EP1690091A1 - Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee - Google Patents

Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee

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Publication number
EP1690091A1
EP1690091A1 EP04805567A EP04805567A EP1690091A1 EP 1690091 A1 EP1690091 A1 EP 1690091A1 EP 04805567 A EP04805567 A EP 04805567A EP 04805567 A EP04805567 A EP 04805567A EP 1690091 A1 EP1690091 A1 EP 1690091A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
molecules
gold
organic
particles according
grafted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04805567A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Francis Vocanson
Roger Lamartine
Pierre-Jean Debouttierre
Christophe Marquette
Loïc BLUM
Stéphane Roux
Olivier Tillement
Pascal Perriat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Universite Claude Bernard Lyon 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National des Sciences Appliquees de Lyon, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1690091A1 publication Critical patent/EP1690091A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/0004—Preparation of sols
    • B01J13/0043—Preparation of sols containing elemental metal
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of probes for detection, monitoring and quantification in biological systems. More particularly, the subject of the invention is new hybrid probe particles, the core of which consists of a gold nanoparticle on which are on the one hand probe molecules and on the other hand molecules with luminescent activity, as well as their preparation process.
  • probes associated with a marker in biological systems for the detection (recognition) or the monitoring of specific substances, called targets, is a common technique in the field of medical diagnosis and research in biology. Such probes are particularly used for flow cytometry, histology, immunological tests or fluorescence microscopy as well for the study of biological materials as of non-biological materials.
  • Common labeling systems are for example radioactive isotopes of iodine, phosphorus and other elements such as the enzyme peroxidase or alkaline phosphatase, the detection of which requires a particular substrate.
  • the selective coupling between the marker and the substance to be detected is carried out by a single or an association of functional molecules.
  • the selectivity of the binding is essential in order to unambiguously identify the target substance to be detected.
  • the reactions ensuring the coupling are known and described for example in "Bioconjugate Techniques", GT Hermanson, Académie Press, 1996 or in "Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity.
  • Fluorescent organic dyes are widely used for labeling. These are fluorescein, Texas Red or Cy5, which are selectively linked to a specific biological or organic substance playing the role of probe. After excitation of the labeled probe by an external source, most often electromagnetic, the presence of the target biological or organic substances linked to the probe is demonstrated by the emission of fluorescence from the latter.
  • Lowering the detection thresholds is a major objective that would lead to the improvement of biochips (analysis and identification of biomolecules) and the development of more efficient probes capable of tracking individual target biomolecules, in order to to study their cellular activity, or capable of highlighting the interactions existing between unicellular beings (bacteria, protozoa ...) and minerals which are manifested by local physicochemical modifications of the environment (variation of pH, force ionic, oxygen concentration).
  • the current limitation to lowering detection thresholds lies in the difficulty of functionalizing a biomolecule or a particular site of a biological substrate, constituting the target to be detected, by more than one fluorescent organic function (most often a molecule) .
  • the immobilization of gold nanoparticles functionalized by strands of oligonucleotide on biochips facilitates the germination of silver crystals (by reduction of the salts of silver cations (I )) inducing an increase in the detection current.
  • the optical properties of gold have also been used for marking and detection.
  • Richards-Kortum et al. in Cancer Research, 63, 1999-2004, 2003 showed that gold nanoparticles could be used for the detection of cancer cells.
  • immobilization on the nanoparticles of biomolecules interacting selectively with cancer cells makes it possible to obtain probes whose detection is based on the capacity of the nanoparticles to reflect the incident light emitted by the confocal microscope.
  • Gold nanoparticles can be used as an optical contrast agent thanks to the optical absorption and reflection properties associated with the plasmons of gold.
  • Another approach has been developed by Mirkin et al. in J. Am. Chem. Soc. 125, 1643-1654, 2003 which showed that the hybridization of two complementary strands of oligonucleotide, carried by two distinct gold particles, induced a bringing together of these particles and therefore a displacement of the plasmon band (resulting from collective oscillations electrons from the conduction band).
  • the color change of the colloid from red to purple
  • the coating of the metallic core with a layer of polysiloxane type was also carried out in WO 99/01 766.
  • the process used does not allow the homogeneity of the polysiloxane layer to be controlled, making it more difficult to control the surface of the nanoparticle and therefore control of the number of molecules that can be grafted onto it. All these approaches of the prior art are restrictive, because they can only apply under certain conditions.
  • Electrochemical detection does not make it possible to follow the fate of a biomolecule in vivo.
  • the technique of Mirkin et al. is limited to the detection of nucleic acids.
  • the displacement of the plasmon band can be caused by other factors (increase in salt concentration, temperature, aging).
  • one of the problems that the invention proposes to solve is to provide new nanometric-sized biological probes allowing detection, labeling and quantification, in vitro and in vivo, in biological systems, with sensitivity. and reproducibility.
  • Another problem, which the invention proposes to solve is to provide new easily detectable biological probes, by virtue of their emission of fluorescence or luminescence exacerbated after excitation.
  • the invention also aims to provide new polyfunctional biological probes of controlled size and composition, produced according to a simple process, easily industrializable.
  • the invention proposes new hybrid probe particles comprising a gold nanoparticle with a diameter included in the range from 2 to 30 nm at the surface of which are grafted by gold-sulfur bonds on the one hand, at least one, and preferably from 1 to 100, organic probe molecules and on the other hand, at least 10, and preferably 10 to 10000 organic molecules with luminescent activity.
  • the invention also proposes a new type of probe where the exacerbated luminescence is coupled to a dense nanometric metallic core, thus allowing another investigation system such as transmission electron microscopy and / or based on the properties of reflection, absorption. and / or diffusion associated with the plasmons.
  • the subject of the invention is also various methods for preparing the hybrid probe particles as defined above.
  • Fig. 1 highlights the persistence of luminescence of lissamine rhodamine B derivatives after grafting onto gold nanoparticles.
  • Fig. 2 shows the absorption spectra of a colloidal solution of gadolinium oxide nanoparticles alone or associated with gold nanoparticles.
  • Fig. 3 is a schematic illustration of the principle of the biochip used.
  • Fig. 5 shows the fluorescence observed after immobilization on Sepharose beads by hybridization of gold nanoparticles comprising an oligonucleotide and a variable number of molecules with luminescent activity (thiolated lissamine rhodamine B: rhoda-SH).
  • Fig. 6 represents the quantification of the fluorescence signal observed on the
  • Fig. 5 compares the light intensity obtained after labeling of oligonucleotide by a single molecule with luminescent activity (derived from lissamine rhodamine B) and by a gold nanoparticle comprising 100 molecules with luminescent activity (lissamine rhodamine B thiolated).
  • molecule with luminescent activity derived from lissamine rhodamine B
  • gold nanoparticle comprising 100 molecules with luminescent activity
  • organic molecule is meant the conventional definition well known to those skilled in the art, namely a carbonaceous molecule optionally containing one or more elements chosen from: O, N, P, S and halogen.
  • probe molecule is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.
  • polynucleotide means a chain of at least 2 deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5- deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • This polynucleotide can also be modified at the level of the internucleotide bond, at the level of the skeleton. Each of these modifications can be taken in combination.
  • the polynucleotide can be an oligonucleotide, a natural nucleic acid or its fragment such as DNA, a
  • Ribosomal RNA a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.
  • polypeptide is meant a chain of at least two amino acids.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and both fibrous and globular glycoproteins, enzymes receptors, enzyme / substrate complexes, glycoproteins, antibodies, antigens.
  • antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments.
  • the term "antigen" designates a compound capable of being recognized by an antibody whose synthesis it has induced by an immune response.
  • nanoparticle we mean a particle of nanometric size. These nanoparticles can be of any shape. Particles of spherical shape are, however, preferred.
  • the core of the hybrid probe particles according to the invention consists of a gold nanopaticule, preferably of average diameter comprised in the range going from 2 to 30 nm, preferably in the range going from 4 to 20 nm and preferentially in the range ranging from 5 to 16 nm.
  • TEM transmission electron microscopy
  • gold is particularly advantageous for the following reasons: - gold is compatible with living organisms and has a fairly high tolerance threshold, - gold is a metal which is very difficult to oxidize, which makes it possible to obtain nanoparticles with high stability (in particular the conservation of its zero oxidation state and of metallic behavior), - the synthesis of gold nanoparticles is easy, - gold is non-paramagnetic, - gold has an affinity particular for sulfur, which makes it possible to graft thiolated derivatives, the gold-sulfur bond being known to be particularly strong, - gold is visible in TEM imaging, - gold has an absorption in surface plasmon, this which makes it possible to obtain information on the nanoparticle, in particular on its size.
  • These gold nanoparticles are polyfunctionalized by grafting of different thiol derivatives which provide: - the biological recognition given by grafting of at least one, preferably from one to 100 and preferably from 1 to 10, probe organic molecules, - the luminescence in biological medium given by grafting from at least 10, preferably from 10 to 10,000, preferably 10 to 1,000, organic molecules with luminescent activity, advantageously 100 to 500, - the solubility adapted according to the working environment, - redispersion, - non-aggregation. Functionalization is easy, the different grafted molecules being linked in a quasi-covalent manner to the gold nanoparticle by gold-sulfur bonds.
  • the various molecules are linked, either directly to the nanoparticle by an Au-S bond, or via an organic molecule acting as a spacer, linked to the nanoparticle for an Au-S bond. If, at present, the nature of the Au-S bond remains undetermined, it is nevertheless recognized that the thiolate groups are strongly bound to the surface of gold. According to Dubois, and Nuzzo in Ann. Phys. Chem. 43, 437-, 1992 and Ulman A.
  • the number of luminescent activity molecules grafted on the surface of the gold nanoparticle is at least 10 times greater than the number of organic probe molecules grafted.
  • the organic molecules with luminescent activity also called dyes
  • the organic molecules with luminescent activity are fixed on the gold either directly (in this case the dyes are thiolated) or indirectly by means of a short organic spacer (the spacer being, preferably, a thiolated molecule comprising between 2 and 50 carbon atoms).
  • the dyes are therefore not linked to an oligonucleotide or to a DNA fragment, as described in the international application published under the number WO 03/027678.
  • the dyes are bonded almost covalently on the gold nanoparticle by gold - sulfur bond.
  • the fluorescence of the dyes is preserved after grafting and is not reduced by the presence of gold which absorbs strongly around 520 nm, which was not the case for the compounds previously chosen and adsorbed directly on the gold.
  • the luminescent function is ensured by a large number of organic molecules with luminescent activity grafted onto the gold nanoparticle, leading to a strong emission in fluorescence after excitation, which makes it possible to obtain a global final luminescence by widely exalted object.
  • the hybrid nanoparticles according to the invention then become viewable both by confocal microscopy due to absorption or reflectivity (optical contrast agent) and by electron microscopy (electronic contrast agent).
  • the target biomolecule is more easily identified because, instead of being marked by a single fluorophore, it is "marked” by several tens of luminescent molecules.
  • a biochip composed of Sepharose beads carrying oligonucleotide (d (A) 22 ), immobilized on the surface of an elastomer (Fig. 3) is used, to demonstrate the amplification obtained through the use of nanoparticles hybrid probes according to the invention carrying lissamine rhodamine B derivatives and oligonucleotides.
  • the strands complementary to those immobilized on the surface of the biochip are marked, either by a single molecule of fluorophore (Lissamine rhodamine B) (Fig.
  • Fig. 3A 3A
  • Fig. 3B and Fig. 4 a hybrid nanoparticle according to the invention carrying a multitude (2- 200) of thiolated rhodamine B lissamine molecule
  • Figs. 5 and 6 clearly show the increase in fluorescence with the number of organic fluorescent molecules (lissamine rhodamine B functionalized by a thiol function). However, beyond 400 fluorescent molecules, the intensity no longer increases and retains the value measured for gold nanoparticles on which are immobilized 400 fluorescent organic molecules. These results were obtained on gold nanoparticles with a diameter of 12 nm. As shown in Fig.
  • the grafted dyes emit at a wavelength situated outside the maximum absorption of the plasmon of gold (at 540 nm).
  • the luminescent activity molecules are fluorescent organic dyes whose maximum emission differs by at least 25 nm from the maximum absorption of the plasmon of gold.
  • Electroluminescent or chemiluminescent compounds for example derivatives of luminol may be used.
  • Luminescent compounds called two-photon or anti-stoke emission compounds, the wavelength of the emitted light is greater than the excitation wavelength, preferably at least 200 nm can also be grafted.
  • Lanthanide complexes, rhodamine derivatives and more particularly those of lissamine rhodamine B are particularly preferred dyes. As shown in Fig.
  • the grafting of lissamine rhodamine B and its derivatives onto gold nanoparticles only causes a reduction by a factor of 3 in the luminescence intensity obtained, compared with the same amount of free dyes (individualized molecules) .
  • the luminescence per biological molecule to be detected is further increased.
  • the non-radiative transfers between the organic dyes and the gold are limited, so as to obtain nanoparticles with reduced luminescence quenching.
  • the gold nanoparticle it is possible, for example, to cover at most 75% of the gold nanoparticle with a covering material having dielectric characteristics allowing the shift of the plasmon band of gold outside the zone of emission of the luminescent molecules.
  • This covering material is, for example, chosen from polysiloxanes, SiO 2 , ZrO 2 , Ln 2 O 3 and lanthanide oxohydroxides.
  • the coverage must be partial, so as to leave on the gold nanoparticle a sufficiently large free surface for the grafting of luminescent and biological molecules.
  • the grafting of the probe organic molecules and of the luminescent molecules is done directly on the gold particle and not on the covering material.
  • FIG. 2 shows, by way of illustration, how grafting with a gadolinium oxide makes it possible to eliminate the absorption of surface plasmon in the visible range.
  • Another way to obtain nanoparticles with reduced luminescence quenching is to graft luminescent activity molecules via a thiol organic spacer.
  • the use of organic dyes previously grafted onto “rigid spacers” organic thiol molecules comprising, for example, a benzene ring) makes it possible to maintain the luminescent center at an average distance from the surface greater than 0.5 nm.
  • These spacers preferably contain at least 6 carbons and less than 50, and are for example chosen from mercaptophenols, dihydrolipoic acid and thio-poly (ethylene glycol).
  • the hybrid probe nanoparticles according to the invention are relatively photostable.
  • the probes according to the invention are perfectly suited to a wide variety of biological targeting, the specifics being dependent on the nature of the probe molecules grafted to the surface of the gold nanoparticle.
  • the biological probe molecules are advantageously chosen from polynucleotides of the DNA, RNA or oligonucleotide type, proteins of the antibody, receptor, enzyme, enzyme / substrate complex type, glycoproteins, polypeptides, glycolipids, oses, polysaccharides and vitamins. Oligonucleotides thiolated or linked to a thiolated spacer are particularly preferred.
  • the probe organic molecules can also be any type of molecule allowing the biotin-streptavidin interaction.
  • thiol organic molecules distinct from the probe organic molecules and molecules with luminescent activity.
  • These thiolated organic molecules preferably comprise at least one alcohol, amino, sulfonate, carboxylic acid or phosphate function.
  • graft 1 to 1000, preferably 10 to 1000, of these other organic molecules The functions provided by these other molecules are, for example, better stability, solubility adapted as a function of the working environment, easy redispersion, non-aggregation, better selectivity.
  • the invention therefore cleverly combines gold nanoparticles, biological probe molecules and molecules with luminescent activity, so that the luminescence is not “destroyed” by the absorption of gold, but on the contrary increased overall compared to an isolated molecule (effect of many of the grafted compounds) and that the probe molecules retain their effectiveness vis-à-vis biological targets.
  • the hybrid gold nanoparticles according to the invention are easily synthesized by the Frens method (citrate route) of which there are many variants (citrate / tarmic acid) or by that of House called the NaBH 4 route.
  • citrate route one can for example refer to Nature Physical Science 241, 20-22, 1973.
  • the reduction of hydrogen tetrachloroaurate by citrate in the aqueous phase provides gold nanoparticles coated with citrate.
  • the latter plays a dual role: it allows the growth of nanoparticles to be controlled and prevents the formation of aggregates.
  • the citrate / tarmic acid combination provides also nanoparticles coated with citrate whose dimensions are smaller.
  • the grafting of thiol molecules onto the gold nanoparticles proceeds by gradual replacement of the citrate molecules by addition per portion of the solution of thiol molecules. This step is delicate because an excessively brutal replacement induces the precipitation of the nanoparticles.
  • the NaBH route consists essentially of reacting, in an aqueous medium and in the presence of sodium borohydride, hydrogen tetrachloroaurate with the thiol derivatives which it is desired to graft.
  • the grafted thiol derivatives are prepared according to methods well known to those skilled in the art.
  • thiol derivatives is meant an organic molecule comprising at least one thiol-SH function.
  • thiol functions can be obtained from dialkyl sulfides or dialkyl disulfides. These different routes are well known to those skilled in the art, who will be able to provide numerous variants. Without limitation, a description of various advantageous variants of the process is given below.
  • the process for preparing hybrid probe particles according to the invention comprises the following steps: - preparing a colloidal suspension of gold nanoparticles with a diameter in the range from 2 to 30 nm, by reduction of a gold salt, and in particular hydrogen tetrachloroaurate, in aqueous or alcoholic phase and in the presence of citrate, - add, to the colloidal suspension obtained, an aqueous or alcoholic solution of organic molecules thiol probes grafted on the surface gold nanoparticles by gold-sulfur bond to replace citrate molecules, - add, to the colloidal suspension obtained, an aqueous or alcoholic solution of luminescent activity molecules grafted onto the surface of gold nanoparticles by gold bond -sulfur to replace citrate molecules.
  • the preparation of the hybrid probe particles comprises at least three stages.
  • the first consists in preparing in the aqueous phase gold particles of nanometric size generally comprised between 10 and 20 nm according to the citrate route and between 6 and 15 nm according to the citrate / tarmic acid route, and this, advantageously, by reduction of HAuCl. 3H 2 O by citrate (citrate route) in an Au / Citrate ratio between 0.170 and 0.255 and by the citrate / tarmic acid couple (citrate / tarmic acid) in citrate and acid ratios tannic / citrate between 0.170 and 0.255 and between 0.030 and 10, respectively.
  • the gold nanoparticles are then covered by citrate molecules adsorbed on their surface. Colloids can optionally be purified by dialysis against water.
  • the functionalization of the nanoparticles is carried out in several stages. Each step corresponds to the grafting of only one kind of molecules. The grafting takes place by replacing the citrate present on the surface of the nanoparticles and therefore requires a slow addition of the solution containing the molecules to be grafted comprising a thiol function.
  • the quantity of molecules grafted onto the gold nanoparticles is advantageously between 0.1 and 60% of the free sites.
  • the grafting of molecules with biological activity is preferably carried out by adding 1 to 500 ⁇ l of a aqueous solution with a concentration between 0.1 ⁇ M and 40 ⁇ M.
  • the quantity of probe molecules grafted onto the surface of the gold nanoparticles is advantageously between 1 and 200 probe molecules per particle.
  • the second step consists in grafting the organic dye carrying one or more thiol functions by adding, preferably, from 3 to 200 ⁇ l of an aqueous (or ethanolic) solution of the thiol dye of concentration between 0.1 and 400 ⁇ M.
  • the number of grafted thiolated dyes is advantageously between 10 and 400 per particle, for particles with a diameter of 12 nm in particular. It is equally possible to graft the biological probes before or after that of the dyes. Possibly can be successively added before, between or after the two preceding stages and in an indifferent order the solutions of different thiol species such as sodium mercaptoethanesulfonate, succinic acid, PEG terminated by a thiol function. When the functionalization is complete, the hybrid gold nanoparticles are purified by column chromatography (Sephadex TM G-25 M, eluent: buffer solution of pH between 7 and 9).
  • the method comprises the following steps: - preparing a colloidal suspension of gold nanoparticles with a diameter in the range from 2 to 30 nm, by reduction of tetrachloroaurate hydrogen, in aqueous or alcoholic phase and in the presence of citrate, add, to the colloidal suspension obtained, an aqueous or alcoholic solution of thiolated spacers functionalized with an ionizable function capable of reacting with probe organic molecules or molecules with luminescent activity at graft, the said spacers coming to be grafted on the surface of the gold nanoparticles by gold-sulfur bond in replacement of citrate molecules, add an aqueous or alcoholic solution of organic molecules probes functionalized to react with the ionizable function carried by the grafted spacers on the surface of the gold nanoparticle, and / or add an aqueous or alcohol solution ic of organic molecules probes functionalized to react with the ionizable
  • this other variant consists in carrying out the grafting by condensation between two complementary reactive functions present for one in the active molecule to graft (dye, probe ...) and for the other at the end of a thiolated molecule immobilized on the surface of the gold and playing the role of spacer.
  • the grafting of an organic molecule with luminescent or biological activity requires the presence of a thiol function to ensure lasting immobilization on the gold particle. Most of these molecules do not have them.
  • the thiol function can be introduced by organic synthesis before grafting (case of the citrate protocol).
  • Another way of proceeding consists in grafting the active molecule devoid of thiol function on a thiolated spacer present on the surface of the gold nanoparticle.
  • the step of grafting active thiol molecules is replaced by two steps.
  • the first consists in immobilizing the thiolated spacer serving as an anchor point (spacer arm) for the molecule with luminescent or biological activity.
  • from 1 to 500 ⁇ l of an aqueous solution of the spacer with a concentration of between 0.1 and 400 ⁇ M is then added to the colloid of gold nanoparticles.
  • the number of immobilized thiol molecules is advantageously between 0.1% and 50% of free sites.
  • an aqueous solution of the active molecule to be grafted is added slowly.
  • This solution may possibly contain a reagent facilitating coupling.
  • the elimination of secondary products is carried out by dialysis of the colloidal solution against water.
  • the spacer used as grafting site must necessarily include a thiol function (essential for immobilization on gold) and at least one reactive function (-OH, -NH 2 , -COCl ...) to ensure subsequent grafting of the active molecule.
  • the carbon chain between the thiol function and the reactive function must be rigid and preferably contains from 6 to 50 carbon atoms.
  • the organic molecule with luminescent or biological activity must necessarily include a reactive function (-SO 2 Cl, -COCl, -OH, -NH 2 ) capable of reacting with that carried by the spacer arm immobilized on the surface of the gold nanoparticles.
  • a reactive function -SO 2 Cl, -COCl, -OH, -NH 2
  • the number of luminescent activity molecules immobilized on the surface of the nanoparticles is determined by UN-visible spectroscopy of the solution after precipitation of the nanoparticles.
  • the method comprises the following steps: - prepare a colloidal suspension of gold nanoparticles of diameter included in the range from 2 to 30 nm, by reduction of gold salt, and in particular of hydrogen tetrachloroaurate, in aqueous or alcoholic phase and in the presence of NaBH , - add, to the colloidal suspension obtained, an aqueous or alcoholic solution of thiolated spacers functionalized with an ionizable function capable of reacting with the probe organic molecules or the molecules with luminescent activity to be grafted, the said spacers being grafted on the surface gold nanoparticles by gold-sulfur bond, - add an aqueous or alcoholic solution of functionalized probe organic molecules to react with the ionizable function carried
  • the thiol molecules present on the surface of the gold nanoparticles were generally introduced during the synthesis. Some can be substituted but with uncertain control of the number of molecules replaced.
  • the immobilization of molecules with biological activity and organic dyes will be carried out in most cases (for better efficiency) by grafting on thiolated spacers present on the surface of gold nanoparticles.
  • the synthesis by the NaBPLt pathway of hybrid nanoparticles for biological labeling also requires several steps.
  • the first consists in preparing in an alcohol, preferably, methanol, ethanol or dimethylformamide, the gold nanoparticles coated with thiol molecules having an ionizable function in a single step by reduction of HAuCl .3H 2 O by a solution aqueous NaBH
  • Thiolated spacers also having an ionizable function (-NH 2 , -COOH) appear suitable for preparing redispersible and stable gold hybrid nanoparticles (under certain pH conditions) in aqueous solution.
  • these ionizable functions can be used to immobilize probe molecules and organic dyes by simple condensation reactions (formation of ester, amide, urea or thiourea derivatives, etc.). After reduction and therefore formation of the gold nanoparticles, a precipitate appears. A maximum of 2/3 of the solvent (methanol or ethanol) are then evaporated under reduced pressure at a temperature below 40 ° C.
  • the precipitate is filtered through a polymer membrane (with, for example, a pore diameter equal to 0.22 ⁇ m) and washed meticulously with different solvents (chosen according to the nature of the thiol immobilized on the surface). This washing aims to eliminate the by-products of the reduction and the large quantity of non-adsorbed thiols.
  • the powder obtained is, after air drying, redispersed in the aqueous phase within a controlled pH range (which depends on the nature of the ionizable group present in the thiolated molecule).
  • This reaction is carried out by adding to the colloidal solution an aqueous or aqueous-alcoholic solution of organic dye, the amount of which is at least four times greater than the number of thiol molecules adsorbed on the gold nanoparticles. Between 0.5 and 10% of the ionizable functions of the thiol molecules adsorbed on gold generally react.
  • the excess secondary products are then eliminated by precipitation of the nanoparticles obtained by a strong variation in the pH ( ⁇ pH> 2).
  • the precipitate is filtered through a membrane (pore diameter equal to 0.22 ⁇ m for example) and washed meticulously before being redispersed in aqueous solution within a controlled pH range.
  • the probe molecules are grafted onto part of the 85 to 90% of the ionizable functions remaining after the grafting of the organic dye.
  • the coupling is carried out by adding an aqueous solution of probe molecules, the quantity of which is at least greater than the number of thiol molecules adsorbed on the gold nanoparticles. Between 0.1 and 2% of the ionizable functions of thiol molecules grafted onto gold react.
  • the grafting of the probe molecules is advantageously carried out after that of the organic dyes. Excess side products are eliminated as before.
  • the characterization of the nanoparticles is carried out in the solid state by XPS,
  • the nanohybrids are therefore stable in these cases and the properties retained.
  • the proposed route therefore makes it possible to determine the “coating” of the gold nanoparticle, and therefore the characteristics of the probe particle obtained.
  • the new probe particles according to the invention are of very particular interest, in particular, in the improvement of biochips, the study of the interaction between microorganisms and their environment, the individual tracking of biomolecules for the study of cell traffic and of cellular activity.
  • the examples below are given purely by way of illustration and are not intended to be limiting.
  • the surface of the nanoparticles synthesized according to Example 1 is covered with thiol derivatives in precise proportions.
  • the thiol derivatives used are sodium mercaptoethanesulfonate (MES), thiomaleic acid (AT) and mercaptophenol (MP).
  • Example 3 Preparation of a colloidal suspension of luminescent gold nanoparticles by the citrate / tannic acid method under the same conditions as those of Example 2.
  • This derivative is obtained by reaction of the amino function of aminothiophenol on the sulfochloride function of rhodamine lissamine B.
  • the reaction takes place at room temperature by dissolution in 100 ml of chloroform of 125 mg of lissamine rhodamine B and 26.9 mg of aminothiophenol in the presence of 1 ml of triethylamine.
  • the solution is stirred for one day and then purified by a chromatographic column of silica with an eluent of dichloromethane / methanol, 9/1 (v / v).
  • Example 5 Grafting of thiolated derivatives of lissamine rhodamine B prepared according to example 4 on the surface of gold nanoparticles prepared according to example 1.
  • the preparation is carried out by adding thiolated rhodamine B lissamine solutions to the solution of gold nanoparticles with mechanical stirring.
  • This addition is of variable quantity and concentration depending on the number of fluorescent molecules desired per nanoparticle; this number can vary from 1 to 400 for nanoparticles 12 nm in diameter.
  • the addition will be 1 ml of an aqueous solution at 1.67.10 "5 M of lissamine rhodamine B thiolated on 10 ml of a solution at 1 , 67.10 "8 M gold nanoparticles.
  • a sulfur derivative of folic acid is obtained by grafting a bt -? - aminopropylpolyethylene glycol then modification by the reagent of Traut in order to obtain a thiol function.
  • This derivative is grafted to the surface of gold nanoparticles by addition to a solution of nanoparticles prepared according to Example 1.
  • oligonucleotides d (T) 22 terminated by a thiol function used are previously filtered on a column, 69 nanomoles of oligonucleotides diluted in 2.33 ml of water, ie a concentration of 29, 6.10 "6 M, are recovered. From 3.35 ⁇ l to 335.1 ⁇ l (from 0.2 to 20 oligonucleotides per nanoparticle) of this solution are then added to 1 ml of gold nanoparticles prepared according to Example 1, 3 or 5.
  • the colloid of Gd 2 O 3 5% Tb nanoparticles was prepared according to the polyol method (R. Bazzi, MA Flores-Gonzalez, C. Louis, K. Lebbou, C. Dujardin, A.
  • Luminescence 102-103, 445-450, 2003 It consists of directly precipitating luminescent oxide nanoparticles from metal salts dissolved in diethylene glycol. After synthesis, the colloid obtained is dialyzed at 40 ° C in diethylene glycol (1:20 by volume).
  • the first solution is added to the colloid, with stirring. After five minutes, the second solution is added (1: 1: 1 by volume). The addition is done slowly drop by drop. The colloid, during the various additions, loses its yellow color to pass through a transparent phase, then through an intense red phase, which appears gradually, direct proof of the presence of gold nanoparticles. Under certain conditions, the luminescence can be greatly exacerbated (by at least a factor
  • a colloidal solution of gold nanoparticles (6.7.10 17 nanoparticles / liter) is added 1 ml of a solution containing 0.1 M EDC and 0.2 M pentafluorophenol in propan-2 ol. After 90 minutes, 1.11 ⁇ 10 ⁇ 9 mol of thiolated oligonucleotides d (T) 22 terminated with an amine function are added. After 2 hours and 30 minutes, the nanoparticles are precipitated by addition of a 1N aqueous HCl solution. The resulting precipitate is filtered and washed before being redispersed in an aqueous solution of pH 8-10.

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Abstract

Particules sondes hybrides comprenant une nanoparticule d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 ô 30 nm ô la surface de laquelle sont greffées par des liaisons or-soufre, d'une part, au moins une, et de préférence de une ô 100, molécules organiques sondes et d'autre part, au moins 10, et de préférence 10 ô 10000, molécules ô activité luminescente, ainsi que leur procédé de préparation.

Description

NOUVELLES SONDES HYBRIDES À LUMINESCENCE EXALTÉE La présente invention concerne le domaine technique des sondes pour la détection, le suivi et la quantification dans les systèmes biologiques. Plus particulièrement, l'invention a pour objet de nouvelles particules sondes hybrides dont le cœur est constitué par une nanoparticule d'or sur laquelle sont immobilisées d'une part des molécules sondes et d'autre part des molécules à activité luminescente, ainsi que leur procédé de préparation. L'emploi de sondes associées à un marqueur, dans les systèmes biologiques pour la détection (reconnaissance) ou le suivi de substances spécifiques, appelées cibles, est une technique usuelle dans le domaine du diagnostic médical et de la recherche en biologie. De telles sondes sont particulièrement utilisées pour la cytométrie de flux, l'histologie, les tests immunologiques ou la microscopie de fluorescence aussi bien pour l'étude de matériaux biologiques que de matériaux non biologiques. Des systèmes de marquage usuels sont par exemple des isotopes radioactifs de l'iode, du phosphore et d'autres éléments comme l'enzyme peroxydase ou la phosphatase alcaline dont la détection nécessite un substrat particulier. Dans la plupart des cas, le couplage sélectif entre le marqueur et la substance à détecter est effectué par une seule ou une association de molécules fonctionnelles. La sélectivité de la liaison est essentielle afin d'identifier sans ambiguïté la substance cible à détecter. Les réactions assurant le couplage sont connues et décrites par exemple dans « Bioconjugate Techniques », G. T. Hermanson, Académie Press, 1996 ou dans « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis », Second Edition, W. T. Mason, éd., Académie Press, 1999. Les colorants organiques fluorescents sont très utilisés pour le marquage. Il s'agit de la fluorescéine, du Texas Red ou de Cy5, qui sont sélectivement liés à une substance biologique ou organique déterminée jouant le rôle de sonde. Après excitation- de la sonde marquée, par une source externe, le plus souvent électromagnétique, la présence des substances biologiques ou organiques cibles liées à la sonde est mise en évidence par l'émission de fluorescence de la part de cette dernière. L'abaissement des seuils de détection constitue un objectif majeur qui permettrait de déboucher sur l'amélioration des biopuces (analyse et identification de biomolécules) et sur le développement de sondes plus performantes capables d'assurer la traque individuelle de biomolécules cibles, afin d'étudier leur activité cellulaire, ou capables de mettre en évidence les interactions existant entre des êtres unicellulaires (bactéries, protozoaires..) et des minéraux qui se manifestent par des modifications physico-chimiques locales de l'environnement (variation du pH, de la force ionique, de la concentration en oxygène). La limitation actuelle à l'abaissement des seuils de détection réside dans la difficulté de fonctionnaliser une biomolécule ou un site particulier d'un substrat biologique, constituant la cible à détecter, par plus d'une fonction (le plus souvent une molécule) organique fluorescente. Pour abaisser le seuil de détection, il est proposé dans l'art antérieur de marquer la sonde destinée à se lier avec la cible à détecter, avec des particules intrinsèquement luminescentes. En particulier, des nanoparticules de matériau semiconducteur ont donné lieu à d'intenses recherches. Le brevet US 5,990,479, et les demandes de brevet internationales publiées sous le numéro WO 00/17642 et WO 00/29617 montrent que les nanocristaux semiconducteurs fluorescents, qui appartiennent à la classe des éléments II-NI ou III-N et ceux qui , sous certaines conditions, sont composés des éléments du 4eme groupe principal du tableau périodique, peuvent être utilisés comme marqueur fluorescent pour les systèmes biologiques. En raison du phénomène connu sous le vocable « quantum size effect », la longueur d'onde d'émission d'un nanocristal semiconducteur fluorescent est imposée par sa taille. Ainsi, en faisant varier la taille de ces nanocristaux, une large gamme du spectre peut être couverte, de la lumière visible au proche infra-rouge. Leur utilisation comme marqueur biologique est décrit par Warren C.W. Chan, Shuming Nie, Science, 281, 2016-2018, 1998, et par Marcel Bradiez Jr, Mario Moronne, Peter Gin, Shimon Weiss, A. Paul Alivisatos, Science, 281, 2013-2016, 1998. La préparation de nanocristaux semiconducteurs avec une longueur d'onde d'émission bien définie, c'est-à-dire avec une faible dispersion en taille, exige une très grande précision et nécessite une parfaite maîtrise des^ conditions opératoires et du déroulement de la synthèse. Ils sont, par conséquent, très difficiles à produire. La palette étendue de couleurs qu'offrent ces cristaux semiconducteurs résulte d'une variation de taille de l'ordre de quelques Angstrôm (c'est-à-dire quelques couches atomiques). Les synthèses en solution permettent rarement d'atteindre un tel degré de précision. De plus, la recombinaison de paires électron-trou observée à la surface des nanocristaux limite le rendement quantique à une faible valeur. Pour contourner ce problème, une structure cœur / coquille (« core / shell ») a été proposée : il s'agit d'enrober individuellement les nanocristaux semiconducteurs fluorescents par une couche de matériau semi-conducteur avec un plus large gap (ZnS, CdS). De plus, le marquage sélectif de biomolécules par des nanocristaux semi-conducteurs fluorescents nécessite la formation d'une couche de polysiloxane fonctionnalisé par des groupes aminés (époxy et acide carboxylique). Ces derniers constitueront des points d'ancrage pour les biomolécules. La préparation de ces nanocristaux demande, donc, au moins trois étapes de synthèse dont les deux premières sont très délicates et est donc difficilement industrialisable. Le marquage par des nanoparticules d'oxyde rendues luminescentes grâce au dopage par des ions luminescents (terre rare) n'est pas, malgré des résultats prometteurs, encore très répandu. Son principal inconvénient réside dans le faible rendement quantique qui nécessite l'utilisation d'un laser pour exciter les ions luminescents présents dans la matrice cristalline. D'autre part, les propriétés de luminescence sont très nettement altérées, lorsque ces particules sont utilisées directement en milieu aqueux. Le marquage par des vésicules ou billes polymères, ou de polysiloxanes, remplies de composés organiques luminescents est efficace pour la visualisation en luminescence, mais nécessite souvent des particules assez grandes (plusieurs dizaines de nanomètres) et reste délicat à employer dans certaines applications où une plus grande « molécularité » est recherchée. Différentes stratégies faisant appel à des particules d'or greffées ont déjà été développées. Aucune cependant n'a réussi à augmenter, de façon satisfaisante, la luminescence émise. La plupart des travaux a été focalisée sur le marquage et la détection d'oligonucléotides dont une des extrémités a été modifiée par une fonction thiol. Si le greffage d'un brin d'oligonucléotide constitue une étape commune des différentes stratégies recensées dans l'art antérieur, les moyens mis en œuvre pour la détection sont très variables. En effet, Pileni et al. dans J. Phys. Chem B, 107, 27, 6497-6499, 2003 décrivent l'immobilisation de nanoparticules fonctionnalisées par des brins d'oligonucléotide fhiolés par hybridation avec le brin complémentaire présent sur des îlots nanométriques d'or déposés sur une surface de verre. L'immobilisation (et par conséquent la détection de l'oligonucléotide) est mise en évidence par une augmentation importante de la sensibilité de la spectroscopie en transmission de résonance du plasmon de surface (T-SPR). La détection électrochimique d'oligonucléotides a également été envisagée par Li et al. dans Analyst, 128, 917- 923, 2003 et Hsing et al. dans Langmuir 19, 4338-4343, 2003. L'immobilisation de nanoparticules d'or fonctionnalisées par des brins d'oligonucléotide sur des biopuces (par hybridation) facilite la germination de cristaux d'argent (par réduction des sels de cations argent (I)) induisant une augmentation du courant de détection. Les propriétés optiques de l'or ont également été mises à profit pour le marquage et la détection. Ainsi, Richards-Kortum et al. dans Cancer Research, 63, 1999-2004, 2003, ont montré que des nanoparticules d'or pouvaient être utilisées pour la détection de cellules cancéreuses. En effet, rimmobilisation sur les nanoparticules de biomolécules interagissant sélectivement avec des cellules cancéreuses permet d'obtenir des sondes dont la détection est basée sur la capacité des nanoparticules à réfléchir la lumière incidente émise par le microscope confocal. Les nanoparticules d'or peuvent être utilisées comme agent de contraste optique grâce aux propriétés optiques d'absorption et de réflexion associées aux plasmons de l'or. Une autre approche a été développée par Mirkin et al. dans J. Am. Chem. Soc. 125, 1643-1654, 2003 qui ont montré que l'hybridation de deux brins complémentaires d'oligonucléotide, portés par deux particules d'or distinctes, induisait un rapprochement de ces particules et donc un déplacement de la bande plasmon (résultant des oscillations collectives des électrons de la bande de conduction). Le changement de couleur du colloïde (du rouge au violet) peut alors être mis à profit pour la détection d'oligonucléotides en solution ou sur des biopuces à ADN. Dubertret et al. dans Nature Biotechnology, 19, 365-370, 2001, se sont, quant à eux, appuyés sur l'extinction de fluorescence observée . pour certains colorants organiques adsorbés sur l'or pour préparer des sondes à ADN. Ils ont montré que l'hybridation d'un brin d'oligonucléotide marqué par un fluorophore et immobilisé à la surface de l'or avec un brin libre permettait de restaurer la luminescence du fluorophore, grâce à l'éloignement de celui-ci de la surface d'or, générée par l'hybridation. L'émission d'une lumière de longueur d'onde caractéristique du fluorophore organique indique la présence de l'oligonucléotide libre. Cette technique par extinction de luminescence sert à détecter la présence d'oligonucléotide en solution. L'enrobage du cœur métallique par une couche de type polysiloxane a également été réalisé dans WO 99/01 766. Cependant, le procédé mis en œuvre ne permet pas de maîtriser l'homogénéité de la couche de polysiloxane rendant plus difficile la maîtrise de la surface de la nanoparticule et donc le contrôle du nombre de molécules qui pourront y être greffées. Toutes ces démarches de l'art antérieur sont restrictives, car elles ne peuvent s'appliquer que dans certaines conditions. La détection électrochimique ne permet pas de suivre le devenir d'une biomolécule in vivo. La technique de Mirkin et al. est limitée à la détection d'acides nucléiques. Par ailleurs, le déplacement de la bande plasmon peut être provoqué par d'autres facteurs (augmentation de la concentration en sel, température, vieillissement). Dans ce contexte, l'un des problèmes que se propose de résoudre l'invention est de fournir de nouvelles sondes biologiques de taille nanométrique permettant la détection, le marquage et la quantification, in vitro et in vivo, dans des systèmes biologiques, avec sensibilité et reproductibilité. Un autre problème, que se propose de résoudre l'invention, est de fournir de nouvelles sondes biologiques facilement détectables, de part leur émission de fluorescence ou de luminescence exacerbée après excitation. L'invention vise également à fournir de nouvelles sondes biologiques polyfonctionnelles de taille et de composition contrôlées, produites selon un procédé simple, facilement industrialisable. Pour atteindre ces objectifs, l'invention propose des nouvelles particules sondes hybrides comprenant une nanoparticule d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm à la surface de laquelle sont greffées par des liaisons or- soufre d'une part, au moins une, et de préférence de 1 à 100, molécules organiques sondes et d'autre part, au moins 10, et de préférence 10 à 10000 molécules organiques à activité luminescente. L'invention propose également un nouveau type de sonde où la luminescence exacerbée est couplée à un cœur métallique nanométrique dense, permettant ainsi un autre système d'investigation comme la microscopie électronique à transmission et/ou basée sur les propriétés de réflexion, d'absorption et/ou de diffusion associées aux plasmons. L'invention a également pour objet différents procédés de préparation des particules sondes hybrides telles que définies ci-dessus. La description ci-après, en référence aux figures annexées, permet de mieux comprendre l'objet de l'invention. La Fig. 1 met en évidence la persistance de la luminescence des dérivés de lissamine rhodamine B après greffage sur des nanoparticules d'or. La Fig. 2 représente les spectres d'absorption d'une solution colloïdale de nanoparticules d'oxyde de gadolinium seules ou associées avec des nanoparticules d'or. La Fig. 3 est une illustration schématique du principe de la biopuce utilisée. La Fig. 4 montre l'influence de la dilution (Laser Argon, λexc = 480 nm, P = 600 μW) lors de l'immobilisation par hybridation sur une biopuce de nanoparticules d'or fonctionnalisées par 5 molécules à activité luminescente (dérivé thiolé de la lissamine rhodamine B) et par un oligonucléotide. La Fig. 5 représente la fluorescence observée après immobilisation sur des billes de Sépharose par hybridation de nanoparticules d'or comportant un oligonucléotide et un nombre variable de molécules à activité luminescente (lissamine rhodamine B thiolée : rhoda-SH). La Fig. 6 représente la quantification du signal de fluorescence observé sur la
Fig. 5. La Fig. 7 compare l'intensité lumineuse obtenue après marquage d'oligonucléotide par une seule molécule à activité luminescente (dérivé de la lissamine rhodamine B) et par une nanoparticule d'or comportant 100 molécules à activité luminescente (lissamine rhodamine B thiolée). En préalable, les définitions de certains termes utilisés dans la présente demande de brevet sont données ci-après. Les termes « molécule à activité luminescente », « fluorophore », « colorant », « molécule fluorescente » seront indifféremment utilisés pour désigner des entités qu'il est possible de détecter grâce à leur activité d'émission optique dans le visible et le proche infrarouge. Par molécule « organique », on entend la définition classique bien connue de l'homme du métier, à savoir une molécule carbonée contenant éventuellement un ou plusieurs éléments choisis parmi : O, N, P, S et halogène. Les composés à base de silicium et/ou de métaux ne font, bien entendu, pas partie des molécules organiques. Par molécule sonde, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique, au niveau du squelette. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un
ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires, les enzymes les récepteurs, les complexes enzyme/substrat, les glycoprotéines, les anticorps, les antigènes. Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Par nanoparticule, on entend une particule de taille nanométrique Ces nanoparticules peuvent être de n'importe quelle forme. Les particules de forme sphérique sont, néanmoins, préférées. Le cœur des particules hybrides sondes selon l'invention est constitué par une nanopaticule d'or, préférentiellement de diamètre moyen compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, de préférence dans la gamme allant de 4 à 20 nm et préférentiellement dans la gamme allant de 5 à 16 nm. La taille moyenne étant déduite ici par spectroscopie de corrélation de photon (diffusion quasi-élastique de la lumière, λ = 633 nm) et par analyse de clichés réalisés en microscopie électronique à transmission (MET). L'utilisation d'or est particulièrement avantageuse pour les raisons suivantes : - l'or est compatible avec les organismes vivants et possède un seuil de tolérance assez élevé, - l'or est un métal très difficilement oxydable, ce qui permet d'obtenir des nanoparticules présentant une grande stabilité (notamment la conservation de son état d'oxydation zéro et du comportement métallique), - la synthèse de nanoparticules d'or est aisée, - l'or est non-paramagnétique, - l'or présente une affinité particulière pour le soufre, ce qui rend possible le greffage de dérivés thiolés, la liaison or-soufre étant connue pour être particulièrement forte, - l'or est visible en imagerie MET, - l'or présente une absorption en plasmon de surface, ce qui permet d'obtenir des informations sur la nanoparticule, notamment sur sa taille. Ces nanoparticules d'or sont polyfonctionnalisées par greffage de différents dérivés thiolés qui apportent : - la reconnaissance biologique donnée par greffage d'au moins une, de préférence de une à 100 et préférentiellement de 1 à 10, molécules organiques sondes, - la luminescence en milieu biologique donnée par greffage d'au moins 10, de préférence de 10 à 10000, préférentiellement 10 à 1000, molécules organiques à activité luminescente, avantageusement 100 à 500, - la solubilité adaptée en fonction du milieu de travail, - la redispersion, - la non agrégation. La fonctionnalisation est aisée, les différentes molécules greffées étant liées de façon quasi covalente à la nanoparticule d'or par des liaisons or-soufre. Dans le cadre de l'invention, les différentes molécules (molécules sondes, molécules à activité luminescente, ou autres molécules organiques) sont liées, soit directement à la nanoparticule par une liaison Au-S, soit par l'intermédiaire d'une molécule organique jouant le rôle d'espaceur, liée à la nanoparticule pour une liaison Au-S. Si, actuellement, la nature de la liaison Au-S demeure indéterminée, il est néanmoins reconnu que les groupes thiolates sont fortement liés à la surface de l'or. D'après Dubois, et Nuzzo dans Ann. Phys. Chem. 43, 437-, 1992 et Ulman A. dans Chemical Reviews 96, 1533-1554, 1996, l'énergie de liaison est de 40 kcal.mol"1 (contre 87kcal.mol"1 pour la liaison S-H) et le bilan énergétique de l'adsorption d'un alcanethiolate sur l'or est négatif ( — Skcal.mol"1, réaction exothermique). L'interaction Au-S s 'établissant après greffage de dérivés thiolés est si forte que ces derniers ne peuvent pas être expulsés de la surface par des lavages successifs. L'utilisation de dérivés thiolés apparaît donc particulièrement appropriée pour immobiliser des molécules de colorants et des biomolécules à la surface de nanoparticules d'or. Un grand nombre de molécules organiques à activité luminescente est greffé en surface des nanoparticules d'or. De façon avantageuse, le nombre de molécules à activité luminescente greffées en surface de la nanoparticule d'or est au moins 10 fois plus important que le nombre de molécules organiques sondes greffées. De plus, au sens de l'invention, les molécules organiques à activité luminescente, également nommées colorants, sont fixées sur l'or soit directement (dans ce cas les colorants sont thiolés) soit indirectement par l'intermédiaire d'un espaceur organique court (l'espaceur étant, de préférence, une molécule thiolée comportant entre 2 et 50 atomes de carbone). Les colorants ne sont donc pas liés à un oligonucléotide ou à un fragment d'ADN, comme décrit dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 03/027678. Selon l'invention, les colorants sont liés de façon quasi covalente sur la nanoparticule d'or par liaison or - soufre. Par cette méthode, la fluorescence des colorants est préservée après greffage et n'est pas réduite par la présence de l'or qui absorbe fortement vers 520 nm, ce qui n'était pas le cas des composés précédemment choisis et adsorbés directement sur l'or. De plus, la fonction luminescente est assurée par un grand nombre de molécules organiques à activité luminescente greffées sur la nanoparticule d'or, conduisant à une émission forte en fluorescence après excitation, ce qui permet d'obtenir une luminescence finale globale par objet largement exaltée. Les nanoparticules hybrides selon l'invention deviennent alors visualisables à la fois en microscopie confocale en raison de l'absorption ou de la réflectivité (agent de contraste optique) et en microscopie électronique (agent de contraste électronique). En effet, tout d'abord, la biomolécule cible est plus facilement repérée car, au lieu d'être marquée par un seul fluorophore, elle est "marquée" par plusieurs dizaines de molécules luminescentes. Une biopuce composée de billes de Sepharose porteuses d'oligonucléotide (d(A)22), immobilisée à la surface d'un élastomère (Fig. 3) est utilisée, pour mettre en évidence l'amplification obtenue grâce à l'utilisation de nanoparticules sondes hybrides selon l'invention porteuses de dérivés de lissamine rhodamine B et d'oligonucléotides. Les brins complémentaires à ceux immobilisés à la surface de la biopuce sont marqués, soit par une molécule unique de fluorophore (Lissamine rhodamine B) (Fig. 3A), soit par une nanoparticule hybride selon l'invention porteuse d'une multitude (2-200) de molécule de lissamine rhodamine B thiolée (Fig. 3B et Fig. 4). Les Fig. 5 et 6 mettent clairement en évidence l'augmentation de la fluorescence avec le nombre de molécules organiques fluorescentes (lissamine rhodamine B fonctionnalisée par une fonction thiol). Cependant, au delà de 400 molécules fluorescentes, l'intensité n'augmente plus et conserve la valeur mesurée pour des nanoparticules d'or sur lesquelles sont immobilisées 400 molécules organiques fluorescentes. Ces résultats ont été obtenus sur des nanoparticules d'or de diamètre 12 nm. Comme présenté sur la Fig. 3, suite à la réaction d'hybridation entre brins complémentaires, pour un même nombre de brins marqués ayant réagi avec les brins immobilisés, c'est à dire un même nombre de molécules cibles dans l'échantillon, une intensité de fluorescence supérieure est attendue. Ceci est illustré sur la Fig. 7 présentant la variation d'intensité de fluorescence obtenue en fonction de la quantité de brins présents dans l'échantillon, marqués soit par une molécule de lissamine rhodamine B, soit par une particule sonde hybride selon l'invention. Dans ce cas précis, plusieurs brins peuvent être présents à la surface de la nanoparticule, mais il est admis qu'un seul de ces brins aura la possibilité de réagir avec un brin immobilisé. La courbe présentée sur la Fig. 7, tient compte de ces paramètres et suppose qu'une centaine de brins est présente à la surface de la nanoparticule, un seul réagissant avec le brin immobilisé. Comme on peut l'observer, une augmentation du signal d'un facteur dix peut être obtenue entre les molécules marquées par un fluorophore (carré blanc) et celles marquées par une particule hybride sonde selon l'invention portant une centaine de fluorophores (carré noir). Malgré l'absorption partielle du signal lumineux émis par le colorant organique due au colloïde d'or, une augmentation d'intensité d'un facteur 10 est observée. Selon une première variante avantageuse de l'invention, les colorants greffés émettent à une longueur d'onde située en dehors du maximum d'absorption du plasmon de l'or (à 540 nm). De façon avantageuse, les molécules à activité luminescente sont des colorants organiques fluorescents dont le maximum d'émission s'écarte d'au moins 25 nm du maximum d'absorption du plasmon de l'or. Des composés électroluminescents ou chimiluminescents, par exemple des dérivés du luminol pourront être utilisés. Des composés luminescents, dits à deux photons ou à émission anti-stokes, dont la longueur d'onde de la lumière émise est supérieure à la longueur d'onde d'excitation, de préférence d'au moins 200 nm pourront également être greffés. Les complexes de lanthanides, les dérivés de la rhodamine et plus particulièrement ceux de la lissamine rhodamine B sont des colorants particulièrement préférés. Comme le montre la Fig. 1, le greffage de lissamine rhodamine B et de ses dérivés sur des nanoparticules d'or n'entraîne qu'une diminution d'un facteur 3 de l'intensité de luminescence obtenue, comparée à la même quantité de colorants libres (molécules individualisées). En augmentant le nombre de molécules de lissamine rhodamine B greffées, la luminescence par molécule biologique à détecter est encore augmentée. Selon une autre variante avantageuse de réalisation de l'invention, les transferts non radiatifs entre les colorants organiques et l'or sont limités, de façon à obtenir des nanoparticules à extinction de luminescence réduite. Pour cela, on peut, par exemple, recouvrir au plus 75 % de la nanoparticule d'or d'un matériau de couverture présentant des caractéristiques diélectriques permettant le décalage de la bande plasmon de l'or en dehors de la zone d'émission des molécules à activité luminescente. Ce matériau de couverture est, par exemple, choisi parmi les polysiloxanes, SiO2, ZrO2,Ln2O3 et les oxohydroxydes de lanthanide. La couverture doit être partielle, de manière à laisser sur la nanoparticule d'or une surface libre suffisamment importante pour le greffage des molécules luminescentes et biologiques. En effet, le greffage des molécules organiques sondes et des molécules luminescentes se fait directement sur la particule d'or et nullement sur le matériau de couverture. La fig. 2 montre, à titre illustratif, comment le greffage par un oxyde de gadolinium permet d'éliminer l'absorption du plasmon de surface dans le domaine visible. Une autre façon d'obtenir des nanoparticules à extinction de luminescence réduite est de greffer les molécules à activité luminescente par l'intermédiaire d'un espaceur organique thiolé. L'utilisation de colorants organiques préalablement greffés sur des « espaceurs rigides » (molécules thiolees organiques comportant par exemple un cycle benzénique) permet de maintenir le centre luminescent à une distance moyenne de la surface supérieure à 0,5 nm. Ces espaceurs contiennent, de préférence, au moins 6 carbones et moins de 50, et sont par exemple choisis parmi les mercaptophénols, l'acide dihydrolipoïque et les thio-poly(éfhylèneglycol). Par ailleurs, les nanoparticules sondes hybrides selon l'invention sont relativement photostables. Les sondes selon l'invention sont parfaitement adaptées à une grande diversité de ciblage biologique, les spécificités étant dépendantes de la nature des molécules sondes greffées à la surface de la nanoparticule d'or. Les molécules sondes biologiques sont avantageusement choisies parmi les polynucléotides de type ADN, ARN ou oligonucléotides, les protéines de type anticorps, récepteur, enzyme, complexe enzyme/substrat, glycoprotéines, les polypeptides, les glycolipides, les oses, les polyosides et les vitamines. Les oligonucléotides thiolés ou liés à un espaceur thiolé sont particulièrement préférés. Les molécules organiques sondes peuvent également être tout type de molécules permettant l'interaction biotine-streptavidine. Il est également possible de greffer sur la nanoparticule d'or d'autres molécules organiques thiolees, distinctes des molécules organiques sondes et des molécules à activité luminescente. Ces molécules organiques thiolees comportent, de préférence, au moins une fonction alcool, aminé, sulfonate, acide carboxylique ou phosphate. On pourra choisir de greffer 1 à 1000, de préférence, 10 à 1000, de ces molécules organiques autres. Les fonctions apportées par ces autres molécules sont par exemple une meilleure stabilité, une solubilité adaptée en fonction du milieu de travail, une redispersion aisée, une non agrégation, une meilleure sélectivité. L'invention combine donc astucieusement nanoparticules d'or, molécules sondes biologiques et molécules à activité luminescente, de manière à ce que la luminescence ne soit pas « détruite » par l'absorption de l'or, mais au contraire globalement augmentée par rapport à une molécule isolée (effet de nombre des composés greffés) et que les molécules sondes conservent leur efficacité vis-à-vis des cibles biologiques. Les nanoparticules hybrides d'or selon l'invention sont facilement synthétisées par la méthode de Frens (voie citrate) dont il existe de nombreuses variantes (citrate/acide tarmique) ou par celle de Brust appelée voie NaBH4. Pour la voie citrate, on pourra par exemple se référer à Nature Physical Science 241, 20-22, 1973. Dans ce cas, la réduction de tétrachloroaurate d'hydrogène par le citrate en phase aqueuse fournit des nanoparticules d'or recouvertes de citrate. Ce dernier joue un double rôle : il permet le contrôle de la croissance des nanoparticules et empêche la formation d'agrégats. L'association citrate/acide tarmique fournit également des nanoparticules recouvertes de citrate dont les dimensions sont plus petites. Le greffage de molécules thiolees sur les nanoparticules d'or procède par remplacement progressif des molécules de citrate grâce à une addition par portion de la solution de molécules thiolees. Cette étape est délicate car un remplacement trop brutal induit la précipitation des nanoparticules. L'immobilisation de différentes molécules thiolees s'effectue en autant d'étapes (une étape = ajout complet d'une solution d'espèces thiolees) qu'il y a de molécules différentes. Pour la voie NaBH , on pourra notamment se référer à J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1655-1656, 1995. La voie NaBH consiste essentiellement à faire réagir, en milieu aqueux et en présence de borohydrure de sodium, du tétrachloroaurate d'hydrogène avec les dérivés thiolés que l'on souhaite greffer. Les dérivés thiolés greffés sont préparés selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art. Par dérivés thiolés, on entend une molécule organique comportant au moins une fonction thiol-SH. Ces fonctions thiols peuvent être obtenues à partir de sulfures de dialkyl ou disulfures de dialkyle. Ces différentes voies sont bien connues de l'homme du métier qui pourra y apporter de nombreuses variantes. A titre non limitatif, une description de différentes variantes avantageuses du procédé est donnée ci-après. Selon une première variante, le procédé de préparation de particules sondes hybrides selon l'invention comprend les étapes suivantes : - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction d'un sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de citrate, - ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes thiolees venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate, - ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules à activité luminescente venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate. Dans le cas des voies citrate et citrate / acide tarmique, la préparation des particules sondes hybrides comporte au moins trois étapes. De façon avantageuse, la première consiste à préparer en phase aqueuse des particules d'or de dimension nanométrique comprise, généralement, entre 10 et 20 nm selon la voie citrate et entre 6 et 15 nm selon la voie citrate / acide tarmique, et ce, avantageusement, par réduction de HAuCl .3H2O par le citrate (voie citrate) dans un rapport Au/Citrate compris entre 0,170 et 0,255 et par le couple citrate / acide tarmique (voie citrate / acide tarmique) dans des rapports Au citrate et acide tannique/citrate compris entre 0,170 et 0,255 et entre 0,030 et 10, respectivement. Les nanoparticules d'or sont alors recouvertes par des molécules de citrate adsorbées sur leur surface. Les colloïdes peuvent éventuellement être purifiés par dialyse contre l'eau. Dans le cas des voies citrate et citrate / acide tarmique, la fonctionnalisation des nanoparticules est réalisée en plusieurs étapes. Chaque étape correspond au greffage d'une seule sorte de molécules. Le greffage s'opère par remplacement du citrate présent à la surface des nanoparticules et nécessite donc une addition lente de la solution contenant les molécules à greffer comportant une fonction thiol. La quantité de molécules greffées sur les nanoparticules d'or est avantageusement comprise entre 0,1 et 60 % des sites libres. Le greffage de molécules à activité biologique, par exemple oligonucléotides thiolees, acide folique modifié par une fonction thiol ou greffé sur du poly(éthylène glycol) (PEG) thiolé, est réalisé, de préférence, par addition de 1 à 500 μl d'une solution aqueuse de concentration comprise entre 0,1 μM et 40 μM. La quantité de molécules sondes greffée à la surface des nanoparticules d'or est avantageusement comprise entre 1 et 200 molécules sondes par particule. La deuxième étape consiste à greffer le colorant organique portant une ou plusieurs fonctions thiols par addition, de préférence, de 3 à 200 μl d'une solution aqueuse (ou éthanolique) du colorant thiolé de concentration comprise entre 0,1 et 400 μM. Le nombre de colorants thiolés greffés est avantageusement compris entre 10 et 400 par particules, pour des particules de diamètre 12 nm notamment. On peut indifféremment effectuer le greffage des sondes biologiques avant ou après celui des colorants. Eventuellement peuvent être successivement ajoutées avant, entre ou après les deux étapes précédentes et dans un ordre indifférent les solutions de différentes espèces thiolees comme le mercaptoéthanesulfonate de sodium, l'acide succinique, le PEG terminé par une fonction thiol. Lorsque la fonctionnalisation est complète, les nanoparticules d'or hybrides sont purifiées par chromatographie sur colonne (Sephadex™ G-25 M, éluant : solution tampon de pH compris entre 7 et 9). Selon une autre variante de la voie citrate ou citrate/acide tarmique, le procédé comprend les étapes suivantes : - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d' espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, et/ou ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or. Au lieu de greffer directement une molécule organique thiolée à activité luminescente ou biologique à la surface d'une nanoparticule d'or, cette autre variante consiste à réaliser le greffage par condensation entre deux fonctions réactives complémentaires présentes pour l'une dans la molécule active à greffer (colorant, sonde ...) et pour l'autre à l'extrémité d'une molécule thiolée immobilisée à la surface de l'or et jouant le rôle d'espaceur. Le greffage d'une molécule organique à activité luminescente ou biologique nécessite la présence d'une fonction thiol pour lui assurer une immobilisation durable sur la particule d'or. La plupart de ces molécules en sont dépourvues. La fonction thiol peut être introduite par synthèse organique avant greffage (cas du protocole citrate). Une autre façon de procéder consiste à greffer la molécule active dépourvue de fonction thiol sur un espaceur thiolé présente à la surface de la nanoparticule d'or. Par rapport au protocole précédent l'étape de greffage de molécules actives thiolees est remplacée par deux étapes. La première consiste à immobiliser l'espaceur thiolé servant de point d'ancrage (bras espaceur) à la molécule à activité luminescente ou biologique. Avantageusement, de 1 à 500 μl d'une solution aqueuse de l'espaceur de concentration comprise entre 0,1 et 400 μM est alors ajoutée au colloïde de nanoparticules d'or. Le nombre de molécules thiolees immobilisées est avantageusement compris entre 0,1% et 50 % de sites libres. Ensuite, une solution aqueuse de la molécule active à greffer est ajoutée lentement. Cette solution peut éventuellement contenir un réactif facilitant le couplage. L'élimination des produits secondaires est réalisée par dialyse de la solution colloïdale contre l'eau. L'espaceur utilisé comme site de greffage doit nécessairement comporter une fonction thiol (indispensable pour l'immobilisation sur l'or) et au moins une fonction réactive (-OH, -NH2, -COCl...) pour assurer le greffage ultérieur de la molécule active. Afin d'obtenir les meilleurs résultats en luniinescence, la chaîne carbonée entre la fonction thiol et la fonction réactive doit être rigide et comporte de préférence de 6 à 50 atomes de carbone. La molécule organique à activité luminescente ou biologique doit nécessairement comporter une fonction réactive (-SO2Cl, -COCl, -OH, -NH2) capable de réagir avec celle portée par le bras espaceur immobilisé à la surface des nanoparticules d'or. On pourra notamment se référer à Chem. Eur. J, 8, 16, 3808-3814, 2002 et Chem. Commun. 1913-1914, 2000. Quel que soit le protocole utilisé (molécule active thiolée ou espaceur thiolé), le nombre de molécules à activité luminescente immobilisées à la surface des nanoparticules est déterminé par spectroscopie UN-visible de la solution après précipitation des nanoparticules. La différence entre le nombre de molécules ajoutées au colloïde et le nombre de molécules présentes dans le surnageant (après filtration du précipité) indique le nombre de molécules immobilisées à la surface des nanoparticules d'or. Selon une autre variante mettant en œuvre la voie ΝaBH4, le procédé comprend les étapes suivantes : - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de NaBH , - ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d'espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre, - ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or. Dans le cas de la voie NaBHi, les molécules thiolees présentes à la surface des nanoparticules d'or ont en général été introduites lors de la synthèse. Certaines peuvent être substituées mais avec un contrôle incertain du nombre de molécules remplacées. L'immobilisation de molécules à activité biologique et de colorants organiques s'effectuera dans la plupart des cas (pour une meilleure efficacité) par greffage sur des espaceurs thiolés présents à la surface des nanoparticules d'or. La synthèse par la voie NaBPLt de nanoparticules hybrides pour le marquage biologique nécessite également plusieurs étapes. La première consiste à préparer dans un alcool, de préférence, le méthanol, l'éthanol ou le diméthylformamide, les nanoparticules d'or recouvertes de molécules thiolees possédant une fonction ionisable en une seule étape par réduction de HAuCl .3H2O par une solution aqueuse de NaBH
(Au/NaBH compris, par exemple, entre 0,05 et 0,5) en présence des molécules organiques thiolees possédant une fonction ionisable dont le rapport Au/S est, avantageusement, compris entre 0,2 et 10. Par cette méthode, la couverture des nanoparticules d'or est quasi totale. Comme le remplacement des molécules thiolees à la surface des nanoparticules d'or est difficile et comme la surface est complètement recouverte, le choix des molécules thiolees est déterminant. Ces molécules doivent permettre à la fois une excellente redispersion des nanoparticules dans une solution aqueuse afin d'obtenir un colloïde stable et le greffage de molécules sondes et de colorants organiques. Des espaceurs thiolees possédant également une fonction ionisable (-NH2, -COOH) apparaissent appropriées pour préparer des nanoparticules hybrides d'or redispersables et stables (sous certaines conditions de pH) en solution aqueuse. De plus, ces fonctions ionisables peuvent servir à immobiliser des molécules sondes et des colorants organiques par de simples réactions de condensation (formation d'ester, d'amide, de dérivés de l'urée ou de la thiourée...). Après réduction et donc formation des nanoparticules d'or, un précipité apparaît. Au maximum 2/3 du solvant (méthanol ou éthanol) sont alors évaporés sous pression réduite à une température inférieure à 40°C. Le précipité est filtré sur membrane polymère (avec, par exemple, un diamètre de pores égal à 0,22 μm) et lavé méticuleusement avec différents solvants (choisis selon la nature du thiol immobilisé à la surface). Ce lavage vise à éliminer les co-produits de la réduction et la grande quantité de thiols non adsorbés. La poudre obtenue est, après séchage à l'air, redispersée en phase aqueuse dans une gamme de pH contrôlée (qui dépend de la nature du groupement ionisable présent dans la molécule thiolée). Le colorant organique est ensuite greffé sur la nanoparticule par réaction entre une fonction réactive, du type -NH2, -COOH, - SO2Cl, -N=C=O, -N=C=S notamment, présente sur le colorant et la fonction ionisable de l'espaceur thiolé greffé sur les nanoparticules d'or. Cette réaction est réalisée en additionnant à la solution colloïdale une solution aqueuse ou aquo- alcoolique de colorant organique dont la quantité est au moins quatre fois supérieure au nombre de molécules thiolees adsorbées sur les nanoparticules d'or. Entre 0,5 et 10 % des fonctions ionisables des molécules thiolees adorbées sur l'or réagissent en général. Les produits secondaires en excès sont alors éliminés par précipitation des nanoparticules obtenue par une forte variation du pH (ΔpH > 2). Le précipité est filtré sur membrane (diamètre des pores égal à 0,22 μm par exemple) et lavé méticuleusement avant d'être redispersé en solution aqueuse dans une gamme de pH contrôlée. Les molécules sondes sont greffées sur une partie des 85 à 90 % des fonctions ionisables restantes après le greffage du colorant organique. Le couplage est effectué par addition d'une solution aqueuse de molécules sondes dont la quantité est au moins supérieure au nombre de molécules thiolees adsorbées sur les nanoparticules d'or. Entre 0,1 et 2 % des fonctions ionisables des molécules thiolees greffées sur l'or réagissent. Afin d'éviter la dénaruration par la répétition des étapes de séparation, lavage et redispersion, le greffage des molécules sondes est, avantageusement, réalisé après celui des colorants organiques. Les produits secondaires en excès sont éliminés comme précédemment. La caractérisation des nanoparticules est réalisée à l'état solide par XPS,
XANES, ATG et à l'état liquide par spectroscopie UN-visible et XAΝES. Une autre variante du procédé consiste à immobiliser les molécules sondes par échange de molécules sondes thiolés avec d'autres molécules thiolees déjà greffées à la surface des nanoparticules d'or. Afin d'éviter l'échange préjudiciable avec une partie des molécules thiolees couplées à des colorants, il est indispensable dans ce cas de réaliser rimmobilisation des molécules à activité biologique avant celle des colorants organiques. Cependant, ces réactions d'échange sont relativement aléatoires et difficiles à maîtriser. Il faut noter que dans la voie ΝaBHU, la couverture des nanoparticules d'or par les molécules thiolees est quasiment complète. L'introduction de nouvelles molécules thiolees s'effectue par conséquent uniquement par échange. Il est important de noter que pour les nanoparticules sondes hybrides préparées en présence de citrate, il n'y a pas d'échange significatif de thiols : les nanohybrides sont donc stables dans ces cas et les propriétés conservées. La voie proposée permet donc de déterminer le « revêtement » de la nanoparticule d'or, et donc les caractéristiques de la particule sonde obtenue. Selon l'invention, il est possible de greffer, à la surface des nanoparticules d'or, des quantités variables mais déterminées de molécules fluorescentes et de sondes biologiques. Le nombre de molécules à la surface des nanoparticules peut être aisément déterminé par spectroscopie UN après précipitation des particules d'or, permettant ainsi de connaître la composition chimique de la surface. Les nouvelles particules sondes selon l'invention présentent un intérêt tout particulier, notamment, dans l'amélioration des biopuces, l'étude de l'interaction entre des microorganismes et leur environnement, la traque individuelle de biomolécules pour l'étude du trafic cellulaire et de l'activité cellulaire. Les exemples ci-après sont donnés à titre purement illustratif et n'ont pas de caractère limitatif.
Exemple 1
Préparation d'une suspension colloïdale de nanoparticules d'or par la méthode citrate / acide tannique.
40 mg de citrate de sodium et 10 mg d'acide tannique sont dissous dans 20 ml d'eau ultra pure. Parallèlement, 10 mg de tétrachloroaurate d'hydrogène, trihydrate HAuCl4.3H2O sont dissous dans 80 ml d'eau ultra pure. Les deux solutions sont ensuite chauffées à 60°C puis réunies par transvasement de la solution citrate de sodium/acide tannique dans la solution d'or. Le mélange est alors chauffé à 60°C à reflux pendant 1 heure puis porté à ébullition pendant 10 minutes et enfin refroidi à température ambiante en maintenant l'agitation. Les nanoparticules obtenues ont un diamètre moyen de 8 nm, ce qui renvoie à une concentration de 1,67.10" moles de nanoparticules /litre.
Exemple 2
Préparation de nanoparticules d'or stabilisées et prêtes à être fonctionnalisées par greffage de dérivés thiolés.
La surface des nanoparticules synthétisées selon l'exemple 1 est recouverte par des dérivés thiolés dans des proportions précises. Les dérivés thiolés utilisés sont le mercaptoéthanesulfonate de sodium (MES), l'acide thiomaléique (AT) et le mercaptophénol (MP). A une solution de 60 ml de nanoparticules sont ajoutés 2 ml de solutions aqueuses de chaque dérivé thiolé dont les concentrations sont les suivantes : AT : 1,112.10"7 M obtenu par dissolution de 16,69 mg dans 100 ml d'eau deionisée, MES : 1,112.10"7 M obtenu par dissolution de 18,26 mg dans 100 ml d'eau deionisée, MP : 2,224.10"7 M obtenu par dissolution de 28,50 mg dans 100 ml d'eau deionisée. Les ajouts sont faits successivement toutes les 30 minutes, la solution est maintenue sous agitation constante.
Exemple 3 Préparation d'une suspension colloïdale de nanoparticules d'or luminescentes par la méthode citrate / acide tannique dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 2.
Sur les fonctions hydroxyles des mercaptophénols greffés à la surface des nanoparticules d'or sont immobilisées des molécules fluorescentes de rhodamine lissamine B. Sur 30 ml de solution préparée selon l'exemple 2 est ajouté 1 ml d'une solution aqueuse de sulfochlorure de lissamine rhodamine B de concentration 10"7 M en présence de 10 ml de triéthylamine concentrée. On obtient ainsi des nanoparticules d'or portant en moyenne 200 molécules de lissamine rhodamine B.
Exemple 4
Synthèse d'un dérivé thiolé de la rhodamine lissamine B.
Ce dérivé est obtenu par réaction de la fonction aminé de l'aminothiophénol sur la fonction sulfochlorure de la rhodamine lissamine B. La réaction se déroule à température ambiante par dissolution dans 100 ml de chloroforme de 125 mg de sulfochlorure lissamine rhodamine B et 26,9 mg d'aminothiophénol en présence d'1 ml de triéthylamine. La solution est agitée durant un jour puis purifiée par colonne chromatographique de silice avec un éluant dichlorométhane/méthanol, 9 /1 (v/v).
Exemple 5 Greffage de dérivés thiolés de la lissamine rhodamine B préparés selon l'exemple 4 sur la surface de nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 1.
La préparation est réalisée par ajout de solutions de lissamine rhodamine B thiolée à la solution de nanoparticules d'or sous agitation mécanique. Cet ajout est de quantité et de concentration variables selon le nombre de molécules fluorescentes désirées par nanoparticule ; ce nombre peut varier de 1 à 400 pour des nanoparticules de 12 nm de diamètre. Pour exemple, pour un rapport désiré de 100 molécules de lissamine rhodamine B par nanoparticule, l'ajout sera de 1 ml d'une solution aqueuse à 1,67.10"5 M de lissamine rhodamine B thiolée sur 10 ml d'une solution à 1,67.10"8 M de nanoparticules d'or.
Exemple 6
Greffage d'un dérivé de l'acide folique à terminaison soufrée. Un dérivé soufré de l'acide folique est obtenu par greffage d'un bt-?-aminopropylpolyéthylèneglycol puis modification par le réactif de Traut afin d'obtenir une fonction thiol. Ce dérivé est greffé à la surface de nanoparticules d'or par ajout à une solution de nanoparticules préparée selon l'exemple 1.
Exemple 7
Greffage d'oligonucléotides sur les nanoparticules d'or Les oligonucléotides d(T)22 terminés par une fonction thiol utilisés sont préalablement filtrés sur colonne, 69 nanomoles d'oligonucléotides diluées dans 2,33 ml d'eau, soit une concentration de 29,6.10"6 M, sont récupérées. De 3,35 μl à 335,1 μl (de 0,2 à 20 oligonucléotides par nanoparticule) de cette solution sont ensuite ajoutés à 1 ml de nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 1, 3 ou 5.
Exemple 8
Greffage de dérivés thiolés de la lissamine rhodamine B préparés selon l'exemple 4 sur la surface de nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 7. Sur les nanoparticules préparées selon l'exemple 7, on greffe des dérivés de lissamine rhodamine B thiolés préparés selon l'exemple 4 dans un rapport 100 pour une nanoparticule d'or. Ce greffage se fait comme décrit précédemment dans l'exemple 5. Exemple 9
Synthèse de particules d'or partiellement entourées de particules d'oxyde de gadolinium pour décalage de l'absorption en dehors de la zone d'émission des molécules à activité luminescente greffées.
Le colloïde de nanoparticules de Gd2O3 5% Tb a été préparé selon la méthode polyol (R. Bazzi, M.A. Flores-Gonzalez, C. Louis, K. Lebbou, C. Dujardin, A.
Brenier, W. Zhang, O. Tillement, E. Bernstein and P. Perriat dans Journal of
Luminescence 102-103, 445-450, 2003). Elle consiste à précipiter directement des nanoparticules d'oxydes luminescents à partir de sels métalliques dissous dans du diéthylène glycol. Après synthèse, le colloïde obtenu est dialyse à 40°C dans du diéthylène glycol (1 :20 en volume).
Ensuite, HAuCl , 3H O est dissous dans le colloïde (1:3 en masse de sels initiaux).
La solution est agitée pendant 15 minutes, pour devenir jaune. Deux solutions aqueuses contenant pour la première 1 g.l"1 de citrate de sodium et 1,5 g.l"1 d'acide tannique et pour la seconde 0,5 g.l'1 de NaBË t sont préparées afin de réduire le sel d'or.
La première solution est ajoutée au colloïde, sous agitation. Au bout de cinq minutes, la deuxième solution est ajoutée (1 :1 :1 en volume). L'ajout se fait lentement au goutte à goutte. Le colloïde, au cours des différents ajouts, perd sa couleur jaune pour passer par une phase transparente, puis par une phase rouge intense, qui apparaît progressivement, preuve directe de la présence de nanoparticules d'or. Sous certaines conditions, la luminescence peut être grandement exacerbée (d'au moins un facteur
10).
Exemple 10
Synthèse de nanoparticules d'or stabilisées par des molécules thiolees portant à leur extrémité une fonction acide carboxylique.
A 60 ml de méthanol contenant 49.10"5 mol d'acide tétrachloroaurique (HAuCl4, 3H20) sont ajoutés 38 ml de méthanol contenant de 49 à 196.10"5 mol d'acide carboxylique portant une ou deux fonctions thiols et 1,96 ml d'acide éthanoïque.
Après 5 minutes d'agitation, 13,2 ml d'une solution aqueuse contenant 480.10"5 mol de tétrahydruroborate de sodium (NaBH4) sont ajoutés goutte à goutte au mélange qui noircit.
Après 1 heure d'agitation, 4 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique (HCl, 1 N) sont ajoutés au mélange réactionnel. La suspension noire obtenue est concentrée par évaporation partielle du méthanol sous pression réduite. Le solide noir est filtré, lavé par 3x30 ml d'HCl 0,1 N, 2x20 ml d'eau et 3x30 ml d'éther de diéthyle. Le mélange réactionnel est ensuite séché à la température ambiante. La poudre obtenue peut être aisément redispersée dans une solution aqueuse dont le pH est supérieur ou égal à 7.
Exemple 11
Greffage de luminol sur les nanoparticules d'or préparées selon l'exemple 10. 8 mg de nanoparticules d'or (de diamètre moyen égal à 5 nm) sont dispersées dans 10 ml d'une solution aqueuse de pH 8-10. 1 ml d'une solution de 0,1 M de l-éthyl-3- (3-diméthylamino)propyl carbodiimide (EDC) et 0,2 M de pentafluorophénol dans le propan-2-ol est ajouté à la solution colloïdale de nanoparticules d'or. Après 90 minutes, 154 μl à 1,54 ml d'une solution aqueuse à 10"2 M de luminol sont ajoutés. Après 150 minutes, les nanoparticules sont précipitées par ajout d'une solution aqueuse de HCl 1 N. Le précipité résultant est filtré et lavé avant d'être redispersé dans une solution aqueuse de pH > 7.
Variante : au lieu d'une solution de propan-2-ol contenant 0,1 M de d'EDC et 0,2 M de pentafluorophénol, une solution aqueuse de 0,1 M d'EDC et 0,2 M de N-hydroxysuccinimide peut être utilisée.
Exemple 12
Greffage d'un oligonucléotide thiolé sur les nanoparticules préparées selon l'exemple 11. 17
A 1 ml d'une solution colloïdale de nanoparticules d'or (6,7.10 nanoparticules/litre) sont ajoutées 1,11.10"9 mol d'oligonucléotides thiolés. Après 1 h, les particules sont précipitées par ajout de nanoparticules de HCl 1 Ν. Le précipité résultant est filtré et lavé avant d'être redispersé dans une solution aqueuse de. pH > 7. Exemple 13
Greffage d'un oligonucléotide terminé par une fonction aminé sur les nanoparticules préparées selon l'exemple 11.
A 1 ml d'une solution colloïdale de nanoparticules d'or (6,7.1017 nanoparticules/litre) est ajouté 1 ml d'une solution à 0,1 M d'EDC et 0,2 M de pentafluorophénol dans le propan-2-ol. Après 90 minutes, 1,11.10"9 mol d'oligonucléotides thiolés d(T)22 terminés par une fonction aminé sont ajoutés. Après 2 heures et 30 minutes, les nanoparticules sont précipitées par ajout d'une solution aqueuse de HCl 1 N. Le précipité résultant est filtré et lavé avant d'être redispersé dans une solution aqueuse de pH 8-10.
Variante : au lieu d'une solution de propan-2-ol contenant 0,1 M d'EDC et 0,2 M de pentafluorophénol, une solution aqueuse de 0,1 M d'EDC et 0,2 M de N- hydroxysuccinimide peut être utilisée.

Claims

REVENDICATIONS 1 - Particules sondes hybrides comprenant une nanoparticule d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm à la surface de laquelle sont greffées par des liaisons or-soufre, d'une part, au moins une, et de préférence de une à 100, molécules organiques sondes et d'autre part, au moins 10, et de préférence 10 à 10000, molécules à activité luminescente. 2 - Particules sondes hybrides selon la revendication 1 caractérisées en ce que le nombre de molécules à activité luminescente greffées en surface de la nanoparticule d'or est au moins 10 fois plus important que le nombre de molécules organiques sondes greffées. 3 - Particules sondes hybrides selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que 10 à 1000, de préférence 100 à 500, molécules à activité luminescente sont greffées sur la nanoparticule d'or. 4 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des colorants organiques fluorescents dont le maximum d'émission s'écarte d'au moins 25 nm du maximum d'absorption du plasmon de l'or. 5 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des composés électroluminescents ou chimiluminescents, par exemple des dérivés du luminol. 6 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des composés luminescents dont la longueur d'onde de la lumière émise est supérieure à la longueur d'onde d'excitation, de préférence d'au moins 200 nm. 7 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont des complexes de lanthanides. 8 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont choisies parmi les dérivés de la rhodamine et en particulier ceux de la lissamine rhodamine B. 9 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisées en ce qu'au plus 75 % de la nanoparticule d'or est recouverte d'un matériau de couverture présentant des caractéristiques diélectriques permettant le décalage de la bande plasmon de l'or en dehors de la zone d'émission des molécules à activité luminescente. 10 - Particules sondes hybrides selon la revendication 9 caractérisées en ce que le matériau de couverture est choisi parmi les polysiloxanes, SiO2, ZrO2,Ln2O3 et les oxohydroxydes de lanthanide. 11 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisées en ce que les molécules à activité luminescente sont greffées à la nanoparticules d'or par l'intermédiaire d'un espaceur organique thiolé, cet espaceur n'étant pas identique aux molécules organiques sondes. 12 - Particules sondes hybrides selon la revendication 11 caractérisées en ce que l'espaceur contient de 6 à 50 atomes de carbone et est, par exemple, choisi parmi les mercaptophénols, l'acide dihydrolipoïque et les thio-poly(éthylèneglycol). 13 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisées en ce que la nanoparticule d'or présente un diamètre compris dans la gamme allant de 4 à 20 nm, de préférence dans la gamme allant de 5 à 16 nm. 14 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisées en ce que 1 à 10 molécules organiques sondes sont greffées sur la nanoparticule d'or. 15 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisées en ce que les molécules organiques sondes sont choisies parmi les polynucléotides de type ADN, ARN ou oligonucléotides, les protéines de type anticorps, récepteur, enzyme, complexe enzyme/substrat, glycoprotéines, les polypeptides, les glycolipides, les oses, les polyosides et les vitamines. 16 - Particules sondes hybrides selon la revendication 14 caractérisées en ce que les molécules organiques sondes sont des oligonucléotides thiolés ou liés à un espaceur thiolé. 17 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisées en ce que les molécules organiques sondes sont des molécules permettant l'interaction biotine - streptavidine. 18 - Particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisées en ce qu' en outre, 10 à 1000 molécules organiques thiolees autres, distinctes des molécules organiques sondes et des molécules à activité luminescente, sont greffées sur la nanoparticule d'or, ces molécules organiques thiolees autres comportant, de préférence, au moins une fonction alcool, aminé, sulfonate, acide carboxylique ou phosphate. 19 - Procédé de préparation de particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 18 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction d'un sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes thiolees venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique de molécules à activité luminescente venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate. 20 - Procédé de préparation de particules sondes hybrides caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de citrate, ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d'espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre en remplacement de molécules de citrate, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, et/ou ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or. 21 - Procédé de préparation de particules sondes hybrides selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce que la réduction du sel d'or est réalisée en présence d'acide tannique. 22 - Procédé de préparation de particules sondes hybrides selon l'une des revendications 1 à 18 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - préparer une suspension colloïdale de nanoparticules d'or de diamètre compris dans la gamme allant de 2 à 30 nm, par réduction de sel d'or, et en particulier de tétrachloroaurate d'hydrogène, en phase aqueuse ou alcoolique et en présence de NaBH , ajouter, à la suspension colloïdale obtenue, une solution aqueuse ou alcoolique d'espaceurs thiolés fonctionnalisés avec une fonction ionisable susceptible de réagir avec les molécules organiques sondes ou les molécules à activité luminescente à greffer, les dits espaceurs venant se greffer à la surface des nanoparticules d'or par liaison or-soufre, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules orgamques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or, ajouter une solution aqueuse ou alcoolique de molécules organiques sondes fonctionnalisées pour réagir avec la fonction ionisable portée par les espaceurs greffés en surface de la nanoparticule d'or.
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