DE69627853T2

DE69627853T2 - Verwendung von squalamin zur herstellung eines arzneimittels zur inhibierung von nhe

Info

Publication number: DE69627853T2
Application number: DE69627853T
Authority: DE
Inventors: Michael Zasloff
Original assignee: Genaera Corp
Current assignee: Genaera Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: CA2223908A1; WO1996040151A1; AU6152896A; CA2223908C; AU712436B2; JPH11506775A; PT831837E; US5792635A; EP0831837A1; DE69627853D1; DK0831837T3; ZA964819B; JP4077512B2; ATE238800T1; ES2201187T3; EP0831837B1

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon als Inhibitoren des Natrium/Protonenaustauschers (NHE).
Hintergrund der Erfindung
Jede der Zellen des Körpers muss ihr Säure-Basen-Gleichgewicht bewahren, oder genauer gesagt, ihre Wasserstoffionen- oder Protonen-Konzentration. Nur geringe Veränderungen der Wasserstoffionen-Konzentration verursachen merkliche Veränderungen der Raten der chemischen Reaktion in den Zellen – einige werden unterdrückt und andere werden beschleunigt. Sehr breit und allgemein formuliert bedeutet das, dass wenn eine Person eine hohe Wasserstoffionen-Konzentration (Acidose) hat, dass diese Person wahrscheinlich in einem Koma stirbt, und wenn eine Person eine niedrige Konzentration an Wasserstoffionen hat (Alkalose) kann er oder sie an Tetanus oder Krämpfen sterben. Zwischen diesen Extremen gibt es einen bemerkenswerten Bereich an Erkrankungen und Zuständen, die von den betroffenen Zellen und vom Niveau der wahrgenommenen Wasserstoffionen-Konzentration abhängen. Deswegen ist die Regulierung der Wasserstoffionen-Konzentration einer der wichtigsten Aspekte der Homöostase.
Ein Kurzschriftverfahren zur Beschreibung der Wasserstoffionen- Konzentration ist der pH-Wert: pH = log 1/(H⁺-Konzentration) = – log (H⁺-Konzentration). Der pH-Wert der normalen Zelle beträgt 7,4, aber eine Person kann nur sehr wenige Stunden mit einem pH-Wert von weniger als 7,0 oder mehr als 7,7 leben. Deswegen ist die Bewahrung des pH-Werts kritisch fürs Überleben.
Es gibt einige Mechanismen, das pH-Gleichgewicht zu bewahren. Während des Ruhezustands oder des konstitutiven Wachstums z. B, scheinen die Zellen den.Chlorid/Bicarbonat-Austauscher zu verwenden, eine gut untersuchte Vorrichtung, die einen Protonen-Austausch über die Zellen ermöglicht, wie beispielsweise in roten Blutkörperchen.
Außerdem verwenden Zellen während beschleunigter Wachstumsperioden, die durch Mitogene, Wachstumsfaktoren, Sperma etc. induziert werden, ein weiteres Stück der zellulären Ausrüstung, um den bevorstehenden metabolischen Ausbruch zu handhaben. Dies ist der Natrium/Protonen-(Na⁺/H⁺)-Austauscher – der „NHE", der auch als „Antiporter" bezeichnet wird. Da der NHE in einer Anzahl von Rollen und in einer Anzahl von Geweben arbeitet, hat der Körper eine Familie von NHEs entwickelt, und eine kürzlich erschienene Arbeit hat eine Familie von NHE-„Isoformen" aufgeklärt, die in bestimmten Geweben lokalisiert sind und mit verschiedenen Funktionen assoziiert sind. Die NHE-„Isoformen", die unten aufgeführt werden, sind höchstwahrscheinlich bedeutend.
NHE1 ist ein "Haushalts"-Austauscher und es wird vermutet, dass er bei der Hypertension nicht reguliert ist. Man vermutet, daß er eine Rolle im intrazellulären pH-Verhalten spielt. Außerdem wird geglaubt, dass die Kontrolle dieses Austauschers einen Patienten vor einer ischämischen Verletzung schützt. NHE1 ist genetisch mit Diabetes assoziiert und dadurch kann die Hemmung das Voranschreiten des Diabetes durch Wirkungen auf die β-Zellen im Pankreas verändern. Zusätzlich ist das Wachstum vaskulärer glatter Muskulatur, die auf Glucose reagiert, mit einer erhöhten Expression von NHE1a assoziiert.
NHE1β ist auf kernhaltigen Erythrozyten vorhanden. Er wird durch hohe Konzentrationen an Amilorid inhibiert. Diese NHE-Isoform wird durch adrenerge Mittel in einer cAMP-abhängigen Weise reguliert.
NHE2 ist mit zahlreichen-Zellen des GI-Trakts und der Skelettmuskulatur assoziiert. Die Inhibierung könnte, das Wachstum hyperplastischer Stadien oder hypertrophischer Stadien wie beispielsweise einer Hypertrophie der glatten Gefäßmuskulatur oder einer Herz-Hypertrophie verändern. Krebsformen muskulären Ursprungs wie beispielsweise Rhabdomyosarkom oder Leiom sind vernünftige therapeutische Ziele.
NHE3 ist mit dem Dickdarm assoziiert. Die unten beschriebene Arbeit zeigt, dass es mit Endothelzellen assoziiert ist. Die Inhibierung würde Funktionen wie beispielsweise den Wasseraustausch im Darm betreffen (erhöhter Darmflüssigkeitsfluß, welcher beispielsweise die Grundlage von Verstopfung ist), Darmkrebs, etc. Auf Endothelzellen würde normales Wachstum durch die Inhibierung des Austauschers gehemmt.
NHE4 ist mit bestimmten Zellen der Niere assoziiert. Es scheint eine Rolle in der Regulierung des zellulären Volumens zu spielen. Spezifische Inhibitoren könnten die Nierenfunktion beeinflussen, und dadurch einen therapeutischen Nutzen bei Hypertension bieten.
NHE5 ist mit Lymphgewebe und Zellen des Gehirns assoziiert. Die Inhibierung von NHE5 könnte die Hemmung proliferativer Erkrankungen, die diese Zellen einschließen, verursachen. NHE5 ist ein möglicher Kandidat für die Proliferation von Glialzellen aufgrund von HIV- und weiteren viralen Infektionen.
Wie oben angemerkt, könnte die Inhibierung der NHE-Funktion bedeutende therapeutische Vorteile liefern, obwohl der NHE so funktioniert, dass er dem Körper hilft. Obwohl der NHE z. B. normalerweise nur arbeitet, wenn der intrazelluläre pH-Wert unter ein bestimmtes Niveau an Azidität sinkt, werden die NHEs durch Wachstumsfaktorstimulierung angeschaltet, obwohl die Zelle in einem "normalen" Ruhe-pH-Wert ausbalanciert ist. Infolgedessen beginnen die NHEs damit, Protonen bei einem pH-Wert aus der Zelle zu pumpen, bei dem sie normalerweise inaktiv sind. Die Zelle durchläuft so einen fortschreitenden Protonenverlust, was seine Netto-Puffer-Kapazität steigert oder in einigen Fällen tatsächlich alkalisiert. Bei Einstellungen, wo die Pumpe vom Arbeiten abgehalten wird, führt der Wachstumsstimulus nicht zu einem zellulären Effekt. So üben Inhibitoren der NHE-Familie wahrscheinlich wachstumsinhibitorische Wirkung aus.
Während schwerem Säurestress – ein Zustand, in dem sich ein Gewebe befinden kann, wenn es von der Sauerstoff-Versorgung abgeschnitten ist (oder von der Blutzufuhr) – geht man davon aus, dass die NHE-Familie an der folgenden irreversiblen Schädigung beteiligt ist. Wenn der Blutfluss zum Herzen beispielsweise gestört ist, tritt eine lokale Azidose auf. Herzmuskelzellen entwickeln eine tiefe interne Azidität. Diese Azidität wiederum aktiviert ansonsten schlafende NHEs. Diese Austauscher eliminieren die Protonen schnell aus der Zelle, aber im Austausch für Natrium. Infolgedessen steigen die intrazellulären Natriumkonzentrationen. Anschließend wird der Natrium-Calcium-Austausch aktiviert, der internes Natrium für externes Calcium austauscht. Der Anstieg der internen Calcium⁺-Konzentration führt zu Zelltod, abgesenkter Kontraktilität und Arrythmien. Daher glaubt man, dass ischämische Myokardschädigungen und assoziierte Arrythmien von einem NHE-abhängigen Mechanismus ausgehen und die Inhibierung dieses NHEs könnte deswegen solch ein Auftreten verhindern. Falls der NHE inhibiert wird, könnte die Internalisierung von Na⁺ und langsamere metabolische Aktivität als Konsequenz des abgesenkten pH-Werts Schäden an der Zelle vermeiden. Dadurch gibt es ein Interesse an der Entwicklung von NHE-Inhibitoren zur Verwendung bei Herzischämie.
Weitere Mitglieder der NHE-Familie scheinen eine eher klassische Rolle beim Wasser- und Natriumtransport über epiteliale Oberflächen zu spielen. Insbesondere die NHE3-Isoform, die im Darm gefunden wird, spielt vermutlich eine Rolle beim Regulierendes Flüssigkeitsgehaltes des Darmlumens. Diese. Pumpe ist in Fällen der Diarrhöe gehemmt. Die NHE3-Isoform, die auf dem proximalen Tubuli der Niere vorhanden ist, spielt vermutlich eine ähnliche Rolle hinsichtlich des Nierensalz- und Säureaustausches. Demgemäss sind Inhibitoren der NHE-Familie als therapeutische Modalitäten zur Behandlung von Hypertension angesehen worden.
Im Hinblick auf den erwarteten Wert der Hemmung der NHE-Wirkung haben Wissenschaftler NHE-Inhibitoren aufgespürt. Der am besten untersuchte Inhibitor von NHE ist Amilorid, ein Guanidin-modifiziertes Pyrazin, das klinisch als Diuretikum verwendet wird. Eine Anzahl an Derivaten sind erzeugt worden, indem verschiedene Alkylsubstituierungen inkorporiert wurden. Diese Derivate wurde an den verschiedenen Isoformen von NHE, die bekannt sind und oben beschrieben wurden, außer für NHE5, für das kein bekannter Inhibitor vorhanden ist, studiert.
Die Wirkungen dieser. Inhibitoren gegen diese spezifischen Austauscher sind vorher bestimmt worden. Wie in Tabelle A unten ersichtlich wird, weist jeder Austauscher ein unterschiedliches Spektrum einer Reaktion auf jeden inhibitor auf:
Tabelle A
Siehe Counsillon et al., Molecular Pharmacology, 44, 1993, 1041–1045.
Die von Counillon et al. beschriebenen NHE-Inhibitoren weisen eine Spezifität für NHE1 auf. Sie dienen daher einem therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Zuständen, wo eine Inhibierung dieser Isoform günstig ist. Diese Inhibitoren zielen jedoch nicht auf die anderen bekannten NHE-Isoformen ab – d. h. NHE3 wird nicht betroffen –.
Wie unten gezeigt wird, wird NHE3 auf Endothelzellen exprimiert und seine Inhibierung führt zu antiangiogenen Wirkungen. Das Spektrum der NHE-Isoformen, die durch die Aminosterolverbindungen gemäß der Erfindung inhibiert werden, sind verschieden von denen, die durch Amilorid oder die Verbindungen von Counillon et al. inhibiert werden, und haben, unterschiedliche verschiedene pharmakologische Wirkungen.
Zusätzlich haben Counillon et al. auch berichtet, dass bestimmte Benzoylguanidin-Derivate weitere NHE-Isoformen inhibieren. Insbesondere 3-Methylsulfonyl-4-piperidinobenzoyl-guanidin-methansulfonat weist eine besondere Selektivität für NHE1 auf, wie in der Tabelle unten gezeigt wird. Tabelle B

NHE-Isoform K_i (μM)

NHE1 0,16

NHE2 5,0

NHE3 650
Diese Benzoylguanidin-Verbindungen, die auf der chemischen Struktur. von Amilorid beruhen, weisen die größte Spezifität für das Inhibieren von NHE1 auf, während sie eine beträchtliche Wirkung gegen NHE2 und NHE3 bewahren. Um eine pharmakologische Inhibierung von NHE1, der weit verbreiteten „Haushalts"-Isoform zu erreichen, würde eine nicht erwünschte Inaktivierung von NHE2 und NHE3 auftreten.
Fachleute haben deswegen ihre Suche nach NHE-Inhibitoren fortgesetzt, die eine selektive Wirkung gegen ein einziges spezifisches NHE aufweisen. Solche Inhibitoren würden eine präzisere Inhibierung eines Gewebes durch Stören der Wirkung des NHEs auf dessen Wachstum erlauben.
Deswegen haben die Fachleute erkannt, dass die Entwicklung von verschiedenen NHE-spezifischen Inhibitoren die Entwicklung neuer Therapien für eine ganze Anzahl an Erkrankungen oder Zuständen ermöglichen würde, einschließlich: Behandlung von Arrythmien, Behandeln und Verhindern von Herzinfarkten; Behandeln und Verhindern von Angina pectoris und ischämischer Störungen des Herzens; Behandeln und Verhindern ischämischer Störungen des peripheren und zentralen Nervensystems; Behandeln und Verhindern ischämischer Störungen der peripheren Organe und Gliedmaßen; Behandlung von Schocks; zur Verfügungstellen von anti-arteriosklerotischen Mitteln; Behandlung von diabetischen Komplikationen; Behandlung von Krebsen; Behandlung von fibrotischen Erkrankungen, einschließlich Fibrosen der Zunge, Leber und Niere; und Behandeln von Prostatahyperplasie. weitere therapeutische Ziele schließen ein: Behandlung viraler Erkrankungen, wie beispielsweise HIV, HPV und HSV; Verhinderung von bösartigen Tumoren; Verhinderung von Diabetes (d. h. Inselzellverletzung); Verhinderung vaskulärer Komplikationen beim Diabetes; Behandlung von Störungen oder nicht normaler Neovaskularisierung, z. B. makulare Degeneration, rheumatoide Arthritis, Psioriasis, Krebs, maligne Hemangiome; Verhinderung von vaskulärer Retenose; Verhinderung von vaskulären Schäden, die mit Hypertension assoziiert sind; Immunsuppression und Behandlung von vaskulären Collagenstörungen.
Inhibitoren von NHEs von Bakterien, Pilzen und Protozoen würden auch als spezifische Mikrobizide wertvoll sein. Es ist bekannt, dass alle lebenden Zellen einen NHE einer Form oder einer anderen verwenden, um das intrazelluläre Na⁺ und die pH-Homöostase zu bewahren. NHEs wurden aus zahlreichen Bakterien und Pilzen kloniert und weisen einige Sequenzhomologie gegenüber Säuger-Isoformen auf. Unter Verwendung hochspezifischer bakterieller oder pilzlicher NHEs als Ziel sollte es möglich sein, hochspezifische Inhibitoren eines solchen Austauschers zu entwickeln, d. h. einen, der besonders vorteilhaft ist, oder der keine Wirkung gegen die Säuger-Isoformen aufweist. Solche Verbindungen würden als Antibiotika eines unterschiedlichen Mechanismus nützlich sein.
Deswegen gibt es in diesem Fachgebiet einen Bedarf an spezifischen Inhibitoren von NHEs. Außerdem gibt es einen Bedarf, NHE-Inhibitoren für zahlreiche therapeutische Verwendungen zu entwickeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Außerdem ist die Erfindung auf pharmazeutische Verwendungen und Therapien ausgerichtet, die die erfindungsgemäßen Verbindungen verwenden. Die Erfindung ist auch auf neue pharmazeutische Verwendungen von Squalamin und pharmazeutisch annehmbare Salze davon ausgerichtet, die kürzlich isoliert und charakterisiert worden sind.
Diese Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Inhibieren von NHE3 ausgerichtet, bevorzugt auf ein Verfahren zum spezifischen Inhibieren dieser NHE-isoform, die in einem pathologischen Prozeß exprimiert wird, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge an Squalamin (oder seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze). Ein weiteres Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt das Inhibieren des Wachstums von Endothelzellen, insbesondere solcher neuer Kapillaren, umfassend Verabreichen einer wirksamen Menge an Squalamin.
Weitere Aspekte, Ziele und Vorteile werden aus der detaillierten Beschreibung unten klar, welche bevorzugte Eigenschaften und Ausführungsformen der Erfindung zusammen mit den anhängenden Figuren darstellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B zeigen die Inhibierung von Kaninchen-Natrium/Protonen-Austauscher Isoform 3 (NHE3) durch Squalamin. 1A ist ein Balkendiagramm der pH-Erholungsrate (y-Achse) als Funktion der wiederhergestellten Natriumion-Konzentration (X-Achse) für säurevorbeladene Zellen, durch Exposition gegenüber 40 mmol NH₄Cl wobei die Kurve, die durch "+" markiert ist, für die Kontrolle steht (kein Medikament) und die Kurve, die mit "Δ" gekennzeichnet ist für Squalamin steht. 1B zeigt den tatsächlichen internen pH-Wert (y-Achse) als Funktion der Zeit (x-Achse) nach der Zugabe von 5 μg/ml Squalamin bei nicht säurevorbeladenen Zellen.
2A zeigt den Mangel an Inhibierung von Kaninchen-Natrium/Protonen-Austauscher Isoform 1 (NHE1) durch Squalamin. 2B zeigt das Fehlen einer Inhibierung des Human-NHE1 durch Squalamin. In diesen beiden Diagrammen des internen pH-Werts vs. Zeit, steht die Kurve, die mit "o" gekennzeichnet ist für Squalamin und die mit "+" markiert ist für die Kontrolle (Zellen, die in Abwesenheit von Squalamin inkubiert wurden).
3A, 3B und 3C stellen dar, dass Endothelzellen eine größere Sensitivität gegenüber Squalamin aufweisen (Balken über 3 auf der x-Achse) als gegenüber anderen membranwirksamen Mitteln; und dass Endothelzellen sensibler gegenüber Squalamin sind als Epithelzellen und Fibroblasten. 3A steht für die Verabreichung von 1 μg/ml des Mittels gegenüber Lungenendothelzellen des Rinds, während die 3B und 3C für die Verabreichung von 10 μg/ml der membranaktiven Mittel an humane Epithelzellen bzw. humane Vorhautfibroblasten bestehen.
4A, 4B und 4C zeigen die Unterdrückung des Wachstums des murinen Melanoms durch die subkutane, intraperitoneale bzw. orale Verabreichung von Squalamin.
5 zeigt die Unterdrückung des Wachstums des humanen Melanoms 1205Lu in immunsupprimierten (RAG-1) Mäusen durch Squalamin in verschiedenen Doierungen ("o" = 10 mg/kg/d, "+" = 20 mg/kg/d, "o" = 40 mg/kg/d, d = Tag).
6 zeigt stellt die Unterdrückung des murinen Melanoms in Mäusen durch intrapiretoneale Verabreichung der Verbindung 319 dar.
7 zeigt die pharmakokinetische Beseitigung von Squalamin aus einer Maus-IV PK-Studie.
8 zeigt die pharmakokinetische Beseitigung von Squalamin aus einer Maus-IV PK-Studie.
9 ist ein HPLC-Profil von Aminosterolen, die aus der Leber des Dornhais stammen, was die Diversität dieser Verbindungen darstellt.
12 stellt dar, dass Squalamin und die Verbindung 1436 eine Synergie beim Supprimieren des Wachstums eines murinen Melanoms in Mäusen aufweisen.
13 und 14 zeigen die in vitro Supprimierung des Wachstums glatter Muskulatur aus menschlichen Herzarterien durch die Verbindung 1436 (13) und Squalamin (14), wobei die Absorption gegen die Konzentration in μl/ml aufgetragen ist.
15 ist ein erweitertes Balkendiagramm der Daten, die in den 14A und 14B gezeigt werden, beweisend, dass sowohl die Verbindung 1436 als auch Squalamin in vitro das Wachstum glatter Muskulatur aus Human-Koronararterien supprimieren.
Die 17A und 17B zeigen die Wirkung der Verbindung 353 gegenüber Squalamin auf ein humanes Melanom.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Synthese der Aminosterol-Verbindungen
Das als Squalamin bekannte Steroid ist Gegenstand des US-Patentes Nr. 5,192,756 an Zasloff et al. Diese Verbindung ist ein Breitband-Antibiotikum, das Bakterien, Pilze und Protozon umbringt. Die absolute Stereochemie für Squalamin, Verbindung 1256, wird unten gezeigt. Die gesamte chemische Synthese von Squalamin wurde 1994 berichtet.
Beispiel 1 – Herstellung von Haileber-Isolaten
Zusätzlich zu Squalamin sind mindestens 10 weitere verschiedene unterschiedliche Aminosterole aus Extrakten aus Dornhaileber gewonnen worden. Um die Aminosterole herzustellen, wurde Haileber in Methanol: Essigsäure extrahiert. Der wässrige Extrakt wurde auf C18-Kieselgel adsorbiert und mit 70% Acetonitril eluiert, und das Eluat wurde an SP-Sepadex adsorbiert und mit 1,5 mol NaCl eluiert. Das Eluat wurde auf 5 mol NaCl eingestellt, und die Steroide ausgesalzen. Das Präzipitat wurde über Celite filtriert und mit warmem Wasser, gefolgt von Methanol, eluiert. Das Eluat wurde im Volumen reduziert und auf eine 1 inch C18-Säule aufgetragen und einer Chromatographie unter Verwendung eines ansteigenden Gradienten an Acetonitril unterworfen. Die Fraktionen wurden eingesammelt, durch Verdampfen konzentriert und getrennt mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) analysiert.
Das HPLC-Profil der Aminosterole, die aus 40 kg Haileber isoliert wurden, ist in der 9 gezeigt. Die endgültige HPLC-Reinigung wurde wie von Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 1993, 1354–1358 beschrieben, durchgeführt. Die HPLC-Fraktionen wurden einzeln durch Kieselgel-Dünnschicht-Chromatographie (6 : 3 : 1 CH₂Cl : MeOH : NH₄OH) aufgelöst und durch Iodverdampfung visualisiert. Fraktion 40 stellt den eher hydrophilen Teil des Elutionsprofils dar und die Fraktion 66 stellt den, mehr hydrophoben Teil dar.
Squalamin eluiert von ungefähr Fraktion 62 beginnend und geht weiter bis ungefähr zur Fraktion 80. Zusätzlich können weitere Steroide zwischen den Fraktionen 43 bis 47 (R_f 82), 53–55 (R_f 1,02), 56–59 (R_f 0,51), 57–62 (R_f 0,96), 60–64 (R_f 0,47) und 61–66 (R_f 1,06) wie in Tabelle 1 unten beschrieben, eluiert gesehen werden.
Tabelle 1 Chemische und strukturelle Charakterisierung von Aminosterolen, die aus Haileber isoliert wurden
Die Strukturen einiger dieser Verbindungen werden unten gezeigt.
Jede dieser Einheiten wurde isoliert, gereinigt, charakterisiert und die Struktur mittels nmr wie unten beschrieben, bestimmt.
Verbindung 1360:
Diese Verbindung, das Hauptsteroid der Fraktion 2 aus der präparativen C18 RP-HPLC wurde durch starken Kationenaustausch unter Verwendung von Sulfoethylaspartamid HPLC mit einem ansteigenden NaCl-Gradienten eluiert. Die Steroidfraktionen wurden mittels Kieselgel TLC, das mit CH₂Cl : CH₃OH : NH₄OH (6 : 3 : 1) entwickelt wurde und mit Iod visualisiert wurde, untersucht. Steroidfraktionen wurden dann gepoolt und mittels C18 RP-HPLC mit einem Gradienten von ansteigendem CH₃CN in wässrigem 0,1%igem TFA rechromatographiert. Die TLC-Analyse der gereinigten Verbindung zeigte einen einzelnen spot bei R_f = 1,02 hinsichtlich Squalamin (R_f Squalamin = 1,0).
Bei anschließenden Isolierungen der Verbindung 1360 wurde keine starke Kationenaustausch-Chromatographie durchgeführt. Statt dessen wurden gepoolte Fraktionen aus der präparativen C18 RP-HPLC direkt C18 oder C8 RP-HPLC unter Verwendung eines flacheren CH₃CN-Gradienten unterworfen. Die Fraktionen wurden sowohl durch TLC wie auch für die Proben, die in D₂O gelöst wurden mittels ¹H-NMR untersucht.
Wenn sie durch FAB-MS untersucht wurde, zeigte die Verbindung typischerweise nur ein sehr schwaches (M + H)+–Signal bei 642,5 und ein intensives Fragment bei 562,5 Dalton in dem positiven Ionmodus. Im negativen Ionen-FAB-MS, (M – H)– wurde bei 640,4 beobachtet. Anschließende Elektrospray-Ionisierung (ESI – MS) Analyse wies eine starke (M + H)+ und (M – H)–-Signale auf, was mit einer ursprünglichen Masse von 641,4 zusammen mit vielen TFA-Addukten einhergeht. Dies lässt vermuten, dass die Labilität des Sulfats in der Verbindung 1360 unter FAB-Bedingungen stärker war.
Da das Mutterion im FAB-positiven Ionmodus sehr schwach in der Intensität war, wurde eine akkurate Massenbestimmung anhand des desulfierten Fragments durchgeführt. Eine akkurate Masse von 561,49325 wurde beobachtet. Eine akkurate Muttermasse von 641,49 Dalton wurde dann durch Zugeben der Masse an SO₄ ^– errechnet, welches der molekularen Formel C₃₄H₆₃N₃O₆S gleichkommt. Diese molekulare Formel mit einem zusätzlichen Sauerstoff und zwei weniger Wasserstoffen, wenn es mit Squalamin verglichen wird (C₃₄H₆₅N₃O₅S) deutete eine Verbindung, die einen Carbonylrest trägt, an.
¹H-NMR der Verbindung 1360 in D₂O (300 MHz) zeigte verschiedene Eigenschaften, die sie vom Squalamin unterscheiden. Bei der Verbindung 1360 trat die Resonanz am weitesten abwärts bei δ = 4,15 ppm auf, wies ein geteiltes Muster von mindestens 7 Signalen mit einer Integration von zwei Protonen auf; bei Squalamin war die am meisten entschützte Resonanz bei δ = 4,2 ppm, die Sulfatposition (H24), aufgelöst bei 300 MHz als ein Miltiplet aus 5 Signalen mit einer Integration von einem Proton. Bei 2,6 ppm wies die Verbindung 1360 ebenfalls ein schwach aufgelöstes Multiplet auf, was 2 Protonen zugeordnet werden kann. Es wurde vermutet, dass diese Resonanzen den Methylenproton α an einem Carbonyl zuzuordnen sind, beruhend auf dem Vergleich mit der Literatur. Beim Squalamin wies die Region von 2,2 bis 2,75 keine Resonanzen auf. Die Verbindung 1360 zeigte zwei unterschiedliche Methyldubletten, einen bei 0,95 ppm und den anderen bei 1,1 ppm; das steht dem Squalamin entgegen, in dem drei Methylgruppen als Duplets aufgesplitet sind, die in der 0,9 bis 1,05 ppm Region überlappen. Weitere Resonanz-Charakteristika waren bei den beiden Steroiden ziemlich ähnlich. In der obenliegenden Methylregion wiesen sowohl die Verbindung 1360 und Squalamin annuläre Singlet Methylsignale bei 0,85 und 0,65 ppm, Positionen 19 bzw. 18 auf. Die Resonänzen des Steroidnukleos (1,0 bis 2,1 ppm) und von Spermidin wiesen die gleichen charakteristischen Muster sowohl für die Verbindung 1360 und Squalamin auf. H7 zeigte an der Alkoholposition in dem Ring Resonanz bei 3,85 ppm bei beiden Steroiden in D₂O.
Ein COSY-Spektrum (correlated spectroscopy), das in D₂O durchgeführt wurde (300 MHz) legte das Sulfat auf der Position 27, -CH₂OSO₃- fest. Diagnostische, sich überkreuzende Muster von Spitzenwerten in der zweidimensionalen Frequenz (2D) wiesen darauf hin, dass der Dublettengipfel bei δ1,1 ppm Methyl 26 war, was dann mit H25 bei 3,05 ppm verbunden war (verdeckt unter den Polyaminresonanzen), welches wiederum der nächste Nachbar zum Komplex-Multiplett bei 4,15 ppm war.
Die Polyaminregion in der 2D Karte war mit dem Splitmuster des Spermidins konsistent, was bestätigte, dass die Verbindung 1360 das gleiche Polyamin wie Squalamin hat. Ansonsten fehlten dem 2D-Überblick in D₂O viele sich überkreuzende Signale von Spitzensignalen, insbesondere in der Steroidnukleusregion, und konnte nicht zum Etablieren der vollständigen Primärstruktur verwendet werden.
Verbindung 1360 wurde im Vakuum getrocknet und in DMSO-d6 unter Stickstoff gelöst und dann unter Stickstoff unter Verwendung von Einfrier-Auftau-Pumpzyklen versiegelt. Sowohl ID und 2D ¹H-NMR-Spektren wurden bei 300 MHz und bei 600 MHz durchgeführt. Alle Protonenresonanzen der Verbindung in DMSO waren klar (außer für die Polyaminregion (2,8 bis 3,1)) und im Hinblick auf die Zuordnungen in D₂O verlagert. Das Multiplett bei einer Position 27 war beispielsweise abwärtsauf 3,77 ppm verlagert und das H7-Proton auf 3,60 ppm verlagert. Zusätzlich trat ein neues Dublettensignal (Integration = 1H) bei 4,17 ppm auf. Diese neue Resonanz wurde als Hydroxyl an Position 7 identifiziert, beruhend auf seiner 2D-Verbindbarkeit mit H7, welches zweifellos bei 600 MHz war. Diese Resonanz konnte in D₂O aufgrund des schnellen Austauschs mit dem Lösungsmittel nicht beobachtet werden. Die 2D-Karte der Verbindung 1360 in DMSO bestätigte den Ort der Sulfatgruppe an der Position 27 erneut, die zuerst aus der 2D-COSY-Map in D₂O abgeleitet wurde.
Ein vorsichtiger Vergleich der 2D-COSY-Maps für die Verbindung 1360 und Squalamin legte das Vorhandensein eines Carbonyls an der Position 24 nahe. Das Multiplet, das bei 2,5 ppm (2,6 ppm in D₂O) mit einer Integration von zwei Protonen zentriert war, ergab starke Crosspeaks, die diese Resonanzen als H23a, b (lokalisiert alpha zum Carbonyl an Position 24) und mit den nächsten Nachbarverbindungen an H22a,b identifizierte. In einem Gesamt-Korrelations-Spektroskopie-Experiment (TOCSY) war ein neuer Crosspeak als H22/H21 erkennbar aufgrund der Propagierung der Magnetisierung entlang des „Schwanzes" des Steroids. Von 2D-COSY- und TOCSY-Mappen waren die Signale, die eine Propagierung der Magnetisierung von den Positionen 23 zu 24 und dann von 24 zu 25 erlauben würden, zusehends verloren. anders als bei dem COSY für Squalamin das die nächsten sich überlagernden Nachbar-Spitzenwerte bei 22–23–24–25–26/27 zeigt, zeigte die Verbindung 1360 eine Unterbrechung der Konnektivität, was nahe legte, dass eine funktionale Gruppe an der Position 24 den Transfer des Protonensignals blockierte. Die Struktur kann durch Reduzieren von C = O zu einem Alkohol verifiziert werden, da eine Alkoholgruppe an der Poition 24 jedoch für eine vollständige Protonenkonnektivität von den Positionen 21 bis 26 und 27 ermöglichen würde.
Das ¹³C-NMR der Verbindung 1360 in DMSO zeigte 34 Rohlenstoffsignale. Im Vergleich zu Squalamin hat die Verbindung 1360 ein Carbonyl bei 212 ppm (C24). C27 zeigte Resonanz bei 67 ppm, was in guter Übereinstimmung mit den Werten ist, die für Scymolsulfat berichtet wurden.
Verbindung 1361:
Verbindung 1361 wurde aus Haileber-Präparaten auf zwei verschiedene. Arten isoliert: zuerst wurde ein Abbauprodukt der Verbindung 1360 und anschließend als geringfügiger Aminostyrol-Bestandteil, der mit leicht schnellerer Verzögerungszeit als Squalamin fraktionierte, während der präparativen C18-RP-HPLC (Verbindung der Fraktion VI) zugegeben. Bei frühen Versuchen jedes Aminosterols bis zur Homogenität zu reinigen, wurden die gepoolten Fraktionen aus C18-RP-HPLC einer Kieselgel-Flash-Chromatographie mit CH₂Cl₂: CH₃OH : NH₄OH 6 : 3 : 1 unterworfen und die Aminosterole wurden auf TLC-Platten untersucht. Die Pools der freien Basensteroide wurden dann erneut einer C18-RP-HPLC unterworfen, unter Verwendung einer analytischen Säule. Das RP-HPLC-Elutionsprofil zeigte zwei Hauptsteroide – Verbindung 1360 und ein zweites, eher hydrophobes Steroid, das bei höherprozentigem CH₃CN eluierte. Die Labilität des Sulfats an der Position 27 in der Verbindung 1360 führte zur Bildung der Verbindung 1361, ofensichtlich durch eine base-katalysierte Eliminierung.
Kennzeichnende Eigenschaften des ¹H-Spektrums der Verbindung 1361 in D₂O (400 MHz) schließen die Abwesenheit eines Multiplets bei δ = 4,15 ppm entsprechend den Methylenprotonen an der Position 27, die das Sulfat tragen, ein. Zwei neue Singlet-Protonen bei δ = 5,95 und 6,15 in D₂O jeweils. mit Integrationswerten von 1H wurden als Vinylprotonen identifiziert. Ebenfalls im Gegensatz zum Methylduplet bei δ = 0,9 ppm in Verbindung 1360 zeigte das neue Steroid ein Singlet-Methyl bei δ = 1,8 ppm, charakteristisch für ein allyles Methyl. Die chemischen Verlagerungen der Vinylgruppen und des allylischen Methyls lassen sich günstig mit Literaturwerten vergleichen. Ansonsten zeigte das ¹H-Spektrum Eigenschaften, die charakteristisch für die Verbindung 1360 sind, einschließlich des Vorhandenseins von Methylensignalen bei δ = 2,75 ppm, alpha bis Carbonyl bei Position 24. Die Polyaminregionen wiesen Splitmuster ähnlich dem des Squalamin auf, was das Spermidinaddukt bestätigte.
Die akkurate Masse von 543,4823 wurde durch FAB-MS (positiver Ionmodus) gemessen. Die molekulare Formel C₃₄H₆₁N₃O₂ hat eine kalkulierte Masse von 543,4842, was in guter Übereinstimmung mit dem experimentell beobachteten Wert ist. Diese molekulare Formel der Verbindung 1361 ist in Übereinstimmung mit der Eliminierung von Sulfat aus dem Muttermolekül, der Verbindung 1360. Außerdem hat die molekulare Formel der Verbindung 1361 ein Doppelbindungsäquivalent (DBE) von 5,5, verglichen mit 5,0 für die Verbindung 1360 und 4,0 für die Verbindung 1356; dieser DBE-Werte stimmt mit der zusätzlichen Nicht-Sättigung der Verbindung 1361 überein.
Verbindung 1436:
Diese Verbindung und die Steroide, die unten beschrieben werden, wurden durch das Unterwerfen von Fraktionen einer präparativen C18-RP-HPLC mit niedrigeren CH₃CN-Gradienten-Bedingungen mit kleineren C18-Säulen gereinigt. Obwohl eine starke Ration-Austausch-Chromatographie und Kieselgel (SG) Flash-Chromatographie, gefolgt von RP-HPLC bei der Reinigung der Verbindungen 1360 und 1361 verwendet worden ist, wurden diese Protokolle nicht verwendet, wenn eine pH-Labilität erkannt wurde.
Obwohl die Verbindung 1436 von C18-RP-HPLC mit einer Retentionszeit eluiert, die nur, etwas schneller ist als Squalamin, weist sein R_f = 0,47 auf TLC auf eine chemische Struktur hin, die eine signifikant höhere Polarität als Squalamin unter alkalischen Bedingungen hat (CH₂Cl₂: CH₃OH : NH₄OH 6 : 3 : 1).
Das ¹H-NMR-Spektrum in D₂O (400 MHz) zeigte, dass die Polyaminregionen von denen des Squalamin verschieden sind. Sowohl das Splitmuster und die Integration ähnelte Spermin eher als Spermidin, d. h. N,N'-Bis-3-aminopropyl-1,4-butan-diamin eher als N-(3-Aminopropyl)-1,4-butandiamin. Ansonsten schien das ¹H-Spektrum dem des Squalamins identisch: ein Proton an δ = 4,15, die 24 Sulfatposition; ein Proton an δ = 3,85, entsprechend der H7-Alkoholring-Position; drei überlappende Dublets in 0,85 bis 0,95 ppm entsprechend Methyl 21 und den Methylen 26 und 27. Die Identität des Spermins wurde durch das Durchführen von COSY in D₂O gestützt, durch das Vergleichen von Crosspeakmustern, zu dem der Referenzstandard des Spermins (C₁₀H₂₆N₄) und vom Spermidin (C₇H₁₉N₃) wie auch dem von Squalamin in D₂O. Obwohl die COSY-Spektren der Aminosterole im allgemeinen keine vollständige zweidimensionale Karte der Crosspeaks in D₂O ergeben und deswegen nicht auf eine vollständige nächste Nachbarschaft-Zuordnung vertraut werden kann, erfolgte die Polyaminregion einen kompletten Satz an off-diagonalen Crosspeaks, welches zuverlässig als Signaturmuster für das Unterscheiden zwischen Spermidin und Spermin dienten.
Das ¹³C-Spektrum der Verbindung 1436 zeigte 3 zusätzliche Signale in D₂O aber ansonsten war das Kohlenstoffskelett des Steroids das gleiche wie bei Squalamin in D₂O. DEPT-135 (distortionless enhanced polarization transfer) wurde so durchgeführt, dass Methyl- und Methinsignale als positive Signale, Methylengruppen als negative Signale bezählt wurden und quaternärer Kohlenstoff null Intensität ergaben. DEPT-135 der Verbindung zeigte, dass diese drei zusätzlchen Signale Methylen waren (negativ).
Die molekulare Formel C₃₇H₇₂N₄O₅S hat eine errechnete Masse von 684,53017, was in guter Übereinstimmung mit der experimentell beobachteten akkuraten Masse von 684,5216 ist, die durch hoch auflösendes FAB-MS gemessen wurde (positiver Ionenmodus). Die zusätzliche Masse von 58 Dalton (684,5 versus 627,5 für Squalamin) war konsistent mit dem Vorhandensein einer zusätzlichen 3-Aminopropylgruppe, die dem Spermin zugeordnet wird. Desweiteren ist die gleiche Nummernmasse (even number mass) des Mutterions in Übereinstimmung mit der Stickstoffregel, welche eine Verbindung mit einer geraden Anzahl an Stickstoffen voraussagt. FAB-MS zeigte auch eine Fragmentierung in Arten von sowohl 80 und 98 Masseeinheiten weniger als die (M + H)+ Ausgangsverbindung bei 685 amu (atomic mass units; Atommasseeinheiten). Diese Fragmente stellen des Verlust des Sulfats als Folge der Dehydrierung dar, was die strukturelle Labilität des Squalamins unter FAB-MS-Bedingungen wiederspiegelt.
Die Verbindung 1436 wurde auch aus der Verbindung 1256 (Squalamin) gemäß dem folgenden Reaktionsschema synthetisiert:
In eine Rundbodenflasche wurden 95 mg (0,106 mmol) Squalamin (TFA-Salz) gegeben, welches in 800 μl wasserfreiem Methanol gelöst wurde. Zu dem Gemisch wurden 118 μl (0,848 mmol) an Triethylamin, gefolgt von 100 μl (0,106 mmol) verdünnter Acrylonitrillösung (70 μl Acrylonitril, verdünnt auf 1000 μl in Methanol) gegeben. Nach 6 Stunden wurden weitere 40 μl (0,042 mmol) der verdünnten Acrylonitrillösung zugegeben. Nach 24 Stunden zeigte TLC das Vorhandensein von Ausgangsmaterial und ein Produkt mit R_f= 0,7 (Squalamin R_f = 0,5). Die Reaktion wurde gestoppt, und das Produkt durch Flash-Chromatographie (12 : 3 : 1 bis 6 : 3 : 1 CH₂Cl₂: MeOH : NH₄OH) isoliert.
Das Produkt schien ein Gemisch in der NMR-Spektroskopie zu sein, obwohl es in der TLC homogen war. Das so erhaltene Produkt wurde in ein Hydrogenierungsgefäß zusammen mit 10 mg an Raney-Nickel, 7,3 mg an Natriumhydroxid und von 5 ml absolutem Ethanol und bei 40 psi für 17 Stunden hydrogeniert. Zwei Produkte, jetzt reparierbar (Flash-Chromatographie, 6 : 3 : 1 CH₂Cl₂ : MeOH : NH₄OH wurden auf TLC gesehen, wobei der niedrigere Spot mit der Referenz zusammenfiel (die natürlich isolierte Verbindung 1436). Dieses Produkt wurde durch Reverse-Phase-Chromatographie getrennt, um 1,5 mg des reinen Materials zu ergeben. Diese Verbindung hatte eine positive Masse (M + 1) Ion 685, und seine ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren waren identisch mit denen des natürlich isolierten Materials, was damit dessen Charakterisierung und Struktur bestätigt.
Verbindung 1437:
Dieses Steroid, das direkt nach der Verbindung 1360 in der präparativen C18 eluierte, weist ein R_f = 0,96 auf dem TLC auf, was einen mehr polaren Charakter als Squalamin selbst reflektiert. 1H-NMR (400 MHz) in D₂O schien im wesentlichen identisch zu dem von Squalamin für die Methylregion; Steroidnukleus und die Spermidinregion, und 7H an der Ring-Hydroxylposition. Verdächtigerweise war das Multiplet an δ = 4,15 ppm entsprechend einem Proton an der 24-Sulfatposition abwesend. Statt dessen wurde ein neues Signal, das bei δ = 3,95 zentriert war, beobachtet, mit der charakteristischen Gemalkohol-Kopplung und Integration für 2 Protonen.
Wenn es mit Squalamin verglichen wurde, offenbarte das ¹³C-Spektrum der Verbindung 1437 in D₂O nur. bemerkenswerte Veränderungenf. Ein neues Signal trag bei δ = 72 ppm auf, das anschließend als eine CH₂OH-Gruppe identifiziert wurde, da sein DEPT-135-Signal negativ war. In Squalamin wurde die Sulatposition als δ = 86 ppm als ein primärer Kohlenstoff identifiziert (positives DEPT-135-Signal). Bei der Verbindung 1437 jedoch verschob sich diese Kohlenstoffresonanz der Sulfatposition zu 76 ppm und ergab kein DEPT-135-Signal, wodurch es als quaternäres Kohlenstoff identifiziert wurde. Die Aminostyrolstruktur, die mit diesen Daten konsistent ist, hat das Kohlenstoffskelett von Ergostanol, mit Kohlenstoff 24; der das Sulfat trägt und Kohlenstoff 24, welcher der Alkohol ist.
FAB-MS in dem positiven Ionmodus zeigte (M + H)+ bei 658,6, der sich aufgrund des Sulfatverlustes zu 578,6 aufspaltete; die negative Ionmodusanalyse bestätigte ein pseudomolekulares Mutterion. (M – H)– bei 656,4. Die exakte Masse von 578,5264 wurde wegen der niedrigeren Intensität des Muttersignals an dem desulfierten Fragment bestimmt. Die akkurate Masse des Mutterions konnte dann als 657,526 (durch Zugeben der Masse des Sulfats) errechnet werden. Die Verbindung 1437 ist deswegen 30 Daltons größer als Squalamin, was durch einen zusätzlichen CH₂OH-Rest erklärt werden könnte.
Steroide in der Fraktion 1:
Fraktion 1 (FX1) ist die früheste Steroidfraktion, die von einer präparativen C18-RP-HPLC eluiert. Die TLC-Analyse zeigt typischerweise einen einzelnen Hauptspot mit R_f = 0,80 bis 0,84 (bezogen auf Squalamin, R_f= 1,0) und Protein, das beim TLC-Ursprung blieb. Wenn die TLC-Platten mit konzentrierten Proben (≥ 3 mg/ml) laufen gelassen wurden, waren Spuren zusätzlicher Spots mit R_f-Werten, die entweder etwas größer oder kleiner als der Hauptbestandteil waren, unterscheidbar.
Wenn sie einer hoch auflösenden RP-HPLC unter Verwendung von C18-Säulen mit 60 bis 100 Å Porengröße und sehr flachen CH₃CN-Gradienten unterworfen wurde, konnte die Fraktion I in bis zu 7 Bestandteile getrennt werden, die als I-1, I-2, I-3, I-4, I-5, I-6 und 1–7 bezeichnet wurden. Die Steroide FX1A, FX1B, FX1C, FX1D werden als mögliche Strukturen dargestellt:
Beispiel 2 – Synthese von Aminosterolen
Zusätzlich zu den obengenannten Verbindungen, die aus Haileber isoliert wurden, sind etherische Am nosterolverbindungen entwickelt worden. Zahlreiche Polyaminostyrolverbindungen, einschließlich der die in den Beispielen A bis G spezifiziert sind, werden in der US Serie Nr. 08/416,883 beschrieben, welches die US Nationale Phase der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US94/10265 ist, die am 13. September 1994 angemeldet wurde. Darin beispielhaft angegebene Verbindungen schließen die folgenden ein:
Zusätzliche Aminosterolverbindungen sind jetzt entwickelt worden. Bevorzugte Verbindungen der Erfindung schließen solche ein, die unten beispielhaft angegeben werden.
Beispiel H Herstellung der Verbindung 353:
Die oben gezeigte Verbindung wurde durch reduktives Koppeln von 573-Cholestan-3-on an Spermin (4 Äquivalente) mit Natriumcyanoborhydrid auf eine Weise hergestellt, die analog zur Herstellung der Verbindung 303 ist. Die Reinigung wurde mittels Kieselgel erreicht (Gradientenelution mit 9 : 3 : 1 bis 3 : 3 : 1 Chloroform : Methanol : Isopropylamin). Verbindung 353 wurde in ihre Hydrochloridsalze auf die gleiche Weise wie Verbindung 303 umgewandelt. β-Aminoverbindung 353: ¹H-NMR (200 MHz, CD₃OD) δ: 3,3–3,0 (m, 13H), 2,2–1,0 (m, 39H), 1,0–0,8 (m, 12H), 0,70 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 2945, 1596, 1466, 1383, MS exakte Masse (+FAB) berechnet: 573,5835; gefunden: 573,5801; berechnet für C₃₇H₇₂N₄-4HCl-H₂O: C = 58,87, H = 10,68, N = 7,42, gefunden: C = 58,49, H = 10,94, N = 7,94.
Verbindung 353 ist einsimples Addukt von Spermin und Cholestanol, das eine sehr günstige Verbindung darstellt. So kann die Verbindung 354 auf die folgende einfache Weise hergestellt werden:
Beispiel J Herstellung der Verbindungen 381 und 382:
Das Steroidmethyl 7α-Hydroxy-3-oxo-5α-cholanoat wurde gemäß dem Verfahren von Iida et al., Chem. Pharm. Bull. 41(4), 1993, 763–765 hergestellt. Dieses Steroid wurde an die Polyaminverbindung 301 mit Natriumcyanoborhydrid gekoppelt, die BOC-Gruppen wurden mit Trichloressigsäure entfernt und der Ester wurde wie in der Herstellung der Verbindung 319 hydrolysiert, außer dass Lithiumhydroxid als Base verwendet wurde. Die Reinigung wurde mittels Kieselgel erreicht (15 : 4 : 1 zu 10 : 4 : 1 Chloroform : Methanol : Isopropylamin). Die Verbindungen 381 und 382 wurden mit 2 mol Harnstoff in Methanol behandelt und verdampft (3 × 20 ml) um das Isopropylamin loszuwerden. Das Hydrochloridsalz wurde wie bei der Verbindung 303 hergestellt.
Verbindung 381, C₃₁H₅₇N₃O₃-1,7H₂O; ¹H-NMR (200 MHz, CD₃OD) δ: 3,80 (br s; 1H), 3,0–2,5 (m, 9H), 2,2–1,1 (m, 32H), 0,94 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,84 (s, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3380, 2929, 1560, 1395; MS(+FAB) berechnet: 520,4478 (M + 1); gefunden: 520,4506; Analyse berechnet für C = 67,64, H = 11,06, N = 7,63; gefunden: C = 67,64, H = 10,24, N = 7,83.
Verbindung 382, C₃₁H₅₇N₃O₃-2H₂O; ¹H-NMR (200 MHz, CD₃OD) δ: 3,80 (br s, 1H), 3,15 (br s, 1H), 3,1–2,6 (m, 8H), 2,2–1,1 (m, 32H), 0,94 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,85 (s, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3416, 2930, 1560, 1395; MS(+FAB) berechnetz 520,4478 (M + 1); gefunden: 520,4489; Analyse berechnet für C = 66,99, H = 11,06, N = 7,56; gefunden: C = 66,93, H = 10,16, N = 7,28.
Beispiel K Herstellung der Verbindung 396:
Methyl-7α-hydroxy-3-oxo-5α-cholanoat wurde an Spermin (2 Äquivalente) mit Natriumcyanoborhydrid gekoppelt, und der Ester wurde wie in der Herstellung der Verbindung 319 hydrolysiert, außer dass Lithiumhydroxid als Base verwendet wurde. Die Reinigung der Verbindung wurde mittels Kieselgel (15 : 5 : 1 bis 5 : 5 : 1 Chloroform : Methanol : Isopropylamin) erreicht. Das Hydrochloridsalz der Verbindung 396 wurde hergestellt auf die gleiche Weise wie, Verbindung 303.
Verbindung 396, C₃₅H₆₆N₄O_3-4HCl-0,5H₂O: M5(+FAB): 592 (M + 1); Analyse berechnet: C = 56,37, H = 9,60, N = 7,51; gefunden: C = 56,41; H = 9,83, N = 7,27.
Beispiel M Herstellung der Verbindung 371:
Herstellung der Verbindung 1010:
Zu einer Suspension aus Pyridiniumchloro bromat (6,85 g, 31,8 mmol) in Dichlormethan (130 ml) wurde eine Lösung der Verbindung 1006 (5,96 g, 13,3 mmol) in Dichlormethan (70 ml) hinzugegeben. Nach dem Rühren für 3 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit Ether (100 ml) verdünnt, filtriert und mit Ether gewaschen. Die organische Schicht wurde mit 5% DTatriumhydroxidlösung, 5% Salzsäurelösung, gesättigtem Natriumbicarbonat und Lauge gewaschen. Die getrocknete etherische Schicht wurde verdampft und durch Flash-Chromatographie gereinigt (6 cm, Gradienteneluierung mit 0 bis 20% Ethylacetat in Hexan) um reine Verbindung 1010 zu ergeben (5,25 g, 77% Ausbeute). ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 4,92 (m, 1H), 2,5–1,0 (m, 29H), 2,06 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,87 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,67 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1); 2949, 1736, 1468, 1372, 1244, 1023; MS(ES+): 467,8 (M + Na).
Herstellung der Verbindung 371: Das Steroid 1010 wurde an Polyamin 301 mittels Natriumcyanovorhydrid gekoppelt, die Boc-Gruppen wurden mit. Trifluoressigsäure entfernt, und das Acetat wurde wie in der Herstellung der Verbindung 319 hydrolysiert, außer dass Natriumhydroxid als Base verwendet wurde. Die Reinigung wurde auf Kieselgel erreicht (2 : 6 : 1 Benzol : Methanol : Isopropylamin). Verbindung 371 (¹H-NMR (200 MHz, CD₃OD) δ: = 3,77 (m, 1H), 2,8–2,5 (m, 9H), 2,1–1,0 (m, 35H), 0,93 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,88 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,83 (s, 3H), 0,69 (s, 3H)) wurde in ihre Hydrochloridsalze wie bei der Herstellung der Verbindung 303 umgewandelt.
Verbindung 371: IR (KBr, cm^–1): 3414, 2953, 1596, 1468, 1381, 1033; MS(+FAB): 532,4 (M + 1); Analyse berechnet für C₃₄H₆₅N₃O,3HCl.2H₂O: C = 60,29, H = 10,71, N = 6,20; gefunden: C = 60,49, H = 11,00; N = 6,47.
Beispiel O Herstellung der Verbindungen 432 und 467:
Herstellung der Vorläufer:
Herstellung der Verbindung 1016: der Methylester von Hyodeoxycholinsäure wurde durch säurekatalysierte Esterifizierung von Hyodeoxycholinsäure in Methanol hergestellt. Zu einer magnetisch gerührten 500 ml Rundbodenflasche, die absoluten Methanol (200 ml) enthält, wurde Hyodeoxycholinsäure (10 g, 25,5 mmol) und konzentrierte Schwefelsäure (5 ml) tröpfchenweise hinzugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht gerührt und dann mit Dichlormethan (250 ml) behandelt, gefolgt vom Waschen mit Natriumbicarbonatlösung (2 × 100 ml) und Lauge (100 ml). Die organische Schicht wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum getrocknet, um die Verbindung 1016 (10,1 g, 97% Ausbeute) (siehe Organic Preparations and Procedures Int. 19(2–3), 1987, 197–208) zu ergeben.
Herstellung der Verbindung 1017: Das 3,6-Dioxosterol wurde durch Oxidierung von Methylhyodeoxycholinsäure mit Pyridiniumchlorochromat hergestellt: Die Verbindung 1016 (10,1 g, 25 mmol) wurde in Dichlormethan gelöst (200 ml). Zu einer Magnetrührflasche in einem Eiswasserbad wurde Pyridiniumchlorbromat (33 g, 150 mmol) hinzugegeben. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur aufgewärmt und dann für 8 Stunden stehen gelassen, bis das Produkt der einzig sichtbare TLC-Spot war. Ein Hauptteil des Dichlormethans wurde unter Vakuum entfernt und Ethylacetat (50 ml) wurde dann in die Flasche hinzugegeben. Die Chromkruste auf dem Boden der Flasche wurde mit einem Spatel aufgebrochen, und der Inhalt der Flasche wurde durch eine Celitsäule filtriert. Das Eluat aus der Säule wurde dann unter Vakuum im Volumen reduziert und durch eine Fluorisiersäule filtriert (Eluierung mit Ethylacetat). Das Eluat wurde im Volumen wieder auf ungefähr 200 ml reduziert und Diethylether (100 ml) wurde hinzugegeben, gefolgt vom Waschen mit Natriumbicarbonatlösung (2 × 250 ml) und dann Lauge (250 ml). Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Die Gesamtausbeute an Methyl-3,6-dioxo-5β-cholan-24-oat 1017 ohne Rekristallisierung betrug 9,6 g (24 mmol, 96%) (siehe Organic Preparations and Procedures Int. 19(2–3), 1987, 197-208). Das Prokt kann aus einer Anzahl von Lösungsmitteln rekristallisiert werden (absolutes Methanol, Ethylacetat in Hexanen oder Diethylether in Hexanen), falls irgendein Chrom zurückbleibt.
Herstellung der Verbindung 1018: Das 3,6-Dioxo-5α-sterol wurde durch Ssäurekatalysierte Isomerisierung des 5β-Sterols hergestellt. Zu Methanol (250 ml) wurde das 3,6-Dioxo-5β-sterol 1017 (9,6 g, 24 mmol) und Tetrahydrofuran (25 ml) hinzugegeben, um das Styrol vollständig aufzulösen. Konzentrierte Salzsäure (12,5 ml.) wurde hinzugegeben und die Reaktion wurde über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde dann unter Vakuum entfernt, um 9,6 g (100% Ausbeute) an Methyl-3,6-dioxo-5α-cholan-24-oat 1018 hervorzubringen (siehe Organic Preparations and Procedures Int. 19(2-3), 1987, 197–208; die Autoren verwendeten eine basekatalysierte Isomerisierung unter Verwendung von Natriummethoxid anstelle von HCl).
Herstellung der Verbindung 1019: Die Monoprotektion von Methyl-3,6-dioxo-5?-cholan-24-oat 1018 kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken durchgeführt werden. Eine Technik, die das Refluxieren der Verbindung 1018 (9,6 g, 23,8 mmol) in Toluol (250 ml) mit Ethylenglykol (1,77 g, 28,5 mmol) in Gegenwart einer katalytischen p-Toluolsulfonsäure einschließt. Eine Dean Stark Fälle wurde zum Entfernen des Toluols/Wasserazeotrops verwendet. Die Reaktion wurde mittels TLC nach ungefähr 20 Minuten als vollständig angesehen. Die Reaktion wurde durch Schütten von Toluol über eine Natriumbicarbonatlösung (500 ml) und einer Eisslurry bearbeitet. Die organische Schicht wurde mit zusätzlichem Natriumbicarbonat (200 ml) und Lauge (200 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Kieselgel (4 cm × 25 cm, Eluierung mit 33% Ethylaceat in Hexan) chromatographiert. Methyl-3-dioxolan-6-oxo-5α-cholan-24-oat 1019 (8,9 g, 81%) war die zweite Bande der Säule; das einzige andere Produkt, das vorhanden war, war weniger polares Didioxolan. Folgende Techniken erzielten bessere Ergebnisse durch das Substituieren von Benzol für Toluol und das Verfolgen der Reaktion mittels TLC, was offensichtlich eine größere Selektivität erlaubt. Die Reaktion kann gestoppt werden, bevor eine signifikante Deprotektion in dem niedriger, siedenden Lösungsmittel. auftritt. Verbindung 1019: Schmelzpunkt 124–126°C; ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 4,04–3,93 (m, 4H), 3,68 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,78 (s, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 2945, 1742, 1709, 1439, 1381, 1313, 1162, 1090; MS(FD): 446 (M⁺), 388.
Herstellung der Verbindung 1020: Das 6β-Styrol wurde in einer guten Ausbeute aus dem monogeschützten Diketon durch Reduzierung mit Natriumborhydrid hergestellt. Das 3-Dioxolan-6-oxosterol 1019 (5 g, 11 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (10 ml) gelöst und zu absolutem Methanol (200 ml) und Natriumborhydrid (2,5 g, 66 mmol) hinzugegeben. Das Natriumborhydrid wurde gelöst und vor der Zugabe des Sterols für ungefähr 20 bis 30 Minuten gerührt. Nach dem Rühren über Nacht wurde das Reaktionsgemisch mit Chloroform (500 ml) behandelt und mit destilliertem Wasser (2 × 200 ml) und dann mit Lauge (100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, unter Vakuum konzentriert und durch Flash-Chromatographie auf Kieselgel (4 cm × 25 cm, Elution mit 2 : 1 : 1 Hexan : Ethylacetat : methylenchlorid) gereinigt, um Methyl-3-dioxolan-6β-hydroxy-5α-cholan-24-oat 1020 (4,35 g, 87% Ausbeute) hervorzubringen. Alternativ kann das Rohprodukt aus Benzol in Hexanen, Ethylacetat in Hexanen oder Chloroform in Hexanen (2x) rekristallisiert . werden, um ein Produkt von hoher Reinheit ohne die Notwendigkeit einer Säulen-Chromatographie zu ergeben. Verbindung 1020: Schmelzpunkt 164°C; ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 4,04–3,93 (m, 4H), 377 (br s, 1H), 3,66 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 0,92 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,69 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3533, 2937, 1726, 1438, 1379, 1255, 1191, 1096; Röntgenstreuung ergab die erwartete Struktur.
Herstellung der Verbindung 1021: Das 3-Dioxolan wurde unter Verwendung von saurer Acetonlösung entschützt. Das 3-Dioxolan-6β-hydroxystyrol 1020 (4,0 g, 8,9 mmol) wurde in Aceton gelöst (200 ml) und mit konzentrierter Salzsäurelösung (10 ml) behandelt. Nach ungefähr 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch in eine Natriumbicarbonatlösung geschüttet. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (3 × 200 ml) extrahiert, mit destilliertem Wasser (100 ml) gewaschen und dann mit Lauge (100 ml), über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum verdampft, um Methyl-3-oxo-6β-hydroxy-5α-cholan-24-oat 1021 zu ergeben (3,45 g, 100% Ausbeute): 1H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 3,8 (br m, 1H), 3,69 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,74 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3447, 2954, 1742, 1707, 1431.
Herstellung der Verbindung 432: Die Ethylendiaminvebindung wurde wie folgt hergestellt. Eine magnetisch gerührte Lösung von 50 : 50 Methanol : Tetrahydrofuran (100 ml) und Ethylendiamin (2 ml) wurde mit Essigsäure behandelt, um den pH-Wert auf ungefähr 6 zu senken. Das 3-Oxosterol 1021 (1,5 g, 3,7 mmol) wurde hinzugegeben und das Gemisch wurde für 15 Minuten gerührt. Natriumcyanoborhydrid (1 g, 16 mmol) wurde in 10 ml Methanol gelöst und in das Reaktionsgefäß hinzugegeben, und der pH-Wert wurde durch die Zugabe von Essigsäure erneut auf 6 eingestellt. Die Reaktion wurde für: eine Stunde gerührt und die Inhalte der Flasche wurden in eine pH 10,5 Carbonatpuffer-Eisaufschlämmung geschüttet (250 ml). Die Lösung wurde mit Chloroform (5 × 150 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden zusammengegeben, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert, unter Vakuum getrocknet und durch Flash-Chromatographie auf Kieselgel (4 cm × 25, cm, Eluierung mit 8 : 2 : 1 Chloroform : Methanol : Isopropylamin) gereinigt, um das β-Isomer 432 (840 mg, 49% Ausbeute) hervorzubringen. Verbindung 432: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃ΟD) δ: 3,75 (m, 1H), 3,64 (s, 3H), 1,02 (s, 3H), 0,94 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3560, 3366, 3257, 2936, 1726, 1648, 1605, 1438, 1376, 1166, 1047; MS(+FAB): 449,5 (M + 1); Analyse berechnet für C₂₇H₄₈N₂Ο₃-0,4H₂O: C = 71,13, H = 10,79, N = 6,14; gefunden: C = 71,15; H = 10,71; N = 6,28.
Herstellung der Verbindung 467: Eine Menge an Aminostyrolmethylester (1 mmol) als freie Base wurde in eine 25 ml Rundbodenflasche eingewogen. Das Aminostyrol wurde in einer minimalen Menge Tetrahydrofuran (2 ml) gelöst, mit 1 N Kaliumhydroxidlösung (10 ml) behandelt und magnetisch für eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde dann mit 1 N HCl neutralisiert und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt: Der Rest wurde in einer minimalen Menge deionisierten Wassers gelöst und auf eine Octadecyl funktionalisierte Kieselgelsäule (Aldrich, 2 × 10 cm, Gradienteneluierung mit Acetonitril in 2% Trifluoressigsäure in Wasser). Die Fraktionen, die das Aminosterol enthalten, wurden zusammengegeben und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Das Aminostyrol wurde in 0,1 N HCl gelöst und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum (2x) entfernt, um die Entfernung von Trifluoracetat zu sichern. Zu den entstehenden Hydrochloridsalzen wurde Benzol gegeben, gefolgt von der Verdampfung über Nacht, um so viel Wasser wie möglich zu entfernen.
Spermin-β-aminoisomer 467: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) ?: 3,80 (m, 1H), 1,05 (s, 3H), 0,95 (d; J = 6,5 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3406, 2944, 1718, 1637, 1458, M5(+FAB): 577,4 (M + 1); Analyse berechnet für C₃₄H₆₄N₄Ο₃-4HCl-4H₂O: C = 51,28, H = 9,64, N = 7,05; gefunden: C = 51,40, H = 8,77, N = 7,01.
Beispiel P Herstellung von Gallensäure-Methylestern 409,410, 411, 355, 356, 416, 448, 414, 415, 412, 413, 417 und 449:
Herstellung der Vorläufer: Die Methylester der Chenodeoxycholinsäure und Deoxycholinsäure, die unten strukturell dargestellt sind, wurden mit dem gleichen Verfahren hergestellt, das zur Veresterung von Hyodeoxycholinsäure in die Verbindung 1016 verwendet wurde.
Silbercarbonat-Oxidierung von Gallensäureestern, um 3-Ketosteroid herzustellen: Sowohl Chenodeoxycholin und Deoxycholinsäurederivate wurden durch reduktive Aminierungen der 3-Oxo-sterole mit den geeigneten Aminen durchgeführt. Die 3-Oxosterole wurden durch ähnliche Verfahren hergestellt. In Silbercarbonat auf Cel t wurde durch Lösen von 4 Äquivalenten Silbernitrat in deionisiertem Wasser und das Zugeben von ausreichend Celit, um zu 50% Silbercarbonat auf Celit zu. führen, hergestellt. Zu der magnetisch gerührten Lösung wurden unter kontinuierlichem heftigem Rühren 2,2 Äquivalente Natriumcarbonat hinzugegeben, das in deionisiertem Wasser gelöst war. Das erhaltene Silbercarbonat, das auf Celit präzipitierte, wurde durch einen Glasfrittentrichter filtriert, mit Tetrahydrofuran gewaschen und in einem Vakuumexikator getrocknet. Der Methylester der Gallensäure, die oxidiert werden sollte, wurde in Toluol gelöst, mit 2 Äquivalenten Silbercarbonat auf Celit behandelt, und im Rückfluß unter Verwendung eines Dean Stark Apparats für die azeotrope Entfernung von Wasser erwärmt. Die Oxidierung war in weniger als 6 Stunden für beide Styrole beendet. Das einzige Produkt in beiden Fällen war das gewünschte 3-Oxosterol. Die Lösung wurde filtriert und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das Produkt wurde in beiden Fällen leicht aus Ethylacetat in Hexanen rekristallisiert, um das 3-Oxosterol in herausragender Ausbeute (> 89% in beiden Fällen) zu ergeben.
Herstellung der Verbindungen 409 und 410: Der 3-Oxosterolmethylester der Chenodeoxycholinsäure (1,5 g, 3,7 mmol) wurde in Methanol gelöst, zu dem ein zehnfacher Überschuß an Ethylendiamin (2,5 ml) hinzugegeben wurde. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf ungefähr 6 gesenkt, ΝaBH₃CN (1 g, 15,9 mmol) in Methanol gelöst, wurde hinzugegeben und der pH-Wert wurde erneut mit Essigsäure eingestellt. Die Lösung wurde für 1 Stunde gerührt und dann aufgearbeitet und auf die gleiche Weise wie die Verbindung 431 gereinigt. Der Gesamtgehalt an Aminosterol war 58%, mit einem ungefähren Verhältnis des α-Aminoisomers zum weniger polaren β-Aminoisomer von 7 : 3. β-Aminoisomer 409: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 3,82 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,05 (br m, 1H), 1,00 (s, 3H), 0,94 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,72 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3522, 2944, 2017, 1718, 1619, 1448, 1377, 1314, 1282, 1260, 1163, 1018; MS(+FAB): 449,3 (M + 1); Analyse berechnet für C₂₇H₄₈N₂Ο₃-3,7H₂O: C = 55,13, H = 9,84, N = 4,76; gefunden: C = 55,03, H = 9,32, N = 4,78.
Herstellung der Verbindung 411: Diese Sperminverbindung wurde mit dem gleichen Verfahren wie die Ethylendiaminverbindungen hergestellt, mit der Ausnahme der folgenden Modifizierungen. 1 g des 3-Oxosterolmethylesters der Chenodeoxycholinsäure und 1 g an Spermin (ungefähr 2 Äquivalente) wurden verwendet. und die Chromatographie benötigte ein mehr polares Lösungsmittelsystem (d. h. 5 : 4 : 1 CHCl₃: Methanol : Isopropylamin). Die Gesamtausbeute an Aminostyrol betrug 48%. Das Verhältnis des α-Aminoisomers zum β-Aminoisomer 411 wurde aufgrund der unvollständigen Trennung nicht bestimmt. Verbindung 411: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) ?: 3,83 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,42 (m, 1H), 1,04 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,70 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3404, 2946, 2059, 1739, 1595, 1458, 1378, 1168, 1073, 1012, 985, 759; M5(+FAB): 591,4 (M + 1); Analyse berechnet für C₃₆H₆₆N₄Ο₃-4HCl-4H₂O: C = 51,97, H = 9,72, N = 6,93; gefunden: C = 51,65, H = 8,53, N = 6,77.
Herstellung der Verbindungen 414 und 415: Die freiem Säuren wurden aus den Methylestern wie in der Präparation des 6β-Hydroxy 433 hergestellt. α-Aminoisomer 414: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 3,83 (m, 1H), 3,06 (br m, 1H), 1,04 (s, 3H), 0,96 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 2940, 2053, 1709, 1452, 1378, 1167, 1076, 1007, 975; MS(+FAB): 435,5 (M + 1); Analyse berechnet für C₂₆H₄₆N₂O₃-2HCl-1,5H₂O: C = 58,41, H = 9,62, N = 5,24; gefunden: C = 58,24, H = 9,40, N = 5,47. α-Aminoisomer 415: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 3,83 (m, 1H), 3,47 (m, 1H), 1,06 (s, 3H), 0,95 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3488, 2935, 2054, 1709, 1593, 1499, 1450, 1246, 1168, 1077, 1022, 984; MS(+FAB): 435,5 (M + 1); Analyse berechnet für C₂₆H₄₆N₂Ο₃-2HCl-1,5H₂O: C = 58,41, H = 9,62, N = 5,24; gefunden: C = 58,59, H = 9,35, N = 5,43.
Herstellung der Verbindungen 412, 413 und 449: Diese Verbindungen wurden unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die den obengenannten analog sind.
α-Amino 412: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 3,83 (m, 1H) , 3,00 (br m, 1H), 1,04 (s, 3H), 0,96 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,74 (s, 3H; IR (KBr, cm^–1): 3413, 2942, 2061, 1710, 1594, 1460, 1377, 1167, 1074; MS(+FAB): 577,7 (M + 1); Analyse berechnet für C₃₄H₆₄N₄Ο₃-4HCl-2,5H₂O: C = 53,19, H = 9,58, N = 7,30; gefunden: C = 53,27, H = 9,47, N = 7,32.
α-Amino 413: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD), δ: 3,8 (m, 1H), 3,4 (m, 1H), 1,05 (s, 3H), 0,96 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,73 (s, 3H); MS(+FAB): 577,7 (M + 1). Deoxycholinsäurespermin 449 (α-Aminoisomer): ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 4,02, (m, 1H), 1,04 (d, J = 6 Hz, 3H), 1,00 (s, 3H), 0,75 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 2941, 1716, 1448, 1038; MS (+FAB): 577,4 (M + 1); Analyse berechnet für C₃₄H₆₄N₄O₃-4HCl-1,5H₂O: C = 54,57, H = 9,54, N = 7,47; gefunden: C = 54,31, H = 8,71, N = 7,80.
Beispiel O Herstellung der Monoaminverbindung 1364:
Herstellung der Verbindung 1002: Zu einer Suspension aus Chromtrioxid (72,6 g, 660 mmol) in Dichlormethan (1000 ml) bei –78°C wurde 3,5-Dimethylpyrazol (63,4 g, 660 mmol) hinzugegeben. Nach 20 Minuten wurde Cholesterylacetat (Verbindung 1001, 24 g, 56 mmol) hinzugegeben und das Gemisch wurde langsam auf Raumtemperatur aufgewärmt und über Nacht gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch (0°C) wurden 5 N Natriumhydroxidlösung (280 ml), hinzugegeben und das Gemisch wurde für 1 Stunde gerührt. Die organische Phase wurde mit 2 N HCl, Wasser und Lauge gewaschen. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt mittels Chromatographie (6 cm, Gradienteneluierung mit 10% bis 30% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, um ein Ausgangsmaterial (6,78 g) und die Verbindung 1002 (12,78 g, 52%) hervorzubringen. ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 5,71 (s, 1H), 4,7 (br m, 1H), 2,5–1,0 (m, 27H), 2,05 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 0,92 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 7 Hz, 6H), 0,68 (s, 3H).
Herstellung der Verbindung 1003: Eine Lösung der Verbindung 1002 (14,32 g, 32,3 mmol) in Ethylacetat (1,4 l) wurde mit Stickstoff gereinigt, mit Platin(IV)oxid (263 mg) behandelt und mit Wasserstoffgas (atmosphärisch) für 3 Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Filtrierung durch Celite wurde die Lösung verdampft und durch Flash-Chromatographie (6 cm, Gradienteneluierung mit 0 bis 20% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, um die reine Verbindung 1003 hervorzubringen (10,86 g, 76% Ausbeute). ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 4,67 (br m, 1H), 2,4–1,0 (m, 29H), 2,02 (s, 3H), 1,10 (s, 3H), 0,90 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,65 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 2950, 1730, 1707, 1471, 1373, 1264, 1032; MS (+ES): 445,7 (M + 1).
Herstellung der Verbindungen 1004 und 1005: Zu einer Lösung der Verbindung 1003 (11,62 g, 26,1 mmol) in Tetrahydrofuran (THF) (500 ml) wurden 1 mol K-Selektrid^® (80 ml, 80 mmol) in THF bei Raumtemperatur hinzugegeben. Nach 5 Stunden bei 50°C wurde das Reaktionsgemisch in einem Eisbad abgekühlt und dann mit 30% Wasserstöffperoxid (45 ml) und gesättigter Ammoniumchloridlösung (200 ml) behandelt. Die organische Phase wurde getrennt, und die wässrige Phase wurde mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert, und die zusammengefügten organischen Schichten wurden mit gesättigtem Natriumbicarbonat, Ammoniumchlorid und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Rohprodukt mittels Chromatographie (6 cm, Gradienteneluierung mit 0 bis 30% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, um die Verbindung 1004 (10,95 g, 24,5 mmol) hervorzubringen, die in Dichlormethan (200 ml) mit Dimethylaminopyridin (30,30 g, 248 mmol) gelöst wurde und mit Essigsäureanhydrid (40 ml, 424 mmol) für 19 Stunden behandelt wurde. Zu dieser Lösung wurde Methanol (150 ml) hinzugegeben und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rest wurde in Ethylacetat gelöst, mit 2 N Salzsäurelösung (3 × 150 ml), Wasser (100 ml), gesättigter Natriumcarbonatlösung (3 × 100 ml) und Lauge (2 × 100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet, verdampft und mittels Flash-Chromatographie (6 cm Gradienteneluierung mit 0 bis 20% Ethylacetat in Hexan) gereinigt, um die Verbindung 1005 (11,47 g, 90% Ausbeute) hervorzubringen. ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 4,88 (m, 1H), 4,71 (br m, 1H), 2,08 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,0–1,0 (m, 29H), 0,92–0,83 (m, 12H), 0,64 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 2954, 2867, 1730, 1468, 1367, 1257, 1025; Analyse berechnet für C₃₁H₅₂O₄: C = 76,18, H = 10,72; gefunden: C = 76,09, H = 10,56.
Herstellung der Verbindung 1006: Eine Lösung der Verbindung 1005 (10,85 g, 22,2 mmol) und Natriumcyanid (1,20 g, 24,4 mmol) in Methanol (420 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann für 10 Stunden im Rückfluß behandelt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rest wurde in Dichlormethan und Wasser gelöst, das mit 2 N Salzsäurelösung angesäuert war. Nach einer weiteren Dichlormethanextraktion wurde die organische Schicht mit Lauge gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft, um die Verbindung 1006 hervorzubringen (9,22 g, 92% Ausbeute). ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 4,89 (m, 1H), 3,62 (br m, 1H), 2,07 (s, 3H), 2,0–1,0 (m, 29H), 0,90 (d, J = 6 Hz, 3H), 0,87 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,82 (s, 3H), 0,64 (s, 3H); IR (KBr, cm^–1): 3446, 2935, 1735, 1469, 1375, 1245, 1042, 941; (MS (+ES): 470 (M + Na).
Herstellung der Verbindungen 1007, 1008 und 1009: Zu einer Lösung der Verbindung 1006 (892 mg, 2,0 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 ml) unter Stickstoff (–10 bis –5°C) wurde Triethylamin (3 ml, 22 mmol) und Methansulfonylchlorid (0,40 ml, 5,2 mmol) in Dichlormethan (4 ml) hinzugegeben. Nach 40 Minuten wurde das Gemisch in 1 N Salzsäurelösung (100 ml) geschüttet und die organische Phase wurde getrennt. Nach dem Extrahieren mit noch mehr Dichlormethan (3 × 20 ml) wurde die organische Phase mit 1 N Salzsäurelösung (30 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (30 ml) und Lauge (2 × 30 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde die Lösung verdampft, um die Verbindung 1007 hervorzubringen, die für den nächsten Schritt ohne Aufreinigung verwendet wurde.
Die rohe Verbindung 1007 wurde in Dimethylformamid (50 ml), gelöst mit Natriumazid (2,0 g, 31 mmol) behandelt und auf 100°C für 18 Stunden erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser (3 × 150 ml), verdünnt mit Dichlormethan (3 × 150 ml) extrahiert, mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und verdampft; um die Verbindung 1008 hervorzubringen, die im nächsten Schritt ohne Reinigung verwendet wurde.
Eine Lösung der Verbindung 1008 in wasserfreiem Tetrahydrofuran (60 ml) wurde mit 1 M Lithiumaluminiumhydrid (20 ml, 20 mmol) behandelt und, im Rückfluß für 5 Stunden erwärmt. Nach dem Abkühlenin einem Eisbad wurde Wasser (50 ml) zu dem Gemisch hinzugegeben und dann 2 M Natriumhydroxidlösung (200 ml). Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (3 × 150 ml) extrahiert, gefolgt vom Waschen mit Lauge (2 × 100 ml) und Wasser (50 ml). Die trockene organische Schicht wurde verdampft, um die Verbindung 1009 hervorzubringen, die ohne Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
Herstellung der Verbindung 1364: Die rohe Verbindung 1009 wurde in Methanol gelöst (40 ml) und mit 2 N Natriumhydroxidlösung (40 ml) bei 80°C für 12 Stunden behandelt. Nach der Verdampfung wurde das Wasser hinzugegeben (40 ml), gefolgt von der Extrahierung mit Dichlormethan (3 × 60 ml). Nach dem Waschen mit Lauge (3 × 50 ml) wurde die organische Schicht getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und verdampft. Die Reinigung mittels Flash-Chromatographie (2 cm Durchmesser, Elution mit 95 : 4,5 : 0,5 Dichlormethan : Methanol : Ammoniumhydroxid) ergab die Verbindung 1364 (schnelleres Eluieren; ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ: 3,4 (br m, 1H), 3,2 (m, 1H), 2,0–1,0 (m, 29H), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,80 (s, 3H), 0,68 (s, 3H). Diese Verbindung wurde in Methanol gelöst, mit einem Überschuß an 1 N Salzsäure in Ether behandelt und verdampft, um das Hydrochloridsalz zu ergeben. Verbindung 1364 (50 mg, 6% Gesamtausbeute für 4 Schritte): (MS(+FAB): 404,4 (M + 1); Analyse berechnet für C₂₇H₄₉NO-HCl-H₂O: C = 70,70, H = 11,44, N = 3,06; gefunden: C = 71,02, H = 11,33, N = 3,35.
Herstellung von Squalamin (Verbindung 1256):
Verbindung 2016 (0,0176 g, 0,032 mmol) wurde in einer Lösung konzentrierter Salzsäure in MeOH gelöst (1 ml konzentrierte Salzsäure in 10 ml MeOH). Die Lösung wurde für 15 Minuten gerührt und das Lösungsmittel in Vakuum entfernt. Zu diesem rohen, trockenen Produkt. wurden SO₃-Pyridinkomplex (0,010 g, 0,064 mmol) hinzugegeben und die Flasche wurde mit Argon gespült.
Herstellung von N-(3'-Aminipropyl)-N;N'-(di-tert.-butoxycarbonyl)-1,4-diaminobutan 301:

(a) Zu einer Lösung aus 1,4-Diaminobutan (8,6 g, 97,6 mmol) in Methanol (3,0 ml) wurde eine Lösung aus Acrylonitril (6,2 g, 116,8 mmol) in Methanol (3,0 ml) bei 0°C hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 12 Stunden gerührt. Die Verdampfung des Lösungsmittels im Vakuum ergab N-(2'-Cyanoethyl)-1,4-diaminobutan als ein farbloses Öl (11,0 g, 80%). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 1,45 (4H, br, -CH₂CH₂-), 2,46 (2H, t), 2,58 (2H, t), 2, 62 (2H, t) und 2,84 (2H, t).
(b) Zu einer Lösung aus N-(2'-Cyanoethyl)-1,4-diaminobutan (5,6 g, 40 mmol) in Dichlormethan (140 ml) wurde tröpfchenweise eine Lösung aus di-t-Butyldicarbonat (19,2 g, 88 mmol) in Dichlormethan (20 ml) bei Raumtemperatur zugegeben und das Gemisch wurde für 12 Stunden gerührt. Das organische Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Restöl wurde in Ethylacetat (150 ml) gelöst und mit gesättigter NaHCO₃ (2 × 75 ml), Wasser (2 × 75 ml), Lauge (75 ml), gelöst, getrocknet (MgSO₄), filtriert und verdampft, um das rohe viskose Öl zu erhalten: Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie auf Kieselgel gereinigt, um reines (N-(2'-Cyanoethyl)-N,N'-(di-t-butoxycarbonyl)-1,4-diaminobutan als farbloses viskoses Öl zu ergeben (8,4 g, 75%): ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 1,44 (9H, s, t-Boc), 1,46 (9H, verschmelzen (merged s), t-Boc), 2,60 (2H, m), 3,15 (2H, m), 3,28 (2A, t) und 3,45 (2H, t); CIMS (m/e): 342 (M + 1, 62,7%); 239 (100%), 186 (83,1 5).
(c) Zu einer Suspension aus Lithiumaluminiumhydrid (1,8 g, 48,9 mmol) in trockenem Ether (300 ml) wurde eine Lösung aus N-(2'-Cyanoethyl)-N,N'-(di-t-butoxycarbonyl)-1,4-diaminobutan (4,8 g, 13,8 mmol) in trockenem Ether (150 ml) tröpfchenweise bei 0°C hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten gerührt. Das überschüssige Lithiumaluminiumhydrid wurde mit 1 N NaOH bei 0°C abgelöscht und die erhaltene weiße Suspension wurde durch Celit filtriert und mit Ether gewaschen und der Etherextrakt wurde mit Lauge gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und in Vacuo verdampft, um ein Rohöl zu erhalten. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie auf Kieselgel gereinigt, um reines N-(3'-Aminopropyl)-N,N'-(di-t-butoxycarbonyl)-1,4-diaminobutan 301 (3,3 g, 68%) als farbloses Öl zu ergeben. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 1,44 (18H, s, (t-Boc)), 2,68 (2H, t), 3,05–3,25 (6H, br) und 4,65 (1H, br); CIMS (m/e): 346 (M⁺+ 1, 100%), 290 (3,1%), 246 (32,2%) zu erhalten.

Beispiel T
Herstellung der Verbindung 1436:
Diese Verbindung kann aus Squalamin durch das Kuppeln von ß-Alaninaldehyd, gefolgt von der Reduzierung wie im folgenden Schema gezeigt, leicht hergestellt werden:
Der obige Ansatz erlaubt die leichte Umwandlung von Squalamin, das in großen Mengen in Haileber vorhanden ist, in die Verbindung 1436, die in ungefähr 5% der Squalaminmenge vorhanden ist.
Zusätiliche Aminosterolverbindungen, wie solche, die in den Tabellen I und II hier gezeigt sind, können auf analoge Weisen, wie die oben angegebenen, hergestellt werden.
Therapeutische Wirkungen und Nutzen
Aminosterolverbindungen wie beispielsweise Squalamin wurden als wirksame Inhibitoren von NHE entdeckt. Beim Suchen danach, den antimikrobiellen Mechanismus der Wirkung von Squalamin aufzuklären wurde gezeigt, dass Squalamin vorteilhaft eine spezifische NHE-Isoform inhibiert – die Verbindung inhibiert NHE3, aber nicht NHE1. Zusätzlich wurde bestimmt, dass Squalamin den Austauscher durch einen speziellen Mechanismus inhibiert. Die speziellen und vorteilhaften Wirkungen und Nutzen von Squalamin und weiteren Aminosterolen werden aus den Ergebnissen der experimentellen Tests, die unten beschrieben werden, offensichtlich.
Spezifische Inhibierung von NHE3:
Um die Spezifität von Squalamin's Inhibierung von NHEs zu bestimmen, wurde Squalamin in einer Zellinie untersucht, die entweder humanes NHE1 oder humanes NHE3 exprimiert, indem den Verfahren gefolgt wurde, die von Tse et al., J. Biol. Chem. 268, 1993, 11917–11924 ausgeführt wurden. Die inneren pH-Werte wurden entweder nach der Säurebeladung oder in Abwesenheit einer Säurebeladungsforderung gemessen, wobei die Ergebnisse in den 1A und 1B gezeigt werden.
Genauer gesagt wurden PS120 Fibroblasten, die mit dem Kaninchen-NHE3 transfiziert waren, in supplementierten Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium wie von Levine et al., J. Biol. Chem. 268, 1993, 25527–25535 beschrieben, gezüchtet. Transfizierte Zellen, die auf Glasdeckgläschen gezüchtet wurden, wurden dann auf die internen pH-Wert-Veränderungen nach der Behandlung mit 5 μg/ml Squalamin unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs BCECF-AM (2',7'-Bis(carboxyethyl)-5(6)carboxyfluorescein-acetoxymethylester) als pH-Indikator wie von Levine et al. beschrieben, untersucht. Für Säure-vorbeladene Zellen war die Rate der pH-Wert-Erholung als Funktion der wiederhergestellten extrazellulären Natriumion-Konzentration gegenüber einer Exposition von 40 mmol NH₄Cl überwacht, wobei die Ergebnisse in der 1A gezeigt werden. Für nicht Säure-vorbeladene Zellen wurde der tatsächliche interne pH-Wert als Funktion der Zeit, gefolgt von der Zugabe von Squalamin überwacht, welcher die Ergebnisse die in 1B dargestellt sind, zeigt.
Wie in den 1A und 1B gezeigt wird, inhibierte Squalamin NHE3 sowohl im Hinblick auf die Protonen-Konzentration sowohl des K_m und des V_max-Niveaus. Im Gegensatz dazu betrafen die vorhandenen Mittel wie beispielsweise Amilorid, nur V_max.
Das bedeutet, dass das Am nosterol Squalamin nicht nur die absolute Anzahl an Protonen, die durch die Zelle sezerniert werden können (den V_max-Effekt) reduziert, sondern auch die Zelle dazu zwingt, auf einen niedrigeren pH-Wert in Gegenwart dieses Inhibitors (dem K_m-Effekt) zu fallen. Als Folge daraus wird der Natrium/Protonen-Austauscher stärker durch Squalamin inaktiviert als durch Amilorid.
Im Gegensatz zu seinen Wirkungen auf NHE3, die in den 1A und 1B gezeigt sind, zeigte Squalamin keine inhibitorische Wirkung gegenüber humanem NHE1 oder Kaninchen-NHE1, wie in den 2A und 2B gezeigt wird. PS120 Fibroblasten, die mit Kaninchen- oder menschlichem NHE1 transfiziert waren, wurden wie oben beschrieben gezüchtet. Transfizierte Zellen, die Kaninchen-NHE1 (2A) oder humanen NHE1 exprimieren (2B), die auf Glas der Gläschen gezüchtet wurden, wurden dann für innere pH-Wertveränderungen nach der Behandlung mit 5 μg/ml Squalamin untersucht, unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs BCECF-AM bei Zellen, die durch Exposition gegenüber 40 mmol NH₄Cl Säure vorbeladen wurden. Die pH-Erholungsrate als Funktion der wiederhergestellten extrazellulären Natriumionen-Konzentration wurde überwacht.
Zusätzlich wurde der Ruhe-pH-Wert dieser Zellen ebenfalls inhibiert, wie in 1A demonstriert wird. Deswegen verursacht der Effekt von Squalamin auf den Protonen-Austausch in der Zelle auf einen niedrigeren pH-Wert in seiner Gegenwart zu fallen, bevor die Aktivierung der Pumpe auftritt.
Durch diese Studien ist Squalamin als distinkter Inhibitor mit einer Spezifität für NHE3 gegenüber NHE entdeckt worden. Außerdem wurde Squalamin als Inhibitor identifiziert, der eine Zelle dazu bringt, auf einen niedrigeren pH-Wert zu sinken, bevor die Pumpe aktiviert wird. Die Ergebnisse die in den 1A, 1B, 2A und 2B gezeigt werden beweisen, dass Squalamin eine einzigartige NHE-Spezifität aufweist.
Die Expression von NHE3:
So ein spezifischer Effekt auf NHE3 ist aus mehreren. Gründen wichtig. NHE3, der auf den apikalen Oberflächen einer limitierten Anzahl von Zelltypen vorhanden ist, ist spezialisierter als NHE1. Eine Zelle von besonderem therapeutischem Interesse ist die Endothelzelle.
Unter Verwendung der PCR ist die Expression dieses Antiporters sowohl in menschlichen mikrovaskulären und menschlichen Lungenarterien Endothelzellen jetzt bewiesen worden. Gesamt-RNA wurde aus primären humanen Lungenarterien-Endothelzellen (HPAEC) aus der humanen Melanom-Zellinie wm1617 und aus humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC) mit einer Modifizierung des Verfahrens von Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 1987, 156, isoliert und dann wurden sie mit MMLV Reverse Transkriptase unter Verwendung eines Erststrang-cDNA-Synthesekits (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) revers transkripiert. Gesamt-RNA aus dem menschlichen Dünndarm, die von Clontech erhälten wurde, wurde ebenfalls auf die gleiche Weise revers transkripiert.
Ungefähr 80 ng des cDNA-Produkts wurden dann in einer 50 μl Reaktionsmischung unter Verwendung von Reagenzien aus dem AmpliTaq DNA Polymerase-Kit amplifiziert (Perkin Elmer, Norwalk, CT) und enthaltend 400 ng jedes der beiden Oligonukleotide, die für humanes NHE3 spezifisch sind (B13: 5'-CATCTGGACCTGGAACACG-3'; B14: 5'-CGTAGCTGATGGCATCCTTC-3') unter Verwendung eines Thermozyklus von 5', 94°C und dann 38 Zyklen von 50'', 94°C, 1', 57°C, 2', 71°C und zum Schluß 10', 72°C bevor auf 4°C abgekühlt wurde 20 μl dieser Probe wurden auf einem 1,7%igen Agarosegel analysiert. Die etwartete NHE3-PCR-Bande von ungefähr 550 Basenpaaren wurde in den meisten Fällen gesehen, wie in Tabelle 2 unten gezeigt wird.
1 μl jeder PCR-Reaktion wurde dann durch eine "nested" PCR in einer 50 μl Reaktionsmischung unter Verwendung zweier interner Primer (B15: 5'-CTGGTCTTCATCTCCGTGTAC-3'; B16: 5'-AGCTCGTGGAA-GACATTCAGG) weiter mit einem 5', 94°C Programm des thermischen Zyklierens, dann 35 Zyklen zu 50'', 94°C, 1', 58°C, 2', 71°C und Final 10', 72°C vor dem Abkühlen auf 4°C analysiert. Ungefähr 20 μl dieser Reaktion wurden auf einem weiteren 1,7%igen Agarosegel analysiert. Die erwartete NHE3 PCR-Bande von ungefähr 490 Basenpaaren wurden in allen Fällen wie in der Tabelle unten angemerkt, gesehen. Die DNA-Sequenzierung der HPAEC und HMVEC nested PCR-Banden von beiden Enden aus bestätigte, dass sie die erwarteten Human-NHE3-Sequenzen hatten.
Tabelle 2 Expression von humanem NHE3 inhumanen Endothelzellinien
Dadurch werden eine Vielzahl an Ereignissen, die von Endothelzell-Wachstum/formabhängen durch Squalamin und funktionell verwandte Verbindungen inkibiert. Die experimentellen Tests, die unten diskutiert werden, wurden durchgeführt, um die Wirkungen dieses Aminosterols zu untersuchen.
Wachstumsinhibierung von Endothelzellen, Fibroblasten und Epithelzellen in vitro:
Wenn nicht transformierte humane Zellen in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen an Squalamin gezüchtet werden, weisen die Endothelzellen eine besondere Sensitivität gegenüber Squalamin auf, wie durch das folgende Experiment gezeigt wird. Rinder-Lungen-Endothelzellen, die menschliche epitheliale Zellinie MCF 10A und menschliche Vorhautfibroblasten wurden in Gegenwart von 12 verschiedenen membranwirksamen Mitteln, einschließlich Peptiden und Squalamin inkubiert.
Genauer gesagt, wurden Rinder-Lungen-Endothelzellen, menschliche epitheliale Zellinie MCF 10A und menschliche Vorhautfibroblasten in Gegenwart der folgenden 12 membranaktiven Mittel inkubiert: (1) RGD[KIAGKIA]₃-NH₂; (2) d-(KKLLKKL]₂-NH₂; (3) Squalamin; (4) SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR; (5) FLGGLIKIVPAMICAVTKKC; (6) Magainin 2; (7) PGLA; (8) GFASFLGKALKAALKIGANLLGGTPQQ; (9) PR-39; (10) 1-[KKLLKKL]₂-NH₂; (11) Cecropin B und (12) [KIAGKIA]₃-NH₂. Das Zellwachstum wurde durch Absorption bei 600 nm gemessen. Die Ergebnisse werden in den 3A bis 3C gezeigt.
Wie aus der 3A ersichtlich wird, inhibierte Squalamin das Wachstum der Rinder-Lungenarterien-Endothelzellen (BPE) bei 1 μg/ml. Im Gegensatz dazu wies es bei 10 μg/ml keine Wirkung auf das Wachstum weiter epithelialer (3B) oder Fibroblasten-(3C)-Linien auf. Peptide, die das Wachstum von epithelialen Zellen jedoch inhibierten, wiesen keine Wirkung auf BPE auf. Das bedeutet, dass endotheliale Zellen gegenüber Squalam n sensitiver sind als Fibroblasten oder epitheliale Zellen.
Inhibierung einer Tubusbildung von Endothelzellen in vitro:
Endothelzellen haben die Fähigkeit, in vitro tubuläre Aggregate zu bilden, die Kapillaren in verschiedenen Frühstadien der Bildung ähneln. Diese Umwandlung tritt unter relativ spezifischen Bedingungen auf, in denen essentielle Wachstumsfaktoren zusammen mit einem wirksamen Substrat zur Verfügung gestellt werden. Es ist gezeigt worden, dass sowohl die Interaktion von Wachstumsfaktoren mit der Endothelzelle und seine Anheftung an ein Substrat NHE aktivieren. Die Aktivierung dieses Austauschers ist wie man glaubt; für anschließende morphologische Veränderungen der Endothelzelle in eine multizelluläre tubuläre Struktur notwendig.
Um die Wirkung der Verbindungen der nabelartigen Strukturen, die durch menschliche-mikrovaskuläre Zellen gebildet werden zu untersuchen, wenn diese in Gegenwart von VBGF (Vascular Endothelial Growth Factor) und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor auf einer Collagenmatrix ausplattiert wurden, wurde ein Standard-Tubusbildungstest durchgeführt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle unten gezeigt. Tabelle 3 Wirkung verschiedener Aminosterole auf Endothel--Tubusbildung
Anmerkung:

+: Inhibierung der Angiogenese;
–: keine Inhibierung der Angiogenese;
T: Toxisch;
•: Abrundung der Zelle bei 10 μg/ml.

Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, inhibiert Squalamin die Nabelbildung bei ungefähr 0,1 μg/ml, verglichen mit Fumagillin, das eine vergleichbare Wirkung bei 10 μg/ml aufweist. Bei diesen Konzentrationen scheint Squalamin die Überlebensfähigkeit der Zelle oder deren Proliferation nicht stark zu beeinflussen: Diese Eigenschaft in vitro korreliert grob mit der antiangiogenen Wirkung in komplexeren in vivo Modellen (siehe Goto et al., Lab Investigation 69, 1993, 508–518).
LPS-induzierte Neutrophilen-Adhärenz an menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen:
Wenn Endothelzellen bestimmten Stimuli, einschließlich Lipopolysaccharid (LPS) und bestimmten Zytokinen ausgesetzt werden, werden spezifische Adhäsionsmoleküle auf der Plasmamembran induziert, die die Bindung von Leukozyten fördern. Diese Leukozyten-Endothelzellen-Interaktionen sind vermutlich notwendig, um Leukozyten an Stellen bakterieller Invasion zu bringen, und die Extravasierung dieser Leukozyten aus der Kapillare in das umgebende Gewebe zu erleichtern. Leukozyten-Adhäsions-Moleküle schließen die Selektine und ICAM-1 ein.
Um zu bestimmen, ob Squalamin diese besondere Endothelzell-Funktion inhibiert, wurden Standard-Adhäsions-Assays wie in Gamble et al., J. Imm. Methods 109, 1988, 175–184 ausgeführt, durchgeführt. Die Expression der Zelloberflächen-Liganden in einem auf Endothel basierenden System zeigte, dass es die Adhärenz von Granulozyten in einem System unter Verwendung von menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen bewirkt, die gereinigten Neutrophilen und Induktoren von Zelloberflächenliganden wie beispielsweise LPS (100 ng/ml) und TNF-α (40 ng/ml). In diesen Experimenten wurden ungefähr 2 × 10⁵ menschliche Nabelschnurvenenzellen (Passage 2 bis 6) pro Kavität aussortiert. Die Zellen wurden über Nacht in einem serumfreien Medium gezüchtet. Für die Induktion wurde entweder TNF-α (40 ng/ml) zu den Endothelzellen für 6 Stunden vor der Zugabe von Neutrophilen hinzugegeben oder LPS (100 ng/ml) wurde für 4 bis 6 Stunden hinzugegeben. Es wurde herausgefunden, dass die LPS-Reaktion durch Zugeben von 1% FBS in die Kavitäten anstieg, um eine Quelle für LPS bindendes Protein zur Verfügung zu stellen. Nach der Aktivierung der Endothelzellen wurden ungefähr 50 × 10⁶-neutrophile Zellen pro Kavität hinzugegeben. Die Platten wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur leicht geschwenkt, gefolgt von der Entfernung des Mediums und dem Waschen in serumfreiem Medium für 3male und dann dem Fotografieren jeder Kavität. Experimente, um die Wirkungen von Squalamin zu testen, wurden durch Zugeben von Squalamin zu 10 μg, 1,0 μg oder 0,1 μg zum Zeitpunkt der Zugabe von LPS oder TNF-α durchgeführt. Eine zweite Wiederholungsdosis von Squalamin wurde zum Zeitpunkt der Zugabe von Neutrophilen hinzugegeben. Ein monoklonaler Antikörper gegen ICAM-1 war eine positive Kontrolle.
Bei der Verwendung von drei verschiedenen Personen gab es keine Inhibierung durch Squalamin auf die Adhärenz der neutrophilen Zellen unter Verwendung von aktivierten Ηuman-Endothelzellen. Es gab ungefähr 50% Inhibition der Adhärenz, wenn 40 μg/ml eines monoklonalen Antikörpers gegen ICAM-1 vor der Zugabe von Neutrophilen hinzugegeben wurde.
Diese Ergebnisse deuten an, dass die Inhibierung des endothelen NHEs durch Squalamin sowohl das Wachstum und die Kapillarbildung in vitro beeinflusst, aber nicht alle Signaltransduktionswege in dieser Zelle inhibiert. Das heißt, dass bestimmte „Haushalts"-Funktionen wie beispielsweise die Fähigkeit der Endothelzellen, Leukozyten an die Stelle einer Infektion anzulocken, nicht durch Squalamin gestört werden sollte. Das beweist, dass Squalamin zur Inhibierung von der Angiogenese verwendet werden kann aber nicht bestimmte wichtige Endothelzell-Funktionen angerweitig zerstört, wie beispielsweise die Leukozyten-Rekrutierung an Stellen einer Infektion oder Entzündung.
Anti-proliferative Wirkung:
Das Chorioallantoin-Membran-Modell:
Unter Verwendung des klassischen Chorioallantoin-Membran-Modells ist herausgefunden worden, dass sq ein Inhibitor des Kapillarwachstums ist. Die wachsenden Kapillare in den Chorioallantoin-Membran-Modellen (CAM-Modell) wurden als System verwendet, in dem die wirkung von Mitteln untersucht wurde hinsichtlich des Potentials, das Wachstum neuer Gefäße zu inhibieren. Die Neovaskularisierung tritt am aggressivsten innerhalb der ersten Woche nach der embryonalen Entwicklung auf. Danach ist das Kapillarwachstum prinzipiell als „Verlängerung" statt als „de novo" Bildung charakterisiert.
In dem Standardassay werden Mittel lokal auf eine Region eines Embryos aufgetragen, über bei dem eine Neovaskularisierung auftreten wird. Die Mittel werden auf ihre Fähigkeit, diesen Prozeß zu inhibieren, untersucht, wie durch die Untersuchung mit dem Auge über 7 Tage nach der Anwendung bewertet wird. Mittel, die das Gefäßwachstum während der Dauer der de novo Kapillarbildung stören aber nicht mit folgendem Kapillarwachstum interferieren, werden im allgemeinen als "spezifische" Inhibitoren einer Neovaskularisierung betrachtet, was verschieden von den weniger spezifischen toxischen Substanzen ist. Der verwendete Test wird in „Details in Auerbach et al., Pharm. Ther. 51, 1991, 1–11 beschrieben. Die Ergebnisse werden unten tabellarisch gezeigt.
Tabelle 4 Inhibierung des Kapillarwachstums im CAM-Modell
Wie aus der Tabelle 4 ersichtlich wird, führte das Auftragen von nur 0,65 μg Squalamin auf ein 3-Tage-CAM zur Inhibierung der CAM-Gefäß Neovaskularisierung. Im Gegensatz dazu übte das Auftragen von zehnmal mehr der Squalaminmenge auf ein 13 Tage altes Hühnchen keine inhibitorische Wirkung aus.
Das bedeutet, dass Squalamin in einem klassischen Angiogenesetest eine starke aber spezifische inhibitorische Aktivität aufwies, gleich der Leistungsfähigkeit der aktivsten Verbindungen, die bis heute in der Literatur beschrieben sind. Die Wirkung ist mit einer Unterdrückung der Neovaskularisierung statt einer toxischen Inhibierung des Kapillarwachstums in Übereinstimmung.
Die Vitall-in-Kapillaren eines 3- bis 5tägigen Hühner-Embryo-Modells:
Im Verlauf der Untersuchung von Squalamin im „klassischen" Hühner-Chorioallantoin-Membran-Modell wurde bemerkt, dass dieses Steroid einen dramatischen und schnellen Effekt auf die Kapillargefäß-Integrität in den 3 bis 5 Tage alten Hühnerembryonen ausübte. Unter Verwendung von Hühner-Embryo-Vitellin-Kapillaren-Tests wurden Verbindungen auf ihre Fähigkeit, eine kapillare Reaktion. zu induzieren, getestet. Jede Verbindung wurde in 0,1 ml 15% Ficol 400 und PBS auf den Embryo aufgetragen und die vaskuläre Regression wurde nach 60 Minuten untersucht.
Es wurde gefunden, dass das Squalamin die Vitellin-Kapillaren von 3 bis 5 Tage. alten Hühner-Embryonen zerstört. Der 3 Tage alte Hühnerembryo besteht aus einer Embryo-Scheibe, aus der zahlreiche Gefäße entspringen und zurückkehren, die eine „8"-förmige Struktur bilden – der Embryo im Zentrum und vaskuläre Schlaufen, die über beide Pole auswärts ausgestreckt sind.
Die Anwendung von Squalamin auf die embryonale Struktur (0,1 ml in den 15% Ficol in PBS) führte zum fortschreitenden Ablösen der Vitellingefäße, wobei die dünnsten Kapillaren die ersten waren, die diese Veränderung aufwiesen. Nach einer Ruheperiode von ungefähr 15 Minuten wurde eine Verengung des Durchgangs zwischen den Kapillaren und den sekundären Gefäßen, im allgemeinen auf der „venösen" Seite, beobachtet. Der kontinuierliche pulsartige Blutfluß dauerte an, was zum „Anschwellen" der Blindröhre führte, gefolgt von einem Abschnüren der verbleibenden Verbindung und der Bildung eines eingeschlossenen vaskulären Sacks, der einer „Blutinsel" ähnelte. Dieser Vorgang ging weiter bis nur die größten Gefäße intakt blieben. Das Embryo-Herz schlug heftig weiter. Es gab keine Zeichen von Hämorrhagie, was die Integrität der Kapillarstruktur reflektiert. Zusätzlich wurde keine offensichtliche Zerstörung der zirkulierenden roten Zellen. mikroskopisch beobachtet, was das Nichtvorhandensein einer Hämolyse beweist.
Unter Verwendung dieses Tests, der zu zeigen scheint, was für gewöhnlich als kapillare „Regression" bezeichnet wird; daß eine minimale Konzentration an Squalamin benötigt wird, um eine Wirkung innerhalb von 60 Minutenzu beobachten. Die Ergebnisse werden in der Tabelle unten zusammengefasst. Tabelle 5 Auswirkung der verschiedenen Aminosterole im Hühner-Embryo Vitellin Kapillar-Regressionstest
Anmerkungen:

+: vaskuläre Reaktivität
0: keine vaskuläre Reaktivität
+/–: gleichmäßige Reaktivität

Wie aus Tabelle 5 zu sehen ist, kann 0,1 bis 0,01 μg Squalamin in 0,1 ml Medium Veränderungen auslösen. Verbindungen mit verschiedenen Aktivitätsbereichen wurden gefunden, wobei Squalamin, Verbindung 319 und Verbindung 415 besonders wirksam sind. Dieses Experiment zeigt, dass die getesteten Steroide die Kapillaren über einen Zeitintervall, der einige Minuten beträgt, dramatisch restrukturieren können. Die Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass Squalamin diese Wirkung durch die Inhibierung von NHE ausübt.
Kaulquappentest:
Ein neu entwickelter Test, bei dem Kaulquappen verwendet werden, bevorzugt Xenopus laevis Stadien 59–60, wurde verwendet, um die Wirkung einer Verbindung durch Überwachen des Kapillarverschlusses im Kaulquappenschwanz zu studieren. Tiere in diesen Stadien wurden verwendet, da sie die Periode der Umwandlung zwischen Metamorphose darstellen, wobei die Tiere sowohl embryonale wie auch adulte Gewebe besitzen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen betreffen die Form, Lebensfähigkeit und Integrität der embryonalen Gewebe, während sie die adulten Gewebe nicht beeinflussen, was ein aussagekräftiges hochspezifisches Mittel zur Durchmusterung bietet. Substanzen, die beispielsweise alle Debitelien des Tieres, sowohl adult wie auch embryonal, können als toxisch angesehen werden. Substanzen, die nur die embryonalen Gewebe zerstören, weisen eine sehr einzigartige Spezifität auf.
In diesem Test werden Kaulquappen in Petrischalen getan, die eine Lösung der Testverbindung in destilliertem Wasser enthalten, bevorzugt ungefähr 100 ml. Die bevorzugte Konzentration der Testverbindung reicht von ungefähr 1 μg/ml bis ungefähr 10 μg/ml. Das Volumen der Flüssigkeit ist ausreichend für das Tier, um frei herumzuschwimmen und aus der Lösung zu trinken. Auf diese weise rührt der beobachtete Effekt von der oralen Absorption her und von der folgenden systemischen Verteilung des Mittels. Falls das Volumen der Flüssigkeit nicht ausreicht, um eine orale Aufnahme zu erlauben, würden die Auswirkungen, die beobachtet werden, aus der Absorption durch das Oberflächen-Epithel stammen. Auf diese Weise kann ein einfacher Test zur Identifizierung führen, ob eine Verbindung Eigenschaften einer oralen Zugänglichkeit hat.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Tests kann eine Lösung einer Verbindung in Wasser direkt in das Abdomen des Tieres unter Verwendung von Standardtechniken injiziert werden. Die Konzentration der Verbindung von ungefähr 0,05 mg/ml bis ungeführ 0,5 mg/ml in ungefähr 0,05 ml Wasser werden bevorzugt.
Nach einer Zeitdauer, typischerweise ungefähr 60 Minuten, wird der Verschlug des Blutflusses durch die Kapillaren im Schwanz der Kaulquappe unter einem umgekehrten Mikroskop bei einer Vergrößerung von ungefähr 100mal beobachtet.
Wenn die Kaulquappen in destilliertes Wasser das Squalamin in einer Konzentration von 10 μg/ml enthält, getan wurden, wurde beobachtet, dass der Blutfluß durch die Kapillaren des Schwanzes abgebrochen ist. Der Vorgang trat von caudaler in cranialer Richtung auf. Der Blutfluß innerhalb der am meisten distal gelegenen Gefäße hörte anfänglich auf, gefolgt von den größeren Gefäßen. Während dieses Zeitraums wurde beobachtet, dass das kardiovaskuläre System ansonsten robust ist, wie durch den fortgesetzten Herzschlag, die pulsartige Ausdehnung der großen Gefäße und am seltensten einem unveränderten Blutfluß durch die feinen Kapillaren der Hände und Füße bewiesen wurde. Das bedeutet, dass eine selektive Beendigung des Blutflusses in lokalisierten Regionen gesehen wurde. Wenn die Tiere für einige Tage in Squalamin gelassen werden, kam es zu einer verstärkten Regression der am meisten distalen Teile des Schwanzes, wie auch der peripheren Aspekte der Schwanzflosse werden beobachtet, was den Regionen des Tiers entspricht, die durch die verschlossene Vaskulatur perfudiert werden.
Diese Wirkung resultiert augenscheinlich aus einer selektiven Änderung im restlichen Durchmesser der Schwanzkapillaren. Die Inhibierung von Endothelzellen NHE führt offensichtlich zu einer Veränderung der Form der Zelle, die die Kapillare ausmacht, was zu einem verringerten Fluß führt. Das fortgesetzte funktionieren der Kapillarbetten in den „adulten" Teilen der Kaulquappe (die Gliedmaßen) deutet darauf hin, dass Squalamin für bestimmte Kapillaren selektiv ist. Aus den Ergebnissen des Kaulquappenschwanz-Kapillar-Verschlußtests wurden die Verbindung 319, Squalamin und die Verbindung 1436 als Auslöser eines allgemeinen vaskulären Verschlusseffekts ausgemacht.
Unterdrückung des Wächstums von Melanom:
Unterdrückung des Wachstums von Melanomen in Mäusen, durch orale und parenterale Verabreichungswege:
Das Wachstum von B16-Melanomen in C57B-Mäusen hängt von der Neovaskularisierung ab. Daher ist dies ein anerkanntes Modell zum Untersuchen des Einflusses von Inhibitoren auf die Angiogenese auf das Wachstum des Krebses.
Unter Verwendung des Wachstums von B16-Melanomazellen in C57B-Mäusen, einem anerkannten Modell für die Untersuchung von Inhibitoren der Angiogenese auf das Wachstum von Krebsen, wurden die Auswirkungen der subkutanen, intraperitonealen und oralen Verabreichung von Squalamin untersucht. Ein Inokulum von B16-Melanomzellen wurde subkutan auf den Rücken der C57B-Mäuse implantiert, was zum progressiven Wachstum von Melanomläsionen über 30 bis 40 Tage führte, wie in den 4A bis 4C gezeigt wird.
In diesem Modell wurden wenig Hinweise von Metastasen mit oder ohne Behandlung bei chemotherapeutischen Mitteln beobachtet. Wenn Tiere mit Squalamin entweder subkutan (4A), intraperitoneal (4B) oder oral (4C) behandelt wurden, wurde eine dosisabhängige Unterdrückung des Tumorvolumens beobachtet. Die Messung sowohl des Körpergewichts und der hämatologischen Parameter zeigte keine signifikante Unterdrückung. Da Squalamin selbst eine minimale zytostatische Wirkung gegen B16 in Kultur zeigt, außer bei sehr hohen Konzentrationen, wurde diese Antwort des Tumors aus sekundär aufgrund der Störung mit der Kapillarentwicklung interpretiert.
Unterdrückung des Wachstums humaner Melanom in immunsupprimierten Mäusen:
Wie aus 5 ersichtlich ist, entwickelt sich das Melanom 1205Lu aggressiv in RAG-1-Mäusen nach der Implantierung. Es wurde herausgefunden, dass Squalamin das Wachstum von Melanom 1205Lu in RAG-1-Mäusen in einer dosisabhängigen Weise unterdrückt.
Squalamin wurde verabreicht, nachdem die Tumore ungefähr 0,1 ml erreicht haben, und eine klare Unterdrückung des Tumorwachstums in einer dosisabhängigen Weise wurde herausgefunden, wie durch die 5 bewiesen. Nach der Beendigung der Behandlung setzte sich das Tumorwachstum in einer Rate fort; die ähnlich den unbehandelten Kontrollen war, was vermuten lässt, dass die Auswirkung von Squalamin bei dieser Versuchsanordnung reversibel ist.
Unterdrückung der Tumor-induzierten Cornea-Neovaskularisierung in Kaninchen:
Die Implantierung des VX2-Karzinoms in die Kaninchencornea führte zur Induzierung von neuen Blutgefäßen innerhalb einiger Tage (Tamargo et al., Cancer Research 51, 1991, 672–675). Man glaubt, dass dieses Karzinom Wachstumsfaktoren verbirgt, die neues Blutgefäßwachstum stimulieren. Dadurch ist dieses Modell andeutungsweise in vivo ein Beweis für eine therapeutische Nützlichkeit bei der Behandlung von pathologischen Störungen der Vaskularisierung, einschließlich der metastatischen Ausbreitung von Tumoren, der diabetischen Retinopathie, der makulären Degeneration und der rheumatoiden Arthritis.
Dieses Experiment folgte dem Veröffenflichungsprotokoll – ein Tumor war neben einem Polymer, das eine Konzentration des zu untersuchenden Mittels enthält, implantiert. Das Polymer setzt das Mittel langsam in die unmittelbare Nachbarschaft des Tumors frei, was fortgesetzt hohe lokale Konzentrationen des Mittels ermöglicht: Bei diesem Experiment inhibiertes Squalamin, das in ein Pellet von ELVAX 40 P (DuPont, Wilmington, DE) eingefügt wurde, die Bildung von neuen Blutgefäßen zu ungefähr 60% an den Tagen 7 und 14 und ungefähr 25% am Tag 21. Wie durch die oben beschriebenen Experimente bewiesen, stellt Squalamin einen leistungsfähigen Inhibitor von NHE3 zur Verfügung. Squalamin sollte deswegen eine unschätzbare therapeutische Intervention bieten, wo immer die Bildung neuer Blutgefäße in vivo beteiligt ist.
In der Tat können einige pathologische Vorgänge, die auf der Bildung neuer Blutgefäße beruhen, durch die Inhibierung von NHE3 behandelt werden. Als Mittel, das mit dem Vorgang der Neovaskularisierung interferiert, hat Squalamin einen therapeutischen Nutzen in der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die von einer fortgesetzten Neovaskularisierung abhängen, wenn eine Störung der Neovaskularisierung die Intensität des pathologischen Vorgangs vermindert. So hat Squalamin einen Nutzen zum Behandeln von. Störungen einschließlich dem Wachstum und der Metastasierung fester Tumoren, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, diabetischer Retinopathie, makularer Degeneration, neovaskuläres Glaucom, Papillom, retrolentale Fibroplasie und Organabstoßung.
Außerdem haben weitere Aminosterole eine antiangiogene Wirkung gezeigt. Die Verbindungen wurden verschiedenen Tests unterworfen, einschließlich des Hühner-Embryo-Kapillar-Regressionstests, dem Kaulquappentest, dem Test für die Inhibierung der Endothel-Nabelbildung und dem Test für die direkte Inhibierung von NHE, wie oben beschrieben, um ihre Nutzen zu bestimmen. Wie aus den oben gezeigten Daten klar wird, ist die Korrelation zwischen den Ergebnissen aus dem Hühnchen, Kaulquappen und der in vitro Inhibition des Endothelzell-Nabelbildungstests herausragend.
Während der Anwendung dieser Tests entwickelte sich die Verbindung 319 als attraktive Alternative zu Squalamin. Es wurde herausgefunden, dass sie Squalamin in den folgenden Eigenschaften. überlegen ist: Leistung als NHE-Inhibitor, einfachere synthetische Herstellung, Spezifität, d: h. keine ZNS-Wirkungen. Weitere Eigenschaften der Verbindung 319 werden unten diskutiert.
Melanom-Wachstums-Unterdrückung:
Es wurde herausgefunden, dass die Verbindung 319 eine Wirkung gegen B16-Malonom in vivo aufweist. Wie in 6 gezeigt wird, welche die Ergebnisse des oben beschriebenen murinen Melanomtests darstellt, erreichte die subkutane Verabreichung der Verbindung die Kontrolle von B16 in C57B-Mäusen in einem Ausmaß, das fast vergleichbar mit Squalamin war (4B).
Pharmakokinetische Ausscheidung:
Die Verbindung 319 hat auch eine schnellere pharmakokinetische Ausscheidung als Squalamin. Um die Ausscheidung zu untersuchen, wurde eine Maur IB PK Studie für die. Verbindung 319 und Squalamin durchgeführt. Die. Verbindung wurde intravenös verabreicht und Blutproben wurden alle 10 Minuten entnommen. Die Konzentration des verabreichten Steroids wurde durch HÜLC-Analyse bestimmt. Wie in 7 gezeigt, wurde die Verbindung nach der intravenösen Verabreichung aus dem Blut der Maus mit einer Halbwertszeit von ungefähr 14 Minuten entfernt. Im Vergleich dazu wurde Squalamin mit einer ungefähr 35minütigen Halbwertszeit entfernt, wie durch die 8 dargestellt wird.
Es sollte möglich sein, weitere Reduzierungen der Reinigung in vivo durch Derivate der Verbindung 319 zu erreichen. Es ist häufig wertvoll, die Lebensdauer, eines Mittels im Blutstrom zu verlängern, um höhere Blutniveaus mit einer verabreichten Dosis eines Medikaments zu erreichen und die Häufigkeit der Verabreichung zu reduzieren. Polyamine werden durch eine Vielzahl an Oxidasen leicht metabolisiert, die die freie terminale Aminogruppe des Polyaminrestes degradieren. Siehe Seller et al., Prog. Drug. Res. 43, 1994, 88–126. Die Alkylierung des primären Amins verzögert im allgemeinen diesen metabolischen Weg. Seller et al., id. Dadurch kann durch eine einfache Alkylierung des primären Amins an der Verbindung 319 oder jeder der Steroide, die ein metabolisierbares Polyamin tragen, einfache Modifizierungen dieser Art erwartungsgemäß die biologische Lebensdauer verlängern.
Xenopus-Kaulquappen-Test:
Der oben beschriebene Kaulquappen-Test bietet einen vorteilhaften Weg, die pharmakologischen Ziele jedes Steroids zu bestimmen, wenn sie in ein Säugetier eingeführt werden, und um die pharmakologischen Kategorien, zu denen die synthetischen Verbindungen gehören, zu bestimmen. In diesem Test wurde jedes der Steroide in 100 ml destilliertem Wasser bei einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst. Xenopus-Kaulquappen im Stadium 59 bis 60 wurden hineingetan und mittels Lichtmikroskopie und oberflächlicher Beobachtung 1 Stunde später bewertet.
Die getesteten Steroide wurden als verschiedene und unterscheidbare pharmakologische Antworten in diesem Tier hervorrufende Substanzen beobachtet:
Verbindung 1256 (Squalamin): Vaskuläre Occlusion in den feinen Kapillaren des Schwanzes. Keine Wirkung auf den Gefäßfluß durch Hände oder Füße. Aktivitätsverlust und Tod trat innerhalb von 2 Stunden auf.
FX1: Gesteigerte Weiterleitung von Fekalmaterial innerhalb von 1 Stunde. Nach 12 Stunden enthielt die Lösung beträchtliche fekale Reste. Das Kreislaufsystem des Tieres schien hyperemic, was eine hämatopoetische Stimulierung nahe legt.
Verbindung 1360: Schwellung und Lysierung bestimmter Erythrozyten trat auf, was zu einer Akkumulierung von Kernen in einigen kleinen Gefäßen des Schwanzes führte. Anschließender Gewebszusammenbruch trat in Bereichen des Schwanzes auf, die diese nukleären Plaques umgeben.
Verbindung 1361: Ähnlich der Verbindung 1360.
Verbindung 1436: Graduierliche Reduzierung der Gesamtaktivität. Der Herzschlag bleibt stark, was eine Unterdrückung des Nerevensystems nahe legt. Die Melanozyten über dem Kopf und Schwanz begannen anzuschwellen, zuerst wiesen sie sichtbare distinkte Nuclei auf, und es wurde gefolgt durch das Zerfallen in Fragmente. Das Tier starb nach ungefähr 2 Stunden.
Verbindung 1437: Das Epithel, das die embryonalen Teile des Tieres bedeckt, wie beispielsweise den Schwanz und die Antenne, begann sich in Schichten abzulösen. Die Schichten der Zellen blieben zuerst intakt aber lösten sich nacheinander voneinander ab. Eine Färbung mit Trypan blau zeigte, dass Zelltod auftrat. Das Tier war ansonsten aktiv, mit wenig bemerkbarem Gewebszusammenbruch.
FX3: Aus dem muskulären Bündel innerhalb des Schwanzes begann Myoglobin auszulecken. Die Streifungen der Skelettmuskulatur wuchsen weniger unterscheidbar. Teile der Muskulatur begannen sich zu trennen. Inhibierung des Mitogen-stimulierten Wachstums humaner T-Zellen:
Spezifische Tests wurden verwendet, um Steroide mit einer besonderen biologischen Wirkung zu identifizieren, wie beispielsweise einem Test zur Inhibierung des Mitogen-stimulierten Wachstums humaner T-Zellen. Die Mitogen-induzierte Zellproliferation ist nach Berichten von der Aktivierung des NHE abhängig. Um daher zu bestimmen, welche Steroide auf bestimmte Zellen wirken, muß man bestimmen, welche Steroide die Mitogen (oder Wachstumsfaktor) aktivierte zelluläre Proliferation inhibieren.
Der T-Lymphozyt ist die lymphoide Zelle, die als Wirt der HN-Infektion dient. Ein Steroid, das die Transformierung humaner Lymphozyten inhibiert, wirkt prinzipiell auf ein NHE, das möglicherweise durch die HIV-Infektion aktiviert wurde. Da GP120 in der Tat Hippocampuszellen NHE durch die Bindung an seinen zellulären Rezeptor aktiviert (Benos et al., J. Biol. Chem. 269, 1954, 13811–13816) ist die Vermutung, dass ein. ähnlicher Effekt einer frühen viralen Interaktion mit dem Lymphozyten erfolgt, begründet. Dies bildete die Basis des nächsten Tests.
Menschliches heparinisiertes Blut, das frisch abgenommen wurde, wurde in Kulturgefäße, die 10 μg/ml Phytohaemagglutinin (PHA) in RPMI-Medium mit 10% FCS enthalten, eingefüllt. Verschiedene gereinigte Steroide wurden anschließend in Konzentrationen von 1,5 und 10 μg/ml hinzugegeben. Die Kulturen wurden 72 Stunden inhubiert, worauf Colcemid in einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben wurde. Die Kulturen wurden für zusätzliche 2 Stunden stehen gelassen und die Zellen wurden eingesammelt. Die Mitosedaten wurden unter Verwendung von Standard cytochemischen Techniken, gefolgt von Giemsa-Färbung, eingeschätzt. Die Ergebnisse werden unten tabellarisch dargestellt.
Tabelle 6 Inhibierung der PHA-stimulierten Human-Lymphozyten
Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, inhibiert die Verbindung 1436 die Blasten-Transformierung am wirkungsvollsten mit mehr als 75% Inhibierung, die bei 10 μg/ml beobachtet wurde. Es wurde auch eine Wirkung bei Squalamin bei dieser Konzentration beobachtet, aber die anderen Steroide waren beträchtlich weniger wirksam. Unter Verwendung dieses einfachen Tests wurde die Verbindung 1436 zur Verwendung bei der Behandlung von T-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen, einschließlich viraler Infektionen, die in diesen Zellen aktiv verbreiten, identifiziert.
Tests mit ähnlichem Design, die eine Zelle von Interesse und einen entsprechenden Wachstumsfaktor verwenden, können. leicht konstruiert werden. Das heißt, um zu bestimmen, welches Steroid das Nützlichste beim Inhibieren der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen nach einer Angioplastie sein kann, muß man nur eine Kultur mit menschlichen Koronar glatten Muskelzellen ansetzen und bestimmen, welches Steroid das PDGF-stimulierte Wachstum dieser Zellen inhibiert, wie unten diskutiert wird.
Synergistische Inhibierung des Tumorwachstums:
Auf der Grundlage der Idee, daß Tumorwachstum sowohl diklonaler Expansion einer malignen Zelle zusammen mit der Entwicklung einer unterstützenden Gefäßversorgung einschließt, wurde eine Kombination der Verbindung 1436 mit Squalamin getestet, um zu bestimmen ob es einen synergistischen Effekt auf das Wachstum fester Tumoren erreicht. Dieses Konzept wurde im B16-Melanommodell untersucht.
Tieren wurde B16-Melanom implantiert, gefolgt von der Behandlung mit der Verbindung 1436 oder 1256, die in einem kombinierten Plan oder getrennt verabreicht werden. Wie aus der 12 offensichtlich wird, wurde keine signifikante Auswirkung auf das Tumorvolumen beobachtet, wenn Squalamin zu 5 mg/kg/Tag oder die Verbindung 1436 zu 10 mg/kg alle 3 Tage verabreicht wurde. Im Gegensatz dazu wurde eine signifikante Reduzierung des Tumorwachstums bemerkt, wenn beide Mittel gleichzeitig verabreicht wurden. Weder die Verabreichung von Squalamin zu 15 mg/kg/Tag noch die Verbindung 1436 alleine in einem tolerierbaren Zeitplan konnte diese Wirkung hervorrufen. Das bedeutet, dass eine Kombination dieser zwei Verbindungen einen therapeutischen Nutzen bei Tumoren ausübt, die auf eine Neovaskularisierung angewiesen sind, was die metastatische Ausbreitung verhindern könnte.
Wirkung auf die Insulinsekretierung:
Beim Studieren zusätzlichezr Rollen für die erfindungsgemäßen Aminostyrole wurde bemerkt, dass die Freisetzung von Insulin aus der Inselzelle des Pankreas die Aktivierung der Inselzellen-NHE2 benötigte, die schließlich durch einen Mechanismus aktiviert wurden, der durch Glukose ausgelöst wurde. Es wird angenommen, dass die Überstimulierung der Inselzelle eine Rolle bei der Depletierung der Inselzellenfunktion im Typ II Diabetes spielen könnte. Zusätzlich sind Vorschläge gemacht worden, dass die genetischen Mechanismen, die zur Hyperaktivität der Inselzell-NHEs führen, eine Rolle in Typ I Diabetes spielen können.
Das bedeutet, dass der Beginn des Diabetes in Individuen, die genetisch suseptibel sind oder sich durch erworbene Prozesse (Fettleibigkeit) in Risikobedingungen begeben haben verzögert oder gelindert werden kann, wenn die Inselzellfunktion unterdrückt werden würde. Die Inhibierung des für die Sezernierung von Insulin verantwortlichen NHE könnte einen therapeutischen Nutzen in diesem Rahmen bilden.
Um die Wirkung eines Steroid-Administrators oder des für die Sezernierung von Insulin verantwortlichen NHEs zu untersuchen, wurden einige der Aminostyrole aus der Haileber an hungernde Mäuse verabreicht. Männliche CD-1-Mäuse wurden in 1 bis 4 Behandlungsgruppen eingeteilt. Der Gesamt-Blutglukosewert wurde unter Verwendung eines Glukometers (Lifescan Glucometer II und One Touch Teststrips) getestet. Die statistische Analyse erfolgte durch einfache Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt vom anschließenden Vonferonni's T-Test. Die Ergebnisse werden unten tabellatisch dargestellt.
Tabelle 11 Wirkung der Verbindung auf hungernde Blutglukose in Mäusen
Wie aus den obigen Daten ersichtlich wird, waren die Glutglukoseniveaus nach der Verabreichung dieser Steroide zwischen 2- bis 3fach erhöht gegenüber dem Normalwert. Die Hunger-Blutglukose der Gruppe 2 war signifikant erhöht, verglichen mit der Gruppe 1 (p < 0,05). Die Hunger-Blut-Glukose der Gruppe 4 war gegenüber der Gruppe 1 signifikant erhöht. Daher scheint es, dass die intravenöse Verabreichung der Verbindung 1436 in D5W (5% Glukose) oder Verbindung 1437 in Wasser eine Hyperglykämie in den Mäusen verursachte. Es wird vermutet, dass die beobachtete hyperglykämische Antwort aus einer Inhibierung der Insulinsekretion bestand, wie aus grundlegenden physiologischen Prinzipien zu vermuten ist: Das heißt, dass die lang dauernde chronische Verabreichung einer Verbindung wie der Verbindung 1436 wertvoll beim Verhindern oder Verzögern des Einsetzens sowohl des TypsI und des Typs II Diabetes sein kann.
Wirkung auf das Wachstum der glatten Muskulatur der Arterien:
Aminosterole der Erfindung können ebenfalls eine Wirkung beim Inhibieren der Wachstumsfaktor-mediierten Proliferation der glatten Muskulatur innerhalb der Arterie haben. Nach einer koronaren Angioplastie tritt sekundär zu einer reparativen Proliferation der glatten Gefäßmuskulator innerhalb der Wand des chirurgisch behandelten Blutgefäßes häufig eine Reocclusion auf. Dieser Prozeß findet im allgemeinen über den Verlauf von 7 bis 10 Tagen statt. Um zu untersuchen, ob ein Mittel die Wachstumsfaktor-mediierte Proliferation der glatten Muskulator innerhalb einer Arterie verhindern kann, wurde die Verbindung 1436 in vitro für seine Wirkung auf die Proliferation auf menschliche koronare Arterien glatte Muskulatur untersucht. Die Ergebnisse für die Verbindung 1436 sind in der 13 gezeigt, und die für Squalamin werden in der 14 gezeigt, 15 ist ein zusammengesetzter logarithmischer Graph.
Wie aus der 13 ersichtlich ist, war die Verbindung 1436 bei ungefähr 10 bis 12 μg/ml beim Unterdrücken des Wachstums dieser Zellen wirksam. Zellen konnten beispielsweise in einem Ruhestadium in Gegenwart dieses Steroids bei ungefähr 11 μg/ml ohne Verlust der Lebensfähigkeit bewahrt werden. Dieses Experiment legt nahe, dass die lokale Verabreichung der Verbindung 1436 an der Stelle der Angioplastie über eine langsame Freisetzungsverabreichung in einer nahen vaskulären Stelle die Muskel-Proliferation während der Dauer reduzieren könnte, bei der das Gefäßendothel einen Verschluß bildet und die zellulären Ereignisse, die die akute Wunde umgeben, abklingen.
Es wird nicht nur auf die Wachstumsfaktor induzierte zelluläre Proliferation wirken, indem es auf die proliferierende Zelle wirkt, sondern auch die Sekretion wachstumsfördernder Hormone auf zentralem, endokrinen Niveau inhibieren. So versetzt die Verbindung 1436 das Tier in einen „Wachstums-inhibierten" Status. In einem solch einen Zustand werden maligne Zellen, die keine optimalen exogenen hormonellen Stimulierungen durch Hormone wie beispielsweise Wachstumshormone und vielleicht LH und FSH erhalten. Die Sekretion von Hormonen wie beispielsweise Östrogen und Progesteron wie auch Insulin werden dadurch wahrscheinlich dereguliert. Viral infizierte Zellen werden unter physiologisch ungünstige Bedingungen gestellt und die Wirksamkeit der viralen Infektionen könnte dramatisch reduziert werden. Immunologisch fremde Zellen, die im Wachstum unterdrückt sind, könnten durch das Existieren des Immunsystems entfernt werden, was jetzt eine Chance ermöglicht, kinetisch mit diesen „fremden" Zellen fertig zu werden.
Antiproliferative Tests und Tumorwachstums-Unterdrückungstests als charakterisierende Tests:
Wie oben, wurde der Kaulquappentest verwendet, um zusätzliche Verbindungen zu finden. In Gegenwart von 10 μg/ml der Verbindung 1436 erleidet die Xenopus Kaulquappe im Stadium 59 bis 60 eine dramatische Zerstörung der Melanozyten auf ihrem Kopf, Rumpf und Schwanz, zusammen mit einer Unterdrückung des Nervensystems. Auf die Integrität der Epithelzellen, den Gefäßfluß und das Erythrozytenvolumen, die Gewebsintegrität, die Streifung der Muskelfasern und die Aktivität des GI-Trakts wurden keine Auswirkungen beobachtet.
Unter Verwendung des Kaulquappentests zum Suchen nach funktionell ähnlichen Verbindungen wurden die Verbindungen 353, 371 und 413 als solche gefunden, die Wirkungen wie die haben, die durch die Verbindung 1436 hervorgerufen werden. Von diesen war die Verbindung 353 aufgrund der Leichtigkeit der Synthese, wie oben beschrieben wurde, besonders bevorzugt. Es wurde gefunden, dass diese Verbindung weitere vorteilhafte Eigenschaften aufweist.
Es wurde unter Verwendung der Wachstums-Unterdrückungs-Methoden, die oben ausgeführt wurden, bestimmt, dass die Verbindung 353 eine starke Wirkung gegen Melanome und eine Anzahl an Krebszellen aufweist, wie unten ausgeführt wird: Tabelle 12 Zytotoxische Wirkung der Verbindung 353 gegen Krebszellen

Zelle IC₅₀ (μg/ml)

Humanes Melanom WM 1167 3,0

Lewis Lungen-Karzinom 1,9
Zusätzlich wurde unter Verwendung des Verfahrens von Baker et al., Cancer Res. 53, 1994, 3052–3057 beobachtet, dass die Wirkung der Verbindung 353 auf das Wachstum eines Melanoms über 48 Stunden am stärksten ist, wobei eine geringere Wirkung innerhalb der ersten 12 Stunden der Inkubierung beobachtet wird, wie in, 17A gezeigt. Für Vergleichszwecke wird die Wirkung von Squalamin in, Human-Melanomen in 17B gezeigt.
Selektion der NHE-Isoform:
Durch die Verwendung molekularbiologischer Techniken ist es möglich zu bestimmen, welche NHE-Isoformen in spezifischen Zellen wie beispielsweise bösartigen Krebserkrankungen, exprimiert sind. Menschliche Melanome, die NHE1, NHE3 und NHE5 exprimieren und menschliche Adenokrazinome exprimieren im wesentlichen NHE3 (siehe Tabelle 8).
Das bedeutet, dass eine Behandlung dieser Art von Adenokarzinom am wirksamsten mit Verwendung eines spezifischeren NHE3-Inhibitors wie beispielsweise Squalamin oder der Verbindung 319 erreicht werden kann. Im Gegensatz dazu exprimiert ein Melanom beträchtliche Mengen an NHE5 zusammen mit NHE3. Das bedeutet, dass die Behandlung dieser bösartigen Erkrankung einen Inhibitor von NHE3 und NHE5 wie beispielsweise die Verbindung 1436 alleine oder in Kombination mit Squalamin einschließen sollte.
Zusammengefasst erlaubt die Erfindung die Nützlichkeit der Aminosterol-NHE-Inhibitoren durch diagnostische Untersuchung der exprimierten NHE-Isoformen in den Zielgeweben zu etablieren. Diagnostische Ansätze können die immunologische Detektion des spezifischen NHE-Isoformproteins oder ein molekularbiologisches Verfahren wie beispielsweise die PCR schließen, die spezifische Sequenzinformation verwendet und Standard-Technologien.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden dem Fachmann nach Betrachtung der Beschreibung und dem Arbeiten mit der Erfindung 'ersichtlich. Die Ausführungsformen und bevorzugten oben beschriebenen Eigenschaften sollten als exemplarisch betrachtet werden, wobei die Erfindung in den anhängenden Ansprüchen definiert wird.

Claims

Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das zum Hemmen des Wachstums von Endothelzellen nützlich ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament nützlich zur Wachstumshemmung von neuen Kapillaren ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament nützlich zur Hemmung der Angiogenese ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament nützlich zur Behandlung von diabetischer Retinopathie ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament nützlich zur Behandlung der makularen Degeneration ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament nützlich zur Behandlung von neovaskulärem Glaukom ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament nützlich zur Hemmung der pathologischen Vaskularisierung ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament nützlich zur Wachstumshemmung von arteriellen Muskelzellen ist.
Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das zur Wachstumshemmung von festen Tumoren nützlich ist.
Verwendung gemäss Anspruch 9, wobei das Medikament nützlich zur Behandlung, eines Melanoms ist.
Verwendung gemäss Anspruch 9, wobei das Medikament nützlich zur Hemmung der metastasierenden Tumorausbreitung ist.
Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von rheumatoider Arthritis nützlich ist.
Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von Papillomavirusinfektion nützlich ist.
Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von Psoriasis nützlich ist.
Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von retrolentaler Fibroplasie nützlich ist.
Verwendung von Squalamin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Medikaments, das zur Hemmung von Organabstossung nützlich ist.