,51	FX 3
57 - 62	0,96	1437	657,52
60 - 64	0,47	1436	684,52
61 - 66	1,05	1361	543,48
63 - 80	1,0	1256	627,98

Las estructuras de algunos de estos compuestos se muestran a continuación.

1

2

3

4

5

6

7

Cada una de estas entidades fue aislada, purificada, caracterizada y su estructura determinada por RMN como se describe a continuación.

Compuesto 1360

Este compuesto, el principal esteroide en la Fracción 2 a partir de HPLC C18 de fase inversa preparativo, fue purificado mediante un fuerte intercambio de cationes usando HPLC de sulfoetilaspartamida eluido con un gradiente creciente de NaCl. Se ensayaron fracciones de esteroides con TLC de sílice desarrollada en CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH:NH_{4}OH (6:3:1) y visualizada con yodo. A continuación las fracciones de esteroides fueron reunidas y vueltas a cromatografiar con HPLC C18 de fase inversa con un gradiente creciente de CH_{3}CN en TFA acuoso al 1%. El análisis de TLC del compuesto purificado mostró un único punto con R_{f} = 1,02 con respecto a la escualamina (R_{f} de la escualamina = 1).

Para posteriores aislamientos del compuesto 1360, no se llevó a cabo una cromatografía de fuerte intercambio de cationes. En lugar de ello, las fracciones reunidas a partir de HPLC C18 de fase inversa preparativo fueron sometidas directamente a HPLC C18 o C8 de fase inversa usando un gradiente más plano de CH_{3}CN. Las fracciones fueron ensayadas tanto por TLC como también por RMN de ^{1}H para muestras redisueltas en D_{2}O.

Cuando se analizó con FAB-MS, típicamente el compuesto sólo mostró una señal (M+H)+ muy débil a 642,5 y un fragmento intenso a 562,5 daltons en el modo de iones positivos. En el FAB-MS de iones negativos, se observó (M-H)- a 640,4. El posterior análisis de ionización por electrospray (ESI-MS) exhibió fuertes señales (M+H)+ y (M-H)- consistentes con una masa matriz de 641,4, junto con muchos aductos de TFA. Esto sugería que la falta de estabilidad del sulfato en el compuesto 1360 era más pronunciada en las condiciones FAB.

Puesto que el ión matriz en el FAB de modo de iones positivos era muy débil en intensidad, la determinación de masas precisa se dirigió al fragmento desulfatado. Se observó una masa precisa de 561,49325. A continuación se calculó una masa matriz precisa de 641,49 daltons añadiendo la masa del SO_{4}^{-}, que coincide con la fórmula molecular C_{34}H_{63}N_{3}O_{6}S. Esta fórmula molecular, con un oxígeno adicional y dos hidrógenos menos si se compara con la escualamina (C_{34}H_{65}N_{3}O_{5}S), sugería un compuesto que porta un resto carbonilo.

El RMN de ^{1}H del compuesto 1360 en D_{2}O (300 MHz) reveló varias características que lo distinguían de la escualamina. Para el compuesto 1360, la resonancia que aparece más alejada a bajo campo en \delta = 4,15 ppm mostró un espectro de partición de al menos 7 señales con una integración de dos protones; para la escualamina, la resonancia más descubierta a \delta = 4,2 ppm fue la posición del sulfato (H24), resuelta a 300 MHz como un multiplete de 5 señales con una integración de un protón. A 2,6 ppm, el compuesto 1360 también mostró un multiplete poco resuelto, atribuido a 2 protones. Se sospechó que estas resonancias podrían ser atribuidas a protones de metilenos en posición \alpha respecto a un grupo carbonilo, basándose en la comparación con la bibliografía. En la escualamina, la región de 2,2-2,75 no exhibía resonancias. El compuesto 1360 mostró dos dobletes de metilo distintos, uno a 0,95 ppm y el otro a 1,1 ppm; esto contrasta con la escualamina, en la que tres grupos metilos se dividen como dobletes que se solapan en la región 0,9-1,05 ppm. Otras características de resonancia eran bastante similares para los dos esteroides. En la región del metilo a alto campo, tanto el compuesto 1360 como la escualamina mostraron señales de metilo de singlete anular a 0,85 y a 0,65 ppm, posiciones 19 y 18 respectivamente. Las resonancias de los núcleos de esteroides (1,0-2,1 ppm) y de la espermidina también mostraron el mismo espectro característico tanto para el compuesto 1360 como para la escualamina. El H7, en la posición del alcohol en el anillo, tiene una resonancia a 3,85 ppm para ambos esteroides en D_{2}O.

Un espectro COSY (Espectroscopía correlacionada) llevado a cabo en D_{2}O (300 MHz) estableció el sulfato en la posición 27, -CH_{2}OSO_{3}-. El diagnóstico de espectros de señales cruzadas en la representación de frecuencia bidimensional (2D) indicó que el pico doble a \delta = 1,1 ppm era el metilo 26, que estaba conectado al H25 a 3,05 ppm (oculto bajo las resonancias de poliamina), que a su vez era el vecino más próximo al multiplete complejo a 4,15 ppm.

La región de la poliamina en el mapa de 2D era consistente con el espectro de partición de la espermidina, confirmando que el compuesto 1360 tenía la misma poliamina que la escualamina. A parte de eso, el mapa de 2D en D_{2}O era deficiente en muchas señales cruzadas, particularmente en la región del núcleo del esteroide, y no podría ser usado para establecer la estructura primaria completa.

El compuesto 1360 fue secado a vacío y disuelto en DMSO-d6 en atmósfera de nitrógeno, y a continuación fue sellado en nitrógeno usando ciclos de congelación-descongelación-bombeo. Tanto los espectros de RMN de ^{1}H de 1D como los de 2D fueron llevados a cabo a 300 MHz y a 600 MHz. Todas las resonancias de protones del compuesto en DMSO eran estrechas (excepto para la región de la poliamina (2,8- 3,1)) y estaban desplazadas con respecto a las asignaciones en D_{2}O. Por ejemplo, el multiplete para la posición 27 estaba desplazado campo arriba hasta 3,77 ppm y el protón H7 estaba desplazado hasta 3,60 ppm. Además, una nueva señal de doblete (integración = 1 H) apareció a 4,17 ppm. Esta nueva resonancia se identificó como el grupo hidroxilo de la posición 7, basándose en su conectividad en 2D con el H7, lo que era inequívoco a 600 MHz. Esta resonancia no podría ser observada en D_{2}O debido a su rápido intercambio con el disolvente. El mapa 2D del compuesto 1360 en DMSO reconfirmó la posición del grupo sulfato en la posición 27, que fue deducida inicialmente a partir del mapa COSY 2D en D_{2}O.

Una comparación en detalle de los dos mapas COSY 2D para el compuesto 1360 y para la escualamina sugirió la presencia de un carbonilo en la posición 24. El multiplete centrado a 2,5 ppm (2,6 ppm en D_{2}O) con integración de 2 protones dio unas intensas señales cruzadas que identificaron estas resonancias como H23a,b (localizadas en posición á con respecto a un carbonilo en la posición 24) y con conexiones a los vecinos más cercanos a H22a,b. En un experimento de espectroscopía de correlación total (TCOSY), una nueva señal cruzada era discernible como H22/H21, debido a la propagación de la magnetización a lo largo de la cola del esteroide.

Sensiblemente ausentes de los mapas 2D de COSY y TCOSY estaban las señales que permitirían la propagación de la magnetización a partir de las posiciones 23 a 24 y a continuación desde la 24 a la 25. Al contrario que el COSY de la escualamina, que muestra las señales cruzadas de los vecinos más próximos para 22-23-24-25- 26/27, el compuesto 1360 mostró una interrupción de la conectividad, sugiriendo que un grupo funcional en la posición 24 bloquea la transferencia de la señal del protón. La estructura puede ser verificada reduciendo el C=O a un alcohol, sin embargo, puesto que un grupo alcohólico en la posición 24 permitiría la conectividad completa entre protones a partir de las posiciones 21-26 y 27.

El RMN de ^{13}C del compuesto 1360 en DMSO indicó 34 señales de carbono. En comparación con la escualamina, el compuesto 1360 tiene un carbonilo a 212 ppm (C24). El C27 presentó una resonancia a 67 ppm, lo cual concuerda con los valores publicados para sulfato de escimnol.

Compuesto 1361

El compuesto 1361 fue aislado a partir de preparaciones de hígado de tiburón de dos formas distintas: primero, como un producto de degradación del compuesto 1360; y, posteriormente, como un componente menor del aminosterol que se fracciona con un tiempo de retención ligeramente más rápido que la escualamina durante el HPLC C18 de fase inversa (componente de la Fracción VI). En los primeros intentos de purificar cada aminosterol hasta homogeneidad, las fracciones reunidas a partir de HPLC C18 de fase inversa fueron sometidas a cromatografía flash con gel de sílice con CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH:NH_{4}OH 6:3:1, y los aminosteroles fueron ensayados sobre placas de TLC. Los conjuntos de esteroides libres de bases fueron resometidos a continuación a HPLC C18 de fase inversa, usando una columna analítica. El perfil de elución de HPLC de fase inversa mostró dos esteroides principales, el compuesto 1360 y un segundo esteroide más hidrófobo que eluye a un mayor % de CH_{3}CN. La falta de estabilidad del sulfato en la posición 27 del compuesto 1360 condujo a la formación del compuesto 1361, aparentemente a través de una eliminación catalizada por una base.

Las señales de contraste del espectro de ^{1}H para el compuesto 1361 en D_{2}O (400 MHz) incluían la ausencia del multiplete a \delta = 4,15 ppm que corresponde a protones de grupo metileno en la posición 27, que porta el sulfato. Dos nuevos protones singlete a \delta = 5,95 ppm y 6,15 ppm en D_{2}O, cada uno con valores de integración de ^{1}H, fueron identificados como protones de grupo vinilo. También, en contraste con el doblete de metilo a \delta = 0,9 ppm del compuesto 1360, el nuevo esteroide mostró un metilo singlete a \delta = 1,8 ppm, característico de un metilo alílico. Favorablemente, los desplazamientos químicos de los grupos vinilo y de los metilos alílicos son comparables con los valores de la bibliografía. Por lo demás, el espectro de ^{1}H mostró señales características del compuesto 1360, incluyendo la presencia de señales de metileno a \delta = 2,75 ppm, en posición alfa con respecto al carbonilo de la posición 24. Las regiones de poliamina presentaron espectros de partición similares a los de la escualamina, confirmando el aducto de espermidina.

Se midió una masa precisa de 543,4823 mediante FAB-MS (modo de ión positivo). La fórmula molecular C_{34}H_{61}N_{3}
O_{2} tiene una masa calculada de 543,4842, con un valor muy parecido al valor experimental observado. Esta fórmula molecular para el compuesto 1361 es consistente con la eliminación de sulfato de la molécula matriz, el compuesto 1360. Además, la fórmula molecular del compuesto 1361 tiene un equivalente de doble enlace (DBE, del inglés "Double Bond Equivalent") de 5,5, en comparación con un valor de 5,0 para el compuesto 1360 y de 4,0 para el compuesto 1256; este valor de DBE está en consonancia con la instauración adicional del compuesto 1361.

Compuesto 1436

Este compuesto y los esteroides descritos más adelante fueron purificados sometiendo a las fracciones a HPLC C18 de fase inversa preparativo en condiciones de gradiente de CH_{3}CN más plano en columnas C18 más pequeñas. Aunque en la purificación de los compuestos 1360 y 1361 se había usado cromatografía de fuerte intercambio iónico y cromatografía flash con gel de sílice (SG, del inglés "Silica Gel") seguidas de HPLC de fase inversa, estos protocolos no se usaron cuando se observó labilidad de pH.

Aunque el compuesto 1436 eluye en HPLC C18 de fase inversa con un tiempo de retención sólo ligeramente más rápido que la escualamina, su R_{f} = 0,47 sobre TLC alude a una estructura química con una polaridad significativamente mayor que la de la escualamina en condiciones alcalinas (CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH:NH_{4}OH 6:3:1).

El espectro de RMN de ^{1}H en D_{2}O (400 MHz) reveló que las regiones de poliaminas diferían de las de la escualamina. Tanto el espectro de partición como la integración se parecían a la espermina más que a la espermidina, es decir, a la N,N=-bis-3-aminopropil-1,4-butanodiamina más que a la N-(3-aminopropil)-1,4- butanodiamina. Aparte de eso, el espectro de ^{1}H era idéntico al de la escualamina: un protón a \delta = 4,15, la posición 24 de sulfato; un protón a \delta = 3,85, que corresponde al H7 de la posición alcohólica del anillo; tres dobletes solapados en 0,85-0,95 ppm que corresponden al metilo 21 y a los metilos 26 y 27. La identidad de la espermina fue confirmada mediante la realización de COSY en D_{2}O, comparando los espectros de señales cruzadas con los de patrones de referencia de la espermina (C_{10}H_{26}N_{4}) y de la espermidina (C_{7}H_{19}N_{3}) así como de la escualamina en D_{2}O. Aunque los espectros COSY de los aminosteroles generalmente no aportan un mapa bidimensional completo de las señales cruzadas en D_{2}O y por lo tanto no se puede confiar en obtener unas completas asignaciones de vecinos próximos, la región de poliamina produjo un conjunto completo de señales cruzadas fuera de la diagonal, que sirvieron como el espectro de firma fidedigno para discernir entre la espermidina y la espermina.

El espectro de ^{13}C del compuesto 1436 mostró 3 señales adicionales en D_{2}O, pero por lo demás el esqueleto de carbono del esteroide era el mismo que para la escualamina en D_{2}O. Se llevó a cabo una DEPT-135 (transferencia de polarización intensificada sin distorsión) de tal forma que las señales de metilo y de metino fueron fasadas como señales positivas, los grupos metileno como señales negativas, y los carbones cuaternarios dieron intensidad cero. La DEPT-135 del compuesto demostró que estas tres señales adicionales eran metilenos (negativas).

La fórmula molecular de C_{37}H_{72}N_{4}O_{5}S tiene una masa calculada de 684,53017, que coincide bastante bien con la masa precisa observada experimentalmente de 684,5216 medida con FAB-MS de alta resolución (modo de ión positivo). La masa adicional de 58 daltons (684,5 frente a 627,5 para la escualamina) era consistente con la presencia de un grupo 3-aminopropil extra atribuido a la espermina. Además, el número de masa uniforme para el ión matriz está en consonancia con la regla del nitrógeno, que predice un compuesto que tiene un número uniforme de nitrógenos. El FAB-MS también mostró la fragmentación en especies tanto de 80 unidades de masa menos como de 90 unidades de masa menos que la matriz (M+H)+ de 685 uma (unidades de masa atómica). Estos fragmentos representa la pérdida de sulfato seguida de deshidratación, de forma paralela a la labilidad estructural de la escualamina en condiciones de FAB-MS.

El compuesto 1436 también fue sintetizado a partir del compuesto 1256 (escualamina) de acuerdo con el siguiente esquema de reacción:

(Esquema pasa a página siguiente)

8

Dentro de un matraz de fondo redondo se introdujeron 95 mg (0,106 mmol) de escualamina (sal de TFA), que se disolvió en 800 \mul de metanol anhidro. Se añadió a la mezcla 118 \mul (0,848 mmol) de trietilamina, seguida de 100 \mul (0,106 mmol) de una disolución de acrilonitrilo diluido (70 \mul de acrilonitrilo diluido en 1000 \mul de metanol). Después de 6 horas, se añadieron 40 \mul adicionales (0,042 mmol) de la disolución diluida de acrilonitrilo. Tras 24 horas, la TLC mostró la presencia del material de partida y de un producto con R_{f} = 0,7 (la escualamina tiene R_{f} = 0,5). Se paró la reacción, y se aisló el producto mediante cromatografía flash (12:3:1 a 6:3:1 CH_{2}Cl_{2}:MeOH:NH_{4}OH).

El producto, aunque homogéneo por TLC, parecía ser una mezcla por espectroscopía de RMN. El producto así obtenido fue añadido a un matraz de hidrogenación junto con 10 mg de níquel Raney, 7,3 mg de hidróxido sódico y 5 ml de etanol absoluto, y fue hidrogenado a 275 KPa durante 17 horas. Se observaron dos productos, ahora separables (cromatografía flash, 6:3:1 CH_{2}Cl_{2}:MeOH:NH_{4}OH), en TLC, en la que la mancha inferior coincidió con la referencia (compuesto 1436 natural aislado). Este producto fue separado mediante cromatografía de fase inversa para dar lugar a 1,5 mg del material puro. Este compuesto tenía un ión de masa positiva (M+1) de 685, y sus espectros de RMN de ^{1}H y de ^{13}C eran idénticos a los del material natural aislado, confirmando de este modo su caracterización y su estructura.

Compuesto 1437

Este esteroide, que eluye de inmediatamente después del compuesto 1360 en C18 preparativo, exhibe un R_{f} = 0,96 en TLC, reflejando un carácter más polar que la escualamina en sí misma. El RMN de ^{1}H (400 MHz) en D_{2}O era esencialmente idéntico al de la escualamina para la región de metilos, para le núcleo del esteroide y para la región de la espermidina, y para el 7H de la posición hidroxilo del anillo. De forma llamativa en el espectro de ^{1}H faltaba el multiplete a \delta = 4,15 ppm correspondiente a un protón de la posición 24 de sulfato. En su lugar, se observó una nueva señal centrada a \delta = 3,95 con el característico acoplamiento de alcohol e integración para dos protones.

Si se compara con la escualamina, el espectro de ^{13}C del compuesto 1437 en D_{2}O reveló sólo dos cambios de interés. Apareció una nueva señal a \delta = 72 ppm, que posteriormente fue identificada como un grupo BCH_{2}OH puesto que su señal DEPT-135 era negativa. En la escualamina, la posición del sulfato fue identificada a \delta = 86 ppm como un carbón primario (señal DEPT-135 positiva). Para el compuesto 1437, sin embargo, esta resonancia de carbón para la posición del sulfato se desplazó hasta 76 ppm y no dio ninguna señal DEPT-135, mediante lo cual se identificó como un carbono cuaternario. La estructura de aminosterol consistente con estos datos tiene el esqueleto de carbono de ergostanol, estando el sulfato en el carbono 24 y el alcohol en el carbono 24'.

El FAB-MS en el modo de ión positivo indicó (M+H)+ a 658,6, que se fragmenta a 578,6 debido a la pérdida del sulfato; el análisis en el modo de ión negativo confirmó un ión matriz seudomolecular (M-H)- a 656,4. Se determinó una masa precisa de 578,5264 en el fragmento desulfatado, a causa de la baja intensidad de la señal de la matriz. La masa precisa del ión matriz podría calcularse entonces como 657,526 (añadiendo la masa del sulfato). El compuesto 1437 es por tanto 30 daltons más grande que la escualamina, lo que podría ser explicado por un resto -CH_{2}OH adicional.

Esteroides de la fracción I

La Fracción I (FXI) es la primera fracción de esteroides que eluye en HPLC C18 de fase inversa preparativo. Típicamente, el análisis de TLC mostró una única mancha principal con un R_{f} = 0,80-0,84 (con respecto a la escualamina, R_{f} = 1,0) y la proteína que estaba en el origen de la TLC. Si las placas de TLC se usaban con muestras concentradas (\geq 3 mg/ml), se discernían sombras de manchas adicionales, con valores de R_{f} o bien ligeramente mayores o bien inferiores a los del componente principal.

Si se sometían a HPLC de fase inversa de alta resolución usando columnas C18 con un tamaño de poro de 60-100 \ring{A} y gradientes de CH_{3}CN muy planos, la Fracción I podría ser separada en hasta 7 componentes, designados I-1, I-2, I-3, I-4, I-5, I-6 e I-7. Los esteroides FX1A, FX1B, FX1C, FX1D se presentan como posibles estructuras:

9

10

11

12

Ejemplo 2 Síntesis de aminosteroles

Además de los compuestos anteriores, que fueron aislados a partir de hígado de tiburón, se han desarrollado compuestos sintéticos de aminosterol. Se describen diversos compuestos de poliaminosterol, incluyendo aquellos específicos de los Ejemplos A-G, en el Nº de Serie de EE.UU. 08/416 883, que es la fase nacional de EE.UU. de la Solicitud Internacional Nº PCT/US94/10265, presentada el 13 de septiembre de 1994. Los compuestos mostrados ahí como ejemplo incluyen los siguientes:

13

14

15

16

Ahora se han desarrollado compuestos de aminosterol adicionales. Los compuestos preferidos de la invención incluyen aquellos mostrados como ejemplo a continuación.

Ejemplo H Preparación del compuesto 353

17

El compuesto anterior fue preparado mediante acoplamiento reductor de 5\alpha-colestan-3-ona a espermina (4 equivalentes) con cianoborohidruro de sodio de forma análoga a la preparación del compuesto 303. La purificación se consiguió sobre gel de sílice (gradiente de elución con cloroformo: metano: isopropilamina de 9:3:1 hasta 3:3:1). El compuesto 353 fue convertido en sus sales de hidrocloruro de la misma manera que para el compuesto 303. Compuesto \beta-amino 353: RMN de ^{1}H (200 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,3-3,0 (m, 13H), 2,2-1,0 (m, 39H), 1,0-0,8 (m, 12H), 0,70 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 2945, 1596, 1466, 1383; MS masa exacta (+FAB) calculado: 573,5835; Encontrado: 573,5801; Anal. Calculado para C_{37}H_{72}N_{4}-HCl-H_{2}O: C = 58,87, H = 10,68, N = 7,42; Encontrado: C = 58,49, H = 10,94, N = 7,94.

El compuesto 353 es un simple aducto de espermina y colestanol, lo que representa un compuesto muy poco caro. Se puede sintetizar como el compuesto 354 de la siguiente manera directa:

18

Ejemplo J Preparación de los compuestos 381 y 382

19

El esteroide metil 7\alpha-hidroxi-3-oxo-5\alpha-colanoato fue preparado según el método de Iida y col., Chem. Pharm. Bull. 41 (4), 1993, 763-765. Este esteroide fue acoplado al compuesto de poliamina 301 con cianoborohidruro de sodio, los grupos BOC fueron eliminados con ácido trifluoroacético, y el éster fue hidrolizado como en la preparación del compuesto 319, excepto que se usó hidróxido de litio como base. La purificación se llevó a cabo sobre gel de sílice (de 15:4:1 a 10:4:1 cloroformo: metanol: isopropilamina). Los compuestos 381 y 382 fueron tratados con amoníaco 2 M en metanol y fueron evaporados (3 x 20 ml) para eliminar la isopropilamina. La sal de hidrocloruro fue preparada como con el compuesto 303.

Compuesto 381, C_{31}H_{57}N_{3}O_{3} - 1,7 H_{2}O: RMN de ^{1}H (200 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,80 (br s, 1H), 3,0-2,5 (m, 9H), 2,2-1,1 (m, 32H), 0,94 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,84 (s, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3380, 2929, 1560, 1395; MS (+FAB) calculado: 520,4478 (M+1); Encontrado: 520,4506; Anal. calculado: C = 67,64, H = 11,06, N = 7,63; Encontrado: C = 67,64, H = 10,24, N = 7,83.

Compuesto 382, C_{31}H_{57}N_{3}O_{3} - 2 H_{2}O: RMN de ^{1}H (200 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,80 (br s, 1H), 3,15 (br s, 1H), 3,1-2,6 (m, 8H), 2,2-1,1 (m, 32H), 0,96 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,85 (s, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3416, 2930, 1560, 1395; MS (+FAB) calculado: 520,4478 (M+1); Encontrado: 520,4489; Anal. calculado: C = 66,99, H = 11,06, N = 7,56; Encontrado: C = 66,93, H = 10,16, N = 7,28.

Ejemplo K Preparación del compuesto 396

20

Se acopló metil 7\alpha-hidroxi-3-oxo-5\alpha-colanoato a espermina (2 equivalentes) con cianoborohidruro de sodio, y
el éster fue hidrolizado como en la preparación del compuesto 319, excepto que se usó hidróxido de litio como base.
La purificación de los compuestos se llevó a cabo sobre gel de sílice (de 15:5:1 a 5:5:1 cloroformo:metanol:
isopropilamina). La sal de hidrocloruro del compuesto 396 fue preparada de la misma manera que para el compuesto 303.

Compuesto 396, C_{35}H_{66}N_{4}O_{3} - 4 HCl - 0,5 H_{2}O: MS (+FAB): 592 (M+1); Anal. Calcd.: C = 56,37, H = 9,60, N = 7,51; Encontrado: C = 56,43, H = 9,83, N = 7,27.

Ejemplo M Preparación del compuesto 371

21

Preparación del compuesto 1010

22

Se añadió una disolución del compuesto 1006 (5,96 g, 13,3 mmol) en diclorometano (70 ml) a una suspensión de clorocromato de piridinio (6,85 g, 31,8 mmol) en diclorometano (130 ml). Después de agitar durante 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con éter (100 ml), se filtró, y se lavó con éter. La capa orgánica fue lavada con una disolución de hidróxido sódico al 5%, con una disolución de ácido clorhídrico al 5%, con bicarbonato sódico saturado y con salmuera. La capa etérea secada fue evaporada y purificada mediante cromatografía flash (6 cm, gradiente de elución con acetato de etilo al 0-20% en hexano) para dar lugar al compuesto 1010 puro (5,25 g, 77% de rendimiento). RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 4,92 (m, 1H), 2,5-1,0 (m, 29H), 2,06 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,87 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,67 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 2949, 1736, 1468, 1372, 1244, 1023; MS(ES+): 467,8 (M+Na).

Preparación del compuesto 371: el esteroide 1010 fue acoplado a la poliamina 301 con cianoborohidruro de sodio, los grupos BOC fueron eliminados con ácido trifluoroacético, y el acetato fue hidrolizado como en la preparación del compuesto 319, excepto que se usó hidróxido de litio como base. La purificación se llevó a cabo sobre gel de sílice (2:6:1 benceno:metanol:isopropilamina). El compuesto 371 (RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,77 (m, 1H), 2,8-2,5 (m, 9H), 2,1-1,0 (m, 35H), 0,93 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,88 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,83 (s, 3H), 0,69 (s, 3H) fue transformado en sus sales de hidrocloruro como en la preparación del compuesto 303. Compuesto 371: IR (KBr, cm^{-1}): 3414, 2953, 1596, 1468, 1381, 1033; MS(+FAB): 532,4 (M+1); Anal. calcd. para C_{34}H_{65}N_{3}O - 3 HCl - 2 H_{2}O: C = 60,29, H = 10,71, N = 6,20; Encontrado: C = 60,49, H = 11,00, N = 6,47.

Ejemplo O Preparación de los compuestos 432 y 467

23

Preparación de los precursores

24

Preparación del compuesto 1016: el metil éster del ácido hiodeoxicólico fue preparado mediante una esterificación catalizada por un ácido de ácido hiodeoxicólico en metanol. Se añadió gota a gota ácido hiodeoxicólico (10 g, 25,5 mmol) y ácido sulfúrico concentrado a un matraz de fondo redondo de 500 ml agitado magnéticamente que contenía metanol absoluto (200 ml). La reacción se dejó con agitación toda la noche y a continuación fue tratada con diclorometano (250 ml), seguido de un lavado con una disolución de bicarbonato sódico (2 x 100 ml) y con salmuera (100 ml). A continuación la capa orgánica fue secada sobre sulfato sódico anhidro, fue filtrada, y secada a vacío para dar lugar al compuesto 1016 (10,1 g, 97% de rendimiento) (véase Organic Preparations and Procedures Int. 19 (2-3), 1987, 197-208).

Preparación del compuesto 1017: El 3,6-dioxo esterol fue preparado por oxidación del ácido metilhiodeoxicólico con clorocromato de piridinio. El compuesto 1016 (10,1 g, 25 mmol) fue disuelto en diclorometano (200 ml). Se añadió clorocromato de piridinio (33 g, 150 mmol) a un matraz agitado magnéticamente en un baño de hielo. Se dejó que la reacción se calentara hasta temperatura ambiente y que evolucionara durante 8 horas, hasta que el producto era la única mancha de TLC visible. La mayor parte de diclorometano se eliminó a vacío, y a continuación se añadió acetato de etilo (250 ml) al matraz. Se rompió la costra de cromo del fondo del matraz con una espátula, y los contenidos del matraz fueron filtrados a través de una columna Celite. A continuación, el elutante de la columna fue reducido en volumen a vacío y filtrado a través de una columna florisil (elución con acetato de etilo). De nuevo, el elutante fue reducido en volumen hasta aproximadamente 200 ml, y se añadió dietil éter (100 ml), seguido de un lavado con una disolución de bicarbonato sódico (2 x 250 ml) y a continuación con salmuera (250 ml). La capa orgánica fue secada sobre sulfato sódico anhidro, fue filtrada, y secada a vacío. El rendimiento total de metil 3,6-dioxo- 5\beta-colan-24-oato 1017 sin recristalización fue de 9,6 g (24 mmol, 96%) (véase Organic Preparations and Procedures Int. 19 (2-3), 1987, 197-208). El producto puede ser recristalizado a partir de un número de disolventes (metanol absoluto, acetato de etilo en hexanos, o dietil éter en hexanos) si queda algo de cromo.

Preparación del compuesto 1018: el 3,6-dioxo-5\alpha esterol fue preparado mediante isomerización catalizada por un ácido del 5\beta esterol. Se añadió el 3,6- dioxo-5\beta-esterol 1017 (9,6 g, 24 mmol) y tetrahidrofurano (25 ml) a metanol (250 ml) para disolver el esterol por completo. Se añadió ácido clorhídrico concentrado (12,5 ml), y se dejó evolucionar la reacción a lo largo de la noche. A continuación se eliminó el disolvente a vacío para dar lugar a 9,6 g (100% de rendimiento) de metil 3,6-dioxo-5\alpha- colan-24-oato 1018 (véase Organic Preparations and Procedures Int. 19 (2-3), 1987, 197- 208; los autores usaron una isomerización catalizada por una base usando metóxido sódico en lugar de HCl).

Preparación del compuesto 1019: la mono-protección del metil 3,6-dioxo- 5\alpha-colan-24-oato 1018 puede ser llevada a cabo usando una variedad de técnicas. Una técnica implica poner a reflujo el compuesto 1018 (9,6 g, 23,8 mmol) en tolueno (250 ml) con etilenglicol (1,77 g, 28,5 mmol) en presencia de ácido p-toluensulfónico catalítico. Se usó una trampa Dean Stark para eliminar el azeótropo tolueno/agua. Se juzgó que la reacción se había completado mediante TLC después de aproximadamente 20 minutos. La reacción fue terminada vertiendo el tolueno sobre una disolución de bicarbonato sódico (500 ml) y hielo. La capa orgánica fue lavada con bicarbonato sódico adicional (200 ml) y con salmuera (200 ml), fue secada sobre sulfato sódico anhidro, filtrada, y secada a vacío. El producto bruto fue sometido a cromatografía sobre gel de sílice (4 cm x 25 cm, elución con acetato de etilo en hexanos al 33%). La segunda banda en salir de la columna fue el metil 3-dioxolan-6-oxo-5\alpha-colan-24-oato 1019 (8,9 g, 81%); el único otro producto presente fue el menos polar di-dioxolano. Técnicas posteriores dieron mejores resultados sustituyendo benceno por tolueno y siguiendo la reacción por TLC, lo que aparentemente permite una mayor selectividad. La reacción puede ser detenida antes de que se produzca una diprotección significativa en el disolvente de menor punto de ebullición. Compuesto 1019: p. f. 124-126ºC; RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 4,04-3,93 (m, 4H), 3,68 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,78 (s, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 2945, 1742, 1709, 1439, 1381, 1313, 1162, 1090; MS(FD): 446 (M^{+}), 388.

Preparación del compuesto 1020: el 6\beta-hidroxi esterol fue preparado con un buen rendimiento a partir de la dicetona mono-protegida por reducción con borohidruro de sodio. El 3-dioxolan-6-oxo esterol 1019 (5 g, 11 mmol) fue disuelto en tetrahidrofurano (10 ml) y se añadió a metanol absoluto (200 ml) y a borohidruro de sodio (2,5 g, 66 mmol). El borohidruro de sodio se disolvió y se agitó durante aproximadamente 20-30 minutos antes de añadir el esterol. Después de agitar toda la noche, la mezcla de reacción fue tratada con cloroformo (500 ml), y fue lavada con agua destilada (2 x 200 ml) y a continuación con salmuera (100 ml). A continuación la capa orgánica fue secada sobre sulfato sódico, fue filtrada, concentrada a vacío, y purificada mediante cromatografía flash sobre gel de sílice (4 cm x 25 cm, elución con 2:1:1 hexanos:acetato de etilo:cloruro de metileno) para dar lugar a metil 3-dioxolan-6\beta- hidroxi-5\alpha-colan-24-oato 1020 (4,35 g, 87% de rendimiento). Alternativamente, el producto bruto puede ser recristalizado a partir de benceno en hexanos, de acetato de etilo en hexanos, o de cloroformo en hexanos (2x) para dar lugar a un producto de elevada pureza sin necesidad de cromatografía en columna. Compuesto 1020: p.f. 164ºC; RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 4,04-3,93 (m, 4H), 3,77 (br s, 1H), 3,66 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 0,92 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3533, 2937, 1726, 1438, 1379, 1255, 1191, 1096; la difracción de rayos X reveló la estructura esperada.

Preparación del compuesto 1021: el 3-dioxolano fue desprotegido usando una disolución ácida de acetona. El
3-dioxolan-6\beta-hidroxi-esterol 1020 (4,0 g, 8,9 mmol) fue disuelto en acetona (200 ml) y fue tratado con una disolución de ácido clorhídrico concentrado (10 ml). Después de aproximadamente 1 hora, la mezcla de reacción fue vertida en una disolución de bicarbonato sódico. La disolución fue extraída con diclorometano (3 x 200 ml), fue lavada con agua destilada (100 ml) y a continuación con salmuera (100 ml), fue secada sobre sulfato sódico anhidro, filtrada, y evaporada a vacío para dar lugar a metil 3-oxo-6\beta-hidroxi-5\alpha-colan-24-oato 1021 (3,45 g, 100% de rendimiento): RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,8 (br m, 1H), 3,69 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,74 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3447, 2954, 1742, 1707, 1431.

Preparación del compuesto 432: el compuesto de etilen-diamina fue preparado como sigue. Una disolución agitada magnéticamente de metanol:tetrahidrofurano 50:50 (100 ml) y de etilendiamina (2 ml) fue tratada con ácido acético para disminuir el pH hasta aproximadamente 6. El 3-oxo esterol 1021 (1,5 g, 3,7 mmol) fue añadido, y la mezcla fue agitada durante 15 minutos. Se disolvió cianoborohidruro de sodio (1g, 16 mmol) en 10 ml de metanol y se añadió al recipiente de reacción, y el pH se ajustó de nuevo a 6 mediante la adición de ácido acético. Se agitó la reacción durante 1 hora, y el contenido del matraz fue vertido en una mezcla de hielo y tampón de carbonato de pH 10,5 (250 ml). Se extrajo la disolución con cloroformo (5 x 150 ml). Las capas orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato sódico anhidro, filtradas, secadas a vacío, y purificadas mediante cromatografía flash sobre gel de sílice (4 cm x 25 cm, elución con 8:2:1 cloroformo:metanol:isopropilamina) para proporcionar el isómero \beta 432 (840 mg, 49% de rendimiento). Compuesto 432: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,75 (m, 1H), 3,64 (s, 3H), 1,02 (s, 3H), 0,94 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3560, 3366, 3257, 2936, 1726, 1648, 1605, 1438, 1376, 1166, 1047; MS(+FAB): 449,5 (M+1); Anal. calcd. para C_{27}H_{48}N_{2}O_{3} - 0,4 H_{2}O: C = 71,13, H = 10,79, N = 6,14; Encontrado: C = 71,15, H = 10,71, N = 6,28.

Preparación del compuesto 467: una cantidad de aminosterol metil éster (1 mmol) como base libre fue pesada en un matraz de fondo redondo de 25 ml. El aminosterol fue disuelto en una cantidad mínima de tetrahidrofurano (2 ml), fue tratado con una disolución de hidróxido potásico 1 N (10 ml), y fue agitado magnéticamente durante 1 hora. A continuación, la disolución fue neutralizada con HCl 1 N, y el disolvente fue eliminado a vacío. El residuo fue redisuelto en una cantidad mínima de agua desionizada y se llevó a una columna de gel de sílice funcionalizada con grupos octadecilo (Aldrich, 2 x 10 cm, gradiente de elución de acetonitrilo en ácido trifluoracético al 2% en agua). Se reunieron las fracciones que contenían el aminosterol, y se eliminó el disolvente a vacío. El aminosterol fue redisuelto en HCl 0,1 N, y el disolvente fue eliminado a vacío (2x) para asegurar la eliminación del trifluoroacetato. Se añadió benceno a las sales de hidrocloruro resultantes, seguido de una evaporación a lo largo de toda la noche para eliminar tanta agua como fuera posible.

El isómero \beta-amino de espermina 467: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,80 (m, 1H), 1,05 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3406, 2944, 1718, 1637, 1458; MS(+FAB): 577,4 (M+1); Anal. calcd. para C_{34}H_{64}N_{4}O_{3} - 4 HCl - 4 H_{2}O: C = 51,38, H = 9,64, N = 7,05; Encontrado: C = 51,40, H = 8,77, N = 7,01.

Ejemplo P Preparación metil ésteres de ácido de bilis 409, 410, 411, 414, 415, 412, 413 y 449

25

26

27

28

29

30

31

32

Preparación de los precursores: los metil ésteres de ácido chenodeoxicólico y de ácido deoxicólico, que estructuralmente se muestran a continuación, fueron preparados por el mismo procedimiento usado para esterificar el ácido hiodeoxicólico para dar el compuesto 1016.

33

Oxidaciones con carbonato de plata de ésteres de ácido de bilis para preparar 3-ceto esteroides: los derivados tanto del ácido chenodeoxicólico como del ácido deoxicólico fueron preparados mediante aminaciones reductoras de los 3-oxo esteroles con las aminas adecuadas. Los 3-oxo esteroles fueron preparados mediante procedimientos similares. El carbonato de plata sobre Celite fue preparado disolviendo 4 equivalentes de nitrato de plata en agua desionizada y añadiendo suficiente Celite para dar como resultado carbonato de plata al 50% sobre Celite. Se añadieron 2,2 equivalentes de carbonato sódico disuelto en agua desionizada a la disolución agitada magnéticamente, con una continua y fuerte agitación. El carbonato de plata resultante precipitado sobre Celite fue filtrado a través de un embudo de fibra de vidrio, lavado con tetrahidrofurano, y se dejó secar en un desecador a vacío. El metil éster de ácido de bilis a oxidar fue disuelto en tolueno, fue tratado con 2 equivalentes de carbonato de plata sobre Celite, y calentado a reflujo usando un aparato Dean Stark para la eliminación azeotrópica del agua. La oxidación se completó en menos de 6 horas para ambos esteroles. Se filtró la disolución y se eliminó el disolvente a vacío. En ambos casos el producto se recristalizó con facilidad a partir de acetato de etilo en hexanos para dar el 3-oxo esterol con un excelente rendimiento (>89% en ambos casos).

Preparación de los compuestos 409 y 410: el 3-oxo esterol metil éster de ácido chenodeoxicólico (1,5 g, 3,7 mmol) fue disuelto en metanol, al que se añadió un exceso de 10 a 1 de etilendiamina (2,5 ml). Se disminuyó el pH con ácido acético hasta aproximadamente 6, se añadió NaBH_{3}CN (1 g, 15,9 mmol) disuelto en metanol, y se ajustó de nuevo el pH con ácido acético. Se agitó la disolución durante 1 hora, y a continuación se sacó y se purificó del mismo modo que el compuesto 431. El rendimiento total a aminosterol fue 58%, con una relación aproximada entre el \alpha-amino isómero y el menos polar \beta-amino isómero de 7:3. \beta-Amino isómero 409: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,81 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,42 (m, 1H), 1,04 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,72 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3428, 2940, 2055, 1740, 1591, 1440, 1377, 1169, 1077, 984; MS(+FAB): 449,3 (M+1); Anal. calcd. para C_{27}H_{48}N_{2}O_{3} - 2 HCl - 1,2 H_{2}O: C = 59,70, H = 9,72, N = 5,16; Encontrado: C = 59,59, H = 9,49, N = 5,15. \alpha-Amino isómero 410: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,82 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,05 (br m, 1H), 1,00 (s, 3H), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,72 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3522, 2944, 2017, 1718, 1619, 1448, 1377, 1314, 1282, 1260, 1163, 1018; MS(+FAB): 449,3 (M+1); Anal. calcd. para C_{27}H_{48}N_{2}O_{3} - 2 HCl - 3,7 H_{2}O: C = 55,13, H = 9,84, N = 4,76; Encontrado: C = 55,03, H = 9,32, N = 4,78.

Preparación del compuesto 411: este compuesto de espermina fue preparado mediante el mismo procedimiento que los compuestos de etilendiamina, excepto por la siguiente modificación. Se usó un gramo del 3-oxo esterol metil éster de ácido chenodeoxicólico y 1 g de espermina (aproximadamente 2 equivalentes), y la cromatografía requirió un sistema de disolventes más polar (es decir, 5:4:1 CHCl_{3}:metanol:isopropilamina). El rendimiento total de aminosterol fue 48%. La relación entre el \alpha-amino isómero y el \beta-amino isómero 411 no fue determinada debido a una separación incompleta. Compuesto 411: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,83 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,42 (m, 1H), 1,04 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,70 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3404, 2946, 2059, 1739, 1595, 1458, 1378, 1168, 1073, 1012, 985, 759; MS(+FAB): 591,4 (M+1); Anal. calcd. para C_{36}H_{66}N_{4}O_{3} - 4 HCl - 4 H_{2}O: C = 51,97, H = 9,72, N = 6,93; Encontrado: C = 51,65, H = 8,53, N = 6,77.

Preparación de los compuestos 414 y 415: Los ácidos libres fueron preparados a partir de los metil ésteres como en la preparación del 6\beta-hidroxi 433. \alpha-Amino isómero 414: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,83 (m, 1H), 3,06 (br m, 1H), 1,04 (s, 3H), 0,96 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 2940, 2053, 1709, 1452, 1378, 1167, 1076, 1007, 975; MS(+FAB): 435,5 (M+1); Anal. calcd. para C_{26}H_{46}N_{2}O_{3} - 2 HCl - 1,5 H_{2}O: C = 58,41, H = 9,62, N = 5,24; Encontrado: C = 58,24, H = 9,40, N = 5,47. \beta- Amino isómero 415: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,83 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 1,06 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3488, 2935, 2054, 1709, 1593, 1499, 1450, 1246, 1168, 1077, 1022, 984; MS(+FAB): 435,5 (M+1); Anal. calcd. para C_{26}H_{46}N_{2}O_{3} - 2 HCl - 1,5 H_{2}O: C = 58,41, H = 9,62, N = 5,24; Encontrado: C = 58,59, H = 9,35, N = 5,43.

Preparación de los compuestos 412, 413 y 449: estos compuestos fueron producidos usando procedimientos análogos a los anteriormente descritos.

\alpha-Amino 412: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,83 (m, 1H), 3,00 (br m, 1H), 1,04 (s, 3H), 0,96 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,74 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3413, 2942, 2061, 1710, 1594, 1460, 1377, 1167, 1074; MS(+FAB): 577,7 (M+1); Anal. calcd. para C_{34}H_{64}N_{4}O_{3} - 4 HCl - 2,5 H_{2}O: C = 53,19, H = 9,58, N = 7,30; Encontrado: C = 53,27, H = 9,47, N = 7,32.

\beta-Amino 413: RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 3,8 (m, 1H), 3,4 (m, 1H), 1,05 (s, 3H), 0,96 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); MS(+FAB): 577,7 (M+1).

Espermina de ácido deoxicólico 449 (\alpha-amino isómero): RMN de ^{1}H (400 MHz, CD_{3}OD) \delta: 4,02 (m, 1H), 1,04 (d, J = 6 Hz, 3H), 1,00 (s, 3H), 0,75 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 2941, 1716, 1448, 1038; MS(+FAB): 577,4 (M+1); Anal. calcd. para C_{34}H_{64}N_{4}O_{3} - 4 HCl - 1,5 H_{2}O: C = 54,57, H = 9,54, N = 7,47; Encontrado: C = 54,31, H = 8,71, N = 7,80.

Ejemplo O Preparación del compuesto de monoamina 1364

34

340

Preparación del compuesto 1002: a una suspensión de trióxido de cromo (72,6 g, 660 mmol) en diclorometano (1000 ml) a -78ºC, se añadió 3,5-dimetilpirazol (63,4 g, 660 mmol). Después de 20 minutos, se añadió acetato de colesterilo (compuesto 1001, 24 g, 56 mmol), y se dejó calentar lentamente la mezcla hasta temperatura ambiente y se dejó agitar a lo largo de la noche. Se añadió a la mezcla de reacción (0ºC) una disolución de hidróxido sódico 5 N (280 ml), y se agitó la mezcla durante 1 hora. La fase orgánica fue lavada con HCl 2 N, agua y salmuera. Después de eliminar el disolvente, el producto crudo fue purificado mediante cromatografía (6 cm, gradiente de elución con acetato de etilo en hexano de 10% hasta 30%) para proporcionar el material de partida (6,78 g) y el compuesto 1002 (12,78 g, 52%). RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 5,71 (s, 1H), 4,7 (br m, 1H), 2,5-1,0 (m, 27H), 2,05 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 0,92 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 7 Hz, 6H), 0,68 (s, 3H).

Preparación del compuesto 1003: se purgó con nitrógeno una disolución del compuesto 1002 (14,32 g, 32,3 mmol) en acetato de etilo (1,4 l), fue tratada con óxido de platino (IV) (263 mg), y con gas hidrógeno (atmosférico) durante 3 horas a temperatura ambiente. Después de filtrar a través de Celite, la disolución fue evaporada y purificada por cromatografía flash (6 cm, gradiente de elución con acetato de etilo en hexano de 0% hasta 20%) para dar lugar al compuesto 1003 puro (10,86 g, 76% de rendimiento). RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 4,67 (br m, 1H), 2,4-1,0 (m, 29H), 2,02 (s, 3H), 1,10 (s, 3H), 0,90 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 7 Hz, 6H), 0,65 (s, 3H); IR (KBr, cm^{- 1}): 2950, 1730, 1707, 1471, 1373, 1264, 1032; MS(+ES): 445,7 (M+1).

Preparación de los compuestos 1004 y 1005: a una disolución del compuesto 1003 (11,62 g, 26,1 mmol) en tetrahidrofurano (THF) (500 ml) se añadió a K- Selectride(r) 1 M (80 ml, 80 mmol) en THF a temperatura ambiente. Después de 5 horas a 50ºC, la mezcla de reacción fue enfriada en un baño de hielo, y a continuación fue tratada con peróxido de hidrógeno al 30% (45 ml) y con una disolución saturada de cloruro amónico (200 ml). Se separó la fase orgánica y la fase acuosa fue extraída con éter (3 x 100 ml), y las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con bicarbonato sódico saturado, con cloruro amónico y con agua. Después del secado, el producto crudo fue purificado mediante cromatografía (6 cm, gradiente de elución con acetato de etilo en hexano de 0% hasta 30%) para proporcionar el compuesto 1004 (10,95 g, 24,5 mmol), que fue disuelto en diclorometano (200 ml) con dimetilaminopiridina (30,30 g, 248 mmol) y tratado con anhídrido acético (40 ml, 424 mmol) durante 19 horas. A esta disolución se añadió metanol (150 ml), y el disolvente fue evaporado. El residuo se disolvió en acetato de etilo, se lavó con una disolución de ácido clorhídrico 2 N (3 x 150 ml), con agua (100 ml), con una disolución saturada de carbonato sódico (3 x 100 ml) y con salmuera (2 x 100 ml). La capa orgánica fue secada, evaporada, y purificada por cromatografía flash (6 cm, gradiente de elución con acetato de etilo en hexano de 0% hasta 20%) para dar lugar al compuesto 1005 (11,47 g, 90% de rendimiento). RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 4,88 (m, 1H), 4,71 (br m, 1H), 2,08 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,0-1,0 (m, 29H), 0,92-0,83 (m, 12H), 0,64 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 2954, 2867, 1730, 1468, 1367, 1257, 1025; Anal. calcd. para C_{31}H_{52}O_{4}: C = 76,18, H = 10,72; Encontrado: C = 76,09. H = 10,56.

Preparación del compuesto 1006: una disolución del compuesto 1005 (10,85 g, 22,2 mmol) y de cianuro sódico (1,20 g, 24,4 mmol) en metanol (420 ml) fue agitada toda la noche a temperatura ambiente, y a continuación se llevó a reflujo durante 10 horas. Se evaporó el disolvente, y el residuo fue disuelto en un mezcla de diclorometano y agua, que fue acidificada con una disolución de ácido clorhídrico 2 N. Después de otra extracción con diclorometano, la capa orgánica fue lavada con salmuera, secada sobre sulfato magnésico, y evaporada para proporcionar el compuesto 1006 (9,22 g, 92% de rendimiento). RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 4,89 (m, 1H), 3,62 (br m, 1H), 2,07 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,0-1,0 (m, 29H), 0,90 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,87 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,82 (s, 3H), 0,64 (s, 3H); IR (KBr, cm^{-1}): 3446, 2935, 1735, 1469, 1375, 1245, 1042, 941; MS(+ES): 470 (M+Na).

Preparación de los compuestos 1007, 1008 y 1009: a una disolución del compuesto 1006 (892 mg, 2,0 mmol) en diclorometano anhidro (20 ml) en atmósfera de nitrógeno (de -10ºC a -5ºC) se añadió trietilamina (3 ml, 22 mmol) y cloruro de metilsulfonilo (0,40 ml, 5,2 mmol) en diclorometano (4 ml). Después de 40 minutos, la mezcla fue vertida en una disolución de ácido clorhídrico 1 N (100 ml), y la fase orgánica fue separada. Después de extraer con más diclorometano (3 x 20 ml), la fase orgánica fue lavada con una disolución de ácido clorhídrico 1 N (30 ml) y con salmuera (2 x 30 ml). Después de secar sobre sulfato sódico, el disolvente fue evaporado para dar lugar al compuesto 1007, que fue usado en la siguiente etapa sin purificar.

Se disolvió el compuesto 1007 crudo en dimetilformamida (50 ml) tratada con azide de sodio (2,0 g, 31 mmol), y fue calentado hasta 100ºC durante 18 horas. Después de enfriar, la mezcla de reacción fue diluida con agua (250 ml), extraída con diclorometano (3 x 150 ml), lavada con agua (3 x 100 ml), secada (Na_{2}SO_{4}), filtrada, y evaporada para dar lugar al compuesto 1008, que fue usado en la siguiente etapa sin purificar.

Una disolución del compuesto 1008 en tetrahidrofurano anhidro (60 ml) fue tratada con hidruro de aluminio y litio 1 M (20 ml, 20 mmol) y calentada a reflujo durante 5 horas. Después de enfriar con un baño de hielo, se añadió a la mezcla agua (50 ml) y a continuación una disolución de hidróxido sódico 2 M (200 ml). La fase acuosa fue extraída con diclorometano (3 x 150 ml), seguido de un lavado con salmuera (2 x 100 ml) y con agua (50 ml). La capa orgánica seca fue evaporada para proporcionar el compuesto 1009, que fue usado sin purificar en la siguiente etapa.

Preparación del compuesto 1364: el compuesto 1009 crudo fue disuelto en metanol (40 ml) y fue tratado con una disolución de hidróxido sódico 2 N (40 ml) a 80ºC durante 12 horas. Después de evaporar, se añadió agua (40 ml), seguida de una extracción con diclorometano (3 x 60 ml). Después de un lavado con salmuera (3 x 50 ml), la capa orgánica fue secada (Na_{2}SO_{4}), filtrada y evaporada. La purificación mediante cromatografía flash (2 cm de diámetro, elución con diclorometano:metanol:hidróxido amónico 95:4,5:0,5) proporcionó el compuesto 1364 que eluye más rápido; RMN de ^{1}H (200 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,4 (br m, 1H), 3,2 (m, 1H), 2,0-1,0 (m, 29H), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,80 (s, 3H), 0,68 (s, 3H)). Este compuesto fue disuelto en metanol, fue tratado con un exceso de cloruro de hidrógeno 1 N en éter, y fue evaporado para dar lugar a la sal de hidrocloruro. Compuesto 1364 (50 mg, 6% de rendimiento total en las cuatro etapas): MS(+FAB): 404,4 (M+1); Anal. calcd. para C_{27}H_{49}NO - HCl - H_{2}O: C = 70,78, H = 11,44, N = 3,06; Encontrado: C = 71,02. H = 11,33, N = 3,35.

Preparación de la escualamina (compuesto 1256)

Se disolvió el compuesto 2016 (0,0176 g, 0,032 mmol) en una disolución de ácido clorhídrico concentrado en MeOH (1 ml de ácido clorhídrico concentrado en 10 ml de MeOH). La disolución fue agitada durante 15 minutos y el disolvente fue eliminado a vacío. Se añadió un complejo SO_{3} - piridina (0,010 g, 0,064 mmol) al compuesto crudo seco.

Preparación de N-(3'-aminipropil)-N,N'-(di-terc-butoxicarbonil)-1,4- diaminobutano 301

(a) A una disolución de 1,4-diaminobutano (8,6 g, 97,6 mmol) en metanol (3,0 ml) se añadió una disolución de acrilonitrilo (6,2 g, 116,8 mmol) en metanol (3,0 ml) a 0ºC, y la mezcla fue agitada durante 12 horas. La evaporación del disolvente a vacío proporcionó N-(2'-cianoetil)-1,4-diaminobutano en la forma de una aceite incoloro (11,0 g, 80%). RMN de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,45 (4H, br, - CH_{2}CH_{2}-), 2,46 (2H, t), 2,58 (2H, t), 2,62 (2H, t) y 2,84 (2H, t).

(b) A una disolución de N-(2'-cianoetil)-1,4-diaminobutano (5,6 g, 40 mmol) en diclorometano (140 ml) se añadió gota a gota una disolución de di-t- butildicarbonato (19,2 g, 88 mmol) en diclorometano (20 ml) a temperatura ambiente, y la mezcla fue agitada durante 12 horas. El disolvente orgánico fue eliminado al vacío y el aceite residuo fue disuelto en acetato de etilo (150 ml), y fue lavado con NaHCO_{3} saturado (2 x 75 ml), con agua (2 x 75 ml), y con salmuera (75 ml), fue secado (MgSO_{4}), filtrado y evaporado para conseguir el aceite viscoso crudo. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía flash en gel de sílice para dar N-(2'-cianoetil)-N,N'-(di-t- butoxicarbonil)-1,4-diaminobutano puro en la forma de un aceite viscoso incoloro (8,4 g, 75%). RMN de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,44 (9H, s, t-Boc), 1,46 (9H, s combinado, t-Boc), 2,60 (2H, m), 3,15 (2H, m), 3,28 (2H, t) y 3,45 (2H, t); CIMS (m/e): 342 (M+1, 62,7%), 239 (100%), 186 (83,1%).

(c) A una suspensión de hidruro de litio y aluminio (1,8 g, 48,9 mmol) en éter seco (300 ml) se añadió una disolución N-(2'-cianoetil)-N,N'-(di-t-butoxicarbonil)- 1,4-diaminobutano (4,8 g, 13,8 mmol) en éter seco (150 ml) gota a gota a 0ºC, y la mezcla fue agitada durante 30 minutos. El exceso de hidruro de litio y aluminio fue apagado con NaOH 1 N a 0ºC y la suspensión blanca resultante fue filtrada a través de Celite y lavada con éter, y el extracto de éter fue lavado con salmuera, secado (MgSO_{4}), filtrado y evaporado al vacío para conseguir un aceite crudo. El producto crudo fue purificado mediante cromatografía flash en gel de sílice para dar N-(3'-aminopropil)-N,N'- (di-t-butoxicarbonil)-1,4-diaminobutano 301 puro (3,3 g, 68%) en la forma de un aceite incoloro. RMN de ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,44 (18H, s, 2(t- Boc)), 2,68 (2H, t), 3,05-3,25 (6H, br) y 4,65 (1H, br); CIMS (m/e): 346 (M^{+}+1, 100%), 290 (3,1%), 246 (32,2%).

Ejemplo T Preparación del compuesto 1436

Este compuesto puede ser fácilmente preparado a partir de escualamina mediante acoplamiento de aldehído de
\beta-alanina, seguido de una reducción, como se muestra en el siguiente esquema:

35

El enfoque anterior permite la conversión rápida de la escualamina, presente en grandes cantidades en el hígado de tiburón, en el compuesto 1436, presente en un 5% de la cantidad de la escualamina.

Se pueden preparar compuestos aminosterol adicionales tales como los mostrados en las Tablas I y II de formas análogas a aquellas presentadas anteriormente.

Actividades terapéuticas y utilidades

Se ha descubierto que compuestos aminosterol tales como la escualamina son inhibidores de NHE eficaces. Investigando para elucidar el mecanismo de acción antimicrobiana de la escualamina, se ha descubierto que la escualamina inhibe de forma ventajosa una isoforma de NHE específica (el compuesto inhibe NHE3, pero no NHE1). Además, se ha determinado que la escualamina inhibe al intercambiador a través de un mecanismo especial. Los efectos especiales y ventajosos y las utilidades de la escualamina y de otros aminosteroles son aún más evidentes en vista de los resultados de los ensayos experimentales discutidos a continuación.

Inhibición específica de NHE3

Para determinar la especificidad de la inhibición de NHEs por escualamina, se probó la escualamina contra una línea de células que expresan tanto NHE1 humano como NHE3 humano siguiendo los procedimientos esbozados en Tse y col., J. Biol.. Chem. 268, 1993, 11917-11924. Se midió el pH interno tanto después de la carga de ácido como en ausencia de un intercambio de carga de ácido, con los resultados mostrados en las Figuras 1A y 1B.

Específicamente, fibroblastos PS120 transfectados con NHE3 de conejo fueron cultivados en un medio Eagle's modificado con Dulbecco's complementado como se ha descrito en Levine y col., J. Biol. Chem. 268, 1993, 25527-25535. A continuación fueron ensayadas células transfectadas cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio para estudiar los cambios de pH interno que siguen a un tratamiento con 5 \mug/ml de escualamina usando el colorante fluorescente BCECF-AM (2',7'-bis(carboxietil)- 5(6)-carboxifluoresceín-acetoximetil éster) como un indicador de pH como se ha descrito en Levine y col. Para las células precargadas con ácido por exposición a 40 NH_{4}Cl mM, si siguió la evolución de la tasa de recuperación de pH en función de la concentración de ión sodio extracelular restaurado, mostrándose los resultados en la Figura 1A. Para las células no precargadas con ácido, se siguió la evolución del valor real del pH interno en función del tiempo transcurrido tras la adición de escualamina, con los resultados mostrados en la Figura 1B.

Como se observa en las Figuras 1A y 1B, la escualamina inhibió al NHE3 con respecto a la concentración de protones a nivel tanto de K_{m} como de V_{max}. Por el contrario, agentes existentes tales como el amiloride afectaron sólo al V_{max}.

Por tanto, el aminosterol escualamina no sólo reduce el número absoluto de protones que pueden ser secretados por la célula (el efecto sobre V_{max}), sino que también fuerza a la célula a caer a un pH más bajo en presencia de este inhibidor (el efecto sobre K_{m}). Como consecuencia, el intercambiador sodio/protón se desactiva más profundamente con la escualamina que con el amiloride.

Al contrario que con sus efectos sobre el NHE3 mostrados en las Figuras 1A y 1B, la escualamina no presentó actividad inhibidora contra el NHE1 humano o contra el NHE1 de conejo como se muestra en las Figuras 2A y 2B. Los fibroblastos PS120 transfectados con NHE1 de conejo o humano fueron cultivados como se ha descrito anteriormente. Las células transfectadas que expresan NHE1 de conejo (Figura 2A) o NHE1 humano (Figura 2B) cultivadas en cubreobjetos de vidrio fueron ensayadas a continuación para estudiar los cambios de pH que siguen al tratamiento con 5 \mug/ml de escualamina usando el colorante fluorescente BCECF-AM con células precargadas con ácido por exposición a NH_{4}Cl 40 mM. Se siguió la evolución de la tasa de recuperación del pH en función de la concentración de ión sodio extracelular restaurado.

Además, como se demuestra en la Figura 1B, el pH de descanso de estas células también fue inhibido. Por tanto, el efecto de la escualamina sobre el intercambio de protones causa que , en su presencia, la célula baje a un pH inferior antes de que se produzca la activación de la bomba.

Mediante estos estudios, se ha descubierto que la escualamina es un inhibidor distinto con especificidad para el NHE3 por encima del NHE1. Además, se ha identificado a la escualamina como un inhibidor que provoca una caída en el pH de una célula antes de que la bomba se active. Los resultados mostrados en las Figuras 1A, 1B, 2A y 2B demuestran que la escualamina exhibe una especificidad de NHE única.

La expresión de NHE3

Dicho efecto específico para el NHE3 es importante por varias razones. El NHE3, que está presente en las superficies apicales de un número limitado de tipos de célula, está más especializado que el NHE1. Una célula con un interés terapéutico particular es la célula endotelial.

Usando PCR, se ha demostrado ahora la expresión de este antiportador tanto en células endoteliales de arteria pulmonar humana como en células microvasculares humanas. Se aisló el ARN total a partir de células endoteliales primarias de arteria pulmonar humana (HPAEC, del inglés "Human pulmonary artery endothelial cells"), a partir de la línea de células wm1617 de melanoma humano, y a partir de células endoteliales microvasculares humanas (HMVEC, del inglés "Human microvascular endothelial cells") mediante una modificación del método de Chomczynski y col., Anal. Biochem. 162, 1987, 156, y a continuación fue transcrito a la inversa con transcriptasa inversa MMLV usando un kit de síntesis de primera cadena de cADN (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). ARN humano de intestino delgado proporcionado por Clontech también fue transcrito a la inversa del mismo modo.

A continuación, aproximadamente 80 ng del producto de cADN fueron amplificados en una mezcla de reacción de 50 \mul usando reactivos del kit AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, CT) y que contiene 400 ng de cada uno de los dos nucleótidos específicos para NHE3 humano (B13: 5'-CATCTGGACCTGGAACACG-3'; B14: 5'-CGTAGCTGATGGCATCCTTC-3') usando un ciclo térmico de 5', 94ºC, y a continuación 38 ciclos de 50^{n}, 94ºC, 1', 57ºC, 2', 71ºC, y finalmente 10', 72ºC antes de enfriar hasta 4ºC. Se analizaron 20 \mul de esta muestra en un gel de agarosa al 1,7%. La banda PCR esperada para el NHE3 de aproximadamente 550 bp fue detectada en muchos de los casos, como se indica en la Tabla 2 mostrada más adelante.

A continuación se analizó adicionalmente un \mul de cada reacción PCR mediante PCR anidado en una mezcla de reacción de 50 \mul usando dos imprimaciones internas (B15: 5'-CTGGTCTTCATCTCCGTGTAC-3'; B16: 5'-AGCTCGTGGAA-GACATTCAGG) con un programa de ciclo térmico 5', 94ºC, a continuación 35 ciclos de 50^{n}, 94ºC, 1', 58ºC, 2', 71ºC, y finalmente 10', 72ºC antes de enfriar hasta 4ºC. Aproximadamente 20 \mul de esta reacción fueron analizados en otro gel de agarosa al 1,7%. En todos los casos se observó la banda PCR esperada para el NHE3 de aproximadamente 490 bp como se muestra en la tabla mostrada más adelante. El secuenciamiento de ADN de las bandas de PCR anidado de ambos extremos de las HPAEC y de las HMVEC confirmó que tenían las secuencias de NHE3 humano esperadas.

TABLA 2 Expresión de NHE3 humano en líneas de células endoteliales humanas

	Detección Visible de NHE3 humano mediante PCR
Fuente de ARN total	Un PCR	Dos PCR anidados
Intestino delgado	-	+
Melanoma humano	+	+
HPAEC	+	+
HMVEC	+/- (bandas múltiples)	+

Por tanto, una variedad de eventos relacionados con el crecimiento/forma de células endoteliales son inhibidos por la escualamina y compuestos funcionalmente relacionados. Los ensayos experimentales discutidos a continuación fueron llevados a cabo para establecer los efectos de este aminosterol.

Inhibición del crecimiento de células endoteliales, fibroblastos y células epiteliales in vitro

Si se cultivan células humanas no transformadas en presencia de concentraciones crecientes de escualamina, las células endoteliales exhiben una sensibilidad particular hacia la escualamina, como demuestra el siguiente experimento. Células endoteliales pulmonares de bovino, la línea de células MCF 10A de células epiteliales humanas, y fibroblastos de prepucio humano fueron incubadas en presencia de 12 agentes membrano-activos diferentes, que incluyen péptidos y escualamina.

Específicamente, las células endoteliales pulmonares de bovino, la línea de células MCF 10A de células epiteliales humanas, y fibroblastos de prepucio humano fueron incubados en presencia de los siguientes doce agentes membrano-activos: (1) RGD[KIAGKIA]_{3}-NH_{2}; (2) d-[KKLLKKL]_{2}-NH_{2}; (3) escualamina; (4) SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR; (5) FLGGLIKIVPAMICAVTKKC; (6) Magainin 2; (7) PGLA; (8) GFASFLGKALKAALKIGANLLGGTPQQ; (9) PR-39; (10) l- [KKLLKKL]_{2}-NH_{2}; (11) Cecropin B; y (12) [KIAGKIA]_{3}-NH_{2}. El crecimiento de células fue medido por absorbancia a 600 nm. Los resultados se muestran en las Figuras 3A- 3C.

Como es evidente a partir de la Figura 3A, la escualamina inhibió el crecimiento de células endoteliales de arteria pulmonar bovina (BPE) con 1 \mug/ml. Por el contrario, a una concentración de 10 \mug/ml no ejerció ningún efecto en el crecimiento tanto de líneas epiteliales (Figura 3B) como de líneas de fibroblastos (Figura 3C). Sin embargo, los péptidos que inhibían el crecimiento de células epiteliales no presentaron ningún efecto sobre BPE. Por tanto, las células endoteliales son más sensibles a la escualamina de lo que lo son tanto los fibroblastos como las células epiteliales.

Inhibición de la formación de la cuerda de célula endotelial in vitro

Las células endoteliales tienen la capacidad de formar in vitro agregados tubulares parecidos a capilares en varias etapas iniciales de la formación. Esta conversión se produce bajo condiciones relativamente específicas, en las que se proporcionan los factores de crecimiento esenciales junto con un sustrato eficaz. Se ha demostrado que tanto la interacción de los factores de crecimiento con la célula endotelial como su unión a un sustrato activa el NHE. Se cree que la activación de este intercambiador es requerida para la posterior transformación morfológica de la célula endotelial en una estructura tubular multicelular.

Para establecer el efecto de los compuestos sobre las estructuras tipo cuerda formadas por células microvasculares humanas cuando se colocan en placa en presencia de VGEF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) y de factor de crecimiento básico de fibroblastos sobre una matriz de colágeno, se usó un ensayo de formación de cuerda estándar. Los resultados se muestran en la Tabla mostrada a continuación.

TABLA 3 Efecto de diversos aminosteroles en la formación de la cuerda endotelial

	\mug/ml
	0,01	0,1	1,0	10,0
Fumagilina		-	+/-	+
Escualamina	-	+	+	+
Compuesto 319	-	+	+	+
Compuesto 353		+	+	+
Compuesto 410		-	+	+*
Compuesto 411		-	-	+
Compuesto 412		-	-	+
Compuesto 413		-	-	+
Compuesto 415		-	-	+/T
Compuesto 371			T	T
Compuesto 432			-	-
Compuesto 449			-	+/-
Compuesto 467			-	-
Notas: + = Inhibición de angiogénesis;
\hskip1cm - = No inhibición de angiogénesis;
\hskip0.9cm T = Tóxico;
\hskip0.9cm * = redondeo de la célula a 10 \mug/ml.

Como se muestra en la Tabla 3, la escualamina inhibe la formación de la cuerda a aproximadamente 0,1 \mug/ml, en comparación con la fumagilina, que presenta una actividad comparable a 10 \mug/ml. A estas concentraciones, la escualamina no parece afectar profundamente a la viabilidad o a la proliferación de las células. Esta propiedad in vitro se correlaciona aproximadamente con la actividad anti-angiogénica en los modelos más complejos in vivo (véase Goto y col., Lab. Investigation 69, 1993, 508-518).

Adherencia neutrófila inducida por LPS a células endoteliales de vena umbilical humanas

Si se expone células endoteliales a determinados estímulos, que incluyen lipopolisacárido (LPS) y determinadas citoquinas, son inducidas sobre la membrana de plasma moléculas de adhesión específica que potencian la unión de leucocitos. Se cree que estas interacciones leucocito - célula endotelial son necesarias para localizar leucocitos en posición de invasión bacteriana y para facilitar la extravasación de los leucocitos de los capilares al espacio de tejido circundante. Las moléculas de adhesión de leucocitos incluyen las selectinas y la ICAM-1.

Para determinar si la escualamina inhibía esta función de las células endoteliales en particular, se llevaron a cabo ensayos estándar de adhesión como se resume en Gamble y col., J. Imm. Methods 109, 1988, 175-184. Se ha demostrado que la expresión de ligandos de superficie de célula en un sistema basado en endotelios efectúa adherencia a granulocitos con un sistema que usa células de vena umbilical humana, neutrófilos purificados, e inductores de ligandos de superficie de célula tales como el LPS (100 ng/ml) y el TNF-\alpha (40 ng/ml). En estos experimentos, se colocó en placa aproximadamente 2 x 10^{5} células de vena umbilical humana (pasaje 2-6) por pocillo. Se cultivó las células en un medio libre de suero a lo largo de la noche. Para la inducción, o bien TNF-\alpha (40 ng/ml) fue añadido a las células endoteliales durante 6 horas antes de añadir neutrófilos o bien LPS (100 ng/ml) fue añadido durante 4-6 horas. Se descubrió que la respuesta al LPS aumentaba al añadir FBS al 1% a los pocillos para proporcionar una fuente de proteína de unión al LPS. Tras la activación de las células endoteliales, se añadió aproximadamente 50 x 10^{6} neutrófilos por pocillo. Las placas fueron mecidas suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de la eliminación del medio y del lavado en un medio libre de suero tres veces y a continuación del fotografiado de cada pocillo. Los experimentos para probar los efectos de la escualamina fueron llevados a cabo añadiendo escualamina en las concentraciones de 10 \mug, 1,0 \mug, ó 0,1 \mug en el momento de la adición de los neutrófilos. Un control positivo fue un Ab monoclonal a ICAM-1.

Usando tres sujetos diferentes, no hubo inhibición de escualamina sobre la adherencia de neutrófilos usando células endoteliales humanas activadas. Hubo aproximadamente un 50% de inhibición de la adherencia cuando se añade 40 \mug/ml de un Ab monoclonal a ICAM-1 antes de añadir neutrófilos.

Estos resultados indican que la inhibición del NHE endotelial por la escualamina afecta tanto al crecimiento como a la formación de capilares in vitro, pero no inhibe todas las rutas de transducción de señal en esta célula. Por tanto, determinadas funciones "caseras", tales como la capacidad de la célula endotelial para atraer leucocitos a la posición de una infección, no deberían verse perjudicadas por la escualamina. Esto demuestra que la escualamina puede ser usada para inhibir la angiogénesis pero por lo demás no interrumpirá determinadas funciones importantes de la célula endotelial, tales como el reclutamiento de leucocitos en las posiciones de infección o de inflamación.

Actividad antiproliferativa El modelo de membrana corioalantoidea

Usando el modelo clásico de membrana corioalantoidea, se ha descubierto que la escualamina es un inhibidor del crecimiento capilar. Los capilares en crecimiento dentro del modelo de membrana corioalantoidea (modelo CAM) han sido usados como un sistema en el que evaluar el efecto de agentes sobre su potencial para inhibir el crecimiento de nuevos vasos. La neovascularización se produce en su mayor parte de forma agresiva durante la primera semana del desarrollo embrionario. Después de eso el crecimiento capilar se caracteriza principalmente por la "elongación" más que por la formación "de novo".

En el ensayo estándar, se aplican agentes localmente en una región del embrión sobre la que se producirá la neovascularización. Se determina la capacidad de los agentes para inhibir este proceso, evaluada mediante examen visual aproximadamente 7 días después de la aplicación. Los agentes que interrumpen el crecimiento vascular durante el periodo de formación capilar de novo, pero que no interfieren en el posterior crecimiento capilar, son contemplados generalmente como inhibidores "específicos" de la neovascularización, para distinguirlos de sustancias tóxicas menos específicas. El ensayo utilizado se describe en detalle en Auerbach y col., Pharm. Ther. 51, 1991, 1-11. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.

TABLA 4 Inhibición del crecimiento capilar en el modelo CAM

Embrión de 3	Escualamina		Porcentaje positivo
días	Aplicada (\mu)	Ensayo 1	Ensayo 2	Media
	0,65	28
	1,25	18	18	18
	2,5	35	18	27
	5,0	91	57	74
	20	52*	58*	55
	40	50*	13*	32
Nota: * = Se observó algo de irritación vascular.
Embrión de 13	Escualamina
días:	Aplicada (\mug)	Porcentaje positivo
	5,0	0/26

Como puede observarse en la Tabla 4, la aplicación de tan sólo 0,65 \mug de escualamina a un CAM de 3 días dio como resultado la inhibición de la neovascularización de vasos CAM. Por el contrario, la aplicación de diez veces esa cantidad de escualamina sobre un polluelo de 13 días de edad no ejerció ningún efecto inhibidor.

Por tanto, en un ensayo clásico de angiogénesis, la escualamina presentó una actividad de inhibición potente pero específica, igual en potencia a los compuestos más activos descritos hasta la fecha en la bibliografía. El efecto es compatible con la supresión de la neovascularización en lugar de con la inhibición tóxica del crecimiento capilar.

Los capilares de vitelina del modelo de embrión de pollo de 3 a 5 días

Durante el transcurso de la evaluación de la escualamina en el modelo "clásico" de membrana corioalantoidea de pollo, se observó que este esteroide ejercía a un efecto rápido y dramático sobre la integridad de los vasos capilares en los embriones de pollo de 3 a 5 días de edad. Usando el ensayo de capilares de vitelina de embrión de pollo, se evaluó la capacidad de los compuestos para inducir regresión capilar. Cada compuesto fue aplicado al embrión en 0,1 ml de Ficol 400 y de PBS al 15%, y se determinó la regresión vascular después de 60 minutos.

Se descubrió que la escualamina interrumpía los capilares de vitelina en los embriones de pollo de 3 a 5 días. El embrión de pollo de 3 días consistía en un disco embrionario del cual emergían y volvían numerosos vasos, formando una estructura con forma de 8, el embrión en el centro con lazos vasculares extendiéndose hacia el exterior sobre ambos polos.

La aplicación de la escualamina sobre la estructura embrionaria (0,1 ml en Ficol al 15% en PBS) resultó en un "goteo" progresivo de los vasos de vitelina, siendo los capilares más finos los primeros en exhibir estos cambios. Después de un periodo de retraso de unos 15 minutos, se observó el estrangulamiento de la continuidad entre los capilares y los vasos secundarios, generalmente en el lado "venoso". El flujo sanguíneo pulsátil continuado progresó, dando como resultado un "hinchamiento" del tubo ciego, seguido de un pellizco de la conexión remanente y de la formación de un saco vascular cerrado parecido a una "isla de sangre". Este proceso progresó hasta que sólo quedaban intactos los vasos más grandes. El corazón embrionario continuó latiendo vigorosamente. No se observó hemorragia, lo que refleja la integridad de la estructura capilar. Además, microscópicamente no se observó la interrupción obvia de la circulación de células rojas, lo que demuestra la ausencia de hemólisis.

Utilizando este ensayo, que parece demostrar lo que comúnmente se conoce como "regresión" capilar, se puede determinar una concentración mínima de escualamina requerida para observar un efecto en 60 minutos. Los resultados se resumen en la tabla mostrada a continuación.

TABLA 5 Efectos de diversos aminosteroles en el ensayo de regresión de capilares de vitelina en embriones de pollo

	Cantidad del Compuesto Aplicada (\mug)
Compuesto	10	1	0,1	0,01	0,001
Compuesto 1436	+	+	+	+	+/-
Compuesto 319	+	+	+	+	+/-
Escualamina	+	+	+	+	0
Compuesto 415		+	+	+	0

TABLA 5 (continuación)

	Cantidad del Compuesto Aplicada (\mug)
Compuesto	10	1	0,1	0,01	0,001
Compuesto 410		+	+/-	+/-	0
Compuesto 412		+	0	0	0
Compuesto 411		+/-	0	0	0
Compuesto 382	+	+	0	0	0
Compuesto 1364	+	+	0	0	0
Compuesto 371	+	+/-	0	0	0
Compuesto 396		+	0	0	0
Compuesto 353		+/-
Compuesto 413		0
Compuesto 414		0
Compuesto 381		0
Compuesto 303		0
Compuesto 318		0
Compuesto 409		0
Compuesto 1360		0
Vehículo	0	0	0	0	0
Notas: \hskip0.1cm + = Reactividad vascular;
\hskip1cm 0 = No reactividad vascular;
\hskip0.8cm +/- = Reactividad equívoca;
Vehículo = Ficol al 15% (p/p) en una disolución tampón salina de fosfato.

Como es evidente a partir de la Tabla 5, 0,1 B0,01 \mug de escualamina en un medio de 0,1 ml pueden inducir cambios. Se descubrieron compuestos que tienen varios intervalos de actividad, siendo la escualamina, el compuesto 319 y el compuesto 415 especialmente activos. Este experimento demuestra que los esteroides probados pueden reestructurar dramáticamente los capilares en un intervalo de tiempo de varios minutos. Los resultados reflejan que la escualamina ejerce este efecto además de la inhibición de NHE.

Ensayo de renacuajo

Un ensayo desarrollado recientemente que emplea renacuajos, preferiblemente Xenopus lavéis Etapas 59-60, fue empleado para estudiar el efecto de un compuesto mediante el seguimiento de la evolución de la oclusión capilar en la cola del renacuajo. Se usó los animales de estas etapas porque representan el periodo de transición de la metamorfosis en el que el animal posee tanto tejidos de la etapa embrionaria como tejidos de la etapa adulta. Los compuestos de la invención afectan a la forma, a la viabilidad y a la integridad de los tejidos embrionarios sin afectar a los tejidos adultos, proporcionando un seguimiento poderoso y altamente específico. Por ejemplo, las sustancias que destruyen todos los epitelios del animal, tanto adultos como embrionarios, podrían considerarse tóxicas. Las sustancias que destruyen sólo los tejidos embrionarios exhiben una especificidad única.

En este ensayo, se introducen los renacuajos en placas Petri que contienen una disolución del compuesto a ensayar en agua destilada, preferiblemente entorno a 100 ml. La concentración preferida del compuesto a ensayar es de aproximadamente 1 \mug/ml hasta aproximadamente 10 \mug/ml. El volumen de líquido es suficiente para que el animal nade libremente y beba de la disolución. De este modo, el efecto observado proviene de la absorción oral y la posterior distribución sistémica del agente. Si el volumen de líquido no es suficiente para permitir la entrada oral, los efectos que se observan podrían provenir de la absorción a través de epitelios superficiales. Por tanto, este sencillo ensayo puede identificar si un compuesto tiene características de disponibilidad oral.

En otra realización de este ensayo, una disolución de un compuesto en agua puede ser inyectada directamente en el abdomen del animal usando técnicas estándar. Se prefieren concentraciones del compuesto entre aproximadamente 0,05 mg/ml y aproximadamente 0,5 mg/ml en aproximadamente 0,05 ml de agua.

Después de un tiempo dado, típicamente entorno a 60 minutos, se observa la oclusión del flujo sanguíneo a través de capilares en la cola del renacuajo en un microscopio invertido con un aumento de más o menos 100X.

Si los renacuajos son introducidos en agua destilada que contiene escualamina a \mug/ml, se observó que el flujo sanguíneo a través de los capilares de la cola se detiene. El proceso se produjo a partir del caudal hacia la dirección craneal. El flujo sanguíneo entre los vasos más distales se paró inicialmente, seguido de los vasos más grandes. Durante este periodo, se observó que por otra parte el sistema cardiovascular era robusto, como evidencia el latido continuo del corazón, la expansión pulsátil de los vasos mayores, y, lo más curioso, el flujo sanguíneo inalterado a través de los capilares finos de las manos y de los pies. Por tanto, se observó el cese selectivo del flujo sanguíneo en regiones localizadas. Si se mantiene a los animales en escualamina durante varios días, se observa la regresión potenciada de los aspectos más distales de la cola, así como de los aspectos periféricos de la aleta de la cola, que corresponden a regiones del animal fusionadas por la vasculatura ocluida.

Este efecto aparentemente resulta de un cambio selectivo en el diámetro de descanso de los capilares de la cola. La inhibición de la célula endotelial NHE evidentemente conduce a un cambio en la forma de la célula que confecciona la capilaridad, dando como resultado un flujo disminuido. El funcionamiento continuo de los lechos capilares en las porciones "adultas" del renacuajo (los miembros) indica que la escualamina es selectiva para determinados capilares. De los resultados del ensayo de oclusión capilar de la cola de renacuajo, se descubrió que el compuesto 319, la escualamina y el compuesto 1436 inducen un efecto oclusivo vascular común.

Supresión del crecimiento de melanoma Supresión del crecimiento de melanoma en ratones por rutas de administración oral y parenteral

El crecimiento de melanoma B16 en ratones C57B depende de la neovascularización. Por tanto, este es un modelo reconocido para evaluar el impacto de los inhibidores de angiogénesis en el crecimiento del cáncer.

Usando el crecimiento de células de melanoma B16 en ratones C57B, un modelo reconocido para la evaluación de inhibidores de angiogénesis en el crecimiento de cánceres, se evaluó los efectos de la administración subcutánea, intraperitoneal y oral de escualamina. Se implantó un inóculo de células de melanoma B16 subcutáneamente en el dorso del ratón C57B, que dio como resultado un crecimiento progresivo de lesiones de melanoma a lo largo de 30 - 40 días como se muestra en las Figuras 4A-4C.

En este modelo, se observó poca evidencia de metástasis con o sin tratamiento con agentes quemoterapéuticos. Si los animales eran tratados con escualamina tanto subcutáneamente (Figura 4A), intraperitonealmente (Figura 4B) u oralmente (Figura 4C), se observó una supresión dependiente de la dosis de volumen tumoral. La medida tanto del peso corporal como de los parámetros hematológicos demostró un depresión insignificante. Puesto que la escualamina por sí misma muestra una actividad citostática mínima frente al B16 en cultivo, excepto en concentraciones muy grandes, se interpretó que esta respuesta del tumor era secundaria en la interferencia del desarrollo capilar.

Supresión del crecimiento de melanoma humano en ratones inmunocomprometidos

Como resulta evidente a partir de la Figura 5, el melanoma 1205Lu se desarrolla agresivamente en ratones
RAG-1 después de la implantación. Se ha descubierto que la escualamina suprime el crecimiento del melanoma 1205Lu en ratones RAG-1 de un modo dependiente de la dosis.

Se administró escualamina después de que los tumores hubieran alcanzado aproximadamente 0,1 ml, y se descubrió una clara supresión del crecimiento tumoral de un modo dependiente de la dosis como se evidencia en la Figura 5. Después del cese del tratamiento, el crecimiento del tumor continuó a un ritmo similar al de los controles sin tratar, lo que sugiere que el impacto de la escualamina en este escenario es reversible.

Supresión de la neovascularización corneal inducida por tumor en conejos

La implantación de carcinoma VX2 en cornea de ratón da como resultado la inducción de nuevos vasos sanguíneos en varios días (Tamargo y col., Cancer Research 51, 1991, 672-675). Se cree que este carcinoma segrega factores de crecimiento que estimulan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Por tanto, este modelo es una evidencia in vivo indicativa de la utilidad terapéutica en el tratamiento de desórdenes patológicos de vascularización, incluyendo la propagación metastásica de tumores, retinopatía diabética, degeneración macular, y artritis reumatoide.

Este experimento siguió el protocolo publicado, se implantó el tumor adyacente a un polímero que contiene una concentración del agente a evaluar. El polímero libera el agente lentamente en las proximidades inmediatas del tumor, proporcionando altas concentraciones locales sostenidas del agente. En este experimento, la escualamina introducida en una pastilla de ELVAX 40 P (DuPont, Wilmington, DE) inhibió la formación de nuevos vasos sanguíneos en aproximadamente un 60% en los días 7 y 14, y en aproximadamente un 25% en el día 21.

De hecho, cualquier proceso patológico dependiente de la formación de nuevos vasos sanguíneos puede ser tratada a través de la inhibición de NHE3. Como un agente que interfiere en el proceso de neovascularización, la escualamina tiene una utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades o desórdenes dependientes de una neovascularización continua en los que la interrupción de la neovascularización disminuye la intensidad del proceso patológico. Por tanto, la escualamina tiene utilidad en el tratamiento de desórdenes que incluyen el crecimiento y la metástasis de tumor sólido, la artritis reumatoide, la soriasis, la retinopatía diabética, la degeneración macular, el glaucoma neovascular, el papiloma, la fibroplasia retrolental, y el rechazo de órganos.

Además, otros aminosteroles han demostrado actividad antiangiogénica. Los compuestos fueron sometidos a diferentes ensayos, incluyendo el ensayo de regresión capilar de embrión de pollo, el ensayo con renacuajos, el ensayo para inhibir la formación de la cuerda endotelial, y el ensayo de la inhibición directa de NHE, como se ha descrito anteriormente, para determinar sus utilidades. Como queda patente de los datos anteriores, la correlación entre los resultados de los ensayos de inhibición de la formación de la cuerda de células endoteliales in vitro, de pollo y de renacuajo son excelentes.

A través de la aplicación de estos ensayos, el compuesto 319 resalta como una alternativa atractiva a la escualamina. De hecho, se ha descubierto que es superior a la escualamina en las siguientes características: potencia como inhibidor de NHE; ruta de síntesis más sencilla; especificidad, es decir, no efectos CNS. Otras propiedades adicionales del compuesto 319 son discutidas a continuación.

Supresión del crecimiento de melanoma

Se ha descubierto que el compuesto 319 exhibe actividad frente al melanoma B16 in vivo. Como se puede ver en la Figura 6, que ilustra los resultados del ensayo de melanoma de murina descrito anteriormente, la administración subcutánea del compuesto alcanzó el control del B16 en ratones C57B en una extensión casi comparable a la escualamina (Figura 4B).

Despeje farmacocinético

El compuesto 319 también tiene un despeje farmacocinético más rápido que la escualamina. Para determinar el despeje, se llevó a cabo un estudio con ratones IV PK para el compuesto 319 y para la escualamina. El compuesto fue administrado in vivo y se tomaron muestras de sangre cada 10 minutos. La concentración del esteroide administrado fue determinada mediante análisis de HPLC. Como se muestra en la Figura 7, después de la administración in vivo, el compuesto fue despejado por la corriente sanguínea del ratón con una vida media de aproximadamente 14 minutos. En comparación, la escualamina fue despejada con una vida media de aproximadamente 35 minutos, como refleja la Figura 8.

Debería ser posible alcanzar reducciones aún mayores en el despeje in vivo con derivados del compuesto 319. Frecuentemente, es interesante ampliar la vida de un agente en la corriente sanguínea, para alcanzar mayores niveles en sangre con una dosis de fármaco dada y para reducir la frecuencia de la administración. Las poliaminas son metabolizadas fácilmente por una variedad de oxidasas, que degradan el grupo amino libre terminal del resto de la poliamina. Véase Seller y col., Prog. Drug. Res. 43, 1994, 88-126. La alquilación de la amina primaria generalmente retarda esta ruta metabólica. Seller y col., id. Por tanto, a través de una simple alquilación de la amina primaria del compuesto 319 o de cualquiera de los esteroides que portan una poliamina metabolizable, serían de esperar modificaciones sencillas de este tipo para incrementar la vida biológica.

Ensayo de renacuajo xenopus

El ensayo de renacuajo descrito antes proporciona una forma ventajosa para determinar los objetivos farmacológicos de cada esteroide cuando se introduce en un mamífero, y para determinar las categorías farmacológicas a las que pertenecen los compuestos sintéticos. En el ensayo, cada uno de los esteroides fue disuelto en 100 ml de agua destilada en una concentración de 10 \mug/ml. Renacuajos Xenopus de etapa 59-60 fueron introducidos y evaluados mediante microscopía con luz y mediante observación directa 1 hora después.

Se observó que los esteroides evaluados producían diferentes y distintas respuestas farmacológicas en este animal:

El compuesto 1256 (Escualamina): oclusión vascular en los capilares finos de la cola. No hubo efecto en el flujo vascular a través de las manos y los pies. La inactividad y la muerte se produjeron en 2 horas.

FX1: aumento el pasaje de materia fecal en 1 hora. A las 12 horas, la disolución contenía considerables restos fecales. El sistema circulatorio del animal parecía hiperémico, lo que sugiere estimulación hematopática.

Compuesto 1360: se produjo el hinchamiento y la lisis de determinados eritrocitos, dando como resultado la acumulación de núcleos dentro de determinados vasos pequeños de la cola. La posterior rotura de tejidos se produjo en áreas de la cola que rodean estos tapones de núcleos.

Compuesto 1361: similar al compuesto 1360.

Compuesto 1436: reducción gradual de la actividad general. El latido de corazón permaneció fuerte, lo que sugiere una depresión del sistema nervioso. Los melanocitos de la cabeza y de la cola comenzaron a hincharse, exhibiendo primero núcleos distintos visibles, seguido de rotura en fragmentos. El animal murió en aproximadamente 2 horas.

Compuesto 1437: el epitelio que recubre las porciones embrionarias del animal, tales como la cola y las antenas, comenzó a deshacerse en láminas. Las láminas de células permanecieron intactas inicialmente, pero gradualmente se separaron una de otra. La tinción con Trypan Azul demostró que la muerte celular se había producido. Por lo demás el animal estaba activo, con poca rotura de tejido visible.

FX 3: el haz muscular de la cola comenzó a perder mioglobina. Las estriaciones del músculo esquelético crecieron menos distintas. Segmentos del músculo comenzaron a separarse.

Inhibición del crecimiento estimulado por mitógeno de células T humanas

Se usaron ensayos específicos para identificar esteroides con una actividad biológica particular, tales como un ensayo para inhibir el crecimiento estimulado por mitógeno de células T humanas. Se ha determinado que la proliferación de células inducida por mitógeno es dependiente de la activación del NHE. De este modo, para determinar qué esteroides actúan sobre unas células determinadas, uno sólo necesita determinar qué esteroides inhiben la proliferación celular activada por mitógeno (o por el factor de crecimiento).

El linfocito T es la célula linfoidea que sirve como hospedante de la infección de HIV. Un esteroide que inhibe la transformación de los linfocitos humanos está, en principio, actuando sobre un NHE activado probablemente durante la infección de HIV. De hecho, puesto que el GP120 activa la célula hipocampal de NHE mediante la unión a su receptor celular (Benos y col., J. Biol. Chem. 269, 1954, 13811-13816), la suposición de que un evento similar sigue a la interacción viral inicial con el linfocito es razonable. Esto conforma la base del siguiente ensayo.

Sangre humana heparinizada, recién obtenida, fue introducida en matraces de cultivo de tejido que contienen 10 \mug/ml de fitohemaglutinina (PHA) en medio RPMI con 10% de FCS. Se introdujeron diversos esteroides purificados de forma consecutiva a concentraciones de 1, 5, y 10 \mug/ml. Se incubó los cultivos durante 72 horas, después de lo cual se añadió colcemida a 1 \mug/ml. Los cultivos fueron mantenidos durante otras dos horas más, y las células fueron cosechadas. Las figuras mitóticas fueron estimadas usando técnicas citoquímicas estándar, después de tinción Giemsa. Los resultados están tabulados a continuación.

TABLA 6 Inhibición de linfocitos humanos estimulados por PHA

(% control)
Compuesto	1 \mug/ml	5 \mug/ml	10 \mug/ml
1256	3	8	10
1360	5	5	5
1436	20	50	80
1437			10
FX 3			5

Como se observa en la tabla anterior, el compuesto 1436 inhibió la transformación de la forma más potente, con una inhibición observada a 10 \mug/ml superior al 75%. Para la escualamina se observó algún efecto a esta concentración, pero los otros esteroides fueron considerablemente menos activos. Usando este sencillo ensayo, el compuesto 1436 fue identificado para el uso en el tratamiento de enfermedades linfoproliferativas de célula T, que incluyen infecciones virales que se propagan activamente en estas células.

Se pueden establecer fácilmente ensayos de diseño similar, empleando una célula de interés y un factor de crecimiento apropiado. De este modo, para determinar qué esteroide podría ser más útil en la inhibición de la proliferación de células vasculares de músculo liso que sigue a la angioplastia, uno sólo necesita preparar un cultivo con músculo liso coronario humano y determinar qué esteroide inhibe el crecimiento estimulado por PDGF de estas células, como se discute más adelante.

Inhibición sinérgica del crecimiento tumoral

Basándose en la idea de que el crecimiento tumoral implica la expansión clónica de una célula maligna junto con el desarrollo de un suministro vascular de apoyo, se probó una combinación del compuesto 1436 con escualamina para determinar si de alcanzaría un efecto sinérgico sobre el crecimiento del tumor sólido. Este concepto fue evaluado en el modelo del melanoma B16.

Se implantó animales con melanoma B16 seguido de un tratamiento con el compuesto 1436 o con el 1256 administrados en un esquema combinado o por separado. Como es evidente a partir de la Figura 12, cuando se administra escualamina a 5 mg/kg\cdotdía o cuando se administra el compuesto 1436 a 10 mg/kg\cdotdía, no se observa un impacto significativo en el volumen del tumor. Por el contrario, cuando ambos agentes fueron administrados conjuntamente, se observó una reducción significativa en el crecimiento del tumor. Ni la administración de escualamina a 15 mg/kg\cdotdía ni el compuesto 1436 por sí solo en un esquema tolerable pudieron alcanzar este efecto. Por tanto, una combinación de estos dos compuestos alcanza un beneficio terapéutico en tumores dependientes de neovascularización que puede prevenir la propagación metastásica.

Efecto sobre la secreción de insulina

Estudiando otras aplicaciones para los aminosteroles de esta invención, se descubrió que la liberación de insulina de la célula de islote del páncreas requiere la activación del NHE de la célula de islote, activado de forma definitiva a través de un mecanismo desencadenado por glucosa. Se cree que la sobreestimulación de la célula de islote puede jugar un papel en el agotamiento de la función de la célula de islote en la enfermedad de Tipo II. Además, se han presentado indicios de que mecanismos genéticos que conducen a la hiperactividad del NHE de célula de islote pueden jugar un rol en la enfermedad de Tipo I.

Por tanto, el principio de diabetes en individuos genéticamente susceptibles, o expuestos a condiciones de riesgo a través de procesos adquiridos (obesidad), podrían ser retrasados o apaciguados si la función de la célula de islote pudiera ser reducida. La inhibición del NHE responsable de la secreción de insulina podría proporcionar un beneficio terapéutico en estos escenarios.

Para estudiar el efecto del administrador de esteroides o del NHE responsable de la secreción de insulina, se administró varios aminosteroles de hígado de tiburón a ratones en ayuno. Se asignó ratones macho CD-1 a uno de los cuatro grupos de tratamiento. Se evaluó la glucosa de sangre entera usando un glucómetro (Lifescan Glucometer II y tiras de ensayo One Touch). El análisis estadístico fue vía análisis de varianza de un sentido (ANOVA) seguido del posterior ensayo t de Bonferonni. Los resultados están tabulados a continuación.

TABLA 11 Efecto del compuesto sobre la glucosa en ayuno en sangre en ratones

			Dosis		Media de Glucosa en
			Total		ayuno en sangre
Grupo	n	Compuesto	mg/Kg	Tratamiento	+SEM (mg/dl)
1	5	--	--	Ayuno de noche, obtención	38 \pm 5,2
				de sangre
2	4	1437	20	10 mg/Kg i.v. Día 0 PM,	82 \pm 15,3
		(en H_{2}O)		ayuno de noche, 10mg/Kg
				iv.Día 1AM, obtención de
				sangre 30 min después de
				la dosis 2d
3	4	1256	20	10 mg/Kg i.v. Día 0 PM,	65 \pm 7,3
		(en H_{2}O)		ayuno de noche, 10mg/Kg
				iv.Día 1AM, obtención de
				sangre 30 min después de
				la dosis 2d
4	3	1436	20	10 mg/Kg i.v. Día 0 PM,	105 \pm 8,0
		(en DSW)		ayuno de noche, 10mg/Kg
				iv.Día 1AM, obtención de
				sangre 30 min después de
				la dosis 2d

Como es evidente a partir de los datos anteriores, los niveles de glucosa en sangre fueron elevados entre 2 y 3 veces los valores normales después de la administración de estos esteroides. La glucosa en ayuno en sangre del Grupo 2 era significativamente elevada en comparación con el Grupo 1 (p<0,05). La glucosa en ayuno en sangre del Grupo 4 era significativamente elevada en comparación con el Grupo 1. Por tanto, parece que la administración intravenosa del compuesto 1436 en DSW (5% de glucosa) o del compuesto 1437 en agua causó hiperglicemia en los ratones. Se asume que las respuestas de hiperglicemia observadas resultan de la inhibición de la secreción de insulina, como se sugiere a partir de los principios fisiológicos básicos. Por tanto, la administración crónica a largo plazo de un compuesto como el compuesto 1436 puede ser valiosa en la prevención o el retraso del inicio tanto de diabetes Tipo I como de diabetes Tipo II.

Efecto sobre el crecimiento de músculo liso arterial

Los aminosteroles de la invención también pueden tener utilidad para inhibir la proliferación de músculo liso mediada por factor de crecimiento dentro de las arterias. Después de una angioplastia coronaria, comúnmente se produce una reoclusión, secundaria para la proliferación reparativa del músculo liso vascular de la pared del vaso sanguíneo manipulado quirúrgicamente. Este proceso generalmente tiene lugar en el transcurso de 7 a 10 días. Para evaluar si un agente podría prevenir la proliferación de músculo liso mediada por factor de crecimiento en la arteria, se evaluó el compuesto 1436 in vitro en cuanto a su efecto sobre la proliferación de músculo liso de arteria coronaria humana. Los resultados para el compuesto 1436 se muestran en la Figura 13, y los correspondientes a la escualamina se muestran en la Figura 14, siendo la Figura 15 una representación logarítmica compuesta.

Como se observa en la Figura 13, a una concentración de aproximadamente 10-12 \mug/ml el compuesto 1436 fue efectivo en la supresión del crecimiento de estas células. Por ejemplo, las células podrían ser mantenidas en un estado quiescente en presencia de este esteroide a una concentración de aproximadamente 11 \mug/ml sin perder la viabilidad. Este experimento sugiere que, durante varios días después de la angioplastia, la administración local del compuesto 1436 en la zona de la angioplastia vía administración de lenta liberación en una zona vascular próxima reduce la proliferación del músculo durante el periodo en el que el endotelio de los vasos reestablece la continuidad y los eventos celulares que rodean la herida aguda se han calmado.

Efecto antiproliferativo cuando se administra a un animal. No sólo inhibirá la proliferación celular inducida por factor de crecimiento actuando sobre la célula proliferativa, sino que también inhibe la secreción de la hormona promotora del crecimiento a un nivel central, endocrino. Por tanto, el compuesto 1436 coloca al animal en un estado de "inhibición del crecimiento". En dicho estado, las células malignas no recibirán la estimulación hormonal exógena óptima de hormonas tales como la hormona del crecimiento, y quizás la LH y la FSH. La secreción de hormonas tales como el estrógeno y la progesterona, así como de la insulina, probablemente se vean desreguladas. Las células infectadas por virus serán colocadas bajo condiciones fisiológicamente desfavorables, y la eficacia de la infección viral debería reducirse dramáticamente. Las células inmunológicamente extrañas, inhibidas en cuanto a crecimiento, deberían ser despejadas por los sistemas inmunes existentes, proporcionándoles ahora una oportunidad de alcanzar cinéticamente a estas células "extrañas".

Ensayos antiproliferativos y ensayos de supresión del crecimiento tumoral como ensayos de caracterización

Como anteriormente, se usó el ensayo con renacuajos para seguir la evolución de compuestos adicionales. En presencia de 10 \mug/ml del compuesto 1436, el renacuajo Xenopus de etapa 59-60 experimenta una interrupción dramática de los melanocitos de su cabeza, tronco, y cola, junto con una depresión de su sistema nervioso. No se observan efectos sobre la integridad epitelial de la célula, sobre el flujo vascular, sobre el volumen de eritrocitos, sobre la integridad de los tejidos, sobre la estriación de las fibras musculares, o sobre la actividad del tracto del intestino grueso.

Usando el ensayo con renacuajos para seguir la evolución de compuestos funcionalmente similares, se descubrió que los compuestos 353, 371 y 413 producen efectos parecidos a los que produce el compuesto 1436. De éstos, se prefiere especialmente el compuesto 353 debido a su facilidad de síntesis como se ha descrito anteriormente. También se descubrió que este compuesto exhibe otras propiedades ventajosas.

Usando los métodos de supresión del crecimiento establecidos anteriormente, se determinó que el compuesto 353 exhibe una actividad potente frente al melanoma y frente a un número de células cancerígenas como se establece a continuación:

TABLA 12 Actividad citotóxica del compuesto 353 frente a células cancerígenas

Célula	IC_{50}(\mug/ml)
Melanoma humano WM 1167	3,0
Carcinoma de pulmón de Lewis	1,9

Además, usando el método de Baker y col., Cancer Res. 53, 1994, 3052- 3057, se observó que el efecto del compuesto 353 sobre el crecimiento de melanoma encuentra su máximo valor después de 48 horas, con un efecto menor observado durante las primeras 12 horas de incubación, como se muestra en la Figura 17A. A efectos comparativos, la Figura 17B muestra el efecto de la escualamina sobre el melanoma humano.

Selección de la isoforma de NHE

A través del uso de técnicas biológicas moleculares, es posible determinar qué isoformas de NHE están expresadas en células específicas, tales como las malignas. El melanoma humano expresa NHE1, NHE3 y NHE5, y el adenocarcinoma humano expresa principalmente NHE3 (véase la Tabla 8).

Por tanto, el tratamiento de este tipo de adenocarcinoma podría llevarse a cabo de la forma más efectiva mediante el uso de un inhibidor más específico de NHE3, tal como la escualamina o el compuesto 319. Por el contrario, el melanoma expresa cantidades considerables de NHE5 junto con NHE3. Por lo tanto, el tratamiento de esta malignidad debería incluir un inhibidor tanto de NHE3 como de NHE5, tal como el compuesto 1436, por sí solo o en combinación con la escualamina.

En resumen, la invención tiene en cuenta las utilidades de los inhibidores de NHE de tipo aminosterol para establecerlas a través de la evaluación diagnóstica de las isoformas de NHE expresadas en los tejidos objetivo. Los enfoques de diagnóstico pueden incluir la detección inmunológica de la proteína específica de la isoforma de NHE o un procedimiento biológico molecular tal como el PCR, utilizando información de secuencia específica, y técnicas estándar.

De este modo, otras realizaciones de la invención serán evidentes para aquellos con conocimientos en la técnica considerando la especificación y la práctica de la invención. Las realizaciones y las características preferidas descritas anteriormente deberían ser consideradas como ejemplos, quedando definida la invención por las reivindicaciones anexas.

Claims

1. El uso de escualamina o de una sal suya farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento útil para inhibir el crecimiento de células endoteliales.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento es útil para inhibir el crecimiento de nuevos capilares.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento es útil para inhibir la angiogénesis.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento es útil para tratar la retinopatía diabética.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento es útil para tratar la degeneración macular.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento es útil para tratar el glaucoma neovascular.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento es útil para inhibir la vascularización patológica.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medicamento es útil para inhibir el crecimiento de células de músculo liso arterial.

9. El uso de escualamina o de una sal suya farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento útil para inhibir el crecimiento de tumor sólido.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el medicamento es útil para tratar un melanoma.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el medicamento es útil para inhibir la propagación de tumor metastásico.

12. El uso de escualamina o de una sal suya farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento útil para tratar la artritis reumatoide.

13. El uso de escualamina o de una sal suya farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento útil para tratar infecciones de virus del papiloma.

14. El uso de escualamina o de una sal suya farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento útil para tratar la soriasis.

15. El uso de la escualamina o de una sal suya farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento útil para tratar la fibroplasia retrolental.

16. El uso de escualamina o de una sal suya farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento útil para inhibir el rechazo de órganos.