EP2989437A1 - Dispositif pour la preparation d'echantillon biologique - Google Patents

Dispositif pour la preparation d'echantillon biologique

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Publication number
EP2989437A1
EP2989437A1 EP14726695.1A EP14726695A EP2989437A1 EP 2989437 A1 EP2989437 A1 EP 2989437A1 EP 14726695 A EP14726695 A EP 14726695A EP 2989437 A1 EP2989437 A1 EP 2989437A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tank
filtration
collection
suction
zone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP14726695.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrick Broyer
Laurent Veron
Hervé ROSTAING
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP2989437A1 publication Critical patent/EP2989437A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples

Definitions

  • the field of the present invention is that of microbiological analysis. More particularly, the present invention relates to a device for the preparation of biological sample for microbiological diagnosis. Vacuum filtration is conventionally used in laboratories. It is used in two ways:
  • the filtrate is discarded, the concentrate (also called retentate) and / or the filter are preserved.
  • FIG. One known device of the state of the art is the Buchner funnel. Such a device is shown in FIG. It comprises a funnel in which is arranged transversely a perforated plate. The funnel is sealed in the neck of a vacuum flask with a stopper. The vacuum flask is connected to a suction source. On the perforated plate is a filter paper moistened so that particles in a liquid poured on the upper part of the paper can be retained during suction. The filtered liquid, or filtrate, is collected in the vial.
  • Such a device has several disadvantages. Indeed, the filter can clog quickly if the liquid contains too much particles or microorganisms which can prevent filtration of the entire volume.
  • the large filtration area necessary to be able to filter a sufficient quantity of sample, may require the use of a large volume of liquid for the complete resuspension of the microorganisms retained on the filter, which not allow to have an optimal concentration ratio.
  • the collection of particles of interest or microorganisms retained on the filter paper is difficult and requires the use of a swab manually. Swab recovery automatically is not easy to achieve in a reproducible manner.
  • this type of device has a second disadvantageous release yield if the concentrate, especially bacterial, must be delivered in liquid form for the purposes of the analysis protocol.
  • the dispensed liquid spreads over the entire surface of the filter, so it is difficult to aspirate it again.
  • the sequence of a filtration protocol using this device can not be automated easily.
  • Another device of the prior art described in the patent application US 2007/0298451 A1, comprises a lower filtration unit and a higher filtration unit.
  • the upper filtration unit comprises a cylindrical wall of a first diameter and a cylindrical wall of a smaller diameter connected by a transverse part.
  • the lower filtration unit comprises a cylindrical wall of a first diameter and a cylindrical wall of a smaller diameter connected by a transverse part.
  • a perforated plate and a filtration membrane On the transverse part is arranged a perforated plate and a filtration membrane.
  • a cylindrical wall of still smaller diameter is disposed downstream of the perforated plate and connected to the lower filtration block by a transverse portion, so as to connect a suction source to the device.
  • the upper filter block is pushed onto the lower filter block.
  • the membrane of the upper filtration block has a higher porosity than the membrane of the lower filtration block. Therefore, by pouring a liquid sample on the membrane of the upper filter block and activating the suction source, it is filtered a first and a second time.
  • this device may have a better filtration efficiency, including progressive filtration, the dispensed liquid spreads over the entire surface of both membranes, making collection difficult.
  • a blockage, even partial, of one or more membranes (s) can cause a loss of load during suction and slow down or even prevent filtration.
  • the object of the invention is therefore to overcome the disadvantages of the aforementioned prior art.
  • a first object of the present invention is thus to provide a biological sample treatment device for collecting the microorganisms contained in the sample by removing constituents of the matrix of the latter.
  • constituents may be dissolved salts, proteins, crystals, mucous, human cells, or others.
  • a second object of the invention is to provide a biological sample treatment device for rapid purification of microbial content for subsequent analysis as well as washing of the filter or collection membrane.
  • a third object of the invention is to provide a biological sample treatment device for both concentrating microorganisms on the surface of the filter or the collection membrane and for resuspending the microorganisms thus concentrated, in one volume. limited buffer.
  • a fourth object of the invention is to provide a biological sample processing device so that the steps of the processing protocol using the device can be performed in a fully automated manner by a suitable pipetting robot (eg Hamilton Robotics Starlet). ), also called a pipetting robot.
  • a suitable pipetting robot eg Hamilton Robotics Starlet
  • a fixed support whose base extends in a first plane
  • a filter unit that can be removable, said filtration unit comprising a collection tank that itself comprises a wall and a filtration means, the filtration means extending in a second plane and dividing said collection tank into a zone; and a suction zone, the suction zone being adapted to be connected to a suction means, the second plane of the filter means being inclined relative to the plane of the base of the fixed support.
  • the present invention relates to a device for the preparation of biological sample comprising:
  • a fixed support whose base extends in a first plane
  • a filter unit that can be removable, said filtration unit comprising a collection tank which itself comprises a filtration means extending in a second plane and dividing said collection tank into a collection zone and a suction zone; , the suction zone being adapted to be connected to a suction means, the second plane of the filtering means being inclined relative to the plane of the base of the fixed support.
  • biological sample a liquid sample, likely to contain one or more constituents of interest, such as urine, blood cultures, sputum, cerebrospinal fluid, ....
  • constituents of interest may be microorganisms such as yeast, bacteria, or micro-vesicles or exosomes.
  • the subject of the invention is a device for the preparation of a biological sample comprising:
  • a fixed support whose base extends in a first plane
  • a filter unit that can be removable, said filtration unit comprising a collection tank itself having a filtration means extending in a second plane and dividing said collection reservoir into a collection zone and a suction zone, the suction zone being adapted to connected to a suction means, the second plane of the filtering means being inclined relative to the plane of the base of the fixed support, the filtration unit further comprises a pre-filtration tank that can be removable, said prefiltration tank comprising a filtration means dividing the prefiltration tank into a collection zone and a suction zone, the suction zone of the prefiltration tank being in fluid communication with the collection area of the collection tank.
  • the subject of the invention is a device for the preparation of a biological sample comprising:
  • a fixed support whose base extends in a first plane
  • said filtration unit comprising a collection tank itself comprising a wall and a filtering means, the filtering means extending in a second plane and dividing said collection tank into a collection zone and a suction zone, the suction zone being adapted to be connected to a suction means, the second plane of the filtering means being inclined relative to the plane of the base of the fixed support, the filtration unit further comprises a prefiltration reservoir which can be removable, said prefiltration tank comprising a filtration means dividing the prefiltration tank into a collection zone and a suction zone, the suction zone of the prefiltration tank being in fluid communication with the collection zone of the collection tank .
  • the suction zone of the prefiltration tank is adapted to be connected to a second suction means.
  • the wall of the collection tank in the collection zone is partly inclined or ogival-shaped.
  • the wall of the collection zone of the collection tank is partly inclined or ogival-shaped.
  • the wall of the collection tank in the collection zone is rigid.
  • the filtering means of the collection reservoir comprises at least one membrane with a porosity of between 0.02 and 1.5 ⁇ " ⁇ , preferably between 0.02 and ⁇ ⁇ , more preferably between 0.02 and ⁇ , ⁇ . , even more preferentially between 0.02 ⁇ and 0.45 ⁇
  • the filtration means of the collection reservoir comprises at least one membrane with a porosity of between 0.02 ⁇ and 0.45 ⁇ .
  • the filtration means of the prefiltration tank comprises at least one porosity filter of between 5 ⁇ and 1,000 ⁇ , preferably between 5 ⁇ and 100 ⁇ .
  • the filtration means of the prefiltration tank comprises a stack of filters.
  • the filtration means of the prefiltration tank comprises a stack of filters of increasing porosity from the suction zone of the prefiltration tank to the collection zone of the prefiltration tank.
  • the filtration means of the prefiltration tank comprises or consists of a stack of prefilters of increasing porosity in order from bottom to top, the prefilter placed at the top being the first to receive the liquid.
  • the second plane of the filtering means of the collection tank is inclined relative to the plane of the base of the fixed support at an angle of between 10 ° and 60 °, preferably between 20 ° and 50 °, of preferably between 25 ° and 45 °, more preferably equal to 30 °.
  • the collection reservoir comprises an upper portion and a lower portion cooperating to maintain the filtration means of the collection tank
  • the prefiltration tank comprises an upper part and a lower part cooperating to maintain the filtering means of the prefiltration tank
  • the prefiltration tank comprises means capable of cooperating with a pipette robot tool such as a pipette holder or a swab holder.
  • the filtration unit further comprises a third filtering container that can be removable, said third filtration tank comprising a filtration means dividing the third filtration tank into a collection zone and a suction zone, the collection zone of the third filtration tank being in fluid communication with the suction zone of the collection tank.
  • the suction means is a suction / discharge means.
  • suction / discharge means any means capable of passing a liquid from the collection area of the collection tank to the suction zone of the suction collection tank and possibly the suction zone of the reservoir. collection to the collection area of the collection tank by backflow.
  • the advantage of the backflow is in particular to be able to resuspend in a liquid a portion of the concentrate of constituents of interest (also called retentate) from the biological sample by detaching from the filtration means.
  • a succession of suction and discharge stages also makes it possible to improve the concentration of the concentrate in the collection zone, more particularly in a preferential zone.
  • This suction / discharge operation can therefore be performed several times.
  • This suction / discharge operation can be carried out by adding a buffer, for example a carbonate buffer or water, in particular to carry out a washing.
  • the second suction means that can be connected to the suction zone of the prefiltration tank is a suction / discharge means.
  • the suction means is replaced by means for placing the collection tank and / or the prefiltration tank and / or the filtration tank in overpressure.
  • the pressurizing means is therefore adapted to be connected to the collection zone of the collection tank and / or the prefiltration tank and / or the filtration tank.
  • the second suction means is replaced by a second means for overpressuring the collection tank and / or the prefiltration tank.
  • the second means of overpressure is adapted for this purpose to be connected to the collection zone of the collection tank and / or the prefiltration tank.
  • the collection tank and / or the prefiltration tank and / or the filtration tank is closed by a closure means.
  • said closure means is pierceable by a robotic robot tool, such as a pipette, a swab, a pipette holder, a swab holder, a gripping tool such as a forceps or directly by the tip of a pipetting channel integrated in the robot.
  • said closure means is removable by a robotic robot tool, for example a gripping tool such as a clamp, a pipette holder or a swab holder.
  • the invention also relates to the use of a device according to any one of the various embodiments presented for the treatment of a biological sample.
  • the subject of the invention is also a method for treating a biological sample using a device according to any one of the various embodiments presented, comprising the following steps:
  • the subject of the invention is a method for treating a biological sample with the aid of a device according to the invention comprising the following steps:
  • the subject of the invention is a method of treating a biological sample with the aid of a device according to the invention comprising the following steps:
  • the subject of the invention is a method for treating a biological sample with the aid of a device according to the invention as described above, further comprising a step consisting of:
  • the subject of the invention is a method of treating a biological sample with the aid of a device according to the invention as described above, including the step of:
  • the invented device allows easy access to the filtration means of the collection tank, for example to the membrane, in order to carry out washes or collect microorganisms, for example by resuspension by pipette or by swabbing.
  • the inclination of the second plane in which the filtering means of the collection tank extends with respect to the plane of the base of the fixed support can be obtained by the geometry of the fixed support on which the filtration unit is arranged and / or by inclination of the filtration means.
  • the fixed support may comprise a plane inclined relative to its base, the latter being horizontal, the filtration unit being disposed on this inclined plane and the filtering means of the collection tank s' extending in a plane parallel to this inclined plane.
  • the inclination of the second plane in which the filtering means of the collection tank extends relative to the plane of the base of the fixed support is fixed throughout the filtration step.
  • the shape of the wall of the collection tank makes it possible, in cooperation with the inclination of the second plane in which the filtration means extends, to promote the retention of the biological sample in a preferential collection zone when the latter is dispensed in the collection tank.
  • This preferential zone corresponding to the lower part of the filtration means.
  • This preferential zone contains, following a filtration step, the majority of the concentrate of microorganisms or constituents of interest present in the biological sample.
  • the suction zone is thus defined by the second plane of the filtration means is the wall of the collection tank so that the filter means is the wall of the collection tank are in contact in the preferred area.
  • the advantage of this contact is to avoid the formation of dead volumes where a liquid portion of the biological sample could stagnate after the filtration step.
  • Another advantage of this contact and of this preferential zone is to favor the retention of the biological sample in a delimited and predictable zone, which favors a higher recovery efficiency by a robotic robot automaton that does not have a vision system. in particular a vision system for locating a bacterial carpet on the surface of the filtration means.
  • the geometry of this preferential zone can be modified according to the angle formed between the filtration means and the wall of the collection tank.
  • This angle can be closed (acute) to create a localized but deep or open (obtuse) preferential zone to limit the depth of the preferential zone while enlarging the area covered by said zone for the same volume of liquid contained in this zone.
  • the angle formed between the filtration means and the wall of the collection reservoir in the preferred zone is thus between 10 and 170 degrees, preferably between 30 and 150 degrees, preferably between 50 and 130 degrees, preferably between 70 and 120 degrees, more preferably between 80 and 100 degrees, more preferably between 50 and 70 degrees. Even more preferably the angle is 90 degrees. Even more preferably the angle is 60 degrees.
  • the filtration means is the wall of the collection tank are in contact over the entire surface of the filtration means.
  • the advantage of this contact over the entire surface of the filtration means is to limit the adhesion on the wall of any debris contained in the biological sample and to simplify the process of filtering the biological sample, which may be be distributed anywhere in the collection area of the collection tank, especially on the wall or directly on the filtering means.
  • the microorganisms concentrate towards the lower part of the filtration means forming, for example, a closed angle with the wall of the collection reservoir.
  • a bacterial concentrate can for example be recovered without significant loss of volume (volume recovered from 300 to 700 ⁇ ), relative to the volume of collection buffer dispensed (volume 400 to 1000 ⁇ ), a factor of 10 to 20 relative to the volume. initial biological sample.
  • the inclination of the second plane of the filtration means relative to the plane of the base of the fixed support may be between 10 ° and 60 °, preferably between 20 ° and 50 °, preferably between 25 ° and 45 °, more preferably equal to 30 °.
  • the device according to the invention is easily usable with an automated pipettor also called pipetting robot.
  • the wall of the collection tank is adapted to be able to present vertically a pipette robot tool, such as a pipette or a swab, in line with the entire surface of the filtering means of the collection tank directly after or during filtration step.
  • the interest is not to have to move the device, the collection tank and / or the filtration means to collect the concentrate of constituents of interest.
  • Another advantage is to be able to collect by abrasion or detachment the concentrate of constituents of interest, such as microorganisms, deposited on all or part of the filtration means after filtration, by means of a swab.
  • the shape of the wall of the collection tank is adapted so that an operator or a pipetting robot can access the entire surface of the filtering means of the collection tank, in particular in the vertical of said filtering means.
  • a pipetting robot indeed has a pipette moving in translation in three degrees of freedom and not allowing to perform complex movements or to present a pipette other than vertically.
  • This access to the entire surface of the filtering means of the collection tank thus makes it possible to dispense a liquid on an area of the filtration means of the collection tank of a powerful jet and then to suck up the same liquid in order to be able to re-dispense it powerfully on another area of the filtering means of the collection tank.
  • a series of about twenty dispensing / re-aspirations can thus be performed in order to concentrate and then harvest the constituents of interest retained on the entire surface of the filtration means of the collection tank.
  • the inclination of the collection tank also allows the collection liquid to be located in the preferential collection area by limiting the volume losses that a horizontal filtration system would generate.
  • the wall of the collection tank may have at least one inclined or ogival-shaped part adapted to be able to vertically present a pipette, in line with the concentrate of constituents of interest, in particular microorganisms, the concentrate being mostly located in the preferential zone.
  • This geometry also facilitates pipetting and / or swabbing operations, manual and / or automatic, in particular by avoiding striking the wall of the collection tank.
  • the advantage of such a device is that it can be used, on the same type of device, for different types of biological samples (urine, blood cultures, etc.) of different volumes (10 ml to 1 ml), selecting a treatment protocol adapted to the biological sample considered.
  • the protocol is a selective lysis followed by a single filtration on a filtering means, for example a membrane.
  • the protocol consists of prefiltration on the filtration means of the prefiltration tank, followed by filtration on the filtering means of the collection tank, for example on a membrane.
  • the two protocols can advantageously be followed by one or more washing steps of the bacterial concentrate, using suitable washing solutions.
  • ITRV Identification Typing Resistance Virulence
  • ESI ElectronSpray ionization mass spectrometry
  • the advantage of such a device is also to be disposable.
  • the materials used for its realization being inexpensive, the device and / or the filtration unit and / or the prefiltration tank may be disposable for the treatment of a sample.
  • the filtration unit is removable.
  • the filtration unit is removable and disposable.
  • the prefiltration tank can also be removable.
  • the prefiltration tank is removable and disposable.
  • the device can also be used for automatic plate preparation
  • the microorganisms can for example be collected directly on the filtration means of the collection tank by a robotic tool to be deposited on a MALDI-TOF plate or used for the preparation of a concentrated and calibrated suspension of microorganisms.
  • the microorganisms can be arranged in a liquid suspension which will be centrifuged in order to be able to recover a pellet of microorganisms. This pellet of microorganisms will then be deposited on a MALDI-TOF plate.
  • FIG. 1 is a device of the prior art
  • Figure 2 is a schematic sectional representation of a first embodiment of the device according to the invention comprising a filter unit on a fixed support inclined at 30 °.
  • Figure 3 is a schematic sectional representation of the filter unit, according to the first embodiment.
  • Figure 4 is a schematic perspective representation of the first embodiment of the device according to the invention.
  • Figure 5 is a schematic bottom view of the filter block, according to the first embodiment.
  • Figure 6 is a schematic top view of the filter unit, according to the first embodiment.
  • Figure 7 is a schematic perspective representation of the fixed support inclined at 30 °, according to the first embodiment.
  • Figure 8 is a photograph of the first embodiment of the device according to the invention.
  • Figure 9 is a schematic perspective representation of a second embodiment of the device comprising a slider support.
  • Figure 10 is a schematic sectional representation of the second embodiment of the device.
  • FIG. 11 is a schematic representation in section of Detail A of the second embodiment of the device, as represented in FIG.
  • FIG. 12 is a schematic sectional representation of Detail B of the second embodiment of the device, as shown in FIG.
  • Figure 13 is a schematic perspective view of the prefilter holder of the second embodiment of the device.
  • FIG. 14 is a diagrammatic representation in perspective and in section of the second embodiment of the device having the suction flows "A" and "B".
  • FIG. 15 is a diagrammatic representation in perspective and in section of the second embodiment of the device without the pre-filtration stage having the suction flow "B" in this use.
  • Figure 16 is a schematic sectional representation of the second embodiment of the device without the prefiltration stage, combined with a pipetting device.
  • FIG. 17 is a graph illustrating the pre-filtration rates obtained using the device according to the invention for the treatment of different samples of inoculated urine.
  • Figure 18 shows three graphs showing the detection in ESI-MS of specific peptides of the inoculated species in blood culture bottles compared to a negative control (sterile blood cultures). This figure 18 illustrates an experiment using the device according to the invention for the treatment of samples of inoculated blood cultures.
  • the collection tank is accessible without removing the prefiltration tank.
  • the device according to the invention can thus be placed in a pipetting robot, which will discharge the biological sample into the pre-filtration tank if pre-filtration is necessary, or in the collection tank if filtration is sufficient.
  • Such a device is therefore able to process biological samples of different kinds, such as urine or blood, without having to manipulate the prefiltration reservoir.
  • the suction zone of the prefiltration tank is in fluid communication with the collection area of the collection tank.
  • the device 100 is composed of a fixed support 1 inclined at 30 ° on which is installed a filtering unit 2 that can be removable.
  • the filtration unit 2 comprises a filtration means also called prefilter or a stack of prefilters 3 contained in a pre-filtration tank 4 and which clarifies the solutions to be filtered without retaining the microorganisms.
  • the filtration unit also comprises a collection tank 5 with a filtration means, for example a membrane 6 disposed in the bottom of the tank.
  • the angle of 30 ° between the plane along which the filtering means of the collection tank extends and the plane of the base 1 of the fixed support 1 is obtained by an inclination of the fixed support 1 and / or the block filtration 2 and / or the membrane 6.
  • the collection reservoir 5 has at least one wall of which at least a portion is inclined 1 January.
  • the collection tank 5 is closed by a sealing means.
  • This sealing means is for example constituted by a lidding film 50, as shown in FIG. 2.
  • This lidding film makes it possible to maintain a low pressure state downstream of the prefilter (s) during the operation. filtration of complex media such as urine.
  • the lidding film 50 may be a self-adhesive film, in particular of the oriented bi-axial polypropylene (BOPP) type, polyethylene terephthalate (PET), polyester (PE), aluminum / PE type.
  • BOPP oriented bi-axial polypropylene
  • PET polyethylene terephthalate
  • PET polyester
  • PE aluminum / PE type.
  • Such a sticker film can be taken off easily by an operator or by means of an automaton.
  • the film can be welded to the filtration unit 2 by any appropriate means (ultrasonic welding, heat sealing, etc.). Such a film is then drilled for a suitable tool, which can cooperate with the toolholder of an automaton.
  • a suitable tool is a pipette robot tool, such as a pipette door, a swab holder, a gripping tool such as a clamp or directly through the tip of a pipetting channel integrated in the robot.
  • the device and / or the filtration unit and / or the prefiltration tank may be disposable. Even more advantageously, the filtration unit is removable. Even more advantageously, the filtration unit is removable and disposable.
  • the prefiltration tank can also be removable.
  • the prefiltration tank is removable and disposable.
  • the closure means may be constituted by a piece of plastic lid type having a suitable opening mechanism, to ensure the necessary seal when positioned on the collection tank 5, for generate the low pressure state while allowing when it is relieved to be able to access the collection tank.
  • the device is connected to a vacuum suction system (for example a pump), not shown, and a bin that collects the filtered liquids.
  • a vacuum suction system for example a pump
  • the suction is made through the suction ports of the prefilter 7 and the membrane 8 located on the fixed support 1.
  • the seal between the filtration unit 2 and the fixed support 1 can be obtained by any appropriate means.
  • the filtration unit 2 is screwed onto the fixed support 1 and a seal, not shown, is placed between the filtration unit 2 and the fixed support 1
  • a valve allows to manage the protocol by aspirating either at the prefilter 3, or at the membrane 6 (or in continuous suction downstream of the membrane and alternating suction downstream of the prefilter).
  • the valve can be integrated into the vacuum suction system or be an integral part of the filtration device.
  • the filtration unit 2 can be removable.
  • the suction orifice of the prefilter 7 is in fluid communication with the suction zone of the prefiltration tank 4 via an orifice 71 on the filtration unit 2 when it is disposed on the fixed support 1.
  • the suction port 8 of the membrane communicates with the open portion 81 of the collection tank 5 it even in fluid communication with the suction zone of the collection tank 5.
  • the collection reservoir 5 has at least one wall of which at least one part 1 1 is inclined.
  • a valve not shown, makes it possible to manage the protocol by sucking, either downstream of the prefilter 3, either downstream of the membrane (either continuous suction downstream of the membrane and alternating suction downstream of the prefilter).
  • the liquid to be treated for example urine
  • the vacuum pump is turned on.
  • the valve is set to suck through the prefilter 3 via the suction port of the prefilter 7 and, if appropriate, the orifice 71.
  • the valve is set to suck at said membrane 6 via the suction orifice of the membrane 8 and, where appropriate, the opening portion 81 of the collection tank 5.
  • the microorganisms are collected on the membrane 6.
  • the porosity of this membrane is less than the diameter of the microorganisms to be collected.
  • the porosity is between 0.22 and 0.45 ⁇ .
  • the membrane can be washed to purify the microorganisms.
  • the wall of the collection tank 5 comprises at least one inclined part 1 1 or at least one ogival-shaped part.
  • This shape of the wall makes it possible, in cooperation with the inclination of the membrane 6, to favor the retention of the microorganisms in a preferential zone corresponding to the lower part of the filtration means 3. This part then forms an acute angle between the means of filtration 3 and the wall of the collection tank 5.
  • this retention of microorganisms in a preferential zone makes it possible to locate the microorganisms in a delimited and predictable zone, which favors a higher recovery efficiency by a PLC that does not have a vision system for locating a bacterial mat on the surface of the membrane.
  • the vacuum pump is extinguished in order to reduce the pressure downstream of the membrane 6 at atmospheric pressure.
  • the microorganisms then adhere to the membrane 6 and can be recovered / collected in various ways and in a nonlimiting manner:
  • the collection reservoir 5 advantageously has at least one wall, at least a portion of which is inclined to 1 1 so as to allow the pipette 10 presented vertically to collect microorganisms collected on the entire surface of the membrane 6, without hitting the wall of the collection tank 5;
  • the advantage of such a device is to be able to suck the liquid through the pipetting cone, through the porous portion of the swab, then to come into contact with the membrane, or any filtration means of the collection tank to "peel off" the microorganism concentrate by abrasion, this operation not being feasible with the conventional end of a pipetting cone; ⁇ By directly recovering membrane 6 and resuspended in a tube or direct lysis of microorganisms. The membrane 6 is then removably mounted in the collection tank 5;
  • the various recovery / collection methods may be adapted depending on the microorganisms sought or the type of sample. Indeed, some microorganism concentrate has a very strong adhesion to the membrane. The collection of microorganisms is then impossible by fast ejection of a liquid, the jet of liquid is not powerful enough to take off the concentrate. Only an abrasion technique (using a swab or a pipetting cone wrapped by the porous part of a swab at its end) is then effective to detach the concentrate from the membrane.
  • FIG. 9 A second embodiment is illustrated in Figure 9.
  • the prefiltration tank must be removed in order to access the collection tank.
  • the prefiltration tank is for example stacked on the collection tank.
  • Such a device is therefore able to process biological samples of different kinds, such as urine or blood, while being compact.
  • the suction zone of the prefiltration tank is in fluid communication with the collection area of the collection tank.
  • the device is composed of a fixed support 20 on which is installed a filter unit 22 that can be removable.
  • the filtration unit 22 is held on the support 20 by means of two sliders 23.
  • the device is connected to a vacuum suction system (for example a pump), not shown, and a bin that collects filtered liquids. Suction is through the suction ports of the prefilter 24 and the suction port of the membrane 25 located on the fixed support 20.
  • the fixed support 20 thus comprises a plurality of suction orifices forming two circuits. aspiration marked by arrows "A" and "B".
  • the two suction circuits thus make it possible to suck downstream of the membrane and / or downstream of the prefilter independently, via the suction zones of the collection and pre-filtration tanks.
  • the device can be held on the support without the use of slides.
  • the seal between the filtration unit 22 and the fixed support 20 can be obtained by any means.
  • the filtration unit 22 is held on the fixed support 20 and two O-rings, not shown, are placed between the filtration unit 22 and the fixed support 20 to seal the suction circuits "suction A" and "suction B".
  • the filtration unit 22 comprises a filter means, also called prefilter or a stack of prefilters 26, contained in a pre-filtration tank 28 and which clarifies the solutions to be filtered without retaining the microorganisms.
  • the filtration unit 22 also comprises a collection tank 30, a filtration means, for example a membrane 32, disposed in the bottom of the collection tank 30.
  • the membrane 32 is inclined at an angle of 30 ° with respect to the plane formed by the base 200 of the fixed support 20, that is 60 ° relative to the vertical.
  • the collection reservoir 30 has at least one wall of which at least one portion 34 is inclined or ogival-shaped.
  • the filter unit 22 can be removable, the suction port of the prefilter 24 then cooperates with a hole 24-i on the filter unit 22. Similarly, the suction port of the membrane 25 cooperates with the part opening of the collection tank 25i.
  • a valve not shown (integrated or not in the device), manages the protocol by sucking either downstream of the prefilter 26, or downstream of the membrane 32 (or continuous suction downstream of the membrane 32 and alternately aspirated downstream of prefilter 26.
  • the collection reservoir 30 can be made in two assembled parts 36 and 38.
  • the upper portion 36 and the lower portion 38 cooperate to maintain the membrane 32 in place. position, for example by means of two lugs 40.
  • the two parts 36 and 38 are welded to maintain the membrane.
  • prefiltration tank 28 can be made in two assembled parts, an upper part 42 and a lower part 44 which serves as a support for pre-filter 26.
  • the upper part 42 and the pre-filter support 44 cooperate to maintain the prefilter 26 in position.
  • the upper portion 42 comprises a means 33 engageable with a pipette tool of a pipetting robot.
  • the means 33 may also take a suitable form (for example one or more holes or pin (s)) to be handled automatically by a mechanical element (such as a clamp), a gripping tool for pipetting robot, a pipette door, a swab holder, or directly by the tip of a pipetting channel integrated in the robot.
  • this means 33 may comprise a cylindrical part in which the pipette-holder tool can be inserted and maintained in such a way as to lift the prefiltration reservoir 28 and thus free access to the membrane 32.
  • this cylindrical portion is held by a set of ribs arranged radially on the cylindrical portion so as to define at least one means of access access to the prefilter or stack of prefilters 26.
  • This access means allowing an apparatus such as a pipetting robot to present a tool vertically to the prefilter or the prefilter stack to dispense a liquid therefrom ( eg the sample to be treated) without handling or hitting the upper part 42.
  • the pre-filter support 44 may have projections 46 extending radially with respect to the suction orifice 45 of the pre-filter support 44.
  • the projections 46 are arranged on the face facing the prefilter, to maintain the pre-filter in position while facilitating the flow of the filtrate.
  • the protrusions 46 extend radially with respect to the suction orifice 45 and in one or more concentric circles concentric with the suction orifice 45.
  • the prefilter support 44 makes it possible at the same time to support the prefilter or the stack of prefilters 26 and ensure the sealing of the collection tank during the evacuation of the reservoir, thus allowing the effective passage of the sample through the prefilter or the stack of prefilters 26.
  • a urine sample filtration protocol using the second embodiment of the device comprises the following steps
  • 1 st step Dump urine on the pre-filter 26.
  • urine can be discharged by a pipettor robot stand from the vertical pre-filter 26 through the access means the prefilter 42.
  • the urine can be spilled, manually or automatically, directly on the prefilter 26 in the case where the upper portion 42 is not present.
  • 3rd step Enable suction "B” through the suction ports 25 and 25i.
  • the microorganisms remain on the membrane 32 while the "waste” is sucked into the trash.
  • 5 th step Optionally perform one or more washing steps of the membrane and the microorganisms distributing pipetted (manual or automated) of volumes of buffer.
  • the microorganisms are then concentrated by the force of gravity and the action of the suction in the lower part of the slope formed by the membrane 32 and the wall of the collection tank 30, the latter advantageously comprising an inclined shape 34 or warhead.
  • the microorganisms are then concentrated in a defined zone, corresponding to the preferential collection zone, to allow the recovery of microorganisms by an automatic pipetting robot in a reduced volume of liquid.
  • the step of recovery / collection of microorganisms on the membrane 32 may be performed by the same means as those stated for the first embodiment of the device according to the invention.
  • a pre-lysed blood sample filtration protocol using the second embodiment of the device without prefiltration reservoir 28 comprises the following steps
  • the microorganisms remain on the membrane 32 while the "waste" is sucked into the trash.
  • 3rd step If necessary carrying out one or more washing steps of the membrane and the microorganisms distributing pipetted (manual or automated) buffer volumes.
  • the recovery of microorganisms can be done by resuspension with the pipette 48 with a liquid (rapid ejection of the liquid, for example a neutral buffer, buffer with detergents or solvent).
  • the collection reservoir 30 may have at least one wall, at least a portion of which is inclined 34 so as to allow a vertical pipette 48 to collect microorganisms collected over the entire surface of the membrane 32 without striking the reservoir wall 30.
  • the device according to the invention may also be used with a swab for the collection of concentrated microorganisms and retained on the filtering means of the collection tank. for example a membrane.
  • the collection by swab can be performed either manually or automatically by adapting the gripping tool of a robotic robot.
  • the device according to the invention also functions with different types of filters used in the prefiltration tank or collection tank, alone or stacked, and different membranes alone or stacked.
  • the prefiltration tank is not useful.
  • the samples are directly deposited above the filtering means of the collection tank, for example on a filtration membrane, more particularly on a membrane of 0.2 ⁇ of porosity.
  • the prefiltration tank can be removed by a pipette tool or swab holder for robot pipettor.
  • filtering materials that can be used as filtering means are given by way of example in Table 1.
  • the size of the pores is adapted according to the size of the debris. filter.
  • the pore size of the material used as a filter medium can be up to 1 mm to filter large debris.
  • the filtration means of the prefiltration tank also called prefilters or stacks of prefilters used in the device according to the invention are also given below.
  • the materials used as a means of filtering the reservoir of Pre-filtration can be used as a means of filtering the collection tank, alone or stacked.
  • the device according to the invention also called dual-filtration device and as described above is here applied to the treatment of inoculated urine.
  • Comparative Table 2 for each filtering means of the prefiltration tank, 9 ml of a set of mixed urine samples consisting of 10 pathological urinary tubes is introduced onto the filtering means in the prefiltration tank in which is evacuated gently by means of a three-way valve.
  • the three-way valve is slowly switched to the Filter position to pass the urine through the filtering means of the collection tank, here a 0.45 ⁇ PES membrane.
  • the valve is returned to the closed position.
  • the bacterial pellet is washed on the membrane with 1 ml of 50 mM carbonate buffer pH8 (open filter valve) and is then recovered with 400 ⁇ l of carbonate buffer (vacuum stopped and device put back to atmospheric pressure); the recovered volume varies from 300 to 400 ⁇ .
  • the volume collected was divided into two parts, part of which was used to carry out a protein assay after lysis (P2 lysis protocol).
  • the polymicrobial urines contained mainly:
  • Comparative Table 2 summarizes the observations made during the tests as well as the results of counting the number of CFUs by counting on bioMérieux chromlD® CPS agar plates and the protein assay results.
  • the stacks of prefilters that can be used as filtration means of the prefiltration tank are:
  • the membranes that can be used, in particular as filtering means for the collection tank are:
  • Polyethersulfone PES
  • Nylon Polyamide
  • Polytetrafluoroethylen PTFE
  • Polycarbonate Polyester
  • Cellulose Regenerated Cellulose, Cellulose Acetate, Cellulose Nitrate, Mixed Cellulose Ester
  • Type Anopore membranes (Anodisc) made of aluminum oxide with a porosity of 0.02 ⁇ (for exosome purification type applications)
  • Filtration membranes may be low silica materials, polymers, acetate or oxide of alumina by way of example.
  • the porosity of the filtration means used in the device according to the invention will be easily adapted by those skilled in the art according to the constituents of interest sought in the biological sample.
  • the swabs that can be used in combination with the use of a pipetting cone are:
  • the porous portion of the swab is dissociated from the handle to come wrap the opening portion, usually pipetting the liquid, a pipetting cone.
  • the collection tank filtration means extending in a second plane can be inclined at an angle other than 30 °, that is between 10 and 60 ° (which corresponds to an angle between 30 to 80 ° relative to the vertical ) with respect to the plane formed by the base of the fixed support. This while allowing the concentration of samples and their collection by a collection means such as a pipette or a swab.
  • the device may be provided with a third reservoir comprising a third filtering means.
  • a third reservoir comprising a third filtering means.
  • This is to achieve a new filtration stage for desired compounds whose size is between 0.02 and 0.2 ⁇ such as micro-vesicles or exosomes.
  • the device and corresponding method can be used to collect microorganisms automatically from urine and blood culture samples as well as to extract small biological elements such as exosomes or microvesicles.
  • the device can thus be used in the field of oncology by allowing for example to concentrate the exosomes (90 nm in diameter), known as cancer marker.
  • the added value is to propose a fast, generic and simple process for extracting exosomes or microvesicles from saliva, serum or plasma samples.
  • the filtration means of the collection tank is a membrane of porosity 0.02 ⁇ .
  • another embodiment comprises a third reservoir containing a third filtering means downstream of the filtering means of the collection reservoir comprising a porosity membrane of 0.02 ⁇ .
  • Example 1 Inoculated urine experiments: Results on the three microorganisms in automatic mode
  • Microorganisms EC Erscherichia coli
  • SE Staphilococcus epidermidis
  • CA Candida albicans
  • the yield is defined as the ratio of the amount of microorganisms recovered on the membrane at the end of the protocol on the amount of microorganism introduced into solution on the prefilter.
  • Example 2 Inoculated healthy urine experiments: on a pipettor automaton (4 parallel devices). Filtration efficiency on microorganisms EC (Escherichia coli) and CA (Candida albicans) for different configurations (volume and distance to the vertical of the filter) resuspension.
  • EC Erichia coli
  • CA Candida albicans
  • Table 4 showing the recovery performance of EC and CA microorganisms on multiple replicates by varying the automated resuspension method.
  • the filtration means of the prefiltration tank consists of a stack of pre-filters (order from the bottom upwards, the prefilter placed at the top being the first to receive the liquid): nylon 30 um / 2x VFE 5um / filtrona 2 mm or 4 mm (ie 2x2 mm) and filter means of the collection tank a membrane PES 0.45 um (Pall).
  • the sequence of pre-filtration / filtration steps for 6 to 10 mL of urine is carried out at most in 3 minutes.
  • the concentrate was collected by resuspension in 400 ⁇ l of carbonate buffer and then subjected to the lysis-digestion protocol (manual version) to be injected into LC-ESI MS with a method of acquisition developed in a non-optimized way to search for peptides found in E.Coli.
  • the MRM method targets 60 peptides, 7 of which are specific to the E. coli species and 9 common to the Enterobacteriaceae family, the remaining 44 must be generic to the Gram-.
  • Table 5 shows that after the double filtration treatment of urine of very different compositions (amount of white blood cells, red cells, epithelial cells), the specific peptides of E. coli are generally well detected for the urine containing the urine.
  • E.coli species from the identification results on a bioMérieux VITEK®2 automated device provided.
  • the detection of peptides common to enterobacteria is also correct since the species E.coli belongs to this family.
  • Urines u10 and u13 containing bacteria of the enterobacteria family do indeed have peptides specific for this family without the presence of peptides specific for E. coli.
  • U9 urine identified C.Koseri results in the detection of peptides specific for E. coli and peptides common to the Enterobacteriaceae family. This presence of an E. coli population together with C. Koseri colonies is also observed on bioMérieux ChromlD® CPS culture medium.
  • Table 6 gives the good identification scores of the E. coli species in a first batch of pathological urines.
  • the bacterial pellet was deposited on a MALDI-TOF target before addition of the ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix (HCCA matrix) or with the addition of formic acid (AF), drying then addition of the HCCA matrix.
  • the MALDI-TOF spectra were obtained with a Shimadzu spectrometer controlled by Launchpad (bioMérieux VITEK® MS device). The results of identifications given according to Table 8 were obtained by interrogation of the database "bacteria”.
  • the lysis-filtration protocol briefly consists of selective lysis of the blood cells by the action of a buffer containing a surfactant for a short time.
  • the advantage provided by the device described above is its geometry, here an inclination of the filtration means of the collection tank of 30 °, which allows the efficient harvesting of microorganisms by means of a liquid solution leading finally to a bacterial suspension.
  • the Lyse-filtration protocol is as follows:
  • Filtration is carried out on a 0.2 ⁇ PES filtration membrane used as a means of filtering the collection tank on the device according to the invention.
  • test portion is 0.8 mL of blood culture which are treated with 0.4 mL of 0.3 M CAPS buffer / 0.45% Brij for 2 minutes followed by filtration for 2 minutes.
  • Figure 18 shows the detection results via the MRM methods adapted to the microorganism inoculated in the bottles of blood cultures.
  • the three graphs show for microorganisms 3 good detection of specific peptides in the positive samples on day 0 post cultivation (EC1 J 0, EC2 J 0, CA1 J 0, CA2 J 0, CA3 J 0, SE1 J 0 SE2 J 0 , SE 3 J 0 ).
  • a minor number of peptides (2-4) are detected in negative controls (Cneg). The significant difference between the number of peptides detected and the cumulative area between the positive samples and the negative controls indicates that the protocol performed on the device described makes it possible to harvest the bacteria contained in the blood cultures.
  • the filtration means of the prefiltration tank consists of a stack of prefilters.
  • the prefilters used being from bottom to top: 1 x VFE 5 ⁇ m / Filtrona 2 mm.
  • the filtration means of the collection tank where the bacteria will be recovered is a membrane: PES 0.45 ⁇ m (Bread
  • the volume of filtered urine is between 3 and 6 mL for a filtration time of a few minutes.
  • Concentrate collection is done with 1000 ⁇ of water (Versol).
  • Short culture manipulation of 5:00 is done by depositing 100 ⁇ of urine and raking. After 5:00 of growth at 37 ° C, the biofilm is observed. This biofilm is then collected with a 1 ⁇ dose and placed on a MALDI-TOF target.
  • Table 1 1 Codification of protocols according to the treatment carried out and the MALDI-TOF target deposition mode

Abstract

Dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan, un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comportant lui-même un moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe.

Description

DISPOSITIF POUR LA PREPARATION D'ECHANTILLON BIOLOGIQUE
Le domaine de la présente invention est celui de l'analyse microbiologique. Plus particulièrement, la présente invention concerne un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique en vue d'un diagnostic microbiologique. La filtration sous vide est utilisée de manière classique dans les laboratoires. Elle est utilisée de deux manières :
• soit pour clarifier un échantillon. Le filtrat est alors gardé et le filtre jeté,
• soit pour collecter et concentrer des particules ou microorganismes d'intérêt présents dans un échantillon liquide. Dans ce second cas, le filtrat est jeté, le concentrât (également appelé retentât) et/ou le filtre sont conservés.
Un dispositif connu de l'état de l'art est l'entonnoir Buchner. Un tel dispositif est représenté sur la figure 1 . Il comprend un entonnoir dans lequel est disposée transversalement une plaque perforée. L'entonnoir est emmanché de manière étanche dans le goulot d'une fiole à vide à l'aide d'un bouchon. La fiole à vide est connectée à une source d'aspiration. Sur la plaque perforée est disposé un papier filtre humidifié de sorte que des particules présentes dans un liquide versé sur la partie supérieure du papier puissent être retenues lors de l'aspiration. Le liquide filtré, ou filtrat, est collecté dans la fiole.
Un tel dispositif présente plusieurs inconvénients. En effet, le filtre peut se boucher rapidement si le liquide contient trop de particules ou microorganismes ce qui peut empêcher la filtration de la totalité du volume. D'autre part, la grande surface de filtration, nécessaire pour pouvoir filtrer une quantité suffisante d'échantillon, peut nécessiter d'employer un volume important de liquide pour la remise en suspension complète des micro-organismes retenus sur le filtre, ce qui ne permet pas d'avoir un rapport de concentration optimal. Après avoir filtré l'échantillon grâce à ce dispositif, la collecte de particules d'intérêt ou microorganismes retenus sur le papier filtre est difficile et nécessite d'utiliser un écouvillon de manière manuelle. La récupération par écouvillon de manière automatique n'est pas évidente à réaliser de manière reproductible. De plus ce type de dispositif présente un deuxième rendement de relargage défavorable si le concentrât, notamment bactérien, doit être délivré sous forme liquide pour les besoins du protocole d'analyse. Enfin, lors des étapes de lavages du filtre ou de reprise des microorganismes avec une pipette, le liquide dispensé s'étale sur toute la surface du filtre, il est donc difficile de l'aspirer de nouveau. De ce fait, la séquence d'un protocole de filtration à l'aide de ce dispositif ne peut être automatisée facilement. Un autre dispositif de l'art antérieur, décrit dans la demande de brevet US 2007/0298451 A1 , comprend un bloc de filtration inférieur et un bloc de filtration supérieur. Le bloc de filtration supérieur comprend une paroi cylindrique d'un premier diamètre et une paroi cylindrique d'un diamètre inférieur reliée par une partie transversale. Sur la partie transversale est disposée une plaque perforée ainsi qu'une membrane de filtration. Le bloc de filtration inférieur comprend une paroi cylindrique d'un premier diamètre et une paroi cylindrique d'un diamètre inférieur reliée par une partie transversale. Sur la partie transversale est disposée une plaque perforée ainsi qu'une membrane de filtration. Une paroi cylindrique d'un diamètre encore inférieur est disposée en aval de la plaque perforée et reliée au bloc de filtration inférieur par une partie transversale, de manière à connecter une source d'aspiration au dispositif.
Le bloc de filtration supérieur est emmanché sur le bloc de filtration inférieur. La membrane du bloc de filtration supérieur a une porosité supérieure à la membrane du bloc de filtration inférieur. De ce fait, en déversant un échantillon liquide sur la membrane du bloc de filtration supérieur et en activant la source d'aspiration, celui-ci est filtré une première puis une seconde fois.
Bien que ce dispositif puisse présenter un meilleur rendement de filtration, notamment en effectuant des filtrations progressives, le liquide dispensé s'étale également sur toute la surface des deux membranes, rendant la collecte difficile. De plus, un bouchage, même partiel, d'une ou des membrane(s) peut entraîner une perte de charge lors de l'aspiration et ralentir voire empêcher la filtration.
Le but de l'invention est donc de remédier aux inconvénients de l'art antérieur précité.
Un premier objectif de la présente invention est ainsi de fournir un dispositif de traitement d'échantillon biologique permettant de collecter les microorganismes contenus dans l'échantillon en éliminant des constituants de la matrice de ce dernier. De tels constituants pouvant être des sels dissouts, protéines, cristaux, mucus, cellules humaines, ou autres.
Un deuxième objectif de l'invention est de fournir un dispositif de traitement d'échantillon biologique permettant la purification rapide d'un contenu microbien pour analyse ultérieure ainsi que le lavage du filtre ou de la membrane de collecte.
Un troisième objectif de l'invention est de fournir un dispositif de traitement d'échantillon biologique permettant à la fois de concentrer des microorganismes à la surface du filtre ou de la membrane de collecte et de remettre en suspension les microorganismes ainsi concentrés, dans un volume de tampon limité. Un quatrième objectif de l'invention est de fournir un dispositif de traitement d'échantillon biologique de sorte que les étapes du protocole de traitement utilisant le dispositif puissent être réalisées de façon totalement automatisées par un robot de pipetage approprié (e.g. Starlet d'Hamilton Robotics), également appelé robot pipeteur.
Ces objectifs parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne en premier lieu un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant :
• un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan,
• un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comprenant lui-même une paroi et un moyen de filtration, le moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe.
Alternativement, la présente invention concerne un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant :
• un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan,
• un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comportant lui-même un moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe.
Par échantillon biologique, on entend un échantillon liquide, susceptible de contenir un ou plusieurs constituants d'intérêt, tel que des urines, des hémocultures, du crachat, du liquide céphalo rachidien,.... Ces constituants d'intérêt peuvent être des microorganismes tel que des levures, des bactéries, ou encore des micro-vésicules ou des exosomes.
Alternativement, l'invention a pour objet un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant :
· un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan,
• un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comportant lui-même un moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe, le bloc de filtration comporte en outre un réservoir de préfiltration pouvant être amovible, ledit réservoir de préfiltration comprenant un moyen de filtration divisant le réservoir de préfiltration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration étant en communication fluidique avec la zone de collecte du réservoir de collecte.
Alternativement, l'invention a pour objet un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant :
• un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan,
· un bloc de filtration pouvant être amovible,
ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comprenant lui-même une paroi et un moyen de filtration, le moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe, le bloc de filtration comporte en outre un réservoir de préfiltration pouvant être amovible, ledit réservoir de préfiltration comprenant un moyen de filtration divisant le réservoir de préfiltration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration étant en communication fluidique avec la zone de collecte du réservoir de collecte.
Alternativement, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration est adaptée pour être connectée à un second moyen d'aspiration.
De manière avantageuse, la paroi du réservoir de collecte dans la zone de collecte est en partie inclinée ou en forme d'ogive.
De manière avantageuse, la paroi de la zone de collecte du réservoir de collecte est en partie inclinée ou en forme d'ogive. De manière avantageuse, la paroi du réservoir de collecte dans la zone de collecte est rigide. De manière avantageuse, le moyen de filtration du réservoir de collecte comprend au moins une membrane de porosité comprise entre 0,02 et 1 ,5μη"ΐ, préférentiellement entre 0,02 et Ι μηη, plus préférentiellement entre 0,02 et Ο,δμηη, encore plus préférentiellement entre 0,02 μηη et 0,45 μηη
De manière avantageuse, le moyen de filtration du réservoir de collecte comprend au moins une membrane de porosité comprise entre 0,02 μηη et 0,45 μηη.
De manière avantageuse, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprend au moins un filtre de porosité comprise entre 5 μηη et 1000 μηη, préférentiellement entre 5 μηη et 100 μπι.
Alternativement, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprend un empilement de filtres.
Alternativement, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprend un empilement de filtres de porosité croissante de la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration vers la zone de collecte du réservoir de préfiltration. Dans ce but, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprend ou est constitué d'un empilement de préfiltres de porosité croissante dans l'ordre allant du bas vers le haut, le préfiltre placé en haut étant le premier à recevoir le liquide.
De manière avantageuse, le second plan du moyen de filtration du réservoir de collecte est incliné par rapport au plan de la base du support fixe d'un angle compris entre 10° et 60°, de préférence compris entre 20° et 50°, de préférence compris entre 25° et 45°, plus préférentiellement égal à 30°.
Alternativement, le réservoir de collecte comprend une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de collecte
Alternativement, le réservoir de préfiltration comprend une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de préfiltration
Alternativement, le réservoir de préfiltration comprend un moyen susceptible de coopérer avec un outil pour robot pipeteur tel qu'un porte pipette ou un porte écouvillon. Alternativement le bloc de filtration comporte en outre un troisième réservoir de filtration pouvant être amovible, ledit troisième réservoir de filtration comprenant un moyen de filtration divisant le troisième réservoir de filtration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone de collecte du troisième réservoir de filtration étant en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de collecte.
De manière avantageuse, le moyen d'aspiration est un moyen d'aspiration / refoulement.
Par moyen d'aspiration/refoulement, on entend tout moyen susceptible de faire franchir un liquide de la zone de collecte du réservoir de collecte vers la zone d'aspiration du réservoir de collecte par aspiration et éventuellement de la zone d'aspiration du réservoir de collecte vers la zone de collecte du réservoir de collecte par refoulement. L'intérêt du refoulement est notamment de pouvoir remettre en suspension dans un liquide une partie du concentrât de constituants d'intérêts (également appelé retentât) issu de l'échantillon biologique en la décollant du moyen de filtration. Une succession d'étapes d'aspiration et de refoulement permet également d'améliorer la concentration du concentrât dans la zone de collecte, plus particulièrement dans une zone préférentielle. Cette opération d'aspiration / refoulement peut donc être réalisée à plusieurs reprises. Cette opération d'aspiration / refoulement peut être réalisé en ajoutant un tampon, par exemple un tampon carbonate ou de l'eau, notamment pour effectuer un lavage.
De manière avantageuse, le second moyen d'aspiration pouvant être connecté à la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration est un moyen d'aspiration / refoulement. De manière avantageuse, le moyen d'aspiration est remplacé par un moyen de mise en surpression du réservoir de collecte et/ou du réservoir de préfiltration et/ou du réservoir de filtration. Le moyen de mise en surpression est pour cela adapté pour être connecté à la zone de collecte du réservoir de collecte et/ou du réservoir de préfiltration et/ou du réservoir de filtration. De manière avantageuse, le second moyen d'aspiration est remplacé par un second moyen de mise en surpression du réservoir de collecte et/ou du réservoir de préfiltration. Le second moyen de mise en surpression est pour cela adapté pour être connecté à la zone de collecte du réservoir de collecte et/ou du réservoir de préfiltration.
De manière avantageuse, le réservoir de collecte et/ou le réservoir de préfiltration et/ou le réservoir de filtration est obturé par un moyen d'obturation. De manière encore plus avantageuse, ledit moyen d'obturation est perçable par un outil pour robot pipeteur, tel qu'une pipette, un écouvillon, un porte pipette, un porte écouvillon, un outil de préhension tel qu'une pince ou directement par l'embout d'un canal de pipetage intégré dans le robot.
De manière alternative, ledit moyen d'obturation est retirable par un outil pour robot pipeteur, par exemple un outil de préhension tel qu'une pince, un porte pipette ou un porte écouvillon.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un dispositif selon l'un quelconque des différents modes de réalisations présentés pour le traitement d'un échantillon biologique. L'invention a également pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'un quelconque des différents modes de réalisations présentés comprenant les étapes suivantes:
• déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte, à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte
• collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
Alternativement, l'invention a pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'invention comprenant les étapes suivantes:
• déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration,
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte,
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte,
· collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte.
Alternativement, l'invention a pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'invention comprenant les étapes suivantes: .
• déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration, • aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du second moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration,
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte,
• collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte.
Alternativement, l'invention a pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'invention tel que décrit ci-dessus, comprenant en outre une étape consistant à :
• refouler l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration/refoulement connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte,
Alternativement, l'invention a pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'invention tel que décrit ci-dessus, dont l'étape consistant à :
• collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte, et remplacée par une étape consistant à :
• collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte dans une zone préférentielle de collecte.
Le dispositif inventé permet un accès aisé au moyen de filtration du réservoir de collecte, par exemple à la membrane, afin de pouvoir exécuter des lavages ou collecter les microorganismes, par exemple par remise en suspension à la pipette ou par écouvillonnage.
L'inclinaison du second plan dans lequel s'étend le moyen de filtration du réservoir de collecte par rapport au plan de la base du support fixe peut être obtenue par la géométrie du support fixe sur lequel est disposé le bloc de filtration et/ou par inclinaison du moyen de filtration. A titre d'exemple, le support fixe peut comprendre un plan incliné par rapport à sa base, celle-ci étant à l'horizontale, le bloc de filtration étant disposé sur ce plan incliné et le moyen de filtration du réservoir de collecte s'étendant selon un plan parallèle à ce plan incliné. Grâce à cette inclinaison, lorsque le liquide est dispensé, en provenance du moyen de filtration du réservoir de préfiltration et/ou directement sur le moyen de filtration et/ou par aspiration/refoulement, il coule naturellement sur le moyen de filtration, où il peut éventuellement être de nouveau aspiré, dans une zone préférentielle de collecte.
L'inclinaison du second plan dans lequel s'étend le moyen de filtration du réservoir de collecte par rapport au plan de la base du support fixe est fixe durant toute l'étape de filtration. La forme de la paroi du réservoir de collecte permet, en coopération avec l'inclinaison du second plan dans lequel s'étend le moyen de filtration, de favoriser la rétention de l'échantillon biologique dans une zone préférentielle de collecte lorsque celui-ci est dispensé dans le réservoir de collecte. Cette zone préférentielle correspondant à la partie basse du moyen de filtration. Cette zone préférentielle contient à la suite d'une étape de filtration, la majorité du concentrât de microorganismes ou de constituants d'intérêt présents dans l'échantillon biologique. La zone d'aspiration est donc définie par le second plan du moyen de filtration est la paroi du réservoir de collecte de telle sorte que le moyen de filtration est la paroi du réservoir de collecte sont en contact dans la zone préférentielle. L'intérêt de ce contact est d'éviter la formation de volumes morts où une partie liquide de l'échantillon biologique pourrait stagner après l'étape de filtration. Un autre intérêt de ce contact et de cette zone préférentielle est de favoriser la rétention de l'échantillon biologique dans une zone délimitée et prédictible, ce qui favorise un rendement plus élevé de récupération par un automate robot pipeteur ne disposant pas de système de vision, notamment de système de vision destiné à localiser un tapis bactérien sur la surface du moyen de filtration. La géométrie de cette zone préférentielle peut être modifiée selon l'angle formé entre le moyen de filtration et la paroi du réservoir de collecte. Cet angle peut être fermé (aigu) pour créer une zone préférentielle localisée mais profonde ou ouvert (obtus) pour limiter la profondeur de la zone préférentielle tout en agrandissant la surface recouverte par ladite zone pour un même volume de liquide contenu dans cette zone. L'angle formé entre le moyen de filtration et la paroi du réservoir de collecte dans la zone préférentielle est ainsi compris entre 10 et 170 degrés, préférentiellement entre 30 et 150 degrés, préférentiellement entre 50 et 130 degrés, préférentiellement entre 70 et 120 degrés, plus préférentiellement entre 80 et 100 degrés, plus préférentiellement entre 50 et 70 degrés. Encore plus préférentiellement l'angle est de 90 degrés. Encore plus préférentiellement l'angle est de 60 degrés.
Préférentiellement, le moyen de filtration est la paroi du réservoir de collecte sont en contact sur toute la surface du moyen de filtration. L'intérêt de ce contact sur toute la surface du moyen de filtration est de limiter l'adhérence sur la paroi de débris éventuels contenus dans l'échantillon biologique et de simplifier le processus la filtration de l'échantillon biologique, celui-ci pouvant être distribué n'importe où dans la zone de collecte du réservoir de collecte, notamment sur la paroi où directement sur le moyen de filtration.
Au fur et à mesure de la délivrance des jets de tampon de collecte, les microorganismes se concentrent vers la partie basse du moyen de filtration formant par exemple un angle fermé avec la paroi du réservoir de collecte. Un concentrât bactérien peut par exemple être récupéré sans perte significative de volume (volume récupéré de 300 à 700 μΙ_), par rapport au volume de tampon de collecte dispensé (volume 400 à 1000 μΙ_), soit un facteur 10 à 20 par rapport au volume initial d'échantillon biologique. L'inclinaison du second plan du moyen de filtration par rapport au plan de la base du support fixe peut être comprise entre 10° et 60°, de préférence comprise entre 20° et 50°, de préférence comprise entre 25° et 45°, plus préférentiellement égale à 30°.
Le dispositif selon l'invention est facilement utilisable avec un pipeteur automatisé également appelé robot pipeteur. Dans ce but, la paroi du réservoir de collecte est adaptée pour pouvoir présenter verticalement un outil pour robot pipeteur, tel qu'une pipette ou un écouvillon, en aplomb de toute la surface du moyen de filtration du réservoir de collecte directement après ou pendant l'étape de filtration. L'intérêt est de ne pas avoir à déplacer le dispositif, le réservoir de collecte et/ou le moyen de filtration pour collecter le concentrât de constituants d'intérêts. Un autre intérêt est de pouvoir collecter par abrasion ou décollement le concentrât de constituants d'intérêts, tel que des microorganismes, déposé sur tout ou partie du moyen de filtration après filtration, au moyen d'un écouvillon. Cette géométrie facilite également les opérations de pipetage et/ou d'écouvillonnage, manuelles et/ou automatiques, notamment directement après ou pendant l'étape de filtration. Ainsi, la forme de la paroi du réservoir de collecte est adaptée pour qu'un opérateur ou un robot pipeteur puisse accéder à toute la surface du moyen de filtration du réservoir de collecte, notamment à la verticale dudit moyen de filtration. Un robot pipeteur présente en effet une pipette se déplaçant en translation selon trois degrés de liberté et ne permettant pas de réaliser des mouvements complexes ni de présenter une pipette autrement qu'à la verticale.
Cet accès à toute la surface du moyen de filtration du réservoir de collecte permet ainsi de dispenser un liquide sur une zone du moyen de filtration du réservoir de collecte d'un jet puissant puis d'aspirer ce même liquide afin de pouvoir le re-dispenser puissamment sur une autre zone du moyen de filtration du réservoir de collecte. Une série d'une vingtaine de dispense/ré-aspirations peut ainsi être effectuée afin de concentrer puis récolter les constituants d'intérêts retenus sur toute la surface du moyen de filtration du réservoir de collecte. L'inclinaison du réservoir de collecte permet de plus au liquide de collecte de se localiser dans la zone préférentielle de collecte en limitant les pertes de volume qu'engendrerait un système de filtration horizontal.
De manière avantageuse, la paroi du réservoir de collecte peut présenter au moins une partie inclinée, ou en forme d'ogive, adaptée pour pouvoir présenter verticalement une pipette, en aplomb du concentrât de constituants d'intérêts, notamment de microorganismes, le concentrât étant majoritairement localisé dans la zone préférentielle. Cette géométrie facilite également les opérations de pipetage et/ou d'écouvillonnage, manuelles et/ou automatiques, notamment en évitant de venir heurter la paroi du réservoir de collecte. L'intérêt d'un tel dispositif est de pouvoir être utilisé, sur un même type de dispositif, pour différents types d'échantillons biologiques (urines, hémocultures,....) de volumes différents (10 mL à 1 ml_), en sélectionnant un protocole de traitement adapté à l'échantillon biologique considéré. Ainsi, pour les hémocultures, le protocole est une lyse sélective suivie d'une unique filtration sur un moyen de filtration, par exemple une membrane. Pour des urines cliniques, le protocole consiste en une préfiltration sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration, suivie d'une filtration sur le moyen de filtration du réservoir de collecte, par exemple sur une membrane. Les deux protocoles peuvent avantageusement être suivis d'une ou plusieurs étapes de lavage du concentrât bactérien, à l'aide de solutions de lavage adaptées. Par ailleurs, pour une approche d'Identification Typage Résistance Virulence (ITRV) de microorganismes, tel que des bactéries, par une technologie de spectrométrie de masse par Ionisation ElectroSpray (ESI), disposer des microorganismes en suspension liquide est plus pratique pour la suite du protocole (lyse suivie d'une extraction des protéines ou lyse suivie d'une digestion trypsique des protéines).
L'intérêt d'un tel dispositif est également de pouvoir être jetable. Les matériaux utilisés pour sa réalisation étant peu coûteux, le dispositif et/ou le bloc de filtration et/ou le réservoir de préfiltration peuvent être à usage unique pour le traitement d'un échantillon. De manière encore plus avantageuse, le bloc de filtration est amovible. De manière encore plus avantageuse, le bloc de filtration est amovible et à usage unique.
Le réservoir de préfiltration peut également être amovible. De manière avantageuse, le réservoir de préfiltration est amovible et à usage unique.
Le dispositif peut également être utilisé en vue de la préparation automatique de plaques
MALDI-TOF après extraction des microorganismes à partir des échantillons biologiques. Les microorganismes pouvant par exemple être collectés directement sur le moyen de filtration du réservoir de collecte par un outil robotisé pour être déposés sur une plaque MALDI-TOF ou servir à la préparation d'une suspension de microorganismes concentrée et calibrée. De la même manière, les microorganismes peuvent être disposés dans une suspension liquide qui sera centrifugée afin de pouvoir récupérer un culot de microorganismes. Ce culot de microorganismes sera alors déposé sur une plaque MALDI-TOF.
Les buts et avantages du dispositif selon la présente invention seront mieux compris à la lumière des exemples nullement limitatifs qui suivent, en référence au dessin, dans lequel :
La figure 1 est un dispositif de l'art antérieur
La figure 2 est une représentation schématique en coupe d'un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention comprenant un bloc de filtration sur un support fixe incliné à 30°.
La figure 3 est une représentation schématique en coupe du bloc de filtration, selon le premier mode de réalisation.
La figure 4 est une représentation schématique en perspective du premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention.
La figure 5 est une représentation schématique en vue de dessous du bloc de filtration, selon le premier mode de réalisation.
La figure 6 est une représentation schématique en vue de dessus du bloc de filtration, selon le premier mode de réalisation.
La figure 7 est une représentation schématique en perspective du support fixe incliné à 30°, selon le premier mode de réalisation.
La figure 8 est une photographie du premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention.
La figure 9 est une représentation schématique en perspective d'un second mode de réalisation du dispositif comprenant un support à coulisseau.
La figure 10 est une représentation schématique en coupe du second mode de réalisation du dispositif.
La figure 1 1 est une représentation schématique en coupe du Détail A du second mode de réalisation du dispositif, tel que représenté sur la figure 10.
La figure 12 est une représentation schématique en coupe du Détail B du second mode de réalisation du dispositif, tel que représenté sur la figure 10.
La figure 13 est une représentation schématique en perspective du support de préfiltre du second mode de réalisation du dispositif.
La figure 14 est une représentation schématique en perspective et en coupe du second mode de réalisation du dispositif présentant les flux d'aspiration « A » et « B ». La figure 15 est une représentation schématique en perspective et en coupe du second mode de réalisation du dispositif sans l'étage de préfiltration présentant le flux d'aspiration « B » dans cette utilisation.
La figure 16 est une représentation schématique en coupe du second mode de réalisation du dispositif sans l'étage de préfiltration, combiné à un dispositif de pipetage.
La figure 17 est un graphe illustrant les taux de préfiltration obtenus en utilisant le dispositif selon l'invention pour le traitement de différents échantillons d'urines inoculées.
La figure 18 comporte trois graphes montrant la détection en ESI-MS de peptides spécifiques de l'espèce inoculée dans des bouteilles d'hémoculture en comparaison avec un contrôle négatif (hémoculture stérile). Cette figure 18 illustre une expérience utilisant le dispositif selon l'invention pour le traitement d'échantillons d'hémocultures inoculées.
Selon un premier mode de réalisation, le réservoir de collecte est accessible sans avoir à retirer le réservoir de préfiltration. Le dispositif selon l'invention peut ainsi être placé dans un robot pipeteur, lequel déversera l'échantillon biologique dans le réservoir de préfiltration si une préfiltration est nécessaire, ou dans le réservoir de collecte si une filtration est suffisante. Un tel dispositif est donc apte à traiter des échantillons biologiques de différentes nature, tel que des urines ou du sang, sans avoir à manipuler le réservoir de préfiltration. Lorsque le réservoir de préfiltration n'est pas retiré du dispositif, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration est en communication fluidique avec la zone de collecte du réservoir de collecte.
En référence aux figures 2 et 3,1e dispositif 100 est composé d'un support fixe 1 inclinée à 30° sur lequel est installé un bloc de filtration 2 pouvant être amovible. Le bloc de filtration 2 comprend un moyen de filtration également appelé préfiltre ou un empilement de préfiltres 3 contenu dans un réservoir de préfiltration 4 et qui permet de clarifier les solutions à filtrer sans retenir les microorganismes. Le bloc de filtration comprend également un réservoir de collecte 5 avec un moyen de filtration, par exemple une membrane 6 disposée dans le fond du réservoir. Alternativement, l'angle de 30° entre le plan selon lequel s'étend le moyen de filtration du réservoir de collecte et le plan de la base 1 10 du support fixe 1 est obtenu par une inclinaison du support fixe 1 et/ou du bloc de filtration 2 et/ou de la membrane 6. Alternativement, le réservoir de collecte 5 présente au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée 1 1 . Le réservoir de collecte 5 est obturé par un moyen d'obturation. Ce moyen d'obturation est par exemple constitué par un film d'operculage 50, tel que représenté sur la figure 2. Ce film d'operculage permet de maintenir un état dépressionnaire en aval du ou des préfiltre(s) lors de l'opération de filtration de milieux complexes tels que l'urine. Le film d'operculage 50 peut être un film autocollant notamment de type polypropylène bi-axial orienté (BOPP), polytéréphtalate d'éthylène (PET), polyester (PE), aluminium/PE. Un tel film autocollant peut être décollé aisément par un opérateur ou par le biais d'un automate. Alternativement, le film peut être soudé sur le bloc de filtration 2, par tout moyen approprié (soudure ultrasons, thermoscellage, ...). Un tel film est alors percé pour un outil approprié, pouvant coopérer avec le porte-outil d'un automate. De manière avantageuse un outil approprié est un outil pour robot pipeteur, tel qu'un porte pipete, un porte écouvillon, un outil de préhension tel qu'une pince ou directement par l'embout d'un canal de pipetage intégré dans le robot.
De manière avantageuse, le dispositif et/ou le bloc de filtration et/ou le réservoir de préfiltration peuvent être à usage unique. De manière encore plus avantageuse, le bloc de filtration est amovible. De manière encore plus avantageuse, le bloc de filtration est amovible et à usage unique.
Le réservoir de préfiltration peut également être amovible. De manière avantageuse, le réservoir de préfiltration est amovible et à usage unique. Selon une alternative, le moyen d'obturation peut être constitué par une pièce de type couvercle en matière plastique comportant un mécanisme d'ouverture adéquat, permettant d'assurer l'étanchéité nécessaire lorsqu'il est positionné sur le réservoir de collecte 5, pour générer l'état dépressionnaire tout en permettant lorsqu'il est relevé de pouvoir accéder au réservoir de collecte.
En référence à la figure 4, le dispositif est relié à un système d'aspiration sous vide (par exemple une pompe), non représenté, et une poubelle qui collecte les liquides filtrés. L'aspiration se fait au travers des orifices d'aspiration du préfiltre 7 et de la membrane 8 situés sur le support fixe 1 .
· L'étanchéité entre le bloc de filtration 2 et le support fixe 1 peut être obtenue par tout moyen approprié. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration 2 est vissé sur le support fixe 1 et un joint, non représenté, est placé entre le bloc de filtration 2 et le support fixe 1
• Une vanne, non représentée, permet de gérer le protocole en aspirant soit au niveau du préfiltre 3, soit au niveau de la membrane 6 (soit en aspiration continue en aval de la membrane et en aspiration alternée en aval du préfiltre). La vanne peut être intégrée au système d'aspiration sous vide ou faire partie intégrante du dispositif de filtration. Tel que représenté sur les figures 5 et 7, le bloc de filtration 2 peut être amovible. Dans ce cas, l'orifice d'aspiration du préfiltre 7 est en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration 4 par l'intermédiaire d'un orifice 71 sur le bloc de filtration 2 lorsque celui-ci est disposé sur le support fixe 1. De même, lorsque le bloc de filtration 2 est disposé sur le support fixe 1 , l'orifice d'aspiration 8 de la membrane communique avec la partie débouchante 81 du réservoir de collecte 5 elle-même en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de collecte 5.
En référence à la figure 6, on constate que le réservoir de collecte 5 présente au moins une paroi dont au moins une partie 1 1 est inclinée.
Afin de réaliser une étape de préfiltration d'un échantillon utilisant le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention et en référence aux figures 4 et 5 , une vanne, non représentée, permet de gérer le protocole en aspirant, soit en aval du préfiltre 3, soit en aval de la membrane (soit en aspiration continue en aval de la membrane et en aspiration alternée en aval du préfiltre).
Le liquide à traiter, par exemple de l'urine, est pipeté dans le réservoir de préfiltration 4 au-dessus du préfiltre 3. La pompe à vide est mise en fonction. La vanne est réglée pour aspirer à travers le préfiltre 3 par l'intermédiaire de l'orifice d'aspiration du préfiltre 7 et, le cas échéant, l'orifice 71 . Une fois le liquide préfiltré, celui-ci est dirigé naturellement par la géométrie du dispositif et stocké au-dessus de la membrane de rétention des microorganismes 6. Le liquide préfiltré transite ainsi par un réservoir intermédiaire 9, disposé entre le préfiltre 3 et le réservoir de collecte 5, tel que représenté sur la figure 5.
Afin de réaliser une étape de filtration d'un échantillon sur la membrane 6 et en référence aux figures 4 et 5, la vanne est réglée pour aspirer au niveau de ladite membrane 6 par l'intermédiaire de l'orifice d'aspiration de la membrane 8 et, le cas échéant, la partie débouchante 81 du réservoir de collecte 5. Les microorganismes sont collectés sur cette membrane 6. La porosité de cette membrane est inférieure au diamètre des microorganismes à collecter. Préférentiellement, la porosité est comprise entre 0,22 et 0.45 μηη. La membrane peut être lavée afin de purifier les microorganismes. Avantageusement, la paroi du réservoir de collecte 5 comprend au moins une partie inclinée 1 1 ou au moins une partie en forme d'ogive. Cette forme de la paroi permet, en coopération avec l'inclinaison de la membrane 6 de favoriser la rétention des microorganismes dans un zone préférentielle, correspondant à la partie basse du moyen de filtration 3. Cette partie forme alors un angle aigu entre le moyen de filtration 3 et la paroi du réservoir de collecte 5. Ainsi, dans une étape ultérieure de récupération des microorganismes, une remise en suspension dans un volume réduit de liquide et plus facilement réalisable notamment de manière automatique. L'accessibilité à cette zone est également améliorée. Avantageusement, cette rétention des microorganismes dans une zone préférentielle permet de localiser les microorganismes dans une zone délimitée et prédictible, ce qui favorise un rendement plus élevé de récupération par un automate ne disposant pas de système de vision destiné à localiser un tapis bactérien sur la surface de la membrane.
A la suite de cette étape de filtration sur la membrane 6 et en référence à la figure 8, la pompe à vide est éteinte afin de ramener la pression en aval de la membrane 6 à pression atmosphérique. Les microorganismes adhèrent alors à la membrane 6 et peuvent être récupérés / collectés de différentes façons et de manière non limitative :
• par remise en suspension à la pipette 10 avec un liquide en dispensant ce dernier sur une zone de la membrane d'un jet puissant puis en aspirant ce même liquide afin de pouvoir le re-dispenser puissamment sur une autre zone de la membrane. Une série d'une vingtaine de dispense/ré-aspirations est effectuée afin de récolter les bactéries retenues sur toutes les zones de la membrane. L'inclinaison du réservoir de collecte permet au liquide de collecte de se localiser dans la zone préférentielle de collecte en limitant les pertes de volume qu'engendrerait un système de filtration horizontal (éjection rapide d'un liquide, par exemple un tampon neutre ou solvant), voir figure 8. Dans ce but, le réservoir de collecte 5 présente avantageusement au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée 1 1 de manière à permettre à la pipette 10 présentée verticalement de venir prélever les microorganismes collectés sur toute la surface de la membrane 6, sans heurter la paroi du réservoir de collecte 5 ;
· par écouvillonnage de la surface de la membrane 6 : soit avec un écouvillon seul, soit avec un dispositif combinant un cône de pipetage comprenant un écouvillon à son extrémité. Un tel dispositif comprend un cône de pipetage, dont l'extrémité débouchante venant aspirer le liquide, est enveloppée par la partie poreuse d'un écouvillon. L'avantage d'un tel dispositif est de pouvoir aspirer le liquide grâce au cône de pipetage, au travers de la partie poreuse de l'écouvillon, puis de venir au contact de la membrane, ou de tout moyen de filtration du réservoir de collecte, pour « décoller » le concentrât de microorganismes par abrasion, cette opération n'étant pas réalisable avec l'extrémité classique d'un cône de pipetage ; · En récupérant directement la membrane 6 puis remise en suspension dans un tube ou lyse directe des microorganismes. La membrane 6 est alors montée de manière amovible dans le réservoir de collecte 5 ;
• Par rinçage : arrivée du liquide par la face arrière de la membrane 6. La face arrière de la membrane étant la face dirigée en regard de l'orifice d'aspiration de la membrane 8 et le cas échéant de la partie débouchante 81 du réservoir de collecte 5. Alternativement, le liquide (tampon neutre, tampon contenant des détergents ou solvant) est déposé sur la membrane 6 dans le réservoir de collecte 5, aspiré, puis refoulé par la face arrière de la membrane 6. Cette opération d'aspiration refoulement peut être réalisée à plusieurs reprises.
Les différentes méthodes de récupération / collecte pourront être adaptées en fonction des microorganismes recherchés ou du type d'échantillon. En effet, certains concentrât de microorganismes présentent une adhérence très forte à la membrane. La collecte des microorganismes est alors impossible par éjection rapide d'un liquide, le jet de liquide n'étant pas suffisamment puissant pour décoller le concentrât. Seule une technique par abrasion (à l'aide d'un écouvillon ou d'un cône de pipetage enveloppé par la partie poreuse d'un écouvillon à son extrémité) étant alors efficace pour décoller le concentrât de la membrane.
Un second mode de réalisation est illustré sur la figure 9. Dans ce mode de réalisation, le réservoir de préfiltration doit être retiré pour pouvoir accéder au réservoir de collecte. Le réservoir de préfiltration est par exemple empilé sur le réservoir de collecte. Un tel dispositif est donc apte à traiter des échantillons biologiques de différentes nature, tel que des urines ou du sang, tout en étant compact. Lorsque le réservoir de préfiltration n'est pas retiré du dispositif, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration est en communication fluidique avec la zone de collecte du réservoir de collecte.
Dans ce mode de réalisation, le dispositif est composé d'un support fixe 20 sur lequel est installé un bloc de filtration 22 pouvant être amovible. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration 22 est maintenu sur le support 20 par l'intermédiaire de deux coulisseaux 23. Le dispositif est relié à un système d'aspiration sous vide (par exemple une pompe), non représenté, et une poubelle qui collecte les liquides filtrés. L'aspiration se fait au travers des orifices d'aspiration du préfiltre 24 et de l'orifice d'aspiration de la membrane 25 situés sur le support fixe 20. Le support fixe 20 comprend ainsi plusieurs orifices d'aspiration formant deux circuits d'aspiration matérialisés par les flèches « A » et « B ». Les deux circuits d'aspiration permettent ainsi d'aspirer en aval de la membrane et/ou en aval du préfiltre indépendamment, par l'intermédiaire des zones d'aspiration des réservoirs de collecte et de préfiltration. Alternativement, si l'aspiration est suffisante en aval de la membrane, le dispositif peut être maintenu sur le support sans l'utilisation de coulisseaux.
L'étanchéité entre le bloc de filtration 22 et le support fixe 20 peut être obtenue par tout moyen. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration 22 est maintenu sur le support fixe 20 et deux joints toriques, non représentés, sont placés entre le bloc de filtration 22 et le support fixe 20 afin d'assurer l'étanchéité des circuits d'aspiration « aspiration A » et « aspiration B ».
En référence à la figure 10, le bloc de filtration 22 comprend un moyen de filtration , également appelé préfiltre ou un empilement de préfiltres 26, contenu dans un réservoir de préfiltration 28 et qui permet de clarifier les solutions à filtrer sans retenir les microorganismes. Le bloc de filtration 22 comprend également un réservoir de collecte 30, un moyen de filtration, par exemple une membrane 32, disposé dans le fond du réservoir de collecte 30. La membrane 32 est inclinée d'un angle de 30° par rapport au plan formé par la base 200 du support fixe 20, soit de 60° par rapport à la verticale.
Alternativement, le réservoir de collecte 30 présente au moins une paroi dont au moins une partie 34 est inclinée ou en forme d'ogive.
Le bloc de filtration 22 pouvant être amovible, l'orifice d'aspiration du préfiltre 24 coopère alors avec un orifice 24-i sur le bloc de filtration 22. De même, l'orifice d'aspiration de la membrane 25 coopère avec la partie débouchante du réservoir de collecte 25i.
Une vanne, non représentée (intégrée ou non au dispositif), permet de gérer le protocole en aspirant soit en aval du préfiltre 26, soit en aval de la membrane 32 (soit en aspiration continue en aval de la membrane 32 et en aspiration alternée en aval du préfiltre 26.
En référence à la figure 1 1 correspondant au Détail A, le réservoir de collecte 30 peut être réalisé en deux parties assemblées 36 et 38. Dans ce mode de réalisation, la partie supérieure 36 et la partie inférieure 38 coopèrent pour maintenir la membrane 32 en position, par exemple par l'intermédiaire de deux ergots 40. Avantageusement, les deux pièces 36 et 38 sont soudées pour maintenir la membrane.
En référence à la figure 12 correspondant au Détail B, le réservoir de préfiltration 28 peut être réalisé en deux parties assemblées, une partie supérieure 42 et une partie inférieure 44 qui sert de support au préfiltre 26. Dans ce mode de réalisation, la partie supérieure 42 et le support de préfiltre 44 coopèrent pour maintenir le préfiltre 26 en position. Avantageusement et tel que représenté sur la figure 14, la partie supérieure 42 comprend un moyen 33 susceptible de coopérer avec un outil porte pipette d'un robot pipeteur. Le moyen 33 peut également revêtir une forme adéquate (par exemple un ou des orifice(s) ou ergot(s)) permettant d'être manipulé de manière automatique par un élément mécanique (tel qu'une pince), un outil de préhension pour robot pipeteur, un porte pipete, un porte écouvillon, ou directement par l'embout d'un canal de pipetage intégré dans le robot. Avantageusement, ce moyen 33 peut comprendre une partie cylindrique dans laquelle l'outil porte-pipette peut venir s'insérer et être maintenu de manière à soulever le réservoir de préfiltration 28 et dégager ainsi l'accès à la membrane 32. Dans un mode de réalisation particulier, cette partie cylindrique est maintenue par un ensemble de nervures disposées radialement sur la partie cylindrique de manière à définir au moins un moyen d'accès au préfiltre ou à l'empilement de préfiltres 26. Ce moyen d'accès permettant à un appareil tel qu'un robot pipeteur de présenter un outil à la verticale du préfiltre ou de l'empilement de préfiltre pour venir y dispenser un liquide (e.g. l'échantillon à traiter) et ce, sans manipuler ni heurter la partie supérieure 42.
En référence à la figure 13, le support de préfiltre 44 peut présenter des saillies 46 s'étendant radialement par rapport à l'orifice d'aspiration 45 du support de préfiltre 44. Les saillies 46 sont disposées sur la face en regard du préfiltre, afin de maintenir le préfiltre en position tout en facilitant l'écoulement du filtrat. Avantageusement, les saillies 46 s'étendent radialement par rapport à l'orifice d'aspiration 45 et selon un ou des cercle(s) concentriques ayant pour centre l'orifice d'aspiration 45. La support de préfiltre 44 permet à la fois de supporter le préfiltre ou l'empilement de préfiltres 26 et d'assurer l'étanchéité du réservoir de collecte lors de la mise au vide de ce réservoir, permettant ainsi le passage efficace de l'échantillon à travers le préfiltre ou l'empilement de préfiltres 26.
En référence à la figure 14, un protocole de filtration d'échantillon d'urine utilisant le second mode de réalisation du dispositif comprend les étapes suivantes
1 ere étape : Déverser l'urine sur le préfiltre 26. Dans le cas d'un protocole automatisé, l'urine peut être déversée par un robot pipeteur venant se présenter à la verticale du préfiltre 26 au travers du moyen d'accès au préfiltre de la partie supérieure 42. Alternativement, l'urine peut être déversée, manuellement ou automatiquement, directement sur le préfiltre 26 dans le cas où la partie supérieure 42 n'est pas présente.
2eme étape : Activer l'aspiration « A » par l'intermédiaire des orifices d'aspiration 24 et 24-|. L'urine passe à travers le préfiltre 26 et se dépose sur la membrane 32.
3eme étape : Activer l'aspiration « B » par l'intermédiaire des orifices d'aspiration 25 et 25i. Les microorganismes restent sur la membrane 32. pendant que le « déchet » est aspiré vers la poubelle.
4eme étape : Retirer le réservoir de préfiltration 28 pour accéder à la membrane 32, par exemple à l'aide d'un moyen automatisé tel qu'un outil de robot utilisé pour manipuler des pipettes.
5eme étape : Eventuellement réaliser une ou plusieurs étapes de lavage de la membrane et des microorganismes en distribuant à la pipette (manuelle ou automatisée) des volumes de tampon. 6eme étape : Récupérer les microorganismes. Les microorganismes étant alors concentrés par la force de pesanteur et l'action de l'aspiration dans la partie basse de la pente formée par la membrane 32 et la paroi du réservoir de collecte 30, celle-ci comprenant avantageusement une forme inclinée 34 ou d'ogive. Les microorganismes étant alors concentrés dans une zone délimitée, correspondant à la zone préférentielle de collecte, pour permettre la récupération des microorganismes par un robot de pipetage automatique dans un volume réduit de liquide.
L'étape de récupération / collecte de microorganismes sur la membrane 32 peut être réalisée par les même moyens que ceux énoncés pour le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention.
En référence à la figure 15, un protocole de filtration d'échantillon de sang, préalablement lysé, utilisant le second mode de réalisation du dispositif sans le réservoir de préfiltration 28 comprend les étapes suivantes
1 ere étape : Déverser le sang, préalablement lysé, sur la membrane 32.
2eme étape : Activer l'aspiration « B » par l'intermédiaire des orifices d'aspiration 25 et 25i.
Les microorganismes restent sur la membrane 32 pendant que le « déchet » est aspiré vers la poubelle.
3eme étape : Eventuellement réaliser une ou plusieurs étapes de lavage de la membrane et des microorganismes en distribuant à la pipette (manuelle ou automatisée) les volumes de tampon.
4eme étape : Récupérer les microorganismes.
En référence à la figure 16, la récupération des microorganismes peut se faire par remise en suspension à la pipette 48 avec un liquide (éjection rapide du liquide, par exemple un tampon neutre, tampon avec détergents ou solvant). Dans ce but, le réservoir de collecte 30 peut présenter au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée 34 de manière à permettre à une pipette 48 présentée verticalement de venir prélever les microorganismes collectés sur toute la surface de la membrane 32 sans heurter la paroi du réservoir 30. Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, le dispositif selon l'invention peut également être utilisé avec un écouvillon pour la collection des microorganismes concentrés et retenus sur le moyen de filtration du réservoir de collecte, par exemple une membrane. La collection par écouvillon peut être réalisée soit manuellement soit de manière automatique moyennant une adaptation de l'outil de préhension d'un robot pipeteur. Le dispositif selon l'invention fonctionne également avec différents type de filtres utilisés dans le réservoir de préfiltration ou le réservoir de collecte, seul ou empilés, et différentes membranes seules ou empilées.
Pour certains liquides peu complexes, le réservoir de préfiltration n'est pas utile. Les échantillons sont directement déposés au-dessus du moyen de filtration du réservoir de collecte, par exemple sur une membrane de filtration, plus particulièrement sur une membrane de 0,2 μηη de porosité. Dans le cas où le réservoir de préfiltration n'est pas utile, celui-ci peut être retiré par un outil porte pipette ou porte écouvillon pour robot pipeteur.
Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, des matériaux de filtration pouvant être utilisés comme moyen de filtration sont donnés à titre d'exemples dans le tableau 1. La taille des pores est adaptée suivant la taille des débris à filtrer. La taille des pores du matériau utilisé comme moyen de filtration peut atteindre 1 mm pour permettre de filtrer de gros débris.
Tableau 1 : exemple de matériaux de filtration
Les moyens de filtration du réservoir de préfiltration, également appelés préfiltres ou empilements de préfiltres utilisés dans le dispositif selon l'invention sont également donnés ci- après. Alternativement, les matériaux employés comme moyen de filtration du réservoir de préfiltration peuvent être employés comme moyen de filtration du réservoir de collecte, seul ou empilés.
Le dispositif selon l'invention, également appelé dispositif de double-filtration et tel que décrit précédemment est ici appliqué au traitement d'urines inoculées. Dans le tableau comparatif 2, pour chaque moyen de filtration du réservoir de préfiltration, 9 ml d'un ensemble d'échantillons d'urines mélangées constitué de 10 tubes d'urines pathologiques est introduit sur le moyen de filtration dans le réservoir de préfiltration dans lequel on fait le vide doucement au moyen d'une vanne trois voies. Quand le volume est passé au travers du ou des préfiltres, la vanne trois voies est basculée lentement en position Filtre pour faire passer l'urine à travers le moyen de filtration du réservoir de collecte, ici une membrane PES 0,45 μηη. La vanne est remise en position fermée.
Le culot bactérien est lavé sur la membrane avec 1 ml de tampon carbonate 50 mM pH8 (vanne filtre ouverte) puis est récupéré avec 400 μΙ de tampon carbonate (vide stoppé et dispositif remis à pression atmosphérique) ; le volume récupéré varie de 300 à 400 μΙ. Le volume collecté a été divisé en deux parts dont une part pour réaliser un dosage de protéines après lyse (protocole lyse P2).
Les urines polymicrobiennes contenaient majoritairement :
- E.aerogenes: 1 ,2e7 CFU/mL
- E.coli: 3e6 CFU/mL
- S.aureus: 1 e5 CFU/mL
Le tableau comparatif 2 récapitule les observations faites durant les essais ainsi que les résultats de dénombrement du nombre de CFU par comptage sur boites de gélose bioMérieux chromlD® CPS et les résultats de dosage des protéines.
Tableau comparatif 2 : préfiltres
Préférentiellement, les empilements de préfiltres pouvant être utilisés comme moyen de filtration du réservoir de préfiltration sont :
• 2 * VFE + Filtrona
• Whatmann Paper Filter 43+1 13+4
• Whatmann Paper Filter 40+41 +1 13+4
• PalIPAD + Coton
Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, les membranes pouvant être utilisées, notamment comme moyen de filtration du réservoir de collecte et à titre d'exemple sont :
• Supor PES 800 membrane, (Pall Gelmann)
• Supor PES 450 membrane, (Pall Gelmann)
• Supor PES 200 membrane, (Pall Gelmann)
• Supor 0.2 Mach V membrane (From Nalgen Filtration Unit) • Express 0,45 (Millipore)
• GF/F glass fiber depth filter (Whatman)
• Des membranes polymères ayant des porosités entre 0,22 et 1 ,5μη"ΐ, préférentiellement entre 0,22 et Ι μηη, plus préférentiellement entre 0,22 et Ο,δμηη, encore plus préférentiellement entre 0,22 et 0,45μηΊ : en polypropylene, en
Polyethersulfone (PES), en Nylon (Polyamide), en Polytetrafluoroethylen (PTFE), en polycarbonate, en polyester, ou à base de cellulose (Cellulose régénérée, acétate de cellulose, nitrate de cellulose, Mixted Cellluose Ester).
• Des membranes Type Anopore (Anodisc) en aluminium oxide avec des porosité de 0,02 μηη (pour les applications de type purification d'exosomes)
• Les membranes de filtration peuvent être des matériaux à basse de silice, polymères, acétate ou oxide d'alumine à titre d'exemple.
La porosité des moyens de filtration utilisés dans le dispositif selon l'invention sera facilement adaptée par l'homme du métier selon les constituants d'intérêts recherchés dans l'échantillon biologique.
Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, les écouvillons pouvant être utilisés en combinaison avec l'utilisation d'un cône de pipetage sont :
• écouvillon 1 (VWR) référence 1490241 Flexible swab
· écouvillon 2 (Texwipe) référence TX745B Hard swab
Dans cette utilisation, la partie poreuse de l'écouvillon est dissociée du manche pour venir envelopper la partie débouchante, venant habituellement pipetter le liquide, d'un cône de pipetage.
Le moyen de filtration du réservoir de collecte s'étendant selon un second plan, peut être inclinée d'un angle différent de 30°, soit entre 10 et 60°(qui correspond à un angle entre 30 à 80° par rapport à la verticale) par rapport au plan formé par la base du support fixe. Ceci tout en permettant la concentration des échantillons et leur collecte par un moyen de collecte tel qu'une pipette ou un écouvillon.
Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, le dispositif peut être muni d'un 3ème réservoir comprenant un troisième moyen de filtration. Ceci afin de réaliser un nouvel étage de filtration pour des composés recherchés dont la taille est comprise entre 0,02 et 0,2 μηη tel que des micro-vésicules ou des exosomes. Le dispositif et procédé correspondant peut être utilisé pour collecter des microorganismes de manière automatique à partir d'échantillons d'urine et d'hémoculture ainsi que pour extraire des éléments biologiques de petite taille tel que des exosomes ou des microvésicules. Le dispositif peut ainsi être employé dans le domaine de l'oncologie en permettant par exemple de concentrer les exosomes (90 nm de diamètre), connus comme marqueur du cancer. La valeur ajoutée est de proposer un procédé rapide, générique et simple pour extraire des exosomes ou microvésicules à partir d'échantillons de salive, sérum ou plasma. Dans ce procédé, le moyen de filtration du réservoir de collecte est une membrane de porosité 0,02 μηη. Eventuellement un autre mode de réalisation comprend un troisième réservoir contenant un troisième moyen de filtration en aval du moyen de filtration du réservoir de collecte comprenant une membrane de porosité de 0,02 μηη.
EXEMPLES D'UTILISATION DU DISPOSITIF SELON L'INVENTION: Le dispositif selon l'invention a été testé sur deux types d'échantillons : urines (cliniques et inoculées) et hémocultures (cliniques et inoculées)
Une partie des expériences a pour but d'estimer l'efficacité du dispositif à collecter et restituer les microorganismes (rendement de collecte des microorganismes). Une seconde partie des expériences se déroule jusqu'à l'analyse finale en spectrométrie de masse (ESI ou MALDI) pour identifier ces microorganismes.
Exemple 1 : Expériences en urines inoculées : Résultats sur les trois microorganismes en mode automatique
Microorganismes EC (Escherichia coli), SE (Staphilococcus epidermidis) et CA (Candida albicans).
Tableau 3 : Rendement de récupération (%) des microorganismes E.C, S.E et CA sur plusieurs réplicats.
Le rendement est défini comme le ratio de la quantité de microorganismes récupérée sur la membrane à la fin du protocole sur la quantité de microorganisme introduite en solution sur le préfiltre.
Cette expérience, illustrée sur la figure 1 , permet de conclure au bon fonctionnement du dispositif selon l'invention. Il permet de filtrer efficacement 10 mL d'urine et d'en collecter une fraction non négligeable des microorganismes.
Exemple 2 : Expériences en urines saines inoculées : sur automate pipeteur (4 dispositifs parallèles). Rendement de filtration sur les microorganismes EC (Escherichia coli) et CA (Candida albicans) pour différentes configurations (volume et distance à la verticale du filtre) de remise en suspension.
Tableau 4 présentant le rendement de récupération des microorganismes E.C et CA sur plusieurs réplicats en faisant varier la méthode de remise en suspension automatisée.
Cette expérience a permis de conclure sur la faisabilité d'automatisation du dispositif et sur l'impact du type de la remise en suspension sur le rendement de récupération.
Exemple 3 : Expérience avec des urines pathologiques : Résultats de détection de peptides E.coli en LC-ESI MS (mode MRM)
Un lot de quinze urines pathologiques a été traité par double-filtration (DF) avec le dispositif selon l'invention. Le moyen de filtration du réservoir de préfiltration est constitué d'un empilement de préfiltres (ordre allant du bas vers le haut, le préfiltre placé en haut étant le premier à recevoir le liquide): Nylon 30 um / 2x VFE 5um / Filtrona 2 mm ou 4 mm (ie 2x2 mm) et comme moyen de filtration du réservoir de collecte une membrane PES 0,45 um (Pall). L'enchaînement des étapes de pré-filtration / filtration pour 6 à 10 mL d'urine se réalise au maximum en 3 minutes. Après un lavage avec 1 ml_ d'eau, le concentrât a été collecté par remise en suspension dans 400 μΙ de tampon carbonate puis soumis au protocole de lyse-digestion (version manuelle) pour être injecté en LC-ESI MS avec une méthode d'acquisition développée de façon non optimisée pour rechercher des peptides qu'on retrouve chez E.Coli. La méthode MRM cible 60 peptides dont 7 sont spécifiques de l'espèce E.coli et 9 communs à la famille des entérobactéries, les 44 restant doivent être génériques aux Gram-.
Le tableau 5 montre qu'après le traitement par double filtration d'urines de compositions très diverses (quantité de globules blancs, rouges, cellules épithéliales), les peptides spécifiques de E.coli sont dans l'ensemble bien détectés pour les urines contenant l'espèce E.coli d'après les résultats d'identification sur un automate bioMérieux VITEK®2 fournis. Pour ces mêmes urines, la détection des peptides communs aux entérobactéries est également correcte puisque l'espèce E.coli appartient à cette famille. Les urines u10 et u13 contenant des bactéries de la famille des entérobactéries présentent bien des peptides spécifiques de cette famille sans la présence des peptides spécifiques de E.coli. L'urine u9 identifiée C.Koseri aboutit à la détection de peptides spécifiques de E.coli et de peptides communs à la famille entérobactéries. Cette présence d'une population d'E.coli conjointement à des colonies de C.Koseri est également observée sur milieu de culture bioMérieux ChromlD® CPS.
Résultats bioMérieux
LC-ESI-MS/MS
méthode MRM EC5
N peptides
peptides
spécifiques
totaux
détectés E.coli détectés
(/60) (maxi=7) détectés ft*>a s9
59
59
59
58
55
48
47
21
27
35
25
Tableau 5
Le tableau 6 donne les scores de bonne identification de l'espèce E.coli dans un premier lot d' urines pathologiques.
Tableau 6
Un second lot de d'urines pathologiques a donné des résultats confirmant l'efficacité de notre protocole de préparation d'échantillons en amont d'analyses LC-ESI MS en mode ciblé comme l'illustre le tableau 7 pour les cinq urines qui contenaient l'espèce E.coli.
Tableau 7
Expérience avec urines pathologiques : Résultats d'identification par MALDI-TOF
Quinze urines pathologiques ont été traitées par double filtration avec le dispositif selon l'invention avec comme moyen de filtration du réservoir de préfiltration un empilement de préfiltres (ordre allant du bas vers le haut, le préfiltre placé en haut étant le premier à recevoir le liquide): 2x VFE 5um / Filtrona 2mm et comme moyen de filtration du réservoir de collecte une membrane PES 0,45um (Pall). Après la rétention des microorganismes sur la membrane, celles-ci ont été lavées 1 fois par 1 ml_ d'eau puis collectées en réalisant une trentaine d'aspirations refoulements ou dispense/ré-aspirations avec 400 μΙ_ d'eau. Les suspensions obtenues ont été centrifugées 5 min à 10000g pour sédimenter les microorganismes et retirer le surnageant. Le culot bactérien a été déposé sur une cible MALDI-TOF avant ajout de la matrice Acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (matrice HCCA) ou avec ajout d'acide formique (AF), séchage puis ajout de la matrice HCCA. Les spectres MALDI-TOF ont été obtenus avec un spectromètre Shimadzu piloté par Launchpad (appareil bioMérieux VITEK® MS). Les résultats d'identifications donnés selon le tableau 8 ont étés obtenus par interrogation de la base de données " bactéries".
Tableau 8
B*= urines bi-microbiennes avec 2 )èces à des concentrations voisines. Les résultats d'identification peuvent être présentés comme suit (voir également tableau
13 urines types sont exploitées :
- 4 stériles,
- 2 mono-microbiennes,
- 4 bi-microbiennes (avec une espèce majoritaire),
- Et 3 bi-microbiennes (avec deux espèces de concentrations proches)
Selon le mode de dépôt sur la cible MALDI (HCCA sans AF (Acide Formique) et avec AF avant l'ajout d'HCCA), 90 % et 100% de bonne identification ont été obtenus au niveau de l'espèce (sur ce panel de 10 urines dont les positives sont à minima à 10e6 CFU/mL).
Pour les 3 bi-microbiennes (avec deux espèces de concentrations proches), seule une espèce peut être identifiée à la fois sur un dépôt.
Ces résultats illustrent bien qu'une double filtration rapide des urines brutes à l'aide du dispositif selon l'invention permet de purifier suffisamment et de collecter assez de microorganismes pour une identification exacte de celles-ci par MALDI-TOF.
Tableau 9 Exemple 4 : Expérience avec hémocultures inoculées : Résultats de détection de peptides en LC-ESI MS (mode MRM)
Le protocole de lyse-filtration consiste brièvement en une lyse sélective des cellules du sang par action d'un tampon contenant un tensioactif pendant un temps court. L'avantage apporté par le dispositif ci-décrit est de par sa géométrie, ici une inclinaison du moyen de filtration du réservoir de collecte de 30°, qui permet la récolte efficace des microorganismes au moyen d'une solution liquide conduisant in fine à une suspension bactérienne.
Le protocole Lyse-filtration est le suivant :
o La filtration est faite sur une membrane de filtration 0,2 μηη PES utilisé comme moyen de filtration du réservoir de collecte sur le dispositif selon l'invention.
o La prise d'essai est de 0,8 mL d'hémoculture qui sont traitées par 0,4 mL de tampon CAPS 0,3 M/ Brij 0,45% pendant 2 minutes suivi de la filtration pendant 2 minutes.
o 3 lavages avec 175 μί de Wash buffer 1 ( NaCI 0,45%/ Brij 97 0,005%) o 1 lavage avec 175 μί de Wash buffer 2 (Wash Buffer 2: Brij 97 0,005%) o La collecte est faite avec 200μί de tampon carbonate en respectant un nombre constant d'aspirations/refoulements (30) ou de dispense/ré-aspirations (30). La répétition de la collecte, une 2nde, une 3eme et une 4eme fois sur la même membrane a également été testée. La lyse digestion a été faite avec le P2A sur un robot pipeteur Hamilton. La démonstration a été faite pour E.Coli, S.epidermidis et C.albicans avec une bonne détection des peptides ciblés par la méthode MRM. La figure 18 présente les résultats de détection via les méthodes MRM adaptées au micro-organisme inoculé dans les bouteilles d'hémocultures. Les trois graphes montrent pour les 3 micro-organismes la bonne détection des peptides spécifiques dans les échantillons positifs à J0 post culture (EC1 J0, EC2 J0, CA1 J0, CA2 J0, CA3 J0,SE1 J0 SE2 J0, SE3 J0). Un nombre mineur de peptides (2 à 4) sont détectés dans les contrôles négatifs (Cneg). La différence significative tant du nombre de peptides détectés que de l'aire cumulée entre les échantillons positifs et les contrôles négatifs indique que le protocole réalisé sur le dispositif décrit permet bien de récolter les bactéries contenues dans les hémocultures.
D'autre hémocultures ont aussi été traitées de la même façon mais après la collecte des microorganismes, nous avons réalisé le protocole l0 afin d'identifier en LC-ESI-MS à l'aide des profils protéiques. Les résultats présentés dans le tableau 10 montrent que les 8 hémocultures E.coli sont bien identifiées en LC-ESI avec l'algorithme Cross-Cor en interrogeant la base de données urine mais qu'il y a confusion avec Shigella si c'est la base culture qui est interrogée, les espèces étant proches. Les quatre hémocultures avec levures {C.AIbicans) sont correctement identifiées (sur quatre). Une seule hémoculture S.epidermidis est bien identifiée (sur quatre). Malgré ces quelques cas de mauvaises identifications, ces essais attestent de l'efficacité de la préparation d'échantillon par lyse-filtration réalisée sur le dispositif selon l'invention.
Tableau 10 : Résultats d'identification en LC-ESI MS après Lyse filtration sur le dispositif tel que décrit et extraction de protéine l0 (mode full scan, profil protéique)
Procédé alternatif sur échantillon d'urine utilisant le dispositif selon l'invention :
Les différentes étapes de la manipulation sont données ci-dessous :
1 ) A réception, les urines sont photographiées.
2) Estimation des volumes dans les tubes (comparé à un tube gradué)
3) 10 μΙ_ sont déposés sur gélose bioMérieux ChromlD® CPS pour vérification.
4) 150 μΙ ont été mis de côté à 4°C pour faire un étalement de 100μΙ_ sur COS pour 5H00 de croissance. 5) Le reste de l'échantillon a été traité avec le dispositif selon l'invention. Le moyen de filtration du réservoir de préfiltration consiste en un empilement des préfiltres. Les préfiltres utilisés étant, du bas vers le haut : 1 x VFE 5 um / Filtrona 2 mm. Le moyen de filtration du réservoir de collecte où seront récupérées les bactéries est une membrane: PES 0,45 um (Pain
Le volume d'urine filtrée est compris entre 3 et 6 mL pour un temps de filtration de quelques minutes. La collecte du concentrât est fait avec 1000 μί d'eau (Versol).
7) A l'issue du protocole manuel, 10 μΙ sont étalés sur gélose bioMérieux ChromlD® CPS pour permettre de voir si la population bactérienne est la même entre la fraction collectée et l'urine de départ (couleur des colonies, polymorphisme, comparaison numération avant/après double filtration).
8) Pour le volume restant des fractions collectées, une centrifugation de 5 min 10000g a été faite pour enlever le maximum de surnageant (eau) et garder un culot de quelque μί pour MALDI-TOF.
9) Les dépôts sur plaque MALDI-TOF sont faits en doublons selon la terminologie du tableau 1 1
10) La manipulation par culture courte de 5h00 est faite en déposant 100 μΙ d'urine et étalement au râteau. Après 5H00 de croissance à 37°C, le biofilm est observé. Ce biofilm est alors collecté avec une oese de 1 μί et déposé sur cible MALDI-TOF.
Tableau 1 1 : Codification des protocoles selon le traitement réalisé et le mode de dépôt sur cible MALDI-TOF
HCCA : (Acide a-cyano-4-hydroxycinnamique) : 1 μΙ par spot
AF: (Acide Formique) : 0,5μΙ par spot double filtration : traitement à l'aide du dispositif selon l'invention

Claims

Revendications
1 ) Dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant :
• un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan,
• un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comprenant lui-même une paroi et un moyen de filtration, le moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, caractérisé en ce que le second plan du moyen de filtration est incliné par rapport au plan de la base du support fixe.
2) Dispositif selon la revendication 1 , dans lequel le bloc de filtration comporte en outre un réservoir de préfiltration pouvant être amovible, ledit réservoir de préfiltration comprenant un moyen de filtration divisant le réservoir de préfiltration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration étant en communication fluidique avec la zone de collecte du réservoir de collecte.
3) Dispositif selon la revendication 2, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration étant adaptée pour être connectée à un second moyen d'aspiration
4) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la paroi de la réservoir de collecte dans la zone de collecte est en partie inclinée ou en forme d'ogive
5) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, le moyen de filtration du réservoir de collecte comprenant au moins une membrane de porosité comprise entre 0,02 et 1 ,5μη"ΐ, préférentiellement entre 0,02 et Ι μηη, plus préférentiellement entre 0,02 et Ο,δμηη, encore plus préférentiellement entre 0,02 μηη et 0,45 μηη 6) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprenant au moins un filtre de porosité comprise entre 5 μηη et 1000 μηη, préférentiellement entre 5 μηη et 100 μηη.
7) Dispositif selon la revendication 6, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprenant un empilement de filtres 8) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, le second plan du moyen de filtration du réservoir de collecte étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe d'un angle compris entre 10° et 60°, de préférence égal à 30°
9) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, le réservoir de collecte comprenant une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de collecte
10) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, le réservoir de préfiltration comprenant une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de préfiltration
1 1 ) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, le réservoir de préfiltration comprenant un moyen susceptible de coopérer avec un outil pour robot pipeteur tel qu'un porte pipette ou un porte écouvillon.
12) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 1 1 , dans lequel le bloc de filtration comporte en outre un troisième réservoir de filtration pouvant être amovible, ledit troisième réservoir de filtration comprenant un moyen de filtration divisant le troisième réservoir de filtration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone de collecte du troisième réservoir de filtration étant en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de collecte.
13) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, le moyen d'aspiration étant un moyen d'aspiration / refoulement.
14) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 ; la paroi du réservoir de collecte et le moyen de filtration formant une zone préférentielle de collecte.
15) Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour le traitement d'un échantillon biologique.
15) Procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 comprenant les étapes suivantes:
• déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte, à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte • collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
16) Procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 14 comprenant les étapes suivantes: .
• déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de
préfiltration,
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte
• collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
17) Procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 3 à 14 comprenant les étapes suivantes: .
• déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de
préfiltration,
• aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du second moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
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