FR3005164A1 - Dispositif pour la preparation d'echantillon biologique - Google Patents
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Abstract
Dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan, un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comportant lui-même un moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe.
Description
Le domaine de la présente invention est celui de l'analyse microbiologique. Plus particulièrement, la présente invention concerne un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique en vue d'un diagnostic microbiologique. La filtration sous vide est utilisée de manière classique dans les laboratoires. Elle est utilisée de deux manières : - soit pour clarifier un échantillon. Le filtrat est alors gardé et le filtre jeté, - soit pour collecter et concentrer des particules ou microorganismes d'intérêt présents dans un échantillon liquide. Dans ce second cas, le filtrat est jeté, le concentrât et/ou le filtre sont conservés.
Un dispositif connu de l'état de l'art est l'entonnoir Büchner. Un tel dispositif est représenté sur la figure 1. Il comprend un entonnoir dans lequel est disposée transversalement une plaque perforée. L'entonnoir est emmanché de manière étanche dans le goulot d'une fiole à vide à l'aide d'un bouchon. La fiole à vide est connectée à une source d'aspiration. Sur la plaque perforée est disposé un papier filtre humidifié de sorte que des particules présentes dans un liquide versé sur la partie supérieure du papier puissent être retenues lors de l'aspiration. Le liquide filtré, ou filtrat, est collecté dans la fiole. Un tel dispositif présente plusieurs inconvénients. En effet, le filtre peut se boucher rapidement si le liquide contient trop de particules ou microorganismes ce qui peut empêcher la filtration de la totalité du volume. D'autre part, la grande surface de filtration, nécessaire pour pouvoir filtrer une quantité suffisante d'échantillon, peut nécessiter d'employer un volume important de liquide pour la remise en suspension complète des micro-organismes retenus sur le filtre, ce qui ne permet pas d'avoir un rapport de concentration optimal. Après avoir filtré l'échantillon grâce à ce dispositif, la collecte de particules d'intérêt ou microorganismes retenus sur le papier filtre est difficile et nécessite d'utiliser un écouvillon de manière manuelle. La récupération par écouvillon de manière automatique n'est pas évidente à réaliser de manière reproductible. De plus ce type de dispositif présente un deuxième rendement de relargage défavorable si le concentrât, notamment bactérien, doit être délivré sous forme liquide pour les besoins du protocole d'analyse. Enfin, lors des étapes de lavages du filtre ou de reprise des microorganismes avec une pipette, le liquide dispensé s'étale sur toute la surface du filtre, il est donc difficile de l'aspirer de nouveau. De ce fait, la séquence d'un protocole de filtration à l'aide de ce dispositif ne peut être automatisée facilement.
Un autre dispositif de l'art antérieur, décrit dans la demande de brevet US 2007/0298451 A1, comprend un bloc de filtration inférieur et un bloc de filtration supérieur. Le bloc de filtration supérieur comprend une paroi cylindrique d'un premier diamètre et une paroi cylindrique d'un diamètre inférieur reliée par une partie transversale. Sur la partie transversale est disposée une plaque perforée ainsi qu'une membrane de filtration. Le bloc de filtration inférieur comprend une paroi cylindrique d'un premier diamètre et une paroi cylindrique d'un diamètre inférieur reliée par une partie transversale. Sur la partie transversale est disposée une plaque perforée ainsi qu'une membrane de filtration. Une paroi cylindrique d'un diamètre encore inférieur est disposée en aval de la plaque perforée et reliée au bloc de filtration inférieur par une partie transversale, de manière à connecter une source d'aspiration au dispositif. Le bloc de filtration supérieur est emmanché sur le bloc de filtration inférieur. La membrane du bloc de filtration supérieur a une porosité supérieure à la membrane du bloc de filtration inférieur. De ce fait, en déversant un échantillon liquide sur la membrane du bloc de filtration supérieur et en activant la source d'aspiration, celui-ci est filtré une première puis une seconde fois. Bien que ce dispositif puisse présenter un meilleur rendement de filtration, notamment en effectuant des filtrations progressives, le liquide dispensé s'étale également sur toute la surface des deux membranes, rendant la collecte difficile. De plus, un bouchage, même partiel, d'une ou des membrane(s) peut entrainer une perte de charge lors de l'aspiration et ralentir voire empêcher la filtration. Le but de l'invention est donc de remédier aux inconvénients de l'art antérieur précité. Un premier objectif de la présente invention est ainsi de fournir un dispositif de traitement 25 d'échantillon biologique permettant de collecter les microorganismes contenus dans l'échantillon en éliminant des constituants de la matrice de ce dernier. De tels constituants pouvant être des sels dissouts, protéines, cristaux, mucus, cellules humaines, ou autres. Un deuxième objectif de l'invention est de fournir un dispositif de traitement d'échantillon 30 biologique permettant la purification rapide d'un contenu microbien pour analyse ultérieure ainsi que le lavage du filtre ou de la membrane de collecte. Un troisième objectif de l'invention est de fournir un dispositif de traitement d'échantillon biologique permettant à la fois de concentrer des microorganismes à la surface du filtre ou de la 35 membrane de collecte et de remettre en suspension les microorganismes ainsi concentrés, dans un volume de tampon limité.
Un quatrième objectif de l'invention est de fournir un dispositif de traitement d'échantillon biologique de sorte que les étapes du protocole de traitement utilisant le dispositif puissent être réalisées de façon totalement automatisées par un robot de pipetage approprié (e.g. Starlet d'Hamilton Robotics).
Ces objectifs parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne en premier lieu un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant : - un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan, - un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comportant lui-même un moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe.
Alternativement, l'invention a pour objet un dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant : - un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan, - un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comportant lui-même un moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, le second plan du moyen de filtration étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe, le bloc de filtration comporte en outre un réservoir de préfiltration pouvant être amovible, ledit réservoir de préfiltration comprenant un moyen de filtration divisant le réservoir de préfiltration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration étant en communication fluidique avec la zone de collecte du réservoir de collecte.
Alternativement, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration est adaptée pour être connectée à un second moyen d'aspiration. De manière avantageuse, la paroi de la zone de collecte du réservoir de collecte est en partie inclinée ou en forme d'ogive.
De manière avantageuse, le moyen de filtration du réservoir de collecte comprend au moins une membrane de porosité comprise entre 0,02 pm et 0,45 pm.
De manière avantageuse, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprend au moins un filtre de porosité comprise entre 5 pm et 1000 pm, préférentiellement entre 5 pm et 100 pm.
Alternativement, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprend un empilement de filtres. De manière avantageuse, le second plan du moyen de filtration du réservoir de collecte est incliné par rapport au plan de la base du support fixe d'un angle compris entre 100 et 60°, de préférence compris entre 20° et 50°, de préférence compris entre 25° et 450, plus préférentiellement égal à 30°. Alternativement, le réservoir de collecte comprend une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de collecte Alternativement, le réservoir de préfiltration comprend une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de préfiltration Alternativement, le réservoir de préfiltration comprend un moyen susceptible de coopérer avec un outil porte pipette pour robot pipeteur Alternativement le bloc de filtration comporte en outre un troisième réservoir de filtration pouvant être amovible, ledit troisième réservoir de filtration comprenant un moyen de filtration divisant le troisième réservoir de filtration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone de collecte du troisième réservoir de filtration étant en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de collecte. De manière avantageuse, le moyen d'aspiration est un moyen d'aspiration / refoulement.
De manière avantageuse, le second moyen d'aspiration pouvant être connecté à la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration est un moyen d'aspiration / refoulement. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un dispositif selon l'un quelconque des différents modes de réalisations présentés pour le traitement d'un échantillon biologique.35 L'invention a également pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'un quelconque des différents modes de réalisations présentés comprenant les étapes suivantes: - déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte, à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte - collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte Alternativement, l'invention a pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'invention comprenant les étapes suivantes: - déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration, - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte, - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte, - collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte. Alternativement, l'invention a pour objet un procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'invention comprenant les étapes suivantes: . - déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration, - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du second moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration, - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte, - collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte.35 Le dispositif inventé permet un accès aisé à la membrane afin de pouvoir exécuter des lavages ou collecter les microorganismes, par exemple par remise en suspension à la pipette ou par écouvillonnage.
L'inclinaison du second plan dans lequel s'étend le moyen de filtration du réservoir de collecte par rapport au plan de la base du support fixe peut être obtenue par la géométrie du support fixe sur lequel est disposé le bloc de filtration et/ou par inclinaison du moyen de filtration. A titre d'exemple, le support fixe peut comprendre un plan incliné par rapport à sa base, celle-ci étant à l'horizontale, le bloc de filtration étant disposé sur ce plan incliné et le moyen de filtration du réservoir de collecte s'étendant selon un plan parallèle à ce plan incliné. Grâce à cette inclinaison, lorsque le liquide est dispensé, en provenance du moyen de filtration du réservoir de préfiltration et/ou directement sur le moyen de filtration et/ou par aspiration/refoulement, il coule naturellement sur le moyen de filtration, où il peut être de nouveau aspiré sans perte significative de volume. Au fur et à mesure de la délivrance des jets de tampon de collecte, les microorganismes se concentrent vers la partie basse du moyen de filtration formant un angle fermé avec la paroi du réservoir de collecte. Le concentrât bactérien peut alors être récupéré dans un volume de tampon propre de 300 à 700 pL, soit un facteur 10 à 20 par rapport au volume initial d'échantillon. L'inclinaison du second plan du moyen de filtration par rapport au plan de la base du support fixe peut être comprise entre 100 et 60°, de préférence compris entre 20° et 50°, de préférence compris entre 25° et 450, plus préférentiellement égal à 30°. Le dispositif selon l'invention est facilement utilisable avec un pipeteur automatisé. Dans ce but, la paroi du réservoir de collecte peut présenter au moins une partie inclinée, ou en forme d'ogive, adaptée pour pouvoir présenter verticalement une pipette, en aplomb du concentrât de microorganismes. Cette géométrie facilite également les opérations de pipetage et/ou d'écouvillonnage, manuelles et/ou automatiques. L'intérêt d'un tel dispositif est de pouvoir être utilisé, sur un même type de dispositif, pour différents types d'échantillons (urines, hémocultures,....) de volumes différents (10 mL à 1 mL) en sélectionnant un protocole de traitement adapté à l'échantillon considéré. Ainsi, pour les hémocultures, le protocole est une lyse sélective suivie d'une unique filtration sur un moyen de filtration, par exemple une membrane. Pour des urines cliniques, le protocole consiste en une préfiltration sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration, suivie d'une filtration sur le moyen de filtration du réservoir de collecte, par exemple sur une membrane. Les deux protocoles peuvent avantageusement être suivis d'une ou plusieurs étapes de lavage du concentrât bactérien, à l'aide de solutions de lavage adaptées.
Par ailleurs, pour une approche d'Identification Typage Résistance Virulence (ITRV) de microorganismes, tel que des bactéries, par une technologie de spectrométrie de masse par Ionisation ElectroSpray (ESI), disposer des microorganismes en suspension liquide est plus pratique pour la suite du protocole (lyse suivie d'une extraction des protéines ou lyse suivie d'une digestion trypsique des protéines). L'intérêt d'un tel dispositif est également de pouvoir être jetable. Les matériaux utilisés pour sa réalisation étant peu couteux, le dispositif ou le bloc de filtration peut être à usage unique pour le traitement d'un échantillon. Le dispositif peut également être utilisé en vue de la préparation automatique de plaques MALDI-TOF après extraction des microorganismes à partir des échantillons biologiques. Les microorganismes pouvant par exemple être collectés directement sur le moyen de filtration du réservoir de collecte par un outil robotisé pour être déposés sur une plaque MALDI-TOF ou servir à la préparation d'une suspension de microorganismes concentrée et calibrée. De la même manière, les microorganismes peuvent être disposés dans une suspension liquide qui sera centrifugée afin de pouvoir récupérer un culot de microorganismes. Ce culot de microorganismes sera alors déposé sur une plaque MALDI-TOF.
Les buts et avantages du dispositif selon la présente invention seront mieux compris à la lumière des exemples nullement limitatifs qui suivent, en référence au dessin, dans lequel : La figure 1 est un dispositif de l'art antérieur La figure 2 est une représentation schématique en coupe d'un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention comprenant un bloc de filtration sur un support fixe incliné à 30°. La figure 3 est une représentation schématique en coupe du bloc de filtration, selon le premier mode de réalisation. La figure 4 est une représentation schématique en perspective du premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention. La figure 5 est une représentation schématique en vue de dessous du bloc de filtration, selon le premier mode de réalisation. La figure 6 est une représentation schématique en vue de dessus du bloc de filtration, selon le premier mode de réalisation.
La figure 7 est une représentation schématique en perspective du support fixe incliné à 30°, selon le premier mode de réalisation.
La figure 8 est une photographie du premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention. La figure 9 est une représentation schématique en perspective d'un second mode de réalisation du dispositif comprenant un support à coulisseau.
La figure 10 est une représentation schématique en coupe du second mode de réalisation du dispositif. La figure 11 est une représentation schématique en coupe du Détail A du second mode de réalisation du dispositif, tel que représenté sur la figure 10. La figure 12 est une représentation schématique en coupe du Détail B du second mode de réalisation du dispositif, tel que représenté sur la figure 10. La figure 13 est une représentation schématique en perspective du support de préfiltre du second mode de réalisation du dispositif. La figure 14 est une représentation schématique en perspective et en coupe du second mode de réalisation du dispositif présentant les flux d'aspiration « A » et « B ».
La figure 15 est une représentation schématique en perspective et en coupe du second mode de réalisation du dispositif sans l'étage de préfiltration présentant le flux d'aspiration « B » dans cette utilisation. La figure 16 est une représentation schématique en coupe du second mode de réalisation du dispositif sans l'étage de préfiltration, combiné à un dispositif de pipetage.
La figure 17 est un graphe illustrant les taux de préfiltration obtenus en utilisant le dispositif selon l'invention pour le traitement de différents échantillons d'urines inoculées. La figure 18 comporte trois graphes montrant la détection en ESI-MS de peptides spécifiques de l'espèce inoculée dans des bouteilles d'hémoculture en comparaison avec un contrôle négatif (hémoculture stérile). Cette figure 18 illustre une expérience utilisant le dispositif selon l'invention pour le traitement d'échantillons d'hémocultures inoculées. En référence aux figures 2 et 31e dispositif 100 est composé d'un support fixe 1 inclinée à 30° sur lequel est installé un bloc de filtration 2 pouvant être amovible. Le bloc de filtration 2 comprend un moyen de filtration également appelé préfiltre ou un empilement de préfiltres 3 contenu dans un réservoir de préfiltration 4 et qui permet de clarifier les solutions à filtrer sans retenir les microorganismes. Le bloc de filtration comprend également un réservoir de collecte 5 avec un moyen de filtration, par exemple une membrane 6 disposée dans le fond du réservoir. Alternativement, l'angle de 30° entre le plan selon lequel s'étend le moyen de filtration du réservoir de collecte et le plan de la base 110 du support fixe 1 est obtenu par une inclinaison du support fixe 1 et/ou du bloc de filtration 2 et/ou de la membrane 6. Alternativement, le réservoir de collecte 5 présente au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée 11. Le réservoir de collecte 5 est obturé par un moyen d'obturation. Ce moyen d'obturation est par exemple constitué par un film d'operculage 50, tel que représenté sur la figure 2. Ce film d'operculage permet de maintenir un état dépressionnaire en aval du ou des préfiltre(s) lors de l'opération de filtration de milieux complexes tels que l'urine. Le film d'operculage 50 peut être un film autocollant notamment de type polypropylène bi-axial orienté (BOPP), polytéréphtalate d'éthylène (PET), polyester (PE), aluminium/PE. Un tel film autocollant peut être décollé aisément par un opérateur ou par le biais d'un automate. Alternativement, le film peut être soudé sur le bloc de filtration 2, par tout moyen approprié (soudure ultrasons, thermoscellage, ...). Un tel film est alors percé pour un outil approprié, pouvant coopérer avec le porte-outil d'un automate. Selon une alternative, le moyen d'obturation peut être constitué par une pièce de type couvercle en matière plastique comportant un mécanisme d'ouverture adéquat, permettant d'assurer l'étanchéité nécessaire lorsqu'il est positionné sur le réservoir de collecte 5, pour générer l'état dépressionnaire tout en permettant lorsqu'il est relevé de pouvoir accéder au réservoir de collecte.
En référence à la figure 4, le dispositif est relié à un système d'aspiration sous vide (par exemple une pompe), non représenté, et une poubelle qui collecte les liquides filtrés. L'aspiration se fait au travers des orifices d'aspiration du préfiltre 7 et de la membrane 8 situés surie support fixe 1. - L'étanchéité entre le bloc de filtration 2 et le support fixe 1 peut être obtenue par tout moyen approprié. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration 2 est vissé sur le support fixe 1 et un joint, non représenté, est placé entre le bloc de filtration 2 et le support fixe 1 - Une vanne, non représentée, permet de gérer le protocole en aspirant soit au niveau du préfiltre 3, soit au niveau de la membrane 6 (soit en aspiration continue en aval de la membrane et en aspiration alternée en aval du préfiltre). La vanne peut être intégrée au système d'aspiration sous vide ou faire partie intégrante du dispositif de filtration. Tel que représenté sur les figures 5 et 7, le bloc de filtration 2 peut être amovible. Dans ce cas, l'orifice d'aspiration du préfiltre 7 est en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration 4 par l'intermédiaire d'un orifice 71 sur le bloc de filtration 2 lorsque celui-ci est disposé sur le support fixe 1. De même, lorsque le bloc de filtration 2 est disposé sur le support fixe 1, l'orifice d'aspiration 8 de la membrane communique avec la partie débouchante 81 du réservoir de collecte 5 elle-même en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de collecte 5.
En référence à la figure 6, on constate que le réservoir de collecte 5 présente au moins une paroi dont au moins une partie 11 est inclinée. Afin de réaliser une étape de préfiltration d'un échantillon utilisant le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention et en référence aux figures 4 et 5, une vanne, non représentée, permet de gérer le protocole en aspirant, soit en aval du préfiltre 3, soit en aval de la membrane (soit en aspiration continue en aval de la membrane et en aspiration alternée en aval du préfiltre). Le liquide à traiter, par exemple de l'urine, est pipeté dans le réservoir de préfiltration 4 au-dessus du préfiltre 3. La pompe à vide est mise en fonction. La vanne est réglée pour aspirer à travers le préfiltre 3 par l'intermédiaire de l'orifice d'aspiration du préfiltre 7 et, le cas échéant, l'orifice 71. Une fois le liquide préfiltré, celui-ci est dirigé naturellement par la géométrie du dispositif et stocké au-dessus de la membrane de rétention des microorganismes 6. Le liquide préfiltré transite ainsi par un réservoir intermédiaire 9, disposé entre le préfiltre 3 et le réservoir de collecte 5, tel que représenté sur la figure 5. Afin de réaliser une étape de filtration d'un échantillon sur la membrane 6 et en référence aux figures 4 et 5, la vanne est réglée pour aspirer au niveau de ladite membrane 6 par l'intermédiaire de l'orifice d'aspiration de la membrane 8 et, le cas échéant, la partie débouchante 81 du réservoir de collecte 5. Les microorganismes sont collectés sur cette membrane 6. La porosité de cette membrane est inférieure au diamètre des microorganismes à collecter. Préférentiellement, la porosité est comprise entre 0,22 et 0.45 pm. La membrane peut être lavée afin de purifier les microorganismes. Avantageusement, la paroi du réservoir de collecte 5 comprend au moins une partie inclinée 11 ou au moins une partie en forme d'ogive.
Cette forme de la paroi permet, en coopération avec l'inclinaison de la membrane 6 de favoriser la rétention des microorganismes dans un zone préférentielle, correspondant à la partie basse du moyen de filtration 3. Cette partie forme alors un angle aigu entre le moyen de filtration 3 et la paroi du réservoir de collecte 5. Ainsi, dans une étape ultérieure de récupération des microorganismes, une remise en suspension dans un volume réduit de liquide et plus facilement réalisable notamment de manière automatique. L'accessibilité à cette zone est également améliorée. Avantageusement, cette rétention des microorganismes dans une zone préférentielle permet de localiser les microorganismes dans une zone délimitée et prédictible, ce qui favorise un rendement plus élevé de récupération par un automate ne disposant pas de système de vision destiné à localiser un tapis bactérien sur la surface de la membrane.
A la suite de cette étape de filtration sur la membrane 6 et en référence à la figure 8, la pompe à vide est éteinte afin de ramener la pression en aval de la membrane 6 à pression atmosphérique. Les microorganismes adhèrent alors à la membrane 6 et peuvent être récupérés / collectés de différentes façons et de manière non limitative : - par remise en suspension à la pipette 10 avec un liquide (éjection rapide d'un liquide, par exemple un tampon neutre ou solvant), voir figure 8. Dans ce but, le réservoir de collecte 5 présente avantageusement au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée 11 de manière à permettre à la pipette 10 présentée verticalement de venir prélever les microorganismes collectés sur toute la surface de la membrane 6, sans heurter la paroi du réservoir de collecte 5; - par écouvillonnage de la surface de la membrane 6: soit avec un écouvillon seul, soit avec un dispositif combinant un cône de pipetage comprenant un écouvillon à son extrémité. Un tel dispositif comprend un cône de pipetage, dont l'extrémité débouchante venant aspirer le liquide, est enveloppée par la partie poreuse d'un écouvillon. L'avantage d'un tel dispositif est de pouvoir aspirer le liquide grâce au cône de pipetage, au travers de la partie poreuse de l'écouvillon, puis de venir au contact de la membrane, ou de tout moyen de filtration du réservoir de collecte, pour « décoller » le rétentât de microorganismes par abrasion, cette opération n'étant pas réalisable avec l'extrémité classique d'un cône de pipetage ; - En récupérant directement la membrane 6 puis remise en suspension dans un tube ou lyse directe des microorganismes. La membrane 6 est alors montée de manière amovible dans le réservoir de collecte 5; - Par rinçage : arrivée du liquide par la face arrière de la membrane 6. La face arrière de la membrane étant la face dirigée en regard de l'orifice d'aspiration de la membrane 8 et le cas échéant de la partie débouchante 81 du réservoir de collecte 5. Alternativement, le liquide (tampon neutre, tampon contenant des détergents ou solvant) est déposé sur la membrane 6 dans le réservoir de collecte 5, aspiré, puis refoulé par la face arrière de la membrane 6. Cette opération d'aspiration refoulement peut être réalisée à plusieurs reprises.
Les différentes méthodes de récupération / collecte pourront être adaptées en fonction des microorganismes recherchés ou du type d'échantillon. En effet, certains rétentâts de microorganismes présentent une adhérence très forte à la membrane. La collecte des microorganismes est alors impossible par éjection rapide d'un liquide, le jet de liquide n'étant pas suffisamment puissant pour décoller le rétentât. Seule une technique par abrasion (à l'aide d'un écouvillon ou d'un cône de pipetage enveloppé par la partie poreuse d'un écouvillon à son extrémité) étant alors efficace pour décoller le rétentât de la membrane. Un second mode de réalisation est illustré sur la figure 9. Dans ce mode de réalisation, le dispositif est composé d'un support fixe 20 sur lequel est installé un bloc de filtration 22 pouvant être amovible. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration 22 est maintenu sur le support 20 par l'intermédiaire de deux coulisseaux 23. Le dispositif est relié à un système d'aspiration sous vide (par exemple une pompe), non représenté, et une poubelle qui collecte les liquides filtrés. L'aspiration se fait au travers des orifices d'aspiration du préfiltre 24 et de l'orifice d'aspiration de la membrane 25 situés sur le support fixe 20. Le support fixe 20 comprend ainsi plusieurs orifices d'aspiration formant deux circuits d'aspiration matérialisés par les flèches « A » et « B ». Les deux circuits d'aspiration permettent ainsi d'aspirer en aval de la membrane et/ou en aval du préfiltre indépendamment, par l'intermédiaire des zones d'aspiration des réservoirs de collecte et de préfiltration. Alternativement, si l'aspiration est suffisante en aval de la membrane, le dispositif peut être maintenu sur le support sans l'utilisation de coulisseaux. L'étanchéité entre le bloc de filtration 22 et le support fixe 20 peut être obtenue par tout moyen. Dans le mode de réalisation présenté, le bloc de filtration 22 est maintenu sur le support fixe 20 et deux joints toriques, non représentés, sont placés entre le bloc de filtration 22 et le support fixe 20 afin d'assurer l'étanchéité des circuits d'aspiration « aspiration A » et « aspiration B ». En référence à la figure 10, le bloc de filtration 22 comprend un moyen de filtration , également appelé préfiltre ou un empilement de préfiltres 26, contenu dans un réservoir de préfiltration 28 et qui permet de clarifier les solutions à filtrer sans retenir les microorganismes. Le bloc de filtration 22 comprend également un réservoir de collecte 30, un moyen de filtration, par exemple une membrane 32, disposé dans le fond du réservoir de collecte 30. La membrane 32 est inclinée d'un angle de 30° par rapport au plan formé par la base 200 du support fixe 20, soit de 60° par rapport à la verticale. Alternativement, le réservoir de collecte 30 présente au moins une paroi dont au moins une partie 34 est inclinée ou en forme d'ogive. Le bloc de filtration 22 pouvant être amovible, l'orifice d'aspiration du préfiltre 24 coopère alors avec un orifice 241 sur le bloc de filtration 22. De même, l'orifice d'aspiration de la membrane 25 coopère avec la partie débouchante du réservoir de collecte 251.
Une vanne, non représentée (intégrée ou non au dispositif), permet de gérer le protocole en aspirant soit en aval du préfiltre 26, soit en aval de la membrane 32 (soit en aspiration continue en aval de la membrane 32 et en aspiration alternée en aval du préfiltre 26.
En référence à la figure 11 correspondant au Détail A, le réservoir de collecte 30 peut être réalisé en deux parties assemblées 36 et 38. Dans ce mode de réalisation, la partie supérieure 36 et la partie inférieure 38 coopèrent pour maintenir la membrane 32 en position, par exemple par l'intermédiaire de deux ergots 40. Avantageusement, les deux pièces 36 et 38 sont soudées pour maintenir la membrane.
En référence à la figure 12 correspondant au Détail B, le réservoir de préfiltration 28 peut être réalisé en deux parties assemblées, une partie supérieure 42 et une partie inférieure 44 qui sert de support au préfiltre 26. Dans ce mode de réalisation, la partie supérieure 42 et le support de préfiltre 44 coopèrent pour maintenir le préfiltre 26 en position. Avantageusement et tel que représenté sur la figure 14, la partie supérieure 42 comprend un moyen 33 susceptible de coopérer avec un outil porte pipette d'un robot pipeteur. Le moyen 33 peut également revêtir une forme adéquate (par exemple un ou des orifice(s) ou ergot(s)) permettant d'être manipulé de manière automatique par un élément mécanique (tel qu'une pince) ou directement par l'embout d'un canal de pipetage intégré dans le robot. Avantageusement, ce moyen 33 peut comprendre une partie cylindrique dans laquelle l'outil porte-pipette peut venir s'insérer et être maintenu de manière à soulever le réservoir de préfiltration 28 et dégager ainsi l'accès à la membrane 32. Dans un mode de réalisation particulier, cette partie cylindrique est maintenue par un ensemble de nervures disposées radialement sur la partie cylindrique de manière à définir au moins un moyen d'accès au préfiltre ou à l'empilement de préfiltres 26. Ce moyen d'accès permettant à un appareil tel qu'un robot pipeteur de présenter un outil à la verticale du préfiltre ou de l'empilement de préfiltre pour venir y dispenser un liquide (e.g. l'échantillon à traiter) et ce, sans manipuler ni heurter la partie supérieure 42. En référence à la figure 13, le support de préfiltre 44 peut présenter des saillies 46 s'étendant radialement par rapport à l'orifice d'aspiration 45 du support de préfiltre 44. Les saillies 46 sont disposées sur la face en regard du préfiltre, afin de maintenir le préfiltre en position tout en facilitant l'écoulement du filtrat. Avantageusement, les saillies 46 s'étendent radialement par rapport à l'orifice d'aspiration 45 et selon un ou des cercle(s) concentriques ayant pour centre l'orifice d'aspiration 45. La support de préfiltre 44 permet à la fois de supporter le préfiltre ou l'empilement de préfiltres 26 et d'assurer l'étanchéité du réservoir de collecte lors de la mise au vide de ce réservoir, permettant ainsi le passage efficace de l'échantillon à travers le préfiltre ou l'empilement de préfiltres 26.
En référence à la figure 14, un protocole de filtration d'échantillon d'urine utilisant le second mode de réalisation du dispositif comprend les étapes suivantes 1ère étape : Déverser l'urine sur le préfiltre 26. Dans le cas d'un protocole automatisé, l'urine peut être déversée par un robot pipeteur venant se présenter à la verticale du préfiltre 26 au travers du moyen d'accès au préfiltre de la partie supérieure 42. Alternativement, l'urine peut être déversée, manuellement ou automatiquement, directement sur le préfiltre 26 dans le cas où la partie supérieure 42 n'est pas présente. 2ème étape : Activer l'aspiration « A » par l'intermédiaire des orifices d'aspiration 24 et 241.
L'urine passe à travers le préfiltre 26 et se dépose sur la membrane 32. 3ème étape : Activer l'aspiration « B » par l'intermédiaire des orifices d'aspiration 25 et 251. Les microorganismes restent sur la membrane 32. pendant que le « déchet » est aspiré vers la poubelle. 4ème étape : Retirer le réservoir de préfiltration 28 pour accéder à la membrane 32, par exemple à l'aide d'un moyen automatisé tel qu'un outil de robot utilisé pour manipuler des pipettes. 5ème étape : Eventuellement réaliser une ou plusieurs étapes de lavage de la membrane et des microorganismes en distribuant à la pipette (manuelle ou automatisée) des volumes de tampon. 6ème étape : Récupérer les microorganismes. Les microorganismes étant alors concentrés par la force de pesanteur et l'action de l'aspiration dans la partie basse de la pente formée par la membrane 32 et la paroi du réservoir de collecte 30, celle-ci comprenant avantageusement une forme inclinée 34 ou d'ogive. Les microorganismes étant alors concentrés dans une zone délimitée pour permettre la récupération des microorganismes par un robot de pipetage automatique dans un volume réduit de liquide. L'étape de récupération / collecte de microorganismes sur la membrane 32 peut être réalisée par les même moyens que ceux énoncés pour le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention.
En référence à la figure 15, un protocole de filtration d'échantillon de sang utilisant le second mode de réalisation du dispositif sans le réservoir de préfiltration 28 comprend les étapes suivantes 1ère étape : Déverser le sang sur la membrane 32. 2ème étape : Activer l'aspiration « B » par l'intermédiaire des orifices d'aspiration 25 et 251.
Les microorganismes restent sur la membrane 32 pendant que le « déchet » est aspiré vers la poubelle. 3ème étape : Eventuellement réaliser une ou plusieurs étapes de lavage de la membrane et des microorganismes en distribuant à la pipette (manuelle ou automatisée) les volumes de tampon. 4ème étape : Récupérer les microorganismes.
En référence à la figure 16, la récupération des microorganismes peut se faire par remise en suspension à la pipette 48 avec un liquide (éjection rapide du liquide, par exemple un tampon neutre, tampon avec détergents ou solvant). Dans ce but, le réservoir de collecte 30 peut présenter au moins une paroi dont au moins une partie est inclinée 34 de manière à permettre à une pipette 48 présentée verticalement de venir prélever les microorganismes collectés sur toute la surface de la membrane 32 sans heurter la paroi du réservoir 30. Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, le dispositif selon l'invention peut également être utilisé avec un écouvillon pour la collection des microorganismes concentrés et retenus sur le moyen de filtration du réservoir de collecte, par exemple une membrane. La collection par écouvillon peut être réalisée soit manuellement soit de manière automatique moyennant une adaptation de l'outil de préhension d'un robot pipeteur. Le dispositif selon l'invention fonctionne également avec différents type de filtres utilisés dans le réservoir de préfiltration ou le réservoir de collecte, seul ou empilés, et différentes membranes seules ou empilées. Pour certains liquides peu complexes, le réservoir de préfiltration n'est pas utile. Les échantillons sont directement déposés au-dessus du moyen de filtration du réservoir de collecte, par exemple sur une membrane de filtration, plus particulièrement sur une membrane de 0,2 pm de porosité. Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, des matériaux de filtration pouvant être utilisés comme moyen de filtration sont donnés à titre d'exemples dans le tableau 1. La taille des pores est adaptée suivant la taille des débris à filtrer. La taille des pores du matériau utilisé comme moyen de filtration peut atteindre 1mm pour permettre de filtrer de gros débris. Code fournisseur matériau Tailles des pores (0 en pm) Grille Grille < 1000 (1mm) Filtrona Filtrona > 100 VFE (2mm) Whatman Fibre de verre 5 Pall PAD Pall Cellulose Pall 10 Pall PPE 10 Coton Magasin grand public Coton Coton20 Prat-Dumas Coton 20 4 Whatman Cellulose 20-25 40 Whatman Cellulose 8-12 41 Whatman Cellulose 12-16 43 Whatman Cellulose 10-15 113 Whatman Cellulose 20 Tableau 1 : exemple de matériaux de filtration Les moyens de filtration du réservoir de préfiltration, également appelés préfiltres ou empilements de préfiltres utilisés dans le dispositif selon l'invention sont également donnés ci- après. Alternativement, les matériaux employés comme moyen de filtration du réservoir de préfiltration peuvent être employés comme moyen de filtration du réservoir de collecte, seul ou empilés. Le dispositif selon l'invention, également appelé dispositif de double-filtration et tel que décrit précédemment est ici appliqué au traitement d'urines inoculées. Dans le tableau comparatif 2, pour chaque moyen de filtration du réservoir de préfiltration, 9 ml d'un ensemble d'échantillons d'urines mélangés constitué de 10 tubes d'urines pathologiques est introduit sur le moyen de filtration dans le réservoir de préfiltration dans lequel on fait le vide doucement au moyen d'une vanne trois voies. Quand le volume est passé au travers du ou des préfiltres, la vanne trois voies est basculée lentement en position Filtre pour faire passer l'urine à travers le moyen de filtration du réservoir de collecte, ici une membrane PES 0,45 pm. La vanne est remise en position fermée. Le culot bactérien est lavé sur la membrane avec 1 ml de tampon carbonate 50 mM pH8 (vanne filtre ouverte) puis est récupéré avec 400 pl de tampon carbonate (vide stoppé et dispositif remis à pression atmosphérique) ; le volume récupéré varie de 300 à 400 pl. Le volume collecté a été divisé en deux parts dont une part pour réaliser un dosage de protéines après lyse (protocole lyse P2). Les urines polymicrobiennes contenaient majoritairement : - E.aerogenes: 1,2e7 CFU/mL - E.coli: 3e6 CFU/mL - S.aureus: 1e5 CFU/mL Le tableau comparatif 2 récapitule les observations faites durant les essais ainsi que les résultats de dénombrement du nombre de CFU par comptage sur boites de gélose bioMérieux chroml D® CPS et les résultats de dosage des protéines. Observations sur géloses CPS Réf. essais Réf. Durée Durée Durée Volume Masse Numération bleu vert rose violet beiges préfiltres préfiltration filtration filtration récupération protéines tampon lavage culot après lyse bactérien P2 (Itg/essai) 1-1 2*VFE + , lminute 30 secondes 340à1 63 >1E+7 nombre env égal nombre env égal qq unes filtrona negl geable pb de vanne (fendue) 9m1 filtrés aux rose violet aux bleu vert préfiltres jaunes 1-2 2*VFE + négligeable préfiltres jaunes 3 minutes 50 secondes 350à1 61 1E+04 nombre env égal nombre env égal qq unes filtrona 9m1 filtrés aux rose violet aux bleu vert 2-1 PALL10+ négligeable préfiltres clairs arrêt à 3min 3 min50 avec 390à1 45 1E+04 nombre env égal nombre env égal env. 10 COTON20+ lent+colmatage 4,5m1 filtrés assistance aux rose violet aux bleu vert filtrona 2-2 PALL10+ négligeable préfiltres clairs arrêt à 3min 3 min50 avec 390à1 53 1E+05 nombre env égal nombre env égal env. 10 COTON20+ lent+colmatage assistance aux rose violet aux bleu vert filtrona 5m1 filtrés 3-1 Wattman rapide 2min40 50 secondes 400à1 26 1E+07 nombre env égal nombre env égal qq unes 43+113+4 mais mousse ds partie filtration 9m1 filtrés aux rose violet aux bleu vert 3-2 Wattman PF 4 : sale arrêt à 3min 2min avec 410à1 45 1E+08 plus que rose violet moins que bleu vert qq unes 43+113+4 PF 113 : sale lent+colmatage assistance PF 43 : sale 8,3 ml filtrés 4-1 Wattman rapide? 2min 30 secondes 300à1 21 1E+07 majoritaires b en moins que qq unes 40+41+113+4 présence mousse 9m1 filtrés? bleu vert 4-2 Wattman rapide? membrane déchirée : culot non récupéré 40+41+113+4 présence mousse 5-1 PalIPAD+coto nbb négligeable 3min 3min avec 390à1 65 1E+07 nombre env égal nombre env égal qq unes 6m1 filtrés assistance aux rose violet aux bleu vert 5-2 PalIPAD+coto nbb négligeable 3min 3min avec 400à1 59 1E+07 majoritaires moins que bleu vert qq unes 5,5ml filtrés assistance Tableau comparatif 2 : préfiltres Préférentiellement, les empilements de préfiltres pouvant être utilisés comme moyen de filtration du réservoir de préfiltration sont : - 2 * VFE + Filtrona - VVhatmann Paper Filter 43+113+4 - VVhatmann Paper Filter 40+41+113+4 - PalIPAD + Coton Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, les membranes pouvant être utilisées, notamment comme moyen de filtration du réservoir de collecte et à titre d'exemple sont : - Supor PES 450 membrane, (Pall Gelmann) - Supor PES 200 membrane, (Pall Gelmann) - Supor 0.2 Mach V membrane (From Nalgen Filtration Unit) - Express 0,45 (Millipore) - GF/F glass fiber depth filter (VVhatman) - Des membranes polymères ayant des porosités entre 0,22 et 0,45pm : en polypropylene, en Polyethersulfone (PES), en Nylon (Polyamide), en Polytetrafluoroethylen (PTFE), en polycarbonate, en polyester, ou à base de cellulose (Cellulose régénérée, acetate de cellulose, nitrate de cellulose, Mixted Cellluose Ester). - Des membranes Type Anopore (Anodisc) en aluminium oxide avec des porosité de 0,02 pm (pour les applications de type purification d'exosomes) - Les membranes de filtration peuvent être des matériaux à basse de silice, polymeres, acetate ou oxide d'alumine à titre d'exemple.
Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, les écouvillons pouvant être utilisés en combinaison avec l'utilisation d'un cône de pipetage sont : - écouvillon 1 (VVVR) référence 1490241 Flexible swab - écouvillon 2 (Texwipe) référence TX745B Hard swab Dans cette utilisation, la partie poreuse de l'écouvillon est dissociée du manche pour venir envelopper la partie débouchante, venant habituellement pipetter le liquide, d'un cône de pipetage. Le moyen de filtration du réservoir de collecte s'étendant selon un second plan, peut être inclinée d'un angle différent de 30°, soit entre 10 et 60°(qui correspond à un angle entre 30 à 80° par rapport à la verticale) par rapport au plan formé par la base du support fixe. Ceci tout en permettant la concentration des échantillons et leur collecte par un moyen de collecte tel qu'une pipette ou un écouvillon. Quel que soit le mode de réalisation envisagé, et de manière non limitative, le dispositif peut être muni d'un 3ème réservoir comprenant un troisième moyen de filtration. Ceci afin de réaliser un nouvel étage de filtration pour des composés recherchés dont la taille est comprise entre 0,02 et 0,2 pm tel que des micro-vésicules ou des exosomes. Le dispositif et procédé correspondant peut être utilisé pour collecter des microorganismes de manière automatique à partir d'échantillons d'urine et d'hémoculture ainsi que pour extraire des éléments biologiques de petite taille tel que des exosomes ou des microvésicules. Le dispositif peut ainsi être employé dans le domaine de l'oncologie en permettant par exemple de concentrer les exosomes (90 nm de diamètre), connus comme marqueur du cancer. La valeur ajoutée est de proposer un procédé rapide, générique et simple pour extraire des exosomes ou microvésicules à partir d'échantillons de salive, sérum ou plasma. Dans ce procédé, le moyen de filtration du réservoir de collecte est une membrane de porosité 0,02 pm. Eventuellement un autre mode de réalisation comprend un troisième réservoir contenant un troisième moyen de filtration en aval du moyen de filtration du réservoir de collecte comprenant une membrane de porosité de 0,02 pm.
EXEMPLES D'UTILISATION DU DISPOSITIF SELON L'INVENTION: Le dispositif selon l'invention a été testé sur deux types d'échantillons : urines (cliniques et inoculées) et hémocultures (cliniques et inoculées) Une partie des expériences a pour but d'estimer l'efficacité du dispositif à collecter et restituer les microorganismes (rendement de collecte des microorganismes). Une seconde partie des expériences se déroule jusqu'à l'analyse finale en spectrométrie de masse (ESI ou MALDI) pour identifier ces microorganismes. 25 Exemple 1 : Expériences en urines inoculées : Résultats sur les trois microorganismes en mode automatique Microorganismes EC (Escherichia cou), SE (Staphilococcus epidermidis) et CA (Candida albicans).
MO EC SE CA Réplicat 1 100 37 12 2 78 44 20 3 88 35 18 4 92 40 9 5 91 38 8 6 7 7 15 Tableau 3: Rendement de récupération (%) des microorganismes E.C, S.E et C.A sur plusieurs réplicats.
Le rendement est défini comme le ratio de la quantité de microorganismes récupérée sur la membrane à la fin du protocole sur la quantité de microorganisme introduite en solution sur le préfiltre. Cette expérience, illustrée sur la figure 17, permet de conclure au bon fonctionnement du dispositif selon l'invention. Il permet de filtrer efficacement 10 mL d'urine et d'en collecter une fraction non négligeable des microorganismes.
Exemple 2 : Expériences en urines saines inoculées : sur automate pipeteur (4 dispositifs parallèles).
Rendement de filtration sur les microorganismes EC (Escherichia cou) et CA (Candida albicans) pour différentes configurations (volume et distance à la verticale du filtre) de remise en suspension. Rendement moyen sur 4 échantillons EC CA Jet faible volume et distance 1 mm 69% 29% Jet faible volume et distance 3 mm 59 `)/0 Jet grand volume 73 `)/0 27 `)/0 et distance 3 mm Jet grand volume 59 `)/0 et distance 5 mm Référence en 82 `)/0 manuel Tableau 4 présentant le rendement de récupération des microorganismes E.0 et C.A sur plusieurs réplicats en faisant varier la méthode de remise en suspension automatisée. Cette expérience a permis de conclure sur la faisabilité d'automatisation du dispositif et sur l'impact du type de la remise en suspension sur le rendement de récupération.
Exemple 3 : Expérience avec des urines pathologiques : Résultats de détection de peptides E.coli en LC-ESI MS (mode MRM) Un lot de quinze urines pathologiques a été traité par double-filtration (DF) avec le dispositif selon l'invention. Le moyen de filtration du réservoir de préfiltration est constitué d'un empilement de préfiltres (ordre allant du bas vers le haut, le préfiltre placé en haut étant le premier à recevoir le liquide): Nylon 30 pm / 2x VFE 5pm / Filtrona 2 mm ou 4 mm (ie 2x2 mm) et comme moyen de filtration du réservoir de collecte une membrane PES 0,45 pm (Pall). L'enchaînement des étapes de pré-filtration / filtration pour 6 à 10 mL d'urine se réalise au maximum en 3 minutes.
Après un lavage avec 1mL d'eau, le rétentât a été collecté par remise en suspension dans 400 pl de tampon carbonate puis soumis au protocole de lyse-digestion (version manuelle) pour être injecté en LC-ESI MS avec une méthode d'acquisition développée de façon non optimisée pour rechercher des peptides qu'on retrouve chez E.Coli. La méthode MRM cible 60 peptides dont 7 sont spécifiques de l'espèce E.coli et 9 communs à la famille des entérobactéries, les 44 restant doivent être génériques aux Gram-. Le tableau 5 montre qu'après le traitement par double filtration d'urines de compositions très diverses (quantité de globules blancs, rouges, cellules épithéliales), les peptides spécifiques de E.coli sont dans l'ensemble bien détectés pour les urines contenant l'espèce E.coli d'après les résultats d'identification sur un automate bioMérieux VITEKO2 fournis. Pour ces mêmes urines, la détection des peptides communs aux entérobactéries est également correcte puisque l'espèce E.coli appartient à cette famille. Les urines u10 et u13 contenant des bactéries de la famille des entérobactéries présentent bien des peptides spécifiques de cette famille sans la présence des peptides spécifiques de E.coli. L'urine u9 identifiée C.Koseri aboutit à la détection de peptides spécifiques de E.coli et de peptides communs à la famille entérobactéries. Cette présence d'une population d'E.coli conjointement à des colonies de C.Koseri est également observée sur milieu de culture bioMérieux ChromIDO CPS. observations/ identifications données par l'hôpital Cellules de KOVA CPS Vitek2 urine Leucocytes (MIL) Hematies (MIL) autres paramètres (cfu/mL) identification(s) u2 400 <5 RAS 10*7 E.Coli u5 1400 <5 RAS 10*7 E.Coli u6 950 2100 Cylindres hématiques 10*7 E.coli u14 3700 <5 RAS 10*7 E.Coli u7 120 230 RAS 10*7 E.Coli ; Enterococcus u9 250 40 RAS 10*7 C.Koseri u8 >5000 NP RAS 10*6 E.Coli u15 >5000 400 RAS 10*7 E.Coli ; Enterococcus u1 >5000 NP RAS 10*7 E.Coli u10 2600 130 Levures 10*7 E.Cloacae, C.albicans, C.non albicans u13 3700 <5 RAS 10*7 Morganella morganii u4 850 <5 RAS 10*6 E.Coli u3 240 1400 Cellules épithéliales 10*4 polymicrobienne un >5000 670 RAS 10*3 polymicrobienne u12 390 90 RAS 0 Stérile Résultats bioMérieux LC-ESI-MS/MS méthode MRM EC5 N peptides totaux détectés peptides peptides de la (/60) spécifiques famille des E.coli détectés enterobacteries (maxi=7) détectés (max=9) 59 59 59 58 55 48 47 21 27 1 35 0 25 0 2 0 0 7 0 0 1 0 0 3 0 0 Tableau 5 Le tableau 6 donne les scores de bonne identification de l'espèce E.coli dans un premier lot d' urines pathologiques. résultats ESI-MS/MS 7 peptides spécifiques de E.coli peptides avec score détectés Peptides détectés 1 <score <3 peptides non (I 3 (/ 7) détectés 7) Lot n° un. N (%) N (%) N (%) Urines urines urines urines contenant E.coli total 10 8 80% 1 10% 1 10% Mono 5 4 80% 1 20% 0% Bimicrobial 5 4 80% 0% 1 20% Tableau 6 15 Un second lot de d'urines pathologiques a donné des résultats confirmant l'efficacité de notre protocole de préparation d'échantillons en amont d'analyses LC-ESI MS en mode ciblé comme l'illustre le tableau 7 pour les cinq urines qui contenaient l'espèce E.coli. résultats ESI-MS/MS 7 peptides spécifiques de E.coli peptides détectés Peptides détectés avec score 3 1 5 score <3 (/ 7) (/ 7) Lot n° deux. N (%) N (%) Urines urines urines contenant E.coli total 5 4 80% 1 20% Mono 2 1 50% 1 50% Bimicrobial 3 3 100% 0% 20 Tableau 7 Expérience avec urines pathologiques : Résultats d'identification par MALDI-TOF Quinze urines pathologiques ont été traitées par double filtration avec le dispositif selon l'invention avec comme moyen de filtration du réservoir de préfiltration un empilement de 25 préfiltres (ordre allant du bas vers le haut, le préfiltre placé en haut étant le premier à recevoir le liquide): 2x VFE 5pm / Filtrona 2mm et comme moyen de filtration du réservoir de collecte une membrane PES 0,45pm (Pall). Après la rétention des microorganismes sur la membrane, 10 celles-ci ont été lavées 1 fois par 1 mL d'eau puis collectées en réalisant une trentaine d'aspirations refoulements avec 400 pL d'eau. Les suspensions obtenues ont été centrifugées 5 min à 10000g pour sédimenter les microorganismes et retirer le surnageant. Le culot bactérien a été déposé sur une cible MALDI-TOF avant ajout de la matrice Acide a-cyano-4- hydroxycinnamique (matrice HCCA) ou avec ajout d'acide formique (AF), sèchage puis ajout de la matrice HCCA. Les spectres MALDI-TOF ont été obtenus avec un spectromètre Shimadzu piloté par Launchpad (appareil bioMérieux VITEK® MS). Les résultats d'identifications donnés selon le tableau 8 ont étés obtenus par interrogation de la base de données" bactéries". observations / identifications données par l'hôpital N° Leucocytes (P/III-) Hématies CFU/mL VITEK2 (P/III-) identification 80 >5000 <5 1E+07 ENT.CLC p66 570 <5 1E+07 ESC.COL p67 >5000 <5 1E+07 ESC.COL p69 >5000 900 1E+07 ESC.COL p71 >5000 <5 1E+06 ESC.COL p75 2000 <5 1E+07 ESC.COL 76 1600 <5 1E+07 PRT.MIR p70 >5000 <5 1E+07 ESC.COL + ENC.FEC p64 ND >5000 1E+07 PSD.AEU + ENC.FEC p65 700 >5 1E+07 Flore polymorphe 79 740 23 1E+03 Flore polymorphe p68 210 <5 0E+00 stérile p73 50 1100 1E+03 stérile 77 90 <5 0E+00 stérile 78 330 <5 1E+03 stérile Observations Dual Filtration Manuelle BioMérieux + MALDI-ToF Identification Interrogation base VITEK MS CLI_2.0.0 CFU/mL Contami- Pl. : P2: at nation DF + HCCA DF + AF + HCCA reception level 1,E+07 B* ENT.CLC et ENT.ASB ENT.CLC et ENT.ASB ESC.COL ESC.COL 1,E+07 B majo 1,E+07 B majo ESC.COL ESC.COL 1,E+07 M ESC.COL ESC.COL 1,E+06 B majo ESC.COL ESC.COL 1,E+07 M ESC.COL ESC.COL 1,E+07 B majo PRT.MIR PRT.MIR 1,E+07 B* ENC.FEC ESC.COL 1,E+07 B* PSD.AEU PSD.AEU 1,E+07 P KLB.OXY No ID 1,E+04 P No ID Low discrim 1e3/1e4 S coryn. Urealyticum Low discrim ou Low discrim 1e3/1e4 S No ID No ID 0,E+00 S No ID No ID 0,E+00 S No ID No ID Tableau 8 B*= urines bi-microbiennes avec 2 espèces à des concentrations voisines. Les résultats d'identification peuvent être présentés comme suit (voir également tableau 9) : 13 urines types d'urines sont exploitées : - 4 stériles, - 2 mono-microbiennes, - 4 bi-microbiennes (avec une espèce majoritaire), - Et 3 bi-microbiennes (avec deux espèces de concentrations proches) Selon le mode de dépôt sur la cible MALDI (HCCA sans AF (Acide Formique) et avec AF avant l'ajout d'HCCA), 90 % et 100% de bonne identification ont été obtenus au niveau de l'espèce (sur ce panel de 10 urines dont les positives sont à minima à 10e6 CFU/mL). Pour les 3 bi-microbiennes (avec deux espèces de concentrations proches), seule une espèce peut être identifiée à la fois sur un dépôt. Ces résultats illustrent bien qu'une double filtration rapide des urines brutes à l'aide du dispositif selon l'invention permet de purifier suffisamment et de collecter assez de microorganismes pour une identification exacte de celles-ci par MALDI-TOF. Identifications correctes par MALDI-ToF versus Vitek2 Bi-microbiennes 2 espèces de concentration identique Mono- Bi-microbiennes ldentif. ldentif. Protocole N Stériles microbiennes Avec 1 espèce Score d'1 des 2 urines (S) (M) prédominante (S+M+B) espèce espèces (B) P1: 9/10 13 3/4 2/2 4/4 3/3 0/3 DF + HCCA (90%) P2: 10/10 13 4/4 2/2 4/4 3/3 0/3 DF+ AF+ HCCA (100%) Tableau 9 Exemple 4: Expérience avec hémocultures inoculées : Résultats de détection de peptides en LC-ESI MS (mode MRM) 20 Le protocole de lyse-filtration consiste brièvement en une lyse sélective des cellules du sang par action d'un tampon contenant un tensioactif pendant un temps court.
L'avantage apporté par le dispositif ci-décrit est de par sa géomètrie, ici une inclinaison du moyen de filtration du réservoir de collecte de 30°, qui permet la récolte efficace des microorganismes au moyen d'une solution liquide conduisant in fine à une suspension bactérienne.
Le protocole Lyse-filtration est le suivant : o La filtration est faite sur une membrane de filtration 0,2 pm PES utilisé comme moyen de filtration du réservoir de collecte sur le dispositif selon l'invention. o La prise d'essai est de 0,8 mL d'hémoculture qui sont traitése par 0,4 mL de tampon CAPS 0,3 M/ Brij 0 45% pendant 2 minutes suivi de la filtration pendant 2 minutes. o 3 lavages avec 175 pL de VVash buffer 1( NaCI 0,45%/ Brij 97 0,005%) o 1 lavage avec 175 pL de VVash buffer 2 (VVash Buffer 2: Brij 97 0,005%) o La collecte est faite avec 200pL de tampon carbonate en respectant un nombre constant d'aspirations/refoulements (30). La répétition de la collecte, une 2nde, une 3è" et une 4è" fois sur la même membrane a également été testée. La lyse digestion a été faite avec le P2A sur un robot pipeteur Hamilton. La démonstration a été faite pour E.Coli, S.epidermidis et C.albicans avec une bonne détection des peptides ciblés par la méthode MRM. La figure 18 présente les résultats de détection via les méthodes MRM adaptées au micro-organisme inoculé dans les bouteilles d'hémocultures. Les trois graphes montrent pour les 3 micro-organismes la bonne détection des peptides spécifiques dans les échantillons positifs à Jo post culture (EC1 Jo, EC2 Jo, CA1 Jo, CA2 Jo, CA3 J0,SE1 Jo 5E2 Jo, 5E3 J0). Un nombre mineur de peptides (2 à 4) sont détectés dans les contrôles négatifs (Cneg). La différence significative tant du nombre de peptides détectés que de l'aire cumulée entre les échantillons positifs et les contrôles négatifs indique que le protocole réalisé sur le dispositif décrit permet bien de récolter les bactéries contenues dans les hémocultures. D'autre hémocultures ont aussi été traitées de la même façon mais après la collecte des microorganismes, nous avons réalisé le protocole lo afin d'identifier en LC-ESI-MS à l'aide des profils protéiques. Les résultats présentés dans le tableau 10 montrent que les 8 hémocultures E.coli sont bien identifiées en LC-ESI avec l'algorithme Cross-Cor en interrogeant la base de données urine mais qu'il y a confusion avec Shigella si c'est la base culture qui est interrogée, les espèces étant proches. Les quatre hémocultures avec levures (C.Albicans) sont correctement identifiées (sur quatre). Une seule hémoculture S.epidermidis est bien identifiée (sur quatre). Malgré ces quelques cas de mauvaises identifications, ces essais attestent de l'efficacité de la préparation d'échantillon par lyse-filtration réalisée sur le dispositif selon l'invention. Non dilués dilués 10x pic_ sum nnls pic_ sum nnls pic_ sum nnls pic_ sum nnls crossCor crossCor crossCor crossCor BaseUrine BaseUrine BaseCulture BaseCulture BaseUrine BaseUrine BaseCulture BaseCulture CAN.ALB_001 TRUE TRUE TRUE TRUE TRUE CAN.TROP TRUE BAC.CEU CAN.ALB_002 TRUE CAN.TROP TRUE TRUE TRUE CAN.TROP TRUE BAC.CEU CAN.ALB_003 TRUE CAN.TROP TRUE TRUE TRUE CAN.TROP TRUE BAC.CEU CAN.ALB_004 TRUE CAN.TROP TRUE TRUE TRUE CAN.TROP TRUE BAC.CEU ESH.COL_001 TRUE TRUE SHG.BOY ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.BOY BAC.CEU ESH.COL_002 TRUE ENT.AER SHG.FLX ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.FLX BAC.CEU ESH.COL_003 TRUE ENT.AER SHG.FLX ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.SON CAN.ALB ESH.COL_004 TRUE ENT.AER SHG.FLX ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.BOY BAC.CEU ESH.COL_005 TRUE ENT.AER SHG.BOY ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.FLX CAN.ALB ESH.COL_006 TRUE ENT.AER SHG.SON ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.SON BAC.CEU ESH.COL_007 TRUE ENT.AER SHG.FLX ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.FLX CAN.ALB ESH.COL_008 TRUE ENT.AER SHG.SON ENT.CLC TRUE CAN.GLB SHG.BOY CAN.ALB STA.EPI_001 STA.AUA TRUE STA.ALJA TRUE CAN.TRO CAN.TRO STR.ORA BAC.CEU STA.EPI_002 STA.AUA CAN.TROP BAC.CEU CAN.ALB CAN.GLB CAN.GLB BAC.CEU BAC.CEU STA.EPI_003 PRT.MIR TRUE YER.ETC TRUE STA.AUA CAN.TRO BAC.CEU BAC.CEU STA.EPI_004 TRUE CAN.TROP TRUE CAN.ALB STA.AUA CAN.GLB STA.AUA BAC.CEU HEM.NEG0013453 ENT.AER CAN.TROP STR.ORA BAC.CEU CIT.KOS NA STR.ORA NA HEM.NEG0013454 ENT.AER CAN.TROP STR.ORA BAC.CEU ENT.AER NA CIT.BRA NA 16 13 4 Correct 81,25 25 Identifications (%) 6 31,25 37,5 12 0 4 0 75 25 5 Tableau 10 : Résultats d'identification en LC-ESI MS après Lyse filtration sur le dispositif tel que décrit et extraction de protéine lo (mode full scan, profil protéique) Procédé alternatif sur échantillon d'urine utilisant le dispositif selon l'invention : Les différentes étapes de la manipulation sont données ci-dessous : 1) A réception, les urines sont photographiées. 2) Estimation des volumes dans les tubes (comparé à un tube gradué) 3) 10 pL sont déposés sur gélose bioMérieux Chroml D® CPS pour vérification. 4) 150 pl ont été mis de côté à 4°C pour faire un étalement de 100pL sur COS pour 5H00 de croissance. 5) Le reste de l'échantillon a été traité avec le dispositif selon l'invention. Le moyen de filtration du réservoir de préfiltration consiste en un empilement des préfiltres. Les préfiltres utilisés étant, du bas vers le haut : lx VFE 5 pm / Filtrona 2 mm. Le moyen de filtration du réservoir de collecte où seront récupérées les bactéries est une membrane: PES 0,45 pm (Pall) 6) Le volume d'urine filtrée est compris entre 3 et 6 mL pour un temps de filtration de quelques minutes. La collecte du rétentât est fait avec 1000 pL d'eau (Versol). 7) A l'issue du protocole manuel, 10 pl sont étalés sur gélose bioMérieux ChromIDO CPS pour permettre de voir si la population bactérienne est la même entre la fraction collectée et l'urine de départ (couleur des colonies, polymorphisme, comparaison numération avant/après double filtration). 8) Pour le volume restant des fractions collectées, une centrifugation de 5 min 10000g a été faite pour enlever le maximum de surnageant (eau) et garder un culot de quelque pL pour MALDI-TOF. 9) Les dépôts sur plaque MALDI-TOF sont faits en doublons selon la terminologie du tableau 11 10) La manipulation par culture courte de 5h00 est faite en déposant 100 pl d'urine et étalement au râteau. Après 5H00 de croissance à 37°C, le biofilm est observé. Ce biofilm est alors collecté avec une oese de 1 pL et déposé sur cible MALDI-TOF.
Protocole 1 (P1) : double filtration + HCCA Protocole 2 (P2) : double filtration + AF + HCCA Protocole 5 (P5) : culture sur COS 5H + HCCA Protocole 6 (P6) : culture sur COS 5H + AF + HCCA Tableau 11: Codification des protocoles selon le traitement réalisé et le mode de dépôt sur cible MALDI-TOF HCCA : (Acide a-cyano-4-hydroxycinnamique) : 1p1 par spot AF: (Acide Formique) : 0,5p1 par spot double filtration : traitement à l'aide du dispositif selon l'invention
Claims (17)
- REVENDICATIONS1) Dispositif pour la préparation d'échantillon biologique comprenant : - un support fixe dont la base s'étend selon un premier plan, - un bloc de filtration pouvant être amovible, ledit bloc de filtration comprenant un réservoir de collecte comportant lui-même un moyen de filtration s'étendant selon un second plan et divisant ledit réservoir de collecte en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration étant adaptée pour être connectée à un moyen d'aspiration, caractérisé en ce que le second plan du moyen de filtration est incliné par rapport au plan de la base du support fixe.
- 2) Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le bloc de filtration comporte en outre un réservoir de préfiltration pouvant être amovible, ledit réservoir de préfiltration comprenant un moyen de filtration divisant le réservoir de préfiltration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration étant en communication fluidique avec la zone de collecte du réservoir de collecte.
- 3) Dispositif selon la revendication 2, la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration étant adaptée pour être connectée à un second moyen d'aspiration
- 4) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la paroi de la zone de collecte du réservoir de collecte est en partie inclinée ou en forme d'ogive
- 5) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, le moyen de filtration du réservoir de collecte comprenant au moins une membrane de porosité comprise entre 0,02 pm et 0,45 pm
- 6) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprenant au moins un filtre de porosité comprise entre 5 pm et 1000 pm, préférentiellement entre 5 pm et 100 pm.
- 7) Dispositif selon la revendication 6, le moyen de filtration du réservoir de préfiltration comprenant un empilement de filtres
- 8) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, le second plan du moyen de filtration du réservoir de collecte étant incliné par rapport au plan de la base du support fixe d'un angle compris entre 100 et 60°, de préférence égal à 30°
- 9) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, le réservoir de collecte comprenant une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de collecte
- 10) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, le réservoir de préfiltration comprenant une partie supérieure et une partie inférieure coopérant pour maintenir le moyen de filtration du réservoir de préfiltration
- 11) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, le réservoir de préfiltration comprenant un moyen susceptible de coopérer avec un outil porte pipette pour robot pipeteur
- 12) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, dans lequel le bloc de filtration comporte en outre un troisième réservoir de filtration pouvant être amovible, ledit troisième réservoir de filtration comprenant un moyen de filtration divisant le troisième réservoir de filtration en une zone de collecte et une zone d'aspiration, la zone de collecte du troisième réservoir de filtration étant en communication fluidique avec la zone d'aspiration du réservoir de collecte.
- 13) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, le moyen d'aspiration étant un moyen d'aspiration / refoulement.
- 14) Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour le traitement d'un échantillon biologique.
- 15) Procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 comprenant les étapes suivantes: - déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte, à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte - collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
- 16) Procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 13 comprenant les étapes suivantes: .- déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration, - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte - collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
- 17) Procédé de traitement d'un échantillon biologique à l'aide d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 3 à 13 comprenant les étapes suivantes: . - déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de préfiltration, - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de préfiltration de manière à déposer l'échantillon biologique sur le moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du second moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de préfiltration - aspirer l'échantillon biologique au travers du moyen de filtration du réservoir de collecte à l'aide du moyen d'aspiration connecté à la zone d'aspiration du réservoir de collecte - collecter les microorganismes sur le moyen de filtration du réservoir de collecte
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