CN113329820A - 从生物样品中选择性提取组分的方法和仪器 - Google Patents

从生物样品中选择性提取组分的方法和仪器 Download PDF

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Abstract

方法和仪器提供过滤以用于浓缩诸如血液或尿液的生物样品的分析物，诸如细菌或外泌体。该技术可以采用诸如分级地实施一种或多种切向流过滤过程的膜装置。示例膜装置通常可以包括具有端面和端部的膜。膜可以选择性地允许样品的一种或多种组分通过，同时将其他组分保留在一侧处。装置的输入室可以包括靠近一端的入口和靠近另一端的出口，并且可以允许样品沿第一侧面切向流动，以及一种或多种组分的跨膜通过。装置的输出室可以被配置在第二端面处，以接收通过的组分。可以在试剂盒中提供这样的装置以促进靶向期望的生物分析物浓度。

Description

从生物样品中选择性提取组分的方法和仪器
相关申请
本申请要求在2019年1月25日提交的美国临时申请序列号62/796,757的优先权，其内容通过引用并入本文。本申请还要求在2019年9月27日提交的美国临时申请序列号62/906,822的优先权，其内容也通过引用并入本文。
技术领域
本技术涉及使用分离机构诸如膜从生物样品中选择性地提取组分以用于进一步分析或诊断目的(包括例如切向流提取，单级提取和多级提取)的方法和仪器。提取技术的某些示例性实施例可能涉及使用切向流过滤/提取进行带通过滤，以分离生物样品(诸如血样(稀释或未稀释)，阳性血液培养物，尿液样品等)的成分，这可能有助于直接和快速的鉴定和/或抗菌药敏试验。
背景技术
在多种情况下分析生物样品(即与生命或生物体有关的样品)。生物样品为细胞、蛋白质、囊泡和其他成分的复杂混合物。这些成分在结构、大小、组成等方面各不相同。通常需要选择性地分析生物样品的离散成分以用于研究、诊断、流行病学、治疗等。例如，生物样品中是否存在细菌或真菌的病原体可用于诊断患者/受试者的疾病，诸如败血症或尿路感染。作为另一个示例，样品成分(例如细胞)中细胞外囊泡的类型和分布可以提供可用于检测和治疗癌症的信息。然而，由于生物样品中存在其他成分，因此对血液等生物样品中离散成分(例如病原体，细胞或细胞外血管)的检测和分析变得复杂，这可能会干扰设计用于检测感兴趣的成分的方法。因此，分离和/或浓缩感兴趣的成分并将其与生物样品的其他成分分离的能力至关重要。
存在用于这种隔离的方法，但是这种方法不是完全合乎需要的。例如，离心和冲洗方法是劳动密集型的并且易受使用者变化的影响。过滤方法趋向于失去与过滤表面相互作用的感兴趣的成分。微生物镀覆方法允许感兴趣的成分(例如细菌)生长和分离，但需要较长的复制时间。
分离/浓缩方法需要较长的等待时间，这尤其成问题。需要改进的样品处理方法的一个重要应用是败血症检测。进入重症败血症的加护病房(ICU)的患者有39.8％的死亡风险。因此，快速识别负责任的病原体和适当的抗生素治疗对于提高患者的生存能力势在必行。用于确定从阳性血液培养物(PBC)中回收的病原体的身份(ID)和抗菌药敏试验(AST)的当前方法要求将标本与血液本底分离。标准方法是将PBC的等分试样传代培养以分离并在一些实施例中进一步浓缩病原体。该传代培养步骤可将产生结果的时间延迟约18-24小时。
因此，期望实现用于评估生物样品中感兴趣的成分的改进的技术和装置，该技术和装置可以快速地分离和评估这样的成分。这样的技术可以提高测试的效率和/或准确性。
发明内容
本文公开的技术的示例可以提供一种可以有效地将病原体与血液本底分离而无需进行传代培养从而可以促进快速ID/AST的过程。样品制备可以包括：i)从样品中分离靶标病原体(例如，由于大小排阻而分离)；ii)增加靶标病原体的浓度；或iii)在保留靶标的同时，通过洗净杂质来纯化靶标病原体。在一个示例中，靶标病原体为被分离并收集用于鉴定测试或药敏测试的细菌。此类测试可以与自动化分析(诸如随时间推移的铺板培养物的数字成像)配对以用于检测其上的微生物生长，或对靶标病原体培养物进行光测试。
本技术的另一方面是实施用于浓缩所需组分的生物样品成分的提取。
本技术的另一方面是在不需要传代培养步骤的情况下促进生物样品分析，以获得具有足够量的生物质/菌落质量和/或足够纯度的样品。
在一个实施例中，用于从生物样品中提取组分以用于浓缩生物样品的所需组分的仪器包括多个膜级，其中，多个膜级中的每个膜级均具有膜，该膜具有第一侧、第二侧、第一端和第二端，该膜具有的特性在于：选择性地允许生物样品的一种或多种组分从第一侧到第二侧穿过该膜，同时将生物样品的其他组分保留在第一侧处。膜还具有输入室，该输入室具有靠近第一端的入口和靠近第二端的出口，该输入室被配置在膜的第一侧处，以允许(a)生物样品在第一侧处沿膜的第一表面的从入口到出口的切向流，以及(b)生物样品的一种或多种组分从第一侧到第二侧的跨膜通过。该仪器还具有输出室，该输出室被配置在膜在第二侧的第二表面处，并被配置为接收穿过膜的生物样品的一种或多种组分。膜级被共同配置以分离生物样品的所需通带的组分。
在另一个实施例中，存在单级切向流膜装置，其具有输入室，该输入室具有第一出口和第二出口。该仪器还具有带有第二出口的输出室。过滤膜限定切向流路，该切向流路将第一室与第二室分开，并且还具有用于引导样品多次越过滤膜的再循环流路。从样品的一部分中回收感兴趣的成分，该感兴趣的成分被过滤膜保留在输入室中(即截留物)。
在另一个实施例中，单级切向流膜装置被配置为药筒。药筒具有接收样品容器的端口，并且该端口流体联接至药筒中的样品室。样品室被流体联接至输入室的第一入口。输入室的第一出口流体联接至样品室使得来自过滤膜的截留物再循环回至样品室。
本文描述了一种从生物样品中提取组分的方法。根据方法，在第一提取过程中，通过压力使生物样品中的一种或多种组分从第一膜的第一侧到第一膜的第二侧穿过第一膜，同时在第一膜的第一侧处保留生物样品的其它组分，并且同时在第一膜的第一侧处沿着第一膜的表面产生生物样品的切向流。在第二提取过程中，利用压力源使一种或多种组分中的一种或多种额外组分从第二膜的第一侧到第二膜的第二侧穿过第二膜，同时将一种或多种组分中的一些保留在第二膜的第一侧处，并且同时在第二膜的第一侧处沿着第二膜的表面产生一种或多种组分的切向流。根据该方法，第一提取过程和第二提取过程从生物样品的其它组分中分离、纯化和/或浓缩生物样品的所需通带的组分。
在另一个实施例中，公开了从阳性血液培养物中分离病原体的方法。根据该方法，怀疑包含靶标病原体的血液培养物流入样品室。血液培养物流入过滤装置。过滤装置包括将第一室与第二室分开的过滤膜。血液培养物切向流经过滤膜，使得如果在阳性血液培养物中存在靶标病原体，则靶标病原体流作为截留物经过滤膜并且通过第一室的第一出口。阳性血液培养物具有小于预定阈值的粒径的部分流过过滤膜并进入第二室。截留物流过第一室的第一出口以在过滤膜上再循环，借此样品的进一步部分渗透通过过滤膜。在将截留物再循环预定量的时间后，通过将截留物与冲洗缓冲液结合来冲洗截留物。所冲洗的截留物至于小瓶中用于下游测试，以确定截留物中的靶标病原体存在与否。
通过考虑以下详细描述、附图和权利要求书中包含的信息，该技术的其他特征将变得显而易见。
附图说明
在附图的图中以示例而非限制的方式示出了本技术，其中，相同的附图标记指代相似的元件，包括：
图1示出了适用于本技术的某些版本的膜装置的一个示例；
图2为配置有真空室以促进本技术的切向流过滤的膜装置的另一个示例；
图3为配置有注射器型柱塞以促进本技术的切向流过滤的示例膜装置；
图4示出了被配置为促进本技术的切向流过滤的示例膜装置的径向版本；
图5示出了被配置为促进本技术的切向流过滤的示例膜装置的再循环泵版本；
图6A示出了通过对含有大肠杆菌的血样的膜过滤，从而允许来自血样的细菌多次浓缩的示例过滤方法的步骤；
图6B为示出了当通过本技术的切向流过滤过程分离样品中的细菌时的诊断速度的增加的曲线图；
图7A和7B示出了使用多级过程分离样品中的外泌体的膜装置的另外的示例；
图8为示出了使用如本文所述的两级过程的提取的外泌体颗粒的截留物的动态光散射数据的曲线图；
图9为示出了使用本文所述的两级过程提取外泌体颗粒的滤液的信号强度的曲线图；
图10为示出了使用单级过滤器从样品中分离大肠杆菌的BACTEC裂解瓶和BACTEC标准瓶中大肠杆菌回收率的比较的曲线图；
图11为本技术示例的低通膜切向流过滤过程的图示；
图12示出了使用本技术的膜装置进行多级切向流过滤的示例方法的步骤；
图13示出了使用本技术的示例膜装置的切向流过滤过程的级的部件和处理；
图14A-K描述了根据一个实施例的用于执行切向流过滤的一次性药筒的流体环路；
图15示出了使用单级切向流过滤过程从人为的阳性血液培养物中分离出的细菌的鉴定和抗生素敏感性测试结果；
图16示出了使用两级切向流过滤过程从人为的阳性血液培养物样品中分离出的细菌的鉴定和抗生素敏感性测试结果；
图17示出了如何将本文描述的方法和装置集成到已知的工作流程中；与其他常规方法相比，比较使用本文所述方法和系统评估阳性血液培养物中细菌所需的时间；
图18示出了用于从阳性血液培养物中去除或分离或浓缩病原体的台式仪器；
图19A-F示出了图18所示的台式仪器的工作流程的一个示例；
图20A-D示出了图18所示的台式仪器的替代工作流程和配置；
图21A-F示出了一次性用品和台式仪器的一个实施例的潜在工作流程过程；
图22A-B示出了将阳性血液培养物引入系统的两种潜在方法；以及
图23A-C示出了用于供应任何所需试剂或缓冲液的潜在方法。
具体实施方式
本生物提取技术的一些实施例可以采用采用一个或多个提取级的切向流提取来实施。
切向流提取原理和概念
本技术提供了使用基于膜的技术结合切向流提取从生物样品中分离或纯化(并且在一些实施例中浓缩)特定感兴趣的组分的仪器和方法，所述生物样品包括例如血液、尿液、唾液和其他样品类型。特定感兴趣的组分的示例可以为靶标分析物，解离或循环的肿瘤细胞(CTC)，白细胞(WBC)，细胞外囊泡(如外泌体，酵母，细菌和病毒等)。基于膜的技术可以用液体形式的生物样品的切向流处理来实现。这样的切向流体流可以使样品(例如，重复地)越过具有跨膜压力特性的指定膜表面，该膜表面被设计成允许靶标组分作为渗透物穿过膜或作为截留物被膜保留。因此，可以取决于靶标以及靶标将被传递还是保留，来选择性地配置指定的膜或膜装置。与许多其他技术不同，该技术提供了一个有益的机会，可以保持脆弱的提取组分(诸如细胞，细菌，病毒等)的生存能力和完整性，这些组分可能会因恶劣的提取条件而受损。此外，本文所述的切向流分离技术即使在低浓度下也能有效回收从样品中提取的成分，因为与其他过滤方法(诸如无端过滤或过滤器由纤维材料制成的直通过滤)相比，成分在膜表面积上的暴露量大大降低。因此，本文所述的分离方法和装置降低了由于结合或损坏引起的靶标损失的风险。
为了实现靶标组分的提取，对装置设计、膜孔径和工艺参数进行了设计。取决于提取过程的目的，靶标组分可以保留或穿过装置膜。多孔膜优选具有相对于待提取的颗粒通常均匀的孔径(特征孔径)和光滑的表面。一种这样的类型的膜为轨迹蚀刻膜(TEM)，其可以由聚酯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰亚胺等制成。适用于TEM的材料对于本领域技术人员而言是众所周知的，因此本文不再详细描述。这样的膜可商购获得并且可以具有从纳米大小到微米大小的均匀孔径。另外，可以进一步处理这样的膜以改变表面性质诸如疏水性以减少膜结垢或以其他方式改善施用性能。这样的涂层和处理对于技术人员而言是众所周知的，并且在本文中没有详细描述。该系统可以优选地被设计为具有相关的切向流速和跨膜压力。切向流速和跨膜压力被选择为：i)防止由于诸如滤饼层形成或颗粒堵塞孔的现象而引起的膜结垢；以及ii)优化样品处理时间，而不引入不希望的细胞成分的剪切或裂解。这样的流速和压力特性选择可以允许目标粒径以截留相保留或在与待提取的靶标组分的膜孔径的适当选择配对时，作为渗透相穿过所选的膜。
参考图1中描绘的装置图示了提取过程，其中膜装置100中的基本切向流过滤可以用来处理样品102。膜装置100通常可以包括输入或上部室104和输出或下部室106，它们由插入其间的多孔膜108形成并连接。上部室104通常将具有至/来自入口室的样品入口/出口101，以使样品相对于入口室104流入和流出。输出或下部室可具有出口103，其用于使较小组分110流出以及穿过膜108的携带较小组分的液体流出。入口/出口通常在膜的端部或其附近，以促进或最大化切向流(TF)面积。因此，生物样品沿膜表面切向流动，并且较小的组分110物质和液体可以穿过膜，并且与未穿过膜的其余流体和样品102的其他组分分离。
可选地，可以通过压差；即通过正压源和/或负压源(例如真空源)来驱动切向流(即，沿着膜表面)和/或跨膜流(即，穿过膜)。切向流可以为单向流，也可以为往复流(其中流体流反转其方向，以允许流体多次流过同一膜表面以完成过滤过程)。样品在膜上的多次通过提供了许多潜在的好处，包括减少了所需的膜面积。在一些实施方式中，切向流可以由循环或压力泵提供动力，以用于沿一个方向驱动切向流。在一些这样的情况下，样品将沿着膜的表面多次流动，诸如在流路采用回路或环路而泵使样品流体在回路/环路中循环或再循环的情况下。在其他示例中，样品沿着膜表面(诸如流路终止处(例如，非回路)并且它与实现往复切向流的一个可逆泵(即，双向泵)或多个交替单向泵联接)在不同方向上多次流动。在一些示例中，此类泵/真空泵可以可选地由一个或多个注射器来实现，这些注射器可以手动或自动操作。可以可选地实现其他类型的泵/真空泵，或者使用单个部署的动力源的适当阀配置，从而实现所需的流动。可用于驱动样品流过膜的泵/真空泵对于本领域技术人员而言是众所周知的，并且在本文中未详细描述。
在一些版本中，加压容器和/或减压容器可联接至室的入口/出口(101、103)以提供用于切向流的力。例如，这种联接可以在膜的相对端处或其附近，以引起沿膜的一个表面从一端到另一端(即在一个室内)的切向流。所述室可被配置为引起沿膜的流动，诸如当室被壁结构107限制以在膜的表面附近并沿膜的表面形成窄间隙时。切向流发生在间隙内。当与膜与形成间隙的壁结构107的表面之间的间隙的深度(D)相比时，这种间隙沿膜的长度(L)更长的尺寸可能是有利的。
如图2所示，容器212的减压版本可以为抽空的收集管(例如，BD
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)，该抽空的收集管可以联接至靠近近端的上部室的入口/出口101-A，诸如经由导管。可选地，诸如用于抽血的针头可经由导管在相对端处或相对端附近联接至入口/出口101-B。收集容器214，诸如可以固定在膜装置200上或从膜装置200移除的小瓶，可以收集穿过膜108的液体和组分110(渗透物)。在图3的示例中，多个柱塞装置316(例如，注射器)用于迫使样品在膜装置300中往复流动，以引起特定的样品组分/分析物跨过内部膜以收集在收集容器214中。
可替代地，也可以通过移动膜来产生切向流。一个这样的示例在图4中示出。装置400可以为旋转心轴318(例如，中空圆柱结构)，其具有内部室和在心轴318的外表面上的多孔膜108。心轴318可以可旋转地安装在圆柱形壳体320内部。诸如血液的生物样品可以被引入心轴318和圆柱形壳体320。切向流通过旋转壳体320的同时使心轴318的圆柱形膜插入件保持静态或反之亦然来形成。可以提供跨膜流动压力，以在心轴相对于圆柱形壳体旋转时引导较小的组分从圆柱形壳体320穿过膜108进入心轴的中空室。在这种情况下，心轴的中空部分用作渗透物的收集容器。在2018年3月1日公开的题为“血浆提取器(PlasmaExtractor)”的美国专利公开号2018/0056243中示出了这种装置的示例，其内容通过引用并入本文。
在图5的示例中，再循环泵522(例如蠕动泵)沿内膜108的一个表面切向地通过回路524(例如，包括膜装置500的上部室104的导管)使生物样品再循环。导管回路允许沿着内膜108进行多次再循环。在图13所示的类似配置中，再循环泵1522通过包括膜装置1500的输入室1504的回路使生物样品再循环，使得样品沿膜1508切向重复地切向流动。这种泵也可以提供跨膜压力。真空泵1528也可以联接至膜装置1500的输出室，并且可以提供跨膜压力，将渗透物通过膜吸入并吸入收集容器1514中。样品的再循环允许从样品中去除额外的/不需要的(即本底)成分，从而提高了样品中病原体与其他样品组分的分离、纯化和/或浓度的程度和程度。可以在本文所述的切向流膜装置的单级或多级配置中进行再循环。
A.单级提取过程
如前所述，膜装置100可被实现用于单级提取，诸如在样品沿着具有相同过滤特性(例如，相同孔径)的单个膜或多个膜切向流动的情况下。可以实施这样的过程以从新鲜的全血、尿液、脑脊液、唾液、呼吸道样品和伤口以及其他样品类型中回收和浓缩细菌。本文描述了示例过程。
(1)从新鲜全血中回收和浓缩细菌
如前所述，期望细菌鉴定/检测和抗生素敏感性测试的快速结果以提高治疗效率。由于原始样品(诸如血液或尿液)中细菌浓度低，常规的测试程序需要较长的孵育时间和复杂的样品纯化步骤。通过提高可检测性或减少孵育时间，直接从患者样品中浓缩细菌可提供更快的结果。
切向流提取可以用作使用膜装置100的浓缩过程，并且可以实现原始样品中细菌的富集，诸如在大肠杆菌细菌回收测试中。例如，可以分离细菌，并且在一些实施例中，可以从血样中浓缩细菌。在图6A所示的这种过程的示例中，收集了10mL的患者血样。出于测试目的，将其掺入大肠杆菌。使用40mL BD BACTECTM Lytic裂解培养基稀释样品。BACTEC为Becton、Dickinson及其公司(BD)的商标。培养基可以实现裂解血液成分但不裂解细菌的差异裂解。裂解后的样品将用于从液体介质中分离出细菌的切向流提取过程。类似于先前讨论的示例，膜装置600(或切向流提取装置)具有被轨迹蚀刻膜(TEM)630隔开的第一室610(例如，输入室或上部室)和第二室620(例如，输出室或下部室)。裂解的血样沿第一室(例如，图1中的上部室；104)中的膜装置600中的轨迹蚀刻膜流动(以多程过程重复)，通过施加跨膜压力，部分液相流过轨迹蚀刻膜630(图1中的TEM108)进入第二室(例如，图1中的下部室；106)。TEM可具有约0.2至约2.0μm或可替代地约0.4μm至约1μm的孔径。选择这样的孔径以将细菌保留在截留相中。切向流速可以在约1至约20 10mL/min的范围内或可替代地在约5mL/min的范围内。本领域技术人员将理解，跨膜的流速受室的横截面几何形状影响。上面的流量范围基于10mmx40mmx0.08mm的室几何形状。在该实施例中，跨膜压力在约0.1psi(约0.69kPa)至约10psi(约68.95kPa)的范围内，可替代地在约0.5(约3.45kPa)至约6psi(约41.4kPa)的范围内。在短时间(例如约5至约10分钟)内，随着体积的减小细菌被浓缩。在一个样品被稀释的示例中(例如，在裂解培养基中将10mL的血样稀释到50mL的体积)，将10mL的稀释样品(约2mL的血液和8mL的培养基)减少到0.5毫升的体积(即减少约4：1)，其中细菌在与膜装置联接的收集室中分离出来。最终体积可以基于靶标浓度而变化，并且通常仅受装置死体积和由于较高比例的固含量随着粘度增加而继续移动流体的能力所限制。在一个实施例中，将分离的细菌样品铺在曙红-亚甲基蓝(EMB)板上，并孵育过夜。使用菌落形成单位(CFU)计数来确定细菌浓度和回收率。
在一个示例中，切向流过滤系统类似于膜装置600，其第一室几何形状为10mm×40mm×0.08mm。使用0.4μm的膜孔径。在流体流沿膜表面多次反向流动的往复流动模式中，以约3psi的跨膜压力以10mL/min的切向流速处理含有加标细菌(大肠杆菌)的10mL稀释的血样(2mL全血和8mL BACTEC培养基)。当截留物体积达到约0.5mL时停止该过程，并通过在曙红-亚甲基蓝(EMB)板上进行铺板并孵育过夜来收集截留物，以进一步确定细菌数。下表1示出了细菌的生存力不受往复多程切向流过滤过程的影响，并表现出良好的回收率。平均回收百分比基于从TEM装置中回收的平均细菌CFU计数来计算，如参考直接从差异裂解的血液溶液中采集的样品的计数(离心血液以收集细菌)。对于高于03CFU/mL的细菌浓度，本研究可实现约95％至100％的回收率。在输入全血的5CFU/mL的低加标浓度下，平均回收率为82％。损失可归因于由于死体积或由于少数微生物的生存能力的轻微损失而导致的装置中细菌的损失。低加标中仅有少数几种生物体的损失导致更大的可测损失，因为每种生物体代表的总百分比要高于滴度较高的样品的总百分比。
表1大肠杆菌细菌回收测试结果
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a细菌浓度基于全血量。对照样品取自血液培养瓶。结果为三个板数的平均值。
b将浓缩液铺在每个装置的三个EMB板上。
c将浓缩液铺在每个装置的一个EMB板上。
(2)阳性血液培养物中细菌的回收和分离
如前所述，寻求快速细菌鉴定和细菌的抗生素敏感性测试以提高治疗效率。常规测试程序需要在鉴定出阳性血液培养物之后进行漫长的传代培养步骤，以获取细菌以用于进行鉴定和抗生素敏感性测试。通过减少对冗长的传代培养步骤的需求，直接从阳性血液培养物样品中分离和冲洗细菌可以更快地得到结果。经由MALDI-TOF进行的抗生素敏感性测试和鉴定测试需要干净的细菌样品。为了获得可靠的测试结果，需要去除血液培养物中的本底成分，诸如细胞，细胞碎屑，盐，蛋白质和其他成分。另外，输出样品中的细菌浓度必须足够高，以便有足够的生物量(约108CFU/mL)用于MALDI-TOF的ID。快速鉴定(例如经由MALDI-TOF)和抗生素敏感性测试(例如通过微生物学或生化方法)的益处在于通过迅速从血液培养物中直接分离细菌并避免了如今广泛使用的传代培养步骤而增加。
切向流提取可用于使用膜装置100从样品中分离细菌。例如，在一个过程中，可以从阳性血液培养物中分离细菌。在这种方法的一个示例中，将10mL患者血样收集到BACTEC瓶中，并用细菌(诸如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌或其他细菌)接种。将样品在BACTEC血液培养仪中孵育，直到检测到阳性血液培养物。在从检测到的0-8小时内，将阳性血液培养物应用于切向流提取过程，在此过程中细菌将被分离和冲洗。再次参考图6A，类似于先前讨论的示例，膜装置600(或切向流提取装置)具有被轨迹蚀刻膜(TEM)630隔开的第一室610(例如，输入室或上部室)和第二室620(例如，输出室或下部室)。
阳性血液培养物沿第一室(例如，图1中的上部室；104)中的膜装置600中的轨迹蚀刻膜流动(以多程过程重复)，通过施加跨膜压力，部分液相流过轨迹蚀刻膜108(图1中的TEM)进入第二室(例如，图1中的下部室；106)。
使用膜装置600的切向流过滤的成功取决于针对靶标组分选择的过滤系统的若干相关参数。在该示例中，靶标组分为阳性血液培养物中的细菌。关键参数包括膜孔径、室几何形状、切向流速和跨膜压力。此外，待处理的样品在固含量、粒度分布和浓度、粘度、剪切敏感性、粘附于表面的倾向、生物结垢程度、凝结等方面可能会有变化。从大样品高效回收一系列潜在的不同细菌需要平衡许多参数。如果处理参数和几何形状选择不当，可能会在过滤过程期间出现诸如生物结垢、膜堵塞、靶标生物体的存活力降低、输出样品纯度低、处理时间过长或回收率低等问题。
在要保留靶标细菌的血液培养物的单级切向流过滤中，选择膜的孔径以防止细菌(通常具有约1μm至约2um的大小)穿过膜孔。选择膜的孔径以小于细菌的典型大小。然而，如果膜的孔径太小，将导致过滤过程缓慢，并可能在细菌的截留相中保留一些不希望的颗粒和碎屑。孔径很小的膜需要较大的跨膜压力来驱动过滤，因为随着孔径的减小，流动阻力通常会更高。如果膜孔径太大，过滤时间可能会缩短，但靶标细菌可能会穿过膜，从而降低回收率。
在切向流过滤中，通常选择切向流速和跨膜压力以提供成功和有效的过滤。所需的效率或目标效率不仅意味着靶标细菌的回收率高且纯度高，而且针对固定的过滤区域优化了过滤速度。较高的切向流速通常有助于防止膜表面上形成滤饼层或膜堵塞。选择跨膜压力以提供足够的过滤速率，但跨膜压力不会太大，以至于通过将颗粒物拉入膜孔(减小有效直径)或阻塞膜孔的入口而引起膜堵塞。当切向流速太低时，即使在跨膜压力低的装置中，也会发生这种堵塞。膜堵塞会大大降低切向过滤的效率，或者使过滤/纯化过程几乎不可能。如在阳性血液培养物中经常看到的，当样品的固含量和/或粘度高时，膜堵塞问题特别严重。
在切向流过滤中，室的几何形状是影响过滤性能的重要因素。在这种装置中通常有两个室，这些室由膜隔开。室高度、宽度和长度的选择会影响流体的流动阻力，从而影响切向流速、速度和有效的跨膜压力。对于固定的过滤区域(宽度X长度＝常数)，较高的室高度将产生较小的流动阻力。为了获得足够的流速以防止或最小化在膜上形成的滤饼层或膜堵塞，流速必须高于用于低室高度系统的流速。对于大多数应用，较小的室高度可在每次通过样品体积时提供更高的过滤效率。然而，在这种情况下，切向流动阻力增加，并且需要更大的压差来驱动沿膜表面的流动。较短的室长度和较宽的室宽度可以减小流动阻力。相反地，在样品入口处引入过宽的均匀流路使得保持流速具有挑战性。因此，对于特定的输入样品类型和输入体积，预期的过滤参数和性能需要适当的对应几何形状。
在一个实施例中，膜装置600的示例可具有约20mm×约42mm×约0.8mm的第一室几何形状，且TEM膜孔径在约0.2μm至约2.0μm的范围内。更优选地，TEM具有约0.4μm至约1μm的孔径。选择这样的孔径以将细菌保留在截留相中。将阳性血液培养物引入连接到仪器入口的贮存器。切向流由泵、注射器或压力源等提供动力。在该实施例中，动力源为蠕动泵，该蠕动泵能够进行再循环流动，从而允许样品以类似于图5的设置连续多次流过膜装置。
切向流速可以在10至90mL/min的范围内，并且更优选地在40至70mL/min的范围内。跨膜压力可以在0.5(约3.45kPa)至10psi(约68.95kPa)的范围内，并且更优选地在3(20.68kPa)至约8psi(55.16)的范围内。跨膜压力通过使用压力源、真空、泵、注射器或其他常规机构来施加。切向流沿膜驱动样品溶液，而跨过过滤器/膜的压力梯度产生动力，以驱动比膜孔径小的较小的组分或颗粒来穿过膜。随着过滤过程的继续，截留相的体积减小并且细菌变得浓缩。
为了减少样品中组分的数量，可以对样品进行预处理以去除某些组分，以减少膜结垢的机会。例如，当样品为阳性血液培养物时，在样品过滤过程之前去除阳性血液培养物本底中的血细胞。这可以通过预过滤来实现。在另一个示例中，在样品过滤过程之前，将阳性血液培养物的本底中的血细胞选择性地裂解。血细胞的选择性裂解可通过使用与阳性血液培养物溶解或混合的液体裂解缓冲液或干燥的裂解剂来实现。需指出，仔细选择差异性溶解剂至关重要，这样才能有效快速地裂解血细胞，而又不影响细菌的存活力或AST测试中它们对药物的反应。这种温和的裂解缓冲液对于技术人员而言是众所周知的，本文不作详细描述。可以通过用附加冲洗缓冲液(诸如去离子(DI)水)漂洗或冲洗来去除在阳性血液培养物的本底中溶解的盐、蛋白质等。可以根据需要重复此过程以纯化截留相，以满足MALDI-TOF测试的细菌纯度要求。细菌截留物可能添加了附加的裂解和冲洗缓冲液，以进一步减少可能对鉴定和抗生素敏感性测试结果产生不利影响的污染物。在一些实施方式中，将消泡剂添加到裂解缓冲液和/或冲洗缓冲液中以防止在过滤过程中形成泡沫，因为取决于细菌类型，许多阳性培养物可以在过滤过程中产生泡沫。在处理过程中形成的泡沫可能对处理过程和输出样品的质量有害。选择和使用的消泡剂的数量不会影响细菌存活力、MALDI-TOFID或AST测试中药物的敏感性。消泡剂对于本领域技术人员而言是众所周知的，本文不作详细描述。
为了测试本文所述的系统，使用单级切向流过滤对三种类型的BACTEC培养基中的8种不同细菌进行正向血液培养。测试的细菌为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，表皮葡萄球菌，粪肠球菌，肺炎克雷伯氏菌，铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌。使用的培养瓶为BACTEC标准瓶，BACTEC plus瓶和BACTEC裂解瓶。将血样(10mL)收集到相应的BACTEC瓶中，然后将其接种细菌菌种以模拟血容量中
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的细菌浓度。将样品在BACTEC血液培养仪中孵育，直到检测到细菌生长。在BACTEC中，通过监测氧气浓度、二氧化碳浓度中的一者的变化或被认为指示微生物生长的pH值的变化来检测生长。阳性培养物中典型的细菌浓度范围为约106CFU/mL至108CFU/mL。从BACTEC瓶中取出阳性血液培养物(约10mL)，并通过与10mL BACTEC裂解培养基(或其他适当的裂解缓冲液)混合来裂解。
传统上，这种混合通过用手将具有阳性血液培养物的容器从直立位置反复旋转到颠倒位置来手动进行。有时还可以通过流体药筒中的其他功能(诸如鲱鱼骨功能或使流体起泡)来实现这种混合。然而，这种方法完全在一次性药筒的流体路径之外。在本发明的一个实施例中，这种混合是自动化的，并且通过使用电机将一次性药筒从直立位置旋转到1-180°之间的旋转来完成。自动化减少了技术人员的工作时间，降低了人工成本。
将20mL裂解的混合物溶液输入到本文所述的切向流提取系统中。使用类似于如上所述的膜装置600的过滤装置。膜的截留物侧(即，如图所示的顶侧)上的切向流动室几何形状为宽20mm×长42mm×深0.08mm，膜孔径为0.8μm。切向流速为60mL/min。穿过过滤装置的样品流由切向流过滤室出口侧的蠕动泵提供动力。蠕动泵的输出以类似于图5所示的布置被反馈到附接到膜装置入口的样品贮存器。这样的布置允许流体样品在相同的过滤膜表面上连续多次再循环切向流。对室的渗透侧施加6psi的真空，以提供跨膜压力，该压力可使包含溶解成分或较小颗粒物质的样品的液相流过膜。随着过滤过程的继续，截留相的体积减小。由于细菌与液体样品组分分离，细菌被保留在膜上并被浓缩。当截留物体积减少到约2mL时，在继续过滤过程的同时，用2.5mL去离子(DI)水连续冲洗两次，然后使用5mL相同的裂解剂进行辅助裂解步骤。裂解试剂可能已经存在于PBC中，或已添加到该装置中。可以将试剂(例如去离子水，裂解试剂等)预装在装置上，经由从装置到试剂贮存器的流体连接手动或自动添加到仪器中。继续进行过滤过程，并使用另外四(4)次连续去离子水冲洗(每次2.5mL)以进一步去除不希望的成分。这些步骤从靶标成分(例如病原体)中去除不需要的样品成分(例如盐，细胞碎屑，血红蛋白等)，并将靶标成分悬浮在流体中，以便在装置中分离、纯化和/或浓缩后从该装置中回收。在最终的去离子水冲洗后，当截留物体积达到约1至1.5mL时，停止过滤过程，并收集分离的、纯化的和/或浓缩的样品来进行测试。由一系列细菌引起的鉴定和抗生素敏感性如图15所示。在图15的数据中，MALDI结果基于三个生物学复制品的平均值，每个生物学复制品具有三个技术复制品。AST结果基于三个生物学复制品的平均值。AST EA为抗生素敏感性的基本协议，并且指的是最小抑菌浓度(MIC)在参考方法MIC的两倍稀释范围内的条件百分比。AST CA为抗生素敏感性测试的分类协议，并且指的是易感性、中间性或耐药性解释与参考方法相符的条件百分比。对于AST EA和CA，根据产品说明书上的说明使用的参考方法为Becton Dickinson PhoenixTM方法。
根据对处理时间、样品纯度、体积限制等的要求，可以对上述过程进行修改，使其具有或多或少的冲洗步骤、或多或少的每次冲洗体积以及或多或少的附加裂解步骤。可以从上面描述的那些调整过程参数或几何形状以适合本文描述的方法/装置的特定用途。
(3)尿液样品中细菌的回收和浓缩
如前所述，膜装置100可以实现为单级提取，诸如在样品沿一个膜过滤器切向流动的情况下。可以以与关于先前的血样示例所描述的过程类似的过程来实施这种过程以用于从尿液中回收和浓缩细菌。以下示例说明了如何将切向流提取应用于尿液样品以进行细菌提取。采集尿液样品，并在接收前全部阴性培养。用于实现尿液处理的装置配置与前面提到的用于新鲜全血TEM浓度实验的仪器相同，其孔径约为0.2μm至3μm。在测试中，在使用膜装置进行浓缩过程之前，将尿液样品以浓度为56CFU/10mL的大肠杆菌加标。使用压力控制系统(例如从Fluigent获得的系统)在输入侧(膜装置的第一室)提供1psi至4psi的压力，以驱动多程切向流。由此在TEM装置上处理10mL样品，直到剩余体积达到0.5mL，将其回收并铺在EMB板上并培养过夜。总共使用了来自不同受试者的五个样品。在该初步测试中，在通过膜装置进行浓缩过程之后，尿液样品中的大肠杆菌初始浓度为5.6CFU/mL，大肠杆菌最终浓度为87CFU/mL。如表2所示，平均回收率为77％，浓缩倍数约为16倍。
表2：大肠杆菌加标尿液样品的TEM装置浓度的平均结果，N＝5
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在另一个实验中，尿液样品中细菌的浓度表明原始样品中细菌的浓度增加了10倍。与未浓缩尿液标本相比，使用TEM实现的加标尿液样品浓度检测β-内酰胺酶(抗生素抗性标记物)的检测速度快约4小时。结果在图6B的曲线图中示出(最上面的两条曲线示出了速度的增加)。
B.多级提取过程
如前所述，膜装置100可被实现用于多级提取，诸如在样品组分沿若干膜(诸如，每个级的膜具有不同的孔特性(例如，大小))切向流动的情况下。可以实施这样的过程以从新鲜或稀释的全血中进行细菌的回收和浓缩，甚至进行外泌体的提取和浓缩。
(1)两级外泌体的提取与浓缩
外泌体为在血液或尿液样品中发现的粒径在120nm至30nm之间的细胞外囊泡。它们被大多数细胞通过内体多囊泡复合体分泌，并通过递送RNA和蛋白质将信息传递给邻近或远端的细胞，从而影响各种生理和病理信号通路。由于外泌体可通过无创液体活检过程获得，并且具有潜在的诊断价值，诸如用于癌症检测，因此已被广泛研究。外泌体的提取已通过多种技术，包括使用超速离心的金标准过程、沉淀和基于亲和力或大小排阻色谱柱技术，来完成。这些技术可能是耗时、繁琐的过程，或者质量差或回收效率低。
本技术允许用于从生物样品中提取外泌体的新过程，诸如通过膜装置使用多级切向流提取。参考图7A和7B描述这种过程。对于图7A的第一级过程，从患者收集全血；从血液中分离出大颗粒，诸如红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。如图所示，该过程可通过使用如上所述的膜装置通过切向流提取以从较大的血液成分中分离血浆来实现。可替代地，可以代替常规离心来实现这种提取/分离。关于所示的切向流动过程，外泌体与蛋白质、肽和溶解盐等其他物种一起留在血浆中。可以使用诸如TEM的膜装置来实现这种血浆与血液的分离，该膜装置的孔径为约0.2μm至约1μm(如图7A所示为0.4μm)的量级。TEM可以夹在用于切向流的第一室(室704)和用于收集具有外泌体的血浆的第二室(室706)之间。施加跨膜压力以驱动血浆流过膜装置700A的膜708(例如TEM)(膜在室706处的输出侧)，同时将细胞和血小板保持在第一室(室704)中(膜在室704处的输入侧)。
如图7B所示的第二级可以用另外的膜装置700B实施以处理膜装置700A的输出(即渗透物)。该装置将在样品输入处(室704处的膜708的第一面)处理包含外泌体的血浆，并通过将溶解的物质(诸如蛋白质，肽，DNA等)去除到输出(膜708在室706处的第二侧)来分离输入侧的外泌体颗粒。提取可以通过使用由膜708(例如，TEM)隔开的第一室(室704)和第二滤液室(室706)组成的装置通过TEM切向流工艺来实现。膜孔径可以为0.1μm或更小(如图所示为0.05μm)的量级。血浆样品在第一室中沿轨迹蚀刻膜切向流动，并且通过施加跨膜压力，具有溶解盐和其他较小颗粒的液体流过该膜。该工程系统允许沿着(切向)和穿过(跨过)TEM(膜708)的平衡双向流动，其中外泌体被保留在膜的第一室(室704)侧并被富集。诸如在此级通过将冲洗缓冲液引入第一室来冲洗外泌体的附加过程并重复该过程等可以进一步纯化分离的外泌体。可替代地，可以在外泌体提取的第二级的开始或第二级的中间添加冲洗缓冲液。根据需要，可以重复冲洗过程。
可替代地，可以将附加的级添加到该过程中，以提取不同大小的外泌体和/或增加提取的外泌体的纯度。例如，在如上所述使用0.4μm孔TEM进行血浆分离的第一级和如上所述使用0.05μm孔TEM过程的第二级之后，可以使用带有膜的膜装置进一步过滤样品(例如，来自级2的截留物)，该膜具有约0.1或0.2μm的孔径以去除较大的颗粒。该第三过滤级也可以在第一级和第二级过程之间进行。
在使用具有0.05μm孔径的切向流TEM装置的图7B的第二级过滤的示例中，表征了血浆过滤速率并且被证实是可行的。下表3显示过滤速率随跨膜压力而变化。
表3
Figure BDA0003174842160000131
使用动态光散射(DLS)进行的粒度分析表明，提取的颗粒的流体动力学半径与外泌体的预期大小范围相匹配。在图8和9中示出了作为跨膜压力的函数的粒度分析。对于所有三个跨膜压力(3psi，6psi和9psi)，0.05μm孔径过滤后的滤液均表现出10nm左右的平均粒径。没有发现流体动力学半径大于50nm的颗粒。截留物的平均粒径约为100nm，这是典型的外泌体粒径。如图9所示，跨膜压力确实对收集在截留物中的平均粒度有一定影响。图8(截留物)和图9(滤液)示出了使用所述的两级过程而不是冲洗过程对提取的外泌体颗粒进行强度加权的流体动力学大小确定。
(2)对全血、稀释血液或阳性血液培养物的两级细菌提取
当从存在大量红细胞的全血中提取细菌时，可以使用多级过程(至少两级或更多级)来达到靶标物质(例如细菌)的纯度和浓度水平。例如，可以执行两级过程，其中第一级过程将从全血、稀释的全血或全血培养样品中去除大的细胞颗粒(例如，红细胞，白细胞或血小板)和较大的碎屑(如果血液裂解)。较大的碎屑为大于预定孔径的颗粒，其将允许细菌或其他靶标物质穿过膜。细菌保留在第一级过程中穿过膜的渗透相中。切向流和跨膜(过滤器)流的图示允许细菌穿过膜，如图13所示。
为了使细菌穿过膜装置，应使用孔径为细菌大小或更大的膜。已经发现，具有约2至约5μm的孔径的径迹蚀刻膜适合于该目的。如前所述，膜装置包括由膜(例如，TEM)隔开的第一室(输入室)和第二室(输出室)。施加跨膜压力以驱动细菌穿过膜(即进入渗透物)，同时将细胞和血小板保持在第一室(即截留物)中。切向流和跨膜流(如前所述)都可以由输入侧和/或输出侧的压力和/或真空源提供动力。切向流可以为单向流。单向流可以为第一室中的单程切向流或多程旋转流，诸如由流体泵提供动力的再循环流。
可替代地，切向流可以为往复流，在往复流的情况下，血流反转其方向，以允许流体多次流过同一膜表面，以有限的样品输入量驱动完成过滤过程，并减少膜结垢。
第二级过程可以将来自第一级的富细菌渗透物作为样品输入，并使用辅助膜(诸如用于在另一膜装置中切向流动的另一TEM)进行处理。该辅助TEM切向流过程使用具有通过孔径为约0.2μm至约1.2μm的TEM隔开的第一或上部室和第二或下部室的装置。由于来自第1级过滤过程的富细菌渗透物被用作第二级的输入样品，并且样品在上部室中沿轨迹蚀刻膜流动，因此液体通过施加跨膜压力来流过该膜。该工程系统允许沿着(切向)和穿过(跨)TEM膜的平衡双向流动，其中细菌在第一室中富集、保留并保持存活力。选择切向流速和反流流速，以防止由于诸如滤饼层形成或颗粒堵塞孔的现象而引起的膜结垢，以及优化样品处理时间，而不引入不希望的细胞成分的剪切或裂解。可以回收残留在第一室或上部室中的细菌，以进行下一步测试，诸如检测、鉴定或抗菌药敏试验。可选地，可以使用附加的冲洗以通过去除溶解的盐、蛋白质、核酸、肽、脂质等来进一步纯化样品，诸如使用一种或多种附加的膜装置。可以在浓缩过程的开始、期间或结束时引入冲洗缓冲液或其他合适的液体。加入缓冲溶液后可以重复浓缩过程，以达到靶标浓缩因子。
在这种过程的一个示例中，使用BD BACTEC裂解液(裂解血)和BD BACTEC标准瓶(非裂解液)中全血中的细菌评估了较大孔径TEM装置在多级过程中的第一级的性能，尽管可以使用其他类型的血液培养基。最初的筛选使用的径迹蚀刻膜的孔径分别为约2μm和约5μm。已经发现，血液中的大肠杆菌可以高效(>95％)穿过孔径为2μm和5μm的膜。在图10的曲线图中，绘制了细菌回收率，该图示出了裂解瓶(棒形图1024)和标准瓶(棒形图1022)都具有良好的细菌回收率。
选择膜孔径为约2μm的TEM装置进行另一项测试，以了解从阳性血液培养物样品中分离细菌中的血细胞的效率。通过在BACTEC标准瓶中孵育后使用大肠杆菌加标血液形成富含细菌的血样。单程TEM装置用于从阳性血液培养物中分离细菌。5mL富含细菌的血样通过真空源提供动力的单程过程进行处理。改变真空动力以研究跨膜压力对过滤过程后细菌回收和血细胞去除的影响。对回收的细菌溶液进行进一步分析，以确定残留的全血细胞计数(CBC)、无血浆血红蛋白和大肠杆菌浓度，以估算细菌悬浮液的纯度。下表4中的结果表明，随着跨膜压(TMP)的变化，渗透相中的渗透物产率、细菌回收率和残留的CBC变化不大。血浆/细菌相中唯一的残留物是一小部分血小板。这表明该过程具有相对较大的操作窗口。需指出，还进行了多程过程，其分离性能与单程过程类似。
表4
Figure BDA0003174842160000141
Figure BDA0003174842160000151
*低于检测下限
**在实验误差范围内
从上面可以明显看出，由于渗透物的含量低于检出限(LOD)，因此渗透物中的白细胞和红细胞非常少。对于具有较高跨膜压力的装置，渗透物的产量略高，而大肠杆菌的回收率略高。初步测试结果表明，从全血中分离细菌是可能的。
如上所述，切向流提取可以用作浓缩和冲洗过程，其将细菌与阳性血液培养物(全血样品或稀释的血样)快速分离，以进行鉴定和/或抗生素敏感性测试。在这种方法的一个示例中，将约8mL至约10mL患者血样收集到BACTEC瓶中，并用细菌(诸如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌和其他细菌)接种。将样品在BACTEC血液培养仪中孵育，直到检测到阳性血液培养物。在从检测到的8小时或更短时间内，将阳性血液培养物应用于切向流提取过程，在此过程中细菌将被分离和冲洗。类似于先前讨论的示例，膜装置600(或切向流提取装置)具有被轨迹蚀刻膜(TEM)630隔开的第一室610(例如，输入室或上部室)和第二室620(例如，输出室或下部室)。样品沿第一室(例如，图1中的上部室104)中的膜装置600中的轨迹蚀刻膜流动(如果使用多程过程，则重复进行)，通过施加跨膜压力，部分液相流过轨迹蚀刻膜108(图1中的TEM)进入第二室(例如，图1中的下部室；106)。过滤过程的第一级的孔径可以为约2μm至约5.0μm。选择这样的孔径以使细菌能够以渗透相穿过。在短时间(例如约0.5至约5分钟)内，处理了20mL的PBC样品，活菌处于渗透相中，宿主血细胞和碎屑处于截留相中。然后通过第二级处理第1级的渗透物(约17mL)。过滤过程的第二级可以具有约0.2μm至约1.2μm的孔径。选择这样的孔径以使细菌能够保留在截留相中。来自第1级的渗透物可以添加附加的裂解或冲洗缓冲液，以进一步减少可能对鉴定和抗生素敏感性测试结果产生不利影响的污染物。切向流沿膜驱动进料溶液(例如，来自第1级的渗透物)，这可以防止结垢，如本文中更详细讨论的，而跨过过滤器/膜的压力梯度会产生动力，从而驱动较小的组分或比膜的孔径小的颗粒穿过膜。在短时段内(例如，约10至约20分钟)，随着所需体积的减少，细菌被浓缩，以使所需的浓度水平达到必要的纯度。图16示出了通过该两级过滤过程处理的一系列细菌的鉴定和抗生素敏感性结果。在图16的数据中，MALDI结果基于三个生物学复制品的平均值，每个生物学复制品具有三个技术复制品。AST结果基于三个生物学复制品的平均值。AST EA为抗生素敏感性的基本协议，并且指的是最小抑菌浓度(MIC)在参考方法MIC的两倍稀释范围内的条件百分比。AST CA为抗生素敏感性测试的分类协议，并且指的是易感性、中间性或耐药性解释与参考方法相符的条件百分比。对于AST EA和CA，参考方法均使用Becton Dickinson PhoenixTM方法，该方法采用18-24次传代培养步骤。
(C)其他实施例
在另一个示例中，可以实现切向流膜装置技术，以提供采用两级过程的带通过滤溶液，该过程基于各种成分/组分的内在大小差异从样品中的较大和较小的成分中分离/提取出感兴趣的组分(诸如感兴趣的病原体)。过滤器通带，诸如图11所示的通带，保留了大的无关成分(例如血细胞)，而感兴趣的标本(细菌)和小碎屑则穿过了截留物。可以考虑与以下级相关的这种过滤过程：
1.高通滤膜装置。过滤的一级采用膜装置作为高通过滤器，该膜装置使样品的较小成分(诸如感兴趣的细菌)通过，而排除较大成分(诸如红细胞和白细胞)。高通滤膜装置使用的膜(例如，TEM)的孔径在大于约0.5μm且小于约8μm的范围内，诸如在约2μm至约5μm的范围内，以设置排除直径通常大于约5μm的血液成分的截止尺寸。
2.低通滤膜装置。在过滤的另一级，将膜装置用作低通过滤器。例如，随后通过用作低通过滤器的膜装置处理穿过高通滤膜装置的细菌和伴随的碎屑。低通过滤器使用具有选定直径孔径的膜(诸如TEM)来保留相对较大的细菌，并允许去除碎屑、分析物和废物。例如，对于低通滤膜，这种孔径可以为约0.4μm至约1μm的量级。
最终结果是以快速方式(例如，约5至约20分钟)将感兴趣的样品与血液本底分离，并准备用于下游过程，诸如鉴定测试、抗性标记测试、药敏测试、板涂、测量浊度、培养、测序和/或在微生物学、临床或研究实验室中常规执行的其他过程。
在图12的过程流程图中进一步示出了这种示例过程。在步骤1中，获得血液培养物。在步骤2中，将血液培养物应用于切向流膜装置，该装置会产生比过滤器尺寸小的样品组分渗透物，诸如3.0μm。可选地，在裂解步骤3中，可以将渗透物与裂解培养基混合。然后，在步骤4中，可以将渗透物施加到另一个切向流膜装置上，该装置会产生比过滤器尺寸小的另一组分的渗透物，诸如0.4μm，从而从感兴趣的截留物中去除较小的组分。在步骤5，从步骤4的截留物浓缩物中回收细菌。例如在图13中示出了用于这种过程的示例仪器。
(D)技术益处
如本说明书中描述的这种技术过程可以具有各种益处。例如，该技术可以促进直接从阳性血液培养物(PBC)进行鉴定和抗菌药敏试验，而无需进行进一步的传代培养，从而将结果产生时间缩短了约十八(18)小时或更长时间。缩短结果产生时间可对临床治疗决策产生重大积极影响，从而改善患者预后并节省机构成本。
当前处理PBC的方法包括传统的传代培养或离心技术。先前的尝试受到处理时间和复杂程序的严重限制。
可替代地，可以使用传统的离心技术直接从PBC中分离细菌以克服这种延迟，但是它们需要大量的离心和冲洗步骤才能获得准备用于下游ID/AST测试的纯化样品。
所提出的技术可以通过提供一种解决方案来克服此类方法的局限性，该解决方案可以在短时间内(诸如少于约15至30分钟)将感兴趣的样品与PBC分离，而无需进行多次离心或冲洗步骤，这既减少了取得结果的时间，又减少了繁琐的程序。此外，与离心方法不同，本技术可以容易地自动化以实现高通量处理。
以前使用过滤直接处理PBC的技术尝试传统上是依靠无端过滤技术。在无端过滤中，进料溶液仅垂直于膜驱动，并且所产生的压力用于迫使小于孔径的颗粒穿过过滤器。然而，大于孔径的颗粒会积聚在膜表面上，从而形成最终使过滤器结垢的滤饼层。克服此限制的常见解决方案是在过滤之前裂解和消化PBC样品，以尝试减小颗粒的总体尺寸以限制形成滤饼层。尽管先前的研究表明，裂解和消化样品对靶标微生物的存活力具有负面影响，从而影响下游ID/AST研究的性能，有效地阻止了现有技术尝试被采用。
所提出的如本文中所描述的技术可以依赖于切向流过滤，该切向流过滤提供了与无端过滤相比显著的优点，诸如防止过滤堵塞。当溶液沿膜切向进料时，切向流过滤(如本文详细描述)会持续冲洗过滤器，以防止结垢，诸如在多程操作中通过蠕动泵。它还可以提供重复过滤给定样品从而提高浓度同时避免堵塞的好处。结果，对于这种切向流过滤，PBC输入(裂解或消化的)可以更加灵活，从而进一步降低了复杂性并提高了性能。
如本文所述，具有带通滤膜装置的仪器可以启用切向流过滤(错流过滤)。如所描述的，切向流过滤(TFF)可以理解为一种过滤类型，其使进料溶液(样品)沿膜的表面切向地通过，而不是像无端过滤中那样仅直接垂直地通过。TFF的一个显著优点在于，切向流动的进料溶液可减少膜结饼和膜孔结垢，从而有效地提高性能和运行持续时间。溶液在相同表面积上的反复流动减少了靶标微生物向膜表面损失的机会，因为可以通过样品在同一表面上的多次通过来实现有效过滤。另外，由于样品相对于较大的内部表面积(如纤维膜)优先暴露于膜顶表面，因此与允许样品穿过纤维或其他较高内表面过滤器的厚度的方法相比，由于粘附于膜而减少了靶标微生物损失的机会。另外，诸如通过施加用真空或真空泵保持的负压差(例如，恒定的负压差)，形成垂直于膜的压差，该压差用作驱动小于膜上的孔的直径的颗粒的原动力。
所公开技术的示例可以通过使用例如带通方法基于大小的固有差异来分离样品成分，从而从PBC(或其他生物样品)中分离出感兴趣的细菌。该技术可以采用本文所述的多程切向流过滤。
可选地，使用切向流膜装置将一次性药筒用来将细菌与样品的其他部分分离。这种一次性药筒的一个示例的操作在图14A-K中描述。如图所示，在药筒基材(未示出)上形成的药筒800具有用于将样品从注射器或培养瓶(未示出)吸入药筒中并随后处理该样品的流体通道805。通过端口810从注射器或培养瓶中抽取样品。合适的端口810的一个示例为鲁尔接头。
通过滤网或多孔膜815抽取样品。选择过滤器或多孔膜的孔径以防止注射器或培养瓶中的树脂流入主室820中。过滤器或膜的孔径对于本领域技术人员而言是众所周知的，该孔径将选择性地阻止树脂穿过膜或过滤器，但允许其他样品组分穿过。设想膜的孔径在约25μm至约100μm的范围内，但是本领域技术人员可以选择另一种孔径，只要树脂粒径可以保证。树脂颗粒的直径通常至少约为10μm或更大，比其他样品组分成分(红细胞，白细胞，微生物污染(如果存在)等)大得多。
尽管被示为看似平面的布置，但是在一个实施例中，端口810、过滤器815和小瓶845在药筒基材(未示出)的一侧上，并且主隔室820、过滤器835、冲洗室830和用于图14A至图14K所示的过程和样品的其他成分在基材的相对侧上。
参考图14A，装置800处于其所有阀821、822、823、824、825和826都关闭的初始状态。当药筒处于此状态时，主室820中预装有裂解缓冲液，冲洗室830中装有冲洗缓冲液。适当温和以确保从生物样品中分离出的微生物污染保持存活力以进行下游分析的裂解缓冲液和冲洗缓冲液对于本领域技术人员而言是众所周知的，因此本文不再详细描述。
参考图14B，在将装置800安装在仪器(未示出)中之后，打开阀821以使流体路径805排气。这由流路859示出。将样品瓶(未示出)连接到端口，然后再次关闭阀821。
在图14C-F中，装置800从竖直位置(例如，图14B)旋转到侧位置(例如，图14C)。样品处理要求PBC培养瓶在某些步骤(即排气)中保持直立，在其他步骤(等分试样)时使其颈部略微朝下。
参考图14C，将装置800旋转到将样品(即，阳性血液培养物(PBC))吸入装置中的位置。在该位置，打开过滤器输出阀826，并通过管路860抽真空。运行泵855(例如蠕动泵)以在主室820中抽真空。如流路860所示，主室820通过真空歧管排放到大气中。在一些实施例中，可以从阳性血液培养物中自动等分约2ml-20ml的体积。当前，手工技术被用于等分小于2ml的体积并排出PBC瓶。通常通过在大气压下将针头(未示出)放入PBC瓶的隔膜中来进行排气。传统的等分装置使用带有针头的注射器或连接到针头系统的真空容器从培养瓶中取出样品。两种方法都适用于小体积，但由于瓶中缺少顶空，因此在抽取大体积时会遇到很大的困难。PBC瓶的颈部又长又窄，因此，当瓶直立时，正常的针长不会达到液位。为了克服这个问题，技术人员经常将瓶上下颠倒，以将流体转移到瓶的颈部。尽管此方法适用于大多数培养基类型，但瓶(诸如BACTECTM Plus瓶)中包含填充并沉淀在瓶颈部的树脂珠。如果技术人员试图在该位置使用普通注射器，则树脂珠会堵塞针头的尖端，从而阻止流体流动。如果技术人员以一定角度而不是上下颠倒地旋转瓶，他们能够从瓶中抽出1-2ml的液体，但仍然很困难。树脂珠会继续完全或部分堵塞针头。
本文所述的药筒解决了这些问题并有利于有利的工作流程。第一步，将PBC瓶附接到药筒。这通过参考图22B进行示例。此处，可以观察到瓶3010被插入端口3055中。在一个实施例中，PBC瓶3010以直立位置进入药筒2070。该端口3055包含含有消毒剂的材料(诸如海绵)。这是为了确保PBC瓶隔膜的表面不会污染PBC样品。当将PBC瓶3010压入消毒材料中时，一根针(未示出)刺穿PBC瓶3010的隔膜。然后，仪器致动阀(未示出)，并且使PBC瓶3010排气(例如，通过疏水性排气孔)。为了减少雾化的任何风险，提供了具有孔径(例如，约0.1-0.45μm)的疏水孔，以防止微生物污染(例如细菌)逸出系统，但允许PBC瓶3010释放真空或压力。
返回参考图14C，一旦旋转PBC瓶，暂停约1至120秒以使树脂珠沉淀在瓶的底部是有利的。可以使用一种仪器以将PBC瓶3010(图22B)/一次性装置800从竖立位置旋转到一个角度，在该角度下，瓶的颈部等于或小于与小电机(未示出)平行(例如0°-25°)。为了等分PBC瓶(图22B中的3010)，该仪器利用仪器泵送机构855(例如，真空，蠕动等)将约2-20ml的PBC瓶3010(图22B)的内容物吸入一次性药筒2070的主填充室820中。所有流体都保留在装置800中，并且不与仪器直接接触。抽吸体积由主填充室820的几何形状与自动填充传感器865结合定义，该传感器检测室何时填满并停止自动填充。当流体填充一次性装置中的主填充室820时，流体最终填充自动填充传感器850的电容式传感器前面的区域。一旦电容式传感器检测到流体，它将停止采样，仪器将PBC瓶3010(图22B)/装置800旋转回到直立位置。在该实施例中，主填充室820的体积限定了从样品瓶3010(图22B)抽取的等分试样的体积。为了防止任何树脂珠进入一次性装置800，将膜设置在壳体(未示出)内。当将来自PBC瓶3010(图22B)的样品吸入装置800(图14C)中时，膜通过侧向或通过流来过滤珠。
参考图14D，打开在线阀822和824中的装置800，并将传感器通道865中的裂解缓冲液吹入主室820中。然后关闭蠕动泵855，然后关闭过滤器输出阀826(图示为打开)。
参考图14E，然后操作装置800以通过流路870将PBC吸入主室820中。如上所述，膜815防止PBC中的树脂进入主室820。然而，剩余的PBC样品穿过膜815，以通过流路870进入室。打开阀822和824，打开真空875，以将PBC样品吸入主室820中。一旦PBC充分填满主室820，PBC将被吸入传感器通道865中。传感器850然后将关闭真空875并关闭阀822和824(图示为打开)。
参考图14F，然后将装置800旋转到直立位置。阀821、822、824和826打开，使空气通过阀821流入主室820中。PBC从主室820流过真空875抽出的过滤器835。如本文所述，来自样品的渗透物通过滤膜835流入废物室880中。携带微生物的截留物沿滤膜835切向流动。蠕动泵855将截留流体移回主室820中。
参考图14G，阀824和826被关闭并且冲洗室阀825被打开以允许冲洗缓冲液从冲洗缓冲室830流入主室820中。在该配置中，主室820通向大气。蠕动泵855被激活预定时间以计量进入主室820中的预定量的冲洗缓冲液。在将冲洗缓冲液添加到主室820中之后，装置800回收图14F中描述的配置，以进一步过滤主室820中的内容物。通过预定数量的过滤和清洗循环来控制装置的操作。当系统到达最后的冲洗循环时，蠕动泵855被激活较长的设置时间以确保冲洗室完全是空的。排空冲洗室，以便可以清除装置中的截留物，并如下所述提取截留物。
参考图14H，在第一净化级中，装置800将截留物从上述截留物流动回路纯化回主室820。在第一净化级中，蠕动泵855被激活以清除在过滤器835的出口与主室820之间的返回通道885。如上所述，在该级，冲洗室830是空的，并且阀825被打开并且通道被排气，从而净化通道885。
参考图14I，在第二净化级中，蠕动泵855被激活以清除过滤器835并将空气从提取瓶845中排出。在这种状态下，阀821、823、824和826被打开。在这种条件下，在提取瓶845内产生真空。小瓶845可以在该过程的其他级被抽空。在一个实施例中，当与系统组装时，小瓶处于真空状态。在另一个实施例中，小瓶可以通过真空管路排空。在该配置中，阀823和824打开，并且至少阀822和826关闭。
参考图14J，关闭蠕动泵855并且打开阀821、822和823，并且关闭所有其他阀。流路为从主室820到小瓶845。因为小瓶845处于真空状态，所以主室820中的截留物被吸入小瓶845中。
参考图14K，关闭装置800中的所有阀。将小瓶845从装置上拆下，并将其中的截留物用于微生物测试(或其他下游用途)。装置800的其余部分可以被丢弃。在这方面要注意的是，蠕动泵、小瓶和样品瓶都安装在装置上，但不是可消耗装置的一部分。该装置具有与蠕动泵相联的管道。然而，样品不会穿过泵本身，即使没有使用可消耗装置，也可以重新使用泵。
图17示出了台式仪器1600的30分钟处理时间，该台式仪器1600适于接收携带了先前描述的单级或多级切向流膜装置的一次性药筒。图17还示出了台式仪器1600如何可以与用于ID和AST样品评估的常规工作流程集成。台式仪器取代了对从阳性血液培养物中回收的病原体进行传代培养的需要。如上所述，从样品(例如，PBC)1610获得感兴趣的成分仅需要约30分钟，该感兴趣的成分为单级或多级膜装置中样品的来源。30分钟后，可以将分离的、纯化的和/或浓缩的感兴趣的成分(例如病原体)递送到鉴定仪器(例如MALDI-TOF)1640或用于抗生素敏感性测试(AST)的仪器1650。MALDI-TOF的结果可以立即获得。AST结果约需要6至14个小时。如果使用圆盘扩散1660执行AST，则结果可能需要8至24小时。如果在AST之前进行传代培养，则AST结果将再花费约18个小时。台式仪器避免了准备传代培养的需要。台式仪器可与革兰氏染色1620或纯度板1630并行使用，以鉴定微生物感染。
图18示出了台式仪器1700的基本部件，该台式仪器可以接收诸如来自阳性血液培养瓶1710的样品。台式仪器1700被配置成容纳一个或多个药筒1720，其可以包含本文所述的单级或多级切向流膜装置。药筒1720包括小瓶1730，该小瓶1730可以接收来自单级或多级切向流膜装置的分离的、纯化的或浓缩的感兴趣的成分(例如病原体)。小瓶1730可与药筒1720分离。药筒1720可以从仪器1700移除，然后被丢弃。在一个示例中，使用者将PBC瓶1710或PBC瓶1710的等分试样输入到药筒1720中，然后将药筒1720放置在台式仪器1700中。台式仪器1700自动处理样品以输出靶标样品成分(例如细菌)的悬浮液。如果靶标成分为细菌，则可以将分离的、纯化的和/或浓缩的样品用于ID和/或AST测试。如上所述，从PBC到开始ID和/或AST测试的时间仅约30分钟。仪器的尺寸是设计选择的问题，但是可以考虑典型的台座尺寸(例如，约微波的大小)。可替代地，台式仪器可以集成到自动化工作流程中，诸如BD KiestraTMTLA(整体实验室自动化系统)。台式仪器1700与当前的ID和AST仪器和方法完全兼容，因为该仪器输出用于那些仪器中的样品并且不需要对这些仪器进行修改。台式仪器1700被示为能够容纳三个药筒1720，但是台式仪器可以被配置成容纳更多或更少的药筒。该系统不需要监测，可以与自动或手动处理流程集成在一起，以准备用于ID和AST测试的样品。
当前，可商购的小瓶1730包含螺帽，并且在将其附接到一次性药筒1720之前以及在使用者使用注射器接近小瓶1730之前需要对帽进行手动灭菌。当前的瓶1710将需要用于将小瓶1730附接到一次性药筒1720以在处理期间保持定位的辅助方法。在本发明的一些实施例中，小瓶1730牢固地连接到药筒1720，从而防止使用者暴露，并且允许使用者一旦在生物安全柜下经由注射器或移液管就可以接近小瓶1730的内容物。在本发明的一个实施例中，小瓶1730的帽具有若干特征，包括以下说明性特征，这些特征可以彼此独立地存在：(1)帽可以包含海绵或其他包含消毒剂的材料。这样可确保将在拆卸过程中逸出的任何少量液体截留在海绵中并进行消毒。(2)帽还可以包含内置的隔膜，诸如橡胶隔膜，以使针头很容易刺穿并在拔出后重新密封。隔膜促进小瓶1730从药筒1720中释放，而没有溢出或泄漏的风险。(3)帽也可以拧成螺纹，以便一旦放在生物安全柜中就可以从小瓶1730上拧下。这为使用者提供了接近高浓度微生物样品的几种选择，并采取了安全措施以降低使用者的风险。(4)帽可以包含机械凹口，该机械凹口将输出瓶1730锁定到一次性药筒1720中，以确保在处理期间小瓶1730不会从药筒1720上移出。(5)系统1700可以对输出瓶1730抽真空。然后，该小瓶1730可以驱动流体流入小瓶1730中，作为处理的最后步骤。
图19A-F示出了用于处理PBC以分离、纯化和或浓缩PBC中的病原体的仪器的工作流程。在步骤1800(图19A)中，将包含本文所述的切向流膜装置的药筒1820放置在生物安全柜1830中。药筒1820用来自装置1810的PBC接种。在步骤1801(图19B)中，将药筒1820插入台式仪器1840中。药筒1820包含切向流膜装置，诸如本文图5和图13所示的那些装置。该PBC在药筒1820中被完全处理并且不进入台式仪器1840。台式仪器1840可以提供必要的压力以使PBC移动通过切向流膜装置，而不是从该装置接收PBC。在步骤1802(图19C)中，使PBC循环并再循环通过药筒1820中的切向流膜装置。此步骤约需要30分钟。在步骤1803(图19D)中，分离的、纯化的和/或浓缩的感兴趣成分(例如病原体)被收集到与药筒1820分离的小瓶1850中。在步骤1804(图19E)中，从台式仪器1840中移除药筒1820。需指出在步骤1805(图19F)中，该方法仅需要10至20mL的PBC，并且保留一部分PBC用于进一步测试或丢弃到生物危害废物中。药筒1820也是一次性的并且被丢弃。
图20A-D示出了将样品装载到药筒中的不同方式。在图20A的1900中，如上所述，将PBC容器1910接种到安全柜中的药筒1920中。在一种选项中，来自PBC的样品在进入系统之前，先在生物安全柜中分配到一次性装置中。在图20A的1901中，PBC容器1910在生物安全柜1925中时插入药筒1920中。然后，药筒1920将PBC容器1910携带到台式仪器1930中。在图20A的1902中，将PBC容器1910插入已经被保持在台式仪器1930中的药筒1920中。样品与台式仪器1930之间没有流体接触。在图20A的1903中，集成系统1940具有与切向流膜装置连通的血液培养容器。在这种配置中，不需要手动地将PBC容器1910与药筒1920接触，因为这种转移是自动发生的。图20B观察到一部分PBC(例如10mL或20mL)通过切向流膜装置进行处理，剩下一部分PBC用于其他用途。图20C-D还示出了切向流膜装置中使用的试剂1950(例如，上述冲洗缓冲液或裂解缓冲液)可以预先包装在药筒1920(图20C)中或与仪器1930(图20D)集成在一起。试剂与台式仪器1930的集成将需要与切向流膜装置的流体连接，因此不能提供室内容物与台式仪器的完全分离。
图21A-F示出了用于处理PBC以分离、纯化和或浓缩PBC中的病原体的可选工作流程。步骤2000(图21A)示出了一次性部件；药筒2010，其包含切向流膜装置，用于处理PBC所需的预填充试剂管2030以及用于获得PBC的等分试样以供处理的仪器2020。使用前，将一次性装置从任何包装中取出。步骤2001(图21B)示出了试剂管2030到药筒2010中的托盘2035的组装。这种组件使试剂管2030与药筒2010流体连通。在步骤2002(图21C)中，仪器2020用于从安全柜(未示出)中的PBC培养瓶2040中抽取所需的体积。仪器2020包括被示为注射器的可移除管2050，其然后经由其中的端口2051连接至药筒2010。端口2051提供与注射器的流体密封连接。在一个示例中，端口2051具有用于与注射器2050流体密封连接的鲁尔锁。2019年8月6日提交的美国临时申请号62/883,427和2019年9月27日提交的美国临时申请号62/907,060中公开了一种与注射器联接以从培养瓶中获取PBC等分试样的收集装置的说明性示例。两个申请均与本申请共同转让，并且两者均通过引用并入本文。
步骤2003(图21D)示出了装入仪器2060中的组装的处理装置2070，其中，仪器2060使用开关2061打开和关闭。在处理期间，迫使注入药筒2010中的样品穿过切向流膜装置(位于壳体2011中)，该切向流膜装置将感兴趣的成分(例如病原体)与其他样品组分分离。感兴趣的成分被收集到小瓶2080中，小瓶2080被放置在贮存器082中，该贮存器与放置在药筒2010内的轨迹蚀刻膜的渗透物侧流体连通。一旦处理完成，如步骤2004中所示，将组装的处理装置2070从仪器2060中移除(图21E)。最后，在步骤2005(图21F)中，已经收集到小瓶2080中的分离的、纯化的和/或浓缩的感兴趣的成分(例如病原体)与一次性并因此被丢弃的仪器2070分离。将小瓶2080从与生物安全柜(未示出)中的装置2070的流体附接中移除。
图22A-B示出了可以将PBC样品引入组装的处理装置2070中的不同方式。在3000(图22A)中，使用仪器3020将所需量的PBC(例如10mL)从培养瓶3010等分装到管3030中。如前面的示例中一样，在生物安全柜(未示出)中进行等分。在该示例中，容器3030为注射器，但是能够提供低于大气压的抽吸力以从培养瓶收集等分试样的PBC的任何替代管(例如BD
Figure BDA0003174842160000221
)被认为是合适的。然后，管3030经由端口2051流体地连接到组装的药筒2070。药筒在壳体3050中包含切向流膜装置。在不同的可选配置3001(图22B)中，PBC瓶3010经由端口3055直接加载到包含切向流膜装置3050的药筒2070上。在处理过程中，所需的PBC体积由处理装置2070从PBC瓶3010吸入，并由仪器(未示出)吸入设置在壳体3050中的膜装置中。如先前的实施例中那样，靶标样品分数从膜装置3050分配并通过药筒2010进入小瓶2080中。
图23A-C示出了可以供应试剂的可选方式。在选项4000(图23A)中，将试剂4020加载到仪器4010上，并且仪器4010将试剂4020分配到处理药筒(未示出)。仪器4010存储试剂以处理一个或多个PBC样品。在选项4001(图23B)中，通过将预填充试剂管4030接收到托盘4031中，将其附接到包含切向流膜装置4040的药筒2070上。在选项4001(图23B)中，PBC瓶(未示出)经由端口3055流体连接到药筒2070。在选项4002(图23C)中，将试剂4021预填充到药筒2070中，该药筒中在壳体4050中包含切向流膜装置。
尽管已经参考特定示例描述了本文中的技术，但是应当理解，这些示例仅是该技术的原理和应用的说明。在某些情况下，术语和符号可能意味着实施该技术不需要的特定细节。例如，尽管可以使用术语“第一”和“第二”，除非另有说明，它们并非旨在要求任何顺序，而是可以用于区分不同的元件。此外，尽管可以按顺序描述或示出方法中的过程步骤，但是不需要这样的顺序。本领域技术人员将认识到，可以修改这种排序和/或其方面可以同时进行，甚至可以同步进行。在本公开中，当提供范围时，应当理解，该范围可以包括该范围内的任何值以及限值。可以使用近似值，并将其理解为包括所有值均明显接近指定值(参考指定值的有效数字)。
因此，应当理解，在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对说明性示例进行多种修改并且可以设计其他布置。

Claims (63)

1.一种从生物样品中提取组分以用于浓缩所述生物样品中所需组分的仪器，所述仪器包括：
多个膜级，其中，所述多个膜级中的每个膜级包括：
具有第一侧、第二侧、第一端和第二端的膜，所述膜具有的特性在于：选择性地允许所述生物样品的一种或多种组分从所述第一侧到所述第二侧穿过所述膜，同时将所述生物样品的其他组分保留在所述第一侧处；
输入室，所述输入室具有靠近所述第一端的入口和靠近所述第二端的出口，所述输入室被配置在所述膜的第一侧处，以允许(a)所述生物样品在所述第一侧处沿所述膜的第一表面的从所述入口到所述出口的切向流，以及(b)所述生物样品的一种或多种组分从所述第一侧到所述第二侧的跨膜通过；以及
输出室，所述输出室被配置在所述膜在所述第二侧的第二表面处，并被配置为接收穿过所述膜的所述生物样品的一种或多种组分，
其中，所述多个膜级共同构成以分离所述生物样品的所需通带的组分。
2.根据权利要求1所述的仪器，其中，所述膜包括轨迹蚀刻膜。
3.根据权利要求1至2中的任一项所述的仪器，其中，所述膜由聚酯材料、聚酰亚胺材料、聚丙烯材料和聚碳酸酯材料中的任一种形成。
4.根据权利要求3所述的仪器，其中，所述特性包括从所述第一表面到所述第二表面穿过所述膜的多个孔的孔径。
5.根据权利要求4所述的仪器，其中，所述多个孔的孔径为被选择为分离所述生物样品的组分的开口宽度，所述孔径在约0.01至8.0微米(μm)的范围内。
6.根据权利要求5所述的仪器，其中，所述膜的孔径特征对于所述膜是基本均匀的。
7.根据权利要求4至6中的任一项所述的仪器，其中，所述多个膜级中的所述膜的多个孔的孔径为约0.03至0.40μm。
8.根据权利要求7所述的仪器，其中，所述多个膜级中的所述膜的多个孔的孔径为约0.03至8.0μm。
9.根据权利要求8所述的仪器，进一步包括压力源，所述压力源联接至所述入口或所述出口，并且被配置为引起所述生物样品沿着所述膜的第一表面的切向流动。
10.根据权利要求9所述的仪器，其中，所述压力源包括泵。
11.根据权利要求9所述的仪器，其中，所述压力源包括柱塞。
12.根据权利要求11所述的仪器，其中，所述压力源包括注射器。
13.根据权利要求9所述的仪器，其中，所述压力源包括蠕动泵。
14.根据权利要求9所述的仪器，其中，所述压力源包括加压室。
15.根据权利要求9所述的仪器，其中，所述压力源包括减压室。
16.根据权利要求9所述的仪器，其中，所述压力源包括真空。
17.根据权利要求1至2中的任一项所述的仪器，其中，所述入口和所述出口包括回路，并且其中，所述切向流为所述回路中的再循环流。
18.根据权利要求8至16中的任一项所述的仪器，其中，所述压力源联接至所述入口，所述仪器还包括附加的压力源，所述附加的压力源联接至所述出口，并且被配置为引起所述生物样品沿所述膜的第一表面的切向流。
19.根据权利要求18所述的仪器，其中，所述切向流为往复流。
20.根据权利要求1至2中的任一项所述的仪器，还包括压力源，所述压力源联接至所述输出室的出口并且被配置为引起所述一种或多种组分的跨膜通过。
21.根据权利要求20所述的仪器，其中，联接至所述输出室的出口的压力源包括泵。
22.根据权利要求20所述的仪器，其中，联接至所述输出室的出口的压力源包括柱塞。
23.根据权利要求22所述的仪器，其中，联接至所述输出室的出口的压力源包括注射器。
24.根据权利要求20所述的仪器，其中，联接至所述输出室的出口的压力源包括蠕动泵。
25.根据权利要求20所述的仪器，其中，联接至所述输出室的出口的压力源包括减压室。
26.根据权利要求20所述的仪器，其中，联接至所述输出室的出口的压力源包括真空。
27.根据权利要求1至2和17至19中的任一项所述的仪器，其中，所述仪器包括集成管，所述集成管包括所述多个膜级中的第一膜装置。
28.根据权利要求27所述的仪器，其中，所述集成管还包括联接至所述第一膜装置的输入室的样品容器，所述样品容器包括用于将所述生物样品提供给所述样品容器的出口或从所述样品容器接收截留物的入口中的至少一个。
29.根据权利要求28所述的仪器，其中，所述集成管还包括联接至所述第一膜装置的所述输出室的收集容器，所述收集容器包括用于向所述收集容器提供漂洗液并且可选地从所述收集容器中接收渗透物的入口或出口中的至少一个。
30.一种用于从生物样品中提取一种或多种组分以用于浓缩所述生物样品中所需组分的试剂盒，所述试剂盒包括：
包括第一膜级和第二膜级的多个膜级，所述第一膜级和所述第二膜级分别为权利要求1至2中的任一项所述的膜级；
其中，所述第一膜级的所述膜的特征孔径与所述第二膜级的所述膜的特征孔径不同，使得所述第一膜级和所述第二膜级共同地构成以分离所述生物样品的所需通带的组分。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，所述生物样品选自由阳性血液培养物、全血、尿液、脑脊髓液、唾液、呼吸道样品和伤口组成的组，其中，所述生物样品是完整的或稀释的，并且所述所需通带的组分为生物样品中的细菌。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，所述第一膜级的膜的特征孔径为约3.0μm。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中，所述第二膜级的膜的特征孔径为约0.40μm。
34.根据权利要求30所述的试剂盒，其中，所述生物样品选自由全血、尿液、脑脊髓液、唾液、呼吸道样品和伤口组成的组，并且所述所需通带的组分为所述生物样品中的外泌体。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中，所述第一膜级的所述膜的特征孔径为约0.40μm。
36.根据权利要求34至35中的任一项所述的试剂盒，其中，所述第二膜级的所述膜的特征孔径为约0.050μm或更小。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中，所述多个膜级还包括第三膜级，所述第三膜级为权利要求1至6中的任一项所述的级；并且其中，所述第三膜级的膜具有约3.0μm的特征孔径。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中，所述多个膜级还包括第四膜级，所述第四膜级为权利要求1至2中的任一项所述的膜级；其中，所述第四膜级的膜具有约0.10至0.20μm的特征孔径。
39.一种从生物样品中提取组分的方法，所述方法包括：
在第一提取过程中，通过压力使所述生物样品的一种或多种组分从所述第一膜的第一侧到所述第一膜的第二侧穿过第一膜，同时将所述生物样品的其它组分保留在所述第一膜的第一侧并且同时在所述第一膜的第一侧处沿着所述第一膜的表面产生所述生物样品的切向流；和
在第二提取过程中，通过压力使所述一种或多种组分的一种或多种额外组分从所述第二膜的第一侧到所述第二膜的第二侧穿过第二膜，同时将所述一种或多种组分中的一些保留在所述第二膜的第一侧并且同时在所述第二膜的第一侧处沿着所述第二膜的表面产生所述一种或多种组分的切向流；
借此所述第一提取过程和所述第二提取过程将所述生物样品的所需通带的组分与所述生物样品分离。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第一膜的特征孔径与所述第二膜的特征孔径不同。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物样品选自阳性血液培养物、全血、尿液、脑脊髓液、唾液、呼吸道样品和伤口，其中所述生物样品是稀释或未稀释的，和所述所需通带的组分是来自所述生物样品的分离的细菌。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述第一膜的特征孔径为约3.0μm至5μm。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二膜的特征孔径为约0.40μm至约1μm。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述生物样品是血液或尿液中的一种，和所述所需通带的组分是来自所述生物样品的分离的外泌体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述第一膜的特征孔径为约0.40μm至约1μm。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述第二膜的特征孔径为约0.050μm或更小。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，还包括：
在第三提取过程中，通过压力使所述生物样品的多种组分从所述第三膜的第一侧到所述第三膜的第二侧穿过第三膜，同时将所述生物样品中的一些保留在所述第三膜的第一侧，和同时在所述第三膜的第一侧处沿着所述第三膜的表面产生所述生物样品的切向流，其中所述第三膜具有约为3.0μm的特征孔径。
48.根据权利要求47所述的方法，还包括
在第四提取过程中，通过压力使所保留的一种或多种组分中的一些组分从所述第二膜的第一侧穿过，所述穿过为从所述第四膜的第一侧到所述第四膜的第二侧穿过第四膜，同时保留所保留的一种或多种组分中的一些，以及同时在所述第四膜的第一侧处沿着所述第四膜的表面产生所保留的一种或多种组分的切向流，其中所述第四膜具有约为0.10或0.20μm的特征孔径。
49.一种从阳性血液培养物中分离病原体的系统，包括：
a)具有第一入口和第一出口的输入室；
b)具有第二出口的输出室；
c)限定切向流路的过滤膜，所述过滤膜将所述输入室与所述输出室分隔开；以及
d)循环流路，其用于引导样品多次穿过所述过滤膜。
50.根据权利要求49所述的系统，其中，所述过滤膜包括轨迹蚀刻膜。
51.根据权利要求50所述的系统，其中，所述膜由聚酯材料、聚酰亚胺材料、聚丙烯材料和聚碳酸酯材料中的任一种形成。
52.根据权利要求49所述的系统，其被配置为药筒，其中，所述药筒包括：
接收样品容器的端口，其中，所述端口流体联接至所述药筒中的样品室，其中所述样品室流体联接至所述输入室的第一入口；
和其中所述输入室的第一出口流体联接至所述样品室，使得来自所述过滤膜的截留物再循环回到所述样品室。
53.根据权利要求52所述的系统，还包括用于所述样品室的填充传感器，其中，所述填充传感器在感测到预定填充条件时使样品收集停止。
54.根据权利要求53所述的系统，其中，所述药筒还包括流体联接至所述样品室的冲洗溶液容器。
55.根据权利要求54所述的系统，还包括出口端口，用于将截留物分配到附接到所述出口端口的收集容器。
56.根据权利要求55所述的系统，其中所述样品室流体联接到所述出口端口。
57.根据权利要求52所述的系统，还包括泵，以使所述截留物从所述输入室的第一出口再循环到所述样品室。
58.一种从阳性血液培养物中分离病原体的方法，所述方法包括：
使怀疑包含靶标病原体的血液培养物流入样品室；
使所述血液培养物流入过滤装置，其中所述过滤装置包括过滤膜，所述过滤膜将第一室与第二室分离；
使所述血液培养物切向流过所述过滤膜，使得如果所述靶标病原体存在于所述阳性血液培养物中，则所述靶标病原体作为截留物流经所述过滤膜并且通过所述第一室的第一出口，其中所述阳性血液培养物的具有小于预定阈值的粒径的部分流过所述过滤膜并且进入所述第二室；
使流过所述第一室的第一出口的所述截留物在所述过滤膜上再循环，借此所述血液培养物的进一步部分渗透通过所述过滤膜；
在再循环所述截留物预定量的时间后，通过使所述截留物与冲洗缓冲液结合来冲洗所述截留物；和
将冲洗的截留物收集在小瓶中用于下游测试，以确定所述截留物中的靶标病原体的存在与否。
59.根据权利要求58所述的方法，还包括在所述血液培养物流经所述过滤膜之前，将裂解剂添加至所述血液培养物。
60.根据权利要求58所述的方法，其中通过跨所述过滤膜施加压差使所述血液培养物的部分流过所述过滤膜。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述过滤膜包括轨迹蚀刻膜。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述膜由聚酯材料、聚酰亚胺材料、聚丙烯材料和聚碳酸酯材料中的任一种形成。
63.根据权利要求58所述的方法，其中通过将所述截留物从所述第一室的第一出口泵至所述样品室来引起所述过滤膜上的再循环。
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