ES2198750T3 - Conjugados de lectinas que se unen a galactosa y neurotoxinas clostridiales como analgesicos. - Google Patents

Abstract

Se describe una clase de nuevos agentes que son capaces de modificar la función aferente nociceptiva. Los agentes pueden inhibir la liberación de neurotransmisores de poblaciones discretas de neuronas y de ese modo reducir o preferentemente impedir la transmisión de señales de dolor aferentes periféricas hacia las fibras de dolor centrales. Estos agentes comprenden una lecitina fijadora de galactosa unida a un derivado de una neurotóxina clostridial. El derivado de la neurotóxina clostridial comprende la cadena ligera (L), o un fragmento de la misma, que incluye el campo enzimático proteolítico activo de la cadena ligera (L), unida a una molécula o un campo con actividad de translocación de membrana. Estos agentes pueden utilizarse solos o en combinación con otros medicamentos, para el tratamiento del dolor, particularmente el dolor crónico.

Description

Conjugados de lectinas que se unen a galactosa y neurotoxinas clostridiales como analgésicos.

Área Técnica

La presente invención se refiere a una clase de agentes nuevos que son capaces de modificar la función aferente nociceptiva. Los agentes pueden inhibir la liberación de neurotransmisores de las poblaciones diferenciadas de neuronas y de ese modo reducir o preferentemente evitar la transmisión de señales aferentes de dolor desde las fibras de dolor periféricas hacia las centrales. El agente puede ser utilizado en o como un medicamento para el tratamiento del dolor, en particular, del dolor crónico.

Antecedentes

La sensación de dolor debido a una herida o enfermedad es llevada desde la periferia hacia el cerebro por medio de una vía de transmisión multi-neuronal. La primera parte de este sistema comprende a los aferentes nociceptivos primarios que forman sinapsis con las neuronas secundarias en el cuerno dorsal de la columna vertebral, o los núcleos de los nervios craneanos. Estas sinapsis transmiten la información entrante mediante la liberación de neurotransmisores y neuromoduladores, tas como el glutamato y la sustancia P. Por lo tanto, estas sinapsis son sitios posibles para la intervención para el alivio del dolor; de hecho, una de las modalidades de acción de los analgésicos opiáceos consiste en disminuir la modulación de la liberación de neurotransmisores en estas sinapsis.

Desgraciadamente, los opiáceos tienen una cantidad de limitaciones en su uso como medicamento. En primer lugar, existe una cantidad de condiciones de dolor crónico para las cuales los opiáceos no son eficaces. En segundo lugar, los opiáceos tienen una cantidad de efectos colaterales que están mediados tanto a nivel periférico (constipación) como central (depresión respiratoria y euforia) la cual presenta problemas en el uso a largo plazo.

Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar un nuevo medicamento para el tratamiento del dolor, en particular, del olor crónico.

Un enfoque hacia este problema está constituido por el uso de nuevos agentes que contienen fragmentos de neurotoxinas clostridiales (WO 96/33273).

Las neurotoxinas clostridiales son proteínas con masas moleculares del orden de los 150 kDa. Son producidas por distintas especies de bacterias del género del Clostridium, principalmente por C. tetani y varias cepas de C. botulinum. En la actualidad existen ocho clases diferentes de neurotoxinas conocidas: toxina tetánica, y neurotoxina botulínica en sus serotipos A, B, C_{2}, D, E, F y G, y todas comparten estructuras y modalidades de acción similares. Las neurotoxinas clostridiales son sintetizadas por la bacteria huésped como polipéptidos simples que están modificados de forma post- translacional para formar dos cadenas de polipéptidos unidas mediante un vínculo bisulfuro. Las dos cadenas se denominan: cadena pesada (H), la cual tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (L), la cual tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa.

Se pueden identificar dos funciones dentro de la cadena H; vinculación y translocación. La mitad carboxi-terminal (H_{C}) está comprometida en la vinculación neuro-específica de alta afinidad de la toxina a los aceptores superficiales de la célula, mientras que la mitad amino-terminal(H_{N}) es central para la translocación de la toxina en la célula neuronal. Para la neurotoxina botulínica tipo A se considera que estos dominios residen dentro de los residuos amino ácidos 872-1296 para la H_{C}residuos amino ácidos 449-871 para la H_{N}y residuos 1-448 para la CL. Los dominios mínimos necesarios para la actividad de la cadena ligera de toxinas clostridiales están descritos en J. Biol. Chem. Vo1.267, Nº.21, Julio 1992, páginas 14721-14729. Las ocho cadenas ligeras (L) de neurotoxinas diferenciadas son endopeptidasas muy específicas, dependientes de zinc, cada una hidrolizando vínculos de péptidos distintos aunque específicos en una de tres proteínas de sustrato, sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25. Estos sustratos constituyen componentes importantes de la maquinaria neurosecretora. La actividad hidrolítica de las toxinas clostridiales resultan en una parálisis muscular prolongada. Las funciones de los tres dominios identificados son necesarias para la actividad tóxica de las endopeptidasas clostridiales.

Algunas de las endopeptidasas clostridiales, especialmente la neurotoxina botulínica tipo A, han sido utilizadas como agentes farmacéuticos para el tratamiento de una gama de distonías musculares. La acción de flaccidez paralizante de las toxinas botulínicas nativas hace que sean adecuadas para este uso.

El uso de fragmentos de neurotoxinas clostridiales para el objetivo deseado de analgesia depende de la invención de conjugados, o derivados de estas moléculas, con una actividad vinculante específica, que entregará la endopeptidasa de cadena L preferentemente a las neuronas aferentes nociceptivas en lugar de a otras neuronas en el sitio anatómico pertinente. La entrega de estos conjugados incluye la vinculación a la superficie celular, internalización vía un compartimento endosómico y translocación de la actividad endopeptidasa clostridial en el citosol.

La selección de especies extracelulares para ubicaciones intracelulares específicas a continuación de la endocitosis comprende una apreciación de una cantidad de estrategias de selección posibles. Se entiende que los endosomas tempranos son parte de los mecanismos de ordenamiento claves de la célula, dirigiendo especies hacia el endosoma tardío (y hacia lisosomas por degradación), reciclándose hacia la superficie celular o la red Trans-Golgi. Se han sugerido determinantes de direccionamiento intracelular que determinan la vía de transmisión y destino final de especies en particular (Mellman, 1996, Annu. Rev. Cell Biol., 12, 575-625).

Los datos actuales sugieren que la translocación de neurotoxinas clostridiales nativas se produce a partir de un compartimento acídico intracelular, aunque no se conoce la ubicación exacta ni la naturaleza del compartimento (Montecucco & Schiavo, 1994, Mol. Micro. 13, 1-8). En la patente WO 96/33273 - se propone que para que un agente sea eficaz, el agente debe seleccionar un compartimento adecuado para translocación de la toxina. Como ejemplo de la selección intracelular específica, la internalización del receptor FCN se realiza mediante endcitosis específica y direccionamiento retrógrado (iniciado mediante complejo receptor-ligando), vía endosomas acídicos hacia el cuerpo celular, y se facilita un agente que incorpora FCN como soporte de la patente WO 96/33273.

La patente WO 96/33273 describe agentes para el tratamiento del dolor, donde se une covalentemente una toxina clostridial a una Estructura Diana, en forma directa o vía un espaciador. La Estructura Diana dirige al agente hacia los aferentes sensoriales periféricos.

Streit et al., J. Histochem. Cytochem. (1985), 33(10), páginas 1042-1052, describe la ubicación histoquímica intracelular de los glico-conjugados que contienen galactosa en las neuronas sensoriales y sus procesos en el sistema nervioso periférico y central de una rata.

Enunciado de la invención

La presente invención se refiere a un agente que puede reducir y preferentemente evitar la transmisión de señales de dolor desde la periferia hacia el sistema nervioso central, aliviando de ese modo la sensación de dolor. Específicamente, la presente invención puede facilitar un agente que puede reducir y preferentemente evitar la transmisión de señales de dolor desde los aferentes nociceptivos hacia las neuronas de proyección. Mas específicamente, la presente invención puede facilitar un agente que puede inhibir la exocitosis de por lo menos una sustancia neurotransmisora o neuromoduladora de por lo menos una categoría de aferentes nociceptivos.

En un aspecto de la presente invención, se facilita un agente que puede ser administrado en la columna vertebral, y que puede inhibir la liberación de por lo menos un neurotransmisor o neuromodulador de las terminales sinápticas de los aferentes nociceptivos con terminación en dicha región de la columna vertebral.

En un segundo aspecto de la presente invención, se facilita un agente que puede apuntar específicamente a poblaciones de neuronas aferentes definidas, de modo tal que el efecto del agente se limite a dicho tipo de célula.

En un tercer aspecto de la presente invención, se facilita el uso de un agente como se mencionó anteriormente, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor.

En un cuarto aspecto de la presente invención, el agente puede estar expresado de forma recombinada como una proteína de fusión que comprende los componentes necesarios del agente.

Definiciones

Sin el deseo de limitación por las definiciones establecidas más abajo, se pretende en la presente descripción, que los siguientes términos tengan los siguientes significados:

Cadena ligera significa el menor de los dos componentes polipéptidos de cualquiera de las neurotoxinas clostridiales. Es comúnmente llamado la cadena L o simplemente L. Una cadena L tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa, y es una metaloproteasa que muestra alta especificidad de sustrato para proteínas asociadas a la membrana vesicular y/o plasmática comprendidas en el proceso de exocitosis.

Cadena pesada significa el mayor de los dos componentes polipéptidos de cualquiera de las neurotoxinas clostridiales. Es comúnmente llamado cadena H o simplemente H y tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa.

Fragmento de H_{C} significa un péptido derivado de la cadena H de una neurotoxina clostridial que es responsable por la vinculación de holotoxina nativa al/a los aceptor/es de superficie celular comprendidos en la acción de intoxicación de la toxina clostridial antes de la internalización de la toxina en la célula. Puede ser equivalente aproximadamente a la mitad carboxi-terminal de la cadena H, o al dominio que corresponde a dicho fragmento en la cadena H intacta.

Fragmento H_{N} significa un fragmento derivado de la cadena H de una neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente a la mitad amino-terminal de la cadena H, o al dominio que corresponde a dicho fragmento en la cadena H intacta. Se caracteriza por ser:

Una porción de la cadena H que permite la translocación de dicha porción de molécula de neurotoxina de modo que la expresión funcional de la actividad de la cadena ligera se produzca dentro de la célula blanco.

El dominio responsable por la translocación de la actividad endopeptidasa, después de la vinculación de neurotoxinas a sus receptores de superficie celular específicos vía el dominio de vinculación, en la célula blanco.

El dominio responsable por la formación de poros permeables a los iones en las membranas lípidas bajo condiciones de pH bajo.

El dominio responsable del aumento de la solubilidad de la totalidad del polipéptido en comparación con la solubilidad de la cadena ligera sola.

LH_{N} significa un fragmento derivado de una neurotoxina clostridial que contiene la cadena L, o uno de sus fragmentos funcionales, acoplado a un fragmento H_{N}.

BoNT/A significa neurotoxina botulínica serotipo A, y es una neurotoxina producida por Clostridium botulinum; tiene una masa molecular de aproximadamente 150 kDa.

LH_{N}/A es LH_{N} que deriva de la neurotoxina Clostridium botulinum tipo A.

Estructura Diana (ED) significa cualquier estructura de un agente que interactúa funcionalmente con un sitio de vinculación produciendo una asociación física entre el agente y la superficie del aferente sensorial primario.

Aferente sensorial primario es una célula nerviosa que puede llevar información sensorial desde la periferia hacia el sistema nervioso central.

Aferente nociceptiva primario es una célula nerviosa que puede llevar información sensorial desde la periferia hacia el sistema nervioso central, donde dicha información puede resultar en sensación de dolor.

Lectina es una proteína que se une a estructuras oligosacáridas.

Lectina que se une a galactosa es una Lectina que se une a estructuras oligosacáridas en las cuales el residuo terminal deriva de galactosa o N- acetilgalactosamina.

Descripción detallada de la invención

A partir de la presente descripción, se puede observar que un agente para reducir o evitar la transmisión de señales de dolor desde las neuronas aferentes nociceptivas periféricas hacia las neuronas de proyección, tiene muchas aplicaciones potenciales en la reducción de la sensación de dolor, en particular, del dolor crónico agudo.

Las lectinas son una clase de proteínas, a menudo glicoproteínas, que se vinculan a estructuras de carbohidratos. Se encuentran lectinas en una amplia gama de formas de vida, desde virus hasta mamíferos. Las fuentes de lectinas más abundantes, explotadas más comúnmente son las que se encuentran en las semillas de plantas. Las lectinas han sido rotuladas previamente y utilizadas como marcadores de superficie celular.

De acuerdo con la invención, se facilita un agente que puede inhibir la liberación de por lo menos un neurotransmisor o neuromodulador o ambos desde las terminales sinápticas de los aferentes nociceptivos.

Se sabe que dicho agente puede ser fabricado a partir de el uso de fragmentos de neurotoxina clostridial conjugada a un ligando diana (WO 96/33273). Dada la complejidad conocida del transporte intracelular y las limitaciones de los requerimientos de elaboración, resulta sorprendente que los conjugados entre fragmentos de toxinas y una sub-clase específica de lectinas que se vinculan solamente a residuos de galactosil, formen agentes para producir analgésicos particularmente potentes y selectivos. Las invenciones que comprenden dichas lectinas constituyen el objeto de la presente descripción y a tal efecto, se facilitan varios ejemplos.

Un ejemplo de una clase de lectinas vinculadas por galactosa, derivadas de plantas son aquellas que pueden ser purificadas a partir de las semillas del género Eritrina. Estas lectinas han sido caracterizadas por existir predominantemente como proteínas diméricas no covalentes con pesos moleculares totales de aproximadamente 60 kDa. Las lectinas han sido aisladas a partir de varias especies de Eritrina, que comprenden: E. corallodendron (Gilboa- Garber y Mizrahi, 1981, Can. J. Biochem. 59,315-320), E. cristagalli (Iglesias et al.1982, Eur. J. Biochem. 123, 247-252), E. indica (Horejsi et al., 1980, Biochim. Biophys. Acta 623, 439-448), E. arborescens, E suberosa, E. lithosperma (Bhattacharyya et al., 1981, Archiv. Biochem. Biophys. 211, 459-470) E. caffra, E. flabelliformis, E. latissima, E. lysistemon, E. humeana, E. perrieri, E. stricta, and E. zeyheri (Lis et al., 1985, Phytochem. 24, 2803-2809).

Estas lectinas han sido analizadas por su selectividad para vinculación con sacáridos (ver por Ej. Kaladas et al., 1982, Archiv. Biochem. Biophys.217, 624- 637). Se ha hallado que se vinculan preferentemente a oligosacáridos con residuo terminal \beta-D-galactosil.

Un segundo ejemplo de lectina que se une a galactosa, derivada de plantas, con la especificidad de vinculación deseada, puede obtenerse de los porotos Glycine max (soja). Esta lectina (aglutinante de poroto de soja - SBA, del inglés soy bean agglutinin) es una proteína tetramérica con un peso molecular total de aproximadamente 110 kDa. Se une a oligosacáridos que contienen residuos de galactosa o N-acetilgalactosamina.

Un ejemplo de lectina que se une a galactosa a partir de bacterias es la PA-I, que se obtiene de Pseudomonas aeruginosa. La PA-I es una lectina D-galactosefílica con un peso molecular de aproximadamente 13 kDa y se une a oligosacáridos que contienen galactosa (Gilboa-Garber y Mizrahi, 1981, Can. J. Biochem. 59, 315-320).

Estas y otras lectinas de la sub-clase de lectinas vinculadas por galactosa pueden ser utilizadas como estructuras dianas (ED) para los conjugados del tipo descrito en la patente WO 96/33273. Los requerimientos de estructuras dianas en estos agentes son que éstos deben mostrar especificidad para los aferentes sensoriales primarios por sobre otros nervios espinales y que deben conducir a la internalización de los agentes en el compartimento intracelular adecuado. Las lectinas de la presente invención cumplen con estos criterios. Sorprendentemente, en comparación con otras lectinas de la patente WO 96/33273, pueden cumplir con estos criterios de forma más eficaz y pueden facilitar agentes con selectividad aumentada para la neurosecreción aferente nociceptiva.

De este modo, en una realización de la presente invención, una lectina que se une a galactosa es conjugada, utilizando uniones, que pueden comprender una o más regiones espaciadoras, a un derivado de las neurotoxinas clostridiales.

En otra realización de la presente invención, el agente es expresado en una forma recombinada como proteína de fusión. La proteína de fusión puede derivar de ácido nucleico que codifica un fragmento adecuado de lectina que se une a galactosa, además de cualquier dominio espaciador deseado, con ácido nucleico que codifica todo o parte de un polipéptido de un serotipo de neurotoxina. Dicho ácido nucleico puede ser una quimera derivada del ácido nucleico que codifica polipéptidos de más de un serotipo.

En otra realización de la presente invención, la LH_{N}, que pude ser un híbrido de una L y H_{N }de diferentes serotipos de toxina clostridial, es expresada como una proteína de fusión recombinada con una lectina que se une a galactosa, y puede también comprender una o más regiones espaciadoras.

En una realización adicional de la presente invención, la ED, L o LH_{N}y los componentes de dominios de translocación pueden ser expresados separadamente en una forma recombinada y unida subsiguientemente, de forma covalente o no covalente, para facilitar el agente deseado.

En una realización adicional de la presente invención el dominio de translocación requerido puede ser de origen no clostridial, comprendiendo, en cambio, un péptido u otra entidad capaz de una función similar o aumentada. Los ejemplos comprenderían, aunque no están limitados a, el dominio de translocación de la toxina de la difteria (O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532), el dominio de translocación de la exotoxina Pseudomonas tipo A (Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559), el dominio de translocación de la toxina del ántrax (Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442) y una variedad de péptidos fusegénicos o hidrofóbicos de función de translocación (Plank et al. J. Biol. Chem. (1999) 269, 12918- 12924).

Explotación en la industria

El agente descrito en la presente invención puede ser utilizado in vivo , ya sea en forma directa o como una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico, para el tratamiento del dolor.

Por ejemplo, un agente de acuerdo con la invención puede ser administrado mediante una inyección espinal (epidural o intratecal) al nivel del segmento de la columna vertebral comprometido en la inervación del órgano afectado para el tratamiento del dolor. Resulta, por ejemplo, aceptable, en el tratamiento del dolor profundo de tejidos, tal como del dolor maligno crónico.

La presente invención será descrita ahora mediante la referencia a los siguientes ejemplos junto con las Figuras que muestran lo siguiente:

Figura 1. Análisis SDS-PAGE de las fracciones del esquema de purificación de ExL-LH_{N}/A.

Figura 2. Hendidura de SNAP-25 mediante ExL-LH_{N}/A

Figura 3. Análisis SDS-PAGE de las fracciones del esquema de purificación de EcL-LH_{N}/A.

Figura 4. Análisis SDS-PAGE de las fracciones del esquema de purificación de SBA-LH_{N}/A.

Figura 5 Análisis del gel nativo de ExL- y SBA-LH_{N}/A

Figura 6 Actividad de ExL-LH_{N}/A en la liberación de neurotransmisor desde las neuronas eDRG y eSC.

Figura 7 Actividad de SBA-LH_{N}/A en la liberación de neurotransmisor desde las neuronas eDRG y eSC.

Figura 8 Actividad de WGA-LH_{N}/A en la liberación de neurotransmisor desde las neuronas eDRG y eSC.

Figura 9 Actividad de ExL-LH_{N}/A en un modelo de analgesia electrofisiológico in vivo.

Figura 10 Actividad de ExL-LH_{N}/A en un modelo de analgesia de comportamiento in vivo.

Ejemplo 1. La producción de un conjugado entre una lectina de Eritrina cristagalli and LH_{N}/A. Materiales

Se obtuvo Lectina de E. cristagalli (ExL) de Sigma Ltd.

Se preparo LH_{N}/A esencialmente mediante el método de Shone C.C., Hambleton, P., y Melling, J. 1987, Eur. J. Biochem. 167, 175-180.

Se obtuvo SPDP de Pierce Chemical Co.

Las columnas de desalinización PD-10 fueron de Pharmacia.

Mediante almacenamiento sobre filtro molecular se mantuvo dimetilsulfóxido (DMSO) sin agua.

Se efectuó electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio por desnaturalización (SDS-PAGE, del inglés sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis) por medio de geles y agentes reactivos de Novex.

Se obtuvo lactosa-agarosa inmovilizada de Sigma Ltd.

Se obtuvieron agentes reactivos adicionales de Sigma Ltd.

Métodos

Se re-hidrató la lectina liofilizada en una solución reguladora salina de fosfato (PBS, del inglés phosphate buffered saline) hasta una concentración final de 10 mg/ml. Se almacenaron alícuotas de esta solución a -20ºC hasta su utilización.

Se hizo reaccionar la ExL con una concentración igual de SPDP mediante el agregado de una solución de cepa de SPDP de 10 mM en DMSO con mezclado. Después de una hora a temperatura ambiente la reacción fue finalizada por medio de la desalinización en PBS sobre una columna PD-10.

Se eliminó el grupo tiopiridona de salida del producto mediante la reducción con ditiotreitol (DTT, 5mM, 30 min.) El producto de esta reacción fue analizado espectrométricamente a 280 nm y 343 nm para determinar el grado de derivatización alcanzado. El grado de derivatización alcanzado fue de 0,8 \pm 0,06 mol/mol. La tiopiridona y el DTT fueron eliminados nuevamente mediante desalinización en PBS sobre una columna PD-10.

Se desalinizó la LH_{N}/A en PBSE (PBS con 1 mM de EDTA). La solución resultante (0,5-1,0 mg/ml) fue reaccionada con un exceso molar de SPDP de cuatro a cinco veces mayor mediante el agregado de una solución de cepa de SPDP de 10 mM en DMSO. Después de tres horas a temperatura ambiente la reacción fue finalizada por medio de la desalinización en PBS sobre una columna PD-10.

Una parte de la LH_{N}/A derivatizada fue sacada de la solución y reducida con DTT (5 mM, 30 min). Esta muestra fue analizada espectrométricamente a 280 nm y 393 nm para determinar el grado de derivatización. El grado de derivatización alcanzado fue de 2,26 \pm 0,10 mol/mol.

El grueso de la LH_{N}/A derivatizada y la ExL derivatizada fue mezclado en proporciones tales que la ExL era mayor al triple del exceso molar. Se permitió que la reacción de conjugación continúe durante 16 horas a 4ºC.

La mezcla del producto fue centrifugada para despejar cualquier precipitado que se hubiera formado. Se concentró el flotante mediante centrifugación a través de concentradores (con límite de exclusión de peso molecular de 10000 - 50000) antes de la estrategia de purificación de dos etapas. Como primera etapa, el material concentrado fue aplicado a una columna Superosa 12 en un sistema de cromatografía FPLC (Pharmacia). La columna fue eluída con PBS y el perfil de la elución siguió a 280 nm. Se analizaron fracciones mediante SDS-PAGE en 9 - 20% de los geles en gradiente de poliacrilamida, seguido por tinción con azul de Coomassie. La banda principal del conjugado tiene una masa molecular aparente de entre 130 y 160 kDa; esto es separado del grueso de la LH_{N}/A no conjugada restante y en forma más completa de la ExL no conjugada. Las fracciones con conjugado fueron reunidas antes de la etapa de la segunda cromatografía; lactosa-agarosa inmovilizada.

Se aplicaron fracciones seleccionadas de post-Superosa-12 a la lactosa-agarosa lavada con PBS y se incubaron durante 2 horas a 4ºC para facilitar la unión. Las proteínas con lectina (es decir, conjugado de ExL-LHN/A) permanecieron unidas a la agarosa durante los lavados subsiguientes con PBS para eliminar los contaminantes (principalmente la LH_{N}/A no conjugada). El conjugado ExL- LH_{N}/A fue eluído de la columna mediante el agregado de 0,3M de lactosa (en PBS) y el perfil de elusión siguió a 280 nm. Se reunieron las fracciones con conjugado, se dializaron contra PBS y se almacenaron a 4ºC hasta su utilización.

En la figura 1 se ilustra el perfil de SDS-PAGE durante las distintas etapas en el esquema de purificación del conjugado. Los carriles 2 y 3 indican la lectina ExL y LH_{N}/A respectivamente antes de la conjugación. Los carriles 4, 5 y 6 representan la mezcla de conjugación, muestras de cromatografía por afinidad de post-Superosa-12 y post-lactosa respectivamente. El carril 6 indica por lo tanto, el perfil del material conjugado final. Los marcadores del peso molecular se encuentran representados en los carriles 1 y 7 con sus medidas indicadas en la figura.

En el gel SDS-PAGE existen bandas debido a la lectina sola en fracciones que contienen el conjugado, este material se debe probablemente a la naturaleza homo-dimérica no covalente de la ExL; donde sólo un monómero de la ExL esta unido de forma covalente a la LH_{N}/A; el otro esta disociado del complejo mediante SDS en el procedimiento electroforético, dando lugar a estas bandas. La ausencia de monómeros de lectina libres fue confirmada mediante un análisis PAGE nativo y está ilustrado en la Figura 5. Se analizaron las ExL y LH_{N}/A (carril 5) mediante PAGE no desnaturalizante. Se separaron muestras utilizando 4 - 20% de gel poliacrilamida durante 6,75 horas 125 V, 4ºC. Se comparó el perfil de electroforesis con aquellos de la LH_{N}/A (carril 3) y lectina ExL solamente (carril 4). Se analizó, además, una gama de proteínas marcadoras; apoferritina (carril 6), \beta-amilasa (carril 8), deshidrogenasa de alcohol (carril 7) y albúmina (carril 9) Se indican medidas moleculares aproximadas.

Ejemplo 2. La producción de un conjugado entre una lectina de Eritrina cristagalli y LH_{N}/A.

El procedimiento para la fabricación de un conjugado entre la lectina de Eritrina cristagalli y LH_{N}/A se encuentra esencialmente descrito en el Ejemplo 1 pero con las siguientes diferencias:

Materiales

Se obtuvo lectina de E. corallodendron (EcL) de Sigma Ltd.

La Figura 3 muestra es esquema de purificación para el conjugado EcL- LH_{N}/A. Se aplicaron muestras a 4 - 20% de geles en gradiente de poliacrilamida y se sometieron a electroforesis antes de la tinción con azul de Coomassie. Carril 1 = marcadores de peso molecular. El carril 2 representa la muestra de afinidad post-lactosa purificada del EcL-LH_{N}/A. El carril 3 es una muestra de afinidad pre-lactosa purificada (sólo cromatografía de exclusión de medida) del EcL-LH_{N}/A. El carril 4 es una muestra de afinidad pre-lactosa purificada del ExL-LH_{N}/A.

Ejemplo 3. Producción de un conjugado entre una lectina de Glycine max y LH_{N}/A.

El procedimiento de fabricación de un conjugado entre lectina de Glycine max y LH_{N}/A está esencialmente descrito en el Ejemplo 1 pero con las siguientes diferencias:

Materiales

Se obtuvo lectina de G. max (SBA) de Sigma Ltd.

Método

Para la etapa de cromatografía de afinidad se utilizó una columna de N- acetilgalactosamina inmovilizada (GalNAc) y se eluyó SBA-LH_{N}/A mediante el agregado de 0,3M de lactosa.

La Figura 4 ilustra los cambios del perfil SDS-PAGE durante el esquema de purificación por SBA-LH_{N}/A. Se purificó SBA-LH_{N}/A a partir de una mezcla de conjugado cruda mediante cromatografía de exclusión de medida Superosa-12 y cromatografía de afinidad de N-acetilgalactosamina inmovilizada. Las muestras fueron sometidas a SDS-PAGE en 4 - 20% de geles de poliacrilamida. Los carriles 6 - 8 corren en presencia de 0,1M DTT. Los carriles 1 (y 7) y 2 (y 8) indican SBA y SPDP - LH_{N}/A derivatizadas respectivamente, antes de la conjugación. Los carriles 3, 4 y 5 (y 6) representan mezclas de conjugación, muestras de cromatografía post-Superosa-12 y post-afinidad respectivamente. El carril 5 indica por lo tanto, el perfil del material conjugado final. Los marcadores del peso molecular se encuentran representados en los carriles Mr con sus medidas indicadas en la figura.

Se confirmó la ausencia de monómeros de lectina libres mediante análisis PAGE no desnaturalizante como se ilustra en la Figura 5. Se separaron muestras utilizando 4 - 20% de gel poliacrilamida durante 6,75 horas 125 V, 4ºC. Se comparó el perfil de electroforesis de SBA-LH_{N}/A (carril 1) con aquellos de la lectina de SBA solamente (carril 2) y LH_{N}/A (carril 3). Se analizó, además, una gama de proteínas marcadoras; apoferritina (carril 6),\beta- amilasa (carril 8), deshidrogenasa de alcohol (carril 7) y albúmina (carril 9). Se indican medidas moleculares aproximadas.

Ejemplo 4. Actividad de ExL-LH_{N}/A en cultivos neuronales primarios.

Los ganglios de la raíz dorsal contienen los cuerpos celulares de las neuronas aferentes nociceptivas. Está bien claro que en cultivos in vitro primarios de este tejido las neuronas retienen muchas de las características del aferente nociceptivo. Estas características comprenden la capacidad de liberar neuropéptidos tales como sustancia P en respuesta a estímulos químicos conocidos por producir dolor in vivo (por Ej. capsaicina) Las neuronas anatómicamente adyacentes a aquellas de los DRG comprenden aquellas de la médula espinal. Los cultivos de neuronas SC preparados a partir de ratas en estado embrionario pueden ser establecidos in vitro y se puede evaluar la liberación de neurotransmisor (^{3}H-glicina) bajo estimulación de potasio. Como tales, las neuronas eSC representan una célula modelo para la prueba de la selectividad de los agentes descritos.

La selectividad del agente ExL-LH_{N}/A para eDRG sobre neuronas eSC se encuentra claramente ilustrada en la Figura 6. Las curvas de dosis documentan la efectividad del ExL-LH_{N}/A en un modelo de cultivo celular in vitro mediante la comparación de la inhibición de neurotransmisión en eDRG con neuronas eSC.

Materiales

Los paquetes de ensayo inmuno-absorbente asociados a la enzima sustancia P fueron de Cayman Chemical Company.

Se obtuvieron agentes reactivos para "Western blot" de Novex.

El anticuerpo monoclonal SMI-81 fue de Sternberger Monoclonals Inc.

Métodos

Se establecieron los cultivos primarios de ganglio de raíz dorsal y las neuronas de la médula espinal embrionaria a continuación de la disociación de los ganglios disecados de embriones de ratas (edad embriológica de 12 a 15 días). Para la preparación de neuronas de eDRG, las células fueron tratadas en placas con 12 pocillos a una densidad inicial de 3 x 10^{5} células / pocillo en un medio que contiene NGF (100 ng/ml). Después de un día en cultivo, se agregó un medio fresco que contenía citosina arabinosida (10 X10^{-6} M) para matar las células no neuronales. Después de 2 - 4 días, se eliminó la citosina arabinosida. Después de varios días más en cultivo, se reemplazó el medio por un medio fresco que contenía conjugado o LH_{N}.

Para la preparación de neuronas de eSC, las células fueron tratadas en placas con 12 pocillos (Costar) recubiertas con poli-D-lisina a una densidad de 2 x 10^{6} células / pocillo (1 ml/pocillo). El medio de "Tratamiento" fue MEM con Earles Salts (Sigma), que contenían 5% de suero fetal bovino (FBS - del inglés "foetal bovine serum"), 5% de suero equino inactivado por calor (HS - del inglés "horse serum"), 0,6% de dextrosa, 1,5 g/l de NaHCO_{3} y 2 mM de L- glutamina. Los cultivos son incubados a 37ºC con 10% de CO_{2}. Después de un día, el medio fue cambiado a un medio de "alimentación" (el medio de tratamiento menos el FBS con suplemento N1 (Sigma) 1/50). Cuando las células gliales se volvieron casi confluentes, se agregaron agentes anti-mitóticos (15 microgramos / ml de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FdU) y 35 microgramos / ml de uridina (U) durante 2 - 3 días más). Las células fueron cultivadas durante por lo menos 3 semanas antes de su utilización.

Las células fueron incubadas con estos agentes durante distintos tiempos y luego se probó su capacidad de liberar glutamato y sustancia P (eDRG) o glicina (eSC) de los neurotransmisores. Después de la realización de los ensayos de liberación, las células fueron lisadas y las proteínas hidrofóbicas fueron extraídas mediante particionamiento de fase con Triton-X-114 siguiendo el método descrito en Boyd, Duggan, Shone y Foster (J. Biol. Chem. 270, 18216-18218, 1995).

Ensayo de liberación de sustancia P

La liberación de sustancia P endógena fue efectuada mediante la colección de los flotantes celulares después de tratar las células durante 5 minutos con una solución fisiológica salina equilibrada o una solución salina equilibrada, en la cual la concentración del ión de potasio ha sido elevada a 100 mM con la consecuente reducción de la concentración del ión de sodio para mantener la isotonicidad.

El total de sustancia P fue medido después de la extracción en 2 M de ácido acético, 0,1% de ácido trifluoroacético y la subsiguiente deshidratación. La inmunoreactividad de la sustancia P fue medida mediante el uso del paquete de inmunoensayo de enzima (Cayman Chemical Company).

Ensayo de liberación de [^{3}H] glutamato

La liberación de glutamato fue medida después de cargar las células con [^{3}H]glutamina como radiotrazador. La [^{3}H]glutamina es transformada en [^{3}H]glutamato en la célula, y es este [^{3}H]glutamato quien es tomado por las vesículas sinápticas y liberado al despolarizarse la neurona. Las células son cargadas con la [^{3}H]glutamina (5 X10^{-6} Ci/ml en solución reguladora por HEPES MEM) durante 2 horas, luego lavada dos veces con solución reguladora por HEPES MEM y tres veces con solución salina equilibrada (BSS). La liberación basal fue evaluada con una incubación de 3 minutos con BSS. La liberación estimulada fue determinada mediante 3 minutos de incubación con BSS, en la cual la concentración de potasio había sido elevada a 80 - 100 mM con la consecuente reducción de la concentración de sodio para mantener la isotonicidad. Todas las gestiones fueron realizadas a 37º C. Las células fueron lisadas mediante el agregado de Triton-X-100 (0,1%, v/v).

Para los superfusatos de liberación basal y estimulada, el glutamato fue separado de la glutamina por medio de cromatografía de intercambio iónico sobre resina Dowex-1. Se analizó el contenido de [^{3}H] en las fracciones pertinentes por medio de la cuenta de centelleo líquido.

Ensayo de liberación de [^{3}H] glicina

La liberación de glicina fue medida después de cargar las células con [^{3}H]glicina como radiotrazador. La [^{3}H]glicina es tomada por las vesículas sinápticas y liberada al despolarizarse la neurona. Las células son cargadas con la [^{3}H]glicina (2 X10^{-6} Ci/ml en solución reguladora por HEPES MEM) durante 2 horas, luego lavada dos veces con solución reguladora por HEPES MEM y tres veces con solución salina equilibrada (BSS). La liberación basal fue evaluada con una incubación de 5 minutos con BSS. La liberación estimulada fue determinada mediante 5 minutos de incubación con BSS, en la cual la concentración de potasio había sido elevada a 56 mM con la consecuente reducción de la concentración de sodio para mantener la isotonicidad. Todas las gestiones fueron realizadas a 37º C.

Las células fueron lisadas por medio del agregado de 2 M de ácido acético, 0,1% de ácido trifuoroacético. Se analizó el contenido de [^{3}H] de las fracciones por medio de cuenta de centelleo líquido y se determinó la inhibición de la liberación.

La Figura 6 ilustra la actividad de ExL-LH_{N}/A en la liberación de neurotransmisor desde las neuronas eDRG y eSC. Tanto los cultivos de eDRG como eSC fueron expuestos a una gama de concentraciones de ExL-LH_{N}/A (1 ml volumen) durante tres días. El porcentaje de inhibición de liberación de sustancia P (n) de eDRG y [^{3}H] glicina de eSC (?) se encuentra en comparación con controles no tratados. Los datos que se muestran son representativos de =3 determinaciones. Se determinó que la IC_{50} para eDRG fue de 3,66 \pm 0,92 \mu/ml. No se obtuvo una inhibición del 50% para eSC utilizando el margen de concentración empleado.

Western blotting

Se aplicó ExL-LH_{N}/A a eDRG durante 16 horas. Después de la determinación de la liberación del neurotransmisor, las células fueron lisadas por medio del agregado de 2 M de ácido acético, 0,1% de ácido trifluoroacético y subsiguientemente deshidratadas. Para extraer las proteínas de la membrana de estas mezclas, se agregó Triton X- 114 (10%, v/v) y se incubó a 4ºC durante 60 minutos, se eliminó el material insoluble por medio de centrifugado y los flotantes fueron calentados a 37ºC durante 30 minutos. Las dos fases resultantes fueron separadas por medio de centrifugación y se descartó la fase superior. Las proteínas en la fase inferior fueron precipitadas con cloroformo / metanol para el análisis mediante "Western blotting".

Las muestras de proteínas extraídas fueron aplicadas a 4 - 20% de geles en gradiente de poliacrilamida y sometidas a electroforesis antes de la transferencia a la nitrocelulosa. La proteólisis de SNAP-25, componente crucial del proceso neurosecretor y substrato para la actividad endopeptidasa del BoNT/A que depende del zinc, fue entonces detectada por medio del análisis con un anticuerpo (SMI-81) que reconoce tanto a las formas intactas como a las hendidas de SNAP-25 (Figura 2). Las proteínas "blotted" en nitrocelulosa fueron analizadas con anticuerpo SMI-81. Los carriles 1-3, 4-6, 7-9 y 10-12, representan las células tratadas con medio, 40 microgramos/ml de ExL, 20 microgramos/ml de ExL y 40 microgramos/ml de LH_{N}/A respectivamente. El análisis densitométrico de estos datos determinó que la hendidura de %SNAP-25 fue de 52,7% y 37,0% para 40 y 20 microgramos/ml respectivamente.

Ejemplo 5. Actividad de SBA-LH_{N}/A en cultivos neuronales primarios.

Se evaluó la actividad de la SBA-LH_{N}/A en los cultivos neuronales primarios utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 4. La selectividad del conjugado de SBA-LH_{N}/A para eDRG sobre neuronas eSC se encuentra ilustrada en la Figura 7. Tanto los cultivos de eDRG como eSC fueron expuestos a una gama de concentraciones SBA- LH_{N}/A (volúmenes de 1 ml) durante tres días. El porcentaje de inhibición de liberación de sustancia P (n) de eDRG y [^{3}H] glicina de eSC (0) se encuentra en comparación con controles no tratados. Los datos constituyen el promedio de tres determinaciones \pm SE. Las curvas que se muestran representan dos experimentos. Los valores de IC_{50} para neuronas eDRG fueron determinados en 1,84 y 7,6 microgramos/ml. Se observó que la SBA-LH_{N}/A exhibe una clara selectividad de inhibición de la liberación del neurotransmisor desde eDRG con relación a las neuronas eSC. Por lo tanto, estos datos confirman las observaciones descritas para ExL-LH_{N}/A más arriba y resaltan las propiedades de las lectinas específicas de galactosa.

Ejemplo 7. Actividad de WGA-LH_{N}/A en cultivos neuronales primarios.

Se evaluó la actividad de la WGA-LH_{N}/A en los cultivos neuronales primarios utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 4. WGA representa un ejemplo de una lectina no seleccionada por galactosil y, por lo tanto, sirve de indicador de las propiedades del conjugado que no reconocen estructuras de galactosil. La falta de selectividad del conjugado de WGA-LH_{N}/A para eDRG sobre neuronas eSC se encuentra ilustrada en la Figura 8. Se expusieron eDRG y neuronas eSC a una gama de concentraciones de WGA-LH_{N}/A durante 3 días antes de la evaluación por liberación simulada de neurotransmisor (sustancia P y glicina respectivamente). Cada concentración de conjugado fue evaluada por triplicado y los resultados están expresados en porcentajes de inhibición en comparación con los controles no tratados. Los Paneles A y B representan las curvas de respuesta a las dosis de un experimento que representa \geq{3} para eDRG y neuronas eSC respectivamente. Cada punto mostrado constituye el promedio de tres determinaciones \pm SE. Se calculó que los datos de IC_{50} para los efectos de WGA-LHN/A fueron de 0,34 \pm 0,06 microgramos/ml (eDRG) y 0,06 \pm 0,09 microgramos/ml (eSC), lo que indica la falta de selectividad de fibra C.

Ejemplo 8. Actividad de ExL-LH_{N}/A en un modelo electrofisiológico de dolor.

Se administró una dosis de 45 microgramos de ExL-LH_{N}/A en un volumen de 10 microlitros de vehículo en ratas por medio de inyección intratecal, entre las secciones lumbares L4-L5, 29 horas antes del análisis electrofisiológico de la actividad neuronal. Se permitió que los animales se recuperaran y no se restringió el movimiento antes del sacrificio y el análisis. Los resultados de un grupo de 3 animales con 10 neuronas registradas por animal, mostraron que hubo una reducción del 73% en las respuestas de fibra C de las neuronas (Figura 9A) aunque el umbral de estímulo está sólo elevado levemente (Figura 9B). La inhibición de las respuestas de fibra C llevaría a la disminución de la transmisión de señales de dolor y estos datos son indicativos del efecto analgésico del conjugado ExL-LH_{N}/A. También hubo una disminución significativa en la respuesta de A_{3} (Figura 9C). Estas fibras también se encuentran comprometidas en la transmisión de estímulos nocivos, y este resultado enfatiza el efecto analgésico del ExL- LH_{N}/A. Las neuronas A_\beta, un tipo de célula que no está comprometido en la transmisión de estímulos nocivos, esencialmente no se alteraron en sus respuestas a estos estímulos (Figura 9D). La falta de afectación sobre las neuronas de fibra A_\beta indica la selectividad del ExL-LH_{N}/A para las neuronas, central en la transmisión de señales de dolor.

Ejemplo 9. Actividad de ExL-LH_{N}/A en un modelo de comportamiento de dolor.

En un modelo in vivo aceptado, la prueba de ratón de plato caliente, el ExL-LH_{N}/A ha demostrado exhibir propiedades analgésicas. La Figura 10 ilustra los datos obtenidos para ExL-LH_{N}/A, donde se compara a una dosis supramáxima de morfina. Se aplicó ExL-LH_{N}/A por vía intratecal (30 microgramos en un volumen de vehículo de 5 microlitros) a cada grupo de 10 ratones y se determinó la respuesta analgésica en la prueba del plato caliente. Los datos se presentan como latencia del plato caliente (segundos) trazado contra el tiempo de evaluación (P = pre-tratamiento, 0 - 5 = horas post- aplicación). El inicio de la acción del ExL-LH_{N}/A había alcanzado aparentemente un nivel estabilizado a 1 hora de haber permanecido constante durante por lo menos 5 horas. El nivel de analgesia es similar a la dosis supramáxima (50 microgramos, 20X EC_{50} de ratón) de morfina en esta prueba, pero tiene una duración mucho mayor. Este nivel de morfina alcanza un efecto máximo a 1 hora y luego vuelve a los niveles de control por un período de 5 horas. Estos datos representan una indicación clara del potencial analgésico de los agentes tales como ExL-LH_{N}/A.

Materiales

Ratones adultos de razas mezcladas (MF1), de ambos sexos, con peso que varía de 20 a 30 gramos.

Métodos

El material de la prueba es inyectado en el espacio intratecal de los ratones anestesiados utilizando una aguja descartable de calibre 30 adosada a una jeringa Hamilton de 50 microlitros. Se escogió normalmente como sitio de inyección el punto entre las vértebras lumbares 5 y 6. Se inserta la aguja en el tejido hacia el otro lado de la vértebra de manera que se deslice dentro del canal entre los procesos espinales y transversos. La aguja es entonces movida cuidadosamente hacia delante, hacia el espacio intervertebral. Se inyectan 5 microlitros del material de la prueba en el espacio intratecal y se retira la aguja. Se cierra la incisión en la piel con un solo clip para heridas y se coloca al animal en una caja para permitirle su recuperación.

Claims (53)

1. Un agente para el tratamiento del dolor que comprende una lectina que se une a galactosa unida a un derivado de una neurotoxina clostridial, en el cual el derivado de la neurotoxina clostridial comprende la cadena L, o un fragmento de la misma, que incluye el dominio de la enzima proteolítica activa de la cadena L (L) ligera, unida a una molécula o dominio con actividad de translocación de membrana.

2. Un agente de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el dominio de translocación de membrana deriva de la cadena pesada de una toxina clostridial.

3. Un agente de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el dominio de translocación de membrana deriva de una fuente no clostridial.

4. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la lectina se une a oligosacáridos que contienen residuos \beta-D- galactosil terminales.

5. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la lectina se une a oligosacáridos que contienen residuos á-D-galactosil terminales.

6. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la lectina se une a oligosacáridos que contienen residuos N-acetilgalactosamina.

7. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la lectina deriva de una especie de planta.

8. Un agente de acuerdo con la reivindicación anterior en el cual la lectina deriva de una especie del género Eritrina.

9. Un agente de acuerdo con la reivindicación 8 en el cual la lectina deriva de E. cristagalli.

10. Un agente de acuerdo con la reivindicación 8 en el cual la lectina deriva de E. corallodendron.

11. Un agente de acuerdo con la reivindicación 7 en el cual la lectina es obtenida a partir de Glycine max.

12. Un agente de acuerdo con la reivindicación 7 en el cual la lectina es obtenida a partir de Arachis hypogaea.

13. Un agente de acuerdo con la reivindicación 7 en el cual la lectina es obtenida a partir de Bandeirea simplicifolia.

14. Un agente de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 en el cual la lectina es de origen mamífero.

15. Un agente de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 en el cual la lectina es obtenida a partir de bacterias.

16. Un agente de acuerdo con la reivindicación 15 en el cual la lectina es obtenida a partir de Pseudomonas aeruginosa.

17. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la lectina ha sido producida por medio de el uso de técnicas de recombinación.

18. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la lectina ha sido modificada enzimáticamente.

19. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la lectina ha sido modificada químicamente.

20. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual, si la cadena pesada (cadena H) de una neurotoxina clostridial se encuentra presente, el dominio H_{C} de la cadena H es eliminado o modificado.

21. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la cadena H, si está presente, es modificada por medio de derivatización química para reducir o eliminar su afinidad nativa de vinculación hacia las neuronas motoras.

22. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 20 en el cual la cadena H, si está presente, es modificada por medio de mutación para reducir o eliminar su afinidad nativa de vinculación hacia las neuronas motoras.

23. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 20 en el cual la cadena H, si está presente, es modificada por proteólisis.

24. Un agente de acuerdo con la reivindicación 20 en el cual, si la cadena H está presente, el dominio H_{C} es eliminado por completo, dejando solamente el fragmento H_{N} de una neurotoxina clostridial.

25. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual el derivado de la neurotoxina clostridial, o su fragmento, es obtenido a partir de la neurotoxina botulínica.

26. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual el derivado de la neurotoxina clostridial, o su fragmento, es obtenido a partir de la neurotoxina botulínica tipo A.

27. Un agente de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 25 en el cual el derivado de la neurotoxina clostridial, o su fragmento, es obtenido a partir de la neurotoxina botulínica tipo B.

28. Un agente de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, ó 4 - 25 (excepto cuando depende de la reivindicación 3) que está formado por el acoplamiento de una lectina que se une a galactosa al fragmento de LH_{N} de la neurotoxina botulínica tipo A.

29. Un agente de acuerdo con la reivindicación 28 que está formado por el acoplamiento de una lectina que se une a galactosa de Eritrina cristagalli al fragmento de LH_{N} de la neurotoxina botulínica tipo A.

30. Un agente de acuerdo con la reivindicación 28 que está formado por el acoplamiento de una lectina que se une a galactosa de Eritrina corallodendron al fragmento de LH_{N} de la neurotoxina botulínica tipo A.

31. Un agente de acuerdo con la reivindicación 28 que está formado por el acoplamiento de una lectina que se une a galactosa de Glycine max al fragmento de LH_{N} de la neurotoxina botulínica tipo A.

32. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la cadena H, si está presente, es obtenida a partir de una neurotoxina clostridial diferente de aquella a partir de la cual se obtiene la cadena L.

33. Un agente de acuerdo con la reivindicación 32 en el cual la cadena H es obtenida a partir de neurotoxina botulínica tipo A, y la cadena L, a partir de la neurotoxina botulínica tipo B.

34. Un agente de acuerdo con la reivindicación 32 en el cual la cadena H es obtenida a partir de neurotoxina botulínica tipo A, y la cadena L, a partir de la neurotoxina tetánica.

35. Un agente de acuerdo con las reivindicaciones 33 y 34 en el cual el componte de la cadena H es el fragmento H_{N} de la neurotoxina botulínica tipo A.

36. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la cadena L o fragmento de la cadena L, está unida a la cadena H, si está presente, por medio de una unión covalente directa.

37. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 35 en el cual la cadena L o fragmento de la cadena L, está unida a la cadena H, si está presente, por medio de una unión covalente que incluye una o más regiones espaciadoras.

38. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual el derivado de neurotoxina clostridial incorpora polipéptidos producidos por medio de técnicas de recombinación.

39. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la cual la lectina está unida al componente derivado de neurotoxina clostridial, por medio de una unión covalente directa.

40. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 38 en el cual la lectina está unida al componente derivado de neurotoxina clostridial, por medio de una unión covalente que incluye una o más regiones espaciadoras.

41. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la cual la lectina y componentes de neurotoxina clostridial son producidos como proteínas de fusión recombinadas.

42. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el cual la proteína de lectina ha sido modificada de su secuencia polipéptida nativa mientras que retiene la capacidad que la proteína se una a estructuras oligosacáridas, en el cual el residuo terminal es derivado de galactosa o N- acetilgalactosamina.

43. Un agente de acuerdo con la reivindicación 42 en el cual la modificación de proteína es resultado de la modificación de la codificación de ácido nucleico para la proteína de lectina a partir de su secuencia nativa.

44. Un método para la obtención de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la unión covalente de una lectina que se une a galactosa a un derivado de una neurotoxina clostridial, en el cual el derivado de la neurotoxina clostridial comprende la cadena L, o un fragmento de la cadena L, que incluye el dominio proteolítico activo de la cadena L (L) ligera, unido a una molécula o dominio con actividad de translocación de membrana.

45. Un método para la obtención de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 43, que comprende la unión covalente de una lectina que se une a galactosa a un derivado de una neurotoxina clostridial con la inclusión de una o más regiones espaciadoras, en el cual el derivado de la neurotoxina clostridial comprende la cadena L, o un fragmento de la cadena L, que incluye el dominio de la enzima proteolítica activa de la cadena L (L) ligera, unida a una molécula o dominio con actividad de translocación de membrana.

46. Un método de acuerdo con la reivindicación 44 ó 45, en el cual el dominio de translocación de membrana deriva de la cadena pesada de una toxina clostridial.

47. Un método de acuerdo con la reivindicación 44 ó 45, en el cual el dominio de translocación de membrana deriva de una fuente no clostridial.

48. Un método para la obtención de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 43, que comprende elaborar una formación genética que codifique para el agente, incorporar dicha formación el organismo hospedante y expresar la formación para producir el agente.

49. Uso de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 43 en la fabricación de un medicamento para controlar la transmisión de información sensorial desde los aferentes sensoriales primarios hacia la neurona de proyección.

50. Uso de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 43 en la fabricación de un medicamento para controlar la transmisión de información sensorial desde los aferentes nociceptivos primarios hacia la neurona de proyección.

51. Uso de acuerdo con la reivindicación 49 ó 50 en la cual la transmisión es la liberación de un neurotransmisor o neuromodulador.

52. Uso de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 43 en la fabricación de un medicamento para controlar la sensación de dolor.

53. Uso de un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 43 en la fabricación de un medicamento para aliviar y/o evitar el dolor.