ES2156851T5 - Amplificacion del adn de genomas multiples para la deteccion de supresiones. - Google Patents
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Abstract
EL INVENTO SE REFIERE A UN METODO PARA DETECTAR SIMULTANEAMENTE MULTIPLES SECUENCIAS DE DNA. EL METODO COMPRENDE LA AMPLIFICACION DE FRECUENCIAS MULTIPLES SIMULTANEAMENTE DESCOMPONIENDO UNA PLURALIDAD DE OLEGONUCLEOITIDOS PRIMARIOS PAREADOS EN DNA DE RAMAL SIMPLE. UN MIEMBRO DE CADA PAR ES COMPLEMENTARIO EN EL SENTIDO DEL RAMAL DE UNA SECUENCIAS Y EL OTRO MIEMBRO ES COMPLEMENTARIO A UN SEGMENTO DIFERENTE DEL RAMAL CONTRARIO DE LA MISMA SECUENCIA. LA AMPLIFICACION SE PRODUCE ALTERNATIVAMENTE DESCOMPONIENDO Y EXTENDIENDO LOS PRIMARIOS. EL INVENTO TAMBIEN INCLUYE SECUENCIAS PRIMARIAS DE OLIGONUCLEOTIDOS UTILES EN LA DETECCION DE ENFERMEDADES GENETICAS Y / O SECUENCIAS DE DNA EXOGENAS.
Description
Amplificación del ADN de genomas múltiples para
la detección de supresiones.
Esta invención se relaciona con el campo de la
detección simultanea de supresiones en secuencias de ADN genómico
por medio de proceso de amplificación de secuencia múltiples dentro
del genoma homocigoto o hemicigoto. Las secuencias de ácido
nucleico se amplifican por medio del proceso de reacciones
repetitivas múltiples simultáneas. Este método de detección de
supresiones es útil en una variedad de áreas incluyendo la detección
de enfermedades genéticas, y la cría de animales. La amplificación
de ADN múltiple se puede aplicar también al análisis simultaneo de
múltiples secuencias genómicas y es útil en medicina forense,
detección d enfermedades, y en el desarrollo de organismos
recombinantes o transgénicos.
Esta invención es una mejora en los
procedimientos actualmente establecidos para la detección de
enfermedades genéticas resultantes de mutaciones y supresiones en
secuencias de ADN genómico. El diagnóstico prenatal y la detección
de portadores de muchas enfermedades ligadas con X están disponibles
a través de análisis Southern utilizando clones de ADNc de longitud
completa. Infortunadamente, existen varias limitaciones importantes
que evitan el uso rutinario y generalizado del análisis Southern
para el diagnóstico de enfermedades genéticas. En muchas de las
enfermedades ligadas con X, las secuencias defectuosas son
desconocidas y no hay sondas disponibles. En otras enfermedades,
tales como distrofia muscular ligada con X, existen múltiples
exones, al menos 60, dispersos en una gran área de ADN genómico,
aproximadamente 2,4 millones de bases. Los intrones tienen un
promedio de 35 Kb de longitud. En el caso de distrofia muscular, al
menos 7 - 9 subclones separados de ADNc son necesarios para el
análisis de transferencia de Southern para resolver cada fragmento
de restricción que contiene un exón para la asignación de un
hiplotipo o el diagnóstico de alteraciones genómicas. Además, el
análisis Southern es una técnica costosa, tediosa y que consume
mucho tiempo que requiere del uso de radioisótopos, haciéndolo
inadecuado para el uso rutinario en laboratorios clínicos.
Una alternativa al análisis Southern para
detección de mutaciones y de supresiones es la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) descrita por Mullis y colaboradores en la
patente estadounidense No. 4.683.195 publicada el 28 de julio de
1987 y por Mullis en la patente estadounidense No. 4.683.202
publicada el 28 de julio de 1987. Con PCR, se pueden amplificar
regiones específicas de un gen hasta un millón de veces a partir de
cantidades en nanogramos de ADN genómico. Después de la
amplificación se pueden analizar las secuencias de ácido nucleico
por la presencia de alelos mutantes ya sea por medio de
secuenciación directa de ADN o por hibridación con sondas de
oligonucleótido específico del alelo. La técnica de PCR ha probado
ser útil en el diagnóstico de diferentes enfermedades incluyendo
\beta-talasemia, hemofilia A, anemia de células
falciformes y fenilcetonuria. La detección de rutina de
enfermedades genéticas y de secuencias exógenas de ADN, tales como
virus, con PCR, ha estado limitada por la habilidad para llevar a
cabo análisis únicamente para una sola secuencia a la vez. La
detección de una pluralidad de posibles secuencias de ADN requiere
de un gran número de engorrosos ensayos separados, incrementando
así el tiempo, el costo, y el tedio en la realización de tales
ensayos. Por ejemplo, en algunas enfermedades, tales como la
distrofia muscular de Duchenne (DMD), el diagnóstico por PCR se ha
visto limitado ya que no se han identificado mutaciones puntuales
conducentes a la DMD. Aproximadamente 60% de los casos de DMD son
debidos a supresiones. El otro 40% son desconocidos hasta el
presente, pero probablemente involucran mutaciones de los sitios de
empalme intrón-exón o la creación de codones de
detención prematura. Por lo tanto, un gen grande como el gen para
la DMD debe ser detectado con múltiples ensayos.
En ambas patentes estadounidenses, la No.
4.683.195 como la No. 4.683.202, se describen procedimientos para
la amplificación de secuencias específicas. Ambas patentes describen
procedimientos para detectar la presencia o la ausencia de al menos
una secuencia específica de ácido nucleico en una muestra que
contiene una mezcla de secuencias. Aunque las patentes reivindican
al menos una secuencia y establecen que se pueden detectar
múltiples secuencias, ellas no proporcionan un procedimiento
efectivo para amplificar múltiple secuencias al mismo tiempo. En
los ejemplos, se amplifican secuencias individuales o se amplifican
secuencialmente múltiples secuencias. La adición de iniciadores
para una segunda secuencia es usualmente posible, pero cuando se
añaden iniciadores para más de dos secuencias, el procedimiento se
derrumba. La presente solicitud es una mejora de un método de PCR y
resuelve los problemas encontrados cuando reaccionan simultáneamente
iniciadores para múltiples secuencias. La presente invención
describe un procedimiento para amplificación simultánea de múltiples
secuencias, y para la aplicación de este procedimiento de
amplificación múltiple con el propósito de detectar una pluralidad
de supresiones dentro del mismo gen o dentro de múltiples genes.
Los procedimientos de la presente solicitud
proveen métodos mejorados para la detección de supresiones en genes
hemicigotos sobre los cromosomas X y Y. Los procedimientos son
efectivos en la detección de enfermedades genéticas provocadas por
supresiones sobre el cromosoma X o el cromosoma Y, por ejemplo, DMD.
También son efectivos en la detección de supresiones en homocigotos
y pueden ser utilizados para detección simultánea de muchas
supresiones posibles en homocigotos o hemicigotos con tal de que se
conozcan partes de las secuencias genéticas apropiadas. El
procedimiento para amplificación múltiple también permite análisis
simultáneos de múltiples loci genéticos independientemente de la
presencia o la ausencia de supresiones.
La presente invención está dirigida a un método
para la detección simultánea de más de dos secuencias de ADN
utilizando más de dos pares de iniciadores.
Aunque
EP-A-0.237.362 pueda sugerir una PCR
múltiple (2 juegos de iniciadores), un examen adicional de las
especificaciones muestra que no existen ejemplos de trabajo de
ninguna PCR múltiple. Además, el único ejemplo hipotético dado en
la página 14, línea 29 utiliza únicamente dos juegos diferentes de
iniciadores. El resto de la descripción de esta solicitud se
relaciona con condiciones PCR estándar.
Nature, Vol. 329, 24 de septiembre de 1987,
páginas 293 - 294 (Chehab y colaboradores), en el mejor de los
casos muestra el uso de dos juegos de iniciadores. Buscando en la
Figura 1, en el control normal, se puede ver una banda nítida para
la hebra beta. Sin embargo, existe una respuesta muy débil para la
hebra alfa. Esto indica que, aún si se obtuvo una amplificación,
fue una amplificación muy débil cuando se utilizaron dos juegos de
iniciadores. Nuevamente, no existe evidencia de que se hubieran
utilizado dos juegos de iniciadores.
American Journal of Human Genetics, Vol. 43,
Suplemento No. 3, Septiembre de 1988, resumen No. (0711) 3.2;
(Chamberlain y colaboradores) es un resumen que sugiere que se puede
hacer un proceso múltiple pero que no brinda ninguna de las
condiciones y tampoco enseña como puede hacerse.
Science, Vol. 239, 29 de enero de 1988, páginas
491 - 494 (Stoflet y colaboradores) muestra nuevamente la
amplificación de al menos dos juegos de iniciadores. Tiene además el
problema de que es un procedimiento mucho más complicado que el de
la presente invención. Existe la necesidad de la adición de T7 ARN
polimerasa seguido por una secuencia y una transcriptasa inversa
para identificar los productos de amplificación. Este es un
procedimiento mucho más costoso que el de la presente invención para
detectar múltiples secuencias. No existe evidencia en este artículo
de la posibilidad de amplificar más de dos juegos de secuencias al
mismo tiempo.
EP-A-0.256.630
únicamente describe el uso de múltiples análisis en los cuales cada
uno tendría su propia secuencia separada de amplificación. Incluso
si el ejemplo fuera descrito como relacionado con múltiples
aplicaciones de PCR, no existe descripción de cómo se lograría
esto. No existen ejemplos de ninguna amplificación múltiple en esta
descripción.
Nucleic Acid Research, vol. 15, no. 22, 1987,
páginas 9129 - 9142 (Heilig y colaboradores) se refiere al estudio
de secuencias de los límites intrón - exón. Sin embargo, al momento
de presentar esta solicitud, habían sido publicadas únicamente
secuencias de intrón para los exones 8 y 19. Muchas de las otras
secuencias de intrón no eran conocidas al momento de la
presentación de la solicitud. Aunque había sido publicada la
secuencia completa del ADNc para el gen de la distrofina, pocos
límites exón/intrón estaban disponibles al momento de presentar
esta solicitud. De los pocos límites intrón/exón que eran conocidos,
varios eran incorrectos.
El artículo en Cell, Vol. 53, 22 de abril de
1988, páginas 219 - 228, Cell Press (Koenig y colaboradores)
describe principalmente límites intrón/exón que fueron inferidos a
partir de la homología de secuencia. Se debe observar, sin embargo,
que los datos de secuencia de la presente solicitud probaron que
varios de los límites intrón/exón inferidos en este artículo eran
erróneos.
Chamberlain y colaboradores, Am. J. Human
Genetics, 43(3), A17, 1988 especulan sobre la posibilidad de
utilizar PCR para amplificar múltiples secuencias utilizando
diferentes juegos de iniciadores pero carecen de los detalles
técnicos necesarios que permitan llevar a cabo PCR múltiple.
La presente invención busca proveer un método
para detectar simultáneamente secuencias objetivo de ADN en una
muestra, preferiblemente supresiones a partir de una pluralidad de
secuencias de ADN genómico. La presente invención detecta
preferiblemente enfermedades genéticas ligadas con X, tales como
DMD.
De acuerdo con la presente invención, se provee
un método para detectar simultáneamente en una muestra secuencias
objetivo de ADN, que comprende las etapas de:
- proveer en un recipiente de reacción común la muestra en forma de una sola cadena y pares de iniciadores oligonucleótidos, cada par específico para una secuencia diferente, un iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte de la secuencia en la secuencia sentido y el otro iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte diferente de la misma secuencia en la cadena complementaria antisentido;
- el apareamiento de los pares de iniciadores con sus secuencias complementarias;
- extender simultáneamente dichos pares de iniciadores apareados a partir de cada terminal 3' del iniciador para sintetizar un producto de extensión complementario con las cadenas apareadas a cada iniciador, dichos productos de extensión, después de la separación de su complemento, sirviendo como moldes para la síntesis de un producto de extensión del otro iniciador de cada par;
- separar dichos productos de extensión de dichos moldes para producir moléculas de una sola cadena de las secuencias objetivo;
- amplificar dichas secuencias objetivo monocatenarias por repetición, al menos una vez, dicho apareamiento, extendiendo y separando etapas; e
- identificar si dichos productos de extensión amplificados han sido sintetizados a partir de cada secuencia diferente, como una medida de la presencia o de la ausencia de cada secuencia objetivo, caracterizado porque:
- el método se adapta para detectar simultáneamente más de dos secuencias objetivo por medio de la utilización de más de dos pares de iniciadores oligonucleótidos.
Modalidades adicionales incluyen la detección de
supresiones en una pluralidad de secuencias de ADN genómico de los
cromosomas X y Y o sobre cromosomas autosomales cuando las
supresiones son homocigotos. Se pueden detectar una variedad de
enfermedades ligadas con X incluida la deficiencia de ornitina
transcarbamilasa, la deficiencia de hipoxantina
fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide sulfatasa y la
distrofia muscular ligada con X.
En otra modalidad, se detecta la distrofia
muscular ligada con X utilizando más de dos iniciadores apareados
que son complementarios con secuencias diferentes dentro del gen que
codifica para la proteína distrofina. Otras modalidades incluyen
múltiples iniciadores oligonucleótidos útiles en la detección de una
enfermedad genética ligada con X.
Otros objetivos y objetivos adicionales,
características y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente
descripción de las modalidades actualmente preferidas de la
invención dados con el propósito de divulgación cuando se los toma
junto con los dibujos acompañantes.
La invención será más fácilmente entendida a
partir de una lectura de la siguiente descripción y por referencias
a los dibujos acompañantes, que forman parte de la misma:
La Figura 1 es una representación esquemática
del gen que codifica para la DMD que ilustra el tamaño aproximado
del locus, la posición de los fragmentos amplificados y la ubicación
de las regiones genómicas que han sido clonadas y secuenciadas.
La Figura 2 es un ejemplo de una reacción PCR
utilizada para detectar una supresión en ADN fetal para diagnóstico
prenatal.
La Figura 3 representa la amplificación múltiple
del ADN de ADN de linfoblasto de pacientes machos con DMD no
tratada. A y B muestran dos juegos de diez muestras. Cada # del DRL
se refiere al número familiar del R. J. Kleberg Center for Human
Genetics Diagnostic Research Laboratory. MW: ADN de \varphiX174
digerido con Hae III. (-): no se añadió molde de ADN a la reacción.
La relación entre la región amplificada y la región sobre el gen
está indicada a la derecha de A. las letras corresponden a aquellas
sobre la Figura 1.
La Figura 4 representa la amplificación múltiple
de ADN para diagnóstico prenatal de DMD. Se muestran los resultados
de la amplificación utilizando ADN de un macho afectado (AM; ADN de
linfoblasto) y un feto macho (MF; ADN celular de fluido amniótico
cultivado) de seis familias diferentes. Tanto los ADN fetales como
los del macho afectado #s 521 y 531 del DRL muestran una supresión
de la región f (Fig. 1); diagnosticando estos fetos como afectados.
En el # 43C del DRL se suprimen todas las regiones excepto la f del
macho afectado, mientras que el feto no está afectado. Se suprime
la región a del macho afectado # 483 del DRL, mientras que el feto
macho no está afectado. Ninguna de las muestras #s 485 ó 469 del DRL
mostró una supresión con esta técnica.
La Figura 5 representa amplificación múltiple de
ADN del ADN de un espécimen de vellosidad coriónica (CVS). Tanto el
macho afectado (AM; ADN de linfoblasto) como el feto macho (MF, ADN
de CVS) # 92 del DRL muestran una supresión de las regiones e y f
(Fig. 1), diagnosticando el feto como afectado. El ADN del CVS # 120
del DRL no mostró una supresión con esta técnica.
La Figura 6 muestra la amplificación de siete
regiones de exón del locus de DMD.
Los dibujos no están necesariamente a escala y
ciertas características de la invención pueden estar exageradas en
escala o mostradas en forma esquemática en el interés de la claridad
y de la concisión.
El término "iniciadores oligonucleótidos"
como se lo utiliza aquí define una molécula que consiste de más de
tres desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. Su longitud exacta
dependerá de muchos factores relacionados con la función última y
el uso del iniciador oligonucleótido, incluida la temperatura, la
fuente del iniciador y el uso del método. El iniciador
oligonucleótido puede ser de origen natural, como en una digestión
purificada de restricción, o puede ser producido sintéticamente. El
iniciador oligonucleótido es capaz de actuar como un punto de
inicio para la síntesis cuando es colocado bajo condiciones que
inducen la síntesis de un producto de extensión del iniciador
complementario a una cadena de ácido nucleico. Las condiciones
pueden incluir la presencia de nucleótidos y un agente de inducción
tal como una ADN polimerasa a una temperatura y pH adecuados. En la
modalidad preferida, el iniciador es un oligodesoxirribonucleótido
monocatenario de longitud suficiente para cebar la síntesis de un
producto de extensión de una secuencia específica en presencia de un
agente de inducción. En el procedimiento de detección de la
supresión, los oligonucleótidos son usualmente al menos mayores a
12 mers de longitud. En la modalidad preferida, los iniciadores
oligonucleótidos son aproximadamente de 18 a 29 mers de longitud.
La sensibilidad y la especificidad de los iniciadores
oligonucleótidos están determinadas por la longitud del iniciador y
por la singularidad de la secuencia dentro de una muestra dada de
ADN molde. Los iniciadores que son muy cortos, por ejemplo
aproximadamente menores de 12 mers, pueden mostrar un enlazamiento
no específico con una amplia variedad de secuencias en el ADN
genómico y por lo tanto no son muy útiles. En la modalidad
preferida, se selecciona usualmente al iniciador oligonucleótido por
su habilidad para aparearse con secuencias de intrón en la
proximidad del extremo 5' ó 3'del exón o para aparearse con una
secuencia en la unión intrón - exón. Ya que los defectos de
supresión conocidos que resultan en enfermedades genéticas son el
resultado de supresiones que incluyen a los exones o a las regiones
del sitio de empalme del intrón, es preferible tener iniciadores
complementarios a las secuencias del intrón.
Cada par iniciador fue seleccionado aquí por ser
sustancialmente complementario con las diferentes cadenas de cada
secuencia específica que es amplificada. Por lo tanto, un iniciador
de cada par es suficientemente complementario para hibridar con una
parte de la secuencia en la cadena sentido y el otro iniciador de
cada par es suficientemente complementario para hibridar con una
parte diferente de la misma secuencia en la cadena antisentido. De
este modo, aunque la secuencia del iniciador no necesita reflejar la
secuencia exacta del molde, entre más cercanamente refleje la
secuencia exacta, mejor el enlazamiento durante la etapa de
apareamiento.
Dentro de un par de iniciadores, cada iniciador
se enlaza preferiblemente en un sitio sobre la secuencia de interés
distante del otro iniciador. En la modalidad preferida, la distancia
entre los iniciadores debe ser suficiente para permitir la síntesis
de un producto de extensión entre los dos sitios de enlazamiento,
aún lo suficientemente cerca para que el producto de extensión de
cada iniciador, cuando está separado de su molde, pueda servir como
molde para el otro iniciador. Los productos de extensión de los dos
iniciadores apareados son complementarios entre sí y pueden servir
como moldes para síntesis adicionales. Entre más separados los
sitios de enlazamiento, hay más ADN genómico que puede ser que puede
ser detectado. Sin embargo, si la distancia es tan grande que los
productos de extensión no se superpondrán eficientemente con los
iniciadores y en consecuencia no se presentará la amplifica-
ción.
ción.
Como se lo utiliza aquí, el término "producto
de extensión" se refiere a la secuencia de nucleótidos que se
sintetiza a partir del extremo 3' del iniciador oligonucleótido y
que es complementaria a la cadena a la cual está enlazado el
iniciador oligonucleótido.
Como se lo utiliza aquí, el término "marcado
diferencialmente" indica que cada producto de extensión puede
ser diferenciado de todos los otros debido a que tiene una marca
diferente unida o es de un tamaño diferente o se enlaza a un
oligonucleótido específicamente marcado. Alguien capacitado en el
arte reconocerá que están disponibles una variedad de marcadores.
Por ejemplo, estos pueden incluir radioisótopos, compuestos
fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos.
Diferentes factores afectan la escogencia del marcador. Estos
incluyen el efecto del marcador sobre el índice de hibridación y de
enlazamiento del iniciador con el ADN, la sensibilidad del
marcador, la facilidad de elaboración del iniciador marcado, la
sonda o los productos de extensión, la capacidad de automatización,
la instrumentación disponible, la conveniencia y similares. Por
ejemplo, se podría utilizar un radioisótopo diferente tal como
^{32}P, ^{3}H, o ^{14}C; un compuesto fluorescente diferente
tal como fluoresceína, tetrametilrodamina, Rojo Tejas ó
4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1-diazol
(NBD), o una mezcla de diferentes marcadores tales como
radioisótopos, compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes.
Alternativamente, se pueden seleccionar los iniciadores de tal
manera que los productos amplificados de extensión para cada
secuencia son de diferentes longitudes y por lo tanto pueden ser
separados por medio de una variedad de métodos conocidos en el
arte. En forma similar, los productos de extensión podrían incluir
un polimorfismo de longitud del fragmento de restricción que podría
ser utilizado para distinguir diferentes productos de extensión. En
estos ejemplos, cada iniciador o su producto de extensión se pueden
diferenciar de todos los otros iniciadores cuando están en una
mezcla. Alternativamente, las sondas que se enlazan a los productos
de extensión amplificados podrían ser marcadas y se podrían utilizar
juegos de sondas que distinguen alelos de una secuencia única en
una reacción de amplificación múltiple de ADN, estén marcadas o
no.
Cada secuencia específica diferente de ADN, que
va a ser detectada allí, puede derivarse de ADN genómico del
organismo o de ADN exógeno tal como de virus, bacterias o parásitos.
La fuente de ADN genómico del organismo que va a ser analizado
puede ser sangre, pelo o tejido (incluyendo vellosidad coriónica,
células amnióticas, fibroblastos y biopsias). La fuente de ADN
puede ser obtenida en forma fresca o haber sido adecuadamente
almacenada durante largos períodos de tiempo. El ADN debe ser de
calidad suficiente para permitir la amplificación. El ADN genómico
se puede preparar por medio de una variedad de técnicas conocidas
por alguien capacitado en al arte.
Como se lo utiliza aquí, el término
"supresión" se refiere a aquellas secuencias de ADN genómico en
las cuales una o más bases de ácido nucleico han sido suprimidas de
la secuencia y por lo tanto ya no están presentes en el gen. El
tamaño de la supresión puede afectar la sensibilidad del
procedimiento de amplificación. Generalmente, entre mayor la
supresión mayor la sensibilidad.
Cualquier secuencia específica conocida de ácido
nucleico puede ser detectada por medio del presente método.
Preferiblemente, al menos parte de la secuencia es suprimida del
genoma. Solamente es necesario que un número suficiente de bases de
ambos extremos de la secuencia sea conocida con suficiente detalle
para preparar iniciadores oligonucleótidos que hibridarán con las
diferentes cadenas de la secuencia deseada en posiciones relativas
a lo largo de la secuencia.
Los iniciadores oligonucleótidos se pueden
preparar utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, métodos
de fosfotriéster y de fosfodiéster o modalidades automatizadas de
los mismos, la síntesis de oligonucleótidos sobre un soporte sólido
modificado, el aislamiento de una fuente biológica (digestión con
una endonucleasa de restricción), y la generación de copias
dirigida enzimáticamente de un molde de ADN o de ARN.
Una modalidad de la presente invención es un
método para detectar simultáneamente supresiones en una pluralidad
de secuencias de ADN, que comprende las etapas de: tratar dicho ADN
para formar cadenas monocatenarias complementarias; añadir una
pluralidad de iniciadores oligonucleótidos apareados, cada par
específico para una secuencia diferente, un iniciador de cada par
sustancialmente complementario con una parte de la secuencia en la
cadena sentido y el otro iniciador de cada par sustancialmente
complementario con una parte diferente de la misma secuencia en la
cadena complementaria antisentido; aparear la pluralidad de
iniciadores con sus secuencia complementarias; extender
simultáneamente dicha pluralidad de iniciadores apareados de cada
terminal 3' del iniciador para sintetizar un producto de extensión
complementario con las cadenas aperadas a cada iniciador, sirviendo
dichos productos de extensión, después de la separación del
complemento, como moldes para la síntesis de un producto de
extensión del otro iniciador de cada par; separar dichos productos
de extensión de dichos moldes para producir moléculas
monocatenarias; amplificar dichas moléculas monocatenarias
repitiendo, al menos una vez, dicho apareamiento, extendiendo y
separando etapas; e identificar dicho producto amplificado de
extensión de cada secuencia diferente.
Una modalidad preferida de la presente invención
es un método para detectar supresiones en una pluralidad de
secuencias de ADN genómico, en donde dichas secuencias se
seleccionan del grupo de secuencias sobre los cromosomas X y Y. Es
preferible detectar genes homocigotos sobre los cromosomas X y Y, ya
que esto incrementa el nivel de sensibilidad. Cuando se utiliza el
procedimiento para detectar el estado homocigoto, se requiere de
medición cuantitativa, y por lo tanto es mucho menos eficiente que
la detección de la presencia o la ausencia de secuencias como se
hace para los genes hemicigotos. Por ejemplo, si se ha suprimido
parte de un exón, el método de amplificación múltiple de la
presente invención detectará esto ya sea fallando en la producción
de una secuencia de oligonucleótidos o por medio de la producción de
una secuencia de oligonucleótidos de un tamaño diferente. Además,
se pueden detectar múltiples exones al mismo tiempo. De este modo,
es fácil detectar la presencia de una supresión. Sin embargo,
mirando estados heterocigotos, donde los cromosomas tienen un gen
normal y un gen suprimido, el gen normal producirá un producto
normal, y por lo tanto existe la necesidad de medir la diferencia
cuantitativa en la producción de productos de extensión.
Una segunda modalidad de la presente invención
es permitir la amplificación simultánea de múltiples secuencias,
posiblemente no relacionadas con el propósito de su análisis
simultáneo. Tales análisis pueden involucrar simplemente la
determinación de si están presentes secuencias exógenas (virus,
bacterias u otros parásitos) dentro de una muestra de ADN, o podría
involucrar la detección de polimorfismos o mutaciones dentro de una
pluralidad de secuencias. Los polimorfismos o mutaciones se pueden
detectar por medio de una variedad de métodos bien conocidos por
aquellos capacitados en el arte. Los métodos incluyen, pero no se
limitan a, secuenciación directa de ADN, hibridación de
oligonucleótidos específica del alelo, e imprimación competitiva de
oligonucleótidos.
El método de amplificación múltiple de ADN
genómico se utiliza preferiblemente para detectar enfermedades
ligadas con X resultantes de las supresiones en la secuencia de ADN
genómico. Las enfermedades genéticas pueden ser causadas por una
variedad de mecanismos incluidas mutaciones y supresiones. El
procedimiento descrito aquí fue desarrollado para la detección de
enfermedades genéticas que resultan de supresiones dentro del
genoma. Los ejemplos de algunas enfermedades ligadas con X que son
candidatas para el uso de amplificaciones múltiples de ADN gnómico
son la deficiencia de ornitina transcarbamilasa, la deficiencia de
hipoxantina fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide
sulfatasa y la distrofia muscular ligada con X. Otros desórdenes
sobre el cromosoma X o de los genes sobre el cromosoma Y pueden ser
detectados también fácilmente. El procedimiento es también
aplicable a la detección de cualquier conjunto de mutaciones
puntuales conocidas dentro de un conjunto de secuencias genómicas.
El procedimiento es también aplicable a la detección simultánea de
cualquier conjunto de secuencias exógenas de ADN en una muestra
dada de ADN. El procedimiento es también aplicable a la detección
simultanea de cualquier conjunto de secuencias repetitivas
polimórficas o variables en tándem dentro de un genoma.
Las ventajas del sistema de amplificación
múltiple son aquellas numerosas enfermedades o aquellas alteraciones
específicas de la secuencia de ADN que pueden ser detectadas en el
mismo ensayo. Por ejemplo, los iniciadores para la deficiencia de
hipoxantina fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide
sulfatasa, la distrofia muscular ligada con X, la deficiencia de
ornitina transcarbamilasa y otras enfermedades ligadas con X pueden
ser corridas todas simultáneamente sobre la misma muestra. Además,
el procedimiento de amplificación múltiple es útil para genes muy
grandes con exones múltiples, tal como el gen para la distrofina.
Debido al gran tamaño del locus de distrofina, la amplificación por
PCR del tipo Mullis no es capaz de escudriñar el gen completo en un
ensayo. Por lo tanto, es necesario para la amplificación en
múltiples sitios dentro del gen, detectar todas las posibles
supresiones que podrían resultar en enfermedades. Las supresiones en
el locus de la DMD pueden abarcar a cualquiera de los
aproximadamente 60 exones más que están distribuidos sobre más de 2
millones de bases de ADN. Virtualmente todos estos exones están
separados por interferones grandes y así se podrían requerir hasta
de 60 reacciones separadas para completar el análisis de las
supresiones de la DMD. Para simplificar esta tarea, se puede
emplear la presente invención de una amplificación múltiple de ADN
genómico para la detección de la supresión para realizar el examen
simultáneo de múltiples exones. Por ejemplo, se pueden sintetizar y
combinar los iniciadores oligonucleótidos que flanquean a los exones
separados del gen para la DND, y usarlos para aplicaciones
múltiples de ADN. Hasta el momento, se han examinado simultáneamente
al menos hasta 7 secuencias diferentes del gen para la DMD. El
procedimiento completo para la amplificación múltiple desde la
puesta en marcha hasta la fotografía de los resultados toma menos
de 5 horas. Las ubicaciones relativas de las regiones amplificadas
no afectan los resultados y se han amplificado exones que han estado
separados al menos al menos por 1000 kb. La técnica de
amplificación por PCR de Mullis es adecuada para uno y posiblemente
dos pares de iniciadores, pero cuando se utilizan más de dos pares
de iniciadores, el proceso no amplifica adecuadamente todas las
secuencias apropiadas.
Alguien capacitado en el arte apreciará
fácilmente que entre más secuencias génicas del exón estén
disponibles, se expandirá la aplicabilidad de este ensayo para
examinar las supresiones en múltiples genes al mismo tiempo o
examinar sitios múltiples dentro del mismo gen al mismo tiempo. Este
último ejemplo es importante para genes tales como los de la
distrofina que son tan grandes que los iniciadores apareados a los
extremos del gen no atravesarán la secuencia completa del gen. Por
eso la necesidad de hacer múltiples análisis para detectar
supresiones en diferentes regiones del gen. Además, como las
mutaciones específicas dentro de genes múltiples no relacionados se
hacen conocidas, se puede aplicar amplificación múltiple de ADN para
analizar simultáneamente la presencia de cualquiera de estas
mutaciones.
Además, como llegan a conocerse polimorfismos
específicos o altamente variables de secuencias de ADN en diferentes
Loci genéticos, se pueden utilizar amplificaciones múltiples de ADN
para analizar simultáneamente estos polimorfismos para determinar
el haplotipo o para determinar la identidad o la fuente del ADN
(huella genética).
El número de análisis que pueden correrse
simultáneamente es ilimitado, sin embargo, el límite superior es
probablemente aproximadamente de 20 y depende de las diferencias de
tamaño requeridas para la resolución y/o del número de marcadores o
de métodos que están disponibles para resolver los productos de
extensión. La habilidad para amplificar simultáneamente únicamente
9 exones permitiría la detección de más del 90% de todas las
supresiones conocidas de la DMD en una única reacción. La habilidad
para amplificar simultáneamente incluso solamente 10 exones permite
el diagnóstico rápido y simple de supresiones de la DMD utilizando
únicamente unas pocas reacciones separadas. Asumiendo que hubiera
aproximadamente 60 exones en el gen para la DMD y que los exones
estén ampliamente separados de tal manera que se necesiten
iniciadores para cada exón, se requieren un máximo de 6 ensayos
separados para detectar todas las supresiones en este gen. Bajo los
mismos supuestos, el método por PCR de Mullis requeriría de 60
reacciones separadas para detectar las supresiones en este gen. Por
lo tanto, en la medida en que se incrementa el tamaño del gen y el
número de exones que no puede ser detectado al mismo tiempo, se
incrementan grandemente las ventajas de este método. Además, el uso
de un aparato automático para PCR (tal como aquel producido por
Perkin-Elmer/Cetus) y de las máquinas secuenciadoras
de ADN facilitará la resolución y la detección de los fragmentos
amplificados de ADN, ayudará a automatizar el análisis y permitirá
que el método sea aplicado rutinariamente en laboratorios clínicos
sin la necesidad de personal de investigación altamente
entrenado.
A continuación se ofrecen los siguientes
ejemplos a manera de ilustración y no se pretende que limiten la
invención de ninguna manera. En los ejemplos, todos los porcentajes
son en peso, si es para sólidos y en volumen si es para líquidos, y
todas las temperaturas se dan en grados Celsius a menos que se
indique otra cosa.
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Ejemplo
1
Las siguientes condiciones están actualmente en
uso para llevar a cabo la amplificación simultánea de una
pluralidad de regiones genómicas dentro del gen para la DMD humana.
Pude necesitarse modificar ligeramente estas condiciones
dependiendo de las regiones particulares que van a ser amplificadas,
del número y longitud de las secuencias que van a ser amplificadas,
y de la escogencia de los iniciadores oligonucleótidos. El tiempo
de reacción depende grandemente de la longitud total de la
secuencia. Por lo tanto, en la medida en que se incrementa el
número de secuencias amplificadas y/o se incrementa la longitud de
las secuencias amplificadas, se debe incrementar el tiempo. La
temperatura depende de la longitud, de la singularidad de la
secuencia del iniciador y del porcentaje relativo de bases GC.
Entre más largos los iniciadores, más alta la temperatura
requerida. Entre más única la secuencia, menor la temperatura
requerida para la amplificación. Los iniciadores ricos en GC
necesitan temperaturas más altas para evitar la hibridación cruzada
y para permitir una amplificación única. Sin embargo, en la medida
en que se incrementa el porcentaje de AT, temperaturas más altas
provocan que estos iniciadores se fundan. Por lo tanto, estos
iniciadores deben ser alargados para que la reacción funcione.
Se preparó un molde de ADN a partir del tejido
escogido para análisis utilizando una variedad de métodos bien
establecidos conocidos por aquellos capacitados en el arte.
Típicamente, se utilizaron volúmenes de reacción de 100 \mul. Se
añadieron aproximadamente 500 ng de ADN a una solución que constaba
de lo siguiente: Tris - HCl 67 mM [pH 8,8 a 25ºC]; cloruro de
magnesio 6,7 mM; sulfato de amonio 16,6 mM;
\beta-mercaptoetanol 10 mM; ácido etilen diamino
tetraacético (EDTA) 6,7 \muM, y 170 \mug/mL de albúmina de
suero bobino. Esta solución se pude preparar de antemano y parece
ser estable durante períodos de tiempo muy largos de almacenamiento
a -70º. Se añadió la enzima, Taq polimerasa, para lograr una
concentración final de 100 unidades/mL. Se mezcló suavemente la
mezcla de reacción. Se cubrió la mezcla de reacción con una capa de
aproximadamente 50 \muL de aceite de parafina, y se centrifugó el
vaso de reacción (preferiblemente en un tubo de microcentrífuga de
0,5 ml) a 14.000 x g durante 10 segundos. Se llevó a cabo la
amplificación ya sea transfiriendo manualmente los vasos de
reacción entre bloques de calentamiento rellenos con glicerol a las
temperaturas apropiadas, o transfiriendo automáticamente los vasos
de reacción con un termociclador Perkin-Elmer/Cetus
utilizando las funciones "etapa - ciclo". La reacción fue
controlada por medio de cambios de temperatura repetidos y
regulados de diferente duración. Inicialmente se calentó la reacción
hasta 94º durante 7 minutos. Posteriormente se aplicaron 25 ciclos
con las siguientes duraciones de temperatura: 94º durante 1 minuto,
luego 55º durante 45 segundos, luego 65º durante 3 ½ minutos.
Después de completar el ciclo final se incubó la reacción a 65º
durante 7 minutos adicionales. Las reacciones fueron luego
almacenadas a 4º hasta el análisis.
Se determinaron las supresiones del ADN genómico
y/o las secuencias exógenas de ADN examinando los productos de
amplificación. Por ejemplo, la carencia de un producto de
amplificación esperado indica una supresión. Se conocen muchos
métodos para esta determinación por parte de aquellos capacitados en
el arte. El método preferido involucra electroforesis de
aproximadamente una vigésima parte de la reacción sobre un gel de
agarosa al 1,4% (peso/volumen) en el siguiente amortiguador: tris -
HCl 40 mM; acetato de sodio 20 mM, EDTA 1 mM (ajustado hasta un pH
de 7,2 con ácido acético glacial), y 0,5 \mug/\mul de bromuro de
etidio. Se llevó a cabo la electroforesis a 3,7 voltios/cM durante
10 minutos por 14 cM de longitud del gel de agarosa. Se completó el
análisis examinando los productos de reacción sometidos a
electroforesis sobre un transiluminador de radiación ultravioleta,
y se fotografiaron los resultados para registros permanentes.
Cuando los análisis requieren la determinación
de los polimorfismos de la secuencia de ADN o de las mutaciones
dentro de productos de amplificación individuales, se transfiere el
gel de agarosa hasta un medio apropiado de enlazamiento de ADN tal
como nitrocelulosa utilizando procedimientos bien establecidos, por
ejemplo, transferencias de Southern. Las secuencias individuales de
ADN dentro de los fragmentos amplificados de ADN se pueden
determinar por medio de una variedad de técnicas que incluyen
hibridación del oligonucleótido específico del alelo.
Alternativamente, se pueden analizar adicionalmente los productos
de reacción antes de la electroforesis sobre gel de agarosa por
medio de amplificación competitiva del iniciador oligonucleótido,
utilizando iniciadores separados específicos del alelo para cada
secuencia amplificada de ADN de los productos de reacción de
amplificación múltiple.
Un tercer método para determinar las diferencias
en la secuencia de ADN dentro de los productos de amplificación
individuales no requiere de electroforesis. En este método, se
aplican secuencialmente alícuotas de la reacción de amplificación
múltiple a una membrana apropiada para enlazamiento del ADN tal como
nitrocelulosa, y luego se analiza cada alícuota a través de
hibridación con membranas individuales de juegos de sondas de
oligonucleótidos específicas del alelo (ASO), siendo hibridada cada
alícuota separada con un miembro de un par de sondas ASO
específicas para un miembro de las secuencias de ADN amplificado en
forma múltiple.
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Ejemplo
2
La Figura 1 es una representación esquemática
del locus de la DMD. Se ilustra la ubicación relativa de los exones
utilizados en los ejemplos de amplificación del gen para la DMD.
Para la detección de DMD, se puede utilizar una
variedad de sondas ya sea en reacciones PCR individuales o en
combinaciones en reacciones PCR múltiples. Estas sondas son
mostradas en la Tabla 1.
En la Tabla 1 cada exón está designado por a, b,
c, d, f, ó g y corresponde a la misma letra en la Fig. 1. Cuando se
conoce el número del exón se lo enlista. También se muestra el
tamaño del exón en pares de bases (pb). Las secuencias del
iniciador de la PCR se muestran en orientación 5' - 3'. El iniciador
hacia adelante (F), hibrida 5' del exón, y el iniciador inverso
(R), hibrida 3' del exón. También se muestra el tamaño del
fragmento amplificado obtenido con cada juego de iniciadores.
El porcentaje de pacientes analizados con DMD
que son suprimidos por cada exón indicado se muestra en la columna
cuatro. Este número total es menor que la suma de las frecuencias
individuales de supresión del exón debido a que muchas supresiones
abarcan múltiples exones.
En la Tabla 2 están las secuencias del exón y
del intrón flaqueo para el Exón 17. El exón es de 227 hasta 402.
Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta
secuencia son de 7 hasta 33 y de 396 hasta 421.
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\newpage
En la Tabla 3 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón d de la tabla 1 [o, el exón
localizado sobre un fragmento de Hind III de 4,1 Kb]. El exón es de
295 hasta 422. Las secuencias utilizadas del iniciador para
amplificar esta secuencia son de 269 hasta 293 y de 512 hasta
536.
En la Tabla 4 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón e de la Tabla 1 [exón del fragmento
de Hind III de 0,5 Kb]. El exón es de 396 hasta 571. Las secuencias
utilizadas del iniciador para amplificar esta secuencia son de 51
hasta 75 y de 572 hasta 597.
En la Tabla 5 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón f de la Tabla 1 [se superpone al
fragmento de Hind III de 1,2 Kb y 3,8 Kb]. El exón es de 221 hasta
406. Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta
secuencia son de 26 hasta 53 y de 516 hasta 541.
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\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 6 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón 12. El exón es de 180 hasta 329.
Las secuencias utilizadas del iniciador para amplificar esta
secuencia son de 27 hasta 52 y de 332 hasta 357.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 7 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de
Hind III de 10 Kb. El exón es de 1 hasta 150.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 8 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de
Hind III de 1,6 Kb de 512 hasta 622.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 9 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de
Hind III de 3,1 Kb. El exón es de 519 hasta 751.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 10 está el exón y las secuencias del
intrón de flanqueo para el Exón localizado sobre un fragmento de
Hind III de 1,5 Kb. El exón es de 190 hasta 337.
Ejemplo
3
Un ejemplo de diagnóstico prenatal con detección
de la supresión por PCR es demostrado por medio de la utilización
de iniciadores oligonucleótidos sintetizados (juego b, Tabla 1).
Este grupo iniciador corresponde a las secuencias del intrón que
flanquean al Exón 17 del gen para la DMD humana, una región que ha
sido aislada y secuenciada (Tabla 2).
Los resultados de este análisis se muestran en
la Figura 2. Los productos PCR (un veinteavo de la reacción total)
fueron obtenidos con ADN molde aislado a partir de un macho de
control \boxempty, siendo diagnosticado el feto macho como A, la
madre portadora de la DMD (\medcirc) y un hermano macho afectado
del feto \blacksquare. También se muestra un estándar de peso
molecular de ADN (MW; ADN de \varphiX174 digerido con Hae III).
Los resultados demuestran que el macho afectado porta una supresión
del Exón 17, que no fue amplificado, pero que el feto no porta la
supresión y por lo tanto no está afectado. Estos resultados indican
que la PCR es útil en el diagnóstico de casos de DMD que contienen
una supresión que involucra a este exón.
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Ejemplo
4
Un ejemplo de detección múltiple es mostrado en
las Figuras 3A y 3B.
Este análisis fue hecho utilizando seis pares de
iniciadores (juegos a - f, Tabla 1) y las condiciones descritas en
el Ejemplo 1. Se llevó a cabo una amplificación automática en vez de
una manual. Estos iniciadores oligonucleótidos representan las
regiones de flanqueo de seis exones separados del gen para DMD. Se
los combinó dentro de un vial de reacción y se los utilizó para
amplificaciones múltiples de ADN genómico. Se aisló el ADN molde a
partir de linfoblastos (de una muestra de sangre). El análisis se
hizo por medio de electroforesis en gel de agarosa.
Cuando se utilizó ADN sin supresiones como
molde, las seis regiones dispersas del gen para la DMD fueron
simultanea y específicamente amplificadas (Figura 3A, Muestra #
534). Las supresiones discretas, que fueron detectadas con este
método, son mostradas en las Figuras 3A y 3B. Se muestran varias
muestras de ADN que contenían supresiones normales, parciales o
totales en el gen para la DMD. Las Figuras 3A y 3B también muestran
un estándar de peso molecular de ADN (MW; ADN de \varphiX174
digerido con Hae III), y un control negativo (-) donde no se añadió
ADN molde a las reacciones. La Figura 3A también indica que
fragmento amplificado de ADN corresponde a que exón (a - f) de la
Figura 1.
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Ejemplo
5
Se ha utilizado exitosamente PCR múltiple en
varios diagnósticos prenatales. Las condiciones son como las
descritas anteriormente en el Ejemplo 1. La Figura 4 muestra una
amplificación múltiple de ADN para diagnóstico prenatal de la DMD.
Se muestran los resultados de la amplificación utilizando ADN de
machos afectados (AM; ADN de linfoblasto) y fetos machos (MF; ADN
de células de fluido amniótico) de seis familias diferentes. El
análisis fue como el descrito en el Ejemplo 1. Tanto el ADN del
macho afectado como el ADN fetal #s 521 y 531 del DRL muestran una
supresión de la región f (Figura 1). Por lo tanto, estos fetos
fueron diagnosticados como afectados. En el # 43C del DRL se
suprimieron todas las regiones del macho afectado excepto la f,
mientras que el feto no fue afectado. En el macho afectado # 483
del DRL se suprimió la región a, mientras que el feto macho no es
afectado. Ninguna de las muestras #s 485 ó 469 del DRL mostró una
supresión con esta técnica. Por lo tanto, si un defecto en una
supresión causa DMD en estas familias, esto ocurrió en un exón no
analizado.
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Ejemplo
6
La Figura 5 demuestra la amplificación múltiple
del ADN del ADN de un CVS. Tanto el macho afectado (AM; ADN de
linfoblasto) como el feto macho (MF; ADN de un CVS) de # 92 del DRL
muestran una supresión de las regiones e y f (Fig. 1). Por lo
tanto, el feto fue diagnosticado como afectado. El ADN de un CVS de
# 120 del DRL no mostró una supresión con esta técnica. Las
muestras fueron analizadas como se describe en el Ejemplo 1. Estos
resultados demuestran que la técnica de amplificación múltiple
trabaja bien para diagnóstico prenatal cuando el ADN de un CVS es
utilizado como el molde para la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Este ejemplo demuestra que siete secuencias
separadas de ADN pueden ser amplificadas simultáneamente utilizando
la técnica de amplificación múltiple. Las condiciones fueron como
las descritas en el Ejemplo 1. Se añadieron los juegos de
iniciadores a - g (Tabla 1) a la reacción. De este modo, se
amplificaron (Figura 6) siete regiones del exón del gen para DMD
(Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
- \bullet US 4683195 A [0003] [0004]
- \bullet EP 0237362 A [0007]
- \bullet US 4683202 A [0003] [0004]
- \bullet EP 0256630 A [0011]
\bulletCHEHAB. Nature, 24 de
septiembre de 1987, vol. 329, 293 - 294 [0008]
\bulletCHAMBERLAIN. American
Journal of Human Genetics, Septiembre de 1988, vol. 43 (3
[0009]
\bulletSTOFLET. Science, 29 de
enero de 1988, vol. 239, 491 - 494 [0010]
\bulletHEILIG. Nucleic Acid
Research, 1987, vol. 15 (22), 9129 - 9142 [0012]
\bulletKOENIG. Cell Press.
Cell, 22 de abril de 1988, vol. 53, 219 - 228
[0013]
\bulletCHAMBERLAIN y colaboradores,
Am. J. Human Genetics, 1988, vol. 43 (3), A17
[0014]
Claims (7)
1. Un método para detectar simultáneamente en
una muestra secuencias objetivo de ADN, que comprende las etapas
de:
- proveer en un recipiente de reacción común la muestra en forma de una sola cadena y pares de iniciadores oligonucleótidos, cada par específico para una secuencia diferente, un iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte de la secuencia en la secuencia sentido y el otro iniciador de cada par sustancialmente complementario con una parte diferente de la misma secuencia en la cadena complementaria antisentido;
- el apareamiento de los pares de iniciadores con sus secuencias complementarias;
- extender simultáneamente dichos pares de iniciadores apareados a partir de cada terminal 3' del iniciador para sintetizar un producto de extensión complementario con las cadenas apareadas a cada iniciador, dichos productos de extensión, después de la separación de su complemento, sirviendo como moldes para la síntesis de un producto de extensión del otro iniciador de cada par;
- separar dichos productos de extensión de dichos moldes para producir moléculas de una sola cadena de las secuencias objetivo;
- amplificar dichas secuencias objetivo monocatenarias por repetición, al menos una vez, dicho apareamiento, extendiendo y separando etapas; e
- identificar si dichos productos de extensión amplificados han sido sintetizados a partir de cada secuencia diferente, como una medida de la presencia o de la ausencia de cada secuencia objetivo, caracterizado porque:
- el método se adapta para detectar simultáneamente más de dos secuencias objetivo por medio de la utilización de más de dos pares de iniciadores oligonucleótidos.
2. El método de la Reivindicación 1 para
detectar supresiones de secuencias de ADN genómico, en donde dichas
secuencias se seleccionan entre el grupo de secuencias sobre los
cromosomas X y Y.
3. El método de la Reivindicación 2 para la
detección de una enfermedad ligada con X, en donde dichas secuencias
de ADN genómico contienen una supresión que provoca una enfermedad
genética.
4. El método de la Reivindicación 3 para la
detección de dichas enfermedades genéticas ligadas con X
seleccionadas del grupo que consiste de la deficiencia de ornitina
transcarbamilasa, la deficiencia de hipoxantina
fosforibosiltransferasa, la deficiencia de esteroide sulfatasa y la
distrofia muscular ligada con X.
5. El método de la Reivindicación 4 para la
detección de distrofia muscular ligada con X, en donde cada par de
dichos iniciadores es complementario con diferentes secuencias
dentro del gen que codifica para la proteína distrofina.
6. El método de la Reivindicación 5, en donde
los pares de iniciadores se seleccionan del grupo que consiste
de:
(1)
5'-GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC-3'
(2)
5'-AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC-3',
(1) 5
'-GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG-3'
(2)
5'-GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTAG-3',
(1)
5'-AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC-3'
(2)
5'-CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3',
(1)
5'-GATAGTGGGCTTTACTTACATCCTTC-3'
(2)
5'-GAAAGCACGCAACATAAGATACACCT-3',
(1)
5'-CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA-3'
(2)
5'-TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT-3',
(1)
5'-TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG-3'
(2)
5'-CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC-3',
y
(1)
5'-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3'
(2)
5'-GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC-3'.
7. El método de la Reivindicación 3, en donde
dicho ADN genómico es de tejido fetal.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25668988A | 1988-10-12 | 1988-10-12 | |
US256689 | 1988-10-12 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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ID=22973199
Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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