EP2502906A2 - Trypsinartige Serinprotease-Hemmstoffe, ihre Herstellung und Verwendung - Google Patents

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EP2502906A2
EP2502906A2 EP12004643A EP12004643A EP2502906A2 EP 2502906 A2 EP2502906 A2 EP 2502906A2 EP 12004643 A EP12004643 A EP 12004643A EP 12004643 A EP12004643 A EP 12004643A EP 2502906 A2 EP2502906 A2 EP 2502906A2
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Definitions

  • the invention relates to inhibitors of trypsin-like serine proteases of the general formula which in addition to plasmin also inhibit plasma kallikrein, and their preparation and use as medicaments preferably for the treatment of blood loss, especially in hyperfibrinolytic conditions, organ transplants or cardiac surgery, especially with cardiopulmonary bypass, or as part of a fibrin sealant.
  • Plasmin is a trypsin-like serine protease and cleaves numerous substrates C-terminal of the basic amino acids arginine or lysine. Plasmin is formed from the zymogen plasminogen by catalytic action of the plasminogen activators urokinase or tPA.
  • the plasmin substrates include various extracellular matrix and basement membrane proteins, such as fibronectin, laminin, type IV collagen or fibrin, but also numerous zymogens, such as the pro forma of the matrix metalloproteases or the plasminogen activator urokinase. In the blood, plasmin is primarily responsible for fibrinolysis by cleaving fibrin into soluble products.
  • Endogenous plasmin inhibitors include ⁇ 2-macroglobulin and serpin ⁇ 2-antiplasmin. Under certain pathological conditions, spontaneous activation of fibrinolysis may occur. In the case of such hyperplasminemia not only is the wound-closing fibrin degraded, but also anticoagulant fibrinogen degradation products are formed. This can cause severe haemostatic disorders.
  • antifibrinolytic agents in the clinic synthetic aminocarboxylic acids, such as ⁇ -aminocaproic acid, p-aminomethylbenzoic acid or tranexamic acid (trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid). These compounds block binding of the zymogen plasminogen to fibrin and thereby inhibit its activation to plasmin.
  • aprotinin Trasylol ®, Bayer AG, Leverkusen
  • aprotinin a polypeptide of 58 amino acids, which is derived from bovine lung.
  • aprotinin is to reduce blood loss, particularly in cardiopulmonary bypass surgery (CPB), which significantly reduces the need for perioperative blood transfusions (Sodha et al., 2006).
  • aprotinin is also used in other operations, such as organ transplantation, to inhibit blood loss or used as an adjunct to fibrin glue.
  • aprotinin has several disadvantages. Because it is isolated from bovine organs, there is a general risk of pathogenic contamination and allergic reactions. The risk of anaphylactic shock is relatively low ( ⁇ 0.1%) when aprotinin is given for the first time, but increases to 4-5% after repeated dosing within 200 days.
  • aprotinin induces an increased number of side effects in direct comparison with ⁇ -aminocaproic acid or tranexamic acid (Mangano et al., 2006).
  • the administration of aprotinin resulted in a doubling of the number of kidney lesions, necessitating dialysis.
  • the administration of aprotinin increased the risk of heart attack and stroke compared to the control groups.
  • the thrombin inhibitor inhibits melagatran plasmin with a K i value of 0.7 ⁇ M while the structurally closely related compounds H317 / 86 has an inhibitory constant of 0.22 ⁇ M for plasmin (Gustafsson et al., 1998).
  • both compounds inhibit the protease thrombin significantly more strongly with K i values ⁇ 2 nM, which leads to a strong anticoagulant effect by the administration of melagatran.
  • aprotinin inhibits plasma kallikrein (PK) in addition to plasmin.
  • PK is a multifunctional trypsin-like serine protease for which several physiological substrates are known.
  • PK can release the vasoactive peptide bradykinin from high molecular weight kininogen by proteolytic cleavage and activate the zymogens coagulation factor XII, pro-urokinase, plasminogen and pro-MMP 3. Therefore, it is believed that the PK / kinin system has an important role in various clinical pictures, e.g. in thromboembolic situations, disseminated intravascular coagulation, septic shock, allergies, post-gastrectomy syndrome, arthritis, and adult respiratory distress syndrome (ARDS) (Tada et al., 2001).
  • ARDS adult respiratory distress syndrome
  • aprotinin inhibits the release of the peptide hormone bradykinin via its PK inhibitory activity.
  • Bradykinin causes various effects via activation of the bradykinin B2 receptor.
  • the bradykinin-induced release of tPA, NO and prostacyclin from endothelial cells affects fibrinolysis, blood pressure and inflammation. It is discussed that by inhibiting bradykinin release systemic Inflammatory processes that can occur as a side effect during surgery can be reduced.
  • PK inhibitors have been Various bis-benzamidines as pentamidine and related compounds, and esters described by ⁇ -amino and ⁇ -Guanidinoalkylcarbonklaren with micromolar Ki values (Asghar et al, 1976;. Muramatu and Fuji, 1971; Fuji Muramatu and , 1972; Ohno et al., 1980; Muramatu et al., 1982; Satoh et al., 1985; Teno et al., 1991).
  • Several studies on the development of competitive PK inhibitors have been published by the Okada group, with the most potent compounds derived from trans-4-amino-methylcyclohexanecarbonyl-Phe-4-carboxymethylanilide having inhibitory constants around 0.5 ⁇ M (Okada et al , 1999, Okada et al., 2000, Tsuda et al., 2001). Common to these PK inhibitors their relatively high K i value.
  • the invention is therefore based on the object to provide for therapeutic applications suitable low molecular weight drugs, in particular plasmin and plasma kallikrein reversibly and competitively inhibit with high activity and specificity and are therefore suitable for hemostasis in various applications, for example in cardiac surgery with CPB, in organ transplants or other operations.
  • a further advantage of these compounds is that their action as inhibitors of plasma kallikrein additionally reduces kinin release and thereby suppresses kinin-mediated inflammatory reactions. Inhibited kinin release represses kinin-induced release of tPA from endothelial cells. whereby fibrinolysis can be downregulated by this mechanism.
  • a further advantage of these compounds, despite selectivity, is a certain inhibiting effect of these compounds on FXa and / or thrombin. whereby additional thrombotic complications in the use of these compounds should be reduced.
  • R 1 represents a 3-COOH group.
  • R 1 is present in a simple and meta or para position
  • R 1 is preferably a COOH radical, in particular R 1 is simply present and selected from hydrogen, a 4-COOH group or in particular a 3- COOH group.
  • a further reduction in the inhibition of thrombin could be achieved in that R 4 represents a fluorine atom, in particular in the ortho position.
  • R 2 is a substituted or unsubstituted aromatic cycle or bicylus of 6-13 carbon atoms or heterocycle of 5 carbon atoms and one nitrogen atom.
  • R 2 can generally be a halogen radical, preferably chlorine or fluorine, in particular chlorine, an optionally fluorine-substituted, branched or linear alkyl radical having 1-6 carbon atoms, preferably methyl or tertiary butyl, an optionally fluorine-substituted, branched or linear alkyloxy radical having 1-6 carbon atoms, preferably methyl, a hydroxy radical or a cyano radical.
  • a halogen radical preferably chlorine or fluorine, in particular chlorine
  • an optionally fluorine-substituted, branched or linear alkyloxy radical having 1-6 carbon atoms preferably methyl, a hydroxy radical or a cyano radical.
  • R 2 may also be a non-aromatic cycle having 6 carbon atoms.
  • the salts of the compounds according to the invention are generally formed from hydrochloric acid, HBr, acetic acid, trifluoroacetic acid, toluenesulfonic acid or other suitable acids.
  • R 2 is selected from the following radicals: and / or where R 3 is selected from especially
  • R 1 is present in a simple and meta or para position, preferably R 1 is hydrogen or a COOH radical, in particular R 1 is simply present and selected from hydrogen, a 4-COOH Group or a 3-COOH group.
  • the salts of these compounds are in turn generally formed from hydrochloric acid, HBr, acetic acid, trifluoroacetic acid, toluenesulfonic acid or other suitable acids.
  • the compounds of the general formula I can be prepared in a manner known in principle, as described below, for example as follows, wherein in general the corresponding amino acids are sequentially coupled to an amidinobenzylamine protected on the amidino group. In this case, the N-terminal amino acid either already carries the P4 residue or this is subsequently bound to it.
  • the P3 amino acid may also be coupled directly as a protected, preferably benzylsulfonyl-protected, amino acid already bearing the R1 residue.
  • the peptide analogues are synthesized sequentially starting from acetyloxamidinobenzylamine. Most intermediates crystallize well and are therefore easy to clean. The final purification of the inhibitors takes place in the last stage preferably via preparative, reversed-phase HPLC.
  • Another object of the invention is therefore a process for preparing a compound according to the invention, wherein sequentially the corresponding amino acids to an amidino or guanidinobenzylamine protected at the amidino or guanidino group, for example to a 4-Acetyloxamidinobenzylamin or to a 4- (Benzyloxycarbonylamidino) benzylamine, be coupled, wherein the N-terminal amino acid either already carries the P4 radical or this is subsequently bound. After a possible purification, the compounds obtained can optionally be PEGylated.
  • a preferred protecting group of the amide nitrogen is, for example, tert-butyloxycarbonyl (Boc).
  • the starting compounds are z. B. amino acid derivatives or PEG derivatives.
  • the chemicals are generally available commercially.
  • the PEGylation, d. H. the derivatization with polyethylene glycol was generally carried out either via the P3-amino acid or via the P4-Benzylsulfonylrest with activated PEG derivatives, eg. B. with N-hydroxysuccinimide ester activated PEG.
  • PEG-coupled compounds are the prolongation of the half-life of the inhibitors in the blood circulation.
  • the following structure shows an example in which the PEG chain has been coupled via the P3 amino acid (D-Lys).
  • the PEG chain was coupled via a suitable P4 benzylsulfonyl radical according to the general formula shown below, with the P4 radical modified with an aminomethyl group in para or ortho position.
  • the PEGylated compounds are generally mixtures of compounds of various degrees of PEGylation wherein the molecular weight of the PEG residues is usually in the range of 750, 1000, 2000, 3400, 5000 or 10000 Da.
  • discrete polyethylene glycols of defined molecular weight are also commercially available.
  • the present invention also extends to a medicament containing at least one of the compounds according to the invention, preferably for the treatment of blood loss, in particular in hyperfibrinolytic states, in organ transplants or heart surgery, especially with cardiopulmonary bypass.
  • the present invention also includes a fibrin glue containing at least one of the compounds of the invention wherein aprotinin is replaced by a suitable inhibitor of the present invention.
  • Fibrin glue is generally understood to mean a physiological two-component adhesive which comprises as the first component fibrinogen, factor XIII and aprotinin or at least one of the compounds according to the invention and as second component thrombin and calcium chloride for factor XIII activation.
  • the present invention also relates to the use of at least one compound according to the invention for the preparation of a medicament according to the invention or of a fibrin glue according to the invention by methods generally known to the person skilled in the art, eg. B. by mixing with suitable auxiliaries or additives.
  • the present invention also relates to the following subjects:
  • R 4 is H or OH
  • A is selected from the following structures: wherein A is preferably a phenyl radical
  • R is 3
  • R 2 is branched or unbranched alkyl having 3-12 C-atoms, also cycloalkyl-substituted, aryl or aralkyl having 6-14 C-atoms, heteroaryl or as heteroarylalkyl having 6-12 C-atoms and 1-3 heteroatoms
  • P4 benzylsulfonyl radical unmodified or substituted
  • P3 hydrophobic amino acid in the D configuration, D-phenylpropylglycine and other amino acids
  • P2 basic hydrophobic amino acids in L configuration
  • P1 4-amidinobenzylamide residue and related groups.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , A and i correspond to the definitions given above.
  • B corresponds to the PEG chain, which in the end is present as methyl ether.
  • Y is a suitable linker for coupling the PEG to the P3 amino acid, for example, a Propionyl, and X is either an NH or NH-alkyl or NH-aryl group. The coupling takes place in a conventional manner.
  • the compounds of the invention have, for example, a PEG chain having an average molecular weight of 750 Da, 1000 Da, 2000 Da, 5000 Da, 10000 Da, 20,000 Da or is a discrete PEG chain.
  • a HPLC system LC-10A from Shimadzu consisting of the subsystems CTO-10AS column oven, LC-10AD pumps (2 x), DGU-14A degasser, SIL-10AD autoinjector, SCL-10A System controller, SPD-10A UV-Vis detector and column Luna 5 ⁇ m C18 (2) 100 ⁇ , 250 x 4.6 mm from Phenomenex, using the corresponding software Shimadzu CLASS-VP, version 5.3. The detection was carried out at 220 nm.
  • the eluant used was water with 0.1% TFA (A) and acetonitrile with 0.1% TFA (B) at a flow rate of 1 ml / min and a linear gradient (1% B / min).
  • TFA 0.1% TFA
  • B acetonitrile with 0.1% TFA
  • the mass spectra were measured by default on an ESI-MS LCQ from Finnigan (Bremen, Germany). All polyethylene glycol coupled compounds were analyzed on a Maldi Ultraflex Tof / Tof Bruker instrument.
  • Hd-Ppg-OH (Peptech, Burlingtom, MA) were suspended in 90 ml of dry DCM and treated with 2 ml (15.7 mmol) TMS-Cl and 2.6 ml (15 mmol) DIEA added. The reaction was refluxed for 1 h, the clear solution was cooled to 0 ° C., and 2 g (8 mmol) of 3-MeOOC-Bzls-Cl and 2.6 ml of DIEA were added. The batch was stirred at 0 ° C. for 15 min and at RT for 1.5 h.
  • the LM was removed iV and the residue was dissolved in 700 ml of semi-saturated NaHCO 3 solution.
  • the mixture was extracted 2x with a little ethyl acetate and then the aqueous phase acidified with HCl (pH about 2-3).
  • the batch is extracted 3 times with 150 ml of ethyl acetate and the combined ethyl acetate phase is washed twice with 5% KHSO 4 solution and once with saturated NaCl solution.
  • the organic phase is dried with Na 2 SO 4 and the LM IV removed. Yield: 2.4 g of oil (HPLC: 33.53 min, start at 20% B)
  • inhibitors were synthesized, incorporating differently substituted or unsubstituted benzylsulfonyl residues and various P3 amino acids as a substitute for d-phenylpropylglycine.
  • Further analogues of d-phenylpropylglycine were synthesized by Heck coupling and incorporated in the P3 position of the inhibitors.
  • the synthesis can be carried out, for example, as follows:
  • a solution of 0.4 g (1.48 mmol) of Bzls-d-Gly (allyl) -OH in 2.5 ml of DMF and 2.5 ml of water is added to this suspension and the batch is left for 4-6 days at 45.degree.
  • PEG polyethylene glycol
  • Other inhibitors were synthesized by standard methods, to which polyethylene glycol (PEG) chains of different chain lengths were covalently coupled.
  • PEG derivatives from Fluka, Nektar Therapeutics or Rapp polymers with different average molecular weights (1000 Da, 2000 Da, 5000 Da, 10000 Da) were used for all syntheses.
  • the PEG derivatives used are protected at one end as methyl ether and modified at the other end with an N-hydroxysuccinimide ester-activated propionic acid or succinic acid residue. As a result, these activated PEG derivatives could be reacted with a free amino group of the inhibitor (see Synthetic Schemes 1 to 5).
  • the TFA protecting group was removed by treatment with 1 N NaOH solution cleaved and the products by ion exchange chromatography on Fractogel ® CE (Merk KGaA, Darmstadt) purified using a gradient of ammonium acetate and 3 x lyophilized from water.
  • Fractogel ® CE Fractogel ® CE (Merk KGaA, Darmstadt) purified using a gradient of ammonium acetate and 3 x lyophilized from water.
  • the following examples gave inhibitors with a PEG chain with an average mass of about 1000, 2000, 5000 or 10000 Da.
  • the reaction was stopped after 20 minutes by adding 25 ⁇ l of acetic acid (50% v / v) and the absorbance at 405 nm was determined by means of a Microplate Reader (Multiscan Ascent, Thermo).
  • the reaction rates in the equilibrium state were recorded by recording the reaction kinetics.
  • the K i values were either after Dixon (1953) was determined by linear regression by means of a computer program or by parameter adaptation according to the rate equation for competitive inhibition. The K i values are the mean of at least two determinations.
  • K i values A means ⁇ 10 nM, B means ⁇ 100 nM, C means ⁇ 1000 nM and D means> 1000 nM
  • the K i value of plasmin inhibition was generally ⁇ 100 nM. Especially for compounds with cyclic structures at R 2 and R 3 , the K i value was significantly lower than 100 nM and for compounds with an aromatic carbon cycle at R 2 and R 3 below about 10 nM. Surprisingly, there are particularly many compounds of the invention having a K i value below 5 nM, z. For example, compounds Nos. 1-11, 13, 14, 16-18, 20-33, 35, 38, 39, 46 and 48-56. 2.
  • the K i value of the plasma kallikrein inhibition was also generally ⁇ 100 nM. Especially for compounds with an aromatic carbon cycle at R 2 and R 3 , the K i value was significantly lower than 100 nM.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Hemmstoffe trypsinartiger Serinproteasen der allgemeinen Formel die neben Plasmin auch Plasmakallikrein hemmen, sowie deren Herstellung und Verwendung als Arzneimittel vorzugsweise zur Behandlung von Blutverlust, insbesondere bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit cardiopulmonalem Bypass, oder als Bestandteil eines Fibrinklebers.

Description

  • Die Erfindung betrifft Hemmstoffe trypsinartiger Serinproteasen der allgemeinen Formel
    Figure imgb0001
     die neben Plasmin auch Plasmakallikrein hemmen, sowie deren Herstellung und Verwendung als Arzneimittel vorzugsweise zur Behandlung von Blutverlust, insbesondere bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit cardiopulmonalem Bypass, oder als Bestandteil eines Fibrinklebers.
  • Inhibitoren für Plasmin und Plasmakallikrein (PK) sind bereits bekannt. Plasmin ist eine trypsinartige Serinprotease und spaltet zahlreiche Substrate C-terminal der basischen Aminosäuren Arginin oder Lysin. Plasmin wird aus dem Zymogen Plasminogen durch katalytische Wirkung der Plasminogenaktivatoren Urokinase oder tPA gebildet. Zu den Plasminsubstraten gehören verschiedene Proteine der extrazellulären Matrix und Basalmembran, beispielsweise Fibronectin, Laminin, Type IV-Kollagen oder Fibrin, aber auch zahlreiche Zymogene, wie Proformen der Matrix-Metalloproteasen oder des Plasminogenaktivators Urokinase. Im Blut ist Plasmin vor allem für die Fibrinolyse verantwortlich, indem es Fibrin in lösliche Produkte spaltet.
  • Zu den endogenen Plasmininhibitoren gehören α2-Macroglobulin und das Serpin α2-Antiplasmin. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen kann es zu einer spontanen Aktivierung der Fibrinolyse kommen. Im Falle einer derartigen Hyperplasminämie wird nicht nur das wundverschließende Fibrin abgebaut, sondern es werden auch gerinnungshemmende Fibrinogenabbauprodukte gebildet. Dadurch können schwere Blutstillungsstörungen auftreten. Als Antifibrinolytika werden in der Klinik synthetische Aminocarbonsäuren, wie ε-Aminocapronsäure, p-Aminomethylbenzoesäure oder Tranexaminsäure (trans-4-Aminomethylcyclo-hexancarbonsäure) verwendet. Diese Verbindungen blockieren die Bindung des Zymogens Plasminogen am Fibrin und hemmen dadurch dessen Aktivierung zu Plasmin. Deshalb sind diese Verbindungen keine direkten Hemmstoffe des Plasmins und können bereits gebildetes Plasmin nicht inhibieren. Als weiteres Antifibrinolytikum wird Aprotinin (Trasylol®, Bayer AG, Leverkusen) eingesetzt, ein Polypeptid aus 58 Aminosäuren, das aus Rinderlunge gewonnen wird. Aprotinin inhibiert Plasmin mit einer Hemmkonstante von 1 nM, ist aber relativ unspezifisch und hemmt auch wirksam Trypsin (Ki = 0,1 nM) und Plasmakallikrein (Ki = 30 nM). Aprotinin inhibiert noch weitere Enzyme, allerdings mit verminderter Wirksamkeit.
  • Eine Hauptanwendung des Aprotinins dient der Reduktion von Blutverlust, insbesondere bei herzchirurgischen Eingriffen mit cardiopulmonalem Bypass (CPB), wodurch der Bedarf an perioperativen Bluttransfusionen deutlich reduziert wird (Sodha et al., 2006). Zusätzlich wird Aprotinin auch bei anderen Operationen, beispielsweise bei Organtransplantationen, zur Hemmung von Blutverlust eingesetzt oder als Zusatz in Fibrinkleber verwendet.
  • Die Verwendung von Aprotinin hat mehrere Nachteile. Da es aus Rinderorganen isoliert wird, besteht prinzipiell die Gefahr pathogener Kontaminationen und allergischen Reaktionen. Das Risiko eines anaphylaktischen Schocks ist bei erstmaliger Gabe von Aprotinin relativ gering (< 0,1 %), erhöht sich bei wiederholter Gabe innerhalb von 200 Tagen allerdings auf 4-5 %.
  • Vor kurzem wurde berichtet, dass die Gabe von Aprotinin im direkten Vergleich zu ε-Aminocapronsäure oder Tranexaminsäure eine erhöhte Anzahl an Nebenwirkungen induziert (Mangano et al., 2006). Durch die Gabe von Aprotinin kam es zu einer Verdopplung der Anzahl von Nierenschädigungen, wodurch eine Dialyse erforderlich wurde. Ebenso erhöhte sich durch die Gabe von Aprotinin das Herzinfarkt- und Hirnschlagrisiko im Vergleich zu den Kontrollgruppen.
  • Bisher sind erst wenige synthetische Inhibitoren des Plasmins bekannt. Von Sanders und Seto (1999) wurden relativ schwach wirksame 4-Heterocyclohexanon-Derivate mit Hemmkonstanten ≥ 50 µM für Plasmin beschrieben. Xue und Seto (2005) berichten von peptidischen Cyclohexanon-Derivaten mit IC50-Werten ≥ 2 µM, deren Weiterentwicklung ist aber nicht bekannt. Von Okada und Tsuda wurden verschiedene Derivate mit einem 4-Aminomethylcyclohexanoyl-Rest beschrieben, die Plasmin mit IC50-Werten ≥ 0,1 µM inhibieren, eine klinische Anwendung dieser Inhibitoren ist nicht bekannt (Okada et al., 2000; Tsuda et al., 2001).
  • In zahlreichen Publikationen zur Entwicklung von Hemmstoffen der Gerinnungsproteasen als Antithrombotika wurden Hemmkonstanten für Plasmin publiziert, wobei in diesen Fällen allerdings das Ziel in einer möglichst schwachen Plasminhemmung bestand. In keiner dieser Arbeiten wurde eine mögliche Verwendung dieser Verbindungen zur Reduktion von Blutverlust bei herzchirurgischen Eingriffen genannt. So hemmt beispielsweise der Thrombininhibitor Melagatran Plasmin mit einem Ki-Wert von 0,7 µM während die strukturell eng verwandte Verbindungen H317/86 eine Hemmkonstante von 0,22 µM für Plasmin besitzt (Gustafsson et al., 1998). Beide Verbindungen hemmen allerdings die Protease Thrombin deutlich stärker mit Ki-Werten ≤ 2 nM, wodurch es durch die Gabe von Melagatran zu einer starken Gerinnungshemmung kommt.
  • Wie einleitend beschrieben, hemmt Aprotinin neben Plasmin zusätzlich Plasmakallikrein (PK). PK ist eine multifunktionelle, trypsinartige Serinprotease, für die mehrere physiologische Substrate bekannt sind. So kann PK durch proteolytische Spaltung das vasoaktive Peptid Bradykinin aus hochmolekularem Kininogen freisetzen und die Zymogene Gerinnungsfaktor XII, Pro-Urokinase, Plasminogen und Pro-MMP 3 aktivieren. Deshalb wird angenommen, dass das PK/Kinin-System eine wichtige Rolle bei verschiedenen Krankheitsbildern besitzt, so z.B. bei thromboembolischen Situationen, der disseminierten intravasalen Gerinnung, septischem Schock, Allergien, dem Postgastrektomiesyndrom, Arthritis und ARDS (adult respiratory distress syndrome) (Tada et al., 2001).
  • Demzufolge hemmt Aprotinin über seine inhibierende Wirkung auf PK die Freisetzung des Peptidhormons Bradykinin. Bradykinin bewirkt über die Aktivierung des Bradykinin-B2-Rezeptors verschiedene Effekte. Durch die Bradykinin-induzierte Freisetzung von tPA, NO und Prostacyclin aus Endothelzellen (siehe Übersichtsarbeit Schmaier, 2002) werden die Fibrinolyse, der Blutdruck und das Entzündungsgeschehen beeinflusst. Es wird diskutiert, dass durch Hemmung der Bradykinin-Freisetzung systemische Entzündungsvorgänge, die als Nebenwirkung bei Operationen auftreten können, reduziert werden.
  • Als PK-Inhibitoren wurden verschiede Bis-benzamidine wie Pentamidin und verwandte Verbindungen, sowie Ester von ω-Amino- und ω-Guanidinoalkylcarbonsäuren mit mikromolaren Ki-Werten beschrieben (Asghar et al., 1976; Muramatu und Fuji, 1971; Muramatu und Fuji, 1972; Ohno et al., 1980; Muramatu et al., 1982; Satoh et al., 1985; Teno et al., 1991).
  • Die ersten selektiven kompetitiven Inhibitoren, die sich vom Arginin bzw. Phenylalanin ableiten, wurde von Okamoto et al., (1988) entwickelt und hemmen PK mit Ki-Werten um 1 µM. Von der Gruppe um Okada wurden mehrere Arbeiten zur Entwicklung kompetitiver PK-Inhibitoren veröffentlicht, wobei die wirksamsten Verbindungen, die sich vom trans-4-Amino-methylcyclohexancarbonyl-Phe-4-Carboxymethylanilid ableiten, Hemmkonstanten um 0,5 µM besitzen (Okada et al., 1999; Okada et al., 2000, Tsuda et al., 2001). Gemeinsam ist den genannten PK-Inhibitoren ihr relativ hoher Ki-Wert. In US 6,472,393 wurden potente PK-Inhibitoren mit Hemmkonstanten um 1 nM beschrieben, die ein 4-Amidinoanilin als P1 Rest besitzen. PK-Hemmstoffe wurden auch in US 5,602,253 beschrieben. In US 2006/0148901 wurden PK-Hemmstoffe beschrieben, deren Hemmwirkung auf Plasmin aber relativ gering ist, wodurch sich diese Hemmstoffe von den Inhibitoren unterscheiden, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden.
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, für therapeutische Anwendungen geeignete niedermolekulare Wirkstoffe bereitzustellen, die insbesondere Plasmin und Plasmakallikrein reversibel und kompetitiv mit hoher Aktivität und Spezifität inhibieren und daher zur Blutstillung bei verschiedenen Anwendungen geeignet sind, beispielsweise bei herzchirurgischen Eingriffen mit CPB, bei Organstransplantationen oder anderen Operationen. Ein weiterer Vorteil dieser Verbindungen besteht darin, dass durch ihre Wirkung als Hemmstoff des Plasmakallikreins zusätzlich die Kininfreisetzung vermindert wird und dadurch Kinin-vermittelte enzündliche Reaktionen unterdrückt werden können. Durch die gehemmte Kininfreisetzung wird wiederum die Kinin-induzierte Freisetzung von tPA aus Endothelzellen unterdrückt. wodurch über diesen Mechanismus die Fibrinolyse herabreguliert werden kann. Ein weiterer Vorteil dieser Verbindungen ist trotz Selektivität eine gewisse Hemmwirkung dieser Verbindungen auf FXa und/oder Thrombin, wodurch zusätzlich thrombotische Komplikationen bei der Anwendung dieser Verbindungen reduziert werden sollen.
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch die Kombination zweier sterisch anspruchsvoller und/oder hydrophober Reste R2 und R3 gemäß Formel 1, vorzugsweise substituierte oder unsubstituierte Aromaten, Inhibitoren mit starken Hemmkonstanten gegenüber Plasmin und Plasmakallikrein erhalten werden konnten. Vergleichbar gute Effekte konnten auch mit Substanzen erhalten werden, die an R2 nichtaromatische und R3 basisch substituierte Phenylreste tragen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
    Figure imgb0002
     mit
    • R1,
    gegebenenfalls einfach oder mehrfach vorhanden und unabhängig voneinander ein COOR5-Rest, mit R5 gleich Wasserstoff oder einer verzweigten oder linearen Niederalkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, insbesondere Methyl, ein verzweigter oder linearer Aminoalkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Halogen- oder Pseudohalogen-Rest, vorzugsweise Chlor oder eine Cyanogruppe, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (II) oder (III)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (II)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (III)

    wobei n in der Regel so definiert ist, dass die genannten Polyethylenglykolreste ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10000 Da, 5000 Da, 3400 Da, 2000 Da, 1000 Da oder 750 Da aufweisen. Üblicherweise ist n eine ganze Zahl zwischen ca. 18 bis ca. 250, insbesondere ca. 18, ca. 25, ca. 50, ca. 85, ca. 125 oder ca. 250.
    R2
    ein gegebenenfalls substituierter, aromatischer oder nichtaromatischer Cyclus oder Bicylus mit 5-13 Kohlenstoffatomen oder aromatischer Heterocyclus mit 4-5 Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom, Stickstoffoxid, Sauerstoffatom oder Schwefelatom, vor allem einem Stickstoffatom oder Stickstoffoxid; oder ein Rest der Struktur:
    Figure imgb0003
    R3
    ein, gegebenenfalls substituierter, aromatischer Cyclus mit 5-6 Kohlenstoffatomen oder aromatischer Heterocyclus mit 3-5 Kohlenstoffatomen und 1-2 Stickstoffatomen, einem Stickstoffoxid, Sauerstoffatom oder Schwefelatom, vor allem einem Stickstoffatom oder Stickstoffoxid;
    R4
    gegebenenfalls ein einfach oder mehrfach vorhandener Halogen-Rest, vorzugsweise Fluor;
    o
    = 1, 2 oder 3, insbesondere 1;
    p
    = 0, 1, 2, 3 oder 4, insbesondere 3; und
    i
    = 0 oder 1, insbesondere 0;
    sowie deren racemische Mischungen und Salze mit organischen oder anorganischen Säuren.
  • Die experimentellen Ergebnisse haben gezeigt, dass die Plasmin- und die Plasmakallikreinhemmung besonders gut bei Verbindungen mit cyclischen Strukturen an R2 und R3 und insbesondere mit einem aromatischen Kohlenstoffcyclus an R2 und R3 ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch geeignete Wahl der Substituenten zusätzlich eine gute Faktor Xa- und/oder Thrombinhemmung bei Verbindungen mit einem aromatischen Kohlenstoffcyclus an R2 und R3 erreicht werden konnte.
  • Die experimentellen Ergebnisse haben auch gezeigt, dass eine deutliche Verminderung der Hemmung von Thrombin erreicht wird, wenn R1 eine 3-COOH-Gruppe darstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist daher R1 einfach und in meta- oder para-Stellung vorhanden, vorzugsweise ist R1 ein COOH-Rest, insbesondere ist R1 einfach vorhanden und ausgewählt aus Wasserstoff, einer 4-COOH-Gruppe oder insbesondere einer 3-COOH-Gruppe. Eine weitere Verminderung der Hemmung von Thrombin konnte dadurch erreicht werden, dass R4 ein Fluoratom, insbesondere in ortho-Stellung, darstellt.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Verbindungen, bei denen R2 ein substituierter oder unsubstituierter, aromatischer Cyclus oder Bicylus mit 6-13 Kohlenstoffatomen oder Heterocyclus mit 5 Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom ist.
  • Die Substitution an R2 kann im allgemeinen ein Halogenrest, vorzugsweise Chlor oder Fluor, insbesondere Chlor, ein gegebenenfalls mit Fluor substituierter, verzweigter oder linearer Alkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder tertiäres Butyl, ein gegebenenfalls mit Fluor substituierter, verzweigter oder linearer Alkyloxy-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Hydroxy-Rest oder ein Cyano-Rest sein.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann auch R2 ein nichtaromatischer Cyclus mit 6 Kohlenstoffatomen sein.
  • Als besonders geeignete Verbindungen haben sich Verbindungen der Formel (I) erwiesen, bei denen die Substitution an R3 ein Aromat mit basischem Rest, insbesondere ein Alkylamino-Rest mit 1-3 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 Kohlenstoffatom, ein Amidino-Rest oder Guanidino-Rest ist. Vor allem hat sich eine Verbindung gemäß Formel (I) mit i = 0 und ohne R4 mit folgenden Resten als besonders geeignet erwiesen.
    Verbindung Nr. R1 R2 p R3 O
    3 3-COOH
    Figure imgb0004
         		3
    Figure imgb0005
         		1
  • Die Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind im allgemeinen gebildet aus Salzsäure, HBr, Essigsäure, Trifluoressigsäure Toluensulfonsäure oder anderen geeigneten Säuren.
  • Im Speziellen sind Verbindungen geeignet, bei denen R2 ausgewählt ist aus folgenden Resten:
    Figure imgb0006
    Figure imgb0007
    Figure imgb0008
    Figure imgb0009
     und/oder bei denen R3 ausgewählt ist aus
    Figure imgb0010
    Figure imgb0011
     insbesondere
    Figure imgb0012
  • Beispiele von derartigen Verbindungen sind Verbindungen der Formel (I), die folgendermaßen definiert sind:
    Verbindung Nr. R1 R2 p R3 o i R4
    1 H
    Figure imgb0013
         		3
    Figure imgb0014
         		1 0 -
    2 4-COOH
    Figure imgb0015
         		3
    Figure imgb0016
         		1 0 -
    3 3-COOH
    Figure imgb0017
         		3
    Figure imgb0018
         		1 0 -
    4 3-COOH
    Figure imgb0019
         		3
    Figure imgb0020
         		1 1 -
    5 3-COOH
    Figure imgb0021
         		3
    Figure imgb0022
         		1 0 2-F
    6 H
    Figure imgb0023
         		3
    Figure imgb0024
         		1 0 -
    7 H
    Figure imgb0025
         		3
    Figure imgb0026
         		1 0 -
    8 H
    Figure imgb0027
         		3
    Figure imgb0028
         		1 0 -
    9 H
    Figure imgb0029
         		3
    Figure imgb0030
         		1 0 -
    10 H
    Figure imgb0031
         		3
    Figure imgb0032
         		1 0 -
    11 H
    Figure imgb0033
         		3
    Figure imgb0034
         		1 0 -
    12 H
    Figure imgb0035
         		3
    Figure imgb0036
         		1 0 -
    13 H
    Figure imgb0037
         		1
    Figure imgb0038
         		1 0 -
    14 H
    Figure imgb0039
         		1
    Figure imgb0040
         		1 0 -
    15 H
    Figure imgb0041
         		1
    Figure imgb0042
         		1 0 -
    16 4-COOH
    Figure imgb0043
         		1
    Figure imgb0044
         		1 0 -
    17 H
    Figure imgb0045
         		1
    Figure imgb0046
         		1 0 -
    18 3-COOH
    Figure imgb0047
         		1
    Figure imgb0048
         		1 0 -
    19 4-COOH
    Figure imgb0049
         		1
    Figure imgb0050
         		1 0 -
    20 H
    Figure imgb0051
         		1
    Figure imgb0052
         		1 0 -
    21 H
    Figure imgb0053
         		3
    Figure imgb0054
         		1 0 -
    22 H
    Figure imgb0055
         		0
    Figure imgb0056
         		1 0 -
    23 3-COOH
    Figure imgb0057
         		0
    Figure imgb0058
         		1 0 -
    24 H
    Figure imgb0059
         		2
    Figure imgb0060
         		1 0 -
    25 3-COOH
    Figure imgb0061
         		2
    Figure imgb0062
         		1 0 -
    26 H
    Figure imgb0063
         		2
    Figure imgb0064
         		2 0 -
    27 H
    Figure imgb0065
         		2
    Figure imgb0066
         		2 0 -
    28 H
    Figure imgb0067
         		3
    Figure imgb0068
         		1 0 -
    29 4-COOH
    Figure imgb0069
         		3
    Figure imgb0070
         		1 0 -
    30 3-COOH
    Figure imgb0071
         		3
    Figure imgb0072
         		1 0 -
    31 H
    Figure imgb0073
         		3
    Figure imgb0074
         		2 0 -
    32 H
    Figure imgb0075
         		3
    Figure imgb0076
         		1 0 -
    33 3-COOH
    Figure imgb0077
         		3
    Figure imgb0078
         		1 0 -
    34 H
    Figure imgb0079
         		3
    Figure imgb0080
         		2 0 -
    35 4-COOH
    Figure imgb0081
         		3
    Figure imgb0082
         		2 0 -
    36 3-COOH
    Figure imgb0083
         		3
    Figure imgb0084
         		2 0 -
    37 H
    Figure imgb0085
         		1
    Figure imgb0086
         		2 0 -
    38 H
    Figure imgb0087
         		1
    Figure imgb0088
         		2 0 -
    39 H
    Figure imgb0089
         		3
    Figure imgb0090
         		2 0 -
    40 3-COOH
    Figure imgb0091
         		3
    Figure imgb0092
         		2 0 -
    41 H
    Figure imgb0093
         		3
    Figure imgb0094
         		2 0 -
    42 3-COOH
    Figure imgb0095
         		3
    Figure imgb0096
         		2 0 -
    43 H
    Figure imgb0097
         		1
    Figure imgb0098
         		2 0 -
    44 H
    Figure imgb0099
         		2
    Figure imgb0100
         		2 0 -
    45 H
    Figure imgb0101
         		1
    Figure imgb0102
         		2 0 -
    46 H
    Figure imgb0103
         		0
    Figure imgb0104
         		2 0 -
    47 H
    Figure imgb0105
         		2
    Figure imgb0106
         		2 0 -
    48 H
    Figure imgb0107
         		2
    Figure imgb0108
         		3 0 -
    49 H
    Figure imgb0109
         		3
    Figure imgb0110
         		2 0 -
    50 3-COOH
    Figure imgb0111
         		3
    Figure imgb0112
         		2 0 -
    51 H
    Figure imgb0113
         		3
    Figure imgb0114
         		2 0 -
    52 3-COOH
    Figure imgb0115
         		3
    Figure imgb0116
         		2 0 -
    53 H
    Figure imgb0117
         		3
    Figure imgb0118
         		2 0 -
    54 3-COOH
    Figure imgb0119
         		3
    Figure imgb0120
         		2 0 -
    55 H
    Figure imgb0121
         		3
    Figure imgb0122
         		2 0 -
    56 3-COOH
    Figure imgb0123
         		3
    Figure imgb0124
         		2 0 -
  • Es hat sich auch herausgestellt, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)
    Figure imgb0125
     die der allgemeinen Formel (I) entspricht, mit
    • R1,
    gegebenenfalls einfach oder mehrfach vorhanden und unabhängig voneinander ein COOR5-Rest, mit R5 gleich Wasserstoff oder einer verzweigten oder linearen Niederalkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, insbesondere Methyl, ein verzweigter oder linearer Aminoalkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Halogen- oder Pseudohalogen-Rest, vorzugsweise Chlor oder eine Cyanogruppe, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (V) oder (VI)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (V)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (VI)

    mit n so definiert, dass die Polyethylenkette ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10000 Da, 5000 Da, 3400 Da, 2000 Da, 1000 Da oder 750 Da hat, vorzugsweise ist n eine ganze Zahl von ca. 18 bis ca. 250, insbesondere ca. 18, ca. 25, ca. 50, ca. 85, ca. 125 oder ca. 250;
    R2
    ein verzweigter oder linearer Alkyloxy-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise tertiäres Butyl, ein Hydroxy-Rest, Amino-Rest oder ein verzweigter oder linearer Alkyloxycarbonylamido-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise tertiäres Butyl, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (V) oder (VI) mit n wie oben definiert;
    R3
    ausgewählt aus folgenden Resten:
    Figure imgb0126
     vorzugsweise
    Figure imgb0127
    R4
    gegebenenfalls ein einfach oder mehrfach vorhandener Halogen-Rest, vorzugsweise Fluor,
    o
    = 1 oder 2;
    p
    = 1, 2, 3 oder 4, insbesondere 1 oder 4,
    i
    = 0 oder 1, insbesondere 0;
    sowie deren racemische Mischungen und Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, gemäß der vorliegenden Erfindung auch geeignet sind.
  • Auch in diesem Fall sind Verbindungen bevorzugt, bei denen R1 einfach und in meta- oder para-Stellung vorhanden ist, vorzugsweise ist R1 Wasserstoff oder ein COOH-Rest, insbesondere ist R1 einfach vorhanden und ausgewählt aus Wasserstoff, einer 4-COOH-Gruppe oder einer 3-COOH-Gruppe.
  • Die Salze dieser Verbindungen sind wiederum im allgemeinen gebildet aus Salzsäure, HBr, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Toluensulfonsäure oder anderen geeigneten Säuren.
  • Beispiele von derartigen Verbindungen sind Verbindungen der Formel (IV) mit i = 0 und ohne Rest R4, die folgendermaßen definiert sind:
    Verbindung Nr. R1 R2 p R3 o
    57 H
    Figure imgb0128
         		4
    Figure imgb0129
         		1
    58 4-COOH
    Figure imgb0130
         		4
    Figure imgb0131
         		1
    59 H
    Figure imgb0132
         		4
    Figure imgb0133
         		1
    60 H
    Figure imgb0134
         		1
    Figure imgb0135
         		1
    61 H
    Figure imgb0136
         		1
    Figure imgb0137
         		1
    62 H
    Figure imgb0138
         		4
    Figure imgb0139
         		2
    63 H
    Figure imgb0140
         		1
    Figure imgb0141
         		1
    64 4-COOMe
    Figure imgb0142
         		1
    Figure imgb0143
         		1
    65 4-COOH
    Figure imgb0144
         		1
    Figure imgb0145
         		1
    66 3-COOMe
    Figure imgb0146
         		1
    Figure imgb0147
         		1
    67 3-COOH
    Figure imgb0148
         		1
    Figure imgb0149
         		1
    68 H *-OH 1
    Figure imgb0150
         		1
    69 4-COOMe *-OH 1
    Figure imgb0151
         		1
    70 4-COOH
    Figure imgb0152
         		1
    Figure imgb0153
         		1
    71 H
    Figure imgb0154
         		1
    Figure imgb0155
         		1
    72 H
    Figure imgb0156
         		1
    Figure imgb0157
         		1
    73 H
    Figure imgb0158
         		1
    Figure imgb0159
         		2
    74 H
    Figure imgb0160
         		1
    Figure imgb0161
         		2
    75 H
    Figure imgb0162
         		1
    Figure imgb0163
         		1
    76 H
    Figure imgb0164
         		1
    Figure imgb0165
         		1
    77 H
    Figure imgb0166
         		1
    Figure imgb0167
         		2
    78 H
    Figure imgb0168
         		1
    Figure imgb0169
         		2
  • Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können in prinzipiell bekannter Weise, wie nachfolgend beschrieben, beispielsweise wie folgt hergestellt werden, wobei im allgemeinen sequentiell die entsprechenden Aminosäuren an ein an der Amidinogruppe geschütztes Amidinobenzylamin angekoppelt werden. Hierbei trägt die N-terminale Aminosäure entweder den P4-Rest bereits oder dieser wird anschließend daran gebunden.
  • Die Nomenklatur der einzelnen Bestandteile P1, P2, P3 und P4 der erfindungsgemäßen Verbindungen ist nachfolgend ersichtlich (siehe auch Schechter und Berger, 1967). Beispielsweise wird aus dem kommerziell erhältlichen 4-Cyanobenzylamin (Showa Denko K.K., Japan) das geschützte, vorzugsweise Boc-geschützte, und an der Amidinogruppe geschützte Amidinobenzylamin, insbesondere 4-Acetyloxamidino-benzylamin nach dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen. Nach Abspaltung der Schutzgruppe erfolgt die Ankopplung der weiteren Aminosäuren und des P4-Restes mittels Standardkopplungsmethoden und Schutzgruppen, vorzugsweise mit Boc als N-terminaler Schutzgruppe. Die P3-Aminosäure kann auch direkt als geschützte, vorzugsweise Benzylsulfonyl-geschützte, Aminosäure, die den R1-Rest schon trägt, gekoppelt werden. Die Peptidanaloga werden sequentiell, beginnend vom Acetyloxamidinobenzylamin, aufgebaut. Die meisten Zwischenprodukte kristallisieren gut und lassen sich damit einfach reinigen. Die Endreinigung der Hemmstoffe erfolgt auf der letzten Stufe vorzugsweise über präparative, reversed-phase HPLC.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei sequentiell die entsprechenden Aminosäuren an ein an der Amidino- oder Guanidinogruppe geschütztes Amidino- oder Guanidinobenzylamin, beispielsweise an ein 4-Acetyloxamidinobenzylamin oder an ein 4-(Benzyloxycarbonylamidino)benzylamin, angekoppelt werden, wobei die N-terminale Aminosäure entweder den P4-Rest bereits trägt oder dieser anschließend daran gebunden wird. Nach einer eventuellen Reinigung können die erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls PEGyliert werden.
  • Ein beispielhaftes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst folgende Schritte:
    1. (a) Amidierung einer entsprechenden Nα-geschützten Aminosäure mit dem Rest R3 mit einem entsprechenden geschütztem Aminomethylbenzamidin oder -guanidin,
    2. (b) nach Abspaltung der Nα-Schutzgruppe der Aminosäure mit R3 Umsetzung des erhaltenen Produktes mit der entsprechenden Benzylsulfonylaminosäure mit den Resten R1 und R2 und Abspaltung restlicher Schutzgruppen zur erfindungsgemäßen Verbindung, und nach einer möglichen Reinigung
    3. (c) gegebenenfalls die erhaltene Verbindung PEGyliert wird.
  • Weitere dem Fachmann allgemein bekannte Verfahrenseinzelheiten, z. B. zu den gewählten Schutzgruppen oder der PEGylierung, können den Beispielen entnommen werden. Eine bevorzugte Schutzgruppe des Amidstickstoffes ist beispielsweise tert.-Butyloxycarbonyl (Boc). Die Ausgangsverbindungen sind z. B. Aminosäure-Derivate bzw. PEG-Derivate. Die Chemikalien sind im allgemeinen käuflich erhältlich. Die PEGylierung, d. h. die Derivatisierung mit Polyethylenglykol, erfolgte im Allgemeinen entweder über die P3-Aminosäure oder über den P4-Benzylsulfonylrest mit aktivierten PEG-Derivaten, z. B. mit als N-Hydroxysuccinimidester-aktiviertem PEG.
  • Eine vorteilhafte Eigenschaft der PEG-gekoppelten Verbindungen ist die Verlängerung der Halbwertszeit der Inhibitoren in der Blutzirkulation. Die folgende Struktur zeigt ein Beispiel, bei dem die PEG-Kette über die P3-Aminosäure (D-Lys) gekoppelt wurde.
    Figure imgb0170
  • Unter Verwendung eines Succinyl-Linkers wurde die folgende Verbindung erhalten:
    Figure imgb0171
  • Zusätzlich wurde die PEG-Kette über einen geeigneten P4-Benzylsulfonylrest entsprechend der unten dargestellten allgemeinen Formel angekoppelt, wobei der P4-Rest mit einer Aminomethylgruppe in para- oder ortho-Stellung modifiziert war.
    Figure imgb0172
  • Unter Verwendung eines Succinyl-Linkers wurde die folgende Verbindung erhalten:
    Figure imgb0173
  • Dem Fachmann sind jedoch auch andere Herstellungsverfahren bekannt, die gleichermaßen durchgeführt werden können. Die PEGylierten Verbindungen sind im allgemeinen Mischungen von Verbindungen verschiedener PEGylierungsgrade, wobei das Molekulargewicht der PEG-Reste üblicherweise im Bereich von 750, 1000, 2000, 3400, 5000 oder 10000 Da liegt. Es sind jedoch auch diskrete Polyethylenglykole mit definiertem Molekulargewicht käuflich erhältlich.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf ein Arzneimittel enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen, vorzugsweise zur Behandlung von Blutverlust, insbesondere bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit cardiopulmonalem Bypass.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch einen Fibrinkleber, der mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen enthält, bei dem Aprotinin durch einen geeigneten Hemmstoff der vorliegenden Erfindung ersetzt wird.
  • Unter Fibrinkleber wird im allgemeinen ein physiologischer Zweikomponentenklebstoff verstanden, der als erste Komponente Fibrinogen, Faktor XIII und Aprotinin bzw. mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und als zweite Komponente Thrombin und Calciumchlorid zur Faktor XIII Aktivierung enthält.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels oder eines erfindungsgemäßen Fibrinklebers nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren, z. B. durch Mischen mit geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoffen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch folgende Gegenstände:
  • Verbindungen der allgemeinen Formel
    Figure imgb0174
     i ist 0 oder 1, vorzugsweise 0
    R4 ist H oder OH, vorzugsweise H
    A ist ausgewählt aus folgenden Strukturen:
    Figure imgb0175
     wobei A bevorzugt ein Phenylrest ist
    R1 ist H, COOH, COOR5 (mit R5 = Methyl oder Ethyl), Aminomethyl, Halogen, Pseudohalogen, vorzugsweise aber H und COOH und besonders bevorzugt COOH , da die Carboxylgruppe die Halbwertszeit der Hemmstoffe in der Zirkulation verlängert
    R3 ist
    Figure imgb0176
     R2 ist verzweigtes oder unverzweigtes Alkyl mit 3-12 C-Atomen, auch cycloalkylsubstituiert, Aryl oder Aralkyl mit 6-14 C-Atomen, Heteroaryl oder als Heteroarylalkyl mit 6-12 C-Atomen und 1-3 Heteroatomen , ferner
    Figure imgb0177
     R6 ist Halogen oder Pseudohalogen mit p = 0, 1, 2,
    sowie deren Racemate, Kristallformen und Hydrate und Salze mit organischen und anorganischen Säuren.
  • Verbindungen der nachstehenden Formel, in welcher die einzelnen Positionen als P4 - P1 bezeichnet sind:
    Figure imgb0178
     mit
    P4 = Benzylsulfonylrest unmodifiziert oder substituiert
    P3 = hydrophobe Aminosäure in der D-Konfiguration, D-Phenylpropylglycin und weitere Aminosäuren
    P2 = basisch-hydrophobe Aminosäuren in L-Konfiguration
    P1 = 4-Amidinobenzylamid-Rest und verwandte Gruppen.
  • Verbindungen der nachfolgenden Struktur, die wie folgt über P3 an PEG gekoppelt sind:
    Figure imgb0179
     oder
    Figure imgb0180
  • Die Bezeichnungen R1, R2, R3, R4, A und i entsprechen den oben angegebenen Definitionen. B entspricht der PEG-Kette, die am Ende als Methylether vorliegt. Y ist ein geeigneter Linker zur Ankopplung des PEG an die P3-Aminosäure, beispielsweise ein Propionylrest, und X ist entweder eine NH- oder eine NH-Alkyl- oder NH-Arylgruppe. Die Ankopplung erfolgt in an sich bekannter Weise.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben beispielsweise eine PEG-Kette, die eine durchschnittliche Molmasse von 750 Da, 1000 Da, 2000 Da, 5000 Da, 10000 Da, 20000 Da hat oder eine diskrete PEG-Kette ist.
  • Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels, das geeignet ist, Blutverlust bei hyperfibrinolytischen Zuständen zu reduzieren, und Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Mittel zur Herstellung eines Fibrinklebers.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie zu beschränken.
    • Beispiele 1. Analyseverfahren 1.1 Analytische HPLC
  • Zur analytischen reversed-phase-HPLC wurde eine HPLC-Anlage LC-10A der Firma Shimadzu, bestehend aus den Teilsystemen CTO-10AS Säulenofen, LC-10AD Pumpen (2 x), DGU-14A Degaser, SIL-10AD Autoinjektor, SCL-10A Systemcontroller, SPD-10A UV-Vis Detektor und einer Säule Luna 5 µm C18(2) 100 Å, 250 x 4,6 mm der Firma Phenomenex, unter Benutzung der zugehörigen Software Shimadzu CLASS-VP, Version 5.3, verwendet. Die Detektion erfolgte bei 220 nm. Als Elutionsmittel dienten Wasser mit 0,1 % TFA (A) und Acetonitril mit 0,1 % TFA (B) bei einer Flussrate von 1 ml/min und einem linearen Gradienten (1 % B/min). Je nach Verbindung, wurden unterschiedliche Startbedingungen für die analytische HPLC verwendet, die bei den entsprechenden Verbindungen angegeben sind.
  • Zur Analyse sämtlicher Polyethylenglykol-modifizierten Wirkstoffe wurde eine Jupiter-Säule 5 µm C18(2) 300 Å, 250 x 4,6 mm der Firma Phenomenex verwendet.
    • 1.2 Präparative HPLC
  • Zur präparativen RP-HPLC wurde eine HPLC-Anlage der Firma Shimadzu, bestehend aus den Teilsystemen LC-8A präparative Pumpen (2 x), DGU-14A Degaser, FRC-10A Fraktionssammler, SCL-10A Systemcontroller, SPD-10A UV-Vis Detektor und einer Säule Luna 5 µm C8(2) 100 Å, 250 x 30,0 mm der Firma Phenomenex, unter Benutzung der zugehörigen Software Shimadzu CLASS-VP, Version 5.3, verwendet. Die Detektion erfolgte bei 220 nm. Als Elutionsmittel dienten ebenfalls Wasser mit 0,1 % TFA (A) und Acetonitril mit 0,1 % TFA (B) bei einer Flussrate von 10 oder 20 ml/min und einem geeigneten Gradienten.
    • 1.3 Massenspektroskopie
  • Die Massenspektren wurden standardmäßig auf einem ESI-MS LCQ der Firma Finnigan (Bremen, Deutschland), gemessen. Sämtliche Polyethylenglykol-gekoppelten Verbindungen wurden auf einem Maldi Ultraflex Tof/Tof Gerät der Firma Bruker analysiert.
    • Verwendete Abkürzungen
    • ACN
    Acetonitril
    4-Amba
    4-Amidinobenzylamid
    Ame
    Aminomethyl
    Boc
    tert.-Butyloxycarbonyl
    BSA
    bovines Serumalbumin
    Bzl
    Benzyl
    Bzls
    Benzylsulfonyl
    DIEA
    Diisopropylethylamin
    DCM
    Dichlormethan
    DMF
    N,N-Dimethylformamid
    HBTU
    2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-Tetramethyluroniumhexa-fluorophosphat
    HPLC
    Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
    i.V.
    im Vakuum
    LM
    Lösungsmittel
    MS
    Massenspektroskopie
    ONHS
    N-Hydroxysuccinimidester
    NMM
    N-Methylmorpholin
    PEG
    Polyethylenglykol
    Phe(3-Ame)
    3-Aminomethylphenylalanin
    Ppg
    Phenylpropylglycin
    RT
    Raumtemperatur
    tBu
    tert.-Butyl
    Tfa
    Trifluoracetyl
    TFA
    Trifluoressigsäure
    TEA
    Triethylamin
    TMS-Cl
    Trimethylsilylchlorid
    Me
    Methyl
    2. Synthese der Inhibitoren 2.1 3-HOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Ame)-4-Amba x 2 Acetat (3)
  • Figure imgb0181
    • a) Boc-Phe(3-Ame)-OH x Acetat
  • Figure imgb0182
  • 5 g (17,2 mmol) Boc-Phe(3-CN)-OH (Acros Organics) wurden in 700 ml 90 %iger Essigsäure gelöst und 3 Stunden unter Normaldruck mit Wasserstoff und 800 mg 10 % Pd/C als Katalysator bei 40°C hydriert. Das LM wurde i.V. entfernt, der Rückstand in einer kleinen Menge Methanol gelöst und durch Zugabe von Diethylether gefällt. Ausbeute: 4,1 g (HPLC: 16,7 min, Start bei 10 % B)
    • b) Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-OH
  • Figure imgb0183
  • 4,6 g (13 mmol) Boc-Phe(3-Ame)-OH x Acetat wurden in 30 ml Methanol gelöst und mit 4 ml (29,9 mmol) DIEA und 2 ml (16,78 mmol) Trifluoressigsäureethylester bei Raumtemperatur versetzt. Der Ansatz wird gerührt, nach ca. 15 min ist die ursprüngliche Suspension komplett gelöst. Nach einer Stunde wird das LM i.V. entfernt und der Rückstand in Essigester und Wasser gelöst. Die Essigesterphase wird 2x mit 5% KHSO4-Lösung und 3 x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und die organische Phase mit Na2SO4 getrocknet. Das LM wird i.V. entfernt.
    Ausbeute: 4,9 g amorpher Feststoff (HPLC: 28,13 min, Start bei 20 % B)
    • c) Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid
  • Figure imgb0184
  • 5,43 g (13,9 mmol) an Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-OH und 4,28 g (15,3 mmol) 4-(Acetylhydroxy-amidino)-Benzylamin (Synthese beschrieben im Supplement zu Schweinitz et al., 2004) wurden in 50 ml DMF gelöst und bei 0 °C mit 5,2 ml (30 mmol) DIEA und 5,81 g (15,3 mmol) HBTU versetzt. Der Ansatz wird 15 min bei 0 °C und weitere 3 h bei RT gerührt. Das LM wird i.V. entfernt und der Rückstand in Essigester gelöst. Die Essigesterphase wird 3 x mit 5 % KHSO4-Lösung, 1 x mit gesättigter NaCl-Lösung, 3 x mit gesättigter NaHCO3-Lösung und 2 x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Das zwischen den Phasen ausgefallene Produkt wird abgesaugt und i.V. getrocknet.
    Ausbeute: 4,17 g weiße Kristalle (HPLC: 28,08 min, Start bei 20 % B)
    • d) H-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid x HCl
  • Figure imgb0185
  • 4,1 g Boc-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid wurden in 60 ml trockenem Dioxan suspendiert und mit 11 ml 4 N HCl in Dioxan versetzt. Nach kurzer Ultraschallbehandlung wird der Ansatz 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 1 h wird das Produkt durch Zugabe von Diethylether gefällt, abgesaugt und i.V. getrocknet. Ausbeute: 3,8 g weißer Feststoff (HPLC: 9,47 min, Start bei 20 % B)
    • e) 3-MeOOC-Bzl-SO3 - x Na+
  • Figure imgb0186
  • 5 g (21.8 mmol) 3-Bromomethylbenzoesäure-Methylester (Acros Organics) wurden in 25 ml Wasser suspendiert und mit 2.94 g (23.8 mmol) Na2SO3 vesetzt. Der Ansatz wurde 5 h unter Rückfluß erhitzt und danach das LM teilweise i.V. entfernt, bis Kristallisation einsetzte. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4 °C aufbewahrt und das Produkt abfiltriert. Ausbeute: 3.7 g weiße Kristalle (HPLC: 12,02 min, Start bei 10 % B)
    • f) 3-MeOOC-Bzls-Cl
  • Figure imgb0187
     2,5 g (9,91 mmol) an 3-MeOOC-Bzl-SO3 - x Na+ wurden mit Phosphorylchlorid angefeuchtet und mit 2,27 g (10,9 mmol) PCl5 versetzt. Der Ansatz wurde ca. 5 min bei 0 °C gekühlt und danach 4 h auf dem Ölbad erhitzt (Badtemperatur 80 °C). Danach wurde der Ansatz auf Eis gegossen und kräftig gerührt. Nach ca. 30 min Rühren beginnt das Säurechlorid auszufallen, wird abgesaugt und i.V. getrocknet.
    Ausbeute: 1,4 g weißer Feststoff
    • g) 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-OH
  • Figure imgb0188
  • 1,3 g (6,72 mmol) H-d-Ppg-OH (Peptech, Burlingtom, MA) wurden in 90 ml trockenem DCM suspendiert und mit 2 ml (15,7mmol) TMS-Cl und 2,6 ml (15mmol) DIEA versetzt. Der Ansatz wurde 1 h unter Rückfluss erhitzt, die klare Lösung auf 0 °C abgekühlt und mit 2 g (8 mmol) an 3-MeOOC-Bzls-Cl und 2,6 ml DIEA versetzt. Der Ansatz wurde 15 min bei 0 °C und 1,5 h bei RT gerührt. Das LM wurde i.V. entfernt und der Rückstand in 700 ml halbgesättigter NaHCO3-Lösung gelöst. Der Ansatz wurde 2x mit wenig Essigester extrahiert und danach die wässrige Phase mit HCl angesäuert (pH ca. 2-3). Der Ansatz wird 3 x mit 150 ml Essigester extrahiert und die vereinte Essigesterphase 2 x mit 5 % KHSO4-Lösung und 1 x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Na2SO4 getrocknet und das LM i.V. entfernt.
    Ausbeute: 2,4 g Öl (HPLC: 33,53 min, Start bei 20 % B)
    • h) 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid
  • Figure imgb0189
  • 0,605g (1,5 mmol) 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-OH und 0,85g (1,65mmol) H-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid x HCl wurden in 40 ml trockenem DMF gelöst und bei 0 °C mit 0,63g (1,65 mmol) HBTU und 0,6 ml (0,34 mmol) DIEA vesetzt. Der Ansatz wird 15 min bei 0 °C und weitere 3 h bei RT gerührt. Das LM wird i.V. entfernt und der Rückstand in Essigester gelöst. Die Essigesterphase wird 3 x mit 5 % KHSO4-Lösung, 1 x mit gesättigter NaCl-Lösung, 3 x mit gesättigter NaHCO3-Lösung und 2 x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Das LM wird i.V. entfernt.
    Ausbeute: 1,36 g Öl (HPLC: 38,40 min, Start bei 20 % B)
    • i) 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-Amidinobenzylamid x Acetat
  • Figure imgb0190
  • 1,3 g 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid werden in 100 ml 90 % Essigsäure gelöst und über Nacht bei Normaldruck mit Wasserstoff und 150 mg 10 % Pd/C als Katalysator hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat i.V. eingeengt.
    Ausbeute: 1,2 g Öl (HPLC: 29,45 min, Start bei 20 % B)
    • 2.2 3-HODC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Ame)-4-Amidinobenzylamid x 2 Acetat (3)
  • Figure imgb0191
  • 1,2 g 3-MeOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Tfa-Ame)-4-Amidinobenzylamid x Acetat wurden in einer Mischung aus 10 ml Dioxan und 10 ml 1 N LiOH 1,5 h gerührt. Anschließend wurde der Ansatz durch Zugabe von TFA neutralisiert und das Produkt mittels präparativer reversed-phase HPLC gereinigt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert.
    Ausbeute: 0,4 g als TFA-Salz (HPLC: 24,16 min, Start bei 10 % B)
    MS: berechnet: 698,29 gef.: 699,3 (M+H)+
  • Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC durch Elution mittels eines ansteigenden Acetonitril-Gradienten, enthaltend 0,1 % Essigsäure, in das Acetat-Salz überführt.
    Ausbeute: 0,32 g
  • Entsprechend der obigen Synthesebeschreibung wurden weitere Inhibitoren synthetisiert, wobei unterschiedlich substituierte oder unsubstituierte Benzylsulfonyl-Reste und verschiedene P3-Aminosäuren als Ersatz für d-Phenylpropylglycin eingebaut wurden. Weitere Analoga des d-Phenylpropylglycins wurden mittels Heck-Kopplung synthetisiert und in P3-Position der Inhibitoren eingebaut. Die Synthese kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
    • 2.3 Bzls-d-Gly(3-Cl-Phpr)-Phe(3-Ame)-4-Amba x 2 TFA (6)
  • Figure imgb0192
    • a) Bzls-d-Gly(Allyl)-OH
  • Figure imgb0193
  • 1,0 g (8,68 mmol) D-Allylglycin (Peptech, Burlingtom, MA) wurden in 50 ml trockenem DCM suspendiert und mit 2,4 ml (19 mmol) TMS-Cl und 3,3 ml (19 mmol) DIEA versetzt. Der Ansatz wurde 1 h unter Rückfluss erhitzt, die klare Lösung auf 0 °C abgekühlt und mit 2,35 g (9,55 mmol) Bzls-Cl und 1,8 ml DIEA versetzt. Der Ansatz wurde 15 min bei 0 °C und 1,5 h bei RT gerührt. Das LM wurde i.V. entfernt und der Rückstand in 700 ml halbgesättigter NaHCO3-Lösung gelöst. Der Ansatz wurde 2 x mit Essigester extrahiert und danach die wässrige Phase mit HCl angesäuert (pH ca. 2-3). Der Ansatz wurde 3 x mit 150 ml Essigester extrahiert und die vereinte Essigesterphase 2 x mit 5 % KHSO4-Lösung und 1 x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Na2SO4 getrocknet und das LM i.V. entfernt.
    Ausbeute: 2,2 g Öl (HPLC: 21,1 min, Start bei 20 % B)
    MS (ESI, m/e): 267 [M-1]-
    • b) Bzls-d-Ala(3-Cl-Styryl)-OH
  • Figure imgb0194
  • Eine Suspension von 0,476 g (1,48 mmol) Tetra-n-butylammoniumbromid, 0,34 g (4,05 mmol) NaHCO3, 0,32g (1,34 mmol) 1-Cl-3-Iodbenzen und 9 mg (0,04 mmol) Palladium(II)acetat in einer Mischung aus 2,5 ml DMF und 2,5 ml Wasser wird 10 min bei RT gerührt. Zu dieser Suspension wird eine Lösung von 0,4 g (1,48 mmol) Bzls-d-Gly(Allyl)-OH in 2,5 ml DMF und 2,5 ml Wasser zugegeben und der Ansatz 4-6 Tage auf 45-50°C erwärmt, ggf. werden wiederholt geringe Mengen Katalysator nachdosiert. Der Katalysator wird abfiltriert, das LM i.V. entfernt und der Rückstand in 50 ml 5 % KHSO4-Lösung suspendiert. Der Ansatz wird 3 x mit je 15-20 ml Essigester extrahiert und die vereinte Essigesterphase 2 x mit 5 % KHSO4-Lösung und 1 x mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird mit Na2SO4 getrocknet und das LM i.V. entfernt. Der Rückstand (0,55 g dunkles Öl) wird mittels Flashchromatographie an Kieselgel 60 (40-63 µM) gereinigt (Gradient 0-20 % Methanol in DCM).
    Ausbeute: 0,23 g (HPLC: 39,7 min, Start bei 20 % B)
  • Der weitere Aufbau des Inhibitors erfolgte analog der beschriebenen Synthese für Hemmstoff 1. Das Intermediat 2.2.b wurde mit dem Zwischenprodukt 2d (H-Phe(3-Tfa-Ame)-4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid x HCl) analog Vorschrift 2h gekoppelt. Die Hydrierung des erhaltenen Intermediates erfolgte analog Vorschrift 2i, dabei wurde keinerlei Abspaltung des Cl-Atoms der P3-Aminosäure beobachtet. Im letzten Schritt erfolgte die Abspaltung der Trifluoracetyl-Schutzgruppe mittel LiOH in Dioxan analog dem finalen Syntheseschritt bei der Herstellung von Verbindung 3.
    HPLC: 29,04 min, Start bei 10 % B
    MS: berechnet: 688,26 gef.: 689,2 (M+H)+
    • 2.4 3-HOOC-Bzls-d-Ppg-Phe(3-Ame)-4-Guanidinobenzylamid x 2 Acetat (4)
  • Figure imgb0195
     Analog der obigen Synthesebeschreibung 2.2a-i wurde auch Verbindung 4 synthetisiert, wobei anstelle des 4-(Acetylhydroxyamidino)-Benzylamid p-Nitrobenzylamin für Schritt c) verwendet wurde. Die Reduktion des Nitrobenzylamin-Restes zum p-Aminobenzylamin. erfolgte analog Schritt 2.2i mit Methanol/THF (1:1) als Lösungsmittel. Die Guanylierung des p-Aminobenzylamin-Restes erfolgte mit kommerziell erhältlichem 1,3-di-Boc-2-(trifluoromethylsulfonyl)guanidin (Fluka) als Guanylierungsreagenz. Dazu wurde das Intermediat aus der Reduktion in Dioxan gelöst und mit dem Guanylierungsreagenz und TEA bei 50 °C einen Tag gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurden die Boc-Schutzgruppen in bekannter Weise mit TFA abgespalten. Nach Abziehen des Lösungsmittels erfolgte im letzten Schritt die Abspaltung der Trifluoracetyl-Schutzgruppe und des Methylesters mittels LiOH in Dioxan analog dem finalen Syntheseschritt bei der Herstellung von Verbindung 3.
    HPLC: 25,1 min, Start bei 10 % B
    MS: berechnet: 713,3 gef.: 714,4 (M+H)+
    • 2.5 Pegylierte Verbindungen
  • Mittels Standardverfahren wurden weitere Hemmstoffe synthetisiert, an die Polyethylenglykol(PEG)ketten unterschiedlicher Kettenlänge kovalent gekoppelt wurden. Für sämtliche Synthesen wurden kommerziell erhältliche PEG-Derivate der Firmen Fluka, Nektar Therapeutics oder Rapp Polymere mit unterschiedlichen durchschnittlichen Molekulargewichten (1000 Da, 2000 Da, 5000 Da, 10000 Da) verwendet. Die verwendeten PEG-Derivate sind an einem Ende als Methylether geschützt und am anderen Ende mit einem als N-Hydroxysuccinimidester-aktiviertem Propionsäure- oder Bernsteinsäurerest modifiziert. Dadurch konnten diese aktivierten PEG-Derivate mit einer freien Aminogruppe des Inhibitors umgesetzt werden (siehe Syntheseschemata 1 bis 5). Im letzten Schritt wurde durch Versetzen mit 1 N NaOH-Lösung die TFA-Schutzgruppe abgespalten und die Produkte über Ionenaustauschchromatographie an Fractogel® CE (Merk KGaA, Darmstadt) mittels eines Ammoniumacetat-Gradienten gereinigt und 3 x aus Wasser lyophilisiert. Die nachfolgenden Beispiele ergaben Inhibitoren mit einer PEG-Kette einer durchschnittlichen Masse von ca. 1000, 2000, 5000 oder 10000 Da.
    Figure imgb0196
    Figure imgb0197
    Figure imgb0198
    Figure imgb0199
    Figure imgb0200
  • Die gemäß den Beispielen synthetisierten Verbindungen einschließlich ihrer Hemmkonstanten sind in der unteren Tabelle zusammengefasst.
    • 3. Bestimmung der Hemmkonstanten für Plasmin und PK (K i -Werte in nM)
  • Die Bestimmung der Hemmwirkung für die einzelnen Enzyme erfolgte analog einer bereits bekannten Methode (Stürzebecher et al., 1997).
  • Die Reaktionen zur Bestimmung der Hemmung von human-Plasmin und human-Plasmakallikrein wurden in folgendem Ansatz bei 25 °C durchgeführt:
    • 200 µl TBS (0,05 M Trishydroxymethylaminomethan; 0,154 M NaCI, 2 % Ethanol, pH 8,0; enthält den Inhibitor)
    • 25 µl Substrat (2 mM, 1 mM und 0,67 mM Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA = Chromozym PL Firma LOXO für Plasmin, und 2 mM, 1 mM und 0,5 mM H-D-Pro-Phe-Arg-pNA = S2302 Firma Chromogenix für PK, gelöst in H2O)
    • 50 µl Enzymlösung (Plasmin Fa. Calbiochem: 2-5 mU/ml in 0,154 M NaCl + 0,1% BSA m/v + 25% v/v Glycerol; Plasmakallikrein Firma Enzyme Research Lab.: 20-60 ng/ml in 0,154 M NaCl + 0,1% BSA m/v)
  • Für Kinetik nullter Ordnung wurde nach 20 min die Reaktion durch Zugabe von 25 µl Essigsäure (50% v/v) gestoppt und die Absorption bei 405 nm mittels eines Microplate Reader (Multiscan Ascent, Firma Thermo) bestimmt. Im Falle von Kinetik pseudoerster Ordnung wurden die Reaktionsgeschwindigkeiten im Gleichgewichtszustand durch Aufnahme der Reaktionskinetiken erfasst. Die Ki-Werte wurden entweder nach Dixon (1953) durch lineare Regression mittels eines Computerprogramms oder durch Parameteranpassung entsprechend der Geschwindigkeitsgleichung für kompetitive Inhibierung ermittelt. Die Ki-Werte sind das Mittel aus mindestens zwei Bestimmungen.
    • Tabelle
  • Ki-Werte: A bedeutet <10 nM, B bedeutet <100 nM, C bedeutet <1000 nM und D bedeutet > 1000 nM
    • 1. Gruppe
  • Nr. Masse (gefunden/berechnet) HPLC %AN Plasmin [Ki] PK [Ki] Xa [Ki] Thrombin [Ki]
    1 655,3/654,3 37,4 A A B C
    2 699,5/698,3 33,6 A A B C
    3 699,3/698,3 34,1 A A B D
    4 714,4/713,3 35,1 B A D D
    5 717,3/716,3 34,9 A A B D
    6 689,2/688,3 39,8 A A B C
    7 689,3/688,26 41,9 A A A B
    8 689,3/688,26 39,0 A A B B
    9 669,3/668,3 39,3 A A B C
    10 685,6/684,3 37,2 A A B C
    11 723,2/722,3 41,6 A A A C
    12 739,4/738,3 44,4 A A B C
    13 683,3/682,3 41,9 B A B C
    14 703,3/702,3 40,7 A A B C
    15 677,3/676,3 37,4 A A B B
    16 721,2/720,3 34,3 A A C C
    17 677,3/676,3 37,7 A A B C
    18 721,1/720,3 35,6 A A B D
    19 721,2/720,3 34,6 A A C C
    20 633,8/632,3 36,1 A A B C
    21 661,4/660,3 41,5 A A B C
    22 703,4/702,3 38,4 A A B A
    23 747,3/746,3 36,3 A A B B
    24 657,3/656,3 29,1 A A A C
    25 747,3/746,3 36,3 A A B D
    26 671,4/670,3 30,7 A A A c
    27 642,3/641,3 42,4 A A A C
    28 655,4/654,3 37,0 A A C C
    29 699,4/698,3 31,8 A A C C
    30 699,4/698,3 34,2 A A C D
    31 669,4/668,3 36,9 A B C B
    32 616,2/615,3 35,3 A B C B
    33 660,3/659,3 31,9 A B C D
    34 640,4/639,3 52,7 A A C B
    35 684,3/683,3 48,6 A A C C
    36 684,3/683,3 49,8 A A B C
    37 647,9/646,3 39,3 B B B B
    38 660,6/659,4 39,3 A B B A
    39 641,5/640,3 36,1 A A B A
    40 685,5/684,3 32,2 A A C B
    41 657,5/656,3 40,0 A A C B
    42 701,5/700,3 35,4 B A D C
    43 619,2/618,3 35,1 A B B A
    44 627,2/626,3 33,7 B B B B
    45 638,8/637,3 30,6 A A C B
    46 638,7/638,2 34,0 A A C B
    47 643,3/642,3 28,0 A A A A
    48 641,4/640,3 34,4 A A A C
    49 641,4/640,3 33,7 A A B B
    50 685,3/684,3 31,5 A A B C
    51 641,3/640,3 33,9 A A A A
    52 685,2/684,3 31,5 A A A B
    53 657,3/656,3 36,7 A A A B
    54 701,4/700,3 34,4 A A B D
    55 657,4/656,3 37,1 A A A B
    56 701,5/700,3 34,9 A A A C
    • 2.Gruppe:
  • # MS (gefunden/berechnet) HPLC %AN Plasmin PK Xa Thrombin
    57 708,6/707,38 36,5 A A B D
    58 752,4/751,4 31,9 B A C D
    59 608,4/607,3 41,0 B A C D
    60 666,8/665,3 34,4 B A C D
    61 566,5/565,3 21,5 B A D D
    62 694,9/693,4 34,6 A A C C
    63 623,6/622,3 34,8 A A C C
    64 681,7/680,3 34,7 A A D D
    65 667,7/666,3 30,1 B A C D
    66 681,3/680,8 34,4 A A B D
    67 667,5/666,8 30,1 A A B D
    68 567,8/566,3 25,4 B A D D
    69 625,6/624,3 26,1 B A D D
    70 611,9/610,3 21,0- B A D D
    71 623,7/622,3 33,9 A A D C
    72 567,7/566,3 24,6 B B D D
    73 637,6/636,3 35,1 B B C B
    74 581,5/580,3 25,2 B B D D
    75 636,5/635,3 33,2 B B C C
    76 580,6/579,3 23,1 B B D D
    77 650,6/649,3 35,0 A A C B
    78 594,6/593,3 25,1 B A D D
    • PEGylierte Verbindungen:
  • Nr. Masse (gefunden/berechnet) HPLC %AN Plasmin [Ki] PK [Ki] Xa [Ki] Thrombin [Ki]
    79a ∼1000 Da 34,9 A A C D
    79b ∼2000 Da 39,4 A - - -
    79c ∼5000 Da 43,6 A A B D
    79d ∼10000 Da 45,4 A A C D
    80 ∼10000 Da 45,8 A A B D
    81 ∼10000 Da 46,4 A A C C
    82 ∼10000 Da 46,0 A A C C
    83 ∼10000 Da 45,2 A A C C
    • Ergebnisse:
  • 1. Der Ki-Wert der Plasminhemmung betrug generell <100 nM. Insbesondere bei Verbindungen mit cyclischen Strukturen an R2 und R3 war der Ki-Wert deutlich geringer als 100 nM und bei Verbindungen mit einem aromatischen Kohlenstoffcyclus an R2 und R3 unterhalb von ca. 10 nM. Überraschenderweise gibt es besonders viele erfindungsgemäße Verbindungen mit einem Ki-Wert unterhalb von 5 nM, z. B. die Verbindungen Nr. 1-11, 13, 14, 16-18, 20-33, 35, 38, 39, 46 und 48-56.
    2. Der Ki-Wert der Plasmakallikreinhemmung betrug ebenso generell <100 nM. Insbesondere bei Verbindungen mit einem aromatischen Kohlenstoffcyclus an R2 und R3 war der Ki-Wert deutlich geringer als 100 nM. Überraschenderweise gibt es besonders viele erfindungsgemäße Verbindungen mit einem Ki-Wert unterhalb von 1 nM, z. B. die Verbindungen Nr. 1-3, 5-6, 8-25, 27, 29, 34-36, 39, 40, 49-57, 59-61, 64, 65 und 68-70.
    3. Durch den Einbau von Homotyrosin oder Pyridin und die entsprechenden N-Oxide als Heterozyklen in P3 konnte die Selektivität gegenüber FXa deutlich reduziert werden.
    4. Im allgemeinen konnte man eine deutliche Verminderung der Hemmung von Thrombin erreichen, wenn R1 eine 3-COOH-Gruppe darstellt Eine weitere Verminderung der Hemmung von Thrombin konnte dadurch erreicht werden, dass R4 ein Fluoratom, insbesondere in ortho-Stellung, darstellt.
    5. Als besonders geeignete Verbindung hat sich die Verbindung gemäß Formel (I) mit i = 0 und ohne R4 mit folgenden Resten erwiesen:
    Verbindung Nr. R1 R2 p R3 o
    3 3-COOH
    Figure imgb0201
         		3
    Figure imgb0202
         		1
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    • US 5,602,253
    • US 6,472,393
    • US 2006/0148901
  • Die folgenden Ausführungsformen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung:
    1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
    Figure imgb0203
     mit
    • R1,
    gegebenenfalls einfach oder mehrfach vorhanden und unabhängig voneinander ein COOR5-Rest, mit R5 gleich Wasserstoff oder einer verzweigten oder linearen Niederalkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, insbesondere Methyl, ein verzweigter oder linearer Aminoalkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Halogen- oder Pseudohalogen-Rest, vorzugsweise Chlor oder eine Cyanogruppe, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (II) oder (III)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (II)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (III)

    mit n so definiert, dass die Polyethylenglykolreste ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10000 Da, 5000 Da, 3400 Da, 2000 Da, 1000 Da oder 750 Da aufweisen, vorzugsweise ist n gleich eine ganze Zahl von ca. 25 bis ca. 250, insbesondere ca. 18, ca. 25, ca. 50, ca. 85, ca. 125 oder ca. 250;
    R2
    ein gegebenenfalls substituierter, aromatischer oder nichtaromatischer Cyclus oder Bicylus mit 5-13 Kohlenstoffatomen oder aromatischer Heterocyclus mit 4-5 Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom, Stickstoffoxid, Sauerstoffatom oder Schwefelatom, vor allem einem Stickstoffatom oder Stickstoffoxid; oder ein Rest der Struktur:
    Figure imgb0204
    R3
    ein, gegebenenfalls substituierter, aromatischer Cyclus mit 5-6 Kohlenstoffatomen oder aromatischer Heterocyclus mit 3-5 Kohlenstoffatomen und 1-2 Stickstoffatomen, einem Stickstoffoxid, Sauerstoffatom oder Schwefelatom, vor allem ein Stickstoffatom oder Stickstoffoxid;
    R4
    gegebenenfalls ein einfach oder mehrfach vorhandener Halogen-Rest, vorzugsweise Fluor;
    o
    = 1, 2 oder 3, insbesondere 1;
    p
    = 0, 1, 2, oder 4, insbesondere 3; und
    i
    = 0 oder 1, insbesondere 0;
    sowie deren racemische Mischungen und Salze mit organischen oder anorganischen Säuren.
    2. Verbindungen nach Ausführungsform 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 einfach und in meta- oder para-Stellung vorhanden ist, vorzugsweise ist R1 ein COOH-Rest, insbesondere ist R1 einfach vorhanden und ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer 4-COOH-Gruppe oder insbesondere einer 3-COOH-Gruppe.
    3. Verbindungen nach Ausführungsform 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ein aromatischer Cyclus oder Bicylus mit 6-13 Kohlenstoffatomen oder Heterocyclus mit 5 Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom ist.
    4. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substitution an R2 ein Halogenrest, vorzugsweise Chlor oder Fluor, insbesondere Chlor, ein gegebenenfalls mit Fluor substituierter, verzweigter oder linearer Alkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder tertiäres Butyl, ein gegebenenfalls mit Fluor substituierter, verzweigter oder linearer Alkyloxy-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Hydroxy-Rest oder ein Cyano-Rest ist.
    5. Verbindungen nach Ausführungsform 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ein nichtaromatischer Cyclus mit 6 Kohlenstoffatomen ist.
    6. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Substitution an R3 ein basischer Rest ist.
    7. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Substitution an R3 ein Alkylamino-Rest mit 1-3, vorzugsweise 3 Kohlenstoffatomen, ein Amidino-Rest oder Guanidino-Rest ist.
    8. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass die Salze gebildet sind aus Salzsäure, HBr, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Toluensulfonsäure.
    9. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ausgewählt ist aus folgenden Resten:
    Figure imgb0205
    Figure imgb0206
    Figure imgb0207
    Figure imgb0208
     10. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass R3 ausgewählt ist aus
    Figure imgb0209
    Figure imgb0210
     insbesondere
    Figure imgb0211
     11. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgendermaßen definiert ist:
    Verbindung Nr. R1 R2 p R3 o i R4
    1 H
    Figure imgb0212
         		3
    Figure imgb0213
         		1 0 -
    2 4-COOH
    Figure imgb0214
         		3
    Figure imgb0215
         		1 0 -
    3 3-COOH
    Figure imgb0216
         		3
    Figure imgb0217
         		1 0 -
    4 3-COOH
    Figure imgb0218
         		3
    Figure imgb0219
         		1 1 -
    5 3-COOH
    Figure imgb0220
         		3
    Figure imgb0221
         		1 0 2-F
    6 H
    Figure imgb0222
         		3
    Figure imgb0223
         		1 0 -
    7 H
    Figure imgb0224
         		3
    Figure imgb0225
         		1 0 -
    8 H
    Figure imgb0226
         		3
    Figure imgb0227
         		1 0 -
    9 H
    Figure imgb0228
         		3
    Figure imgb0229
         		1 0 -
    10 H
    Figure imgb0230
         		3
    Figure imgb0231
         		1 0 -
    11 H
    Figure imgb0232
         		3
    Figure imgb0233
         		1 0 -
    12 H
    Figure imgb0234
         		3
    Figure imgb0235
         		1 0 -
    13 H
    Figure imgb0236
         		1
    Figure imgb0237
         		1 0 -
    14 H
    Figure imgb0238
         		1
    Figure imgb0239
         		1 0 -
    15 H
    Figure imgb0240
         		1
    Figure imgb0241
         		1 0 -
    16 4-COOH
    Figure imgb0242
         		1
    Figure imgb0243
         		1 0 -
    17 H
    Figure imgb0244
         		1
    Figure imgb0245
         		1 0 -
    18 3-COOH
    Figure imgb0246
         		1
    Figure imgb0247
         		1 0 -
    19 4-COOH
    Figure imgb0248
         		1
    Figure imgb0249
         		1 0 -
    20 H
    Figure imgb0250
         		1
    Figure imgb0251
         		1 0 -
    21 H
    Figure imgb0252
         		3
    Figure imgb0253
         		1 0 -
    22 H
    Figure imgb0254
         		0
    Figure imgb0255
         		1 0 -
    23 3-COOH
    Figure imgb0256
         		0
    Figure imgb0257
         		1 0 -
    24 H
    Figure imgb0258
         		2
    Figure imgb0259
         		1 0 -
    25 3-COOH
    Figure imgb0260
         		2
    Figure imgb0261
         		1 0 -
    26 H
    Figure imgb0262
         		2
    Figure imgb0263
         		2 0 -
    27 H
    Figure imgb0264
         		2
    Figure imgb0265
         		2 0 -
    28 H
    Figure imgb0266
         		3
    Figure imgb0267
         		1 0 -
    29 4-COOH
    Figure imgb0268
         		3
    Figure imgb0269
         		1 0 -
    30 3-COOH
    Figure imgb0270
         		3
    Figure imgb0271
         		1 0 -
    31 H
    Figure imgb0272
         		3
    Figure imgb0273
         		2 0 -
    32 H
    Figure imgb0274
         		3
    Figure imgb0275
         		1 0 -
    33 3-COOH
    Figure imgb0276
         		3
    Figure imgb0277
         		1 0 -
    34 H
    Figure imgb0278
         		3
    Figure imgb0279
         		2 0 -
    35 4-COOH
    Figure imgb0280
         		3
    Figure imgb0281
         		2 0 -
    36 3-COOH
    Figure imgb0282
         		3
    Figure imgb0283
         		2 0 -
    37 H
    Figure imgb0284
         		1
    Figure imgb0285
         		2 0 -
    38 H
    Figure imgb0286
         		1
    Figure imgb0287
         		2 0 -
    39 H
    Figure imgb0288
         		3
    Figure imgb0289
         		2 0 -
    40 3-COOH
    Figure imgb0290
         		3
    Figure imgb0291
         		2 0 -
    41 H
    Figure imgb0292
         		3
    Figure imgb0293
         		2 0 -
    42 3-COOH
    Figure imgb0294
         		3
    Figure imgb0295
         		2 0 -
    43 H
    Figure imgb0296
         		1
    Figure imgb0297
         		2 0 -
    44 H
    Figure imgb0298
         		2
    Figure imgb0299
         		2 0 -
    45 H
    Figure imgb0300
         		1
    Figure imgb0301
         		2 0 -
    46 H
    Figure imgb0302
         		0
    Figure imgb0303
         		2 0 -
    47 H
    Figure imgb0304
         		2
    Figure imgb0305
         		2 0 -
    48 H
    Figure imgb0306
         		2
    Figure imgb0307
         		3 0 -
    49 H
    Figure imgb0308
         		3
    Figure imgb0309
         		2 0 -
    50 3-COOH
    Figure imgb0310
         		3
    Figure imgb0311
         		2 0 -
    51 H
    Figure imgb0312
         		3
    Figure imgb0313
         		2 0 -
    52 3-COOH
    Figure imgb0314
         		3
    Figure imgb0315
         		2 0 -
    53 H
    Figure imgb0316
         		3
    Figure imgb0317
         		2 0 -
    54 3-COOH
    Figure imgb0318
         		3
    Figure imgb0319
         		2 0 -
    55 H
    Figure imgb0320
         		3
    Figure imgb0321
         		2 0 -
    56 3-COOH
    Figure imgb0322
         		3
    Figure imgb0323
         		2 0 -
    12. Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)
    Figure imgb0324
     mit
    R1,
    gegebenenfalls einfach oder mehrfach vorhanden und unabhängig voneinander ein COOR5-Rest, mit R5 gleich Wasserstoff oder einer verzweigten oder linearen Niederalkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, insbesondere Methyl, ein verzweigter oder linearer Aminoalkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Halogen- oder Pseudohalogen-Rest, vorzugsweise Chlor oder eine Cyanogruppe, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (V) oder (VI)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (V)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (VI)

    mit n so definiert, dass die Polyethylenglykolreste ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10000 Da, 5000 Da, 3400 Da, 2000 Da, 1000 Da oder 750 Da aufweisen, vorzugsweise ist n gleich eine ganze Zahl von ca. 25 bis ca. 250, insbesondere ca. 18, ca. 25, ca. 50, ca. 85, ca. 125 oder ca. 250;
    R2
    ein verzweigter oder linearer Alkyloxy-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise tertiäres Butyl, ein Hydroxy-Rest, Amino-Rest oder ein verzweigter oder linearer Alkyloxycarbonylamido-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise tertiäres Butyl, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (V) oder (VI) mit n wie oben definiert;
    R3
    ausgewählt aus folgenden Resten:
    Figure imgb0325
     vorzugsweise
    Figure imgb0326
    R4
    gegebenenfalls ein einfach oder mehrfach vorhandener Halogen-Rest, vorzugsweise Fluor,
    o
    = 1 oder 2;
    p
    = 1, 2, 3 oder 4, insbesondere 1 oder 4,
    i
    = 0 oder 1, insbesondere 0;
    sowie deren racemische Mischungen und Salze mit organischen oder anorganischen Säuren.
    13. Verbindungen nach Ausführungsform 12, dadurch gekennzeichnet, dass R1 einfach und in meta- oder para-Stellung vorhanden ist, vorzugsweise ist R1 Wasserstoff oder ein COOH-Rest, insbesondere ist R1 einfach vorhanden und ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer 4-COOH-Gruppe oder einer 3-COOH-Gruppe.
    14. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 12-13, dadurch gekennzeichnet, dass die Salze gebildet sind aus Salzsäure, HBr, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Toluensulfonsäure.
    15. Verbindungen nach einer der Ausführungsformen 12-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgendermaßen definiert ist:
    Verbindung Nr. R1 R2 p R3 o
    57 H
    Figure imgb0327
         		4
    Figure imgb0328
         		1
    58 4-COOH
    Figure imgb0329
         		4
    Figure imgb0330
         		1
    59 H *-NH2 4
    Figure imgb0331
         		1
    60 H
    Figure imgb0332
         		1
    Figure imgb0333
         		1
    61 H *-NH2 1
    Figure imgb0334
         		1
    62 H
    Figure imgb0335
         		4
    Figure imgb0336
         		2
    63 H
    Figure imgb0337
         		1
    Figure imgb0338
         		1
    64 4-COOMe
    Figure imgb0339
         		1
    Figure imgb0340
         		1
    65 4-COOH
    Figure imgb0341
         		1
    Figure imgb0342
         		1
    66 3-COOMe
    Figure imgb0343
         		1
    Figure imgb0344
         		1
    67 3-COOH
    Figure imgb0345
         		1
    Figure imgb0346
         		1
    68 H *-OH 1
    Figure imgb0347
         		1
    69 4-COOMe *-OH 1
    Figure imgb0348
         		1
    70 4-COOH *-OH 1
    Figure imgb0349
         		1
    71 H
    Figure imgb0350
         		1
    Figure imgb0351
         		1
    72 H *-OH 1
    Figure imgb0352
         		1
    73 H
    Figure imgb0353
         		1
    Figure imgb0354
         		2
    74 H *-OH 1
    Figure imgb0355
         		2
    75 H
    Figure imgb0356
         		1
    Figure imgb0357
         		1
    76 H *-OH 1
    Figure imgb0358
         		1
    77 H
    Figure imgb0359
         		1
    Figure imgb0360
         		2
    78 H *-OH 1
    Figure imgb0361
         		2
    16. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einer der Ausführungsformen 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass sequentiell die entsprechenden Aminosäuren an ein an der Amidino- oder Guanidinogruppe geschütztes Amidino- oder Guanidinobenzylamin angekoppelt werden, wobei die N-terminale Aminosäure entweder den P4-Rest bereits trägt oder dieser anschleßend daran gebunden wird, und anschließend die erhaltenen Verbindungen gegebenenfalls gereinigt und gegebenenfalls PEGyliert werden.
    17. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einer der Ausführungsformen 1-15 umfassend folgende Schritte:
    1. (a) Amidierung einer entsprechend Nα-geschützten Aminosäure mit dem Rest R3 mit einem entsprechenden geschütztem Aminomethylbenzamidin oder -guanidin,
    2. (b) Abspaltung der Nα-Schutzgruppe der Aminosäure mit R3 und Umsetzung des erhaltenen Produktes mit der entsprechenden Benzylsulfonylaminosäure mit den Resten R1 und R2 und Abspaltung restlicher Schutzgruppen zur Verbindung der Formel (I), und nach einer möglichen Reinigung
    3. (c) gegebenenfalls PEGylierung der erhaltenen Verbindung.
    18. Arzneimittel enthaltend mindestens eine Verbindung nach einer der Ausführungsformen 1-15.
    19. Arzneimittel nach Ausführungsform 17 zur Behandlung von Blutverlust, insbesondere bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit cardiopulmonalem Bypass.
    20. Fibrinkleber enthaltend mindestens eine Verbindung nach einer der Ausführungsformen 1-15.
    21. Verwendung mindestens einer Verbindung nach einer der Ausführungsformen 1-15 zur Herstellung eines Arzneimittels nach Ausführungsform 18 oder 19 oder eines Fibrinklebers nach Ausführungsform 20.

Claims (15)

  1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
    Figure imgb0362
     mit
    R1, gegebenenfalls einfach oder mehrfach vorhanden und unabhängig voneinander ein COOR5-Rest, mit R5 gleich Wasserstoff oder einer verzweigten oder linearen Niederalkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, insbesondere Methyl, ein verzweigter oder linearer Aminoalkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Halogen- oder Pseudohalogen-Rest, vorzugsweise Chlor oder eine Cyanogruppe, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (II) oder (III)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (II)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (III)

    mit n so definiert, dass die Polyethylenglykolreste ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10000 Da, 5000 Da, 3400 Da, 2000 Da, 1000 Da oder 750 Da aufweisen, vorzugsweise ist n gleich eine ganze Zahl von ca. 25 bis ca. 250, insbesondere ca. 18, ca. 25, ca. 50, ca. 85, ca. 125 oder ca. 250;
    R2 ein gegebenenfalls substituierter, aromatischer oder nichtaromatischer Cyclus oder Bicylus mit 5-13 Kohlenstoffatomen oder aromatischer Heterocyclus mit 4-5 Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom, Stickstoffoxid, Sauerstoffatom oder Schwefelatom, vor allem einem Stickstoffatom oder Stickstoffoxid; oder ein Rest der Struktur:
    Figure imgb0363
    R3 ein, gegebenenfalls substituierter, aromatischer Cyclus mit 5-6 Kohlenstoffatomen oder aromatischer Heterocyclus mit 3-5 Kohlenstoffatomen und 1-2 Stickstoffatomen, einem Stickstoffoxid, Sauerstoffatom oder Schwefelatom, vor allem ein Stickstoffatom oder Stickstoffoxid;
    R4 gegebenenfalls ein einfach oder mehrfach vorhandener Halogen-Rest, vorzugsweise Fluor;
    o = 1,2 oder 3, insbesondere 1;
    p = 0, 1, 2, oder 4, insbesondere 3; und
    i = 0 oder 1, insbesondere 0;
    sowie deren racemische Mischungen und Salze mit organischen oder anorganischen Säuren zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Blutverlust, insbesondere bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit cardiopulmonalem Bypass.
  2. Verbindungen zur Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 einfach und in meta- oder para-Stellung vorhanden ist, vorzugsweise ist R1 ein COOH-Rest, insbesondere ist R1 einfach vorhanden und ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer 4-COOH-Gruppe oder insbesondere einer 3-COOH-Gruppe.
  3. Verbindungen zur Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ein aromatischer Cyclus oder Bicylus mit 6-13 Kohlenstoffatomen oder Heterocyclus mit 5 Kohlenstoffatomen und einem Stickstoffatom ist.
  4. Verbindungen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substitution an R2 ein Halogenrest, vorzugsweise Chlor oder Fluor, insbesondere Chlor, ein gegebenenfalls mit Fluor substituierter, verzweigter oder linearer Alkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder tertiäres Butyl, ein gegebenenfalls mit Fluor substituierter, verzweigter oder linearer Alkyloxy-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Hydroxy-Rest oder ein Cyano-Rest ist.
  5. Verbindungen zur Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ein nichtaromatischer Cyclus mit 6 Kohlenstoffatomen ist.
  6. Verbindungen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Substitution an R3 ein basischer Rest ist, insbesondere ein Alkylamino-Rest mit 1-3, vorzugsweise 3 Kohlenstoffatomen, ein Amidino-Rest oder Guanidino-Rest ist.
  7. Verbindungen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Salze gebildet sind aus Salzsäure, HBr, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Toluensulfonsäure.
  8. Verbindungen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ausgewählt ist aus folgenden Resten:
    Figure imgb0364
    Figure imgb0365
    Figure imgb0366
    Figure imgb0367
  9. Verbindungen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass R3 ausgewählt ist aus
    Figure imgb0368
    Figure imgb0369
     insbesondere
    Figure imgb0370
  10. Verbindungen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgendermaßen definiert ist: Verbindung Nr. R1 R2 P R3 o i R4 1 H
    Figure imgb0371
         3
    Figure imgb0372
         1 0 -     2 4-COOH
    Figure imgb0373
         3
    Figure imgb0374
         1 0 -     3 3-COOH
    Figure imgb0375
         3
    Figure imgb0376
         1 0 -     4 3-COOH
    Figure imgb0377
         3
    Figure imgb0378
         1 1 -     5 3-COOH
    Figure imgb0379
         3
    Figure imgb0380
         1 0 2-F     6 H
    Figure imgb0381
         3
    Figure imgb0382
         1 0 -     7 H
    Figure imgb0383
         3
    Figure imgb0384
         1 0 -     8 H
    Figure imgb0385
         3
    Figure imgb0386
         1 0 -     9 H
    Figure imgb0387
         3
    Figure imgb0388
         1 0 -     10 H
    Figure imgb0389
         3
    Figure imgb0390
         1 0 -     11 H
    Figure imgb0391
         3
    Figure imgb0392
         1 0 -     12 H
    Figure imgb0393
         3
    Figure imgb0394
         1 0 -     13 H
    Figure imgb0395
         1
    Figure imgb0396
         1 0 -     14 H
    Figure imgb0397
         1
    Figure imgb0398
         1 0 -     15 H
    Figure imgb0399
         1
    Figure imgb0400
         1 0 -     16 4-COOH
    Figure imgb0401
         1
    Figure imgb0402
         1 0 -     17 H
    Figure imgb0403
         1
    Figure imgb0404
         1 0 -     18 3-COOH
    Figure imgb0405
         1
    Figure imgb0406
         1 0 -     19 4-COOH
    Figure imgb0407
         1
    Figure imgb0408
         1 0 -     20 H
    Figure imgb0409
         1
    Figure imgb0410
         1 0 -     21 H
    Figure imgb0411
         3
    Figure imgb0412
     3 1 0     1 0 -     22 H
    Figure imgb0413
         0
    Figure imgb0414
     0 1 0     1 0 -     23 3-COOH
    Figure imgb0415
         0
    Figure imgb0416
         1 0 -     24 H
    Figure imgb0417
         2
    Figure imgb0418
         1 0 -     25 3-COOH
    Figure imgb0419
         2
    Figure imgb0420
         1 0 -     26 H
    Figure imgb0421
         2
    Figure imgb0422
         2 0 -     27 H
    Figure imgb0423
         2
    Figure imgb0424
         2 0 -     28 H
    Figure imgb0425
         3
    Figure imgb0426
         1 0 -     29 4-COOH
    Figure imgb0427
         3
    Figure imgb0428
         1 0 -     30 3-COOH
    Figure imgb0429
         3
    Figure imgb0430
         1 0 -     31 H
    Figure imgb0431
         3
    Figure imgb0432
         2 0 -     32 H
    Figure imgb0433
         3
    Figure imgb0434
         1 0 -     33 3-COOH
    Figure imgb0435
         3
    Figure imgb0436
         1 0 -     34 H
    Figure imgb0437
         3
    Figure imgb0438
         2 0 -     35 4-COOH
    Figure imgb0439
         3
    Figure imgb0440
         2 0 -     36 3-COOH
    Figure imgb0441
         3
    Figure imgb0442
         2 0 -     37 H
    Figure imgb0443
         1
    Figure imgb0444
         2 0 -     38 H
    Figure imgb0445
         1
    Figure imgb0446
         2 0 -     39 H
    Figure imgb0447
         3
    Figure imgb0448
         2 0 -     40 3-COOH
    Figure imgb0449
         3
    Figure imgb0450
         2 0 -     41 H
    Figure imgb0451
         3
    Figure imgb0452
         2 0 -     42 3-COOH
    Figure imgb0453
         3
    Figure imgb0454
         2 0 -     43 H
    Figure imgb0455
         1
    Figure imgb0456
         2 0 -     44 H
    Figure imgb0457
         2
    Figure imgb0458
         2 0 -     45 H
    Figure imgb0459
         1
    Figure imgb0460
         2 0 -     46 H
    Figure imgb0461
         0
    Figure imgb0462
         2 0 -     47 H
    Figure imgb0463
         2
    Figure imgb0464
         2 0 -     48 H
    Figure imgb0465
         2
    Figure imgb0466
         3 0 -     49 H
    Figure imgb0467
         3
    Figure imgb0468
         2 0 -     50 3-COOH
    Figure imgb0469
         3
    Figure imgb0470
         2 0 -     51 H
    Figure imgb0471
         3
    Figure imgb0472
         2 0 -     52 3-COOH
    Figure imgb0473
         3
    Figure imgb0474
         2 0 -     53 H
    Figure imgb0475
         3
    Figure imgb0476
         2 0 -     54 3-COOH
    Figure imgb0477
         3
    Figure imgb0478
         2 0 -     55 H
    Figure imgb0479
         3
    Figure imgb0480
         2 0 -     56 3-COOH
    Figure imgb0481
         3
    Figure imgb0482
         2 0 -
  11. Verbindungen der allgemeinen Formel (IV)
    Figure imgb0483
     mit
    R1, gegebenenfalls einfach oder mehrfach vorhanden und unabhängig voneinander ein COOR5-Rest, mit R5 gleich Wasserstoff oder einer verzweigten oder linearen Niederalkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, insbesondere Methyl, ein verzweigter oder linearer Aminoalkyl-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl, ein Halogen- oder Pseudohalogen-Rest, vorzugsweise Chlor oder eine Cyanogruppe, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (V) oder (VI)

             CH3-O-(CH2-CH2-O-)n-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (V)

             CH3-O-(CHZ-CH2-O-)n CH2-CH2-NH-(C=O)-CH2-CH2-(C=O)-NH-CH2-     (VI)

    mit n so definiert, dass die Polyethylenglykolreste ein durchschnittliches Molekulargewicht von 10000 Da, 5000 Da, 3400 Da, 2000 Da, 1000 Da oder 750 Da aufweisen, vorzugsweise ist n gleich eine ganze Zahl von ca. 25 bis ca. 250, insbesondere ca. 18, ca. 25, ca. 50, ca. 85, ca. 125 oder ca. 250;
    R2 ein verzweigter oder linearer Alkyloxy-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise tertiäres Butyl, ein Hydroxy-Rest, Amino-Rest oder ein verzweigter oder linearer Alkyloxycarbonylamido-Rest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise tertiäres Butyl, oder ein Polyethylenglykol-Rest der Formel (V) oder (VI) mit n wie oben definiert;
    R3 ausgewählt aus folgenden Resten:
    Figure imgb0484
     vorzugsweise
    Figure imgb0485
    R4 gegebenenfalls ein einfach oder mehrfach vorhandener Halogen-Rest, vorzugsweise Fluor,
    o = 1 oder 2;
    p = 1, 2, 3 oder 4, insbesondere 1 oder 4,
    i = 0 oder 1, insbesondere 0;
    sowie deren racemische Mischungen und Salze mit organischen oder anorganischen Säuren zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Blutverlust, insbesondere bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit cardiopulmonalem Bypass.
  12. Verbindungen zur Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass R1 einfach und in meta- oder para-Stellung vorhanden ist, vorzugsweise ist R1 Wasserstoff oder ein COOH-Rest, insbesondere ist R1 einfach vorhanden und ausgewählt ist aus Wasserstoff, einer 4-COOH-Gruppe oder einer 3-COOH-Gruppe.
  13. Verbindungen zur Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Salze gebildet sind aus Salzsäure, HBr, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Toluensulfonsäure.
  14. Verbindungen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgendermaßen definiert ist: Verbindung Nr. R1 R2 p R3 o 57 H
    Figure imgb0486
         4
    Figure imgb0487
         1     58 4-COOH
    Figure imgb0488
         4
    Figure imgb0489
         1     59 H *-NH2 4
    Figure imgb0490
         1     60 H
    Figure imgb0491
         1
    Figure imgb0492
         1     61 H *-NH2 1
    Figure imgb0493
         1     62 H
    Figure imgb0494
         4
    Figure imgb0495
         2     63 H
    Figure imgb0496
         1
    Figure imgb0497
         1     64 4-COOMe
    Figure imgb0498
         1
    Figure imgb0499
         1     65 4-COOH
    Figure imgb0500
         1
    Figure imgb0501
         1     66 3-COOMe
    Figure imgb0502
         1
    Figure imgb0503
         1     67 3-COOH
    Figure imgb0504
         1
    Figure imgb0505
         1     68 H *-OH 1
    Figure imgb0506
         1     69 4-COOMe *-OH 1
    Figure imgb0507
         1     70 4-COOH *-OH 1
    Figure imgb0508
         1     71 H
    Figure imgb0509
         1
    Figure imgb0510
         1     72 H *-OH 1
    Figure imgb0511
         1     73 H
    Figure imgb0512
         1
    Figure imgb0513
         2     74 H *-OH 1
    Figure imgb0514
         2     75 H
    Figure imgb0515
         1
    Figure imgb0516
         1     76 H *-OH 1
    Figure imgb0517
         1     77 H
    Figure imgb0518
         1
    Figure imgb0519
         2     78 H *-OH 1
    Figure imgb0520
         2
  15. Verbindung der Formel
    Figure imgb0521
     sowie deren racemische Mischungen und Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, insbesondere deren Salze aus Salzsäure, HBr, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Toluensulfonsäure.
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