EP2417434A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchführung einer quantitativen ortsaufgelösten lokal- und verteilungsanalyse chemischer elemente und in-situ charakterisierung de ablatierten oberflächenregionen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur durchführung einer quantitativen ortsaufgelösten lokal- und verteilungsanalyse chemischer elemente und in-situ charakterisierung de ablatierten oberflächenregionen

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EP2417434A1
EP2417434A1 EP10715085A EP10715085A EP2417434A1 EP 2417434 A1 EP2417434 A1 EP 2417434A1 EP 10715085 A EP10715085 A EP 10715085A EP 10715085 A EP10715085 A EP 10715085A EP 2417434 A1 EP2417434 A1 EP 2417434A1
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EP
European Patent Office
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sample
laser
laser ablation
lmd
cover glass
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10715085A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Sabine Becker
Dagmar Salber
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Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP2417434A1 publication Critical patent/EP2417434A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N1/04—Devices for withdrawing samples in the solid state, e.g. by cutting
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    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • the invention relates to a method for local analysis and distribution analysis ("imaging” or “mapping”) for the quantitative determination of element concentrations in substrates, in particular in thin tissue sections, on individual cells or cell organelles, and in situ characterization of sample surfaces (topography) and after chemical analysis with lateral resolution in the micrometer to nanometer range. Furthermore, the invention relates to a device suitable for carrying out the aforementioned method.
  • laser ablation - inductively coupled plasma mass spectrometry (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry - LA-ICP-MS) is known, which is used for trace, isotope but also surface and micro focal analysis on solid sample materials.
  • this method is disadvantageously unable to determine element distributions and concentrations in thin tissue sections (mapping or imaging analysis) with a high lateral resolving power, and in particular in the lower micro- and nanoscale scale below 5 ⁇ m, as for example in the analysis of individual cells or cell organelles is required.
  • lasers such as the Nd-YAG laser
  • a wavelength in the UV range ⁇ -266 nm or 213 nm
  • These lasers are often used for sample entry in combination with high-detection ICP mass spectrometers.
  • Nd-Y AG laser systems with a laser spot diameter from several ⁇ m to several hundred ⁇ m for microlocal analysis (e.g., LSX 213, 500 CETAC Technologies, Ohama, USA or UP 213, 266 New WAVE Research, Fremont, USA).
  • Focused IR and UV laser beams are used in commercial instruments (by known laser-assisted microdissection - LMD) to excise a precisely defined area from a tissue.
  • the laser microdissection (LMD) which allows targeted molecular genetic studies on minimal amounts of a specific tissue, also allows the isolated study in selected regions of living single cells.
  • LMD laser microdissection
  • Such high-performance LMD systems with a spatial resolution in the lower micrometre and sometimes in the submicrometer range are nowadays used for isolation and analysis of individual cells or cell areas, for example in the biopsy of individual cancer cells compared to surrounding healthy control cells, small pieces of tissue or DNA strands Routine and research tasks in medicine (pathology), but also in molecular and cell biology, used.
  • Such an LMD system has a number of outstanding advantages over commercially available laser ablation systems, for example an improved spatial resolution of about one order of magnitude, a significantly improved microscopic resolution or also in connection with special staining techniques (immunostaining) and the application of highly specific software packages the recognition of special cells (eg of cancer cells in stained tissue sections).
  • the object of the invention is to provide a simple method, which on the one hand a qualitative local and distribution analysis in the nanometer range and at the same time the quantitative determination of element concentrations in different
  • Another object of the invention is to provide a device suitable for carrying out the method.
  • the invention provides a simple method, which qualitative local and Provide distributional analysis and quantification of elemental concentrations in various nanoscale sample materials, as well as the ability to observe the topographic sample surface to be examined before and after analysis.
  • the invention thus combines the advantages of LMD in accurately cutting out thin tissue sections of biological samples by a defined laser ablation of the examined region of analysis in the known line-scan mode combined with a high-resolution microscopic observation of the sample surface with the advantages of the quantitative element mass spectrometric technique, laser ablation -ICP-MS.
  • the invention advantageously makes possible a practical quantification technique for determining the chemical composition of the samples analyzed with respect to metal and non-metal contents, as used, for example, in brain research in the study of neurodegenerative diseases, the growth of carcinogenic tissue, aging processes or questions of metal distribution in individual cases living cells and cell organelles in any biological sample materials is required.
  • the sample to be examined located in a laser ablation chamber is examined microscopically in a first step, and an area for ablation and thus for mass spectrometric analysis of the trace elements is selected.
  • the high-resolution optics of a laser-assisted microdissection device (LMD) can be used.
  • the second step is followed by the laser-induced ablation of the selected region and the distributional analysis of the chemical elements by means of the same already in a LMD laser.
  • this can be done together with at least one selected standard, but preferably with several standard samples, with defined element concentrations for the quantification of the chemical elements.
  • a corresponding analogous region can be excised from the sample for further examinations, preferably by laser microdissection (LMD), and after tryptic digestion of the excised tissue by biomolecular mass spectrometry with respect to the structure elucidation of the metal-binding proteins or phosphoproteins to be analyzed.
  • LMD laser microdissection
  • the advantage of the method according to the invention lies, inter alia, in the fact that the three aforementioned steps can be carried out with the aid of a commercial device in which only a new object table having a laser ablation chamber has to be constructed, and the sample and, if appropriate, suitable standards for quantification are constantly carried out on one Slides can remain.
  • This procedure is made possible by a special laser ablation chamber, in which the coverslip, which is permeable to laser light, is formed by a slide which can be used simultaneously for laser microdissection.
  • This replaceable slide can be used to fix both the sample and the standard samples required for analysis (brain research uses mostly matrix-matched synthetic laboratory standards).
  • the slide with the sample and the standard samples is inserted into the laser microdissection device for examination in such a way that sample and standard samples are located on the underside of the slide.
  • the slide is closed with a container forming the lower part of a laser ablation chamber to an ablation chamber, so that sample and standard are located inside the chamber.
  • the ablation chamber thus formed also has a supply line and a discharge line for a transport gas of the ablated material (eg Ar), the discharge line being connected directly to an analytical device, in particular to an inductively coupled plasma mass spectrometer ICP-MS can be.
  • the dimensions of the laser ablation chamber are selected such that the entire chamber can be inserted as an object table into an existing laser microdissection device instead of a normal microscope slide or a slide placed in a cover glass holder.
  • the sample to be examined can first be examined with the aid of the existing high-resolution optics of the microscope of the LMD apparatus (approximately at a magnification of 150 times).
  • the laser which is likewise present, with a corresponding power density (with a spot diameter below 20 ⁇ m) is focused on the sample, so that the biological material is completely blanketed.
  • the standard samples on the slide are also screened under the same conditions.
  • the thus ablated material of sample and standards is advantageously transported with a carrier gas, such as an argon stream, in the inductively coupled plasma of a highly sensitive and selective ICP mass spectrometer and ionized.
  • a carrier gas such as an argon stream
  • the ions in the separation system of the mass spectrometer are separated and detected in a known manner.
  • the ICP-OES comes into consideration.
  • the method according to the invention determines certain analogous regions of the tissue in which metals or phosphorus have been detected (eg plaques) for another Analysis of the metalloproteins and / or phosphoproteins.
  • the selected areas are ablated (cut out) by means of a focused laser beam and collected in suitable sample containers, which are mounted under the microscope slide after the laser ablation examination.
  • the laser ablation chamber according to the invention which is suitable for carrying out the method has a modular construction.
  • the laser ablation chamber consists of the coverslip, the cover glass holder, and the actual flat laser ablation chamber, preferably Teflon, to avoid contamination during LA-ICP-MS analysis.
  • the cover glass holder and the remaining laser ablation chamber are gas-tightly connected to one another via an agent.
  • Such suitable means may be, for example, clamps or screw connections, where appropriate an additional seal between the wall of the laser Ablationshunt and the cover glass is arranged.
  • the coverslip may be a typical conventional slide that is transparent to the wavelength of the laser light of the LMD device and that can be fixed to the underside of the sample and any standard reference samples for examination.
  • the cover glass (slide) with the sample to be examined and the standard samples on its underside can be installed in the cover glass holder on a special microscope stage, and these are then connected in a gas-tight manner to the container, so that neither air enters the Chamber still the transport gas Ar from the chamber can flow into the environment.
  • the ablated material is transported specifically with the transport gas Ar into the inductively coupled plasma of an ICP-MS.
  • the slide with the sample and a standard sample on the underside may also initially be arranged on the container via gaskets and connected in a gas-tight manner with the aid of the cover glass holder arranged thereon. Subsequently, the entire laser ablation chamber is introduced into the laser microdissection device.
  • the LA-ICP-MS chamber which was specially developed for the slide, is pushed horizontally from the front into the LMD apparatus via an existing displacement unit prior to element mass spectrometric analysis.
  • the entire laser ablation chamber can thus be connected to a laser microdissection device and advantageously positioned under the lenses using the existing positioning devices for the object table of the LMD.
  • the ablation chamber according to the invention which is suitable for use in a conventional laser-assisted microdissection apparatus (LMD), can thus easily be used to combine a microscopic examination with an online LA-ICP-MS examination, and optionally also further examinations, without the sample must be removed from a sample slide or that the slide must be placed in different examination devices.
  • LMD laser-assisted microdissection apparatus
  • FIG. 1 shows a detailed arrangement of the laser ablation chamber 10 according to the invention, which can be used in a conventional laser microdissection device (LMD) via a specially adapted holder together with a slide, with a) view of the chamber from above and b) view of the chamber of the side.
  • LMD laser microdissection device
  • FIGS. 1 and 2 are identical here, in FIGS. 1 and 2:
  • the ablation chamber according to the invention is for the direct analysis of small areas of biological samples, such. B. tissue sections or individual cells, by means of LA-ICP-MS suitable.
  • the already mounted laser ablation chamber with the slide (carrying the sample and the standard reference materials on the underside) is retracted from the front instead of a standard slide frame into an existing LMD apparatus.
  • the slide can also be fixed on a specially designed table of the LMD, the holder of the slide can already be part of the table.
  • the table here has only one recess for the slide, which is gas-tight from below with the container as the lower part of the laser ablation chamber via a seal (eg., By glands or clamps) is connected.
  • the sample and the standard samples are always located on the bottom of the slide, d. H. inside the laser ablation chamber.
  • the simplest and most practicable variant is the laser ablation chamber outside the LMD assemble and insert for analysis (microscopy and elemental analysis) from the front into the LMD apparatus so that the analysis area to be examined is brought into the focus of the laser beam.
  • a precise displacement unit in the LMD in the first step, the sample surface is observed in reflected-light microscope mode and the analysis region is selected.
  • this area is advantageously ablated in a defined manner with the same arrangement and analyzed by mass spectrometry with respect to the metal and nonmetal distribution. A shift or readjustment of the sample by a transfer into an external laser ablation chamber is thus not necessary.
  • a sample is then completely ablated, or cut out for further investigations.
  • the slide with the sample and optionally standard samples is removed from the laser ablation chamber according to the invention and inserted into the conventional original sample table of the LMD with the sample containers underneath and inserted into the LMD.
  • Mass spectrometric methods can be used to determine the structures and sequences of the proteins in the sample and to validate the analysis results of the LA-ICP-MS with ICP-MS after digestion of an analogous sample area. The latter technique allows statements about the average contents, e.g. As the metal concentrations and phosphorus contents in the examined sample or standard material.
  • the sample is located on a slide in the LDM with standard samples. The selection of the area to be examined takes place. b) The slide remains in the LMD and is assembled with a container (lower part of the laser ablation chamber) to the laser ablation chamber. The assembly is difficult due to the limited space below the sample table, but in principle feasible.
  • the laser ablation chamber is sealed gas-tight. The LA-ICP-MS examination of selected areas is carried out according to a known analysis protocol.
  • the slide is removed from the laser ablation chamber and individually reinserted into the LDM installed together with the collection containers for the tissue samples to be excised.
  • the laser ablation chamber is assembled with the slide completely outside the LMD and sealed gas-tight, and then inserted, for example, from the front into the LMD and fixed.
  • the slide is also coverslip of the laser ablation chamber in the variants.
  • the selected area of the tissue sample to be analyzed is sampled along with the standard samples under the same laser ablation experimental conditions using a LMD laser in the proven line-scan mode (line by line).
  • the bombardment of the sample surface takes place with photons of a focused laser beam, in particular of a powerful Nd: YAG laser, wherein a spatial resolution (laser spot diameter) on the surface of the sample should amount to a few ⁇ m. Suitable devices realize spot diameters of significantly less than 20 ⁇ m.
  • the arrangement according to the invention of the laser ablation chamber, in which the lid simultaneously serves as a slide with the sample fixed underneath, is advantageously possible with an objective of the LMD almost as far as the slide and thus almost to the sample. As a result, resolutions down to the sub-micron range are possible.
  • the ablation of sample material is thus advantageously possible with a spot diameter of less than 1 .mu.m, in particular less than 0.5 .mu.m.
  • FIG. 2 illustrates the advantageous combination of the laser ablation chamber (10) according to the invention with an existing laser microdissection device.
  • the entire laser ablation chamber according to the invention with container and slide can be simply inserted into the LMD device instead of the usual cover glass holder.
  • a laser dissection usually the sample with the aid of the adjustable microscope stage in the correct position for observation brought, and then the laser beam passed through mirrors to the appropriate position.
  • the area to be analyzed is outlined on the screen with a special pen and, after entering the experimental parameters (laser beam diameter in focus, speed of the laser beam, distance between the lines) in line scan mode.

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Abstract

Eine Laserablationskammer, für den Einsatz in einem herkömmlichen lasergestützten Mikrodissektionsgerät (LMD) geeignete, Laserablationskammer ermöglicht in Kombination mit dem LMD sowohl eine quantitative ortsaufgelöste Nanolokal- und Verteilungsanalyse von Elementkonzentrationen einer Probe, als auch eine mikroskopische Erfassung der Oberflächentopographie im Nanometerbereich derselben Probe. Optional können sich weitere Untersuchungen anschließen, ohne dass dazu die Probe von einem die Probe aufweisenden Objektträger entfernt werden muss. Für die Untersuchung wird ein zu analysierender Bereich der Probe mit Hilfe eines Mikroskops eines LMD ausgesucht. Dabei befindet sich die Probe auf der Unterseite eines Deckglases (Objektträger), welches gleichzeitig Teil einer unterhalb des Objektträgers und innerhalb des LMD montierten Laserablationskammer ist. Ein Teil der Probe wird ablatiert und analysiert. Optional können mit der vorhandenen LMD Instrumentation gezielt bestimmte Bereiche des Gewebes, in denen Metalle nachgewiesen wurden, für eine weitere Analytik ausgeschnitten und in Probenbehältern, die nach der Laserablation unter den Objektträger montiert werden, auffangen werden.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung einer quantitativen ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente und in-situ Charakterisierung der ablauerten Oberflächenregionen
Die Erfindung betrifft einerseits ein Verfahren zur Lokalanalyse und Verteilungsanalyse („Imaging" oder „Mapping") zur quantitativen Bestimmung von Elementkonzentrationen in Substraten, insbesondere in dünnen Gewebeschnitten, an einzelnen Zellen oder Zellorganellen, und der in-situ Charakterisierung von Probenoberflächen (Topographie) vor und nach der chemischen Analyse mit lateraler Auflösung im Mikrometer- bis in den Nanometer- bereich. Ferner betrifft die Erfindung eine zur Durchführung der vorgenannten Verfahren geeignete Vorrichtung.
Stand der Technik
Als Analysenmethode zur quantitativen Bestimmung von lateralen Elementverteilungen mit Ortsauflösung im μm-Bereich und zur Bestimmung von Spurenelementen bis in den ng/g und sub-ng/g-Konzentrationsbereich werden in der Element-Massenspektrometrie zur direkten Ablation des zu untersuchenden Probenmaterials verschiedene Verfahren, z. B. unter Verwendung von fokussierten Laserstrahlen, angewandt. Bekannt ist beispielsweise das Verfahren der Laserablations - induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometrie (laser ablation in- ductively coupled plasma mass spectrometry - LA-ICP-MS), das für die Spuren-, Isotopen- aber auch Oberflächen- und Mikrolokalanalyse an festen Probenmaterialien eingesetzt wird. Dieses Verfahren ist nachteilig jedoch nicht in der Lage, Elementverteilungen und -konzen- trationen in dünnen Gewebeschnitten (Mapping oder Imaginganalyse) mit einem hohen lateralen Auflösungsvermögen, und insbesondere im unteren mikro- und nanoskaligen Maßstab unterhalb von 5 μm, zu bestimmen, wie es beispielsweise bei der Analyse an einzelnen Zellen oder auch Zellorganellen gefordert wird.
In zunehmendem Maße werden in der Analytik Laser, wie beispielsweise der Nd-YAG-Laser, mit einer Wellenlänge im UV-Bereich (λ-266 nm oder 213 nm) eingesetzt. Diese Laser werden häufig für den Probeneintrag in Kombination mit nachweisstarken ICP- Massenspektrometern verwendet. Zurzeit sind Nd- Y AG-Lasersysteme mit einem Laserspot- durchmesser von einigen μm bis zu einigen hundert μm zur Mikrolokalanalyse kommerziell verfügbar (z. B. LSX 213, 500 CETAC Technologies, Ohama, USA oder UP 213, 266 New WAVE Research, Fremont, USA). Als nachteilig wird empfunden, dass mit derartigen kommerziellen Laserablationssystemen in der Regel biologische Matrizes bei einem lateralen Auflösungsvermögen im unteren μm-Bereich direkt mit hoher Effizienz nicht ablatiert werden können. Der begrenzende Faktor ist dabei die Beugungsgrenze, die ein Laser regelmäßig nicht unterschreiten kann. Dies bedeutet, dass die mögliche minimale Auflösungsgrenze im Bereich einer Wellenlänge des Lasers liegt. Ortsaufgelöste Analysen unterhalb von 1 μm sind daher regelmäßig gar nicht möglich.
Für viele medizinisch-molekularbiologische Fragestellungen, z. B. zur Verteilungsanalyse von Metallen in biologischen Proben (wie in Gehirnschnitten), wird jedoch ein laterales Auflösungsvermögen des zu verwendenden Analysenverfahrens im unteren Mikrometer- bzw. von einigen hundert nm bis in den unteren nm-Bereich gefordert. Eine solche Ortsauflösung könnte dazu fuhren, dass eine direkte Nanolokalanalytik an einzelnen Zellorganellen durchführbar wäre. Zudem sind für viele Fragestellungen quantitative Aussagen der Metallverteilung von kranken gegenüber gesunden Gewebeschnitten erforderlich.
Fokussierte IR und UV Laserstrahlen werden in kommerziellen Instrumenten (mittels der bekannten lasergestützten Mikrodissektion - LMD) zum Ausschneiden eines exakt definierten Areals aus einem Gewebe eingesetzt. Die Lasemiikrodissektion (LMD), die gezielt molekulargenetische Untersuchungen an minimalen Mengen eines spezifischen Gewebes erlaubt, ermöglicht auch die isolierte Untersuchung an ausgewählten Regionen lebender Einzelzellen. Derartige leistungsfähige LMD-Systeme mit einer Ortsauflösung im unteren Mikrometerbzw, teilweise im Submikrometerbereich werden heutzutage zur- Isolierung und Analyse von einzelnen Zellen oder Zellarealen, wie beispielsweise bei der Biopsie einzelner Krebszellen im Vergleich zu umliegenden gesunden Kontrollzellen, kleinen Gewebestücken oder auch DNA Strängen, für Routine und Forschungsaufgaben in der Medizin (Pathologie), aber auch in der Molekular- und Zellbiologie, eingesetzt. Vorhandene kommerzielle Systeme verfügen über exzellente Möglichkeiten der mikroskopischen Beobachtung der Probenoberflächen und ein sehr präzises Ausschneiden von Gewebestücken durch einen stark fokussierten Laserstrahl. Dieser erreicht unter Verwendung von speziellen Laseroptiken eine hohe Ortsauflösung bis in den Submikrometerbereich (bis zu 0,5 μm). Dabei wird im Gegensatz zu den Laserablationssystemen - hier wird die Ablation des Probenmaterials durch eine definierte Bewegung des Probentisches gesteuert - der Laserstrahl mit Hilfe einer ausgefeilten Optik mit einer Präzision von ca. 0,07 μm über die Probenoberfläche definiert bewegt. Die ausgeschnittenen Gewebeproben werden anschließend meist nach einem tryptischen Verdau (cell lysis) einer weiteren biomolekularen massenspektrometrischen off-line Analyse zugeführt. Eine quantitative Elementanalyse mit LMD on-line ist jedoch regelmäßig nicht möglich. Ein solches LMD-System besitzt gegenüber kommerziell verfügbaren Laserablationssystemen eine Reihe von herausragenden Vorteilen, beispielsweise eine verbesserte Ortsauflösung etwa um eine Größenordnung, eine signifikant verbesserte mikroskopische Auflösung oder auch in Verbindung mit speziellen Färbetechniken (immunostaining) und der Anwendung hochspezieller Softwarepakete die Erkennung spezieller Zellen (z. B. von Krebszellen in gefärbten Gewebeschnitten) .
Aufgabe und Lösung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zu Verfügung zu stellen, welches einerseits eine qualitative Lokal- und Verteilungsanalyse im Nanometerbereich sowie gleichzeitig die quantitative Bestimmung von Elementkonzentrationen in verschiedenen
Probenmaterialien ermöglicht, und andererseits auch in der Lage ist, auf einfache Weise zeitnah die untersuchte Probenoberfläche vor und nach der Analyse darzustellen und zu charakterisieren.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung zu schaffen.
Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch ein Verfahren mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Hauptanspruch sowie durch eine Vorrichtung mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Nebenanspruch. Vorteilhafte Ausführungen des Verfahrens und der Vorrichtung finden sich in den jeweils darauf rückbezogenen Ansprüchen.
Gegenstand der Erfindung
Die Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zur Verfügung, welches qualitative Lokal- und Verteilungsanalysen und quantitative Bestimmungen von Elementkonzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien im Nanometerbereich ermöglicht, und zudem über die Möglichkeit verfugt, die zu untersuchende topographische Probenoberflache vor und nach einer Analyse zu beobachten.
Es ist bekannt, dass Geräte zur Lasermikrodissektion (LMD) bereits über eine sehr entwickelte und hochaufgelöste Optik in Kombination mit der Möglichkeit des Ausschneidens von zuvor beobachteten und definierten Teilen einer Probe mittels eines fokussierten Laserstrahls, der definiert über die Probenoberfläche geführt wird, verfügen. Im Rahmen dieser Erfindung wurde nun herausgefunden, dass die bislang in den üblichen Lasermikrodissektionsgeräten verwendeten Objekttische mit eingelassenen Objektträgern vorteilhaft derart modifiziert werden können, dass dadurch nunmehr direkt vor Ort auch eine Laserablation zusammen mit einer quantitativen Bestimmung der Elementverteilungen im ausgewählten Probenbereich durchgeführt werden kann.
Die Erfindung verbindet somit die Vorteile der LMD bezüglich des präzisen Ausschneidens dünner Gewebeschnitte biologischer Proben durch eine definierte Laserablation des untersuchten Analysenbereichs im bekannten Line-Scan-Modus kombiniert mit einer hochaufgelösten mikroskopischen Beobachtung der Probenoberfläche mit den Vorzügen der quantitativen Element-massenspektrometrischen Technik, der Laserablations-ICP-MS. Die Erfindung ermöglicht vorteilhaft eine praktikable Quantifizierungstechnik zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung der analysierten Proben bezüglich der Metall- und Nichtmetallgehal- te, wie sie beispielsweise in der Gehirnforschung beim Studium neurodegenerativer Erkrankungen, des Wachstums von cancerogenem Gewebe, von Alterungsprozessen oder bei Fragen der Metallverteilung in einzelnen lebenden Zellen und Zellorganellen in beliebigen biologischen Probenmaterialien erforderlich ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die in einer Laserablationskammer befindliche, zu untersuchende Probe in einem ersten Schritt mikroskopisch untersucht, und ein Bereich zur Ablation und damit zur massenspektrometrischen Analyse der Spurenelemente ausgesucht. Dazu kann vorteilhaft die hochaufgelöste Optik eines lasergestützten Mikrodissektionsgerätes (LMD) eingesetzt werden. Es folgt im zweiten Schritt die laserinduzierte Ablation des ausgesuchten Bereichs und die Verteilungsanalyse der chemischen Elemente mit Hilfe des ebenfalls schon in einem LMD vorhandenen Lasers. Optional kann dies zusammen mit wenigstens einem ausgewählten Standard, vorzugsweise aber mit mehreren Standardproben, mit definierten Elementkonzentrationen zur Quantifizierung der chemischen Elemente erfolgen. Je nach Ergebnis kann dann in einem dritten Schritt ein entsprechender analoger Bereich aus der Probe für weitere Untersuchungen ausgeschnitten werden, vorzugsweise durch Lasermikro- dissektion (LMD), und nach einem tryptischen Verdau des ausgeschnittenen Gewebes mit biomolekularer Massenspektrometrie bezüglich der Strukturaufklärung der metallbindenden Proteine oder Phosphoproteine analysiert werden.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt unter anderem darin, dass die drei vorgenannten Schritte mit Hilfe einer kommerziellen Vorrichtung, bei der lediglich ein neuer, eine Laserablationskammer aufweisender Objekttisch konstruiert werden muss, durchgeführt werden können und die Probe und gegebenenfalls geeignete Standards zur Quantifizierung ständig auf einem Objektträger verbleiben können.
Ermöglicht wird dieses Verfahren durch eine spezielle Laserablationskammer, bei der das für Laserlicht durchlässige Deckglas durch einen Objektträger gebildet wird, der gleichzeitig für die Lasermikrodissektion eingesetzt werden kann. Auf diesem austauschbaren Objektträger können sowohl die Probe als auch die für die Analytik benötigten Standardproben (in der Gehirnforschung verwendet man meist matrixangepasste synthetische Laborstandards) fixiert werden. Der Objektträger mit der Probe und den Standardproben wird zur Untersuchung dabei derart in das Lasermikrodissektionsgerät eingebracht, dass sich Probe und Standardproben auf der Unterseite des Objektträgers befinden. Zuvor wird der Objektträger derart mit einem das Unterteil einer Laserablationskammer bildenden Behälter zu einer Ablationskam- mer verschlossen, so dass sich Probe und Standard im Inneren der Kammer befinden. Die so gebildete Ablationskammer verfügt zudem über einen Zuführungs- und eine Abführungsleitung für ein Transportgas des ablatierten Materials (z. B. Ar), wobei die Abführungsleitung direkt an eine Analytikeinrichtung, insbesondere an ein induktiv gekoppeltes Plasma- Massenspektrometer-ICP-MS), angeschlossen werden kann. Vorteilhaft sind die Abmaße der Laserablationskammer derart gewählt, dass die komplette Kammer anstelle eines normalen Objektträgers, bzw. eines in einen Deckglashalter eingelegten Objektträgers als Objekttisch in ein vorhandenes Lasermikrodissektionsgerät eingebracht werden kann. Die zu untersuchende Probe kann zunächst mit Hilfe der vorhandenen hochaufgelösten Optik des Mikroskops der LMD Apparatur (etwa bei einer 150 fachen Vergrößerung) untersucht werden. Für die Ablation wird der ebenfalls vorhandene Laser mit einer entsprechenden Leistungsdichte (mit einem Spotdurchmesser unterhalb von 20 μm) auf die Probe fokussiert, so dass das biologische Material vollständig ablauert wird.
Gemeinsam mit der Ablation des Probenmaterials werden unter denselben Bedingungen auch die auf dem Objektträger befindlichen Standardproben ablauert. Das so ablatierte Material von Probe und Standards wird vorteilhaft mit einem Trägergas, beispielsweise einem Argon- Strom, in das induktiv gekoppelte Plasma eines hochempfindlichen und selektiven ICP- Massenspektrometers transportiert und ionisiert. Anschließend werden die Ionen im Trennsystem des Massenspektrometers auf bekannte Art und Weise separiert und detektiert. Es erfolgt eine Bestimmung der elementaren Zusammensetzung bis in den Ultraspurenbereich und eine Verteilungsanalyse des untersuchten Probenmaterials. Als alternatives Analysengerät kommt beispielsweise auch die ICP-OES in Betracht.
Nach dem Vorliegen der Ergebnisse der Verteilungsanalyse von Metallen und Nichtmetallen in der untersuchte Probe ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren anschließend möglich, bestimmte analoge Bereiche des Gewebes, in denen Metalle oder Phosphor nachgewiesen wurden (z. B. Plaques), nunmehr auch für eine weitere Analytik der Metalloproteine und/oder Phosphoproteine auszuschneiden. Dazu werden mittels eines fokussierten Laserstrahls die ausgewählten Bereiche ablatiert (ausgeschnitten) und in dafür geeigneten Probenbehältern, die nach der Laserablationsuntersuchung unter den Objektträger montiert werden, aufgefangen.
Die zur Durchführung des Verfahrens geeignete erfindungsgemäße Laserablationskammer weist einen modularen Aufbau auf. Die Laserablationskammer besteht aus dem Deckglas, der Halterung des Deckglases und der eigentlichen flachen Laserablationskammer, vorzugsweise aus Teflon, um Kontaminationen während der LA-ICP-MS Analyse zu vermeiden. Die Deck- glashalterung und die restliche Laserablationskammer sind über ein Mittel gasdicht miteinander verbunden. Solch geeignete Mittel können beispielsweise Klammern oder Verschraubun- gen sein, wobei gegebenenfalls eine zusätzlich Dichtung zwischen der Wandung der Laser- ablationskammer und dem Deckglas angeordnet ist. Bei dem Deckglas kann es sich insbesondere um einen typischen herkömmlichen Objektträger handeln, der transparent für die Wellenlänge des Laserlichtes des LMD Gerätes ist, und bei dem zur Untersuchung die Probe und eventuelle Standardreferenzproben auf deren Unterseite fixiert werden können.
Für den Zusammenbau der Laserablationskammer kann beispielsweise zunächst das Deckglas (Objektträger) mit der zu untersuchenden Probe und den Standardproben auf deren Unterseite in die Deckglashalterung auf einen speziellen Mikroskoptisch eingebaut werden, und diese anschließend gasdicht mit dem Behälter verbunden werden, so dass weder Luft in die Kammer noch das Transportgas Ar aus der Kammer in die Umgebung strömen kann. Das ablatier- te Material wird mit dem Transportgas Ar gezielt in das induktiv gekoppelte Plasma eines ICP-MS transportiert.
Alternativ kann aber auch zunächst der Objektträger mit der Probe und einer Standardprobe auf der Unterseite gegebenenfalls über Dichtungen auf dem Behälter angeordnet und mit Hilfe des darauf angeordneten Deckglashalters gasdicht mit diesem verbunden werden. Anschließend wird die gesamte Laserablationskammer in das Lasermikrodissektionsgerät eingebracht. Die speziell für den Objektträger entwickelte LA-ICP-MS Kammer wird vor der Element-massenspektrometrischen Analyse von vorn horizontal über eine vorhandene Verschiebeeinheit in die LMD Apparatur eingeschoben.
Die gesamte Laserablationskammer kann so mit einem Lasermikrodissektionsgerät verbunden und vorteilhaft mit Hilfe der vorhandenen Positioniereinrichtungen für den Objekttisch des LMD unter den Objektiven positioniert werden.
Durch die erfindungsgemäße, für den Einsatz in einem herkömmlichen lasergestützten Mikrodissektionsgerät (LMD) geeignete, Ablationskammer kann so auf einfache Weise eine mikroskopische Untersuchung mit einer online LA-ICP-MS Untersuchung, und optional auch noch weitere Untersuchungen kombiniert werden, ohne dass dazu die Probe von einem die Probe aufweisenden Objektträger entfernt werden muss oder dass der Objektträger in verschiedene Untersuchungsgeräte eingesetzt werden muss. Spezieller Beschreibungsteil
Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von zwei Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch eingeschränkt werden soll.
Die Figur 1 zeigt eine detaillierte Anordnung der erfindungsgemäßen Laserablationskammer 10, die über eine speziell angepasste Halterung zusammen mit einem Objektträger in eine herkömmliche Lasermikrodissektions- Vorrichtung (LMD) eingesetzt werden kann, mit a) Ansicht der Kammer von oben und b) Ansicht der Kammer von der Seite.
Dabei bedeuten in den Figuren 1 und 2:
1 Deckglas, z. B. ein üblicher Objektträger
2 Deckglashalterung
3 Behälter (Unterteil der Laserablationskammer)
4 Probe
5 Standardproben zur Quantifizierung der Analysenergebnisse
6 Mittel zum gasdichten Verbinden von Behälter und Objektträger, bzw. Deckglashalterung
7 Dichtung
Die erfindungsgemäße Ablationskammer ist für die direkte Analyse von kleinen Bereichen biologischer Proben, wie z. B. von Gewebeschnitten oder einzelnen Zellen, mittels LA-ICP- MS geeignet.
Vorteilhaft wird die bereits montierte Laserablationskammer mit dem Objektträger (der die Probe und die Standardreferenzmaterialien auf der Unterseite trägt) von vorn anstelle eines üblichen Objektträgerrahmens in eine vorhandene LMD Apparatur eingefahren. Der Objektträger kann aber auch auf einem speziell entwickelten Tisch des LMD fixiert werden, wobei die Halterung des Objektträgers bereits Teil des Tisches sein kann. Der Tisch hat hier nur eine Aussparung für den Objektträger, der von unten mit dem Behälter als Unterteil der Laserablationskammer über eine Dichtung gasdicht (z. B. durch Verschraubungen oder Klemmungen) verbunden ist. Die Probe und die Standardproben befinden sich immer auf der Unterseite des Objektträgers, d. h. im Innern der Laserablationskammer.
Die einfachste und praktikabelste Variante ist, die Laserablationskammer außerhalb des LMD zusammenzubauen und zur Analyse (Mikroskopie und Elementanalyse) von vorn derart in die LMD Apparatur einzuschieben, dass der zu untersuchende Analysenbereich in den Fokus des Laserstrahles gebracht wird. Zur Einführung der Laserablationskammer existiert bereits eine präzise Verschiebeeinheit im LMD. Unter Verwendung dieser Anordnung wird im ersten Schritt die Probenoberfläche im Auflicht-Mikroskopmodus beobachtet und der Analysenbereich ausgewählt. Im zweiten Schritt wird vorteilhaft mit derselben Anordnung dieser Bereich definiert ablatiert und bezüglich der Metall- und Nichtmetallverteilung massenspektro- metrisch analysiert. Eine Verschiebung oder Nachjustierung der Probe durch eine Überführung in eine externe Laserablationskammer ist somit nicht nötig.
In einer weiteren Variante wird anschließend eine Probe komplett ablatiert, bzw. für weitere Untersuchungen ausgeschnitten. Dazu wird der Objektträger mit der Probe und gegebenenfalls Standardproben aus der erfindungsgemäßen Laserablationskammer entfernt und in den herkömmlichen Originalprobentisch des LMD mit den darunter befindlichen Probenbehältern eingesetzt und in das LMD eingeschoben. Auf bekannte Art und Weise lassen sich nun gezielt bestimmte Bereiche der Probe mittels des fokussierten Laserstrahls in dem LMD ausschneiden und in den darunter befindlichen Probenbehältern auffangen. Mittels massenspektrometri- scher Methoden lassen sich somit einmal die Strukturen und Sequenzen der in der Probe befindlichen Proteine bestimmen, und zum anderen die Analysenergebnisse der LA-ICP-MS mit ICP-MS nach Aufschluss eines analogen Probebereiches validieren. Die letztere Technik erlaubt Aussagen über die Durchschnittsgehalte, z. B. der Metallkonzentrationen und Phosphorgehalte, im untersuchten Proben- bzw. Standardmaterial.
Prinzipiell sind somit zwei unterschiedliche Verfahrensabläufe denkbar, die nachfolgend kurz zusammengefasst sind:
1 a) Die Probe befindet sich gegebenenfalls mit Standardproben auf einem Objektträger im LDM. Es erfolgt die Auswahl des zu untersuchenden Bereichs. b) Der Objektträger verbleibt im LMD und wird mit einem Behälter (Unterteil der Laserablationskammer) zur Laserablationskammer zusammengebaut. Der Zusammenbau ist auf Grund der beengten Räumlichkeit unterhalb des Probentisches schwierig, aber prinzipiell machbar. Die Laserablationskammer wird gasdicht verschlossen. Es erfolgt die LA-ICP-MS Untersuchung ausgewählter Bereiche nach bekanntem Analysenprotokoll. c) Der Objektträger wird aus der Laserablationskammer entfernt und einzeln wieder ins LDM zusammen mit den Auffangbehältern für die auszuschneidenden Gewebeproben eingebaut.
2 a) Der Objektträger wird zusammen mit der Probe und gegebenenfalls Standardproben mit einem Behälter (Unterteil der Laserablationskammer) zur Laserablationskammer zusammengebaut und ins LMD eingeschoben. Es erfolgt erst die Bereichsauswahl und anschließend die LA-ICP-MS-Untersuchung. b) Der Objektträger wird aus der Laserablationskammer entfernt und einzeln wieder ins LDM zusammen mit den Auffangbehältern für die ausgeschnittenen Proben eingebaut.
In der zweiten vorgeschlagenen und bevorzugten Vorgehensweise wird die Laserablationskammer mit dem Objektträger komplett außerhalb des LMD zusammengebaut und gasdicht verschlossen, und anschließend beispielsweise von vorn in das LMD eingeschoben und fixiert. Der Objektträger ist bei den Varianten gleichzeitig Deckglas der Laserablationskammer. Der ausgewählte Bereich der zu analysierenden Gewebeprobe wird zusammen mit den Standardproben unter denselben experimentellen Bedingungen mit Laserablation unter Verwendung eines Lasers des LMD in bewährtem Line-Scan-Modus ablauert (Linie für Line). Der Beschuss der Probenoberfläche erfolgt dabei mit Photonen eines fokussierten Laserstrahles, insbesondere eines leistungsfähigen Nd:YAG Lasers, wobei eine Ortsauflösung (Laserspotdurchmesser) auf der Oberfläche der Probe wenige μm betragen soll. Geeignete Geräte realisieren dabei Spotdurchmesser von deutlich weniger als 20 μm.
Die erfindungsgemäße Anordnung der Laserablationskammer, bei der der Deckel gleichzeitig als Objektträger mit der darunter fixierten Probe dient, ist es vorteilhaft möglich, mit einem Objektiv des LMD fast bis an den Objektträger und damit bis fast an die Probe heranzureichen. Dadurch werden Auflösungen bis in den sub-μm Bereich erst möglich. Die Ablation von Probenmaterial ist somit vorteilhaft mit einem Spotdurchmesser von weniger als 1 μm, insbesondere von weniger als 0,5 μm möglich.
Mit der vorhandenen LMD Instrumentation kann nicht nur die Probenoberfläche vor und nach der Laserablation mikroskopisch untersucht werden, sondern es lassen sich gezielt in einem weiteren Schritt bestimmte Bereiche des Gewebes, in denen Metalle und Phosphor nachgewiesen wurden, für eine weitere Analytik der Metalloproteine ausschneiden und in Probenbehältern, die nach der Laserablation unter den Objektträger montiert werden, auffangen. Dazu muss die originale Anordnung des LMD-Probentisches mit darunter befindlichen Probenbehältern wieder hergestellt werden.
In der Figur 2 wird die vorteilhafte Kombination der erfindungsgemäßen Laserablationskam- mer (10) mit einem vorhandenen Lasermikrodissektionsgerät verdeutlicht. Die gesamte erfindungsgemäße Laserablationskammer mit Behälter und Objektträger kann anstelle des sonst üblichen Deckglashalters einfach in das LMD-Gerät eingeschoben werden.
Anders als bei üblichen Laserablationskammern, bei denen der Laserstrahl mehr oder weniger fixiert ist, und nur die Probe über eine Verstelleinrichtung in die gewünschte Position gebracht wird, wird bei einem Laserdissektionsgerät in der Regel die Probe mit Hilfe des verstellbaren Mikroskoptisches in die richtig Position zur Beobachtung gebracht, und anschließend der Laserstrahl über Spiegel an die entsprechende Position geleitet. Der zu analysierende Bereich wird auf dem Bildschirm mit einem Spezialstift umrissen und nach Eingabe der experimentellen Parameter (Laserstrahldurchmesser im Fokus, Geschwindigkeit des Laserstahles, Abstand zwischen den Linien) im Line-Scan-Modus ablauert.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Laserablationskammer, umfassend einen Behälter mit einer Zu- und Abführunsgleitung für ein Transportgas, einen Deckglashalter mit einem für Laserlicht durchlässigen Deckglas, welches gleichzeitig zur Aufnahme der Probe geeignet ist, sowie ein Mittel zum gasdichten Verbinden von Deckglashalter und Behälter.
2. Laserablationskammer nach Anspruch 1 , mit wenigstens einer zusätzlichen Dichtung, die zwischen dem Deckglashalter und dem Behälter angeordnet ist.
3. Laserablationskammer nach Anspruch 1 oder 2, mit Klammern oder Verschraubungen als Mittel zum gasdichten Verbinden von Deckglashalter und Behälter.
4. Laserablationskammer nach Anspruch 1 bis 3, mit einem Deckglashalter aus Teflon.
5. Laserablationskammer nach Anspruch 1 bis 4, mit einem Objektträger als Deckglas.
6. Laserablationskammer nach Anspruch 1 bis 5, welche für den Einsatz in einem herkömmlichen lasergestützten Mikrodissektionsgerät (LMD) geeignet ist.
7. Verfahren zur quantitativen, ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente und in-situ Charakterisierung der ablauerten Oberflächenregion, mit Hilfe der Laserablation - induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS) und mit Hilfe eines lasergestützten Mikrodissektionsgerätes (LMD), dadurch gekennzeichnet,
- dass die Probe an der Unterseite eines Deckglases fixiert wird,
- dass das Deckglas zusammen mit einem Deckglashalter auf einen Behälter zu einer Laserablationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zusammengesetzt wird,
- dass die Laserablationskammer zusammen mit der Probe in das Lasermikro- dissektionsgerät eingeschoben wird und
- dass der Laser des LMD durch das Deckglas hindurch auf die Probe fokussiert wird und ausgewählte Bereiche oder die gesamte Probe definiert ablauert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem neben der Probe auch wenigstens eine Standardprobe (vorteilhaft mehrere Standardreferenzmaterialien zur Quantifizierung) an der Unterseite des Deckglases fixiert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 8, bei dem ein herkömmlicher Objektträger als Deckglas verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem nach der Einführung der die Probe enthaltenen Laserablationskammer in das LMD zunächst die Auswahl des zu untersuchenden Bereichs erfolgt, und anschließend eine LA-ICP-MS Untersuchung des ausgewählten Bereichs erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem nach der LA-ICP-MS Untersuchung der Objektträger mit der Probe aus der Laserablationskammer entfernt und zusammen mit einem Auffangbehälter für ausgeschnittene Proben wieder in das LMD eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, bei dem für die Laserablation der in dem LMD vorhandene Laser eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem ein Laser mit einer Wellenlänge von 355 nm eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, bei dem Probenmateriel mit einem Spotdurchmesser von weniger als 1 μm, insbesondere von weniger als 0,5 μm ablauert wird.
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