CN101415482A - 用于化合物分离的切向流动过滤设备、系统和方法 - Google Patents
用于化合物分离的切向流动过滤设备、系统和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于从水性流体回收和纯化蛋白质、肽、核酸、生物制造的聚合物和其它化合物的设备、装置、系统和方法。水性流体可包括酶浓缩物和/或具有或不具有细胞或其它原材料的发酵液。可通过真菌、酵母、细菌、哺乳动物、昆虫或植物细胞的发酵产生发酵液。
Description
相关申请的交叉参考
[0001]本申请要求2006年3月31日提交的美国临时申请号60/788,125的优先权权益，其整体被引入本文作为参考。
介绍
[0002]本文使用的章节标题仅仅用于组织目的，而不应该被解释为以任何方式限制所描述的主题。
技术领域
[0003]本发明涉及用于从水性流体(aqueous fluid)分离、回收和/或纯化蛋白质、肽、核酸、生物制造的聚合物和其它化合物的设备、系统和方法。水性流体可包括具有或不具有细胞或其它原材料的发酵液。可通过真菌、酵母、细菌、哺乳动物、昆虫或植物细胞的发酵产生发酵液。
背景技术
[0004]微量过滤已被用于分离生物培养液或其它液体中的化合物。饮料工业已经使用微量过滤来净化(澄清)啤酒和白酒，在乳品工业中，微量过滤可被用于例如干酪乳清或奶的加工。微量过滤近来也被应用到生物技术工业，虽然对于产品的分离和纯化略微更加谨慎。一个实例是在Couto等的美国专利申请号US2004/0167320 A1中提供的，其中讨论通过切向流动过滤加工溶液，其能增强期望的分子从原料流的净化、浓缩和分馏。
[0005]Laustsen等的美国专利申请号US 20020020668 A1讨论源自发酵的产品的微量过滤过程，其包括在微量过滤过程之前或在微量过滤过程期间，将活性炭加入到源自发酵的产品的溶液中，微量过滤过程的温度从25℃至65℃。在WO2004/029076中，Christensen等讨论包括高温的微量过滤方法。
[0006]另外，关于微量过滤的信息可在科学文献中找到。实例包括但不限于V.Chen et al.，Journal of Membrane Science 125(1997)109-122；和L.Palacio，et al，Chemical Engineering(2003)35-41。
[0007]各种技术的主要缺陷是需要反复加入原料以完成过滤或分离。在转鼓真空滤器(RDVF)和压滤机/压膜机(membrane press)的情况中，助滤剂例如硅藻土或dicalite(一种过滤机预涂层)可被用来促进颗粒的分离，并且离心可利用絮凝助剂(盐或带电聚合物以增加粒度)使用差异颗粒密度来产生分离。这可明显增加生产成本，并且可能必须修改这些材料以提供允许通过的特定最大粒度。
[0008]一些方法可被暴露于环境，并且增加产物污染的风险以及操作者暴露于助滤剂、原料培养液和产物的风险。暴露的个体可能发生过敏或其它不良反应。因此，环境工程控制可能需要被设计和安装。此外，由这些技术产生的分离的蛋白质馏分与通过本文描述的微量过滤方法产生的馏分相比可具有大得多的粒度分布和更低的纯度。前述方法的描述可在科学文献例如W.Aehle，ed.：Enzymes inindustry：Production and Applications.Weinheim，F.R.D.，New York，2004，1-12中找到。
[0009]柱层析是可用于生物培养液纯化的技术。该方法可提供高度纯化的产物，然而，生产经济情况一般比上述方法高几个数量级，并且在所述方法没有重要调整的情况下，层析不能处理颗粒物，例如膨胀床柱。在需要高产量和低成本的产业中，膨胀床没有被广泛采用。
[0010]如先前提到的，微量过滤可以是用于生物培养液净化的方法。作为除去颗粒的方法，其也可被进一步使用在工艺级联中。微量过滤可以以切向流动过滤模式(TFF)应用，其也称为交叉流过滤，其中培养液以平行于膜表面的方向泵入，并且保持恒流。在切向流动方法中，许多变量是重要的，例如膜类型、装备设计、溶液性质、温度和操作条件。两个操作参数可以是跨膜压(TMP)和交叉流速度(CF)。跨膜压是推动选取成分通过过滤器孔的力。交叉流速度是液体沿膜表面的流速。其提供将较大分子和颗粒物扫离膜表面的力。这些成分可以是有机或无机的、溶解的聚合物或颗粒例如细胞或细胞碎片。这些成分可污损膜，从而降低该方法的功效。在TFF方法中，流动进料流从进料容器泵出沿过滤器中的膜表面(交叉流)，并且作为保留物(retentate)反馈到容器中。通过阀或夹应用到保留物管道的反压力产生驱动液体的跨膜压，小于膜孔的成分产生滤液或渗透物(permeate)。在本实践的微量过滤方法中，用于成功完成TTF方案的主要目标是优化TMP和CF，以便样品可以以高特异性被有效过滤，而没有产生污损膜的凝胶层。TMP可在整个过滤中被调整，或可在浓缩步骤期间被降低以保持较高浓度下的选择性。与超滤比较，在超滤中可期望形成界面层以提供均匀的孔径，以仅允许特定分子量截留以内的化合物通过，而微量过滤通常在低TMP下操作，以避免明显的凝胶或界面层形成。污垢层形成可引起期望化合物的通过减少。
[0011]本文描述的发明的实施方式尤其可在连续流动系统或间歇流动系统中使用TFF，其可适用于获得不同的、可选择水平的纯度和收率，这取决于需要。
发明内容
[0012]根据多种实施方式，提供多级过滤系统或设备用于以容易和有效的方式产生可区分的过滤产物。
[0013]根据多种实施方式，提供过滤，其具有多个流动互连过滤组件，所述组件包括第一组件和多个随后的组件，其中每个组件被设定为在过滤器附近为接收进料和稀释剂提供路径，以提供渗透物和保留物。第一组件在进口侧从系统外接收进料，随后的组件从系统内的在前组件接收保留物作为进料。至少一个组件具有渗透物收回流动管道(permeate withdrawal flow line)，用于从系统收回渗透物。多个组件具有渗透物流动管道，其被配置用于使渗透物反馈到系统内的同一组件或在前组件的进口侧。该系统允许增强控制由系统分离的渗透产物、保留物产物或两者的收集和纯化。每一过滤器可包括超滤膜或其它类型的超滤或微量过滤元件。过滤系统可以是切向流动过滤(TFF)系统。
[0014]根据各种实施方式，上面示例的过滤系统可包括第一组件和随后的组件，其每一个具有用于将渗透物再循环至同一组件的进口侧的渗透物管道。第一组件后的组件可进一步具有用于将渗透物反馈(backfeed)到系统内的在前组件的进口侧的渗透物管道。通过组合两个或多个组件的收回渗透物流，可以提供混合控制，以提供具有目标总纯度的产物。
[0015]根据多种实施方式，过滤系统具有控制系统，其可提供产物收率、产物纯度、净渗透速度和总流量之一的独立调整，同时保持其它三个变量接近不变。本文示例的系统的构造使其适于对这些操作参数的这种独立控制。传统的TFF装置和方法例如本文鉴别的方法，在过滤组件处不具有如本发明的各种实施方式提供的多渗透物流(即再循环、反馈、收回)，也没有独立控制它们的能力。正是这些多渗透物流和上述操作参数的控制可在本发明的各种实施方式中提供对工艺参数和产品质量更精确和可预测的控制。如本文描述的实例所示的，当使用相似进料时，与传统过滤系统(例如RVDF)产生的产品相比，本发明的系统和方法产生的产品具有提高的纯度和其它优良特性。
[0016]根据其它多种实施方式，过滤系统包括第一组件——其包括用于将渗透物再循环至第一组件的进口侧的渗透物管道，和第一组件后的组件——每一个组件具有用于将渗透物再循环至同一组件的进口侧的渗透物管道和将渗透物反馈到系统内直接在前组件的进口侧的渗透物管道，并且具有热交换系统以提高系统内的操作温度控制。热交换系统包括第一热交换器，其与第一组件的渗透物收回管道热接触；第二热交换器，其与随后的组件的至少一个渗透物反馈管道热接触；和冷却剂供应管道，其与第一和第二热交换器的至少一个流体连通。这些内部热交换(冷却)结构使控制过程的操作温度更容易，其又以一致和可重复的方式促进对收率、容量和/或产物纯度的控制。
[0017]根据其它多种实施方式，过滤系统的第一组件后的每一随后的组件具有渗透物侧出口，其具有进入系统内直接在前组件的进口侧的各自的渗透物反馈管道，和用于转移来自反馈管道的渗透物流的各自的放液管道(tap line)，用于从系统回收渗透物。在这个实施方式中，一个或多个随后的组件上的渗透物放液管道可被用来在一个或多个下游阶段抽出或排出(draw or pull off)控制量的渗透物。抽出渗透物(一种或多种)可被用于与系统的其它渗透物流——例如从第一组件和/或其它接下来的阶段抽出的渗透物——的混合操作，以便可使用TFF系统将成品的总纯度调节至期望值。
[0018]根据多种实施方式，就用于分离的驱动力而言(对于TFF系统为TMP)，过滤方法可提供独立进行每一阶段的能力，并且可提供控制过滤速度和纯度的能力。除非另有说明，术语“阶段(stage)”和“组件(module)”在本文可交换使用。
[0019]也提供使用过滤系统的过程和/或方法，以及该方法的产物。在本文描述的方法和系统中，应该理解，进口侧指过滤组件的保留物侧，出口侧指过滤组件的渗透物侧。
[0020]根据多种实施方式，提供工业规模、成本有效的方法，其可回收蛋白例如酶。该方法可使用微量过滤来从发酵液分离蛋白，从而减少工艺步骤和过程原料加入。与使用传统工业规模方法回收的蛋白产品相比，该方法可进一步得到具有高纯度、低气味、浅色和/或增加功效的高收率蛋白产品。
[0021]本文描述的系统和方法可被用于分离和/或纯化目的产物(感兴趣产物)。在多种实施方式中，可产生具有提高收率和提高质量的产品。然而，提高收率和提高产品质量并不必是本文描述的系统/设备/方法的必要条件。
附图说明
[0022]技术人员将理解下述的附图仅仅用于阐述的目的。附图不拟以任何方式限定本申请教导的范围。
[0023]图1阐明过滤方法的范围(谱)。
[0024]图2是传统微量过滤或TFF系统的简化图。
[0025]图3是阐述改良的TFF微量过滤设备或系统的本发明的实施方式的简化图。
[0026]图4是本发明的一个实施方式的示意图。
[0027]图5是本发明的另一个实施方式的示意图。
[0028]图6阐明从研究过滤参数的实验得到的数据。
[0029]图7阐明从研究过滤参数的实验得到的数据，其中在进料培养基中的宿主生物和酶是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α淀粉酶。
[0030]图8阐明从研究过滤参数的实验得到的数据，其中在进料培养基中的宿主生物和酶是里氏木霉(T.reesei)纤维素酶。
[0031]图9A和9B是提供就图4和5的系统而言的示例性操作实例的表，其阐明调节(增加)成品收率、成品纯度、净渗透速度和总流量的操作参数之一，同时保持其它三个参数基本不变的方法。
[0032]图10是图4的实施方式的示意图，其包括示例性的控制系统和整合于其中的工艺控制组件。
具体实施方式
[0033]应该理解下列描述仅仅是示例性的和解释性的。附图被引入并且构成本申请的一部分，其与说明书一起阐述了数个示例性实施方式。现在对不同的实施方式进行参考，其实例在附图中阐述。
[0034]整个申请中，多种实施方式的描述使用“包括”的语言，然而，本领域普通技术人员应该理解，在一些特定的实例中，实施方式可以可选地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”进行描述。
[0035]为了更好的理解本申请并且决不限定本教导的范围，本领域普通技术人员应该清楚，使用单数形式包括复数，除非另外明确表明。因此，术语“一”(＂a，＂＂an＂)和“至少一”在本申请中可交换使用。
[0036]除非另外表明，在说明书和权利要求书中使用的表示量、百分比或比例的所有数字和其它数值，被理解为在所有情况下被术语“大约”修饰。因此，除非表明相反，在下面说明书和所附权利要求书中提出的数字参数是近似值，其可根据寻求获得的期望特性而变化。在一些实例中，“大约”可被理解为意味着给定值±5％。因此，例如，大约100ml可指95-105ml。至少，每个数字参数应该至少根据报告的有效数字的数目并且通过运用普通的舍入技术来解释。
[0037]根据多种实施方式，提供方法——其提及涉及样品制备或其它过程的方法或行为。应该理解在多种实施方式中，方法或过程可以以所提供的过程的顺序实施，然而，在相关的实施方式中，为了完成期望的结果，在认为适当时，本领域普通技术人员可改变顺序。
[0038]生物培养液(broth)应该被理解指由生物有机体培养或发酵产生的原始的生物流体，所述生物有机体例如细菌、真菌、哺乳动物或昆虫细胞、或植物细胞。生物培养液可包含期望的产物、发酵培养基和细胞、或细胞碎片。生物培养液也可通过从生物样品例如植物物质或动物组织提取而得到，或可以指应用过程中间体，例如沉淀物、晶体或提取物。
[0039]细胞分离应该被理解指方法，通过该方法，细胞、细胞碎片和/或颗粒被除去以允许分离和回收期望的化合物并且净化培养液进行进一步的处理。细胞裂解过程可在细胞分离之前进行。
[0040]净化应该被理解指从溶液中除去颗粒物。
[0041]细胞糊(cell paste)应该被理解指过滤组件中保留物部分中的物质；通常，其指离开最后组件的保留物。
[0042]浓缩应该被理解指从培养液除去水，并且可以指例如在微量过滤、超滤、纳米过滤或反向渗透方法、色谱法、沉淀法和结晶中使用膜。也可通过蒸发技术完成浓缩。
[0043]浓差极化(Concentration Polarization)应该被理解指在膜表面上保留的分子(凝胶层)的聚集，并且可由下列因素的组合造成：跨膜压、交叉流速度、样品粘度和溶质浓度。
[0044]浓缩比(Concentration Ratio)可被理解为指流出组件的浓缩物或保留物除以流入组件的进料。
[0045]逆流(Counter-current)应该被理解指在其上游产生特定渗透物的位置(阶段)渗透物流反馈入保留物流。同样地，逆流可指渗透物流的多级反馈。逆流超滤方法被描述于：F.Lipnizki et.al，Desalination 144(2002)179-184。
[0046]应该注意，如本文使用的术语逆流不应与在血液透析中惯常使用的术语逆流混淆，其被描述于：S.Eloot et.al，Int.J.Artif.Organs(2004)205-13。
[0047]应该理解，逆流流动是多级方法，其中水、缓冲液或盐溶液可进入与含有期望化合物的液体流动相反的过程的第nth阶段、最后阶段或其它阶段，但是，当其移动至较早的阶段时，逆流流动可然后连续补充含有期望化合物的液体。
[0048]交叉流速度(Crossflow Velocity)应该被理解为指与保留物侧上膜表面平行流动的流体的速度。
[0049]渗滤(Diafiltration)应该被理解指分馏方法，通过该方法，较小的成分被冲洗穿过膜，在保留物中留下期望的较大的成分。其可以是用于除去或交换盐、缓冲液、除去洗涤剂、低分子量物质或改变离子或pH环境的有效技术。该方法一般可使用微量过滤或超滤膜，其被用来从混合物中分离目的产物，同时保持较大成分的浓度不变。渗滤可使用例如过滤渗透、水或缓冲盐溶液来完成。
[0050]进料(Feed)或进料流(Feedstream)应该被理解指在方法开始时含有蛋白质或其它目的分子的生物培养液或原料或原溶液，其也可以含有包括微生物、病毒和细胞片段在内的多种污染物。
[0051]术语流体以一般意义应用，除非在具体上下文中另外表明，可包括含有分散的和/或溶解的种类的液体物质、纯液体或其它可流动的物质。
[0052]流量或总流量是操作中渗透的总体积比除以膜的总面积，通常以每小时每平方米升来表示，例如升/m2/小时(lmh)。
[0053]污损(Fouling)应该被理解指膜中的孔被凝胶层、细胞块或细胞糊阻塞，或由于分子与膜孔的内部结合而阻塞。
[0054]分馏应该被理解指基于物理或化学部分(moiety)，分子的优先分离。
[0055]凝胶层或界面层应该被理解指化合物的微观薄层，其可在膜的顶部形成。其可通过堵塞或污损膜表面影响分子的保留，并因而减小流量。
[0056]微量过滤应该被理解指使用膜分离较大化合物和较小化合物的方法，例如，分离较高分子量化合物和较低分子量化合物。其可用于浓缩混合物，并且其功效通过因素例如分子量截断或孔径和过滤介质的类型、处理条件和被分离的混合物的特性来确定。较低分子量化合物可以比通过超滤分离的较低分子化合物更大。超滤和微量过滤能力之间的相对分离能力可被发现在图1中描述。当然，应该注意在两种过滤方法之间存在一些重叠。然而，本文描述的系统和方法可适用于所有的过滤，包括例如RVDF、压滤机和膜系统作为纯化系统(例如，UF膜)。在本发明中，微量过滤可被用来从生物流体例如发酵液分离大约0.05到10微米范围内的、大约0.1到8微米范围内的、和大约1到大约5微米范围内的悬浮颗粒。
[0057]分子量截断(分子量截留，MWCO)应该被理解指对超滤膜的尺寸(千道尔顿)的指示。MWCO被定义为被膜保留90％的球状蛋白质的分子量。
[0058]净渗透速度(Net Permeation Rate)是离开系统的渗透物的流速，典型地以升/分钟表示。净渗透速度是系统生产量或容量的度量。
[0059]通过或传输应该被理解指蛋白质/分子通过膜的运动。事实上，通过计算蛋白质/分子的渗透物浓度与保留物浓度的比值确定通过，其典型被表示为百分比。
[0060]渗透速度是每单位时间流过膜的渗透物的流速或体积，其典型被以升/分钟表示。
[0061]产物收率或收率是在产物流中收集的产物的总量，通常被表示为原料流中总量的百分比。在多种实施方式中，可以获得高收率的高纯度产物。在其它实施方式中，可以获得高收率的产物，然而，该产物可能具有较低的纯度水平，例如，如从过滤组件的保留物侧产生粗提物。
[0062]蛋白质、多肽或生物源聚合物应该被理解指生物或生物化学来源或体外方法中的分子。这些是由浓缩的氨基酸构件构成的，并且包括酶、结构蛋白和细胞衍生的聚合物例如纤维素、淀粉、多羟基丁酸和聚乳酸(盐)。
[0063]产物纯度或纯度是在产物流中产物分离的程度。其可被理解为指与在该流中其它成分的总量相比，分离的期望化合物的量，并且其可被表示为重量百分比。可选地，其可被理解为指产物的浓度相对于产物流中另一种选定的成分的浓度的比值，并且其可被表示为具有浓度除以浓度的单位的数。在多种实施方式中，例如通过测定酶活性(例如比色测定)；和/或通过吸光度测量、CIELAB公式或美国药典(USP)专著等测量产物颜色的产物颜色确定；和/或通过杂质水平测量(例如新制产物中微生物杂质的测定或作为贮存期研究的一部分)；和/或总蛋白含量或其它产物成分；和/或通过气味、味道、质地、视觉颜色等感官(例如在新制产物中或作为贮存期研究的一部分)，直接或间接地、用仪器或手动测量纯度。
[0064]排斥应该被理解指化合物不能通过过滤介质，例如因为在膜表面上凝胶或界面层的形成；化合物和膜表面之间的静电相互作用；或膜的孔径小。
[0065]切向流动过滤(Tangential Flow Filtration，TFF)应该被理解指方法，其中含有待被过滤分离的成分的流体混合物以多种速度切向于膜平面而流动，以最小化或限制凝胶层形成或污损。将进料以与膜表面平行的方向以恒流泵入。在这种过滤中，压降可沿膜组件的长度产生。该过滤以间歇方法以及连续流动方法适当进行。例如，进料可重复通过膜，而通过过滤器的流体被连续排出进入分离单元，或者溶液一次通过膜，并且通过过滤器的流体被连续向下游进行。δ压力或δP是沿进口侧上流程的压降，其可被定义为进口侧上进入压和排出压之间的差，如以psi或巴测量的。
[0066]跨膜压(TMP)应该被理解指引起流体或可过滤溶质流过过滤器的通过膜的压差驱动力。在切向流动系统中，最高的TMP在进口(流动通道的起点)，最低TMP在出口(流动通道末端)。TMP被计算为保留物侧上的膜组件加入和离开的平均压力，减去渗透物侧的压力，并且可被表达为压力单位例如psi或巴。因为流量可通常随着TMP变化而改变，流量有时被报告针对TMP标准化，例如，作为升/平方米/小时/巴(l/m2/h/bar)。
[0067]保留物应该被理解指没有通过膜的样品部分，也称为提浓物(浓缩物)。在TFF期间，保留物可被再循环，并且其是停留在膜的进料侧的混合物。
[0068]超滤应该被理解指方法，其使用膜分离高分子量化合物和低分子量化合物。其被用来浓缩溶液，其效力通过膜的分子量截断确定。超滤和微量过滤能力之间的相对分离能力可被发现在图1中描述。当然，应该注意在两种过滤方法之间存在一些重叠。超滤可被用来浓缩分子量大于1,000道尔顿、并且尺寸大于大约0.005微米并上至大约0.1微米的悬浮颗粒和溶质。
[0069]根据多种实施方式，本文描述的所有方法、设备和系统涉及蛋白质、多肽和生物学产生的聚合物以及小分子化合物的水溶液，其可以处于下列物质的混合物中：病毒或细胞(细菌、真菌、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物、昆虫、植物或嵌合体)、细胞碎片、残留培养基成分、宿主细胞产生的不期望的生物聚合物、和在培养基处理期间引入系统的污染物——其可在微量过滤准备中发生。方法、设备和系统也可被用于加工在期望分子的回收期间产生的进料流，例如沉淀物、含水提取物的溶剂和晶体浆(crystal slurries)。在多种实施方式中，过滤系统可包括过滤设备，然而，在一些实施方式中，对过滤系统的提及可与对过滤设备或过滤装置的提及相互交换使用。
[0070]根据多种实施方式，提供过滤系统，其可包括：可配置来接收进料流的系统进口；第一过滤组件，其包括第一进口侧和第一出口侧，其中第一进口侧可与系统进口流体连通；第二过滤组件，其包括第二进口侧和第二出口侧，其中第二进口侧可与第一进口侧流体连通；和第一可中断旁路，其可被配置来限定第二出口和第一进口之间的可中断的流体连通；和系统出口，其可与第一出口侧和第二出口侧的每一个流体连通。在多种实施方式中，系统出口可以与第一出口侧和第二出口侧的每一个可中断地流体连通。在多种实施方式中，第一过滤组件和第二过滤组件可包括切向流动过滤组件。
[0071]根据多种实施方式，系统可包括与第一可中断旁路热接触的热交换器；和/或与第一进口侧和第二进口侧的至少一个流体连通、或可与第一进口侧和第二进口侧的每一个流体连通的冷却剂供应管道。在多种其它实施方式中，系统可包括可以加热或制冷的温度控制器。
[0072]根据多种实施方式，系统可包括：第三过滤组件，其包括第三进口侧和第三出口侧，其中第三进口侧可与第二进口侧可中断地流体连通，并且其中第三出口侧可与系统出口侧流体连通；并且第二可中断旁路可被配置以在第三出口侧和第一进口侧与第二进口侧的至少一个之间提供可中断的流体连通。
[0073]根据多种实施方式，系统可包括可与第一可中断旁路热接触的第一热交换器，和可与第二可中断旁路热接触的第二热交换器。
[0074]根据多种实施方式，系统可包括可与第一和第二热交换器的至少一个流体连通，或者可与第一进口侧、第二进口侧、第一热交换器和第二热交换器的每一个流体连通的冷却剂供应管道。冷却剂供应管道可包括冷却剂除去部分，其用于将已经循环的冷却剂从系统转移。
[0075]根据多种实施方式，系统可包括进料流，并且系统进口可与进料流流体连通。进料流可包括可能需要被过滤、纯化或加工的酶培养液或任何流体。
[0076]根据多种实施方式，提供过滤系统，其可以包括：配置来接收进料流的系统进口；第一过滤组件，其包括第一进口侧和第一出口侧，其中第一进口侧可与系统进口流体连通；第二过滤组件，其包括第二进口侧和第二出口侧，其中第二进口侧可与第一进口侧流体连通；第一可中断旁路，其可被配置来限定第二出口侧和第一进口侧之间的可中断的流体连通；和系统出口，其可与第一进口侧和第二进口侧的每一个流体连通。在多种实施方式中，系统出口可与第一进口侧和第二进口侧的每一个可中断的流体连通。在多种实施方式中，第一过滤组件和第二过滤组件可包括切向流动过滤组件。
[0077]根据多种实施方式，系统可包括与第一可中断旁路热接触的热交换器。
[0078]根据多种实施方式，系统可包括与第一进口侧和第二进口侧的至少一个流体连通、或者可以与第一进口侧和第二进口侧的每一个流体连通的冷却剂供应管道。
[0079]根据多种实施方式，系统可包括可与第一可中断旁路热接触的第一热交换器；和可与第二可中断旁路热接触的第二热交换器。在多种实施方式中，热交换器可与一个或多个可中断旁路热接触。
[0080]根据多种实施方式，系统可包括可与第一和第二热交换器的至少一个流体连通的，或者可与第一进口侧、第二进口侧、第一热交换器和第二热交换器的每一个流体连通的冷却剂供应管道。在多种实施方式中，热交换器可与系统的一个或多个进口侧或其它部分热接触。
[0081]根据多种实施方式，系统可包括进料流，并且系统进口可与进料流流体连通。进料流可包括可能需要被过滤或加工的酶培养液或任何流体。
[0082]根据多种实施方式，提供过滤系统，其可包括：可与流体处理途径流体连通的储蓄器(reservior)；至少第一流动过滤组件和第二流动过滤组件，其中第二流动过滤组件可包括渗透物出口，并且第一流动过滤组件可包括渗透物反馈进口；多个泵和阀门，用于泵送和调节流体样品流过流体处理途径；和与第一和第二流动过滤组件和储蓄器流体连通的多个导管，其可至少部分限定流体样品流过的流体处理途径，其中可配置流体处理途径以使渗透物再循环通过至少第一和第二流动过滤组件，其中第二流动过滤组件的渗透物出口可与第一过滤组件的渗透物反馈进口连通，并且来自第一流动过滤组件和第二流动过滤组件至少一个的渗透物可离开系统。在多种实施方式中，第一流动过滤组件和第二流动过滤组件之间的流体连通进一步可包括，用来在反馈入第一流动过滤组件之前，任选从第二流动过滤组件除去渗透物的旁路。在多种实施方式中，系统可包括至少一个附加流动过滤组件。系统可进一步包括渗透物在重新进入过滤组件之前可能穿过的附加容器和泵。
[0083]根据多种实施方式，第一流动过滤组件和第二流动过滤组件的每一个可包括切向流动过滤组件。
[0084]根据多种实施方式，系统可包括导管，其限定流体洗涤流的途径，所述途径与流体处理途径分开并且不同，每一导管与储蓄器和第一流动过滤组件与第二流动过滤组件的每一个流体连通。
[0085]根据多种实施方式，系统可包括冷却系统，并且冷却系统可与流体处理途径热接触。在多种实施方式中，通过限定冷却流途径——与流体处理途径分开并且不同——的导管可限定冷却系统，导管可与第一流动过滤组件和第二流动过滤组件的每一个流体连通。冷却流途径中的冷却流可包括液体例如渗滤液体。
[0086]根据多种实施方式，第一流动过滤组件和第二流动过滤组件的每一个可包括如此膜，该膜适合从混合物分离目的种类，同时标准化的流量被保持在大约0.1到大约200L/m2/hr/巴，并且其中保持流动过滤组件在0.1巴到60巴的TMP下。术语“巴”被定义为压力单位，相当于105Pa。常规压力可被考虑在大约0.1到大约1.5巴的范围内，然而，该范围可以根据例如被过滤的蛋白或被使用的过滤介质而改变。高压可被考虑起始于大约1.5巴以上至大约2.0巴。本文描述的设备和方法可在常规压力和/或高压下进行。在多种实施方式中，设备和系统可从大约0.1巴到大约60巴、从大约0.1到大约50巴、从大约0.1巴到大约40巴、从大约0.1巴到大约30巴、从大约0.1巴到大约20巴、从大约0.1巴到大约10巴、从大约0.1巴到大约5.0巴、从大约0.5巴到大约60巴、从大约1.0巴到大约60巴、从大约1.5巴到大约60巴、从大约2.0巴到大约60巴、从大约2.5巴到大约60巴、从大约3.0巴到大约60巴、从大约3.5巴到大约60巴、从大约4.0巴到大约60巴、从大约4.5巴到大约60巴、从大约5.0到大约60巴、从大约1.0巴到大约10巴、从大约1.0巴到大约5巴、从大约5巴到大约10巴、从大约10巴到大约30巴、从大约30巴到大约60巴、或60巴以上操作。
[0087]根据多种实施方式，过滤系统可包括多个传感器，用于获得关于流体样品当流过流体处理途径时的数据。在多种实施方式中，过滤系统可包括能至少接收、传输(发射)、处理和记录与泵、阀门和传感器操作相关的数据的电子数据处理网络，并且在流动过滤处理期间收集的记录数据可以是充分广泛的，以便控制流动过滤处理。
[0088]根据多种实施方式，提供过滤系统，其包括：储蓄器；多个过滤组件，每一过滤组件包括样品室；多个导管，其连同储蓄器和多个过滤组件一起，限定引导流体样品的流体处理流，其中流体处理流与冷却流和清洁流分开并且不同；导管，其连同多个过滤组件和储蓄器一起，限定流体处理流；流体处理流，用于使渗透物再循环通过多个过滤组件中的至少两个；多个泵和阀门，用于泵送和调节流体样品流过流体处理流；多个导管，其连同冷却源和多个过滤组件一起，限定引导冷却流体的冷却流，其中冷却流与流体处理流和清洁流分开并且不同；多个泵和阀门，用于泵送和调节冷却流从冷却源流入多个过滤组件的至少一个的室中；多个导管，其连同储蓄器和多个过滤组件的至少一个，限定引导清洁流体的洗涤流，其中清洁流与冷却流和流体处理流分开并且不同；和多个泵和阀门，用于泵送和调节清洁流从储蓄器流入多个过滤组件的至少一个的室中。
[0089]根据多种实施方式，冷却流可包括渗滤流体。
[0090]根据多种实施方式，流体处理流可包括与第一过滤组件的渗透物反馈进口流体连通的第二流动过滤组件的渗透物出口，并且系统适合从第二过滤组件收集渗透物，或既从第一过滤组件又从第二过滤组件收集渗透物。
[0091]根据多种实施方式，第一和第二过滤组件之间的流体处理流可包括旁路，用于在进入第一过滤组件之前从第二流动过滤组件任选地除去渗透物。
[0092]根据多种实施方式，系统可包括切向流动过滤系统，并且过滤组件可以是切向流动过滤组件。
[0093]根据多种实施方式，多个流动过滤组件的至少一个可包括适合从混合物分离目的种类的膜，同时标准化流量被保持在大约0.1到大约200L/m2/hr/巴，并且保持流动过滤组件在大约0.1巴到大约60巴的TMP下。
[0094]在多种实施方式中，过滤组件可由控制器控制。控制器在调节过滤方法的各种参数中可起作用，所述参数例如纯度、收率、TMP、CF、净渗透速度或流量。系统也可包括帮助系统调控的阀门。适当的控制方案可基于过滤或纯化目的化合物的需要而确定。
[0095]根据多种实施方式，过滤系统可包括多个传感器，用于获得关于流体样品当流过所述流体处理流时的数据。在多种实施方式中，系统可包括能至少接收、传输、处理和记录与所述泵、阀门和传感器、检测器的操作相关的数据的电子数据处理网络，并且在所述切向流动过滤处理期间收集的记录数据可以是充分广泛的，以便确定对切向流动过滤处理的控制。
[0096]根据多种实施方式，检测器可包括能测量流速、压力、浓度、pH、导电率、温度、浊度、紫外吸光度、荧光、折射率、渗透性、干固体、近红外线或傅立叶变换红外线的检测器。这些检测器可被用于监控和控制过滤过程的进展和安全性。
[0097]根据多种实施方式，过滤系统可包括由与冷却源和多个过滤组件的至少一个流体连通的热交换器规定的第二冷却流，其中第二冷却流可适合于任选地防止冷却流与多个过滤组件的至少一个连通，但是仍旧允许冷却流在热交换器和冷却源之间流动。
[0098]根据多种实施方式，提供过滤系统，其可包括：可配置来接收进料流的系统进口；第一过滤组件，其包括第一进口侧和第一出口侧，其中第一进口侧可与系统进口流体连通；第二过滤组件，其包括第二进口侧和第二出口侧，其中第二进口侧可与第一进口侧流体连通；冷却剂供应管道，其可与第一进口侧和第二进口侧的每一个流体连通，其中冷却剂供应管道不与热交换器热连通；系统出口，其可与第一出口侧和第二出口侧的每一个流体连通；和附加的系统出口，其可与第一进口侧和第二进口侧的每一个流体连通。
[0099]根据多种实施方式，系统可包括可以是切向流动过滤(TFF)组件的过滤组件，并且系统或设备可以是TFF微量过滤设备或TFF过滤系统。设备可被设计或改变以使阶段或各个步骤在针对渗滤的特定控制设定点下操作，以便得到产物和副产物的高水平纯化控制。
[0100]产物的纯化可包括大约10％至大约25％纯度、大约25％至大约50％纯度、大约50％至大约75％纯度、大约75％至大约90％纯度、大约90％至大约95％纯度、大约95％至大约97％纯度、或大约97％至大约99％纯度的目的产物。
[0101]纯的或基本上纯的可以指，蛋白质、核酸或其它化合物从其天然环境移出或从混合物分离或分开，并且不含与其天然相关的其它成分，以百分比基础计。例如，60％纯的酶制备物可包括60％的目的酶和40％的其它成分，例如，其它蛋白质或细胞碎片。
[0102]根据多种实施方式，系统可包括TFF微量过滤设备，其可被设计或改变以允许在针对渗滤物再循流的特定控制设定点下操作TFF系统的阶段或各个步骤中的每一个，以便实现产物和副产物的高水平纯化控制。
[0103]根据多种实施方式，系统可包括TFF微量过滤设备，其可被设计或改变以允许在针对浓缩比的特定控制设定点下操作TFF系统的阶段或各个步骤中的每一个，以便实现产物和副产物纯化的高水平控制。
[0104]根据多种实施方式，系统可包括TFF设备，可操作该设备从二到十个阶段、或十个阶段以上的连续渗透物反馈。
[0105]根据多种实施方式，TFF设备可使用膜元件操作，膜元件为一个元件到25个元件，和多至500个元件，在过滤器组件内，其在组件内连续或平行排列。
[0106]根据多种实施方式，TFF设备可使用聚合的、陶瓷的或不锈钢类型材料操作，而不论其结构，例如螺旋形、管状、空心纤维、平板等，但不限于这些材料。
[0107]可被用于系统或方法的膜中的各种膜材料的实例可包括：聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚醚砜、聚芳基砜、再生纤维素、聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、乙酸纤维素、聚丙烯腈、乙烯基共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、或它们的混合物或类似材料。
[0108]根据多种实施方式，系统可包括TFF微量过滤设备，其被设计或改变以便每一阶段或步骤易于自动化，并且自动化可产生自动控制系统，然而，在其它实施方式中，自动化可能不产生自动控制系统。
[0109]根据多种实施方式，TFF设备可根据本文描述的方法使用。TFF设备在低和高操作压力下都可具有以高回收收率分离分子、化合物、和/或颗粒的能力，这用传统设备例如转鼓真空滤器(RDVF)、压滤机或死端式膜滤器不能实施。高回收收率指大约80％和以上的收率。在其它实施方式中，收率可低于80％，从大约60％至大约80％、从大约40％至大约60％或从大约20％至大约40％。如上面提到地，在多种实施方式中，制备物可既具有高收率又具有高纯度；或具有高收率和低纯度。
[0110]根据多种实施方式，TFF设备可纯化具有不希望产物性质的产物流，所述不希望产物性质包括但不限于气味、颜色或污染物。纯化产物中的其它感兴趣的性质也可被除去或减少或增加。
[0111]根据多种实施方式，TFF系统可包括机械设备以在与传统系统相比相等或降低制造成本下制造可区分的产品。在其它实施方式中，TFF设备可减少与传统技术相关的几个化学步骤、过程和/或程序，并且也产生优异的(可区分的)产品。例如，与传统方法或产品相比，本发明的装置/设备/系统的一个实施方式有助于去除3个处理步骤，减少对设备的暴露和人员，并且提高效率7％以上。通过容量、收率、成本和/或流量提高的组合，可限定效率。在多种实施方式中，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，产品的纯度也通常提高4％以上、特别地10％以上、更特别地50％以上(如活性与总蛋白比率增加所限定的)，其中在这些范围内活性的升高百分数可根据具体的酶而变化。在其它多种实施方式中，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，本发明的TFF产物具有3％以上、特别地10％以上、更特别地50％以上的活性/氮的升高。在其它多种实施方式中，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，本发明的TFF产物具有5％以上、特别地10％以上、更特别地50％以上的活性/碳的升高。在其它多种实施方式中，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，提供酶源的微量过滤的渗透产物，其至少具有40％的颜色降低，其中颜色基于使用分光光度计在470和/或520nm处测量的吸光值。
[0112]根据多种实施方式，TFF系统可包括设备，其对于渗透产物和保留物产物的至少一个产生可区分的产品质量。在其它系统或用其它方法制造的物质相比，渗透物中的可溶成分或溶质可具有非常低的气味或没有气味，和高纯度(例如，期望成分更高程度的分离)。保留物中的不可溶的成分可具有较低的气味和改进的颜色。在多种实施方式中，有关于上述性质，从渗透物制造的组分可区别于使用传统微量过滤方法制造的相同化合物。
[0113]根据多种实施方式，TFF系统可包括设备，其通过减少例如原料应用、功耗和/或可再循环的废物流，增加过滤或纯化方法的可持续性(sustainability)(超过传统纯化方法)。
[0114]多种参数可影响和控制本文描述的系统和方法的收率、纯度、流量和净渗透速度。
[0115]六个示例性TFF操作参数和控制关系如下：1)组件的表面积或数量可影响净渗透速度；2)渗滤流速可影响纯度、净渗透速度、收率和流量；3)跨膜压可影响流量、净渗透速度、纯度和收率；4)交叉流速度可影响流量、净渗透速度、纯度和收率；5)组件类型具有特定的物理性质，其可满足待被实施的分离的流量、净渗透速度、收率和纯度需要；和6)基于进入系统的注射点，渗滤位置可影响流量、净渗透速度、收率和纯度。
[0116]这六个参数对TFF系统性能的影响可根据进料、渗滤溶液、膜元件和产物化合物的具体特性和它们之间的相互关系而变化。
[0117]除了上述操作参数以外，多种实施方式可具有来自每一组件的渗透物的三个流动(图4和5)。三个渗透物流的联合操作可帮助控制流量、净渗透速度、收率和纯度。传统的TFF系统将不具有全部三个渗透物流，也不能独立控制它们。这三个渗透物流和上述六个操作参数的控制可对包括产品质量在内的过程结果提供更特定和独立的控制。
[0118]根据多种实施方式，TFF系统可包括机械设备，其能够使工作环境更安全，因为其可被完全包起，并且可减少或消除雇员对有害物质的暴露(超过传统纯化方法)。
[0119]本文描述的设备、装置和系统可用于各种方法或过程。方法不限于微量过滤方法，然而，微量过滤方法通常在示例性实施方式中被引用。
[0120]根据多种实施方式，微量过滤方法可与超滤方法结合，所述超滤方法可包括单级或多级逆流方法或其它过滤方法。在多种实施方式中，微量过滤方法可与其它回收方法，例如结晶、离心、蒸发和柱层析结合。
[0121]根据多种实施方式，提供过滤方法，其可包括：使进料液体流过进料导管(feed conduit)进入第一过滤组件的进口侧；使渗滤溶液通过与进料导管分开的第一渗滤导管流入第一过滤组件的进口侧；在第一过滤组件中，将进料液体和渗滤溶液分成第一保留物和第一渗透物；使第一保留物通过保留物导管流入第二过滤组件的进口侧；使第二渗滤溶液通过第二渗滤导管流入第二过滤组件的进口侧，而没有使第二渗滤溶液流过任何其它过滤组件；在第二过滤组件中，将第一保留物和第二渗滤溶液分成第二保留物和第二渗透物；和收集第一渗透物和第二渗透物的至少一个。在多种实施方式中，被过滤或纯化的流体在重新进入过滤组件或系统之前，可通过分开的容器和泵。
[0122]根据多种实施方式，该方法可通过多个附加的过滤组件重复过滤液体，其进一步包括：使保留物从第一过滤组件、第二过滤组件或一个附加的过滤组件中的一个或多个流入另一个过滤组件；使渗滤溶液从与进料导管分开的导管流入附加的过滤组件的一个或多个；按需要使一个或多个渗透物或保留物反馈或再循环以在渗透物或保留物中得到期望水平的成分纯度；和收集具有目标成分的渗透物或保留物。在多种实施方式中，目标化合物或成分可以是蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白、其它生物聚合物或小分子化合物。
[0123]在多种实施方式中，化合物可包括治疗性蛋白质，例如，抗体、酶活性蛋白治疗剂(酶)和激素。它们也可包括，例如，结构蛋白例如胶原蛋白、弹性蛋白和相关分子。激素可包括但不限于促卵胞激素、促黄体激素、促肾上腺皮质激素释放因子、生长抑素、促性腺激素、血管升压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。治疗性蛋白质可包括但不限于生长因子，其为与细胞表面上受体结合的蛋白质，主要结果为活化细胞增殖和/或分化；血小板衍生生长因子；表皮生长因子；神经生长因子；成纤维细胞生长因子；胰岛素样生长因子；转化生长因子等。
[0124]根据多种实施方式，可通过工业规模的方法生产酶。可以使用任何酶，酶的非限定性列表包括肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶(α或β)、葡糖淀粉酶、纤维素酶、肌醇六磷酸酶、脂酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶、漆酶、其它氧化还原酶和它们的混合物。
[0125]在一些实施方式中，回收的酶是水解酶，其包括但不限于蛋白酶(细菌、真菌，酸性、中性或碱性)、淀粉酶(α或β)、脂酶、纤维素酶和它们的混合物，例如，以下列商品名出售的酶：Genencor International(USP 4,760,025和WO 91/06637)出售的
和；Novo Industries A/S(Denmark)出售的
和
[0126]纤维素酶是水解纤维素中β-D-糖苷键的酶。纤维素分解酶传统上被分为三个主要类型：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶(J.Knowles et al.，TIBTECH(1987)5：255-261)。纤维素酶的实例是
BGL，其可从Genencor International获得。纤维素酶可以从种类例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、青霉菌属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、芽孢杆菌属(Bacillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、嗜热单孢菌属(Thermomonospore)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和肉座菌属(Hypocrea)。多种纤维素酶已被描述于科学文献中，其实例包括：来自里氏木霉(Trichodermareesei)，S.Shoemaker et al.，Bio/Technology(1983)1：691-696，其公开CBHI；T.Teeriet al.，Gene(1987)51：43-52，其公开CBHII；M.Penttila et al.，Gene(1986)45：253-263，其公开EGI；M.Saloheimo et al.，Gene(1988)63：1 1-22，其公开EGII；M.Okada et al，Appl Environ Microbiol(1988)64：555-563，其公开EGIII；M.Saloheimo et al.，Eur J Biochem(1997)249：584-591，其公开EGIV；和A.Saloheimoet al.，Molecular Microbiology(1994)13：219-228，其公开EGV。来自非木霉属的种类的外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶也被描述，例如，Ooi et al.，1990，其公开编码棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)产生的内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；T.Kawaguchi et al.，1996，其公开克隆和测序编码来自棘孢曲霉的β-葡糖苷酶1的cDNA；Sakamoto et al.，1995，其公开编码来自白曲霉(Aspergillus kawachii)IFO 4308的内切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；和Saarilahti et al.，1990其公开来自胡萝卜欧文菌(Erwinia carotovara)的内切葡聚糖酶。
[0127]蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶或酸性蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白酶将是丝氨酸蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶)。丝氨酸蛋白酶在本领域是公知的，并对下面的文献进行参考：Markland et al.，Honne-Seyler′s Z Physiol.Chem(1983)364：1537-1540；J.Drenth et al.Eur JBiochem(1972)26：177-181；美国专利号4,760,025(RE34,606)、5,182,204和6,312,936，以及EP 0 323，299。测量蛋白水解活性的方法公开于K.M.Kalisz，＂Microbial Proteinases＂Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology，A.Fiecht Ed.1988。
[0128]木聚糖酶包括但不限于来自里氏木霉的木聚糖酶和来自里氏木霉的变体木聚糖酶，它们都可从Danisco A/S，Denmark和/或Genencor International，Inc.，Palo Alto，California获得；以及来自黑曲霉(Aspergillus niger)、白曲霉(Aspergilluskawachii)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Neocallimastixpatriciarum、变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)、热紫链酶菌(Streptomycesthermoviolaceus)、褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)、哈茨木酶(Trichodermaharzianum)、里氏木霉、绿色木酶(Trichoderma viride)的其它木聚糖酶。
[0129]肌醇六磷酸酶的实例是Finase ，来自曲霉属各种的肌醇六磷酸酶，可从AB Enzymes，Darmstadt，Germany获得；PhyzymeTM XP，来自大肠杆菌(E.coli)的肌醇六磷酸酶，可从Danisco，Copenhagen，Denmark获得，和来自例如下列种类的其它肌醇六磷酸酶：木霉属、青霉菌属、镰刀菌属(Fusarium)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、青霉菌属、腐质霉属、芽孢杆菌属和隔孢伏革菌属(Peniophora)。
[0130]淀粉酶例如可以来自种类如曲霉属、木霉属、青霉菌属、芽孢杆菌属例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。适合的真菌淀粉酶衍生自曲霉属例如米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)。蛋白酶可以来自解淀粉芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及曲霉属和木霉属各种。
[0131]上述酶名录仅仅是实例，而不拟为全部的。例如，其它产酶宿主生物可包括毛霉属各种(Mucor sp)、克鲁维酵母属各种(Kluyveromyces sp)、罗威亚酵母各种(Yarrowia sp)、支顶孢属各种(Acremonium sp)、脉孢菌属各种(Neurospora sp)、毁丝霉属各种(Myceliophthora sp)和梭孢壳属各种(Thielavia sp)。任何酶可被用于本发明，包括细菌、真菌、植物和动物源的野生型、重组体和变体酶，以及酸性、中性或碱性pH-活化酶。
[0132]根据多种实施方式，本方法也可被用于纯化生物学产生的聚合物，例如聚乳酸、多羟基丁酸(polyhydroxybutiric acid)和相似的化合物。然而，方法或设备决不拟被限定于上述聚合物的制备或加工。
[0133]根据多种实施方式，本方法也可被用于纯化生物学产生的小分子化合物，例如维生素(例如抗坏血酸)、乙醇、丙二醇、氨基酸、有机染料(例如靛青染料)、营养品(例如甜菜碱和肉碱)、调料(例如丁酸丁酯)、香料(例如萜类)、有机酸(例如草酸、柠檬酸和琥珀酸)、抗生素(例如红霉素)、药物(例如他汀类药物和紫杉醇)、抗氧化剂(例如类胡萝卜素)、固醇和脂肪酸。然而，方法或设备决不拟被限定于上述小分子化合物的制备或加工。
[0134]渗透物、保留物或细胞糊中目的成分或化合物的期望纯度可以从大约25％至大约100％。在多种实施方式中，目的成分的纯度可以从大约5％至大约25％纯、大约25％至大约50％纯、从大约50％至大约75％纯、从大约75％至大约90％纯、从大约90％至大约95％纯、从大约95％至大约97％纯或从大约97％至大约99％纯。
[0135]根据多种实施方式，来自从过滤组件之一的渗透物可以再循环(反馈)入先前的过滤组件的保留物中。在多种实施方式中，来自冷却源的液体可被直接泵入至少两个过滤组件的保留物中，而没有在先的多个过滤组件之间的冷却液体再循环。
[0136]根据多种实施方式，方法可包括运行多级逆流流动，并从2个到大约20个过滤组件过滤样品。
[0137]根据多种实施方式，方法可包括使渗透物或保留物流过一个或多个附加的过滤组件。在多种实施方式中，第一过滤组件可包括膜，并且方法可包括保持跨膜压为从大约0.1巴至大约60巴、从大约2巴至大约10巴，或保持跨膜压在大约60巴以上。在多种实施方式中，跨膜压可在过滤组件中测量。
[0138]根据多种实施方式，方法可包括使液体流过第一过滤组件。液体可包括水、盐、缓冲液和洗涤剂溶液的至少一个。在多种实施方式中，方法可包括液体逆流流动通过至少一个过滤组件。
[0139]根据多种实施方式，逆流液体可包括洗涤剂溶液，并且洗涤剂溶液可包括从大约1％至大约25％的氯化钠以及硫酸钠、磷酸钠和缓冲液的至少一个。
[0140]根据多种实施方式，方法中过滤或分离步骤的至少一个可在从大约1℃至大约100℃、从大约1℃至大约25℃、从大约25℃至大约50℃、或从大约50℃至大约75℃、或从大约75℃至大约100℃的温度下进行。在多种实施方式中，过滤或分离步骤的至少一个可在从大约pH1至大约pH14、从大约pH2至大约pH10、从大约pH3至大约pH9、从大约pH4至大约pH8或pH5-pH14的pH下进行。
[0141]根据多种实施方式，在方法中，第一和第二过滤组件的至少一个可包括陶瓷过滤器、不锈钢过滤器、中空纤维过滤器、管状过滤器、螺旋形过滤器、平板过滤器或其它过滤器结构的至少一个。在多种实施方式中，过滤器可具有从大约0.02微米至大约0.05微米、0.05微米至大约10微米、从大约0.05微米至大约0.5微米、从大约0.5微米至大约1微米、从大约1微米至大约5微米、从大约5微米至大约10微米或从大约10微米至大约100微米的过滤孔径。
[0142]根据多种实施方式，在方法的不同阶段之间的孔径可以是相同的，或者在阶段之间可能不同。
[0143]多种切向流动过滤组件结构是本领域普通技术人员已知的。几种类型被描述于专利文献中，例如在美国专利号6,054,051、美国专利号4,761,230、美国专利号5,096、美国专利号5,256,294和美国专利号5,525,144中，所有这些整体引入本文作为参考。另外，流动过滤组件是商业可获得的，例如，＂Pellicon XL＂和＂Pellicon 2＂TFF柱(cartridges)(可从Millipore Corporation of Bedford，Mass.01730获得)；以及＂Centramate＂、＂Centrasette＂、＂Maximate＂和＂Maximate-Ext＂TFF柱(可从Pall Corporation of East Hills，N.Y.11548获得)。
[0144]根据多种实施方式，方法可包括优化系统参数。系统参数可包括温度、进料流流速、跨膜压、进料流浓度和渗滤体积的至少一个。进料流速度的范围可从大约1cm/sec到大约500cm/sec。进料流浓度可按认为适当的那样而变化。渗滤体积的范围可以为保留物体积的大约1倍到大约100倍。
[0145]根据多种实施方式，方法的进料流体可从生产生物体或生产细胞获得。生产生物体可以是病毒、细菌或真菌。生产细胞可包括原核或真核细胞。在多种实施方式中，生产细胞可包括细菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、植物细胞或来自先前提到细胞的细胞系。细胞系可包括哺乳动物、鸟、两栖动物或昆虫的细胞。可用目的DNA或其它核酸转化或转染细胞，以便细胞表达目的生物聚合物。细胞转化和/或转染的方法是本领域公知的，并且可见于例如美国专利号7,005,291，其整体被引入本文作为参考。
[0146]在多种实施方式中，进料液体可从非转化或非转染细胞或其它来源获得，所述其它来源例如动物或植物组织，这样从来源获得的进料液体可流过多级-过滤设备。在多种其它实施方式中，进料液体可从转基因细胞或生物体获得，例如转基因动物。方法的结果可独立于作为进料液体进入方法的起始材料或原料。可将方法应用于从植物或动物物质和过程中间物得到的培养液，或最终的产物形式——可包括晶体浆、沉淀物、渗透物、保留物、细胞糊或提取物。
[0147]根据多种实施方式，细菌生产生物体可来自任何细菌种类，例如芽孢杆菌各种、链霉菌(Streptomyces)各种或假单胞菌(Pseudomonas)各种，例如得自枯草芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Pantoea citrea、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、赤色链霉菌(Streptomycesrubiginosus)或产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。
[0148]根据多种实施方式，保留物可包括细胞糊，方法可包括收集细胞糊。
[0149]根据多种实施方式，微量过滤方法可在能形成凝胶或界面层的跨膜压下操作。压力的范围可为从0.1到大约60巴。该范围的下限可通过选择膜系统来确定。
[0150]根据多种实施方式，该方法可以以连续流动模式、间歇模式、逆流模式或被认为适当的模式的各种结合而进行。在逆流模式中，渗透物流可被反馈入过滤组件的各个阶段的进口侧。
[0151]在另一个实施方式中，该方法在完全封闭的设备中操作，因此消除暴露风险和设计环境控制的需要。
[0152]在另一个实施方式中，该方法保留物，即浓缩的细胞和细胞碎片，可含有很少或不含有环境有害的化合物例如合成的絮凝剂，并且可因此进行再循环或处理掉，而不需要特殊的环境处理措施。
[0153]根据多种实施方式，该方法可产生具有提高产品质量的产品，例如但不限于较低气味、较低颜色、较高或较低浓度。
[0154]在多种实施方式中，渗滤溶液可被更有效的使用，因为其可被用来多次提取化合物。第一次提取后，其可携带一些化合物，然后越来越多，直到渗滤溶液离开系统。通过控制其离开系统的位置(例如，哪一阶段)，可控制膜的保留物侧或渗透侧上的化合物的纯度。
[0155]根据多种实施方式，在传统方法使用的相似的过滤条件下——除了跨膜压，与使用相对较低跨膜压的传统方法得到的收率和产物纯度相比，使用本文描述的方法可以得到更高的收率和更纯的产物。
[0156]低TMP微量过滤技术中的分离原理与本文描述的高TMP微量过滤技术可以相似，然而，低TMP可导致较低的产品质量。这可能是由于低TMP处理一般必须在较低的压力下进行，这样界面层过滤效果较不显著的事实。
[0157]本文描述的TFF微量过滤方法可以在较低的制造成本下产生较高质量的产品。通过在膜的表面上形成流体动力层(hydrodynamic layer)(凝胶或界面层)，可以得到较高的纯度。该层可由于较高的跨膜压形成。产生的较低传送和在较高的压力下较高的化合物排斥可由独特的逆流设计弥补，这样其能提供产生经济可接受方法的总收率。本文描述的逆流设计可增加收率，因为其可使得渗滤溶液更有效地被应用。当与传统TFF相比，这能允许实现化合物的更好的分离，并可导致更大的回收收率和纯度。
[0158]上面描述的方法可以使用逆流和渗滤的结合，但是不仅仅限于膜相关的方法，尽管其最通常以这种方式应用。也可应用多种分离技术(旋转式真空鼓过滤器(rotary vacuum drum filter)、压滤机、压膜滤器(membrane filter press)、层析分离、滗析器、由密度或极性变化引起的相分离等)代替单一的膜阶段。图3图解加入渗滤溶液以及从不同阶段除去渗透物的不同选择，用于分离目的分子。
[0159]在多种实施方式中，本发明提供使用微量过滤设备系统从生物培养液分离蛋白质、多肽和生物学产生的聚合物以及小分子化合物的方法，并且本文描述的方法可提供成本有效的资本设置(capital installation)、成本有效的操作、提高的产品质量、高产物收率、消除大多数或所有细胞分离原料消耗、使操作人员对潜在有害化合物的暴露最小化、和再循环液体流用于有用的用途。
[0160]本文描述的方法与传统方法或系统相比，也可提供更高水平的产物纯度。
[0161]根据多种实施方式，本文描述的设备、系统和方法可使用生产细胞或其它物质裂解后得到的流体。裂解方法是本领域公知的并被描述于例如美国专利申请公开200/0014245中，其全部被并入本文作为参考。
[0162]TFF，以及其它过滤方法，可被用来分离不同尺寸的不同的分子(或颗粒)。使用多种压力和过滤器孔径截断，可分离宽范围的分子或化合物。不同的TFF方法对于拟被分离或纯化的期望分子和/或颗粒的不同粒度范围可以具有特异性。如在图1中阐述的，微量过滤(MF)、超滤(UF)、纳米过滤(NF)和反向渗透(RO)可被用来分离或纯化分子量或尺寸范围分别为0.1-10μm、0.005-0.1um、100-1000道尔顿分子量和0-500道尔顿分子量的分子(或颗粒)。这些范围可有些变化，如在图1下面指出的。
[0163]本文描述的设备、系统和方法的特征与它们达到高收率的蛋白质、多肽或生物学产生的聚合物以及小分子化合物，同时容许通过过滤膜的期望化合物的低通过的能力相关。在多种实施方式中，本文描述的设备、系统和方法可提高与期望化合物通过路径——其中系统使渗滤溶液流过该系统——的低通过相关的低收率。
[0164]在多种实施方式中，方法可将渗滤溶液——其包括水或另一种稀释液——引入如图3阐述的系统的最后的阶段(第三阶段)，其中渗滤溶液与从前面阶段得到的保留物结合。然后，一部分期望的化合物通过膜，并且该渗透物，例如蛋白质的稀释溶液，然后可被泵入第2阶段，并且作为渗滤流体与从第1阶段得到的保留物结合。因此，进入第二阶段的这一混合物可包括比替代性地加入新鲜渗滤溶液更多的期望化合物。然后，来自第2阶段的渗透物可被泵入第1阶段，并且与来自MF进料罐的进料结合。因为蛋白质在进料中，并且也被来自第2和第3阶段的反馈渗透物所携带，极大地富集了产物化合物例如蛋白质的渗透产物作为第1阶段渗透物现在可离开系统，并且从系统被除去。
[0165]控制产品纯度的其它方法可由在系统内的不同进入点提供渗滤溶液而产生。获得最高纯度水平的一个方式将是在严格逆流模式中操作，所有渗滤溶液进入最后的阶段，如在前一段描述的。如果需要的纯度水平较低，渗滤溶液可被引入一个或多个阶段和按需要从这些阶段除去渗透物，以便达到期望的纯度。纯度控制过程可结合两个前面用作独立方法的渗滤方法——但以在以前没有应用的结合方式，以便获得“自定义(custom)”水平的纯度。
[0166]图2和3表明在传统MF装置和本文描述的TFF微量过滤设备/装置/系统之间的流动差异。在多种实施方式中，至少渗滤水的流动差异可有助于得到比先前系统和方法更高的收率。
[0167]图2是阐明传统过滤系统中渗滤溶液——包括水或其它稀释液——的流动的简化图。渗滤溶液进入每一阶段，并且作为渗透物离开，所述渗透物携带例如蛋白质。在该图中，特别注意用于渗透物流动的有限的途径可能性。渗透物仅具有从每一阶段除去的选择，并且没有被引入任何其它阶段。最终结果是就控制和加工能力而言具有很低灵活性的装置/方法。
[0168]图3-5示例了本发明的不同实施方式的过滤系统，其通常包括多个流动互连的过滤组件，包括第一组件和多个随后的组件。设置每一组件发送邻近过滤器的接收进料和稀释剂的路径，以提供渗透物和保留物。在每个系统中，第一组件在进口侧从系统外接收进料，并且随后的组件从系统内前面组件接收保留物作为进料。在每个系统中，组件的至少一个具有用来从系统收回渗透物的渗透物收回流动管道，并且可提供多个渗透物收回管道以混合从系统回收的渗透物至期望水平的纯度或其它性质。多个组件具有配置用来使渗透物再循环或反馈到同一组件的进口侧的返回渗透物流动管道，和/或用于将渗透物从组件反馈到系统内前面组件的进口侧的渗透物流动管道。
[0169]图3图解本发明的系统/设备的水力途径(hydraulic path)的实施方式。图3例证的系统具有渗滤管道和渗透再循环。进料和保留物中的大颗粒可沿着途径从MF进料罐至不同的阶段，例如，第1阶段至第2阶段至第3阶段。对于第1、2和3阶段，渗透物流动管道31、32和33分别在图3中示出。管道32和33中的渗透物分别与渗透物再循环管道321和331连接，其导引渗透物至系统的前面的阶段。渗透物管道32和33也分别连接放液管道322和332。渗滤溶液可在多个点被加入系统，其中目的蛋白质/分子被通过溶液“拣出”，并且洗入较早的阶段，直到其最终作为第1阶段渗透物排出系统。进料和渗滤途径以相反方向流动。通过从不同阶段移去渗透物以及通过将渗滤溶液以需要的和选择的速度引入不同的阶段，可以选择和控制纯度以达到期望纯度水平。应该注意，取决于被纯化的分子的期望的纯度水平，渗透物任选地可在系统的多个点移去，例如从第3阶段、第2阶段或第1阶段。在多种实施方式中，系统可被改变以任选地在系统的多个点移去保留物或细胞糊，例如，从第3阶段、第2阶段或第1阶段。渗透物放液管道322和332可被用来在一个或多个下游阶段抽出或排出控制量的渗透物。抽出渗透物(一种或多种)可被用于与系统的其它渗透物流——例如从第一组件和/或其它接下来的阶段抽出的渗透物——的混合操作，从而可使用TFF系统将成品的总纯度调节至期望值。
[0170]图3-5中示出的系统与图2的传统系统不同，其具有能够彼此独立地控制流量、净渗透速度、收率和纯度的能力。
[0171]图4图解TFF系统的一个实施方式的示意图。该示意图拟提供具有根据期望产品的期望收率和纯度的多个可选途径的系统的描述。同样地，本领域普通技术人员会理解，取决于期望的最终结果，途径、液体的再循环和溶液加入的许多组合是可能的。本发明不拟被限定于使用本文描述的系统的任何单一途径、系统或方法。也将理解，示意图中示出的途径可实际包括，例如，用于期望流体流动的管道或导管。
[0172]应该理解，在多种实施方式中，取决于期望的最终结果，针对方法的收率、质量或经济性，可以使用系统和其流动途径的全部或仅仅一部分。另外，对于流动途径的列举特征，多种实施方式可包括泵、阀门和用于调节和控制目的溶液流动的其它设备。在多种实施方式中，目的产物可以从系统中的单个点或多个点收集。
[0173]本领域普通技术应该理解，系统的最佳操作依赖于在不同的操作条件下具体进料和产物化合物如何运转的知识，并且该知识通常通过中间工厂规模和生产规模研究收集。
[0174]根据多种实施方式，可提供图4的过滤系统，包括：第一过滤组件30，配置其系统进口侧以接收进料流，其中组件30可包括第一进口侧和第一出口侧，第一进口侧与系统进口流体连通(例如，管道70)；第二过滤组件32，其包括第二进口侧和第二出口侧，第二进口侧与第一进口侧流体连通(例如，管道72)；和第一可中断旁路，其被配置为限定第二出口侧和第一进口侧之间的可中断的流体连通(例如，以管道63)；和系统出口，例如，与第一出口侧和第二出口侧每一个流体连通的45或47。在多种实施方式中，第二过滤单元的系统出口可从系统移去渗透物，而不是使渗透物在过滤器组件之间再循环。
[0175]图4的TFF系统可包括渗滤溶液进入点15、17、19、21、23和25。一些进入点可允许渗滤溶液流入TFF组件的进口侧。渗滤溶液的这些进入点可被单独使用或组合使用，这取决于目的产物的期望质量。对于渗滤溶液，可具有单一或多个来源。在系统中，也可以有泵，其将渗滤溶液从其来源泵到适当进入点进入系统。
[0176]TFF组件(例如30、32、34或36)可以包括任意类型的TFF工艺(例如，聚合的、陶瓷的、不锈钢类型的材料，而不论结构类型——其包括但不限于例如螺旋形、管状、空心纤维、平板等)。TFF组件(例如30、32、34或36)也可包含产生切向流动的仪器，例如(但不限于)泵或可产生切向流体流动跨过膜的保留物侧的任何其它此类仪器。可选地，切向流动可被产生于过滤组件之外。该切向流动既可提供压力，又能帮助图4的TFF装置中的分离和纯化。
[0177]纯化和渗透物湍流控制流用45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65表示。所述流的应用将取决于渗透物是否再循环入同一过滤器组件、泵入先前的过滤器组件或作为产物从系统收集。
[0178]图4的系统可提供下列几个性质中的至少一个，包括但不限于：控制待被纯化(或分离)的进料流以受控和/或计算方式流过系统的能力，以精确性和控制将每一流(保留物和渗透物)或细胞糊纯化或分离至期望程度的能力，和/或以受控方式进行进料流的纯化(或分离)的能力，而不管阶段之间的液压过滤(或分离)率如何；以及其它性质。系统可以以受控和有效的方式减少杂质、消除其它纯化(或分离)步骤、和在封闭环境中用一个系统实施多个流和产物(或副产物)的高效纯化(或分离)，从而保护工作人员的安全。
[0179]参考图4，待被纯化(或分离)的溶液12可进入进料罐10。稀释或使用用于纯化的渗滤溶液或帮助过滤的最初能力是通过管道15。进料罐10可被改变以具有从系统接收一些或全部保留物流的能力，以便进一步重新处理、纯化或分离该被部分处理的流。从进料罐10可具有两个出口点，收集管道可从进料罐10以及进入第一组件的进料管道16捕获任何处理的物质40。来自管道40的物质在图中被称为副产物，然而，在多种实施方式中，这一物质也可以是目的产物。在系统中，来自管道16的进料然后可以以受控的速率与渗滤溶液17结合，以提供纯化和/或帮助分离。来自16的物质和来自17的渗滤溶液的组合产生可经由管道70进入系统的保留物或进料。
[0180]来自管道70的进料可进入表示为TFF组件30的TFF的第一阶段。TFF组件30可以包括任意类型的TFF工艺(例如，聚合的、陶瓷的、不锈钢类型的材料，而不论结构类型——包括螺旋形、管状、空心纤维、平板等)。在多种实施方式中，渗滤溶液可以流动通过管道19进入TFF组件30。TFF组件30可具有进口侧和出口侧，在系统中使用的所有TFF组件都可如此。管道63可流动来自TFF组件32的过滤物质(例如，渗透物)。该渗透物可被用来纯化和/或帮助分离TFF组件30中的进料，并且可以以受控的比率加入到TFF组件30，以便控制纯化和分离过程。从TFF组件30产生的纯化和分离的物质可通过渗透产物管道45离开装置，并且可经由管道65再循环回TFF组件30的进口/进料侧，这可被用来例如控制来自进料罐10的进料的总的纯化和分离。TFF组件30的保留物侧外的出口点可提供部分分离和纯化的保留物，其可被送到装置中的其它TFF组件。
[0181]在多种实施方式中，来自TFF组件30的部分纯化和分离的保留物或进料可通过管道72进入TFF组件32。TFF组件32可以包括任意类型的TFF工艺(例如，聚合的、陶瓷的、不锈钢类型的材料，而不论结构类型，例如螺旋形、管状、空心纤维、平板等)。在多种实施方式中，渗滤溶液可流过管道21进入TFF组件32的进口侧。管道59可含有来自TFF组件34的过滤物质(渗透物)。该渗透物可被用来纯化和/或帮助分离TFF组件32中的进料，并且可以以受控的比率加入到TFF组件32的进口侧，以便控制纯化和分离过程。来自TFF组件32的渗透物中的纯化的和分离的物质可通过渗透产物管道47离开系统并收集，并且可经由管道61再循环回TFF组件32以控制来自进料罐10的进料的总的纯化和分离，或者经由管道63送到TFF组件30。如果渗透物离开系统，那么其可以经由管道47从TFF组件32直接离开，或者可经由TFF组件32和TFF组件30之间的可中断旁路(没有示出)而离开。可配置可中断旁路以限定TFF组件32的出口侧和TFF组件30的进口侧之间的可中断的流体连通。在TFF组件32处，管道61可被用来以反相关控制管道72，即管道72流动可随着管道61流动的增加而减少。
[0182]在多种实施方式中，系统可包括可中断旁路(没有示出)，其可被配置以限定TFF组件32的进口侧和TFF组件30的进口侧之间的可中断的流体连通。可中断旁路可被用来从系统移去在TFF组件32和TFF组件30之间流动的保留物，用于收集保留物中的产物。可中断旁路可通过特征42表达——仅在第n阶段示出，但是其也可随系统的任何前面的组件例如组件30、32和34被提供。
[0183]来自TFF组件32的部分纯化和分离的保留物或进料可通过管道74进入TFF组件34的进口侧。TFF组件34可以包括任意类型的TFF工艺(例如，聚合的、陶瓷的、不锈钢类型的材料，而不论结构类型，例如螺旋形、管状、空心纤维、平板等)。尽管没有在图4中阐明，但是在多种其它实施方式中，除了就在其下游的TFF组件外或替代就在其下游的TFF组件，来自装置中TFF组件30到第(n-2)阶段组件中的任何一个或多个组件的部分分离或纯化的保留物被分配至装置中的一个或多个下游TFF组件，并且不包括上游组件。
[0184]在多种实施方式中，渗滤溶液可流过管道23进入TFF组件34的进口侧。管道55可含有来自TFF组件36的过滤物质(例如渗透物)。该渗透物可被用来纯化和/或帮助分离TFF组件34中的进料或保留物，并且可以以受控的比率加入到TFF组件34的进口侧，以便控制纯化和分离过程。从TFF组件34产生的纯化的和分离的物质可通过渗透产物管道49离开系统并收集，可经由管道57再循环回TFF组件34以控制从保留物管道74引入的进料的总的纯化和分离，或者经由管道59送到TFF组件32。如果渗透物离开系统，其可以经由管道49从TFF组件34直接离开，或者可经由TFF组件34和TFF组件32之间的可中断旁路(没有示出)而离开。可配置可中断旁路以限定TFF组件34的出口侧和TFF组件32的进口侧之间的可中断的流体连通。在TFF组件34，管道57可被用来以反相关控制管道74，即管道74流动可随着管道57流动的增加而减少。
[0185]在多种实施方式中，系统可包括可中断旁路(没有示出)，其可被配置以限定TFF组件34的进口侧和TFF组件32的进口侧之间的可中断的流体连通。可中断旁路可被用来从系统移去在TFF组件32和TFF组件34之间流动的保留物，用于收集保留物中的产物。
[0186]TFF组件34的保留物侧外的出口点76可含有待被输送到装置中其它TFF组件的部分分离的和纯化的保留物(除了TFF组件30和32或系统内其它在前组件)。
[0187]来自TFF组件34的部分纯化和分离的保留物或进料可通过管道76进入TFF组件36。TFF组件36可以包括任意类型的TFF工艺(例如，聚合的、陶瓷的、不锈钢类型的材料，而不论结构类型，例如螺旋形、管状、空心纤维、平板等)。在多种实施方式中，渗滤溶液可流过管道25进入TFF组件36。因为在图4中阐明的TFF装置可具有无限多个理论数目的阶段(或者另外的TFF组件)，所以可有来自另外的TFF组件的过滤物质(例如，渗透物)。该渗透物可被用来纯化和/或帮助分离TFF组件36中的进料，并且可以以受控的比率加入到TFF组件36，以便控制纯化和分离过程。从TFF组件36产生的纯化的和分离的物质可通过渗透物管道51离开系统，可经由管道53再循环回TFF组件36以控制来自管道76的保留物的进料的总的纯化和分离，或者可经由管道55送到TFF组件34。在TFF组件36，管道53可被用来以反相关控制管道76，即，管道76流动可随着管道53流动的增加而减少。TFF组件36的保留物侧外的出口点(一个或多个)可以是管道78和/或管道42。该物质可以是部分分离的和纯化的保留物，其可被i)送到装置中附加的TFF组件(因为该装置可具有无限的阶段)，ii)经由管道42送到装置外，或iii)经由管道78送回进料罐10，以进一步处理。管道78将保留物从组件36或者任意其它第n个阶段的组件反馈到进料罐10。离开TFF组件36的保留物不应该到达TFF组件(一个或多个)30、32或34。流出系统的所有渗透物和保留物可以计算的方式——作为控制图4中所示的TFF装置中的总的纯度和分离方法的总的策略的一部分——控制。如果渗透物离开系统，其可从TFF组件直接离开，或者可经由TFF组件之间的可中断旁路离开。可以配置可中断旁路，以限定一个TFF组件的出口侧和另一个TFF组件的进口侧之间的可中断的流体连通。
[0188]可确定渗滤溶液进入点(例如在15、17、19、21、23或25)以得到各种范围和/或质量的渗滤(或洗涤/提取/纯化)溶液。这些流的每一个相对于进料的比率和/或流动速率可被确定用于各种操作范围，以及使用过滤系统在过程中得到期望的纯度控制。
[0189]如上面提到的，在图4中示出的TFF装置在其设计中可具有无限数目的阶段，以控制装置的产物和副产物的总的纯度和分离过程。这些另外的步骤对于渗透物或保留物循环选择可具有相似设定(setup)。
[0190]上面的描述提供在方法中的各个阶段移去渗透物和保留物。应该也注意，保留物产物例如细胞糊可从不同过滤组件移去——如果目的产物被留在过滤系统的那部分中。
[0191]应该理解，在多种实施方式中，可加入附加的管道(例如，导管)和TFF组件。从上面的描述中，本领域普通技术人员将明白使用附加的TFF组件如何处理流体。
[0192]特征40和42可提供间歇和/或连续流动模式的双重操作。管道40和42可在认为适当时被用来收集产物。设计的这种灵活性可被用来控制离开装置的最终产品的纯度和产品质量，和/或可允许制造厂控制速度，装置在该速度下可生产产品。
[0193]根据多种实施方式，管道/导管/流动管道(例如40、42、78、72、74、76、51、53、55、49、57、59、47、61、63、65和45)可在各种操作范围例如流速或压力下应用，以便a)控制装置中的水力不均衡(hydraulic imbalance)，其可由于可被用来使用系统制备可区分产品的纯度控制能力而发生；b)控制使用系统产生的最终产物的纯度；和/或c)控制功效和速度，在该速度下可通过系统制造可区分的产品。例如，水力不均衡可通过从30流入32、34和36来控制，以便控制收率和纯度。这些组件可具有固定的体积。如果不能控制流出，那么可能需要控制管道72、74、76流入组件，例如管道53、57、61和65可控制72、74和76的流动。根据多种实施方式，可从上述系统，将渗透物加料到第二系统。
[0194]图4和下面更详细描述的图5的系统，可被操作以独立操纵总产物收率、产物纯度、净渗透速度和流量的任何一个，其中产物从渗透侧收集。参考图9A和9B，表IA-ID对总产物收率、产物纯度、净渗透速度或流量参数中的一个如何可升高同时保持其它三个变量不变或至少近似不变提供示例性图解。设计表IA-ID，以便用来升高给定变量的示例类型的行为被显示在给定栏的上部的框中，并且可被采取以保持其它三个变量不变的协同类型的行为被表示在同一栏的下面部分。对于表IA-ID中表示的每一列出类型的行为，所需要的调节程度可在系统上经验性确定，以学习特定进料和产物对包括至少四个上面提到的条件在内的不同组的工艺条件会如何响应。例如，如在图9A的表IA所示例的，对于给定产物，可通过提供更大的总膜面积、增加的渗滤水加入、和/或仅在第n阶段引入渗滤溶液和从第一阶段收集产物，可提高收率，并且可采取各自的对策以保持纯度(例如，调节来自每一阶段的渗透产物的流速，和混合该流等)、净渗透速度(例如，通过改变阶段的数目而改变总膜面积等)和流量(例如，在一个或多个步骤中改变TMP等)。可应用一个或多个示例性调节，其在表中的每一参数标题下列出。本领域普通技术人员将理解，经验信息和知识可预先获得，例如，通过对本系统进行的中间工厂规模研究和生产规模研究。
[0195]这些操作控制可手动或以自动方式或者两者的一部分来控制，以实现在表IA-ID中示例的操作实例。参考图10，阐明图4的实施方式，其包括示例性控制系统400和整合于其中的元件。控制系统400允许使以协调的自动化方式控制系统的相关操作参数。可提供多个传感器401用于获得关于当流体流过系统的各个部分(例如管道)和过滤组件时的流体数据(例如流速、压力、浓度、pH、导电率、温度、浊度、紫外吸光度、荧光、折射率、渗透性、干固体、近红外线或傅立叶变换红外线)。系统也具有多个泵402和阀门403，用于泵送和调节流体流动通过系统。仅数个这类元件在图4中示出，其目的是为了清楚地阐明。本领域普通技术人员将知晓在系统内这些元件的其它方便和有用、用于实现本文公开的教导的安装点。控制系统400可以是电子数据处理网络，包括控制元件401-403等之间的由虚线表示的通讯链路(communication link)404、405、406、407等和控制器408，可被提供能至少接收、处理、记录和传输与所述泵、阀门和传感器操作相关的数据和信号，其中在流动过滤处理期间收集的记录数据是充分广泛的，以便控制流动过滤处理。这些通讯链路可以是硬连线、无线或它们的组合，并且包括用于传输、接收和处理可用信号的适当的硬件和软件，如本领域普通技术人员将理解的。控制器408也可以将从处理控制仪器接收的信号转为流速、压力、浓度、pH、导电率、温度、浊度、紫外吸光度、荧光、折射率、渗透性、干固体、近红外线或傅立叶变换红外线等可显示的读数，其可在元件处显示(经返回信号通信)，显示在控制器上和/或显示在图形用户界面409上——其包括与控制器408连接的计算机显示监视器(没有示出)以进行互通。针对与自动化图9A和9B中示例的操作参数调节方案相关的算法的管理和实施，图形用户界面409也可被用来与控制器408通信。
[0196]如前面表示的，对于给定的工艺条件和装备设置组，制造系统可被预试用以经验性地学习特定的进料和产物对本文示例的系统中应用的不同工艺条件组会如何响应。例如，这样的经验性研究可被用来开发预测模型，其包括检测的参数值之间的关系的数学算法、改变一个操作参数值的期望调节、和在其它操作参数下待被进行以保持它们在其它参数调节期间不变的调节的选择和程度。为了完成这样的预测模型，控制器可包括可编程的逻辑控制器(PLC)——其有权使用计算机编码，其被包含在安装于母板和类似物上的微电子硬件中，和/或包含在装载在远程计算机(没有示出)上的软件中，经由界面409下的图形与其通信。基于本文提供的教导和指导，商业可得的PLC组件可被修改以支持这些功能，所述教导和指导包括图9A和9B中的信息。控制器系统可具有硬件元件和软件二者，其可被改变以开发和完成用于如本文示例的过程控制的这种算法。
[0197]应该注意，在上面和申请中其它地方描述的系统不限定于微量过滤。系统性能可使用任何交叉流过滤，其中期望分离多种成分，并且可能需要控制制造最终产物或副产物的纯度和速度。
[0198]在多种实施方式中，可结合本文描述的两个或多个系统/设备/装置以产生更大、更复杂的系统/设备/装置。系统可以彼此串联连接。
[0199]根据多种实施方式，系统可以是微型过滤器系统。过滤组件例如TFF组件(图4中的30、32、34或36)可使用可商业上购买的限定孔或分子尺寸范围的过滤器元件。针对期望的结果，对该组件的操作条件可由本领域技术人员确定。
[0200]图5图解了系统的另一个实施方式。图4中的数字识别特征识别图5中的相似特征。图5也阐明系统，该系统被配置以从单一TFF组件再循环通过附加单元后产生产物。另外，图5阐明系统，该系统被配置用于过滤组件(管道31、29)的独立清洁、热交换器(26、27)的使用和冷却排出管(bleed-off piping)(管道82)。系统的这些特性可相等地运用于图4的构造。
[0201]在多种实施方式中，可通过添加用于渗滤冷却溶液流动的冷却排出管道，控制TFF系统的温度。渗滤溶液81可通过首先通过热交换器26和27冷却TFF系统。如果期望，附加的热交换器可被置于系统中。然后，渗滤溶液可经由管道83进入TFF过滤组件34。在多种实施方式中，不是在通过热交换器后渗滤溶液进入TFF组件，而是溶液通过管道82被排出，并且在23处加入新鲜渗滤溶液。这样，可更好控制温度以保持如此产物——其性质可能是温度敏感的，或者施加期望的温度以热处理产物。由于该特征，可以在操作期间控制TFF系统中的纯化和分离，并且控制系统的温度。这些内部热交换(冷却)结构使控制工艺的操作温度更简单，其又以一致和可重复的方式促进控制收率、容量和/或产物纯度。
[0202]在多种实施方式中，系统中各种流体流的温度可通过调节进入系统的渗滤溶液(15、17、23和83)的温度和相对流速进行调控，其中在其经过系统前，可通过混合热水和冷水制备溶液来调节渗滤溶液温度。
[0203]在多种实施方式中，系统中多种流体流的pH或电导率可通过注入浓酸、碱或盐溶液来调节，其中可使用计量泵或自动阀来调节溶液的注入速率，并且其中这样的泵或阀将经由中央控制器接收与来自pH或电导率传感器的输出信号相结合的控制信号(图10)。
[0204]在多种实施方式中，如在图5中所示，在TFF组件32的管道29和在TFF组件34的管道31可被加入到系统。这些管道可被用来在已知的浓度和温度下独立地将清洁化学药品从罐10直接输送到所有三个TFF组件(TFF组件30可接收来自管道70的化学药品)。在传统的系统中，所有的清洁化学药品在达到系统的随后的组件之前必须通过第一组件，在那里它们失去效能，这导致在接下来的产物运行期间TFF组件32和34较差的清洁和较差的分离/纯化。没有这种修改则得到不一致的结果。
[0205]在多种实施方式中，可使用方法来从发酵液(发酵培养液)回收酶。将发酵液转移到收集槽，在那里如果需要可调节培养液的pH。然后，发酵液被预处理，用于转移到TFF微量过滤单元或另一个分离组件例如转鼓真空过滤(RDVF)组件。当培养液待被转移到TFF单元时，通过加入水调节溶解的固体至大约10％以下进行预处理，并且稀释的培养液在进入TFF微量过滤单元之前通过筛以除去较大的颗粒，典型地在350微米以上。当培养液待被送到RDVF组件时，典型地用吸附剂和/或絮凝剂对其预处理。在转移到TFF单元或RDVF组件之前，保持培养基一段时间以使适当混合所有的成分。
[0206]通过选择和设定例如TMP、浓缩比和渗滤比，完成TFF分离。可将渗滤溶液注射入TFF单元中任何TFF组件的进口侧进入点。渗滤溶液可包括进入每一阶段的分开的流或从一个阶段行进到另一个阶段的渗透物的逆流的流。当渗滤溶液循环通过TFF单元组件时，其可多次提取成分，并且通过控制渗透物离开TFF单元的位置，可调节回收的酶的纯度。超滤单元可与TFF单元平行操作以浓缩来自TFF单元的渗透物。例如，可以配制从超滤单元回收的酶而无需另外的过滤。
[0207]可选地，当处理的发酵液被送至RDVF组件用于细胞分离时，选择温度和进料速率，并且将培养液在大约2到3个循环中进料到鼓中，并且加入水喷在鼓上以通过鼓式过滤器洗涤可溶性酶。超滤单元可以与RDVF方法平行运行，以浓缩来自RDVF组件的溶液。然后，如果需要，调节浓缩的产物的pH，并且将浓缩物送至压滤机以净化溶液并减少在操作环境中发现的污染物，例如，环境微生物。
实施例
[0208]下列实施例仅仅代表本发明的多种实施方式。无论如何，实施例不拟以任何方式限定本发明。
实施例1
[0209]进行一组实验，其表明在从由谷物浸渍固体(corn steep solid)、盐和碳养分的混合物组成的发酵液微量过滤纯化葡糖淀粉酶期间，TFF微量过滤系统的优点。在该实验中，Koch膜组件(Koch系统，Wilmington，Mass.)Model MFK-601-FYT(8338)被用于本实施例。在实施例2和3中，使用相似的组件，除了直径更小(3838)。生产宿主是黑曲酶。在发酵的最后，用硫酸将培养液的pH调节为大约pH3.3；将3.5％膨润土加入到培养液中；在开始微量过滤处理之前，保持培养液最少12小时。在开始净化处理之前，没有水或渗滤溶液被加入到培养液，并且没有絮凝剂或助滤剂被用于这些实验。
[0210]与传统TFF系统相比，本申请的系统在常规TMP下可得到更大的产物收率。设定传统系统(图2)和TFF微量过滤系统(图3)在相同操作条件下操作。在这两种情况中，将进口侧进料压力设定在3.5巴，进口侧排出压力设定在1.5巴。使用的膜是螺旋形结构，其具有1.2微米的公称孔径。渗滤比被设定在3.0(渗滤溶液与进料)，浓缩比被设定在0.7(离开进料的细胞糊流速，cell paste rate out to feed)，并且温度设定在30℃。
[0211]传统微过滤器具有49.3％的平均传送(初始传送在50％，并且在运行的末端为48％)，实验的运行总收率为73.5％。
[0212]如本文描述的逆流TFF系统提供优于传统系统的明显益处。系统具有41％的平均传送(运行早期为45％，并且末端为38％)，总收率为94.2％。该收率差异可采用方法：其不会被发展并且使其成为可能的处理选择，这是由于在本申请前面描述的许多特征。
实施例2
[0213]使用传统TFF系统，应用微量过滤膜和由枯草芽孢杆菌培养液和蛋白酶组成的进料，得到图6中的结果。结果提供关于改变TMP和对流量和物质经过过滤单元中的膜的通过情况的影响的信息(图2的简化版本，一个阶段)。
[0214]图6图解，对于传统MF装置操作时应用低TMP压力的产物，蛋白质的通过足以能在高达大约0.9巴TMP下操作，并且具有70％或以上的通过，流量速率为大约28L/m2/h(lmh)。然而，本文描述的TFF微量过滤设备/系统可在大约1.5巴的更高TMP下操作，并且尽管通过为大约40％，但可以达到90-92％的总收率(参见实施例1)。
[0215]图7提供逆流装置如何可提供益处的另一个阐述。其示出从在含有α淀粉酶的地衣芽孢杆菌培养液中证明TMP对流量和通过情况的影响的三个独立实验得到的数据。在不同的交叉流速度(在A、B和C中，δP分别是0.7、1.0和1.5巴)下实施每个实验。TFF微量过滤装置可在2巴TMP下操作，并且在70-75％的面积中通过，总收率是97-99％，流量速率85lmh。使用工程模型(engineering model)通过结合经验数据和质量平衡方程预测收率。数据阐明，可彼此独立地控制期望成分的纯度、收率和流量。与之对照，传统的装置将需要在0.6巴TMP范围内、在40lmh的流量下操作，通过大约90％，总收率是90-92％。同样地，该数据表明，TFF微量过滤发明流量在较高TMP下可为2倍以上(>2x)，以及比传统装置的总收率高5-7％。
[0216]图8表明了实例，其中与传统装置相比，TFF微量过滤方法可能不具有上述相同水平的益处。在这种情况中检测的产物表明，在传统装置的较低TMP下，流量和通过都是高的，所以就流量和通过而言，将获得非常小的优势至没有优势。然而，甚至在这种情况中，TFF微量过滤可仍旧具有产生较高产物纯度的益处。通过在较高的TMP下操作，更高密度的界面层在膜表面上形成，从而引起更大量的杂质的排斥。
实施例3
[0217]表1列出使用本文描述的系统和方法得到的几种产物。从细菌或真菌培养液制备的这些产物代表酶，每一种具有独特的特性，尽管一些可能拥有相似的酶功能并且被称为属于特定类型，例如α-淀粉酶第1到第4号。在得到产物中使用的不同的参数也在本文中列出。
[0218]表1.产物和生产参数
| 产物 | δP(巴/元件) 进口侧进料 进口侧排出 渗滤与培养 浓缩比压力(巴) 压力(巴) 液比 |
| α-淀粉酶第1号α-淀粉酶第2号α-淀粉酶第3号α-淀粉酶第4号纤维素酶第1号纤维素酶第2号葡糖淀粉酶甘露聚糖酶过氧化物酶蛋白酶第1号蛋白酶第2号蛋白酶第3号支链淀粉酶 | 0.5-1.5 1.5-4.5 0.5-1.5 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-5.5 0.5-3.0 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-4.0 0.5-2.5 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-3.5 0.5-2.0 2.0-6.0 0.5-1.00.5-1.5 1.5-3.5 0.5-2.0 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-5.5 0.5-3.5 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-3.5 0.5-1.0 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.0 1.5-3.0 0.5-1.0 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.0 1.5-3.0 0.5-1.5 3.0-7.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-5.5 0.5-3.5 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-5.5 0.5-3.5 2.0-6.0 0.3-1.00.5-1.5 1.5-5.5 0.5-3.5 2.0-6.0 0.3-1.01.0-1.5 1.5-5.5 0.5-3.5 2.0-6.0 0.3-1.0 |
实施例4
[0219]获得蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶浓缩产物的批次，如在下面表2列出的，将使用用于分离的本发明的一个实施方式的TFF单元产生的酶的性质与使用RDVF或离心细胞分离(传统方法)产生的酶的性质比较。
TFF微量过滤发明操作条件
[0220]TFF微量过滤单元被装配有螺旋形1.2微米公称孔径、聚醚砜(PES)膜元件。取决于产物酶，将进料培养液调节到pH5-7。渗滤比被设定为3份水比1份进料，并且渗滤水从第3阶段进入但可在图3表示的任何点进入。进口侧排出压力具有0.5巴的设定点，并且进口侧进料压力被设定在3.25巴。温度被设定在35℃(可接受的范围：10-45℃)，并且取决于进料速率，浓缩比被设定在0.6至1.0。超滤单元与TFF微量过滤器平行运行，其进行微过滤器渗透物的10-20倍浓缩。因为与其它细胞分离方法相比，微量过滤方法可提供更纯和污染更少的产物流，所以超滤方法又获得产生更纯和污染更少的浓缩物的能力，这导致胶粒引起的浊度更低，并且因此对最终的抛光过滤步骤的需求更低。
RDVF操作条件
[0221]在RVDF的细胞分离中，将培养液pH值调节至5-7，将硅藻土(DE)和絮凝剂加入到培养液，并且用DE预涂布RDVF的鼓。然后，将培养液进料到鼓，直到耗尽预涂层，在这时候停止分离，进行清洁和安装另一个预涂层。通常，实施2-3个这样的预涂布循环以处理一批次培养液。在分离期间，以喷到预涂层上的形式将水加入到过程中，以洗涤可溶的成分(包括产物)穿过饼(cake)。细胞分离的温度可被保持在15或50℃以最小化由于过滤是环境开放的而引起的环境微生物污染。超滤单元与RVDF平行运行，其被用来将RVDF滤液浓缩10-20倍。在配制之前，最终的超滤提浓物通常被压滤以减少可能在RVDF步骤进入和在下游过程增加的环境微生物的污染水平。在TFF微量过滤方法中，该抛光步骤通常是不需要的，因为处理流没有足够暴露于环境以获取污染。
离心操作条件.
[0222]细胞分离也可通过沉降式离心机进行。在该过程的开始，将进料培养液的pH调节至5-7，并且用絮凝剂处理，然后将其进料入离心机。在进入离心机之前，可用差不多2份的渗滤水稀释培养液。有两个处理流由离心机产生：含有产物化合物的澄清的液体(离心脱出水(centrate))和主要含有脱水的细胞和其它不溶物质的浆状物(沉淀物)。将浆状物连同更多的渗滤水送入第二离心机是可能的，按需要调节其pH并加入更多的絮凝剂，以将更多的产物化合物提取到第二离心脱出水以便与第一离心脱出水结合。取决于进料速率，在3000-4000xg下操作离心机。将离心脱出水送到RVDF以除去在离心机中太小而不能沉淀并与浆状物分开的颗粒。RVDF的操作与先前描述的相同，除了在离心脱出水被进料入鼓之前，不需要絮凝剂处理离心脱出水。超滤单元与RVDF平行运行，其浓缩RVDF滤液10-20倍。如在RVDF细胞分离过程中，在超滤液可被配制为最终产物之前，最终的超滤液通常需要抛光过滤以除去环境微生物污染。
[0223]使用标准试验测量活性水平及其其它组分，比较各批次的酶产物。在表2中提供结果，其包括副表2a-2c。
[0224]表2的数据分析阐明，TFF产物比传统制备的产物(＂Conv.＂)的纯度具有明显的增加。相对于选择的其它成分的活性的增加表明，在TFF产生的物质中具有更少的杂质(表2a)。同样地，涉及更浅颜色的吸光度的减少也表明，在TFF产生的物质中具有更少的杂质(表2b)。
[0225]表2最终产物数据比较
[0226]
表2a.几种TFF产物浓缩物的更大的纯度1
表2b.几种TFF产物浓缩物的较浅的颜色
表2c.测量描述
| 测量 单位 描述 |
| 活性 mg/g、mg/ml、kU/g或 酶活性kU/ml总蛋白 mg/mL 蛋白质、肽、氨基酸氮、碳、硫 Wt％ 元素组成铁、磷 Ppm 元素组成灰分 Wt％ 不可燃成分固体 Wt％ 不可蒸发成分吸光度 吸光度单位 光阻碍程度；暗度 |
[0227]表2注释/限定：1.为了制造产物浓缩物，通过TFF微量过滤或传统方法(RVDF或离心)净化培养液；然后，通过10k MWCO超滤浓缩所形成的产物流至相等的活性(差异在较大的10％以内)。2.对于配制，包括加入稳定剂，这些蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶产物将分别被给予
和的商品名。
[0228]取决于酶，通过手动或自动的方法测量酶活性。该方法使用不同的底物(例如羧甲基纤维素)和不同盐和pH的缓冲液。最终使用Beckman DU640分光光度计或Konelab自动分析器(Thermoelectron)比色分析确定活性。通过Biuret呈色反应(Pointe Scientific试剂)，使用Konelab自动分析器在完整样品上测定总蛋白，其将包括所有的蛋白质、多肽和氨基酸。牛血清白蛋白被用于产生标准曲线。定量＂动态闪速燃烧(dynamic flash combustion)＂方法与Fisons EAl 108 ElementalAnalyzer一起使用以确定元素氮、碳和硫组分，其以重量百分比报告。Perkin ElmerOptima 3200 Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer(电感耦合等离子体发射光谱仪)(ICP-OES)被用于分析无机元素。用硫酸和硝酸消化样品。无机元素以百万分率(ppm)报告。常规检测的元素包括银、铝、砷、铋、钙、镉、钴、铬、铜、铁、钾、镁、锰、汞、钠、镍、磷、铅、锑、硅、锡、钛和锌。Silliker Laboratories(Chicago Heights，Illinois)分析样品的灰分和湿气。遵照AOAC(Association ofAnalytical Chemists)方法930.22，测定灰分含量。总固体通过从100％中减去湿气重量百分比而确定，其中湿气含量遵照AOAC方法926.08测定。颜色(黑色外观)通过使用Beckman DU640分光光度计在470和520nm下记录样品吸光度而评估。将样品稀释达到器械范围(0-2.0)内的吸光度，并且旋转以除去可能影响光散射的任何颗粒。
[0229]表3示出与RVDF或离心传统样品(＂Conv.＂)相比较，在发明的TFF样品中测量的纯度和颜色吸光度读数的变化，纯度变化如活性蛋白对总蛋白的变化而定义，RVDF或离心传统样品作为基准。
[0230]表3.纯度和颜色吸光度读数的变化％
[0231]如在表2和表3中的数据结果所示的，对于多种不同的检测酶，通过本发明示例的TFF系统和方法获得的产物与用传统系统(例如RVDF)获得的产物相比具有更大的纯度。具体而言，表3中的结果示出，与传统样品相比TFF样品展现的每一总蛋白中的活性至少增加大约4％(提高)，对于蛋白酶，可见甚至大得多的提高(即大约103％)。关于表3中报告的N和C度量值，不希望束缚于理论，与传统产物相比，认为TFF产物的更大的活性/N可表明更多地除去某些含氮杂质，例如DNA，TFF产物的更大的活性/C可表明更多地除去某些含碳杂质，例如碳水化合物聚合物。尽管不希望束缚于理论，但是认为如本文明允许的、在高TMP下操作而没有牺牲收率，可产生凝胶层，凝胶层可发挥排除有效尺寸比折叠蛋白大得多的这些分子类型的功能。这些TFF和传统产物的检测也表明，在RDVF产物和对应的TFF产物的平均颜色之间存在颜色的重大差异，例如在470nm和520nm下以吸光单位测量的。对TFF产物测定的、比RDVF产物明显低的吸光度/活性，例如在表3中报道的值的变化％所显示的，也表明TFF产物的纯度明显增加，并且尽管不期望被理论所束缚，但认为这些结果表明，与传统产物相比，产生颜色的大量分子在TFF产物中已被除去。
[0232]除了颜色改变，TFF产物可具有增强的气味和味道特性，这允许它们被用于食物和酿造应用中，这些特性在食物和酿造应用中是重要的。
[0233]预期具有通过传统方法制备的传统纯度水平的产物将具有明显更大量的杂质，以及更多数量的微生物污染。
[0234]通过本发明的方法和设备得到的产物可在通过TFF装置处理后收集。然后，可通过传统方法浓缩并纯化产物，包装并出售。
[0235]考虑到本文公开的本说明书的本教导的实践，本教导的其它实施方式对本领域普通技术人员将是显而易见的。说明书和实施例拟仅被考虑为示例性的，不限定权利要求书。所有引用的参考文献、专利和专利申请以其全部被引入本文作为参考。
Claims (51)
1.过滤系统，其包括多个流动互连过滤组件，所述组件包括：第一组件和多个随后的组件，其中设定每个组件发送邻近过滤器的接收进料和稀释剂以提供渗透物和保留物，所述第一组件在进口侧从所述系统外部接收进料，所述随后的组件从所述系统内前面组件接收保留物作为进料，至少一个组件具有渗透物收回流动管道，用于从所述系统收回渗透物；和多个组件，其具有返回渗透物出口，其被配置用于使渗透物进料回到所述系统内同一组件或前面组件的进口侧。
2.权利要求1所述的系统，进一步包括控制系统，其被配置以对产物收率、产物纯度、净渗透速度和总流量之一独立调整，同时保持其它三个变量大致不变。
3.权利要求1所述的系统，其中所述第一和随后的组件每一个具有用于将渗透物返回至同一组件的所述进口侧的渗透物再循环管道，并且所述第一组件随后的组件进一步包括用于将渗透物反馈回所述系统内的在前组件的渗透物再流通管道。
4.过滤系统，包括：
系统进口，用于从所述系统外部接收新鲜进料；
多个流动互连过滤组件，所述组件包括第一组件和多个随后组件，
其中所述第一组件包括：
进口侧，其与用于接收新鲜进料的所述系统进口流体连通；渗滤管道，用于将稀释剂引入到所述进口侧；过滤器，用于从含有新鲜进料和稀释剂的混合物的进料中选择性地分离目的种类，以提供穿过所述过滤器到达所述组件出口侧的渗透物和没有穿过所述过滤器的保留物；至少一个渗透物流动管道，用于从所述第一组件的出口侧收回渗透物；和任选的另一个渗透物流动管道，用于将渗透物再循环到所述第一组件的所述进口侧；和保留物流动管道，其被配置以发送保留物流从所述组件的所述进口侧到随后组件的进口侧，
其中所述随后组件的每一个包括：
进口侧，其与在前组件的保留物流动管道流体连通；渗滤管道，用于将稀释剂引入到所述进口侧；过滤器，用于从在其所述进口侧引入的进料中选择性地分离目的种类；渗透物流动管道，其被配置用于将渗透物流从所述组件的出口侧返回到同一组件的进口侧，或者用于将渗透物流反馈到在前组件；另外的渗透物流动管道，其被配置用于从所述系统收回渗透物；和保留物流动管道，其被配置以发送保留物从所述组件的所述进口侧到随后组件的进口侧，或者排出保留物用于回收或在所述系统内再流通。
5.权利要求4所述的系统，其中所述第一组件和随后的组件每一个具有用于将渗透物返回至同一组件的进口侧的渗透物再循环管道，并且所述第一组件随后的组件进一步包括用于将渗透物反馈到所述系统内的在前组件的渗透物再流通管道。
6.权利要求5所述的系统，进一步包括混合控制，其用于合并两个或更多个所述组件的收回渗透物流，以有效提供具有目标总纯度的产物。
7.权利要求5所述的系统，其中所述多个组件的每一个的保留物流动管道被配置以从组件的保留物出口发送保留物至下一随后组件的进口侧。
8.权利要求5所述的系统，其中每一个过滤器包括膜。
9.权利要求5所述的系统，其中所述多个组件包括3到25个组件。
10.权利要求5所述的系统，进一步包括控制系统，以独立调整产物收率、产物纯度、净渗透速度和总流量之一，同时保持其它三个变量大致不变。
11.权利要求5所述的系统，进一步包括多个泵和阀，用于泵送和调节流体通过所述系统的流动。
12.权利要求11所述的系统，进一步包括多个传感器，用于获得当流体流过所述系统时关于所述流体的数据；电子数据处理网络，其能至少接收、传输、处理和记录与所述泵、阀和传感器操作相关的数据，并且其中在流动过滤处理期间收集的所述记录数据是充分广泛的，以便允许控制所述流动过滤处理。
13.权利要求12所述的系统，其中所述传感器选自流速传感器、压力传感器、浓度传感器、pH传感器、导电率传感器、温度传感器、浊度传感器、紫外吸光度传感器、荧光传感器、折射率传感器、渗透性传感器、干固体传感器、近红外线传感器或傅立叶变换红外线传感器的至少一个。
14.权利要求4所述的系统，其中所述第一组件包含用于将渗透物返回至所述第一组件的所述进口侧的渗透物再循环管道，并且其中所述第一组件随后的组件的每一个包括用于将渗透物返回至同一组件的所述进口侧的渗透物再循环管道和用于将渗透物反馈至直接在前组件的渗透物再流通管道，和
其中所述系统进一步包括：
第一热交换器，其与所述第一组件的渗透物收回管道热接触，
第二热交换器，其与所述随后的组件的至少一个渗透物再流通管道热接触，
冷却剂供应管道，其与所述第一和第二热交换器的至少一个流体连通。
15.权利要求4所述的系统，其中在所述第一组件后的随后组件的每一个的渗透物流动管道包括：i)各自的再流通管道，其反馈回所述系统内直接在前组件的所述进口侧，和ii)各自的放液管道，用于使来自所述再流通管道的渗透物流转向，以便从所述系统收回。
16.权利要求15所述的系统，进一步包括对所述第一组件和一个和多个所述随后的组件的收回渗透流的混合控制，以有效提供具有目标总纯度的产物。
17.权利要求15所述的系统，其中所述第一组件和至少一个所述随后的组件的保留物流动管道被配置，以将保留物从组件的保留物出口反馈至所述系统内紧邻的随后组件的进口侧。
18.权利要求15所述的系统，其中每一个过滤器包括微量过滤膜。
19.过滤纯化方法，包括：
a)将进料引入第一组件，其包括发送新鲜进料至流动互连过滤组件的第一组件的进口侧，并且任选地在所述进口侧引入稀释剂，所述流动互连过滤组件包括所述第一组件和多个随后的组件，
b)发送邻近所述第一组件中的过滤器的所述进料，以提供渗透物和保留物，
c)从所述第一组件发送保留物和任选的稀释剂向下游至随后组件的进口侧，作为对所述随后组件的随后组件进料，用于邻近过滤器流动以提供随后组件保留物和随后组件渗透物，
d)发送所述随后组件保留物和任选的稀释剂至下一个随后组件，用于邻近过滤器流动以提供下一个随后组件保留物和下一个随后组件渗透物，
e)重复步骤d)至少一次，
f)将多个所述组件中的渗透物返回到同一组件的进口侧，或者将渗透物反馈至上游组件，
g)从至少一个所述组件收回渗透物作为产物。
20.权利要求19所述的方法，进一步包括控制独立调整产物收率、产物纯度、净渗透速度和总流量之一，同时保持其它三个变量大致不变。
21.权利要求19所述的方法，包括将所述第一和随后组件中的渗透物返回到同一组件的进口侧，和将随后组件中的渗透物反馈到上游组件的进口侧。
22.过滤纯化方法，包括：
a)将新鲜进料引入流动互连过滤组件的第一组件的进口侧，并且任选地在所述进口侧引入稀释剂以提供进料，所述流动互连过滤组件包括所述第一组件和多个随后的组件，
b)使邻近过滤器的所述进料流动，以从所述进料中的混合物中选择性地分离目的种类，用以提供穿过所述过滤器到达所述组件出口侧的渗透物和没有穿过所述过滤器的保留物，
c)从所述出口侧引导渗透物进入渗透物流动管道，用于将所述渗透物从所述第一组件排出和任选地将所述渗透物再循环到所述第一组件的所述进口侧以与所述进料结合，和从所述第一组件排出保留物进入保留物流动管道，所述保留物流动管道被配置以将所述保留物发送至随后组件的进口侧，
d)使所述保留物经由在前组件的保留物流动管道流动到随后组件的进口侧，任选地在其进口侧引入稀释剂，并且穿过过滤器，以从进料中的混合物中选择性地分离目的种类，提供穿过所述过滤器到达所述组件外侧的渗透物和没有穿过所述过滤器的保留物，
e)发送渗透物进入渗透物流动管道，所述渗透物流动管道被配置以将渗透物返回到同一随后组件的至少进口侧，以形成其部分进料，或者将渗透物反馈到在前组件以结合其各自的进料，任选地将渗透物发送入渗透物收回管道，并且指引随后组件的保留物到达所述系统内的下一个随后组件的进口侧，
f)重复步骤d)和e)至少一次，和
g)回收作为包括从至少一个所述组件收回的渗透物的总渗透物的产物。
23.权利要求22所述的方法，进一步包括：在所述多个组件的每一个处将渗透物经由渗透物再循环管道返回到同一组件的进口侧，和在随后组件每一个处将渗透物反馈到在前组件的进口侧。
24.权利要求23所述的方法，进一步包括合并两个或多个所述组件的收回渗透物流，以有效提供具有目标总纯度的产物。
25.权利要求23所述的方法，其中在每一组件处所述渗透物经过滤器的通过是通过微量过滤膜发生的。
26.权利要求23所述的方法，进一步包括独立调整产物收率、产物纯度、净渗透速度和总流量之一，同时保持其它三个变量大致不变。
27.权利要求23所述的方法，其中在每一组件中，在相对于膜滤器切向流动期间，进料的流体流动被保持在大约0.1至大约200L/m2/hr/巴的流量下，并且其中每一组件被保持在大约0.1巴到大约60巴的压力下。
28.权利要求23所述的方法，其中至少一个所述分离步骤在大约1℃至大约75℃的温度下进行。
29.权利要求23所述的方法，其中至少一个所述分离步骤在大约pH 2至大约pH 10的pH下进行。
30.权利要求23所述的方法，其中至少一个所述过滤组件包括陶瓷过滤器、不锈钢过滤器、中空纤维过滤器、管状过滤器、螺旋形过滤器、平板过滤器或其它过滤器结构的至少一个。
31.权利要求30所述的方法，其中所述过滤器具有大约0.005微米至大约10微米的过滤器孔径。
32.权利要求30所述的方法，其中所述过滤器具有大约0.05微米至大约10微米的过滤器孔径。
33.权利要求23所述的方法，其中蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白、生物聚合物或小分子被回收。
34.权利要求23所述的方法，其中来自所述系统外部的进料包括细菌生产生物体的发酵产物。
35.权利要求34所述的方法，其中所述细菌生产生物体选自：芽孢杆菌各种(Bacillus sp)、埃希氏菌属各种(Escherichia sp)、泛菌属某种(Pantoea sp)、链霉菌属各种(Streptomyces sp)和假单胞菌属各种(Pseudomonas sp)。
36.权利要求23所述的方法，其中来自所述系统外部的进料包括来自真菌生产宿主的发酵产物。
37.权利要求36所述的方法，其中所述真菌生产宿主选自：曲霉属各种(Aspergillus sp)、木霉属各种(Trichoderma sp)、裂殖酵母属各种(Schizosaccharomyces sp)、酵母属各种(Saccharomyces sp)、镰刀菌属各种(Fusarium sp)、腐质霉属各种(Humicola sp)、毛霉属各种(Mucor sp)、克鲁维酵母属各种(Kluyveromyces sp)、罗威亚酵母各种(Yarrowia sp)、支顶孢属各种(Acremonium sp)、脉孢菌属各种(Neurospora sp)、青霉菌属各种(Penicilliumsp)、毁丝霉属各种(Myceliophthora sp)和梭孢壳属各种(Thielavia sp)。
38.权利要求23所述的方法，其中所述保留物包括细胞糊，并且所述方法进一步包括收集所述细胞糊。
39.权利要求23所述的方法，其中所述方法是微量过滤方法或超滤方法。
40.权利要求19所述方法的渗透产物。
41.权利要求21所述方法的渗透产物。
42.进料的膜分离的渗透产物，包括根据权利要求21所述的方法的酶，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，所述产物包括具有由活性蛋白与总蛋白比率增加所限定的活性高至少4％的酶源。
43.进料的膜分离的渗透产物，包括根据权利要求21所述的方法的酶，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，所述产物包括具有由活性蛋白与总蛋白比率增加所限定的活性高至少10％的酶源。
44.进料的膜分离的渗透产物，包括根据权利要求21所述的方法的酶，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，所述产物包括颜色浅至少40％的酶源，其中颜色基于使用分光光度计在470nm和/或520nm下测量的吸光度值。
45.进料的膜分离的渗透产物，包括根据权利要求21所述的方法的酶，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，所述产物包括活性/氮高至少3％的酶源。
46.进料的膜分离的渗透产物，包括根据权利要求21所述的方法的酶，相对于通过转鼓真空过滤获得的相似酶源的渗透产物，所述产物包括活性/碳高至少5％的酶源。
47.权利要求19所述方法的保留物产物。
48.权利要求22所述的方法，进一步包括：
i)经由渗透物再循环管道再循环渗透物至所述第一组件的所述进口侧，
ii)经由所述第一组件的所述出口侧的渗透物收回管道从所述系统收回渗透物，
iii)在所述随后组件的每一个，经由渗透物再循环管道将渗透物返回到同一组件的进口侧，
iv)从所述随后组件的每一个，经由渗透物再流通管道将渗透物反馈到所述系统内的直接在前组件，
v)将第一热交换器与所述渗透物收回管道热接触，
vi)将第二热交换器与至少一个渗透物再流通管道热接触，
vii)将冷却剂经由冷却剂供应管道与所述第一和第二热交换器的至少一个流动连通，并且任选地将冷却剂作为稀释剂引入所述组件的一个或多个。
49.权利要求48所述的方法，进一步包括将清洁化学药品直接引入到所述随后组件的每一个的进口侧。
50.权利要求22所述的方法，进一步包括将渗透物从所述随后组件的每一个经由各自的再流通管道反馈至直接在前组件的进口侧，和经由与所述再流通管道相连的一个或多个各自的放液管道使渗透物流转向，用于从所述系统收回渗透物。
51.权利要求50所述的方法，进一步包括合并所述第一组件与一个或多个所述随后组件的收回渗透物流，以有效提供具有目标总纯度的产物。
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