EP3880224A1 - Verwendung von extrakten aus den blättern der zitronenverbene (aloysia citriodora) zur steigerung der neuronalen, cerebralen verfügbarkeit von neurotransmittern, ausgewählt aus der gruppe serotonin, dopamin, noradrenalin - Google Patents

Verwendung von extrakten aus den blättern der zitronenverbene (aloysia citriodora) zur steigerung der neuronalen, cerebralen verfügbarkeit von neurotransmittern, ausgewählt aus der gruppe serotonin, dopamin, noradrenalin

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EP3880224A1
EP3880224A1 EP19813247.4A EP19813247A EP3880224A1 EP 3880224 A1 EP3880224 A1 EP 3880224A1 EP 19813247 A EP19813247 A EP 19813247A EP 3880224 A1 EP3880224 A1 EP 3880224A1
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EP
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extracts
extract
use according
leaves
lemon
Prior art date
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Pending
Application number
EP19813247.4A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Björn FEISTEL
Bernd Walbroel
Bernd L. Fiebich
Kurt Appel
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Finzelberg GmbH and Co KG
Original Assignee
Finzelberg GmbH and Co KG
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Publication date
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    • A61K2236/30—Extraction of the material

Definitions

  • the lemon verbena (plant species: Aloysia citriodora PAL ⁇ U) belongs to the genus of lemon shrubs (Aloysiae) and the verbena family (Verbenaceae).
  • Aloysia citriodora (formerly Lippia citriodora) refers to the specific scent and taste of the leaves of citrus aromas by referring to "citriodora”.
  • the genus of lemon shrubs differs from both the sweet herbs (Lippiae) with, for example, the representative "Aztec sweet herb” (Lippia dulcis TREV.) Or the “Mexican oregano” (Lippia graveolens HB & K.), as well as the approximately 250 verbena (Verbenae), which include the traditional medicinal plant "Verbena” (Verbena officinais L.).
  • the lemon verbena is a plant that comes from South America and is found mainly in the regions of Chile and Brazil. Because of the lack of frost tolerance, the lemon verbena is only grown in southern Europe, especially in France and Spain.
  • the leaves of the lemon verbena are usually light green, slightly serrated at the edge, lanceolate or tapering and hairless.
  • the length of the leaves (leaf blade) varies between 3 and 10 cm, while the leaf width can be between 0.5 and 3 cm.
  • the fresh or dried leaves of the lemon verbena are used as an aroma ingredient or as a medicinal plant.
  • the healing treatments described include the following properties: antioxidant, milk flow stimulator, pain reliever, antibacterial, antipyretic, muscle relaxant and diuretic.
  • the constituents of the essential oils and the group of flavonoids should be jointly responsible for the very broad spectrum of active ingredients. Consequently, the Ph. Eur. Monograph for lemon verbena leaves (Lemon verbena, leaf) specifies in the quality description for dried whole leaves a minimum content of 3ml / kg essential oil and 2.5% acteoside and a DC fingerprint for the presence of flavonoids .
  • the essential oil is very often cited as an active ingredient group, characteristic chromatographic analyzes are for the specific ingredients of the oil in connection with their effects not exactly described.
  • the essential oil components of the lemon verbena are used in aromatherapy. There they serve, among other things, for the treatment of nervous restlessness and stress-related exhaustion or when taking tea orally as a remedy for difficulty falling asleep or minor digestive problems.
  • Wannmacher et al. investigated the postulated sedative and anxiolytic effects of lemon verbena tea preparations, but were unable to determine any significant effects in a human randomized double-blind parallel group study in 40 healthy volunteers (Wannmacher L. et al. - Plants employed in the treatment of anxiety and insomnia: II. Effect of infusions of Aloysia triphylla on experimental anxiety in normal volunteers. Fitorick 1990; 61: 449-453). Thus, a simple aqueous liquid extract with a small amount of essential oil was not sufficiently significantly effective on the central nervous system (CNS).
  • CNS central nervous system
  • Verbena is verbena, not lemon verbena.
  • CN 102309622 (B) relates to individual glycosides from Verbena for use in cerebral ischemia. From paragraph [0007] it follows that it is verbena (Verbena officinalis).
  • Carpinella et al. in Phytotherapy Research 24 (2010) 259 - 263 describes purely ethanolic extracts from 73 different plants, which are then separated into an aqueous and an organic fraction.
  • the applied measurement system "acetyl-choline esterase inhibition” is used as a screening for diseases such as Alzheimer's.
  • WO 2005/058338 A1 relates to extracts from lemon verbena. No depletion of essential oils is described for the extracts thus obtained.
  • Veisi et al. who also produced aqueous dry extracts with thermal drying and administered this orally to rats. No anxiolytic effects in the Elevated Plus Maze from 10 mg extract / kg body weight were found (Veisi M, Shahidi S, Komaki A, Sarihi A.: Assessment of aqueous extract of Lemon verbena on anxiety-like behavior in rats. J Pharm Negative Results 2015; 6: 37-9.), But an anxiety-like behavior. Ceuterick et al.
  • the object of the present invention is to find further fields of application for lemon verbena.
  • the task is solved by extracts from leaves of the lemon shrub (Aloysia citriodora) for use in the treatment and prophylaxis of neuronal or cerebral disorders.
  • the invention describes the standardized production of extracts from the leaves of lemon verbena (Aloysia citriodora) in correlation to a specific CNS-mediated clinical picture by influencing neurotransmitters.
  • the previous areas of application can thus be expanded to include the attention deficit syndrome and / or the increase in cognitive performance as a preliminary stage of Alzheimer's disease.
  • Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) is a mental disorder that begins in childhood and is characterized by problems with attention, impulsiveness and often also hyperactivity. Up to ten percent of all children in Europe show symptoms in the sense of ADHD (boys significantly more often than girls). The symptoms can persist into adulthood with different forms. Between 30% and 70% of adolescents affected by ADHD persist in adulthood (persistence).
  • ADHD hyperactivity takes on a different character by acting as an increased restlessness. People with ADHD often show various other mental disorders, e.g. Depression, anxiety disorders and disorders of self-image and self-esteem as well as social phobias. Attention deficit hyperactivity syndrome is currently a multifactorial disorder with an inherited disposition that favors the development of the disease.
  • striatofrontal dysfunction Areas affected are areas of the brain, more precisely the frontal brain, in which motivation, cognition (information transformation), emotion and movement behavior are regulated or their interaction is coordinated. Since areas of the so-called striatum (part of the basal ganglia belonging to the cerebrum) are also affected in addition to the frontal brain, doctors speak of striatofrontal dysfunction.
  • Medicinal treatment of ADHD primarily uses stimulants that influence the dopamine metabolism in the brain. These include methylphenidate and amphetamine derivatives (DL amphetamine), which have been used around the middle of the last century. Approx. 2/3 of those affected respond to this. Antidepressants which act on the dopamine or norepinephrine household can also be used for the treatment.
  • stimulants that influence the dopamine metabolism in the brain. These include methylphenidate and amphetamine derivatives (DL amphetamine), which have been used around the middle of the last century. Approx. 2/3 of those affected respond to this.
  • Antidepressants which act on the dopamine or norepinephrine household can also be used for the treatment.
  • One cause of ADHD is an abnormality in signal processing in the brain.
  • This disorder is based on a deficiency or a reduced effect of the messenger substances (neurotransmitters) noradrenaline and dopamine.
  • attention is controlled via norepinephrine, motivation via dopamine.
  • the result of a disturbed signal processing is correspondingly difficult for those affected to concentrate on one thing and to filter external stimuli according to their importance or unimportance, i.e. an easy distraction and overstimulation of stimuli.
  • An involvement of the messenger serotonin in ADHD was also proven. Serotonin controls impulsivity and can accordingly lead to increased impulsivity, low frustration tolerance and poor behavior adjustment of those affected to the respective circumstances in the event of a disorder.
  • methylphenidate which inhibits the reuptake of dopamine and norepinephrine in the presynapses and thus increases their concentration in the synaptic cleft. This leads to an increased Signal generation at the receptor and, among other things, an increase in sympathetic tone.
  • substances that inhibit the selective noradrenaline and dopamine (also slightly serotonin) reuptake represent successful candidates for the treatment of ADHD.
  • this drug also has extensive side effects. Common side effects include: nasopharynx inflammation, decreased appetite, moderately reduced weight and size gain (after prolonged use in children), mental imbalance, anxiety, depression, irritability, cardiac arrhythmia, etc.
  • methylphenidate may aggravate the symptoms of behavioral and thinking disorders in psychotic children. There is no treatment recommendation for children under 6 years of age. With long-term use, the side effects are most likely to occur. With chronic improper use, methylphenidate can even lose its effect (development of tolerance) and lead to mental dependence.
  • Cognition information transformation
  • cognitive processes in humans are conscious, “cognition” and “consciousness” do not have the same meaning.
  • Certain processes in humans can be unconscious and yet cognitive. An example of this is unconscious learning.
  • a person's cognitive skills include, for example, attention, memory, learning, creativity, planning, orientation, imagination, reasoning, introspection, will, belief and some more. Cognitive skills are studied by various sciences, such as psychiatry, psychology, philosophy, and neuroscience.
  • Cognitive performance is therefore a complex process that can be quantified using measurable parameters of brain performance.
  • the ability to learn includes memorizing (duration and amount of input retained), the influence on the speed of reaction, the ability to perform logical operations (quickly and correctly) or spatial thinking, e.g. in an orientation phase under new or changed conditions.
  • Disorders of this cognitive performance are described with the syndrome MCI (Mild Cognitive Impairment).
  • MCI is a special condition of age-related reduction in cognitive functions and skills. The examination of MCI in healthy people can be seen as a pre-indicator for later dementia.
  • the invention thus relates to the use of extracts from the leaves of the species Aloysia citriodora (or their synonyms) for the treatment of ADHD and / or cognition and / or mild cognitive impairment and / or stress-related exhaustion /
  • somatoform disorders burn-out syndrome
  • acute and post-traumatic stress disorders chronic fatigue syndrome
  • chronic fatigue syndrome a syndrome that can be treated or prevented according to the invention
  • nervous restlessness mental stress
  • anxiety and depression as symptoms of neurotic disorders as well as stress symptoms such as fatigue and weakness.
  • the neuronal disorder is preferably not a neurodegenerative disease which is associated with accumulated proteins / peptides, that is to say in particular not Alzheimer's disease or Parkinson's.
  • the invention also relates to the use of extracts from the leaves of the species Aloysia citriodora (or their synonyms) for the manufacture of a medicament for the treatment of ADHD.
  • the invention further relates to the use of extracts from the leaves of the species Aloysia citriodora (or their synonyms) for the production of a therapeutic agent for improving cognitive performance and / or mild cognitive impairment.
  • the invention also relates to the use of extracts from the leaves of the species Aloysia citriodora (or their synonyms) for the production of a therapeutic agent for nervous restlessness (mental stress).
  • Preferred solvents are methanol, ethanol, isopropanol and mixtures thereof, with ethanol being particularly preferred.
  • the volume ratio of the alcohol-water mixture for extracting the extracts from the leaves of the lemon verbena can vary within wide limits. It is particularly preferably 99: 1 to 1:99 vol.%, Still more preferably 70: 30 to 30: 70 vol.%, Most preferably 55: 45 to 45: 55 vol on the ratio of alcohol to water in the entire mixture used for extraction).
  • Preferred ratios are 10:90 to 70:30 or 10:90 to 60:40 or 20:80 to 70:30 or 20:80 to 60:40, in each case as vol% and as alcohol: water.
  • a mixture of ethanol and water is preferably used as the extracting agent, mixing ratios of 70:30 to 30:70 vol.%, In particular 60:40 to 40:60 vol.% Or 55:45 to 45:55 vol. % are particularly suitable.
  • particularly suitable extractants are mixtures of water with contents between 10:90 to 30:90% by volume. Preferred ratios are 10:90 to 70:30 or 10:90 to 60:40 or 20:80 to 70:30 or 20:80 to 60:40, in each case as vol% and as ethanol: water. All vol .-% data refer to the volume at 21 ° C.
  • mixtures for example mixtures of water with organic solvents such as ketones or organic acids, can also be used as extractants.
  • organic solvents such as ketones or organic acids.
  • the characteristic of the selected organic solvents is that after the extraction process they have been removed again from the enriched extract by distillation, sublimation or freezing.
  • the extracts produced by means of the extracting agents mentioned above by way of example not used as such, but subjected to further purification as the primary extract.
  • Such treatment steps can be
  • extracts from the leaves of the lemon verbena and / or fractions produced from such extracts can be used individually or in combination with one another.
  • it is also preferred according to the invention to extract extracts from the leaves of the lemon verbena and / or fractions produced from such extracts individually or in combination with one another in combination with chemically synthetic substances for example non-selective monoamine reuptake inhibitors (NSMRIs), selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), selective noradrenaline reuptake inhibitors (NARIs), serotonin-norad renal in reuptake inhibitors (SNRIs), dopamine reuptake inhibitors (DRIs), selective noradrenaline dopamine reuptake inhibitors (NDRIs) or MAO inhibitors.
  • NSMRIs non-selective monoamine reuptake inhibitors
  • SSRIs selective serotonin reuptake inhibitors
  • NARIs selective noradrenaline reuptake inhibitors
  • the use according to the invention according to the embodiments described above can be a use in the form of a pharmaceutical preparation.
  • dosage forms which are generally customary and known to the person skilled in the art as such and which contain a certain concentration of lemon verbena extracts in a form which enables metered administration in pharmaceutically customary dosage forms.
  • the dosage form depends on the route of administration (oral, intravenous, intramuscular, nasal) in the manner known to the person skilled in the art and can be a solid, semi-solid, liquid, mist-like, gaseous or other form which allows administration in the desired way.
  • the use according to the invention with one of the aforementioned dosage forms can also be used as a food supplement.
  • FIG. 1 shows a thin-layer fingerprint comparison on flavonoid substances (yellow) and CCS compounds (light blue) using the example of extract fractions from lemon verbena vs. Primary extract EtOH 50% v / v. The same native proportions of the extracts were applied).
  • Figure 2b shows the Morris-Water-Maze behavior test test setup.
  • FIG. 3b shows a tele-stereo EEG determination in vivo in a control group in rats with the administration of water 1 ml / kg body weight.
  • This 70% native extract preparation is spray dried to a beige powder (temperature at the spray head 185 ° C, outlet temperature from the spray tower 105 ° C).
  • the resulting extract preparation is a beige-colored powder, characterized by an essential oil content of ⁇ 0.01%, a content of 0.06% flavonoids and 1.8% verbascoside.
  • Example 2 Extraction with 20 vol% ethanol in water
  • 1700 g of lemon verbena leaves (Folia Aloysia citriodora) are mixed twice with 10 L ethanol 20% V / V at 50 ° C and percolated for 8 hours (agitated extraction). The mixture is separated from the extracted starting material and clearly filtered through a cellulose filter at 40 pm. The filtrate is freed of the ethanol portion in a Sambay evaporator and becomes a homogeneous thick extract evaporated. The extract is freed from volatile constituents by repeated addition of water and renewed steaming in the vacuum. 182 g of drying aids are added to 611 g of a thick extract evaporated to 69.5% solids.
  • This 70% native extract preparation contains 28% maltodextrin and 2% Aerosil (silicon dioxide) and is dried in a vacuum drying cabinet at 45 ° C. The extract is then ground to a homogeneous beige-brown powder using a sieve mill with a 0.315 mm sieve. The resulting extract preparation is characterized by an essential oil content of ⁇ 0.01%, a content of 0.06% flavonoids and 4.3% verbascoside.
  • Example 3 Extraction with 50 vol% ethanol in water
  • 1700 g lemon verbena leaves (Folia Aloysia citriodora) are mixed twice with 10 L ethanol 50% V / V at 50 ° C and percolated for 8 hours (agitated extraction).
  • the batch is separated from the extracted starting material and clearly filtered through a cellulose filter 40 pm.
  • the filtrate is pre-evaporated on a plate evaporator and finally evaporated on a rotary evaporator in vacuo at 45 ° C to form the thick extract without solvents.
  • the evaporation process is repeated twice with the addition of water in order to remove all volatile constituents.
  • 206 g of drying aids are added to 750 g of a thick extract evaporated to 64.3% solids.
  • This 70% native extract preparation contains 28% maltodextrin and 2% Aerosil (silicon dioxide) and is dried in a vacuum drying cabinet at 45 ° C. The extract is then ground to a homogeneous brown powder using a sieve mill with a 0.315 mm sieve. The resulting extract preparation is characterized by an essential oil content of ⁇ 0.01%, a content of 0.51% flavonoids and 11.6% verbascoside.
  • the increasing silicon dioxide content is necessary for binding and drying the increased chlorophyll content in this lipophilic extracting agent. Finally, it is dried in a vacuum drying cabinet at 45 ° C and ground to powder in a ball mill.
  • the resulting extract preparation is a green-brown powder and is characterized by an essential oil content of ⁇ 0.1%, a content of 1.70% flavonoids and 19.6% verbascoside.
  • Table 1 Extract characterization depending on the extraction solvent
  • the drug-to-extract ratio indicates the concentration factor; it is arithmetically the reciprocal of the native extractive substance yield.
  • Example 5 Determination of the neurotransmitter noradrenaline, dopamine and serotonin influencing properties by extracts from lemon verbena leaves
  • Lemon verbena leaves compared to methylphenidate Surprisingly, all four lemon verbena extracts tested showed very good potential for inhibiting the reuptake of the three neurotransmitters. The strongest potential is shown in norepinephrine, where all four extracts show a very potent reuptake inhibition ⁇ 25 pg / mL. All four extracts are also able to inhibit the reuptake of dopamine in a dose-dependent manner.
  • the three hydroethanolic extracts show good IC50 values of max. 30 pg / mL; the aqueous extract still has a good effect, falling at least by a factor of 2.6 compared to the hydroethanolic extracts. A similar picture emerges for the influence of serotonin.
  • an aqueous extract shows the least activity. From good (extract 4) and very good (extract 2) to moderate activity (extract 3), the hydroethanolic extracts show a clear dependence on the extractant. Overall, however, the extracts show a significantly stronger activity in the serotonin reuptake inhibition compared to methylphenidate. The activity ratio of serotonin to noradrenaline is factor 86 for methylphenidate, while extract 2 or extract 4 has a factor of approx. 4.1 have. Surprisingly, a similar activity profile for influencing norepinephrine and dopamine is shown for the extracts from lemon verbena leaves, in addition to an improved serotonin influence. Based on the three most important neurotransmitters tested, the extracts are very suitable candidates for the treatment of ADHD.
  • extract 4 lipophilic extracts with pure ethanol
  • extract 2 also includes the active ingredient-determining ingredients of the starting material at the same level as a medium-polar aqueous-ethanolic extract (extract 2), if the same extract yields (here DEV 4: 1) are used.
  • extract yields here DEV 4: 1
  • extract No. 4 results in poorer galenical properties in terms of appearance (green-brown), handling (hygroscopic dry extract) and solubility (practically insoluble in an aqueous medium) compared to extract No. 2 and 3.
  • the cause here is that of the extraction agent EtOH 96% V / V favored transitions of cuticula wax and chlorophyll parts from leaves.
  • n-butanol was added three times, each with a third of the volume of the primary solution, and the mixture was stirred vigorously.
  • the phases were then separated in the separating funnel.
  • the combined three butanol phases were evaporated in vacuo on a rotary evaporator.
  • This extract phase was then dried 70% native / 30% drying aids (28% maltodextrin and 2% silicon dioxide) in a vacuum drying cabinet at 45 ° C. and ground to a homogeneous powder.
  • the remaining aqueous phase was also worked up and dried as a 70% native extract powder.
  • the filter action of the adsorber traps substances inside the adsorber. These were washed down by elution with two bed volumes of ethanol 96% v / v. The ethanolic eluate obtained was evaporated in vacuo on a rotary evaporator in a solvent-free manner. This extract phase was then dried 70% native / 30% drying aids (28% maltodextrin and 2% silicon dioxide) in a vacuum drying cabinet at 45 ° C. and ground to a homogeneous powder. Likewise, the previously collected aqueous phase, which has passed through the adsorber, was worked up and dried to a dry extract powder with 70% native content and 30% auxiliaries.
  • extract no. 9 and 10 which resulted from the adsorber resin separation.
  • the adsorber selectively separated the target substances from the water phase (extract No. 9), whereby its activity compared to the primary extract with serotonin and dopamine clearly declined.
  • norepinephrine was influenced in roughly the same order of magnitude also shows that the total extract determines the effect and not just individual lead substances / groups of substances.
  • the ethanolic extract phase from the adsorber (extract no. 10) was able to achieve a concentration of a factor of 3.2 purely in terms of manufacturing technology (12.9 for fractionation vs. 4.0 for primary extract). Exactly this order of magnitude improved the overall neurotransmitter influence.
  • nematode C. elegans is a nematode that is primarily researched in developmental biology and genetics as a model organism. An important reason is that, despite its almost 1000 body cells, it has more than 20,000 genes (human: almost 40,000), many of which have functions similar to those in mammals. Almost half of all proteins encoded in the worm genome have homologs in Homo sapiens, including a large number of known human disease genes. It is therefore a representative model organism in terms of metabolism, targeted gene expression and neuronal behavior.
  • the complete nervous system of nematodes consists of approx. 300 neurons and is made up of 2 independent parts: a larger, somatic and a smaller, pharyngeal nervous system.
  • C. elegans lives in temperate climates where it feeds on bacteria.
  • the animals are about 1 mm long and have a transparent cuticle.
  • C. elegans has a short lifespan of around 15 to 20 days (depending on the temperature and the amount of feed). They can be cultivated in a reproducible manner by placing Escherichia co // bacteria on agar plates as feed.
  • transgenic worms are used in a targeted manner, whose reaction products with defined substances can be detected directly by fluorescence measurements or by behavioral tests.
  • 6-hydroxydopamine (6-OHDA) damages dopaminergic neurons, which is used in various animal models.
  • the transgenic C. elegans strain BZ555 expresses green fluorescent protein in the dopaminergic neurons.
  • the 6-OHDA-induced neurodegeneration, or the reduction thereof, can thus be quantified by fluorescence microscopy.
  • the worms were exposed to 50 mM 6-OHDA, which reduces the fluorescence intensity of the neurons due to their degeneration.
  • Bupropion a selective noradrenaline and dopamine reuptake inhibitor (NDRI), serves as a positive control.
  • Bupropion prevents the neurotoxin 6-OHDA from entering the nerve cells and damaging them by inhibiting the norepinephrine (NA) or dopamine (DA) transporters (reuptake).
  • NA norepinephrine
  • DA dopamine
  • the damage to nerve cells with 6-OHDA in the animal model is a recognized experimental approach for ADHD (Kostrzewa RM et al.: Pharmacological models of ADHD; J Neural Transm (Vienna) 2008; 115: 287-98.)
  • the positive control confirms this in the applied here C.elegan's model.
  • the A. citriodora extract according to the invention is described, as is the positive control for the reuptake inhibition of NA and DA (see Example 5 above).
  • the A. citriodora extract according to the invention can be approx. Achieve 1/3 of the protective function of the positive control.
  • Example 10 Influence on ⁇ -amyloid-induced toxicity in the C.eleaans model:
  • the transgenic C. elegans strain CL4176 was used, which is able to express human ⁇ -amyloid (Aß 1-42).
  • Aß expression can be induced by increasing the temperature.
  • Age-synchronized and treated worms were incubated for 48 hours at 16 ° C. After raising the temperature to 25 ° C and incubating for 24 hours, the worms began to paralyze due to the toxicity of the Aß oligomer.
  • the paralysis was assessed every 2 hours (experiment according to Heiner et al: Sideritis scardica extra cts inhibit the aggregation of a-synuclein and ß-amyloid peptides in Caenorhabditis elegans used as a model for neurodegenerative diseases. Planta Medica 81 - PW_127,2015.) . Substances that counteract this toxic effect of ß-amyloid lead to a slower or later paralysis of the animals. Such substances delay neurodegeneration among others in Alzheimer's dementia. The median (PTso) was used as a comparison value, i.e. the point in time at which exactly 50% of the roundworms were paralyzed.
  • the transgenic C. elegans strain CL2355 expresses pan-neuronal human ⁇ -amyloid. This leads to cognitive disorders such as reduced chemotactic movement towards an attractant (benzaldehyde).
  • the chemotaxis index was measured, i.e. the proportion of worms that had moved to the attractant on the agar plate.
  • the control strain CL2122 expresses no ⁇ -amyloid and shows no behavioral disorders; the chemotaxis index was accordingly high. The experiment was carried out according to Heiner et al.
  • mice are trained over several days to find a platform that is not visible under the water surface and find themselves to notice their spatial position. The mice are let into the water at a distance of approx. 30 cm from the edge, whereupon the animals immediately attempt to swim with swimming movements to reach the saving platform.
  • the advantage of this measuring system which has been known since the beginning of the 1980s, compared to conventional simple labyrinths in animal experiments is that there are no local landmarks, only global ones and that the task has a high motivation factor due to the animals' flight behavior.
  • the experiment aims above all to study the (spatial) learning (recognition and memorization) of the animals under stress conditions and to measure possible influences on them.
  • the measurement parameters are the time until the platform is found, the distance traveled there, and the relative time spent in the correct quadrant of the pool. These parameters are influenced by the training effect. This typically reduces the time it takes to find and the distance to the rescue platform, as well as the quadrant stay time.
  • the training effect can also be influenced by different neurotransmitter concentrations [dissertation, Uni Freiburg 2004, Theresa Schweizer: 3,4-diaminopyridine-evoked release of neurotransmitters from brain sections of rats: examinations in the cortex and hippocampus in old rats, as well as in rats with serotonergic hippocampal lesions Afferents and intrahippocampal raphe grafts].
  • 2 groups of 6 mice were examined.
  • the first control group was formed from water-treated transgenic animals (strain AD-B6), which due to their genetic disposition manifest a strong ß-amyloid deposition within 50 days after birth, or who develop Alzheimer's.
  • the dosage was 400 mg native extract / kg body weight.
  • a behavioral biological test using Morris Water Maze starts.
  • the test includes a daily early and late test / learning session over four days.
  • the early session begins with a run without a platform for 30 seconds, recording the time the mouse is in the quadrant in which the platform is located (target quadrant).
  • the other four runs take place with an invisible platform and with 4 different starting positions.
  • Electroencephalography (from Greek encephalon brain, gräphein write) -EEG abbreviated- is a method of medical diagnostics for measuring the total electrical activity of the brain by recording the voltage fluctuations.
  • the electroencephalogram offers a standard examination method in neurology as a graphic representation of these fluctuations. For clinical evaluation, recording in at least twelve channels of different electrode combinations is required. The resulting data can be examined by trained specialists for striking patterns.
  • a common mathematical method for analyzing the EEG is the Fourier transform in the frequency domain.
  • the EEG is often divided into frequency bands (so-called EEG bands), whereby the number of bands and the exact division sometimes is specified differently. The division of the frequency bands and their limits are historically determined and do not consistently coincide with limits that are considered reasonable based on more modern studies.
  • theta band was divided into a range Theta 1 and Theta 2 in order to take into account the different meanings of the sub-areas.
  • software algorithms for assisted or automatic evaluation are used that emulate pattern recognition.
  • Brain waves can not only be measured, they can also be influenced. This can happen, among other things, as neurofeedback - a special form of biofeedback - as a result of pharmacologically active substances, such as psychotropic drugs [Dimpfel W, et al. (1996) Source Density Analysis of Functional Topographical EEG: Monitoring of Cognitive Drug Action. Eur J Med Res 1: 283-290].
  • the evaluation is also referred to as an electropharmacogram.
  • neurofeedback it is customary to subdivide the EEG bands more precisely and interpret them in more detail than in clinical EEG. An increased amplitude within the frequency ranges is associated with certain mental states or Activities correlated.
  • Theta 2 waves can be associated, for example, with memory and learning ability, concentration, and / or creativity. After extensive calibrations, conclusions can also be drawn about neurotransmitter-mediated CNS activities, which can be divided into dopaminergic, serotonergic, cholinergic or noradrenergic subgroups.
  • n 7 Fischer-344 rats were each implanted with 4 semi-microelectrodes in the 4 brain areas "frontal cortex”, “hippocampus”, “striatum” and “formatio reticularis”. The measurable potential field changes were transmitted by radio and were evaluated for an electropharmacogram.
  • the animals were treated with lemon verbena dry extract preparation according to Example 3 at a dose equivalent of 150 mg / kg body weight.
  • the single dose was dissolved in water and administered once. Water was used as a control experiment.
  • the test liquid was administered to the animals orally by gavage, followed by a 5-minute calming phase for the animal.
  • the measurement was then started over a measurement period of 5 hours.
  • the frequency data were obtained using Fast Fourier Transformation (FFT) and averaged over 60-minute periods.
  • FFT Fast Fourier Transformation
  • Comparable electropharmacograms have, for example, moclobemide, a monoamine oxidase inhibitor approved as an antidepressant, but also methylphenidate, a dopamine and norepinephrine reuptake inhibitor, with additional agonistic activity at the serotonergic receptors 5-HT1A and 5-HT2B, which is approved for the treatment of ADHD.

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Abstract

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Zubereitungen und Extrakten aus Zitronenverbene (Aloysia citriodoraoder ihrer synonymen Bezeichnungen) zur Prophylaxe von mentalem Stress, zur Steigerung kognitiver Leistungsfähigkeit sowie in der Behandlung von ADHS. Die Aufgabe wird gelöst, durch die erfindungsgemäße Verwendung von Zubereitungen und Extrakten aus Zitronenverbene (Aloysia citriodoraoder ihrer synonymen Bezeichnungen), insbesondere die Verwendung von hydroalkoholischen Extrakten. Diese Extrakte können in Lebensmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln, ergänzenden bilanzierten Diäten oder pharmazeutischen Zubereitungen eingesetzt werden.

Description

Verwendung von Extrakten aus den Blättern der Zitronenverbene
(Alovsia citriodora ) zur Steigerung der neuronalen, cerebralen Verfügbarkeit von Neurotransmittern, ausgewählt aus der Gruppe
Serotonin, Dopamin, Noradrenalin
Beschreibung
Botanisch gehört die Zitronenverbene (Pflanzen-Art: Aloysia citriodora PALÄU) zur Gattung der Zitronensträucher (Aloysiae) und der Familie der Eisenkraut gewächse (Verbenaceae).
Für die Zitronenverbene existieren in der Literatur verschiedene synonyme Begriffe: Aloysia triphylla (L'Herit.) Kuntze / Lippia citriodora Kunth/ Verbena triphylla L'Herit., welche sich auch in der europäischen Arzneibuchmonographie (Ph.Eur. Kapitel 1834) wiederfinden.
Der wissenschaftliche Name Aloysia citriodora (früher Lippia citriodora ) verweist durch den Bezug auf "citriodora" auf den spezifischen Duft und Geschmack der Blätter nach Citrusaromen. Der synonym verwendete Name von Aloysia triphylla (früher Verbena triphylla ) weist durch den Bezug "triphylla" = Dreiblatt auf die Blattanordnung an den Ästen hin.
Korrekte Internationale Bezeichnungen der Zitronenverbene lauten : Deutsch : Zitronenverbene, Zitronenstrauch
Österreichisch : Luiserkraut
Englisch : Lemon verbena, Lemon-scented verbena
Französisch : Verveine citronelle, Verveine odorante
Niederländisch : Citroenverbena, Citroenstruik
Portugiesisch : Limonette, Buona Luisa
Spanisch : Cedron, Hierba luisa
Umgangssprachlich werden oft fälschlicherweise Namen wie Zitronenkraut oder Verbenenkraut parallel benutzt. In einigen überwiegend französischsprachigen Veröffentlichungen werden unter der Bezeichnung "Vervein" gelegentlich alle
l Gattungen der Verbenaceae subsumiert abgehandelt, aber auch synonym für Verbena spp., also die Eisenkräuter verwendet, manchmal aber auch für die Zitronenverbene. Eine eindeutige Zuordnung des Begriffes "Vervein" zur Art Aloysia citriodora oder zu Verbena officinaiis ist somit nicht immer eindeutig ableitbar und muss stets im Einzelfall aus dem Zusammenhang geklärt werden.
Innerhalb der Familie der Verbenaceae unterscheidet sich die Gattung der Zitronensträucher (Aloysiae) sowohl von den Süßkräutern (Lippiae) mit beispielsweise dem Vertreter "Aztekisches Süßkraut" ( Lippia dulcis TREV.) oder dem "mexikanischen Oregano" ( Lippia graveolens H.B. & K.), als auch den rund 250 Verbenen (Verbenae), zu denen die traditionelle Heilpflanze "Echtes Eisenkraut" ( Verbena officinais L.) gehört.
Botanisch ist das auffälligste Merkmal, dass Pflanzen der Gattung Aloysia als mehrjährige bis zu 6 Meter hohe laubabwerfende Sträucher wachsen, wohingegen die Verbenen meist als einjährige Kräuter wachsen und nur etwa 70 cm groß werden, während das aztekische Süßkraut flachwachsend bodennah bleibt bis etwa 20 cm Höhe.
Die Zitronenverbene ist eine aus Südamerika stammende Pflanze, die vor allem in den Regionen Chiles und Uruguay wild zu finden ist. Wegen der fehlenden Frosttoleranz wird die Zitronenverbene nur im südlichen Europa, vor allem in Frankreich und in Spanien angebaut. Die Blätter der Zitronenverbene sind in der Regel hellgrün, am Rand leicht gesägt, lanzettlich bzw. spitz zulaufend und unbehaart. Die Länge der Blätter (Blattspreite) variiert zwischen 3 und 10 cm, während die Blattbreite zwischen 0,5 und 3 cm betragen kann. Auf den Blättern befinden sich in der Regel kleinere Punkte (sog. Öldrüsen), welche das charakteristische ätherische Öl beinhalten und den zitronenhaften Duft beim Berühren entfalten.
Von Aloysia citriodora werden gewöhnlich die Blätter verwendet, wohingegen von echtem Eisenkraut oder dem aztekischem Süßkraut die gesamten oberirdischen Pflanzenteile (Stängel, Triebspitzen, Blätter und Blüten) verwendet werden. Da es im allgemeinen Sprachgebrauch immer wieder zu Verwechslungen kommt, sind im europäischen Arzneibuch zwei separate Monographien erschienen, welche mit dem Verweis auf Blätter bei Zitronenverbene (Ph.Eur. 1834, Monographie Lemon verbena leaf) bzw. auf Herba bei Eisenkraut (Ph.Eur. 1854, Monographie Verbena officinalis herba) eine Differenzierung erlauben. Auch die analytische Leitsubstanz aus den Blättern der Zitronenverbene nach Ph.Eur. 1834, beschrieben als Acteosid, findet sich in der Literatur mit dem synonymen Namen Verbascosid, was eine klare Zuordnung oft erschwert.
Die DE 10 2011 078 432 Al beschreibt die Verwendung ätherischer Öle und deren Komponenten aus einer Vielzahl von Pflanzen in der Behandlung hyperkinetischer Störungen. Unter anderem wird in der Beschreibung in Absatz [0014] noch Eisenkraut mit Verbena officinalis richtig übersetzt, allerdings wird in den Absätzen [0036] [0046] und [049] Eisenkraut falsch mit Lippia citriodora Kunze gleichgesetzt. In den Beispielen wird keine botanische Bezeichnung mehr verwendet, jedoch in den Ansprüchen wieder auf Verbena officinalis zurück gewechselt. Dies zeigt exemplarisch, wie ungenau mit den Begrifflichkeiten umgegangen wird.
Traditionell werden die frischen oder getrockneten Blätter der Zitronenverbene als Aroma-Zutat oder als Heilpflanze eingesetzt. Die beschriebenen Heilanwendungen umfassen folgende Eigenschaften : antioxidativ, milchflussanregend, schmerzlindernd, antibakteriell, fiebersenkend, muskelentspannend und harntreibend. Für das sehr breite Wirkstoffspektrum sollen die Bestandteile der ätherischen Öle und die Gruppe der Flavonoide mitverantwortlich sein. Konsequenterweise gibt die Ph. Eur. Monographie für Zitronenverben-Blätter (Lemon verbena, leaf) in der Qualitätsbeschreibung für getrocknete ganze Blätter einen Mindestgehalt von 3ml/kg ätherisches Öl und 2,5% Acteosid sowie einen DC-Fingerprint auf das Vorhandensein von Flavonoiden vor.
Obwohl das ätherische Öl sehr oft als aktive Inhaltsstoffgruppe zitiert ist, sind charakteristische chromatographische Analysen auf die spezifischen Inhaltsstoffe des Öles in Verbindung mit ihren Wirkungen nicht genau beschrieben. So werden die ätherischen Ölbestandteile der Zitronenverbene in der Aromatherapie genutzt. Dort dienen sie u.a. bei der Behandlung nervöser Unruhezustände und stressbedingter Erschöpfung oder bei oraler Einnahme von Tee als Mittel bei Einschlafschwierigkeiten oder kleineren Verdauungsbeschwerden.
Wannmacher et al. untersuchten die postulierten sedativen und anxiolytischen Effekte von Zitronenverbene-Teezubereitungen, konnten jedoch in einer humanen randomisierten doppelblinden Parallelgruppenstudie an 40 gesunden Probanden keinerlei signifikante Wirkung feststellen (Wannmacher L. et al. - Plants employed in the treatment of anxiety and insomnia : II. Effect of infusions of Aloysia triphylla on experimental anxiety in normal volunteers. Fitoterapia 1990;61 : 449-453). Somit war ein einfacher wässriger Flüssigextrakt mit geringem Anteil an ätherischem Öl nicht ausreichend signifikant auf das zentrale Nervensystem (ZNS) wirksam.
Unter dem Namen "Planox L" werden wässrige Extrakte von Zitronenverbene beschrieben, denen ein Anti-Aging Effekt zugeschrieben wird. Gestützt wird dies auf anti-oxidative und anti-inflammatorische Eigenschaften an Epithelzellen, die bevorzugt in der Haut und im Intestinalbereich Vorkommen.
CN 107397011 (A) beschreibt einen chinesischen Kräutertee mit einer
Mischungaus neun verschiedenen Pflanzen, der als erfrischend beschrieben wird. Es handelt sich um einen wässrigen Extrakt. Die als Verbena beschriebene Inhaltskomponente ist Eisenkraut, keine Zitronenverbene.
CN 102309622 (B) betrifft einzelne Glycoside aus Verbena zur Anwendung bei cerebraler Ischämie. Aus dem Absatz [0007] ergibt sich, dass es sich dabei um Eisenkraut ( Verbena officinalis ) handelt.
Erping Xu et al., Saudi Pharmaceutical Journal 25 (2017) 660 - 665 beschreibt die Testung verschiedener pflanzlicher Inhaltsstoffe bei cerebraler Ischämie. U.a. wird eine Zubereitung von Verbena Totalglycosiden getestet. Die Zusammensetzung des Substanzgemisches ist nicht nachvollziehbar. Die Glykoside stammen aus Verbena, der englischsprachigen Bezeichnung für Eisenkraut, nicht aus Zitronenverbene.
Carpinella et al. in Phytotherapy Research 24 (2010) 259 - 263 beschreibt rein ethanolische Extrakte von 73 verschiedenen Pflanzen, die anschließend in eine wässrige und eine organische Fraktion aufgetrennt werden. Das angewandte Meßsystem „Acetyl-Cholin-Esterase-Inhibition" wird als Screening für Krankheiten wie Alzheimer benutzt.
DE 10 2007 052 223 Al betrifft Extrakte aus Verbena officinalis L, also Eisenkraut ; siehe Absatz [0002].
WO 2005/058338 Al betrifft Extrakte aus Zitronenverbene. Es wird für die so erhaltenen Extrakte keine Abreicherung von ätherischen Ölen beschrieben.
Für einen wässrig hergestellten Extrakt, der durch Gefriertrocknung frei von ätherischem Öl hergestellt wurde, postulieren Ragone et al. ebenfalls eine sedierende und anxiolytische Wirkung, welche über eine GABA-A- Rezeptor- Affinität vermittelt sein soll. Im Open-field-Test wurde dies an Mäusen untersucht sowie eine herzschonende negativ inotrope Aktivität, nachgewiesen am isolierten Rattenherz gezeigt, (Ragone MI, Sella M, Pastore A, Consolini AE. Sedative and Cardiovascular Effects of Aloysia citriodora Palau, on Mice and Rats. Latin American Journal of Pharmacy (Lat Am J Pharm) 2010; 29(l) :79-86.). Somit konnte für einen wässrig hergestellten Trockenextrakt ohne ätherischen Öl-Anteil ebenfalls eine ZNS-Aktivität nachgewiesen werden.
Dies wurde bestätigt durch Untersuchungen von Veisi et al., welche ebenfalls wässrig hergestellte Trockenextrakte mit thermischer Trocknung herstellten und dies an Ratten oral verbreichten. So wurden keine anxiolytischen Effekte im Elevated-Plus-Maze ab 10 mg Extrakt/kg Körpergewicht festgestellt (Veisi M, Shahidi S, Komaki A, Sarihi A. : Assessment of aqueous extract of Lemon verbena on anxiety-like behavior in rats. J Pharm Negative Results 2015; 6: 37-9.), sondern eine angstfördernde Wirkung ("anxiety-like behavior"). Ceuterick et al. ermitteln bei der Auswertung der ethnobotanischen Verwendung von Heilpflanzen unter Kolumbianern in London u.a. die Zitronenverbene mit anxiolytischen, sedativen und antidepressiven Anwendungen (Ceuterick M., Vandebroek I., Torry B., Pieroni A.- Cross-cultural adaptation in urban ethnobotany: The Colombian folk pharmacopoeia in London, Journal of Ethnopharmacology 120 (2008) 342-359). Stofflich beschrieben wurde stets die Verwendung von Tee aus frischen oder getrockneten Blättern und somit rein wässrigen Auszügen. Die Beeinflussung des Inhaltsstoffspektrums eines Zitronenverbene-Blattextraktes durch Veränderung des Herstellverfahrens (z.B. durch das Auszugsmittel) und in Korrelation zu einer das ZNS beeinflussenden Eigenschaft ist bislang nicht beschrieben. Ebenso gibt es keine näheren analytischen Hinweise zu den wirksamkeitsbeteiligten Inhaltsstoffgruppen bei einer ZNS beeinflussenden Eigenschaft.
Keines der Dokumente zeigt Wirkungen von Extrakten, die mit wässrigem Ethanol aus Zitronenverbene hergestellt werden und praktisch frei von ätherischen Ölen sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Anwendungsgebiete für Zitronenverbene zu finden. Gelöst wird die Aufgabe durch Extrakte aus Blättern des Zitronenstrauches (Aloysia citriodora) zur Verwendung in der Behandlung und Prophylaxe von neuronalen oder cerebralen Störungen.
Die Erfindung beschreibt die standardisierte Herstellung von Extrakten aus den Blättern von Zitronenverbene (Aloysia citriodora) in Korrelation zu einem spezifischen ZNS-vermittelten Krankheitsbild durch Beeinflussung von Neurotransmittern. Damit lassen sich die bisherigen Anwendungsbereiche auf die Indikationsbereiche Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom und/oder die Steigerung der kognitiven Leistungsfähigkeit als Vorstufe der Alzheimer Erkrankung erweitern. Das Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) ist eine bereits im Kindesalter beginnende psychische Störung, die sich durch Probleme mit der Aufmerksamkeit sowie Impulsivität und häufig auch Hyperaktivität auszeichnet. Bis zu zehn Prozent aller Kinder in Europa zeigen Symptome im Sinne einer ADHS (Jungen deutlich häufiger als Mädchen). Die Symptome können mit unterschiedlicher Ausprägung bis in das Erwachsenenalter hinein fortbestehen. Zwischen 30 % und 70 % der ADHS-betroffenen Jugendlichen besteht die Störung auch im Erwachsenenalter fort (Persistenz).
Im Erwachsenenalter nimmt Hyperaktivität einen veränderten Charakter an, indem sie sich als erhöhte innere Unruhe auswirkt. ADHS-Betroffene zeigen häufig auch verschiedene andere psychische Störungen z.B. Depressionen, Angststörungen und Störungen des Selbstbildes und Selbstwertgefühls sowie soziale Phobien. Das Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom ist nach derzeitigem Stand ein multifaktoriell bedingtes Störungsbild mit einer erblichen Disposition, welche die Ausbildung der Krankheit begünstigt.
Auf neurobiologischer Ebene wird ADHS oft mit einer striatofrontale Dysfunktion erklärt. Betroffen sind Bereiche des Gehirns, genauer des Frontalhirns, in denen die Motivation, Kognition (Informationsumgestaltung), Emotion und das Bewegungsverhalten reguliert bzw. deren Zusammenwirken koordiniert wird. Da neben dem Frontalhirn auch Bereiche des so genannten Striatums (Teil der zum Großhirn gehörenden Basalganglien) betroffen sind, sprechen Mediziner von einer striatofrontalen Dysfunktion.
Prävalenzschätzungen in Deutschland zwischen 2009 und 2014 belegen die erhöhte Häufigkeit von ADHS-Diagnosen bei 0- bis 17-Jährigen von 5,0 % auf 6,1 % und bei 18- bis 69-Jährigen von 0,2 % auf 0,4 %. Es handelt sich um eine der am meisten verbreiteten chronischen Erkrankungen bei Kindern und Jugendlichen. Diese tritt bei Jungen häufiger auf als bei Mädchen, ebenso öfters bei Kindern als bei Jugendlichen. Jungen mit rd. 9 Jahren stellen das Maximum mit 13,9 % Betroffenen dar. (Bachmann CJ, Philipsen A, Hoffmann F: ADHD in Germany: trends in diagnosis and pharmacotherapy— a country-wide analysis of health Insurance data on attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) in children, adolescents and adults from 2009-2014. Dtsch Arztebl Int 2017; 114: 141-8. DOI: 10.3238/arztebl.2017.0141).
Während bei Erwachsenen mit ADHS-Diagnose die Verordnung von ADHS - Medikamenten zunahm (meistverordnete Wirkstoffe waren Methylphenidat, gefolgt von Atomoxetin und Lisdexamfetamin), sank die Verordnungsrate bei Kindern und Jugendlichen. Der Bedarf an alternativen Wirkstoffen ist sehr groß.
Zur medikamentösen Behandlung des ADHS werden in erster Linie Stimulanzien eingesetzt, welche den Dopamin Stoffwechsel im Gehirn beeinflussen. Dazu gehören Methylphenidat und Amphetaminderivate (DL Amphetamin), die etwa seit Mitte des letzten Jahrhunderts verwendet werden. Ca. 2/3 der Betroffenen sprechen darauf an. Weiterhin können auch auf den Dopamin- oder Noradrenalin Haushalt wirkende Antidepressiva zur Behandlung eingesetzt werden.
Eine Ursache für ADHS ist eine Abnormität der Signalverarbeitung im Gehirn. Diese Störung basiert auf einem Mangel oder einer verminderten Wirkung der Botenstoffe (Neurotransmitter) Noradrenalin und Dopamin. Über Noradrenalin wird beispielsweise die Aufmerksamkeit gesteuert, über Dopamin die Motivation. Resultat einer gestörten Signalverarbeitung sind entsprechend Schwierigkeiten der Betroffenen, sich auf eine Sache zu konzentrieren und äußere Reize auf deren Wichtigkeit oder Unwichtigkeit zu filtern, also eine leichte Ablenkbarkeit und Reizüberflutung. Zudem wurde eine Beteiligung des Botenstoffes Serotonin an ADHS nachgewiesen. Serotonin steuert die Impulsivität und kann entsprechend bei einer Störung zu einer gesteigerten Impulsivität, einer geringen Frustrationstoleranz und einer schlechten Verhaltensanpassung der Betroffenen an die jeweiligen Gegebenheiten führen.
Die heute zur Therapie des Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndroms am häufigsten eingesetzte Substanz Methylphenidat hemmt die Wiederaufnahme von Dopamin und Noradrenalin in den Präsynapsen und erhöht so deren Konzentration im synaptischen Spalt. Dies führt zu einem erhöhten Signalaufkommen am Rezeptor und unter anderem zu einer Erhöhung des Sympathikotonus. Somit stellen Substanzen, welche die selektive Noradrenalin- und Dopamin- (geringfügig auch Serotonin-) Wiederaufnahme hemmen, erfolgreiche Kandidaten zur Behandlung von ADHS dar. Doch auch ein umfangreiches Nebenwirkungspotential zeichnet diesen Wirkstoff aus. Unter häufig vorkommenden Nebenwirkungen sind bekannt: Nasen-Rachen- Entzündung, verminderter Appetit, mäßig verringerte Gewichts- und Größenzunahme (bei längerer Anwendung bei Kindern), seelisches Ungleichgewicht, Angst, Depression, Reizbarkeit, Herzrhythmusstörungen u.a.
Klinische Erfahrungen deuten darauf hin, dass Methylphenidat die Symptome von Verhaltens- und Denkstörungen bei psychotischen Kindern verstärken kann. Für Kinder unter 6 Jahren gibt es keine Behandlungsempfehlung. Bei Langzeiteinnahme stellen sich die Nebenwirkungen am ehesten ein. Bei chronischem nicht bestimmungsgemäßem Gebrauch kann Methylphenidat seine Wirkung sogar verlieren (Toleranzentwicklung) und zu seelischer Abhängigkeit führen.
Kognition (Informationsumgestaltung) ist ein messbares Kriterium innerhalb der striatofrontalen Dysfunktion. Wenngleich„Kognition" oft uneinheitlich verwendet wird, ist mit„Kognition" das Denken in einem umfassenden Sinne gemeint. Auch wenn viele kognitive Prozesse im Menschen bewusst sind, haben„Kognition" und „Bewusstsein" nicht die gleiche Bedeutung. Bestimmte Prozesse im Menschen können unbewusst und dennoch kognitiv sein. Ein Beispiel hierfür ist das unbewusste Lernen. Zu den kognitiven Fähigkeiten eines Menschen zählen zum Beispiel die Aufmerksamkeit, die Erinnerung, das Lernen, die Kreativität, das Planen, die Orientierung, die Imagination, die Argumentation, die Selbstbeobachtung, der Wille, das Glauben und einige mehr. Kognitive Fähigkeiten werden von verschiedenen Wissenschaften, wie der Psychiatrie, der Psychologie, der Philosophie und den Neurowissenschaften untersucht.
Die kognitive Leistungsfähigkeit ist daher ein komplexer Prozess, der mit messbaren Parametern an Gehirnleistung quantifiziert werden kann. Die Fähigkeit zu Lernen umfasst sowohl Memorieren (Dauer und Menge an behaltenem Input), als auch den Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit, die Fähigkeit logische Operationen (schnell und richtig) durchzuführen oder räumliches Denkvermögen, z.B. in einer Orientierungsphase unter neuen oder veränderten Bedingungen. Störungen dieser kognitiven Leistungsfähigkeit werden unter anderem mit dem Syndrom MCI (Mild Cognitive Impairment) beschrieben. MCI stellt eine Sonderbedingung der altersbedingten Minderung kognitiver Funktionen und Fähigkeiten dar. Die Überprüfung des MCI kann an gesunden Menschen als ein Präindikator für spätere Demenzen angesehen werden.
Überraschend wurde nun gefunden, dass Extrakte aus den Blättern der Zitronenverbene (Aloysia citriodora) bei Synaptosomen aus Rattencortex stark hemmende Eigenschaften auf die Wiederaufnahme von Noradrenalin und Dopamin sowie auch hemmend auf Serotonin hatten. Außerdem konnte die durch in-vitro-Ergebnisse gefundene Eignung bei ADHS in in-vivo-Versuche an Fadenwürmern, mittels EEG-Aufnahmen an Mäusen und zusätzlich in einem Verhaltensmodell (Moris-Water-Maze) an Mäusen bestätigt werden.
Neu entdeckt wurde, das besonders der Bereich der Kognition durch die orale Verabreichung von hydroethanolischen Extrakten aus Zitronenverbene vorteilhaft unterstützt wird.
Es wurde auch gefunden, dass die regelmäßige, dosierte Einnahme von Extrakten aus Zitronenverbene, wie das Trinken eines Instantzubereitung, einen deutlichen Behandlungseffekt bei ADHS Patienten zeigte.
Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Extrakten aus den Blättern der Species Aloysia citriodora (oder ihrer synonymen Bezeichnungen) zur Behandlung von ADHS und/oder der Kognition und/oder von Mild Cognitive Impairment und/oder stressbedingten Erschöpfungszuständen/
Belastungsstörungen. Erkrankungen, die erfindungsmäß behandelt oder vorgebeugt werden können sind u.a. somatoforme Erkrankungen (Burn-Out-Syndrom), akute und posttraumatische Belastungsstörungen, chronisches Müdigkeitssyndrom; nervöse Unruhe (mentaler Stress), Angst und Depression als Symptome neurotischer Störungen sowie Stresssymptome wie Müdigkeit und Schwächegefühl.
Bevorzugt handelt es sich bei der neuronalen Störung nicht um eine neurodegenerative Erkrankung, welche mit akkumulierten Proteinen/Peptiden in Verbindung gebracht wird, also insbesondere nicht um Alzheimererkrankung oder Parkinson.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Extrakten aus den Blättern der Species Aloysia citriodora (oder ihrer synonymen Bezeichnungen) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ADHS.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Extrakten aus den Blättern der Species Aloysia citriodora (oder ihrer synonymen Bezeichnungen) zur Herstellung eines Therapiemittels zur Besserung der kognitiven Leistungsfähigkeit und/oder Mild Cognitive Impairment.
Die Erfindung betrifft ebenfalls auch die Verwendung von Extrakten aus den Blättern der Species Aloysia citriodora (oder ihrer synonymen Bezeichnungen) zur Herstellung eines Therapiemittels bei nervöser Unruhe (mentalem Stress).
Die Erfindung wird nachfolgend anhand bevorzugter Ausführungsformen und einzelner Beispiele, die ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen betreffen, erläutert. In bevorzugten Verwendungen gemäß der Erfindung kommen getrocknete, geschnittene Blätter der Zitronenverbene, welche die Qualitätskriterien der Ph. Eur. Monographie erfüllen, für die vorgenannten Zwecke zur Anwendung. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kommen Extrakte, hergestellt aus getrockneten Blättern der Zitronenverbene Ph.Eur. zur Anwendung. Alternativ dazu ist es auch möglich, Blätter und Extrakte aus Blättern der Zitronenverbene zusammen zu verwenden. Wenn Extrakte aus den Blättern der Zitronenverbene verwendet werden, sind dies beispielsweise alkoholisch-wässrige Extrakte. Alkohol bedeutet in diesem Zusammenhang niedere (CI bis C4)-Alkohole, die sich alle mit Wasser mischen. Bevorzugte Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol, Isopropanol und Mischungen davon, wobei Ethanol besonders bevorzugt ist. Das Volumenverhältnis der Alkohol-Wasser-Mischung für die Gewinnung der Extrakte aus den Blättern der Zitronenverbene kann in weiten Grenzen schwanken. Es liegt besonders bevorzugt bei 99: 1 bis 1 :99 Vol.-%, noch weiter bevorzugt bei 70: 30 bis 30 :70 Vol.-%, am meisten bevorzugt bei 55 :45 bis 45: 55 Vol.-% (bezogen auf das Verhältnis Alkohol zu Wasser in der gesamten, zur Extraktion verwendeten Mischung). Bevorzugte Verhältnisse sind 10:90 bis 70: 30 oder 10:90 bis 60:40 oder 20:80 bis 70 :30 oder 20:80 bis 60:40, jeweils als Vol-% und als Alkohol : Wasser.
Bevorzugt wird als Extraktionsmittel eine Mischung von Ethanol und Wasser eingesetzt, wobei Mischungsverhältnisse von 70 :30 bis 30 :70 Vol.-%, insbesondere 60:40 bis 40:60 Vol.-% oder 55:45 bis 45: 55 Vol.-% besonders geeignet sind. In anderen Ausführungsformen sind besonders geeignete Extraktionsmittel Mischungen von Wasser mit Gehalten zwischen 10:90 bis 30:90 Vol.-%. Bevorzugte Verhältnisse sind 10:90 bis 70 : 30 oder 10:90 bis 60 :40 oder 20:80 bis 70: 30 oder 20 :80 bis 60:40, jeweils als Vol-% und als Ethanol : Wasser. Alle Angaben zu Vol.-% beziehen sich auf das Volumen bei 21°C.
Als Extraktionsmittel können jedoch auch andere Mischungen, beispielsweise Mischungen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln wie Ketonen oder organischen Säuren angewandt werden. Das Merkmal der ausgewählten organischen Lösungsmittel besteht darin, dass diese nach dem Prozess der Extraktion wieder aus dem angereicherten Extrakt durch Destillation, Sublimation oder Ausfrieren entfernt wurden.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die mittels der vorstehend beispielhaft genannten Extraktionsmittel hergestellten Extrakte nicht als solche verwendet, sondern als Primärextrakt einer weiteren Aufreinigung unterzogen. Derartige Behandlungsschritte können sein
- die enzymatische Behandlung wässriger Auszüge im Beisein von Zellbestandteilen;
- die Entfernung von ätherischen Öl-Anteilen und flüchtigen organischen Bestandteilen durch Destillation, bevorzugt azeotrope Destillation;
- die Entfernung von ätherischen Öl-Anteilen und lipophilen Bestandteilen wie Pflanzenharzen und Chlorophyll durch eine Flüssig-Flüssig- Aufreinigung mittels aliphatischer Kohlenwasserstoffe
- die Anreicherung polarer, wertgebender Inhaltsstoffe durch eine Flüssig- Flüssig- Extraktion mit n-Butanol oder Ethylacetat;
- die Anreicherung polarer, wertgebender Inhaltsstoffe durch eine Flüssig- Fest-Extraktion an festen Phasen wie organischen Adsorberpolymeren.
Die Durchführung der aufgeführten Reinigungsschritte bzw. das Gewinnen von Extrakt-Fraktionen, die aus den genannten Primärextrakten gewonnen wurden, kann auf beliebigen, dem Fachmann als solches bekannten Wegen geschehen und bedarf daher an dieser Stelle keiner weiteren näheren Erläuterung.
Weiter können in anderen bevorzugten Ausführungsformen gemäß der Erfindung Extrakte aus den Blättern der Zitronenverbene und/oder aus solchen Extrakten hergestellte Fraktionen einzeln oder in Kombination miteinander verwendet werden. Genauso ist es auch erfindungsgemäß bevorzugt, Extrakte aus den Blättern der Zitronenverbene und/oder aus solchen Extrakten hergestellte Fraktionen einzeln oder in Kombination miteinander in Kombination mit chemisch-synthetischen Stoffen, z.B. nicht-selektiven Monoaminwieder aufnahmehemmern (NSMRIs), selektiven Serotoninwiederaufnahmehemmer (SSRIs), selektiven Noradrenalinwiederaufnahmehemmer (NARIs), Serotonin- Norad renal in-Wiederaufnahmehemmern SNRIs), Dopaminwiederaufnahme- hemmern (DRIs), selektive Noradrenalin-Dopamin-Wiederaufnahmehemmern (NDRIs) oder MAO-Hemmern zu verwenden. Die erfindungsgemäße Verwendung gemäß den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen kann eine Verwendung in Form einer pharmazeutischen Zubereitung sein. Als solche kann sie allgemein übliche und dem Fachmann als solche bekannte Darreichungsformen annehmen, die eine bestimmte Konzentration an Zitronenverbene-Extrakten in einer Form enthalten, die eine dosierte Verabreichung in pharmazeutisch üblichen Darreichungsformen ermöglicht. Die Darreichungsform richtet sich in der für den Fachmann bekannten Weise nach dem Verabreichungsweg (oral, intravenös, intramuskulär, nasal) und kann eine feste, halbfeste, flüssige, nebelartige, gasförmige oder andere die Verabreichung auf dem gewünschten Weg erlaubende Form sein. Daneben kann die erfindungsgemäße Verwendung mit einer der vorgenannten Darreichungsformen ebenfalls in einer Verwendung als Nahrungsergänzungs mittel bestehen.
Die folgenden Beispiele einer bevorzugten Ausführungsform erläutern die Erfindung.
Figur 1 zeigt einen Dünnschicht-Fingerprintvergleich auf Flavonoid-Substanzen (gelb) und CCS-Verbindungen (hellblau) am Beispiel von Extrakt-Fraktionen aus Zitronenverbene vs. Primärextrakt EtOH 50% V/V. Es wurden gleiche Nativanteile der Extrakte aufgetragen).
Figur 2a zeigt einen Morris-Water-Maze Verhaltenstest in-vivo.
Figur 2b zeigt den Morris-Water-Maze Verhaltenstest Testaufbau.
Figur 2c zeigt die Wirkung von Zitronenverbene-Extrakten (EtOH 20% V/V und 50% V/V) auf die Gedächtnisleistung im kognitiven Testmodell an Mäusen (n=6).
Figur 3a zeigt eine Tele-Stereo-EEG Bestimmung in-vivo; n = 7 Ratten bei Einsatz des erfindungsgemäßen Zitronenverbene Extrakts (EtOH 50% V/V); 150 mg/kg Körpergewicht und eine schnelle ZNS Aktivität binnen 65 min. Figur 3b zeigt eine Tele-Stereo-EEG Bestimmung in-vivo bei Kontrollgruppe an Ratten mit der Gabe von Wasser 1 ml_/kg Körpergewicht.
Figur 3c zeigt eine Tele-Stereo-EEG Bestimmung in-vivo bei Einsatz des erfindungsgemäßen Zitronenverbene-Extrakts (EtOH 50% V/V) - Charge UB2010-98 an gesunden Ratten (n=8) im Vergleich zu synthetischen Wirkstoffen und Ginkgo-Extrakt Ph.Eur. Qualität.
Herstellung und Charakterisierung von Extrakten aus Zitronenverbene- Blättern:
Beispiel 1 : Extraktion mit Wasser
1500 g Zitronenverbene-Blätter (Folia Aloysia citriodora) werden 2 mal mit 15 L Osmosewasser bei 80°C versetzt und 8 Stunden lang unter gelegentlichem Rühren (bewegte Mazeration) extrahiert. Der Ansatz wird zum Abkühlen über Nacht stehen gelassen. Das Eluat wird von dem extrahierten Ausgangsmaterial getrennt, über einen Cellulosefilter klar filtriert. Das Filtrat wird am Plattenverdampfer zu einem viskosen Dickextrakt eingedampft. Der Eindampfvorgang wird unter Zugabe von Wasser noch 2 mal wiederholt, um alle flüchtigen Bestandteile zu entfernen. Zu 622 g eines auf 71,4% Feststoffanteil eingedampften Dickextraktes werden 190 g des Trocknungshilfstoffes Maltodextrin zugegeben. Diese 70% native Extraktzubereitung wird zu einem beigen Pulver sprühgetrocknet (Temperatur am Sprühkopf 185°C, Auslass- Temperatur vom Sprühturm 105°C). Die resultierende Extraktzubereitung ist ein beige-farbenes Pulver, charakterisiert durch einen Anteil an ätherischem Öl von < 0,01%, einen Gehalt von 0,06% Flavonoiden und 1,8% Verbascosid.
Beispiel 2: Extraktion mit 20 Vol-% Ethanol in Wasser
1700 g Zitronenverbene-Blätter (Folia Aloysia citriodora) werden 2 mal mit 10 L Ethanol 20% V/V bei 50°C versetzt und 8 Stunden lang perkoliert (bewegte Extraktion). Der Ansatz wird von dem extrahierten Ausgangsmaterial getrennt und über einen Cellulosefilter mit 40 pm klar filtriert. Das Filtrat wird in einem Sambay-Verdampfer vom Ethanol-Anteil befreit und zum homogenen Dickextrakt eingedampft. Durch mehrfache Zugabe von Wasser und erneutes Beidampfen im Unterdrück wird der Extrakt von flüchtigen Bestandteilen befreit. Zu 611 g eines auf 69,5% Feststoffanteil eingedampften Dickextraktes werden 182 g Trocknungshilfstoffe zugegeben. Diese 70% native Extraktzubereitung enthält 28% Maltodextrin und 2% Aerosil (Siliziumdioxid) und wird im Vakuumtrockenschrank bei 45°C getrocknet. Der Extrakt wird anschließend zu einem homogenen beige-braunen Pulver über eine Siebmühle mit 0,315 mm Sieb vermahlen. Die resultierende Extraktzubereitung ist charakterisiert durch einen Anteil an ätherischem Öl von < 0,01%, einen Gehalt von 0,06% Flavonoiden und 4,3% Verbascosid.
Beispiel 3: Extraktion mit 50 Vol-% Ethanol in Wasser
1700 g Zitronenverbene-Blätter (Folia Aloysia citriodora) werden 2 mal mit 10 L Ethanol 50% V/V bei 50°C versetzt und 8 Stunden lang perkoliert (bewegte Extraktion). Der Ansatz wird von dem extrahierten Ausgangsmaterial getrennt und über einen Cellulosefilter 40 pm klar filtriert. Das Filtrat wird an einem Plattenverdampfer voreingedampft und final am Rotationsverdampfer im Vakuum bei 45°C zum Dickextrakt lösemittefrei eingedampft. Der Eindampfvorgang wird unter Zugabe von Wasser noch 2 mal wiederholt, um alle flüchtigen Bestandteile zu entfernen. Zu 750 g eines auf 64,3% Feststoffanteil eingedampften Dickextraktes werden 206 g Trocknungshilfstoffe zugegeben. Diese 70% native Extraktzubereitung enthält 28% Maltodextrin und 2% Aerosil (Siliziumdioxid)und wird im Vakuumtrockenschrank bei 45°C getrocknet. Der Extrakt wird anschließend zu einem homogenen braunen Pulver über eine Siebmühle mit 0,315 mm Sieb vermahlen. Die resultierende Extraktzubereitung ist charakterisiert durch einen Anteil an ätherischem Öl von < 0,01%, einen Gehalt von 0,51% Flavonoiden und 11,6% Verbascosid.
Beispiel 4: Extraktion mit 96 Vol-% Ethanol
1500 g Zitronenverbene-Blätter (Folia Aloysia citriodora) werden 2 mal mit 15 L Ethanol 96% V/V bei Raumtemperatur 20°C versetzt und 8 Stunden lang unter gelegentlichem Rühren (bewegte Mazeration) extrahiert. Der Ansatz wird von der Droge getrennt und über einen Cellulosefilter 40 pm klar filtriert. Das klare grünliche Filtrat wird am Plattenverdampfer zum Dickextrakt eingedampft. Der Eindampfvorgang wird unter Zugabe von Wasser noch 2 mal wiederholt, um alle flüchtigen Bestandteile zu entfernen. Zu 190 g eines auf 65,8% Feststoffanteil eingedampften Dickextraktes werden 54 g Trocknungshilfsstoffe zugegeben. Diese 70% native Extraktzubereitung enthält 20% Maltodextrin sowie 10% Aerosil. Der steigende Siliziumdioxid-Anteil ist zur Bindung und Trocknung der erhöhten Chlorophyll-Anteile bei diesem lipophilen Extraktionsmittel notwendig. Final wird im Vakuumtrockenschrank bei 45°C getrocknet und in einer Kugelmühle zu Pulver gemahlen. Die resultierende Extraktzubereitung ist ein grünbraunes Pulver und charakterisiert durch einen Anteil an ätherischem Öl von < 0,1%, einen Gehalt von 1,70% Flavonoiden und 19,6% Verbascosid.
Charakterisierung der Extrakte
Tabelle 1 : Extraktcharakterisierung in Abhängigkeit des Extraktionslösemittels Das Droge-zu-Extrakt-Verhältnis gibt den Aufkonzentrierungsfaktor an; es ist rechnerisch der reziproke Wert der nativen Extraktivstoffausbeute.
Alle vergleichenden Ansätze wurden aus ein und derselben Charge an Zitronenverbene-Blättern generiert. Diese Charge entsprach der Qualität Ph.Eur. (Gehalt an Ätherisch Öl 0,5 %; Gehalt an Acteosid 5,6 %). Aus allen Herstellungsvarianten resultierten ätherisch Öl freie Extraktzubereitungen mit verschiedenen Lösungseigenschaften, Aussehen und verschiedenen Gehalten an polaren Inhaltsstoffen wie den Flavonoiden oder Verbascosid (Phenylethanoid). Die Flavonoide wurden als Gruppenbestimmung per UV-Spektroskopie in Analogie zur Ph.Eur. Methode von Birkenblättern mit der Referenzsubstanz Hyperosid durchgeführt. Verbascosid ist der Synonym-Name zu Acteosid, dessen Bestimmung analog der Acteosid-HPLC-Methode von Zitronenverbene-Blättern analog Ph.Eur. 1834 erfolgte.
Beispiel 5: Bestimmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Dopamin und Serotonin beeinflussenden Eigenschaften durch Extrakte aus Zitronenverbene- Blättern
Frisch isolierte Synapotosomen aus Ratten wurden nach Perovic und Müller [Perovic S, Müller WE, 1995, Arzneimittelforschung 45; 1145-1148] sowohl für einen Dopamin-Wiederaufnahme-Test, Serotonin-Wiederaufnahme-Test, als auch für einen Noradrenalin-Wiederaufnahme-Test verwendet. Als Liganden dienten [3H]-Dopamin, [3H]-Noradrenalin bzw. [3H]-Serotonin. Die Testsubstanz wurde mit den Synaptosomen und dem entsprechenden Liganden für 15 min bei 37°C in Dunkelheit inkubiert. Die Proben wurden dann auf GF/C-Filterplatten übertragen und zweimal kalt gewaschen und getrocknet, bevor die filtergebundene Radioaktivität mit einem Mikrotiterplattencounter (Microbeta, Wallac, Finnland) gemessen wurde. Zur Bestimmung der 100%igen Wiederaufnahme wurde der Versuch ohne Testsubstanzen durchgeführt. Als 0%- Aufnahme galt der Messwert bei Inkubation mit entsprechenden Inhibitoren (GBR12909 bei der Dopamin-Wiederaufnahmehemmung, Protripyline bei der Noradrenalin- Wiederaufnahmehemmung und Imipramin-Hydrochlorid für die Serotonin- Wiederaufnahmehemmung).
Für ein erstes Screening zur Eignung der Extrakte bei ADHS empfiehlt sich nach Sommer et al. (Sommer et al. : Ein pflanzliches Arzneimittel im Vergleich zu Methylphenidat: Ein alternativer Weg in der zukünftigen Behandlung von ADHS?, GPT-Posterbeitrag zum GPT Phytokongress im September 2017 in Münster, Zeitschrift für Phytotherapie Ausgabe S 01 Volume 38 DOI : 10.1055/S-007- 34868) eine mittlere Wiederaufnahmehemmung im Bereich < 50 pg/mL für Dopamin oder Noradrenalin, für ein Kombinationsarzneimittel mit rd. 20 pg/mL als potentes Beispiel angegeben. Markowitz et al. fanden für Serotonin einen deutlich schwächeren Effekt und bestätigen die Effekte für Noradrenalin und Dopamin (Moskowitz et al. : A Comprehensive In Vitro Screening of d-, /-, and /t/ireo-Methylphenidate, Journal of child and adolescent Psychopharmacology 16, 2006, 687-698).
Tabelle 2: Neurotransmitter-Wiederaufnahmehmmung durch Extrakte aus
Zitronenverbene-Blättern im Vergleich zu Methylphenidat Überraschend zeigte sich für alle vier geprüften Zitronenverbene-Extrakte ein sehr gutes Potential zur Wiederaufnahmehemmung der drei Neurotransmitter. Das stärkste Potential zeigt sich bei Noradrenalin, wo alle vier Extrakte eine sehr potente Wiederaufnahmehemmung <25 pg/mL aufzeigen. Ebenfalls sind alle vier Extrakte in der Lage, die Wiederaufnahme von Dopamin dosisabhängig zu hemmen. Dabei zeigen die drei hydroethanolischen Extrakte gute IC50-Werte von max. 30 pg/mL; der wässrige Extrakt zeigt noch eine gute Wirkung, fällt mind. um den Faktor 2,6 gegenüber den hydroethanolischen Extrakten ab. Ein ähnliches Bild zeigt sich für die Beeinflussung von Serotonin. Auch hier zeigt ein wässriger Extrakt die geringste Aktivität. Die hydroethanolischen Extrakte zeigen hier von guter (Extrakt 4) und sehr guter (Extrakt 2) bis mittlerer Aktivität (Extrakt 3) eine deutliche Abhängigkeit vom Extraktionsmittel. Insgesamt zeigen die Extrakte aber eine deutlich stärkere Aktivität bei der Serotonin- Wiederaufnahmehemmung im Vergleich zu Methylphenidat. So liegt das Aktivitätsverhältnis von Serotonin zu Noradrenalin bei Faktor 86 für Methylphenidat, während der Extrakt 2 oder Extrakt 4 hier einen Faktor von rd. 4.1 aufweisen. Somit zeigt sich überraschend für die Extrakte aus Zitronenverbene-Blättern grundsätzlich ein ähnliches Aktivitätsprofil für die Beeinflussung von Noradrenalin und Dopamin, zusätzlich noch eine verbesserte Serotonin-Beeinflussung. Die Extrakte stellen ausgehend von den drei geprüften wichtigsten Neurotransmittern sehr geeignete Kandidaten zur Behandlung von ADHS dar.
Bringt man des Weiteren die genannten Ergebnisse in Relation zu den Aufkonzentrierungsfaktoren (nativer DEV-Wert) sowie zu den galenischen Eigenschaften der Extrakte, so ergibt sich ein bevorzugter Bereich für mittelpolare Extrakte wie z.B. Extrakte Nr. 2 oder 3. Hier liegt im Vergleich zu reinem Wasser als Auszugsmittel bei nahezu gleicher Anreicherung und ähnlichen galenischen Eigenschaften eine deutliche Steigerung der pharmakologischen Eigenschaften vor. Vergleicht man dies zu Extrakt Nr. 4 - einem hoch lipophilen Extraktionsmittel mit EtOH 96% V/V - so liegt hier mit einem DEV von 12 : 1 ein um den Faktor 3 größerer Anreicherungsgrad für den Extrakt 4 vs. Extrakt 2 zugrunde. Teilt man die erhaltenen ICso-Werte für die drei Neurotransmitter durch den zusätzlichen Anreicherungsfaktor 3, so erhält man die ICso-Werte, bei rechnerisch gleicher Gesamt-Anreicherung aus der Droge; hier einem nativen DEV von 4: 1.
Dieser rechnerische Vergleich zeigt, das lipophile Extrakte mit reinem Ethanol (Extrakt 4) die wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffe des Ausgangsmaterials auf gleichem Niveau miterfasst wie ein mittelpolarer wässrig- ethanolischer Extrakt (Extrakt 2), wenn man gleiche Extraktausbeuten (hier DEV 4: 1) zugrunde legt. Es liegen praktisch gleiche Ergebnisse über alle drei Neurotransmitter unter Betrachtung eines relativen Meßbereichsfehler mit 5-10% vor.
Dies ist auch bei Betrachtung der Wirtschaftlichkeit mit einem höheren Extraktionspreis (höherer Materialeinsatz notwendig 12fach vs 4fach ) kein Vorteil. Ferner resultieren für Extrakt Nr. 4 schlechtere galenische Eigenschaften in Bezug auf Aussehen (grünbraun), Handhabung (hygroskopischer Trockenextrakt) und Löslichkeit (praktisch unlöslich in wässrigem Milieu) gegenüber Extrakt Nr. 2 und 3. Ursache hier sind die vom Extraktionsmittel EtOH 96% V/V begünstigten Übergänge von Cuticulawachs- und Chlorphyllanteilen aus Blättern. Diese Probleme können bei Verwendung von maximal 50% oder 60% Ethanol (V/V) vermieden werden.
Weitere Aufreinigung
Ausgehend von einem Primärextrakt - gewonnen mit Ethanol 50% V/V - wurde hersteiltechnisch die weitere Auftrennung in stark lipophile, unpolare bzw. polar, hydrophile Inhaltsstoffe vorgenommen. Hierzu wurden unter Anwendung bekannter Trennungstechniken wie Flüssig-Flüssig-Verteilung, Flüssig- Festphasen-Trennung sowie Umfällung in Ethanol insgesamt sechs Subfraktionen gewonnen. Dies wurden hinsichtlich ihrer Ausbeuten (=Anreicherungsfaktoren) typischen Inhaltsstoffen und ihres Fingerprints per Dünnschichtchromatographie (siehe Figur 1) untersucht.
Beispiel 6: Flüssiq-Flüssiq-Extraktion :
Ein Primärextrakt aus Ethanol 50% V/V, hergestellt analog Beispiel 3, wurde in demineralisiertem Wasser auf 10% Trockensubstanz rückgelöst und ständig gerührt. Hierzu wurde dreimal mit je einem Drittel des Volumens der Primärlösung n-Butanol zugegeben und intensiv verrührt. Anschließend erfolgte die Phasentrennung im Scheidetrichter. Die vereinigten drei Butanolphasen wurden lösemittelfrei am Rotationsverdampfer im Vakuum beigedampft. Anschließend wurde diese Extrakt-Phase 70% nativ / 30% Trocknungshilfsstoffe (28% Maltodextrin und 2% Siliziumdioxide) im Vakuumtrockenschrank bei 45°C getrocknet und zu einem homogenen Pulver vermahlen. Ebenso wurde die verbliebene wässrige Phase aufgearbeitet und als 70% natives Extraktpulver getrocknet.
Beispiel 7: Umfällunq in Ethanol :
Ein Primärextrakt aus Ethanol 50% V/V, hergestellt analog Beispiel 3, wurde in Ethanol 96% V/V portionsweise zugegeben, bis insgesamt 10 Gew.-% Trockensubstanz gelöst vorhanden waren. Nach 60 min Rühren wurde die Lösung über 24h kalt gestellt bei 6°C. Dabei fielen hydrophile Substanzen als Niederschlag aus.
Nach Abtrennung der oberen Ethanol-Phase durch Dekantieren wurde der Niederschlag in Wasser aufgenommen. Dieser wurde lösemittelfrei am Rotationsverdampfer im Vakuum beigedampft. Anschließend wurde diese Extrakt-Phase 70% nativ / 30% Trocknungshilfsstoffe (28% Maltodextrin und 2% Siliziumdioxide) im Vakuumtrockenschrank bei 45°C getrocknet und zu einem homogenen Pulver vermahlen. Der ethanolische Überstand wurde ebenfalls lösemittelfrei im Vakuum an Rotationsverdampfer beigedampft und ebenso als 70% natives Extraktpulver getrocknet. Beispiel 8: Flüssiq-Fest-Verteilunq :
Ein Primärextrakt aus Ethanol 50% V/V, hergestellt analog Beispiel 3, wurde in demineralisiertem Wasser auf 10% Trockensubstanz rückgelöst und 30 min gerührt. Die Lösung wurde 12h über Nacht kühl stehen gelassen. Ein kleiner Teil des Extraktes fiel dabei als unlöslicher Niederschlag aus. Es wurde über Faltenfilter abfiltriert und verworfen. Das klare Eluat wurde auf eine Glassäule gegeben, die gefüllt war mit Adsorber vom Typ XAD-7HP. Dabei beträgt die aufgegebene Menge an gelöstem, nativen Extrakt 25 Gew.-% des Trockengewichtes des Adsorbers. Der Adsorber ist so selektiv, dass er polare, mittegroße Substanzen wie Flavonoide, Phenole etc. an sich bindet und kleinere Moleküle wie Zucker, Salze, Aminosäuren durchlässt. Durch die Filterwirkung des Adsorbers werden Substanzen im Inneren des Adsorbers festgehalten. Diese wurden durch Elution mit zwei Bettvolumina an Ethanol 96% V/V runtergespült. Das erhaltene ethanolische Eluat wurde lösemittelfrei am Rotationsverdampfer im Vakuum beigedampft. Anschließend wurde diese Extrakt-Phase 70% nativ / 30% Trocknungshilfsstoffe (28% Maltodextrin und 2% Siliziumdioxid) im Vakuumtrockenschrank bei 45°C getrocknet und zu einem homogenen Pulver vermahlen. Ebenso wurde die vorher aufgefangene wässrige Phase, welche durch den Adsorber durchgelaufen ist, aufgearbeitet und zu einem Trockenextraktpulver mit 70% Nativanteil und 30% Hilfsstoffen getrocknet.
Tabelle 3: Extraktcharakterisierung von sechs Extraktfraktionen von Zitronenverbene
Tabelle 4: Neurotransmitter-Wiederaufnahmehrnmung durch Extraktfraktionen aus Zitronenverbene-Blättern im Vergleich zum Primärextrakt EtOH 50% V/V
Die Fraktionierungen belegen unter Einbeziehung der analytischen Daten zu den Inhaltsstoffen, dass eine Anreicherung in Richtung mittelpolar bis polar-lipophile Substanzen die Wirkeffekte verstärken können. Mit der Anreicherung der Substanzgruppen Flavonoide, Caffeoylchinasäuren (CCS-Verbindungen) und Verbascosid steigen die Wiederaufnahmehemmungen für alle drei getesteten Neurotransmitter.
Dies ist besonders gut erkennbar an den Extrakten-Nr. 9 und 10, welche aus der Adsorberharz-Trennung resultierten. Der Adsorber trennte selektiv die Zielsubstanzen aus der Wasser-Phase (Extrakt Nr. 9) ab, wodurch dessen Aktivität gegenüber dem Primärextrakt bei Serotonin und Dopamin deutlich zurückging. Dass Noradrenalin in etwa gleicher Größenordnung beeinflusst wurde zeigt auch, dass der Gesamtextrakt die Wirkung bestimmt und nicht nur einzelne Leitsubstanzen / Substanzgruppen. Im Umkehrschluss konnte die ethanolische Extrakt-Phase vom Adsorber (Extrakt-Nr. 10) rein hersteiltechnisch eine Aufkonzentrierung um den Faktor 3,2 erzielen (12,9 für Fraktionierung vs. 4,0 für Primärextrakt). Genau um etwa diese Größenordnung verbesserten sich die Neurotransmitter-Beeinflussung insgesamt.
Die Fraktionierungen am Beispiel der Extrakte Nr. 7 und 8 (Umfällung in Ethanol) zeigt auch, wenn die relative Mengenverteilung bei je 50% liegt und sich keine Unterschied im Anreicherungsgrad ergeben, so resultieren auch annähernd gleiche pharmakologische Aktivitäten. Auch hier zeigt sich trotz der unterschiedlichen Verteilung einiger analytisch. Leitsubstanzen (Flavonoide, Verbascosid), das diese an der Wirkung zwar mitbeteiligt sind, aber keineswegs die alleinigen Wirksubstanzen darstellen. Es kommt auf die Art der Extraktgewinnung an. Dieses Beispiel belegt auch im Vergleich zum Primärextrakt erneut für Zitronenverbenen-Extrakte die Beeinflussung aller drei hier getesteten Neurotransmitter.
Nach den vorliegenden positiven in-vitro-Daten stellt sich die Frage, inwieweit dies in-vivo ebenfalls belegt werden kann. Ein geeignetes Modell hierzu stellt der Fadenwurm C. elegans dar. Caenorhabditis elegans ist ein Fadenwurm, der vor allem in der Entwicklungsbiologie und der Genetik als Modellorganismus erforscht wird. Ein wichtiger Grund liegt darin, dass er es trotz seiner knapp 1000 Körperzellen auf mehr als 20.000 Gene (Mensch : knapp 40.000) bringt, von denen viele ähnliche Funktionen wie in Säugetieren aufweisen. Fast die Hälfte aller im Wurmgenom codierten Proteine haben Homologe in Homo sapiens, darunter eine Vielzahl bekannter menschlicher Krankheitsgene. Somit ist er ein repräsentativer Modellorganismus was die Metabolisierung, gezielte Gen- Expression und das neuronale Verhalten betrifft. Das komplette Nervensystem der Fadenwürmer besteht aus rd. 300 Neuronen und ist dabei aus 2 unabhängigen Teilen aufgebaut: einem größeren, somatischen und einem kleineren, pharyngalen Nervensystem. Als Neurotransmitter nutzen die Fadenwürmer Acetylcholin, Glutamat, GABA (g-Aminobuttersäure) und biogene Amine wie Serotonin und Dopamin.
C. elegans lebt im Boden gemäßigter Klimazonen, wo er sich von Bakterien ernährt. Die Tiere werden ca. 1 mm lang und haben eine transparente Kutikula. C. elegans hat eine kurze Lebensdauer von ca. 15 bis 20 Tagen (je nach Temperatur und Futtermenge). Sie lassen sich gut reproduzierbar kultivieren, indem als Futter Escherichia co//- Bakterien auf Agar-Platten platziert wird. Je nach Fragestellung werden gezielt transgene Würmer eingesetzt, deren Umsetzungsprodukte mit definierten Substanzen durch Fluoreszenzmessungen direkt oder über Verhaltenstest detektiert werden können.
Beispiel 9: Schutz dopaminerqer Neuronen vor 6-OHDA-induzierter Degeneration :
6-Hydroxydopamin (6-OHDA) schädigt dopaminerge Neuronen, was in verschiedenen Tiermodellen angewendet wird. Der transgene C. elegans- Stamm BZ555 exprimiert Grün-fluoreszierendes Protein in den dopaminergen Neuronen. Damit lässt sich die 6-OHDA-induzierte Neurodegeneration, bzw. die Verminderung dieser, fluoreszenzmikroskopisch quantifizieren. Die Würmer wurden 50 mM 6-OHDA ausgesetzt, was die Fluoreszenzintensität der Neuronen wegen deren Degeneration vermindert. Als Positivkontrolle dient Bupropion, ein selektiver Noradrenalin- und Dopamin-Wiederaufnahmehemmer (NDRI). Bupropion verhindert über die Inhibition der Noradrenalin (NA)- bzw. Dopamin (DA)-Transporter (Reuptake), dass das Neurotoxin 6-OHDA in die Nervenzellen gelangt und diese schädigt. Die Behandlung mit 600 pg/mL eines Zitronenverbene-Extraktes aus Ethanol 50% nach Bsp. 3 führte im Vergleich zur Negativkontrolle zu einer rd. 20% höheren Fluoreszenzintensität (Schutzfunktion).
Tabelle 5: Einfluss von Zitronenverbene Extrakt (EtOH 50% V/V) auf die 6- OHDA-induzierte Degeneration bei Fadenwürmern
Die Schädigung von Nervenzellen mit 6-OHDA im Tiermodell ist ein anerkannter Versuchsansatz für ADHS (Kostrzewa RM et al. : Pharmacological models of ADHD; J Neural Transm (Vienna) 2008; 115: 287-98.) Die Positivkontrolle bestätigt dies im hier angewandten C.elegans Modell. Der erfindungsgemäße A. citriodora-Extrakt ist ebenso wie die Positivkontrolle für die Wiederaufnahmehemmung von NA und DA beschrieben (s. Bsp. 5 oben). Der erfindungsgemäße A. citriodora-Extrakt kann dabei rd. 1/3 der Schutzfunktion der Positivkontrolle erreichen.
Beispiel 10: Einfluss auf ß-Amyloid induzierte Toxizität im C.eleaans-Modell :
Um die Wirkung auf die ß-Amyloid-Toxizität zu testen, wurde der transgene C. elegans- Stamm CL4176 genutzt, welcher in der Lage ist, humanes ß-Amyloid (Aß 1-42) zu exprimieren. Die Aß-Expression kann durch eine Temperaturerhöhung induziert werden. Alters-synchronisierte und behandelte Würmer wurden für 48 Stunden bei 16°C inkubiert. Nach Erhöhung der Temperatur auf 25°C und 24- stündiger Inkubation begannen die Würmer aufgrund der Toxizität des Aß- Oligomers zu paralysieren. Die Lähmung wurde alle 2 Stunden bewertet (Versuchsdurchführung nach Heiner et al : Sideritis scardica extra cts inhibit the aggregation of a-synuclein and ß-amyloid peptides in Caenorhabditis elegans used as a model for neurodegenerative diseases. Planta Medica 81 - PW_127,2015.). Substanzen, die dieser toxischen Wirkung von ß-Amyloid entgegenwirken, führen zu einer langsameren bzw. späteren Paralyse der Tiere. Solche Substanzen verzögern die Neurodegeneration u.a. bei Alzheimer Demenz. Als Vergleichswert wurde der Median (PTso) herangezogen, also der Zeitpunkt, an dem exakt 50 % der Fadenwürmer paralysiert waren.
Tabelle 6: Einfluss von Zitronenverbene Extrakt (EtOH 50% V/V) auf ß-Amyloid induzierte Toxizität
Die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Zitronenverbene-Blattextrakt (Ethanol 50% V/V) verzögerte die ß-Amyloid-induzierte Paralyse um 1,5h. Dabei ist das in diesem Extrakt als Einzelsubstanz vorkommende Acteosid an der protektiven Wirkung positiv beteiligt ( + l,8h). Ein im gleichen Modell getesteter Pflanzenextrakt aus Sideritis scardica (EtOH 50%), der für seine Eignung bei ADHS beschrieben ist (EP2229950B1), wurde als Positivkontrolle verwendet und wirkte hochsignifikant (+3, 5h). Beispiel 11 : Einfluss auf ß-Amyloid-induzierte neuronale Dysfunktion (eingeschränkte Kognition') :
ß-Amyloid-Spezies können Nervenzellen schädigen und eine Dysfunktion von neuronal kontrolliertem Verhalten auslösen. Der transgene C. elegans- Stamm CL2355 exprimiert pan-neuronal humanes ß-Amyloid. Dies führt zu kognitiven Störungen wie der verminderten chemotaktischen Bewegung hin zu einem Anlockungsmittel (Benzaldehyd). Gemessen wurde in den Experimenten der Chemotaxis-Index, also der Anteil an Würmern, der sich auf der Agarplatte zu dem Anlockungsmittel begeben hat. Der Kontrollstamm CL2122 exprimiert kein ß-Amyloid und zeigt keine Verhaltensstörungen; der Chemotaxis-Index war dementsprechend hoch. Die Versuchsdurchführung erfolgte nach Heiner et al.
Tabelle 7: Einfluss von Zitronenverbene- Extrakt auf die neuronale Dysfunktion
Die Behandlung mit einem erfindungsgemäßen Zitronenverbene-Blattextrakt (Ethanol 50% V/V) wies einen 2,3fach erhöhten und signifikanten Chemotaxis- Index aus. Die Verbesserung gegenüber dem unbehandelten Teststamm lag bei 46%. Dies ist auf verminderte ß-Amyloid induzierte Degeneration der für diese kognitive Fähigkeit wichtigen Nervenzellen zurückzuführen. Dabei ist das in diesem Extrakt als Einzelsubstanz vorkommende Acteosid an der neuroprotektiven Wirkung nachweislich beteiligt (ca. 88% vom Chemotaxis- Index des Kontrollstammes CL2122 erreicht).
Beispiel 12: Verhaltensuntersuchunqen im Moris Water Maze (MWM) :
Gemäß des Tiermodelles "Moris Water maze" wird die Steigerung der kognitiven Leistungsfähigkeit besonders unter bestehender Belastungssituation sichtbar, in dem eine Steigerung der Lernleistung, insbesondere der Merkfähigkeit, gezeigt wurde. In einem mit trübem Wasser gefüllten runden Becken, welches seitlich mit ausgeprägten Markierungen versehen ist, sog. externen Hinweisreizen, werden Versuchstiere, in diesem Fall Mäuse, über mehrere Tage hinweg trainiert, selbstständig eine unter der Wasseroberfläche befindliche, nicht sichtbare Plattform zu finden und sich deren räumliche Position zu merken. Hierbei werden die Mäuse in etwa einem Abstand von ca. 30cm vom Rand ins Wasser gelassen, woraufhin die Tiere umgehend mit Schwimmbewegungen versuchen, die rettende Plattform zu erreichen. Der Vorteil dieses seit Beginn der 80er Jahre bekannten Messsystems gegenüber herkömmlichen einfachen Labyrinthen im Tierexperiment besteht darin, dass es keine lokalen Landmarken gibt, sondern nur globale und dass die Aufgabe aufgrund des Fluchtverhaltens der Tiere einen hohen Motivationsfaktor aufweist. Das Experiment zielt vor allem auf die Untersuchung des (räumlichen) Lernens (Erkennen und Memorieren) der Tiere unter Stressbedingungen und der Messung möglicher Einflüsse auf dieses. Messparameter sind hierbei die Zeit bis zum Auffinden der Plattform, die bis dorthin zurückgelegte Wegstrecke, sowie die relative Aufenthaltszeit im richtigen Quadranten des Beckens. Diese Parameter werden durch den Trainingseffekt beeinflusst. So reduziert sich üblicherweise die Auffindzeit und Wegstrecke zur rettenden Plattform sowie die Quadranten-Aufenthaltszeit verlängert sich. Durch unterschiedliche Neurotransmitterkonzentrationen kann der Trainingseffekt darüber hinaus beeinflusst werden [Dissertation, Uni Freiburg 2004, Theresa Schweizer: 3,4-Diaminopyridin evozierte Freisetzung von Neurotransmittern aus Hirnschnitten von Ratten : Untersuchungen im Kortex und Hippocampus an alten Ratten, sowie an Ratten mit serotonergen Läsionen hippocampaler Afferenzen und intrahippocampalen Raphe-Transplantaten]. In dieser Versuchsanordnung wurden u.a. 2 Gruppen ä 6 Mäuse untersucht. Die erste Kontrollgruppe wurde von mit Wasser behandelten transgenen Tieren (Stamm AD-B6) gebildet, welche auf Grund ihrer genetischen Disposition innerhalb von 50 Tagen nach ihrer Geburt eine starke ß-Amyloidablagerung manifestieren, respektive an Alzheimer erkranken. Die weiteren zwei Prüfgruppen bilden transgene Tiere (Stamm AD-B6), welche ab ihrem Lebenstag d = 50 mit einer Lösung eines Zitronenverbene-Extraktes nach Beispiel 2 oder Beispiel 3 behandelt wurden. Die Dosierung betrug dabei jeweils 400mg nativer Extrakt /kg Körpergewicht.
Im Alter von ca. 95 Tagen startet eine verhaltensbiologische Testung mittels Morris Water Maze (95-100d). Der Test beinhaltet eine tägliche frühe und späte Test/Lerneinheit über vier Tage. Die frühe Einheit beginnt mit einem Lauf ohne Plattform für 30 Sekunden, hierbei wird die Zeit aufgezeichnet, in der sich die Maus in dem Quadranten aufhält, in dem sich gewohnter Weise die Plattform befindet (Zielquadrant). Die weiteren vier Läufe erfolgen mit unsichtbarer Plattform und mit 4 variierenden Startpositionen.
Analysiert wurde die Zeit bis zum Erreichen der Plattform (escape latancy), graphisch ausgewertet in Figur 2. Die Auswertung zeigt, dass es bei einer Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Zitronenverbene-Extrakt aus EtOH 20% V/V zu einer beeindruckenden Steigerung der Gedächtnisleistung kommt. So verbesserte sich die escape latency von relativen 100% am 1. Tag zu nur noch 24,6% an Tag 2 oder 22,4% an Tag 3. Der etwas lipophilere Zitronenverbene-Extrakt mit EtOH 50% V/V flutete zeitversetzt an und erreichte die gleiche Größenordnung. Es verbesserte sich die escape latency von rel. 100% am 1. Tag zu 42,0% an Tag 2 und nur noch 19,1% an Tag 3. So sind die mit Zitronenverbene-Extrakten behandelten Tiere bereits an Tag 2 und 3 tendenziell schneller und an Tag 4 signifikant (p<0,05) schneller im Erreichen der Plattform. An Tag 4 nivelliert sich in diesem Modell die Lernleistung von behandelten und gesunden Tieren; sind aber signifikant verschieden zu den transgenen Tieren mit ß-Amyloid-Ablagerung. Diese Ergebnisse zeigen in überraschender Weise, dass Zitronenverbene-Extrakt in der Lage ist, die kognitive Leistungsfähigkeit zu erhöhen.
Beispiel 13: EEG-Profile an gesunden Ratten :
Die Elektroenzephalografie (von griechisch encephalon Gehirn, gräphein schreiben) -EEG abgekürzt- ist eine Methode der medizinischen Diagnostik zur Messung der summierten elektrischen Aktivität des Gehirns durch Aufzeichnung der Spannungsschwankungen. Das Elektroenzephalogramm bietet als graphische Darstellung dieser Schwankungen eine standardmäßige Untersuchungsmethode in der Neurologie. Zur klinischen Bewertung wird eine Aufzeichnung in mindestens zwölf Kanälen von verschiedenen Elektrodenkombinationen benötigt. Die resultierenden Daten können von geübten Spezialisten auf auffällige Muster untersucht werden. Eine verbreitete mathematische Methode zur Analyse des EEGs ist die Fouriertransformation in den Frequenzbereich. Häufig wird das EEG in Frequenzbänder (sogenannte EEG-Bänder) eingeteilt, wobei die Anzahl von Bändern wie auch die genaue Einteilung z.T. unterschiedlich angegeben wird. Die Einteilung der Frequenzbänder und deren Grenzen sind historisch bedingt und decken sich nicht durchgehend mit Grenzen, die auf Grund modernerer Untersuchungen als sinnvoll gelten. So wurde beispielsweise das Theta-Band in einen Bereich Theta 1 und Theta 2 aufgeteilt, um den unterschiedlichen Bedeutungen der Teilbereiche Rechnung zu tragen. Insbesondere für Langzeit- und Schlaf-EEGs werden Software-Algorithmen zur assistierten oder automatischen Auswertung eingesetzt, die eine Mustererkennung nachbilden.
Gehirnwellen lassen sich aber nicht nur messen, sondern auch beeinflussen. Das kann u.a. als Neurofeedback - eine Spezialform des Biofeedbacks - in Folge pharmakologisch aktiver Substanzen geschehen, wie Psychopharmaka [Dimpfel W, et al. (1996) Source Density Analysis of Functional Topographical EEG : Monitoring of Cognitive Drug Action. Eur J Med Res 1 : 283 - 290]. Die Auswertung wird auch als Elektropharmakogram bezeichnet. Beim Neurofeedback ist es üblich, die EEG-Bänder feiner zu unterteilen und detaillierter zu interpretieren als im klinischen EEG. Eine erhöhte Amplitude innerhalb der Frequenzbereiche wird mit gewissen mentalen Zuständen oder Aktivitäten korreliert. Theta 2-Wellen können z.B. mit Erinnerungs- und Lernfähigkeit, Konzentration, und / oder Kreativität in Zusammenhang gebracht werden. Ebenso können nach umfangreichen Kalibrierungen Rückschlüsse auf Neurotransmitter-vermittelte ZNS-Aktivitäten gezogen werden, welche in dopaminerge, serotonerge, cholinerge oder noradrenerge Untergruppen eingeteilt werden können.
Einer Gruppe von n=7 Fischer-344-Ratten wurden je 4 Semi-Microelectroden in die 4 Hirnareale "frontaler Cortex", "Hippocampus", "Striatum" und "Formatio reticularis" implantiert. Die messbaren Potentialfeldwechsel wurden durch Funk übertragen und wurden zu einem Elektropharmakogramm ausgewertet.
Die Tiere wurden mit Zitronenverbene-Trockenextraktzubereitung nach Beispiel 3 mit einem Dosierungsäquivalent von 150 mg/kg Körpergewicht behandelt. Die Einzeldosierung wurde hierzu in Wasser gelöst und einmalig verabreicht. Als Kontrollexperiment diente Wasser. Nach einer 45-minütigen Prä-Drug- Beobachtungsphase wurde die Testflüssigkeit den Tieren oral per Schlundsonde verabreicht, gefolgt von einer 5-minütigen Beruhigungsphase für das Tier. Anschließend wurde die Messung über einen Messzeitraum von 5 Stunden gestartet. Die Frequenzdaten wurden mittels Fast Fourier Transformation (FFT) erhalten und in 60-minütige Perioden gemittelt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels Wilcoxon, Mann and Whitney U-Test gegen die Kontrolle (Wasser).
Die Untersuchung eines Zitronenverbene-Extraktes EtOH 50% V/V nach Beispiel 3 zeigte innerhalb einer Stunde nach Verabreichung eine statistisch signifikante Änderung in verschiedenen Frequenzbändern (siehe Figur 3 - Abb. 3 EEG- Grafik). Insbesondere theta-, alphal-, alpha2- und betal- Frequenzen waren betroffen, was auf eine Beeinflussung der noradrenergen, serotonergen, dopaminergen und glutaminergen Systeme hindeutet. Diese komplexe Art der Aktivität wurde zuvor bei Arzneistoffen beobachtet, die inhibierend auf die Monoaminoxidase einwirken. Vergleichbare Elektropharmakogramme haben z.B. Moclobemid, ein Monoaminoxidase-Hemmer mit Zulassung als Antidepressivum, aber auch Methylphenidat, einem Dopamin- und Noradrenalin-Reuptake- Inhibitor, mit zusätzlicher agonistischer Aktivität an den serotonergen Rezeptoren 5-HT1A und 5-HT2B, welches zur Behandlung von ADHS zugelassen ist.
Diese Ergebnisse zeigen , dass der Zitronenverbene-Extrakt zur Behandlung von ADHS geeignet ist.
Im Serum der Mäuse wurde kein erhöhter Level des Stresshormons Cortisol gefunden, weshalb davon ausgegangen werden kann, dass der übliche mentale Stress der Messung durch den Extrakt prophylaktisch verhindert oder zumindest gesenkt werden konnte.
Auch war ein vergleichbares EEG-Profil mit einem Ginkgo- Extra kt (Ph.Eur. Qualität) festzustellen, was die Eigenschaften von Zitronenverbene-Extrakt zur kognitiven Leistungsverbesserung zeigt.
Die im Ratten-EEG gefundenen Daten bestätigen die erhaltenen in-vitro- Ergebnisse zu Neurotransmitter-Bindungsstudien. Insgesamt ergeben alle präklinischen Daten zusammen eine deutliche Evidenz für den Einsatz von Zitronenverbene-Blattextrakten als ZNS-aktive Extrakte; bevorzugt in den Anwendungsbereichen der kognitiven Leistungsverbesserung oder dem Aufmerksamkeits- Defizit- Hyperaktivitäts-Syndrom.

Claims

Ansprüche
1. Extrakte aus Blättern des Zitronenstrauches (Aloysia citriodora) zur Verwendung in der Behandlung und Prophylaxe von neuronalen oder cerebralen Störungen, wobei die Extrakte alkoholisch-wässrige Extrakte mit einer Alkoholkonzentration von 10-60% (V/V) sind und der Extrakt einen Gehalt an ätherischem Öl von weniger als 0,05 Gew.-% bezogen auf den Extrakt ohne Hilfsstoffe aufweist.
2. Extrakte zur Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung des Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitäts-Syndrom (ADHS).
3. Extrakte zur Verwendung nach Anspruch 1 zur Prophylaxe vor mentalem Stress, und/oder zur Behandlung oder Vorbeugung von stressbedingten Erschöpfungszuständen oder Belastungsstörungen, somatoformen Erkrankungen, wie dem Burn-Out-Syndrom, akuten und posttraumatischen Belastungsstörungen, chronischem Müdigkeitssyndrom, nervöser Unruhe, mentalem Stress, Angst und Depression als Symptome neurotischer Störungen sowie Stresssymptomen wie Müdigkeit und Schwächegefühl.
4. Extrakte zur Verwendung nach Anspruch 1 zur Steigerung der kognitiven Leistungsfähigkeit.
5. Extrakte zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der neuronalen Störung um eine neurodegenerative Erkrankung handelt, welche mit akkumulierten Proteinen/Peptiden in Verbindung gebracht wird.
6. Extrakte zur Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der Extrakt durch Extraktion des Zitronenstrauches mit Mischungen von Wasser oder Ethanol erhalten wurde, bevorzugt wobei der Ethanol eine Konzentration von 20-50 (V/V) aufweist.
7. Extrakte zur Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der Extrakt sekundär gereinigt wird durch Entfernung von lipophilen Inhaltsstoffen mittels
- Flüssig-Flüssig-Behandlung mit geeigneten, nicht wassermischbaren Lösemitteln oder
- Flüssig-Fest-Behandlung mit geeigneten Adsorberharzen/ Adsorbentien, die bevorzugt die polaren Inhaltsstoffe anreichern.
8. Extrakte zur Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Fraktionen der Extrakte, in flüssiger oder getrockneter Form, verwendet werden.
9. Extrakte zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1-8 dadurch gekennzeichnet, dass die Extrakte in Kombination mit anderen Pflanzen in Form von Pflanzenteilen und/oder Extrakten und/oder in Kombination mit chemisch synthetischen Stoffen verwendet werden.
10. Extrakte zur Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei das Präparat oral eingenommen wird, bevorzugt als Getränkezubereitung, insbesondere aus einer Instantzubereitung hergestellt, weiterhin bevorzugt als Tablette, als Kapsel, als Pastille, als Kauzubereitung, Wafer oder Schmelztablette.
11. Extrakte zur Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der Extrakt einen Gehalt an Verbascosid, von mindestens 2 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 5 Gew.-% und besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-% bezogen auf den Extrakt ohne Hilfsstoffe aufweist.
12. Extrakte zur Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der Extrakt einen Gehalt an Flavonoiden, von mindestens 0,05 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 0,5 Gew.-% und besonders bevorzugt von mindestens 1,5 Gew.-% bezogen auf den Extrakt ohne Hilfsstoffe aufweist.
13. Extrakte zur Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, wobei der Extrakt einen Gehalt an ätherischem Öl von weniger als 0,01 Gew.-% bezogen auf den Extrakt ohne Hilfsstoffe aufweist.
14. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus den Blättern von Zitronenverbene (Aloysia citriodora) umfassend die Schritte
- Primärextraktion mit einem Extraktionsmittel bestehend aus Mischungen von Alkohol und Wasser, wobei der Alkohol eine Konzentration von 10- 60% (V/V) aufweist,
- Abtrennen eines Drogenrückstandes,
- zumindest teilweise Entfernen des Extraktionsmittels,
- gegebenenfalls Entfernen lipophiler Inhaltsstoffe,
- optional Trocknen eines enthaltenen flüssigen, viskosen Dickextraktes zu einem Trockenextrakt,
wobei der Extrakt einen Gehalt an ätherischem Öl von weniger als 0,05 Gew.-
% bezogen auf den Extrakt ohne Hilfsstoffe aufweist.
15. Verwendung von Extrakten aus Blättern des Zitronenstrauches (Aloysia citriodora) zur nichtmedizinischen Behandlung und Prophylaxe von neuronalen oder cerebralen Störungen, zur nichtmedizinischen Behandlung des Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitäts-Syndroms (ADHS), zur nicht medizinischen Prophylaxe vor mentalem Stress oder zur nichtmedizinischen Steigerung der kognitiven Leistungsfähigkeit, und/oder zur nichtmedizinischen Vorbeugung oder Behandlung von stressbedingten Erschöpfungszuständen oder Belastungsstörungen, somatoformen Erkrankungen wie dem Burn-Out-Syndrom, akuten und posttraumatischen Belastungsstörungen, chronischem Müdigkeitssyndrom, nervöser Unruhe, mentalem Stress, Angst und Depression als Symptome neurotischer Störungen sowie Stresssymptomen wie Müdigkeit und Schwächegefühl, wobei die Extrakte alkoholisch-wässrige Extrakte mit einer Alkoholkonzentration von 10-60% (V/V) sind und der Extrakt einen Gehalt an ätherischem Öl von weniger als 0,05 Gew.-% bezogen auf den Extrakt ohne Hilfsstoffe aufweist.
16. Extrakte aus Blättern des Zitronenstrauches (Aloysia citriodora), wobei die Extrakte alkoholisch-wässrige Extrakte mit einer Alkoholkonzentration von 10- 60% (V/V) sind und die Extrakte einen Gehalt an ätherischem Öl von weniger als 0,05 Gew.-% bezogen auf den Extrakt ohne Hilfsstoffe aufweist.
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