EP3877536A1 - Verfahren zur biotechnologischen gewinnung des blaugrünen pilzpigments xylindein - Google Patents

Verfahren zur biotechnologischen gewinnung des blaugrünen pilzpigments xylindein

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EP3877536A1
EP3877536A1 EP19802100.8A EP19802100A EP3877536A1 EP 3877536 A1 EP3877536 A1 EP 3877536A1 EP 19802100 A EP19802100 A EP 19802100A EP 3877536 A1 EP3877536 A1 EP 3877536A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
biomass
xylindein
chlorociboria
blue
culture
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19802100.8A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Susanne STEUDLER
Stephanie Stange
Hubertus Delenk
André WAGENFÜHR
Christof ZEEB
Thomas Walther
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Dresden filed Critical Technische Universitaet Dresden
Publication of EP3877536A1 publication Critical patent/EP3877536A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/22—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/145—Fungi isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the field of application of the invention is the biotechnological production of a fungal pigment which is usually used as a colorant.
  • Xylindein is a natural blue-green pigment (empirical formula C 32 H 24 O 10 , CAS No. 3779-1 1 - 1), which is produced by fungi of the genus Chlorociboria sp., Verdigris cups and has the following chemical structure:
  • This pigment is known for the natural blue-green discoloration of wood. This wood, which is naturally discolored in the forest, has been used for inlays for several centuries. Xylindein is also promising for use as a fluorescent marker or as an organic semiconductor. There is currently no way to chemically synthesize xylindein.
  • Robinson et al. (2014) applied the concept of extracting xylindein directly from the fungal biomass and colored solid substrate instead of extracting it from the cell culture supernatant of a liquid culture. Robinson et al. also examined the solubility of xylindeine in u. a. Acetonitrile, tetrahydrofuran or ethanol.
  • Weber et al. (2014) described the extraction of xylindein using dichloromethane from a Chlorociboria aeruginosa culture from malt agar plates consisting of 2% malt and 1.5% agar.
  • Stange et al. (2018, Part 2) used this concept and colored solid wood by cultivating fungi in liquid media such as orange juice.
  • the aim of the work was to find suitable types of wood as a substrate for this mushroom cultivation.
  • US2017 / 0081540A1 used acetone, tetrahydrofuran or acetonitrile to extract the fungal pigment from discolored substrates.
  • the extract was mixed with an oil which, after evaporation of the solvent, acted as a liquid carrier for the fungal pigment.
  • a suspension of the pigment in oil could thus be produced. This pigment suspension is to be used as a paint.
  • the object of the invention is to provide a method that allows shorter process times.
  • the cultivation time should be short.
  • the productivity of the mushroom culture is said to be high.
  • Overall, just as much or more xylindeine should be obtained in a shorter time than in known methods from the prior art.
  • the process should be easy to carry out and ecological.
  • the invention relates to a process for the biotechnological production of the blue-green mushroom pigment xylindein in a bioreactor, comprising the steps:
  • a Contacting the reactor contents with biomass from the fungal culture Chlorociboria sp. and stirring the reactor contents to form xylindein-containing biomass
  • b Separation of the xylindein-containing biomass, which is in step a. has formed
  • c Extraction of the xylindeine from the step b. separated biomass with a solvent, characterized in that the biomass with which in step a. is contacted, undyed biomass.
  • Steps a, b and c take place one after the other in this order.
  • the “contacting the reactor contents with biomass of the fungal culture ...” according to the invention is understood as inoculating / seeding / seeding / inoculating, ie. H. a relatively small amount of fungal culture is added to the relatively large reactor contents to multiply.
  • Chlorociboria sp. Ie mushrooms of the genus Chlorociboria
  • the reactor contents are contacted with isolated biomass from the fungal culture, for example in the form of a cleaned fungal mycelium, and that the biomass is used adherently on a substrate, such as wood or agar infested with fungal culture.
  • Reactor content in the sense of the invention means the content of the bioreactor according to the invention, in particular the mostly liquid content from, for example, nutrient medium, additives, etc.
  • Biomass in the sense of the invention is the mass of the mushroom culture.
  • the so-called mushroom mycelium is included.
  • the term "undyed biomass” in the sense of the invention stands for biomass of the fungal culture, the metabolism of which has been established in such a way that no or very little blue-green mushroom pigment xylindein is produced.
  • the biomass is therefore undyed. In particular, it apparently has no or no visible blue-green coloring. They can also be called light biomass.
  • An advantage of the invention is that the method allows a surprisingly short cultivation period, which leads to significantly shorter process times, and thus more Xylindein can be obtained per time than with conventional methods.
  • Process time in the sense of the invention is the time to produce a certain amount of xylindein with the method according to the invention, i. H. Time per mass Xylindein.
  • the cultivation time ie the time for contacting and stirring in step a.
  • the cultivation time or the process time of the overall process is shortened, i. H. with any pre-cultivation steps previously carried out.
  • productivity in the method according to the invention is higher than in conventional methods.
  • Productivity is the mass of the xylindein obtained (ie produced) from the mushroom culture per volume Reactor content per time. It is assumed that the losses in step b. and c. of the method according to the invention are negligibly small and the amount of xylindein obtained is therefore always proportional to the amount of xylindein produced by the mushroom culture.
  • Another advantage is that the process is wood-free; that is, no wood is required as a substrate for the fungal culture in the process.
  • the starting point of the production of the mushroom pigment Xylindein can be predicted on the basis of the course of the pH of the reactor contents (FIG. 2).
  • a continuous increase in the pH during the cultivation of the undyed biomass according to the invention there is a slowdown in the rise in pH and finally a brief decrease in the pH.
  • an increased xylindeine production by the mushroom culture begins and a short time later the blue-green color of the mushroom culture becomes visible.
  • the nitrogen content is limited, which is the reason for the start of such a secondary metabolism.
  • An additional advantage of the method according to the invention is the storability and, associated therewith, also the transportability of the intermediate product, i. H. the one in step b. separated xylindein-containing biomass that can be dried. It is therefore advantageously possible to carry out the process steps at different locations and to transport this intermediate product, preferably in dried form.
  • undyed biomass is one which, after drying at 60 ° C. in the lab color space, has an L value of> 67, preferably> 70. In particular, drying is carried out at 60 ° C. for 24 hours.
  • undyed biomass is one which is lighter than RAL 130 90 20 after drying in the RAL color system mentioned above. It is preferably lighter than RAL 130 90 10, particularly preferably lighter than RAL 140 90 05.
  • the invention also relates to the use of undyed biomass from the chlorociboria sp. for seeding in the biotechnological extraction of the blue-green mushroom pigment xylindein, in particular the use in the process according to the invention.
  • the reactor content in one embodiment comprises a nutrient medium.
  • the sewing medium preferably has a limit on the available nitrogen compared to the total carbon content.
  • the ratio of nitrogen to carbon source in the nutrient medium is particularly preferably 1/400 (in the form of total nitrogen content to total carbon content, in each case in g).
  • the fungal culture primarily forms xylindein, whereas under nitrogen-rich nutrient conditions, primarily undyed biomass is produced.
  • step a (Contact %) the process parameters are checked and regulated.
  • the separation of the xylindein-containing biomass in step b. a filtration.
  • the filter material particularly preferably has a mesh size of at most 80 pm, in particular 80 pm.
  • the filter material is a material that is well suited for large volumes, such as a filter bag made of polypropylene fabric.
  • the biomass is dried and / or shredded. Drying takes place particularly preferably combined with subsequent comminution, for example by grinding. In particular, this drying takes place at a maximum of 70 ° C. and / or over a large area with a loading of a maximum of 350 g of moist biomass per dm 2 .
  • the drying time at 70 ° C is preferably 24 hours.
  • An advantage of this embodiment is that the shelf life of the intermediate, namely that in step b. separated xylindein-containing biomass, increased. It is also easier to transport.
  • the fungal culture is Chlorociboria sp. selected from Chlorociboira aeruginascens and Chlorociboria aeruginosa. In a preferred embodiment, it is Chlorociboira aeruginascens, particularly preferably selected from the strains ATCC® 24028, ATCC® 24029, ATCC® 200365, ATCC® 200366 and IHIA39 (NCBI BioSample: SAMN06706673).
  • the method is preceded by at least one pre-cultivation step, preferably in a nutrient medium as preferably selected elsewhere.
  • a preculture is used and the mushroom biomass is increased.
  • pre-cultivation / pre-culture and main cultivation / main culture.
  • the pre-cultivation and the conversion of the fungal biomass from smaller to larger scales is a known method from the prior art and is usually multi-stage, as shown for example in FIG. 3. It is necessary to transfer the fungus to the next larger scale during the exponential growth phase.
  • inoculation with fungal biomass which is undyed is preferably carried out both in the main culture and in each pre-cultivation step.
  • the necessary cultivation time is advantageously shortened in each of these steps. This means that the biomass is kept at the stage in which it is still undyed and no or hardly any xylindein produced.
  • the fungus always forms uncolored, light biomass when it is propagated.
  • the precultivation takes place in a nitrogen-rich nutrient medium, such as a 50% by volume orange juice agar, in particular at 20-22 ° C.
  • a nitrogen-rich nutrient medium such as a 50% by volume orange juice agar, in particular at 20-22 ° C.
  • Inoculating, i.e. H. the contacting according to the invention with undyed mushroom biomass then preferably takes place in a nitrogen-poor medium, as described above.
  • An advantage of the method according to the invention is that the color change from undyed biomass to colored, xylindein-containing biomass is based on the pH profile of the culture medium, ie. H. of the reactor contents can be recognized. After a continuous increase in the pH during the cultivation of the mushroom culture, there is a slowdown in the increase in pH and finally a brief decrease in the pH. At this change between rising and falling, Xylindein production by the mushroom culture begins and a short time later the blue-green color of the mushroom culture becomes visible. In particular during the pre-cultivation steps of the last-mentioned embodiment, the time of the color change can thus advantageously be predicted. This is helpful to keep the mushroom culture at the stage where little or no xylindein is produced.
  • the precultivation first takes place on poured, nutrient-rich agar plates which are inoculated (inoculated) with the mushroom culture according to the invention and incubated at 20-22 ° C.
  • the solvent in step c a non-halogenated solvent. It is preferably selected from acetone, 2-butanone or a mixture thereof.
  • the reactor contents contain a nutrient medium which is suitable for keeping the fungal culture of the invention alive, i.e. the method according to the invention is a method in liquid culture.
  • the fungal culture will adapt its metabolism and the metabolic products will u. U. changed.
  • the method according to the invention advantageously also works with nutrient media which contain fruit juices, even if these fruit juices are older than indicated by the best before date. It is important that the organic residues contain carbohydrates (preferably glucose, mannose, maltose or sucrose) and an organic nitrogen source (e.g. proteins, peptides, yeast extract).
  • the reactor contents preferably comprise a nutrient medium (i.e. a culture solution) which contains up to 50% by volume of food residues. Also included is a nutrient medium which contains a 1-20% by volume orange juice solution, preferably a 3-15% by volume, in particular a 5-10% by volume, particularly preferably a 5% by volume.
  • a 100% orange juice solution is understood to be orange juice with 100 vol% fruit content.
  • the xylindein obtained in step c. is purified by the steps
  • step d Drying in step d is preferred. only a removal of the majority of the solvent, which can be carried out, for example, in a rotary evaporator.
  • the re-dissolution preferably takes place in a small amount of solvent.
  • the precipitation by adding water in step e. expediently takes place with an excess of water, preferably in a volume ratio of 1:10 (1 part of water-soluble organic solvent from step d. and 10 parts of water from step e.) It is particularly preferred after the precipitation in step e. the Xylindein filtered off as a solid. In particular, this is followed by washing with water and drying at about 103 ° C. for preferably 24 hours.
  • the step b. after separation of the biomass remaining liquid culture supernatant further Xylindein by known methods such as filtration with subsequent ultrafiltration, preferably only ultrafiltration, separated and concentrated.
  • Ultrafiltration preferably with a pore size of ⁇ 10 kDa, concentrates, for example, dissolved xylindeine, suspended xylindein and mycelium particles containing xylindeine, which are further described in step c. of the method according to the invention can be used.
  • step a. and b. of the process according to the invention preferably only in step a., worked sterile and the reactor contents kept sterile.
  • the gassing with air is preferably also carried out sterile through a filter.
  • oxygen limitation during step a. excluded the method of the invention.
  • the stirring takes place in step a. at a maximum stirring speed of 0.52 m / s at the edge of the stirrer, d. H. Tip-Speed (stirrer tip speed) instead.
  • the bioreactor has a volume of 70 L.
  • the liquid reactor content preferably has a volume of 55 L.
  • the bioreactor with its content, in particular nutrient medium is contacted in step a. heat sterilized by known methods.
  • Table 1 shows the values of the color determination on the biomass using the Lab color space and the RGB color scale.
  • Table 2 shows exemplary cultivation parameters for the preparation of a preculture from Chlorociboria sp. (in several pre-cultivation steps) and the main culture in the biotechnological extraction of the blue-green mushroom pigment Xylindein.
  • Table 3 shows the results of an embodiment (seeding with undyed biomass) and a comparative example from the literature (seeding with colored biomass). Both the shortening of the cultivation period and the higher productivity in the exemplary embodiment are clearly recognizable.
  • Table 4 shows the comparison of the exemplary embodiment with a comparative example from the laboratory.
  • 1 shows the course of numerous parameters, including the pH value over the cultivation period using an exemplary embodiment.
  • FIG. 2 shows the course of the pH during inoculation (a main culture) with colored or uncolored mushroom biomass using an exemplary embodiment.
  • Fig. 3 shows an example of the sequence of the method according to the invention in an embodiment with pre-cultivation (first, second and third part from the left) and main culture (right part), inoculation (contacting) with undyed biomass in each stage.
  • the preculture for the step a The process described for the production of blue-green mushroom biomass was carried out in several cultivation steps. At the beginning, cultivation on a Petri dish scale was carried out to maintain the strain (preservation of the mushroom culture strain). A 50 vol% orange juice agar was used for this, consisting of 50 vol% orange juice (100 vol% orange juice is understood to mean orange juice with 100 vol% fruit content) and at least 30 g / L agar agar (also called agar, Chinese / Japanese gelatin or Japanese fish glue). The nutrient medium was autoclaved at 121 ° C for 15 min.
  • the poured agar plates were inoculated (inoculated) with an inoculum (plaque, 1 cm 2 ) of an older or acquired stock holding plate and incubated at 20-22 ° C. From this cultivation, two plaques were transferred to the shake flask scale and cultivated in an aqueous nutrient medium made from 5% by volume of orange juice. Subsequently, a total of 200 mL of precultivated mushroom biomass suspension (preculture solution) was transferred from the shake flask culture into a 3 L batch reactor (cultivation medium: 5% by volume orange juice solution) and further cultivated. The pH was monitored continuously and samples of the culture solution for color determination of the fungal biomass were taken regularly.
  • the biomass contained was separated by filtration, washed with distilled water and dried (directly on the filter paper) at 60 ° C. for 24 hours in a drying oven.
  • the color in the lab color space was determined using a spectrophotometer (Datacolor ELREPHO). The determined values represent mean values from 5 measured values.
  • a conversion into, for example, RGB colors is possible with one of the available databases (for example http: //www.cielab-maschine.de/farbsteinbank.html).
  • Execution example 1 - step a Production of blue-green mushroom biomass on a 70 L scale
  • Productivity indicates the amount of xylindein produced per liter of reactor content per day. It is determined by weighing the xylindein obtained in the process and dividing by the volume of the culture medium and the number of days of contacting and stirring (step a.).
  • the yield is defined as the mass of xylindein obtained divided by the volume of the reactor contents.
  • Comparative example 1 b seeding with colored biomass
  • Execution example 1 - step b preparation of the xylindein-containing wet biomass for
  • the blue-green, xylindein-containing wet biomass was separated from the liquid culture supernatant by filtration.
  • a filter bag made of polypropylene fabric with a mesh size of 80 pm was used for this.
  • the liquid culture supernatant was also colored blue-green.
  • Ultrafiltration (10 kDa membrane) was also used to extract xylindein diffused into the medium, as well as remaining, particularly small, biomass particles.
  • the blue-green xylindein-containing wet biomass was dried at a maximum of 70 ° C for 24 h by surface drying on a sheet in an oven with a maximum load of 350 Q wet biomass / dm 2 dried.
  • the dried blue-green biomass was processed into powder in an ultracentrifugal mill (particle size ⁇ 0.5 mm).
  • the extract powder 2-butanone (MEK) was added to the powdered dry mushroom mass.
  • the blue-green mushroom pigment xylindein dissolved in the extraction agent.
  • the extract solution was separated from the extraction residue by filtration.
  • the extractant was removed from the extract solution by rotary evaporation.
  • the extract thus obtained was redissolved in 15 ml of solvent 2-butanone (MEK) and diluted 1:10 with distilled water in a volume ratio (1 part of MEK and 10 parts of distilled water).
  • the mushroom pigment xylindein precipitated and was filtered off.
  • the xylindein was then washed several times with distilled water and dried at 103 ° C. for 24 h.
  • Fungi-derived pigments as sustainable organic (opto) electronic materials
  • Pigments extracted from the wood-staining fungi Chlorociboria aeruginosa, Scytalidium cuboideum, and S. ganodermophthorum show potential for use as textile dyes
  • Centrifugal partition chromatography A preparative tool for isolationand purification ofxylindein from Chlorociboria aeruginosa

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein aus der Pilzbiomasse in einem Bioreaktor, wobei der Reaktorinhalt mit Biomasse angeimpft wird, die ungefärbt ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung ungefärbter Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. zum Animpfen bei der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein.

Description

Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein
Anwendungsgebiet der Erfindung ist die biotechnologische Gewinnung eines Pilzpigmentes, das gewöhnlich als Färbemittel Verwendung findet.
Xylindein ist ein natürliches blaugrünes Pigment (Summenformel C32H24O10, CAS-Nr. 3779-1 1 - 1 ), welches von Pilzen der Gattung Chlorociboria sp., Grünspanbecherlinge, produziert wird und die folgende chemische Struktur besitzt:
Xylindein
Bekannt ist dieses Pigment für die natürliche Blaugrünverfärbung von Holz. Dieses im Wald natürlich verfärbte Holz wird seit mehreren Jahrhunderten für Intarsien genutzt. Xylindein ist ebenfalls für die Nutzung als Fluoreszenzmarker oder als organischer Halbleiter vielversprechend. Derzeit gibt es keine Möglichkeit, Xylindein chemisch zu synthetisieren.
Aus der Literatur ist bekannt, Xylindein biotechnologisch herzustellen und aus grünverfärbtem Zellkulturüberstand und grünverfärbter Zellbiomasse zu isolieren.
Beispielsweise Harrison et al. (2017) kultivierten den Pilz Chlorociboria aeruginosa zuerst auf Malz-Agarose-Platten, um nach Transfer der Biomasse in einen Bioreaktor im 1 L-Maßstab zu kultivieren.
Weber et al. (2016) untersuchten die Kultivierung verschiedener Pilze, darunter Chlorociboria sp., in Schüttelkulturen. Xylindein wurde dort aus dem Zellkulturüberstand extrahiert. Ausbeuten wurden nicht offenbart. Die Kultivierungszeiten sind mit 48d (7 Wochen) aber sehr lang. Stange et al. (2018, Teil 1 ) offenbarten die Kultivierung der Pilzkultur in Lebensmittelreststoffen wie Orangensaft. Verschiedene Substrate wie Holz, Kaffeesatz, Heu oder Reis wurden getestet. Es wird auch beschrieben, dass nährstofflimitierte Bedingungen in der Form eines niedrigeren Stickstoffgehalts im Vergleich zur verfügbaren Kohlenstoffkonzentration für die Bildung von Xylindein günstig sind. Verschiedene N- und C-Quellen wurden getestet und gemischt.
Auch die Heißwasserextraktion von Baumrinden zur Herstellung eines geeigneten Kultivierungsmediums, welche sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe beinhalten, wird beschrieben.
Schon Robinson et al. (2014) wandten das Konzept an, Xylindein direkt aus der Pilzbiomasse und gefärbtem Feststoffsubstrat zu extrahieren, anstatt es aus dem Zellkulturüberstand einer Flüssigkultivierung zu gewinnen. Robinson et al. untersuchten auch die Löslichkeit des Xylindeins in u. a. Acetonitril, Tetrahydrofuran oder Ethanol.
Saikawa et al. (2000) extrahierten mittels heißem Chloroform aus mit Chlorociboria sp. befallenem Holz.
Weber et al. (2014) beschrieben die Extraktion von Xylindein mittels Dichlormethan aus einer Chlorociboria aeruginosa- Kultur aus Malzagarplatten, bestehend aus 2 % Malz und 1 ,5 % Agar.
Stange et al. (2018, Teil 2) nutzten dieses Konzept und färbten Vollholz durch Pilzkultivierung in Flüssigmedien wie beispielsweise Orangensaft. Ziel der Arbeit war es, geeignete Holzarten als Substrat für diese Pilzkultivierung zu finden. Sie entwickelten diesbezüglich einen Feststoffreaktor im Prototypenmaßstab zur gezielten mykologischen Holzverfärbung.
Zur Extraktion des Pilzpigments aus verfärbten Substraten wurde in US2017/0081540A1 Aceton, Tetrahydrofuran bzw. Acetonitril genutzt. Das Extrakt wurde in einem weiteren Schritt mit einem Öl vermischt, welches nach Evaporation des Lösungsmittels als Flüssigträger für das Pilzpigment fungierte. Somit konnte eine Suspension des Pigments in Öl hergestellt werden. Diese Pigment- Suspension soll als Anstrichstoff eingesetzt werden.
Die Extraktion von Pigmenten mit heißem Wasser, sowohl aus befallenem Holz als auch aus Pilzmyzel, wird in EP1736053A1 nahegelegt. Als Reinigungsmethode wird das Ausfällen durch Ansäuern in Kombination mit Filtration beschrieben. Zusammenfassend geht aus dem Stand der Technik hervor, dass eine Kultivierung bisher nur im 1 L-Maßstab realisiert werden kann. Die beschriebenen Kultivierungszeiten sind sehr lang. Sie betragen mindestens 6 Wochen. Die bei der Extraktion eingesetzten Lösungsmittel sind für die industrielle Anwendung aufgrund hoher Toxizität und der damit verbundenen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen nicht praktikabel.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, dass kürzere Prozesszeiten erlaubt. Die Kultivierungszeit soll gering sein. Die Produktivität der Pilzkultur soll hoch sein. Insgesamt soll in kürzerer Zeit genauso viel oder mehr Xylindein als bei bekannten Methoden aus dem Stand der Technik erhalten werden. Das Verfahren soll einfach durchführbar und ökologisch sein.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche. Vorzugsweise Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der jeweils rückbezogenen Unteransprüche.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein in einem Bioreaktor, mit den Schritten:
a. Kontaktieren des Reaktorinhalts mit Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. und Rühren des Reaktorinhalts unter Bildung von Xylindein-haltiger Biomasse, b. Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse, die sich in Schritt a. gebildet hat, c. Extraktion des Xylindeins aus der in Schritt b. abgetrennten Biomasse mit einem Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse, mit der in Schritt a. kontaktiert wird, ungefärbte Biomasse ist.
Die Schritte a, b und c finden nacheinander in dieser Reihenfolge statt.
Das erfindungsgemäße„ Kontaktieren des Reaktorinhalts mit Biomasse der Pilzkultur...“ wird als Impfen/Animpfen/Beimpfen/Inokulieren verstanden, d. h. eine relativ kleine Menge an Pilzkultur wird zum relativ großen Reaktorinhalt gegeben, um sich zu vermehren.
Als Pilzkultur kommt Chlorociboria sp., d. h. Pilze vom Genus Chlorociboria zum Einsatz. Es ist bei diesem Kontaktieren sowohl umfasst, dass der Reaktorinhalt mit isolierter Biomasse der Pilzkultur, beispielsweise in Form eines gereinigten Pilzmyzels kontaktiert wird, als auch, dass die Biomasse anhaftend auf einem Substrat zur Anwendung kommt, wie beispielsweise mit Pilzkultur befallenes Holz oder Agar.
Reaktorinhalt im Sinne der Erfindung bedeutet der Inhalt des erfindungsgemäßen Bioreaktors, insbesondere der meist flüssige Inhalt aus beispielsweise Nährmedium, Zusatzstoffen etc.
Biomasse im Sinne der Erfindung ist die Stoffmasse der Pilzkultur. Insbesondere das sogenannte Pilzmyzel ist damit umfasst.
Die Bezeichnung„ungefärbte Biomasse“ im Sinne der Erfindung steht für Biomasse der Pilzkultur, deren Metabolismus sich noch so eingerichtet hat, dass kein oder nur sehr wenig blaugrünes Pilzpigment Xylindein produziert wird. Die Biomasse ist folglich ungefärbt. Insbesondere hat sie augenscheinlich keine bzw. noch keine sichtbare blaugrüne Färbung. Man kann sie auch als helle Biomasse bezeichnen.
Es ist auch möglich, dass im Zellkulturüberstand kein Xylindein enthalten ist, die Pilzbiomasse aber schon stark blaugrün verfärbt ist und folglich Xylindein enthält, wobei man in diesem Fall nicht mehr von ungefärbter Biomasse spricht.
Vorteil der Erfindung ist, dass das Verfahren eine überraschend kurze Kultivierungsdauer erlaubt, was zu wesentlich kürzeren Prozesszeiten führt, und damit mehr Xylindein pro Zeit als mit herkömmlichen Verfahren gewonnen werden kann.
Prozesszeit im Sinne der Erfindung ist die Zeit, um eine bestimmte Menge Xylindein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellen, d. h. Zeit pro Masse Xylindein. Durch Kontaktieren des Reaktorinhalts (d. h. Animpfen bzw. Inokulieren) mit ungefärbter Biomasse wird die Kultivierungsdauer (d. h. die Dauer des Kontaktierens und Rührens in Schritt a.) um mindestens 33 % im Vergleich zur Nutzung von gefärbter, (vorrangig blaugrüner) Xylindein-haltiger Biomasse als Inokulum reduziert. Insbesondere verkürzt sich die Kultivierungsdauer bzw. die Prozesszeit des Gesamtverfahrens, d. h. mit eventuell vorher durchgeführten Vorkultivierungsschritten.
Ein sich aus diesem Zusammenhang ergebender anderer Vorteil ist, dass die Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren höher ist als bei herkömmlichen Verfahren. Produktivität ist die Masse des von der Pilzkultur gewonnenen (d.h. hergestellten) Xylindeins pro Volumen Reaktorinhalt pro Zeit. Es wird dabei davon ausgegangen, dass die Verluste in Schritt b. und c. des erfindungsgemäßen Verfahrens vernachlässigbar klein sind und die Menge gewonnenen Xylindeins daher immer zu der von der Pilzkultur produzierten Menge Xylindeins proportional ist.
Ein weiterer Vorteil ist, dass das Verfahren holzfrei ist, d. h., dass im Verfahren kein Holz als Substrat für die Pilzkultur erforderlich ist.
Des Weiteren vorteilhaft ist, dass der Startpunkt der Produktion des Pilzpigments Xylindein anhand des Verlaufs des pH-Wertes des Reaktorinhalts vorhergesagt werden kann (Fig. 2). Nach einem kontinuierlichen Anstieg des pH-Wertes während der Kultivierung der erfindungsgemäßen, ungefärbten Biomasse kommt es zu einer Verlangsamung des pH-Anstieges und schließlich zu einer kurzen Absenkung des pH-Wertes. An diesem Wechsel zwischen Anstieg und Abfall des pH-Wertes beginnt eine erhöhte Xylindein-Produktion durch die Pilzkultur und kurze Zeit später wird die blaugrüne Färbung der Pilzkultur sichtbar. Kurz vor diesem Wechselpunkt ist der Stickstoffgehalt limitiert, was den Grund für den Beginn solch eines Sekundärmetabolismus' darstellt.
Ein zusätzlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Lagerfähigkeit und damit verbunden auch die Transportfähigkeit des Zwischenprodukts, d. h. der in Schritt b. abgetrennten Xylindein-haltigen Biomasse, die getrocknet werden kann. Es ist damit vorteilhaft möglich, die Verfahrensschritte an unterschiedlichen Orten durchzuführen und dafür dieses Zwischenprodukt, vorzugsweise in getrockneter Form, zu transportieren.
In einer Ausführungsform ist ungefärbte Biomasse solche, die nach Trocknung bei 60 °C im Lab- Farbraum einen L-Wert von > 67 aufweist, bevorzugt > 70. Insbesondere wird bei 60 °C für 24 h getrocknet.
Im Lab-Farbraum ist L=0 als schwarz und L=100 als weiß definiert. Entsprechend der typischen blaugrünen Färbung der von Chlorociboia sp. produzierten Xylindein-haltigen Biomasse kann also die Stärke des Xylindein-Gehalts in der Biomasse schon allein durch den L-Wert (Luminanz = Helligkeit) bestimmt werden. In einer weiteren Ausführungsform ist ungefärbte Biomasse solche, die nach der oben genannten Trocknung im RAL-Farbsystem heller als RAL 130 90 20 ist. Bevorzugt ist sie heller als RAL 130 90 10, besonders bevorzugt heller als RAL 140 90 05.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung ungefärbter Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. zum Animpfen bei der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein, insbesondere die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.
Es kann angenommen werden, dass ein Zusammenhang besteht zwischen Zusammensetzung des Nährmediums, dem dazu angepassten Stoffwechsel des Pilzstamms und der Verstoffwechselung zu Xylindein oder zu anderen farbfreien Stoffwechselprodukten.
Diesbezüglich umfasst der Reaktorinhalt in einer Ausführungsform ein Nährmedium. Bevorzugt weist das Nähmedium eine Limitierung des verfügbaren Stickstoffs im Vergleich zum Gesamtkohlenstoffgehalt auf. Besonders bevorzugt liegt das Verhältnis von Stickstoff- zu Kohlenstoffquelle im Nährmedium bei 1/400 (in Form von Gesamtstickstoffgehalt zu Gesamtkohlenstoffgehalt, jeweils in g). Unter Stickstoff-Iimitierten Nährstoffbedingungen bildet die Pilzkultur vorrangig Xylindein, wogegen unter Stickstoff-reichen Nährstoffbedingungen vorrangig ungefärbte Biomasse produziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden während Schritt a. (Kontaktieren...) die Prozessparameter kontrolliert und geregelt.
Das umfasst manuelles sowie automatisches Kontrollieren und Regeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse in Schritt b. eine Filtration. Besonders bevorzugt hat das Filtermaterial eine Maschenweite von maximal 80 pm, insbesondere 80 pm. Insbesondere ist das Filtermaterial ein Material, dass für große Volumina gut geeignet ist, wie beispielsweise ein Filtersack aus Polypropylengewebe. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet nach der Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse in Schritt b. und vor Schritt c. eine Trocknung und/oder Zerkleinerung der Biomasse statt. Besonders bevorzugt findet die T rocknung kombiniert mit anschließender Zerkleinerung durch beispielsweise Mahlen, statt. Insbesondere erfolgt diese Trocknung bei maximal 70 °C und/oder flächig bei einer Beladung von maximal 350 g feuchte Biomasse pro dm2. Die Trocknungszeit ist bei 70 °C bevorzugt 24 h.
Vorteilhaft an dieser Ausführungsform ist, dass sich die Lagerfähigkeit des Zwischenproduktes, nämlich der in Schritt b. abgetrennten Xylindein-haltigen Biomasse, erhöht. Sie ist damit auch besser transportfähig.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Pilzkultur Chlorociboria sp. ausgewählt aus Chlorociboira aeruginascens und Chlorociboria aeruginosa. In einer bevorzugten Ausführungsform ist sie Chlorociboira aeruginascens, besonders bevorzugt ausgewählt aus den Stämmen ATCC® 24028, ATCC® 24029, ATCC® 200365, ATCC® 200366 und IHIA39 (NCBI BioSample: SAMN06706673).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dem Verfahren mindestens ein Vorkultivierungsschritt, vorzugsweise in einem Nährmedium wie an anderer Stelle bevorzugt ausgewählt, vorgeschalten. In diesen Schritten wird eine Vorkultur herangezogen und die Pilzbiomasse vermehrt.
In dieser Ausführungsform spricht man dann von Vorkultivierung/Vorkultur und Haupt- kultivierung/Hauptkultur. Die Vorkultivierung und die Überführung der Pilzbiomasse aus kleineren in größere Maßstäbe ist eine bekannte Methode aus dem Stand der Technik und ist meist mehrstufig, wie beispielsweise in Figur 3 dargestellt. Dabei ist es erforderlich, den Pilz während der exponentiellen Wachstumsphase in den nächstgrößeren Maßstab zu überführen.
Vorzugsweise wird in dieser Ausführungsform sowohl in der Hauptkultur als auch bei jedem Vorkultivierungsschritt mit Pilzbiomasse angeimpft, die ungefärbt ist. Vorteilhaft verkürzt sich dabei die nötige Kultivierungsdauer in jedem dieser Schritte. Das heißt, dass die Biomasse in dem Stadium gehalten wird, indem sie noch ungefärbt ist und kein oder kaum Xylindein produziert. Der Pilz bildet bei der Vermehrung bekanntermaßen immer zuerst ungefärbte, helle Biomasse.
In einer Variante dieser Ausführungsform findet die Vorkultivierung in Stickstoff-reichem Nährmedium, wie beispielsweise einem 50 Vol%-igen Orangensaftagar statt, insbesondere bei 20-22 °C. Das Inokulieren, d. h. das erfindungsgemäße Kontaktieren mit ungefärbter Pilzbiomasse, findet dann vorzugsweise in Stickstoff-armem Medium, wie weiter oben beschrieben, statt.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass der Farbumschlag von ungefärbter Biomasse zu gefärbter, Xylindein-haltiger Biomasse anhand des pH-Wert-Verlaufes des Kulturmediums, d. h. des Reaktorinhalts, erkannt werden kann. Nach einem kontinuierlichen Anstieg des pH-Wertes während der Kultivierung der Pilzkultur kommt es zu einer Verlangsamung des pH-Wert-Anstieges und schließlich zu einer kurzen Absenkung des pH- Wertes. An diesem Wechsel zwischen Anstieg und Abfall beginnt die Xylindein-Produktion durch die Pilzkultur und kurze Zeit später wird die blaugrüne Färbung der Pilzkultur sichtbar. Insbesondere während der Vorkultivierungsschritte der letztgenannten Ausführungsform kann damit vorteilhaft der Zeitpunkt des Farbumschlags vorhergesehen werden. Das ist hilfreich, um die Pilzkultur in dem Stadium zu halten, in dem kein oder kaum Xylindein produziert wird.
In einer bevorzugten Variante der obigen Ausführungsform findet die Vorkultivierung zuerst auf gegossenen, nährstoffreichen Agar-Platten statt, die mit der erfindungsgemäßen Pilzkultur beimpft (angeimpft) und bei 20-22 °C inkubiert werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Lösungsmittel in Schritt c. ein nicht-halogenhaltiges Lösungsmittel. Bevorzugt ist es ausgewählt aus Aceton, 2-Butanon oder einer Mischung daraus.
In einer vorteilhaften Ausführungsform enthält der Reaktorinhalt ein Nährmedium, das geeignet ist, die Pilzkultur der Erfindung am Leben zu halten, d.h. das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren in Flüssigkultur. Je nach Zusammensetzung des Nährmediums wird die Pilzkultur ihren Metabolismus anpassen und die Stoffwechselprodukte werden u. U. verändert. Das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert vorteilhaft auch mit Nährmedien, die Fruchtsäfte enthalten, auch wenn diese Fruchtsäfte schon älter sind als durch das Mindesthaltbarkeitsdatum angegeben. Dabei ist wichtig, dass die organischen Reststoffe Kohlenhydrate (bevorzugt Glucose, Mannose, Maltose oder Saccharose) sowie eine organische Stickstoffquelle (z. B. Proteine, Peptide, Hefeextrakt) enthalten.
Vorzugsweise umfasst der Reaktorinhalt in einer Ausführungsform ein Nährmedium (d. h. eine Kulturlösung), das bis zu 50 Vol-% Lebensmittelreststoffe enthält. Weiterhin ist ein Nährmedium umfasst, das eine 1 -20 Vol-%ige Orangensaftlösung enthält, bevorzugt eine 3-15 Vol-%ige, insbesondere eine 5-10 Vol-%ige, besonders bevorzugt eine 5 Vol-%ige. Als 100%ige Orangensaftlösung wird Orangensaft mit 100 Vol-% Fruchtgehalt verstanden.
In dieser Ausführungsform erkennt man (bei Verfolgung des pH-Wertes im flüssigen Reaktorinhalt), dass der Farbumschlag, d. h. der Start bzw. die Verstärkung der Xylindein- Produktion umso später erfolgt, je höher die Konzentration des Orangensafts im Nährmedium zu Beginn der Kultivierung ist. Es wird angenommen, dass es umso länger dauert, bis der Stickstoff- limitierte Zustand als Auslöser des Sekundärmetabolismus' erreicht wird, je höher die Konzentration des Orangensafts im Nährmedium ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Xylindein, erhalten in Schritt c., aufgereinigt durch die Schritte
d. Trocknung des Xylindeins und Wiederauflösen in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel e. Ausfällen gereinigten Xylindeins durch Zugabe von Wasser zu der Mischung aus Schritt d.
Bevorzugt ist die Trocknung in Schritt d. nur eine Entfernung des Großteils des Lösungsmittels, die beispielsweise in einem Rotationsverdampfer durchgeführt werden kann. Bevorzugt findet das Widerauflösen in einer geringen Menge Lösungsmittel statt. Das Ausfällen durch Zugabe von Wasser in Schritt e. erfolgt zweckmäßig bei einem Überschuss von Wasser, vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von 1 :10 (1 Teil wasserlösliches organisches Lösungsmittel aus Schritt d. und 10 Teile Wasser aus Schritt e.) Besonders bevorzugt wird nach dem Ausfällen in Schritt e. das Xylindein als Feststoff abfiltriert. Insbesondere schließt sich ein Waschen mit Wasser und ein Trocknen bei ca. 103 °C für vorzugsweise 24h an.
In einer ebenfalls vorteilhaften Ausführungsform wird aus dem in Schritt b. nach Abtrennung der Biomasse verbleibenden flüssigen Kulturüberstand weiteres Xylindein durch bekannte Methoden wie Filtration mit anschließender Ultrafiltration, bevorzugt nur Ultrafiltration, abgetrennt und aufkonzentriert.
Die Ultrafiltration, bevorzugt mit einer Porengröße < 10 kDa, konzentriert dabei beispielsweise gelöstes Xylindein, suspendiertes Xylindein sowie Xylindein-haltige Myzelpartikel auf, welche weiter in Schritt c. des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei Schritt a. und b. des erfindungsgemäßen Verfahrens, bevorzugt nur bei Schritt a., steril gearbeitet und der Reaktorinhalt steril gehalten. Dabei erfolgt bevorzugt die Begasung mit Luft ebenfalls steril durch einen Filter. In einer Ausführungsform wird eine Sauerstoff-Limitierung während Schritt a. des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeschlossen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet das Rühren in Schritt a. bei maximal 0,52 m/s Rührgeschwindigkeit am Rand des Rührers, d. h. Tip-Speed (Rührerspitzengeschwindigkeit), statt.
In einer Ausführungsform hat der Bioreaktor ein Volumen von 70 L. Bevorzugt hat dabei der flüssige Reaktorinhalt ein Volumen von 55 L.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Bioreaktor mit seinem Inhalt, insbesondere Nährmedium, vor dem Kontaktieren in Schritt a. nach bekannten Methoden hitzesterilisiert.
Tabelle 1 zeigt Werte der Farbbestimmung an der Biomasse mittels Lab-Farbraum sowie anhand der RGB-Farbskala auf. Tabelle 2 zeigt beispielhafte Kultivierungsparameter zur Herstellung einer Vorkultur aus Chlorociboria sp. (in mehreren Vorkultivierungsschritten) und der Hauptkultur bei der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse eines Ausführungsbeispiels (Animpfen mit ungefärbter Biomasse) und eines Vergleichsbeispiels aus der Literatur (Animpfen mit gefärbter Biomasse). Sowohl die Verkürzung der Kultivierungsdauer als auch die höhere Produktivität im Ausführungsbeispiel sind deutlich erkennbar.
Tabelle 4 zeigt den Vergleich von Ausführungsbeispiel mit einem Vergleichsbeispiel aus dem Labor.
Fig. 1 zeigt den Verlauf zahlreicher Parameter, darunter des pH-Werts über die Kultivierungsdauer anhand eines Ausführungsbeispiels.
Fig. 2 zeigt den Verlauf des pH-Wertes beim Animpfen (einer Hauptkultur) mit gefärbter bzw. ungefärbter Pilzbiomasse anhand eines Ausführungsbeispiels.
Fig. 3 zeigt beispielhaft den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Ausführungsform mit Vorkultivierung (erster, zweiter und dritter Teil von links) sowie Hauptkultur (rechter Teil), wobei in jedem Stadium anfangs mit ungefärbter Biomasse angeimpft (kontaktiert) wird.
Alle Ausführungsformen der Erfindung können in beliebiger Weise miteinander kombiniert werden.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele verdeutlicht ohne auf diese beschränkt zu sein.
Ausführunqsbeispiel 1 : Vorkultivierunq des Xylindein-produzierenden Pilzes Chlorociboria so.
Die Vorkultur für den in Ausführungsbeispiel 1 - Schritt a. beschriebenen Prozess zur Herstellung von blaugrüner Pilzbiomasse erfolgte in mehreren Kultivierungsschritten. Dabei wurde Eingangs eine Kultivierung im Petrischalenmaßstab zur Stammerhaltung (Erhaltung des Pilzkulturstamms) durchgeführt. Hierfür diente ein 50 Vol-%iger Orangensaftagar, bestehend aus 50 Vol- % Orangensaft (als 100 Vol-%iger Orangensaft wird Orangensaft mit 100 Vol-% Fruchtgehalt verstanden) und mindestens 30 g/L Agar-Agar (auch genannt Agar, Chinesische/Japanische Gelatine oder Japanischer Fischleim). Das Nährmedium wurde bei 121 °C für 15 min autoklaviert. Die gegossenen Agar-Platten wurden mit einem Impfstück (Plaque, 1 cm2) einer älteren oder erworbenen Stammhaltungsplatte beimpft (angeimpft) und bei 20 - 22 °C inkubiert. Aus dieser Kultivierung wurden zwei Plaques in den Schüttelkolbenmaßstab überführt und in einem wässrigen Nährmedium aus 5 Vol-% Orangensaft kultiviert. Im Anschluss wurden insgesamt 200 mL vorkultivierte Pilzbiomassesuspension (Vorkulturlösung) aus der Schüttelkolbenkultur in einen 3 L-Batchreaktor (Kultivierungsmedium: 5 Vol-% Orangensaft-Lösung) transferiert und weiterkultiviert. Der pH-Wert wurde kontinuierlich verfolgt und es wurden regelmäßig Proben der Kulturlösung zur Farbbestimmung der Pilz-Biomasse entnommen. Es wurde solange kultiviert, bis die Steigerung des pH-Wertes abnahm und der pH-Wert wieder zu sinken begann. Zur gleichen Zeit näherte sich der L-Wert aus der Farbbestimmung dem Grenzbereich an, bei dem ein Umschlag von ungefärbter zu gefärbter Biomasse auftrat. Die Kultivierung dieser Vorkultur wurde bei L=85 (Luminanz-Wert) gestoppt. Tabelle 1 zeigt die Werte der Farbbestimmung an der Biomasse mittels Lab-Farbraum sowie der RGB-Farben auf. Die Methode zur Farbbestimmung der Pilz-Biomasse und die erforderliche Vorbehandlung werden im folgenden Abschnitt beschrieben.
Während der Vorkultivierung ist es erforderlich, den Pilz während der exponentiellen Wachstumsphase in den nächstgrößeren Maßstab zu überführen. Hierfür wurde für den Pilz Chlorociboria aeruginascens IHIA39 für die Schüttelkolbenkultur 7 Tage und für die 5L- Kultivierung ebenfalls 7 Tage ermittelt. Damit wurde die Vorkultivierungsdauer um mindestens 50 % im Vergleich zur Nutzung von gefärbter, Xylindein-haltiger Biomasse als Inokulum reduziert. Methode zur Farbbestimmung der Pilz-Biomasse
Nach Entnahme einer Probe der Flüssigkultur wurde die enthaltene Biomasse durch Filtration abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und (direkt auf dem Filterpapier) bei 60°C für 24 h im Trockenofen getrocknet. Anhand der getrockneten Biomasse wurde die Farbe im Lab- Farbraum mittels eines Spektralphotometers (Datacolor ELREPHO) bestimmt. Die ermittelten Werte stellen Mittelwerte aus 5 Messwerten dar. Eine Umrechnung in beispielsweise RGB- Farben ist mit einer der verfügbaren Datenbanken möglich (beispielsweise http://www.cielab- farben.de/farbdatenbank.html).
Tabelle 1 - Bestimmung der Farbe der Biomasse in unterschiedlichen Stadien
Es sind Werte aufgeführt für ungefärbte Biomasse (zum Animpfen), für Biomasse bei Farbumschlag (von ungefärbter Biomasse zu gefärbter Biomasse) und für stark blaugrün gefärbte Biomasse.
Als Grenze zur Unterscheidung zwischen gefärbter und ungefärbter Biomasse wurde ein L-Wert (Luminanz = Helligkeit) von ca. 70 bestimmt.
Ausführunqsbeispiel 1 - Schritt a: Herstellung von blauqrüner Pilzbiomasse im 70 L-Maßstab
Für die Hauptkultivierung zur Herstellung von blaugrüner Pilzbiomasse enthaltend Xylindein wurde ein 70 L-Bioreaktor (Applikon Biotechnology B.V.) mit 55 L 5Vol-%igem Orangensaft in Wasser beschickt. Im Bioreaktor wurde das Nährmedium bei 123 °C für 30 min („ Sterilisation in Place“, SIP) hitzesterilisiert und die Prozessparameter (wie in Tabelle 2 aufgeführt) eingestellt. 5 L Vorkultur mit ungefärbter Biomasse (aus Ausführungsbeispiel 1 , Vorkultivierung) wurden in den Reaktor überführt und für 14 Tage kultiviert. Mittels Prozessmonitoring wurde der Zeitpunkt des Farbumschlags der Pilzbiomasse von ungefärbt zu blaugrüngefärbt durch online-Messung des pH-Wertes bestimmt. Während der Kultivierung stieg der pH-Wert von pH 4 auf pH 4,2 an. Etwa ab Tag 4 sank der pH-Wert leicht auf 4,1 ab und stieg ab Tag 5 bis Tag 6 wieder auf pH 4,5 an. Dieses pH-Wert-Verhalten weist auf den Farbumschlag der Kultur hin.
In Tabelle 2 sind die verwendeten Kultivierungsparameter aufgeführt.
Tabelle 2 - Kultivierungsparameter einer Vor- und der Hauptkultur aus Chlorociboria sp. zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein.
Tabelle 3 - Vergleich der Ergebnisse der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein, bei Animpfen mit gefärbter bzw. ungefärbter Biomasse
Die Produktivität gibt die Menge Xylindein an, die pro Liter Reaktorinhalt pro Tag produziert wurde. Sie wird bestimmt, durch Wiegen des Xylindeins, dass im Verfahren gewonnen wurde und Division durch das Volumen des Kulturmediums sowie die Anzahl der Tage des Kontaktierens und Rührens (Schritt a.).
Dementsprechend wird die Ausbeute definiert als die Masse an gewonnenem Xylindein, dividiert durch das Volumen des Reaktorinhalts.
Verqleichsbeispiel 1 b - Animpfen mit gefärbter Biomasse
Es wurden parallel auch alle Kultivierungen mittels gefärbter, d. h. Xylindein-haltiger Biomasse durchgeführt. Diese Vergleichsbeispiele wurden analog der obigen Vorschriften durchgeführt mit dem Unterschied, dass nach erster Impfung mit dem Impfstück nur noch mit gefärbter Biomasse angeimpft wurde.
Tabelle 4 - Vergleich der Ergebnisse in der kompletten Kultivierungskette vom Schüttelkolben bis zum 70 L-Bioreaktor.
Wie in Tabelle 4 zu sehen ist, konnte durch das Animpfen mit ungefärbter Biomasse die Prozesszeit von 6 Wochen um ein Drittel auf 4 Wochen reduziert werden, bei gleichzeitig schnellerem Eintritt der Farbstoffbildung. Die Absorptionswerte des Überstandes bei 640 nm nach Kultivierungsende (korrelieren mit der Xylindeinkonzentration im Überstand) zeigen, dass beim Animpfen mit ungefärbter Biomasse mehr Xylindein produziert wurde als beim Animpfen mit gefärbter Biomasse. Dieser Vorteil zeigt sich auch bezüglich der Menge des in der Pilzbiomasse enthaltenen Xylindeins.
Ausführunqsbeispiel 1 - Schritt b: Aufbereitung der Xylindein-haltiqen Feuchtbiomasse zur
Herstellung von blauqrüner Xylindein-haltiqer Biotrockenmasse
Bei der Ernte des 70 L-Bioreaktors wurde die blaugrüne, Xylindein-haltige Feuchtbiomasse durch Filtration vom flüssigen Kulturüberstand abgetrennt. Hierfür wurde ein Filtersack aus Polypropylengewebe mit der Maschenweite von 80 pm genutzt. Der flüssige Kulturüberstand war ebenfalls blaugrün gefärbt. Mittels Ultrafiltration (10 kDa-Membran) wurde daraus zusätzlich ins Medium diffundiertes Xylindein sowie restliche, besonders kleine Biomassepartikel gewonnen. Die blaugrüne Xylindein-haltige Feuchtbiomasse wurde bei maximal 70 °C für 24 h durch flächiges Trocknen auf einem Blech in einem Ofen mit maximaler Beladung von 350 Q Feuchtbiomasse/ dm2 getrocknet. Die getrocknete blaugrüne Biomasse wurde in einer Ultrazentrifugalmühle zu Pulver verarbeitet (Partikelgröße < 0,5 mm).
Ausführunqsbeispiel 1 - Schritt c: Extraktion des Xylindeins
Die pulverförmige Pilzbiotrockenmasse wurde mit dem Extraktionsmittel 2-Butanon (MEK) versetzt. Dabei löste sich das blaugrüne Pilzpigment Xylindein im Extraktionsmitel. Die Extraktlösung wurde vom Extraktionsrückstand durch Filtration abgetrennt. Durch Rotationsverdampfung wurde der Extraktlösung das Extraktionsmittel entzogen. Das somit gewonnene Extrakt wurde in 15 ml_ Lösungsmittel 2-Butanon (MEK) zurückgelöst und im Volumen-Verhältnis 1 :10 mit destilliertem Wasser verdünnt (1 Teil MEK und 10 Teile destilliertes Wasser). Dabei fiel das Pilzpigment Xylindein aus und wurde abfiltriert. Anschließend wurde das Xylindein mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 103 °C für 24 h getrocknet.
Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein in einem Bioreaktor, mit den Schritten a. Kontaktieren des Reaktorinhalts mit Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. und Rühren des Reaktorinhalts unter Bildung von Xylindein-haltiger Biomasse, b. Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse, die sich in Schritt a. gebildet hat, c. Extraktion des Xylindeins aus der in Schritt b. abgetrennten Biomasse mit einem Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse, mit der in Schritt a. kontaktiert wird, ungefärbte Biomasse ist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei das Lösungsmittel in Schritt c. ausgewählt ist aus Aceton, 2-Butanon oder einer Mischung daraus.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei nach der Abtrennung derXylindein- haltigen Biomasse in Schritt b. und vor Schritt c. eine Trocknung und/oder Zerkleinerung der Biomasse stattfindet.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Reaktorinhalt in Schritt a. ein Nährmedium umfasst, das bis zu 50 Vol-% Lebensmittelreststoffe enthält.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Reaktorinhalt in Schritt a. ein Nährmedium umfasst, das eine 1 Vol-%ige bis 20 Vol-%ige Orangensaft-Lösung enthält.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Xylindein, erhalten in Schritt c., aufgereinigt wird durch die Schritte d. Trocknung des Xylindeins und Wiederauflösen in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel e. Ausfällen gereinigten Xylindeins durch Zugabe von Wasser zu der Mischung aus Schritt d.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei aus dem in Schritt b. nach Abtrennung der Biomasse verbleibenden flüssigen Kulturüberstand weiteres Xylindein durch Ultrafiltration abgetrennt und aufkonzentriert wird.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Pilzkultur Chlorociboria sp. ausgewählt ist aus Chlorociboria aeruginascens und Chlorociboria aeruginosa.
9. Verwendung ungefärbter Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. zum Animpfen bei der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein.
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