EP1635879A2 - Lektin-konjugate - Google Patents

Lektin-konjugate

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Publication number
EP1635879A2
EP1635879A2 EP04739672A EP04739672A EP1635879A2 EP 1635879 A2 EP1635879 A2 EP 1635879A2 EP 04739672 A EP04739672 A EP 04739672A EP 04739672 A EP04739672 A EP 04739672A EP 1635879 A2 EP1635879 A2 EP 1635879A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lectin
conjugate according
conjugate
target
searching unit
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04739672A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernhard Keppler
Paul Debbage
Wolfgang Buchberger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH
Original Assignee
Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH filed Critical Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH
Publication of EP1635879A2 publication Critical patent/EP1635879A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K49/1881—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles the nanoparticle having a magnetically inert core and a (super)(para)magnetic coating wherein the coating consists of chelates, i.e. chelating group complexing a (super)(para)magnetic ion, bound to the surface
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    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to conjugates which comprise at least one target-searching unit which binds specifically to receptors on the surface of endothelial cells, and at least one effector unit coupled thereto via a linker.
  • the invention further relates to compositions containing the conjugates, their use and the preparation of the conjugates.
  • All cells have special surface molecules that e.g. B. enable cell-cell interactions and the like.
  • the majority of these surface molecules consist of proteoglycans and glycoproteins, the protein structure of which is more or less strongly glycosylated.
  • the respective expression of oligosaccharides varies from species to species, but also from organ to organ.
  • this so-called glycocalyx changes in a characteristic manner as part of the development or modification of the endothelium through pathophysiological processes.
  • the functional states of the underlying tissue are signaled by the surface of the endothelial cells.
  • the (patho) physiological processes that result in a change in the Glykokalix include z. B. inflammatory reactions, exposure to hormones, the response to invading organisms such. B. viruses, and especially changes in the Glykokalix by proliferating cells, such as z. B. occur during angiogenesis.
  • the processes that result in proliferation of the endothelium include the formation of new tissue as part of wound healing and the uncontrolled proliferation of cells during tumor growth and the metastatic spread of tumor cells.
  • the natural ligands for the glycoproteins and proteoglycans of the glycocalyx are the lectins.
  • Lectins are proteins or glycoproteins that have a strong affinity for the sugar structures of the Glykokalix.
  • the structures of the lectins vary widely, but the common feature is that they are always proteins.
  • Another common feature of lectins is that they bind with high affinity specifically and reversibly, preferably to carbohydrates.
  • the affinity for binding to oligosaccharides is many times higher than the affinity for binding to monosaccharides.
  • WO 01/17566 discloses a contrast agent for displaying changes in the lymph nodes, inflammatory processes or pathological changes which are associated with the specific expression of endothelial and / or leukocytic ligands.
  • a receptor for specifically expressed endothelial ligands specifically L-selectin or an L-selectin derivative, is coupled to a signal unit in a defined orientation.
  • WO 85/01442 describes various conjugates of lectins selected from peanut lectin, lectin extract from the orange peel, Maclura pom / fera lectin, Dolichos jb // 7o ⁇ vs agglutinin and soybean agglutinin, with either a therapeutic agent or a radioactive label to be used for cancer therapy or for the detection of tumor cells.
  • the object of the present invention is to provide novel lectin conjugates which enable the diagnosis of pathophysiological changes in the glycocalyx in a particularly effective and less stressful manner and, moreover, can also be easily and effectively coupled to therapeutic agents.
  • the latter embodiment not only allows targeted drug delivery, but also tracking drug accumulation in the patient's body.
  • conjugates according to claim 1 of the present application which has at least one target-searching unit that binds specifically to receptors on the surface of endothelial cells, and at least one effector unit coupled to it via a linker, the at least one signal unit and optionally at least one therapeutic unit Active ingredient comprises, and are characterized in that the target-searching unit comprises a lectin or a fragment or derivative thereof, wherein the lectin is not an L-selectin, and the signal unit comprises a lanthanide ion.
  • Fragments of lectins in the sense of the present invention represent parts of naturally occurring lectins which preferably have the binding specificity of the naturally occurring form.
  • Derivatives of lectins in the sense of the present invention are preferably chemically modified lectins which have the binding specificity of the unmodified lectins.
  • An example of the chemical modification of lectins is biotinylation.
  • Chemical modifications of lectins can include:
  • radioactive modifications e.g. radioactive phosphorylation or radioactive labeling with sulfur, hydrogen, carbon, nitrogen,
  • colored groups e.g. digoxygonine, etc.
  • fluorescent groups e.g. fluorescein, etc.
  • conjugates comprise and are characterized by at least one target-searching unit, which specifically binds to receptors on the surface of endothelial cells, and at least one effector unit coupled thereto via a linker, which comprises at least one therapeutic agent that the targeting unit comprises a lectin or a fragment or derivative thereof, the lectin being no peanut lectin, lectins extract of the orange peel, Maclura pomifera-LekWn, Dolichos ⁇ b / 77ort / s-agglutinin or soybean agglutinin.
  • the present invention further includes methods for producing these conjugates and the use thereof in diagnostic and / or therapeutic methods.
  • a conjugate according to the invention formed from a target-searching unit and an effector unit tailored to the respective task, these pathophysiological changes can be recognized and made detectable by utilizing the specific interaction between the glycocalyx modified by pathophysiological changes and the lectins used as target-searching unit if necessary, an active substance can also be transported in a targeted manner to the site of the disease and the accumulation of active substance in the patient's body can be followed.
  • the characteristic glycocalyx to be recognized can be determined not only by the specific carbohydrate structures or specific lectins; which are expressed by the pathologically altered endothelial cells, also by particles deposited on the vessel wall, such as e.g. B. plaque, arteriosclerosis or a biofilm can be shaped.
  • the fact that the actual surface of the blood vessel is covered by deposits on it and the glycocalix can therefore no longer be registered is to be used as a sign of a change in the blood vessel and can indicate pathophysiological changes.
  • characteristic glycans of the tissue lying under the blood vessel can also be imaged under certain circumstances if this has been exposed by pathological processes with partial loss of the vascular tissue.
  • the carbohydrate structures of the glycocalyx of the vascular wall serving as the target are characteristic of inflammatory diseases or of underlying tumor tissue.
  • Suitable endothelial markers for inflammatory diseases are, for example, VCAMGPI, class I MHC antigen, ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1, E-selectin, P-selectin or VLA-4.
  • vascular endothelium As a marker for tumor tissue under the vascular endothelium and for angiogenesis caused by tumor growth and the associated Changes in the vascular endothelium are suitable for the cell surface molecules 4Ff2, EndoGlyx-1, Endoglin (CD105), the galectins and especially Endosialin.
  • Lectins, fragments or derivatives thereof which specifically bind to the characteristic carbohydrate structures of the glycocalyx of endothelial cells modified by pathophysiological processes serve as the target-searching unit for the conjugate according to the invention.
  • a monovalent lectin is preferably used for the conjugate, so that it is not used for agglutination of the blood cells, e.g. B. the erythrocytes comes.
  • the lectin used should not affect or even disturb normal bodily functions.
  • the lectins, fragments or derivatives thereof used in the conjugate are of plant, animal, bacterial, viral or human origin.
  • Suitable lectins for the present invention are:
  • Adhesins especially the adhesin from Bordetella Pertussis family 13 of the carbohydrate-binding molecules comitin lectin from the bacterial lawn Dictyostelium Neuroaminidase from Vibrio Cholera
  • Collectine family Clq, MBL, HSP-A, HSP-D, Collectin 43, ⁇ -Ficolin, ß-
  • Siglecl (sialoadhesin), Siglec 2 (CD22), Siglec 3, Siglec 4,
  • Lecticane family Aggrecan, Versican, Neurocan, Brevican
  • Cytokines IL-3, TFN- ⁇ , thrombomodulin, CD11b / CD18, CD66b, elastin / laminin binding protein, CD44, EN4, CD36, Hevein, pseudohevein
  • Adhesion molecules galactosyl receptor, PECAM-1 (CD31), EpCAM, ICAM-1
  • LEC-CAM in particular LEC-CAM-1 C-type lectins associated with immune system cells: NK cell domains such as Ly-49, CD23, or CQ69, monocyte and macrophage lectin, CD72, T&B lymphoblastoid-mucin-like lectin, P47, LSLCL gene -Product further lectins: hepatic asialoglycoprotein receptor, tetranectin, P58 / ERGIC-53, LOX-1, coagulation factors IX / X-binding protein, polycystin 1-C-type lectin, mucin-like proteins with C-type lectin domains , Myelin-associated glycoprotein, endosialin (TEM1), endoglyx, lipopolysaccharide-binding protein
  • TEM1 Myelin-associated glycoprotein
  • TEM1 endosialin
  • the plant lectins here in particular LEA, GSA-1 B 4 , UEA-1, ConA and WGA, the animal lectin LFA and the body's own lectins, in particular LOX-1, thrombomodulin, endosialin, endoglyx and galectin, are particularly preferred. 1.
  • a further functional component of the conjugates according to the invention is a signal unit coupled to the lectin by means of suitable methods, which remains stable on the lectin under physiological conditions.
  • This signal unit comprises a lanthanide ion, preferably a gadolinium ion or europium ion.
  • the lanthanide ion is preferably bound to a suitable chelator.
  • suitable chelating molecules or chelators are EDTA, DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), DOTA (1, 4,7,10-tetraazacyclododecane- ⁇ /, ⁇ /, / V, ⁇ / -tetraacetic acid), DFO (deferoxamine).
  • DTPA or DFO are particularly preferred.
  • oligomerized or polymerized chelator units can also be used as signal unit by suitable methods.
  • Suitable bifunctional bridging reagents for example, suitable diols, such as. B. ethylene glycol, 1, 3-propylene glycol or ⁇ /, ⁇ / -Bis- (2-hydroxyethylglycine), or diamines, such as. B. ethylenediamine, 1, 3-propylenediamine or 1, 6-hexamethylenediamine, so that the Chelator monomers are coupled to one another via ester or amide functions.
  • Naturally occurring polymers and fragments thereof, such as chitosan, dextran or polylysine, which have been linked to the chelator units in variable stoichiometric ratios, can be used to increase the metal ion loading.
  • the monomeric or oligomeric chelator units of the signal unit can be covalently coupled to the lectin, fragment or derivative thereof and thus simultaneously act as covalent linkers.
  • the signal unit is coupled to the lectin, the fragment or the derivative thereof by using a suitable functional group of the lectin without impairing its biological function. If necessary, this functional group can be introduced by modifying the native lectin.
  • the use of a biotinylated lectin can also be used to couple an avidinylated signal unit.
  • the signal unit is preferably coupled via a free nitrogen function of the lysine in the lectin.
  • all known linker molecules can be used as a linker for coupling a signal unit to the lectin, which enable the signal unit to be transported safely to the destination and allow the signal unit to remain safely at the destination.
  • a suitable linker for coupling the signal unit is non-toxic and does not significantly impair the biological behavior and the specificity of the lectin, the fragment or the derivative thereof or the activity of the signal unit.
  • Suitable linkers can be selected depending on the type of substance provided for coupling and the type of reactive functional group on the lectin.
  • a number of linkers for coupling diagnostic and therapeutic substances to various functional groups on proteins are already known in the prior art and, if necessary, can be adapted and used for the specific conjugates according to the invention.
  • the specific binding site of the lectin is, if necessary, protected by a suitable, temporarily binding ligand which has to be removed again after coupling.
  • This can be, for example, specifically binding oligosaccharides or polysaccharides, which can be removed again after coupling, for example by affinity chromatography.
  • This protective group can be, for example, chitobiose.
  • specifically expressed lectins are detected on the surface of endothelial cells of the vascular wall.
  • divalent sugars are used which on the one hand have a selective binding affinity for the lectins on the endothelial cell and on the other hand have a second affinity for the lectin, fragment or derivative thereof of the targeting unit of the lectin conjugates according to the invention.
  • the divalent sugar can either be bound to the specific binding site of the conjugated lectin before application or it can be applied separately so that the sugar first binds to the specifically expressed lectin on the endothelial cell and only then is recognized and bound by the conjugated lectin.
  • the target-seeking unit i.e. H. provide the lectin, the fragment or the derivative thereof, or the conjugate of the target-searching unit and the signal unit with a therapeutic agent in such a way that the agent can be released again at the target site characterized by the target.
  • the therapeutic agent is preferably a cytotoxic substance.
  • This can e.g. B. a metal complex such as c / s platinum or suitable derivatives thereof.
  • Other cytostatically active substances such as alkylating agents, antibiotics, antimetabolites, hormones or mitosis inhibitors, can also be used as active ingredients. Growth factors, toxins, recombinant proteins or vectors for gene transfections can also be used.
  • the radioactive particle is through a suitable chelator, such as DTPA or DFO, coupled to the lectin.
  • DTPA DTPA
  • DFO suitable chelator
  • higher metal ion concentrations per mole of lectin can be achieved by using higher oligomerized or polymerized chelator units.
  • the radioactive element can be incorporated into suitable groups and thus coupled to the protein.
  • 75 Br, 76 Br, 77 Br, 99m Tc, 11 C, 13 N, 15 O and 18 F can be used.
  • 125 l, 111 ln, 99m Tc and 18 F are particularly preferred.
  • the active substance is preferably bound to the lectin, the fragment or the derivative thereof.
  • the active substance is coupled via covalent linkers using a suitable functional group of the lectin without impairing its biological function. If necessary, this functional group can be modified by modifying the native lectin, e.g. B. have been introduced by chemical or genetic engineering methods.
  • the active substance is preferably coupled via a free nitrogen function of the lysine in the lectin.
  • linker molecules can be used as a linker for coupling an active substance to the lectin, which enable safe transport of the active substance to the target location and release of the active substance at the target location.
  • a suitable linker for coupling the signal unit or the active substance is non-toxic and does not significantly impair the biological behavior and the specificity of the lectin, the fragment or the derivative thereof or the activity of the active substance.
  • Preferred linkers for coupling metal ions have already been mentioned above.
  • linkers can be selected depending on the type of substance to be coupled and the type of reactive functional group on the lectin.
  • a series of linkers for coupling diagnostic and therapeutic substances to different functional groups on proteins are already known in the prior art and, if necessary, can be adapted and used for the specific conjugates according to the invention.
  • the specific binding site of the lectin is protected by a suitable, temporarily binding ligand that has to be removed again after coupling.
  • a suitable, temporarily binding ligand that has to be removed again after coupling.
  • This can be, for example, specifically binding oligosaccharides or polysaccharides, which can be removed again after coupling, for example by affinity chromatography.
  • This protective group can be, for example, chitobiose.
  • the lectin, fragment or derivative of the targeting unit is preferably designed such that the pathologically modified endothelial cell can first bind the lectin to its glycocalyx, then the lectin is taken up into the cell and released again into the subendothelial area can be, after which a selective and targeted inclusion in the focus of the disease is possible.
  • a therapeutic effect can also be achieved by selective labeling of the endothelial cell with subsequent transcytosis, so that a high active substance accumulation or a high active substance concentration is achieved on the subendothelial side of the vascular wall of the vessel.
  • the high accumulation then facilitates the passive transport of active ingredient towards the diseased tissue through diffusion.
  • the pathophysiological conditions in the tissue to be treated are preferably inflammatory or tumor diseases.
  • the conjugates can also consist only of a combination of target-searching unit, ie lectin, fragment or derivative thereof, and therapeutic agent. Combinations of all of the above-mentioned lectins, fragments and derivatives with all of the above-mentioned active substances are possible for this embodiment.
  • the body's own lectins are particularly preferred for this purpose, and here in particular LOX-1, the leukocyte and macrophage receptors, the elastin / laminin-binding protein, CD11b / CD18, MBL, thrombomodulin, vitronectin and EpCAM.
  • the molar ratio between lectin, fragment or derivative thereof and the respective signal unit coupled to the lectin or the respective coupled active ingredient can be varied within an empirically determinable range in order to optimally fulfill the specific task of the respective lectin conjugate. Such attempts to optimize are within the capabilities of an average person skilled in the art.
  • Lectin, signaling unit and optionally active ingredient can be built up in separate synthesis processes and combined as desired.
  • This modular structure makes it possible to vary the properties of the conjugates according to the invention, e.g. B. a change in lectin specificity, easily possible.
  • the lectin conjugates according to the invention can be immobilized on the surface of a polymeric carrier or enclosed in the interior of a polymeric carrier.
  • polymeric carriers are nano- or microparticles based on polystyrene or chitosan, BSA / PLA (polylactic acid) microparticles or latex particles, e.g. B. made of polystyrene.
  • BSA / PLA polylactic acid microparticles or latex particles, e.g. B. made of polystyrene.
  • the size of the polymer carrier is chosen so that the normal blood flow in the blood vessels is not disturbed by the presence of the lectin conjugate.
  • the conjugates according to the invention coupled with a signal unit are used in various imaging diagnostic methods, preferably in MRI ("Nuclear resonance imaging") for the detection of specific targets, for example characteristic carbohydrate structures or specifically expressed lectins, on vascular endothelial cells or, if appropriate, on the underlying tissue
  • MRI Magnetic resonance imaging
  • the endothelial marking for the MRI can also be carried out by a less selective lectin, so that the entire vascular endothelium is completely marked by the lectin-signal unit conjugate and thus by determining the blood vessel volume in a given volume element complete imaging of the blood vessels becomes possible.
  • Fig. 1 concentration-activity curve of compound 1 (LEA-DTPA-Gd) compared to Omniscan [Aqua [5,8-bis (carboxymethyl) -11- [ 2 , - (methylamino) -2-oxoethyl] -3-oxo-2, 5, 8, 11 -tetraazatridecan-13-oato- (3 -) - N 5 , N 8 , Ni !
  • vein control
  • Vein 1 week
  • Vein fresh
  • contrast medium top view of the cross-section of the vein
  • PBS positive control
  • Magnevist as a positive control
  • Fig. 3 MRI images of liver vessels of the mouse using the latex-LEA conjugate 3.4 as a contrast agent
  • liver vessels of the mouse are white, contrast medium is in the vessels (concentration 5.75 mg / ml)
  • FIG. 3C contrast agent in the mouse rinsed out with 1 ml PBS, vessels are still somewhat whitish
  • reaction solution is separated by means of FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) by gel filtration with citrate buffer (0.1 M; pH 6.5).
  • FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
  • the protein fraction with the covalently bound DTPA is isolated.
  • the 3 ml protein solution obtained is mixed with 0.030 ml Gd (NTA) 2 solution (preparation as under a)) and stirred at 4 ° C. for 24 h.
  • the solution is then lyophilized, dissolved in 0.5 ml of distilled water and purified again by means of FPLC in order to separate unbound Gd (NTA) 2 and free H 3 NTA.
  • Sodium bis (ethylhexyl) sulfosuccinate (0.03-0.1 M) is dissolved in 40 ml r / hexane. 100 ⁇ l of 0.1% chitosan-acetic acid solution, 200 ⁇ l of LEA-DTPA-Gd solution (different concentrations), 10 ⁇ l of ammonia solution and 10 ⁇ l of 0.01-1.0% strength solution are added to this solution with constant stirring at room temperature Glutaraldehyde solution added. The reaction solution becomes homogeneous and clear. In this way, the chitosan nanoparticles with encapsulated LEA-DTPA-Gd conjugate are formed.
  • the activator precipitates in the form of calcium diethylhexyl sulfosuccinate [Ca (DEHSS) 2 ].
  • the contrast medium thus produced is characterized by means of AAS, FACS, SEM.
  • the activator and the ionic impurities in the latex suspension are separated by centrifugation (3 x 10 min. At 4000 rpm in PBS). 36.0 mg latex particles are resuspended in 4 ml PBS. After adding 35.0 mg of EDC [1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride], the reaction mixture is stirred for 3.5 h at room temperature. After removal of the activator by washing (centrifuging once at 4000 rpm for 3 min), 10 mg of LEA are added and incubated overnight at room temperature. The reaction mixture is then centrifuged once at 4000 rpm to separate free lectin.
  • the polymer is resuspended in 1 ml PBS and stored at 4 ° C.
  • the next step is the conjugation with DTPABA. This is carried out analogously to steps b) and c) in Example 1.
  • the loading with gadolinium (III) according to Example 1 c) takes place with 2 x 0.030 ml Gd (NTA) 2 solution.
  • the lectin is covalently bound to BSA / PLA microparticles.
  • the microparticles are first activated with glutaraldehyde (25% aqueous solution) and then the second step is the incubation with LEA.
  • the amount of bound lectin is determined using the difference method (lectin in the preparation / lectin in the supernatant after the conjugation). Protein determination is carried out using the amido black method.
  • the BSA-DTPABA-Gd conjugate required for this compound is prepared as follows.
  • FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
  • the protein fraction with the covalently bound DTPA is isolated.
  • the 3 ml protein solution obtained is mixed with 0.056 ml Gd (NTA) 2 solution (0.016 mmol) and stirred at 4 ° C. for 24 h.
  • the solution is then lyophilized, dissolved in 0.5 ml of distilled water and purified again by means of FPLC in order to separate unbound Gd (NTA) 2 and free H 3 NTA.
  • the 3 ml solution obtained is mixed with 3 x 0.030 ml Gd (NTA) 2 solution and stirred at 4 ° C. for 24 h.
  • the solution is then lyophilized, dissolved in 0.5 ml of distilled water and purified again by means of FPLC in order to separate unbound Gd (NTA) 2 and free H 3 NTA.
  • the amount of bound lectin is determined using the difference method (lectin in the preparation / lectin in the supernatant after the conjugation). Protein determination is carried out using the amido black method.
  • Polycondensates of the chelating compound DTPABA with [N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine)], ethylenediamine, hexamethylenediamine and ethylene glycol are produced as carriers.
  • the protein fraction with the covalently bound polycondensate is isolated.
  • the 3 ml protein solutions obtained are each mixed with 120 ⁇ l Gd (NTA) 2 solution (0.016 mmol) and stirred at 4 ° C. for 24 hours.
  • the solutions are then lyophilized, dissolved in distilled water and purified by FPLC in order to separate unbound Gd (NTA) 2 and free H 3 NTA.
  • the dissolved test substance was filled as a 30 to 100 nM aliquot into an Eppendorff plastic tube and positioned in the detector coil for the MRI measurements.
  • the molar concentration was based on the carrier for which the analytical data are known, and calculated taking into account the molar ratio between carrier and gadolinium.
  • the small molecules such as. B. Gd-DTPA or smaller polymers, the molar concentration was determined on the basis of the absolute molecular weight of the corresponding substance.
  • the concentration of the nanoparticle suspension and the absolute amount of gadolinium, based on the total surface of the nanoparticle in the total volume were used as the basis for calculating the concentration in the solution.
  • MRI images at 1 x 10 "4 M weak imaging of the liver veins of the mouse (spin echo and flash 3D technology).
  • Substance 3.4 MRI images, see FIGS. 2 and 3.
  • the human veins were removed during the surgical treatment of varicose veins. They were immediately soaked in 2.5% glutaraldehyde buffered with PBS. After fixation in this solution for 18 to 24 hours at 4 ° C, the veins were removed transferred to PBS and stored at + 4 ° C for up to 6 weeks. During the operation, the vein is turned inside out, which means that the endothelium, contrary to its natural orientation, is directed outwards under physiological conditions.
  • the veins were cut into 2 cm fragments, placed in 0.15 M ammonium chloride solution for two hours to a week at 4 ° C., then for at least one hour in PBS with 0.1% HSA , 0.1 mM calcium ions and 0.1 mM magnesium ions (PBS Inc.) stored. The veins were then placed in PBS-In ⁇ containing 10 mg / ml latex-400-LEA-Gd (substance 3.4) for one hour. A vein, which was used in PBS-Inc. had been inserted without the addition of additives.
  • MRI examinations were carried out while the vein segments were inserted in PBS Inc. or in PBS Inc. with substance 3.4. The veins were then placed in 5 ml of PBS Inc. as a rinse, shaken for two minutes, then the vein was rinsed again with PBS Inc. and examined again by MRI.
  • the data was recorded in the form of digital images so that quantitative data can be extracted from the images.
  • Each mouse was anesthetized with ketamine and rompun, then small venflons were inserted into one of the carotid arteries and one of the jugular veins.
  • the mouse was then placed in a falcon tube that was opened at one end to allow air to enter, and the falcon tube became positioned within the detector coil of the MRI device.
  • MRI measurements were taken from various mouse organs (brain, intestine, liver, kidney and lungs) before perfusion with the test substance. The perfusion of 0.2 ml of the test substance within 60 seconds was monitored directly by means of MRI. After the MRI measurement, the mouse was flushed into the jugular vein by perfusion with L15 in various volumes between 1.0 and 2.5 ml. The mouse was immediately placed back in the detector and the MRI measurements were carried out again.
  • FIGS. 3A to 3D 4 MRI images of the liver of the mouse are shown in FIGS. 3A to 3D.
  • the contrast between the blood vessels in the liver can clearly be seen from these images by using a compound according to the invention.
  • the contrast medium remains in the blood vessels (FIGS. 3C and 3D).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Konjugat, das mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit umfasst, wobei die Effektoreinheit mindestens eine Signaleinheit sowie gegebenenfalls mindestens einen therapeutischen Wirkstoff aufweist und, die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein L-Selektin ist, und die Signaleinheit ein Lanthanidenion umfasst.

Description

Lektin-Koniuqate
Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate, die mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit umfassen. Die Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen, die die Konjugate enthalten, sowie deren Verwendung und die Herstellung der Konjugate.
Alle Zellen besitzen spezielle Oberflächenmoleküle, die z. B. Zell-Zell-Interaktionen und dergleichen ermöglichen. Dies gilt entsprechend auch für die Zellen des vaskulären Endotheliums. Ein Großteil dieser Oberflächenmoleküle besteht aus Proteoglykanen und Glykoproteinen, deren Proteingerüst mehr oder weniger stark glykosyliert vorliegt. Die jeweilige Expression von Oligosacchariden variiert von Spezies zu Spezies, aber auch von Organ zu Organ. Darüber hinaus verändert sich diese sogenannte Glykokalix auch im Rahmen der Entwicklung oder der Veränderung des Endotheliums durch pathophysiologische Prozesse in einer charakteristischen Weise. Somit werden sogar die Funktionszustände des darunter liegenden Gewebes durch die Oberfläche der Endothelzellen signalisiert.
Zu den (patho)physiologischen Vorgängen, die eine Veränderung der Glykokalix zur Folge haben, gehören z. B. Entzündungsreaktionen, Einwirkung von Hormonen, die Reaktion auf eindringende Organismen wie z. B. Viren, und besonders Veränderungen in der Glykokalix durch proliferierende Zellen, wie sie z. B. während der Angiogenese auftreten. Zu den Vorgängen, die eine Proliferation des Endotheliums zur Folge haben, gehören die Neubildung von Gewebe im Rahmen der Wundheilung sowie die unkontrollierte Proliferation von Zellen beim Tumorwachstum und bei der metastatischen Verbreitung von Tumorzellen.
Diese vom Normalzustand abweichenden Markierungen auf den Zelloberflächen des vaskulären Endotheliums lassen sich somit zur Erkennung, d. h. zur Diagnose pathophysiologischer Zustände des darunter liegenden Gewebes verwenden, darüber hinaus jedoch auch zum zielgerichteten Transport von therapeutischen Wirkstoffen, wenn diese an ein geeignetes Trägermolekül gebunden sind. Besonders die große Variabilität an möglichen Strukturen, die sich bei der Verknüpfung einer gegebenen Zahl an Zuckermolekülen ergibt und die die Variabilität von aus Aminosäuren aufgebauten Strukturen um Größenordnungen übertrifft, erlaubt die Darstellung der verschiedenen Stadien der Entwicklung einer Zelle und auch der jeweils aktiven Funktionen.
Es sind immer wieder Versuche unternommen worden, bestimmte Marker auf dem vaskulären Endothelium, die krankhafte Veränderungen anzeigen, für den zielgerichteten Wirkstofftransport oder zum Transport von Partikeln, die für diagnostische Zwecke eingesetzt werden können, zu verwenden. Als zielsuchende Teilchen sind häufig z. B. monoklonale Antikörper eingesetzt worden. Erschwert wird der allgemeingültige Einsatz dieser Technologie durch die geringe Spezifität der verwendeten Strukturen oder auch durch das Hervorrufen einer Immunantwort. Gerade im Rahmen von diagnostischen Verfahren ist die immunogene Wirkung und die durch die Immunantwort des Körpers hervorgerufene Zerstörung der markierten Zellen ein emstzunehmendes Problem bei der Verwendung von Antikörpern. Auch Zielstrukturen auf den Zellen des Krankheitsherdes selbst sind schon öfter als Target für ein zielsuchendes Teilchen beschrieben worden, wobei hier als Nachteil besonders die schwierige Erreichbarkeit der erkrankten Stelle bei systemischer Applikation zu nennen ist.
Die natürlichen Liganden für die Glykoproteine und Proteoglykane der Glykokalix sind die Lektine. Lektine sind Proteine oder Glykoproteine, die eine starke Affinität zu den Zuckerstrukturen der Glykokalix besitzen. Die Strukturen der Lektine variieren in einem breiten Rahmen, jedoch ist das gemeinsame Merkmal, dass es sich immer um Proteine handelt. Ein weiteres gemeinsames Merkmal von Lektinen ist, dass sie mit hoher Affinität spezifisch und reversibel vorzugsweise an Kohlenhydrate binden. Dabei ist die Affinität der Bindung zu Oligosacchariden um ein Vielfaches höher als die Affinität der Bindung zu Monosacchariden. Somit ermöglicht die unterschiedliche räumliche und auch funktionell zeitliche Ausbildung von Oligosacchariden und der endothelialen Zelloberfläche ein räumlich spezifisches Anbinden der Lektine. Neben dieser sehr günstigen Eigenschaft in Hinblick auf die Selektivität ist auch die Verfügbarkeit dieser Proteinstrukturen aus verschiedenen Quellen sehr günstig. WO 01/17566 offenbart ein Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder pathologischen Veränderungen, die mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytären Liganden verbunden sind. Bei diesem Kontrastmittel ist ein Rezeptor für spezifisch exprimierte endotheliale Liganden, konkret L-Selektin oder ein L-Selektin-Derivat, in definierter Ausrichtung an eine Signaleinheit gekoppelt.
WO 85/01442 beschreibt verschiedene Konjugate von Lektinen, ausgewählt aus Erdnuß-Lektin, Lektinextrakt der Orangenschale, Maclura pom/fera-Lektin, Dolichos jb//7oπvs-Agglutinin und Sojabohnen-Agglutinin, mit entweder einem therapeutischen Agens oder einer radiaktiven Markierung, die zur Krebs-Therapie oder zum Nachweis von Tumorzellen eingesetzt werden sollen.
Demgegenüber besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung neuartiger Lektin-Konjugate, welche auf besonders wirksame und den Körper wenig belastende Weise die Diagnose von pathophysiologischen Veränderungen der Glykokalix ermöglichen und darüber hinaus gegebenenfalls auch einfach und effektiv an therapeutische Wirkstoffe gekoppelt werden können. Die letztere Ausführungsform erlaubt nicht nur einen zielgerichteten Wirkstofftransport, sondern auch eine Verfolgung der Wirkstoffakkumulation im Körper des Patienten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Konjugate gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Anmeldung, welche mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens eine Signaleinheit sowie gegebenenfalls mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, umfassen und dadurch gekennzeichnet sind, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein L- Selektin ist, und die Signaleinheit ein Lanthanidenion umfasst.
Fragmente von Lektinen im Sinne der vorliegenden Erfindung stellen Teile natürlich vorkommender Lektine dar, die vorzugsweise die Bindungsspezifität der natürlich vorkommenden Form besitzen. Derivate von Lektinen im Sinne der vorliegenden Erfindung stellen vorzugsweise chemisch modifizierte Lektine dar, die die Bindungsspezifität der nicht modifizierten Lektine besitzen. Eih Beispiel für die chemische Modifikation von Lektinen ist die Biotinylierung.
Chemische Modifikationen von Lektinen können erfindungsgemäß umfassen:
(i) radioaktive Modifikationen, z.B. radioaktive Phosphorylierung oder radioaktive Markierung mit Schwefel, Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff,
(ii) farbige Gruppen (z.B. Digoxygonin, etc.),
(iii) fluoreszierende Gruppen (z.B. Fluorescein, etc.),
(iv) chemolumineszierende Gruppen, und/oder
(v) Gruppen zur Immobilisierung an einer festen Phase (z.B. Biotin, Streptavidin, Streptag),
(vi) Markierung mit elektronendichten Materialien, wie z.B. Gold,
oder Kombinationen von Modifikationen gemäß zwei oder mehr der unter (i) bis (vi) genannten Modifikationen. Diese Modifikationen können mit Hilfe von einem Fachmann bekannten Reaktionen nachgewiesen werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Konjugate bereitgestellt, welche mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, umfassen und dadurch gekennzeichnet sind, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein Erdnuß-Lektin, Lektinextrakt der Orangenschale, Maclura pomifera-LekWn, Dolichos ιb/77ort/s-Agglutinin oder Sojabohnen-Agglutinin ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate sowie die Verwendung derselben in diagnostischen und/oder therapeutischen Verfahren. Durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats, gebildet aus einer zielsuchenden Einheit und einer auf die jeweilige Aufgabe abgestimmten Effektoreinheit, können unter Ausnutzung der spezifischen Wechselwirkung zwischen der durch pathophysiologische Veränderungen modifizierten Glykokalix sowie den als zielsuchende Einheit eingesetzten Lektinen diese pathophysiologischen Veränderungen erkannt und nachweisbar gemacht werden und gegebenenfalls kann auch ein Wirkstoff zielgerichtet zum Ort der Erkrankung transportiert und die Wirkstoffakkumulation im Körper des Patienten verfolgt werden.
Die zur erkennende charakteristische Glykokalix kann außer durch die spezifischen Kohlenhydratstrukturen oder spezifischen Lektine; die von den pathologisch veränderten Endothelzellen exprimiert werden, auch durch auf der Gefäßwand abgelagerte Teilchen, wie z. B. Plaque, Arteriosklerose oder ein Biofilm, geprägt werden. Auch die Tatsache, dass die eigentliche Oberfläche des Blutgefäßes durch Ablagerungen auf dieser verdeckt ist und die Glykokalix somit nicht mehr registriert werden kann, ist als Zeichen für eine Veränderung des Blutgefäßes heranzuziehen und kann auf pathophysiologische Veränderungen hinweisen. Weiterhin lassen sich mit den erfindungsgemäßen Konjugaten unter Umständen auch charakteristische Glykane des unter dem Blutgefäß liegenden Gewebes abbilden, wenn dieses durch pathologische Prozesse mit partiellem Verlust des vaskulären Gewebes freigelegt worden ist.
Vorzugsweise sind die als Target dienenden Kohlenhydratstrukturen der Glykokalix der vaskulären Gefäßwand charakteristisch für Entzündungskrankheiten oder für darunter liegendes Tumorgewebe.
Als endotheliale Marker für Entzündungskrankheiten eignen sich zum Beispiel VCAMGPI, Klasse I MHC Antigen, ICAM-1 , VCAM-1, ELAM-1 , E-Selektin, P-Selektin oder VLA-4.
Als Marker für unter dem vaskulären Endothel liegendes Tumorgewebe und für eine durch Tumorwachstum verursachte Angiogenese und die damit verbundenen Veränderungen des vaskulären Endothels eignen sich die Zeiloberflächenmoleküle 4Ff2, EndoGlyx-1 , Endoglin (CD105), die Galektine und insbesondere Endosialin.
Als zielsuchende Einheit für das erfindungsgemäße Konjugat dienen Lektine, Fragmente oder Derivate davon, die spezifisch an die charakteristischen Kohlenhydratstrukturen der Glykokalix von durch pathophysiologische Vorgänge veränderten Endothelzellen binden.
Bevorzugt wird für das Konjugat ein monovalentes Lektin verwendet, so dass es bei der Applikation nicht zur Agglutination der Blutzellen, z. B. der Erythrozyten, kommt.
Auch sollen durch das eingesetzte Lektin die normalen Körperfunktionen nicht beeinflusst oder gar gestört werden.
Die in dem Konjugat eingesetzten Lektine, Fragmente oder Derivate davon sind pflanzlichen, tierischen, bakteriellen, viralen oder menschlichen Ursprungs.
Konkrete Beispiele geeigneter Lektine für die vorliegende Erfindung sind:
Lektine von Viren:
Lektin des Rotavirus Lektin des Vacciniavirus
Bakterielle Lektine:
Adhäsine, insbesondere das Adhäsin von Bordetella Pertussis Familie 13 der Kohlenhydrat-bindenden Moleküle Comitinlektin aus dem Bakterienrasen Dictyostelium Neuroaminidase von Vibrio Cholera
Lektine von Einzellern:
Lektin von Entamoeba Lektine aus Pflanzen:
LEA, DSA, GSA-IB4, PHA, SBA, UEA-1 , CSA-1 , WGA, Kartoffellektin (STA), Barley-Lektin, LAA-1 , MAA, GNA, DBA, Jacalin, SCAman, ConA, ECA, PSA, RCA, LOLI, Modeccin, Abrin, Viscun , Ricin, ML-VAIliumlektin
Tierische Lektine:
BSCLT aus Botryllus Schlosseri
BgSEL aus Miomphalaria Glabrata
Ficolin/Opsonin P35-Lektin aus dem Igel
Echicetin aus der Schlange
BjcuL aus der Schlange
RW-X aus der Schlange
Galektin aus dem Nematoden Caenorhabditis Elegans
BmLBP aus dem Seidenwurm
CCF-1 der Wirbellosen
Ly-49 der Maus
Limulin
Limulus-Faktor C
LFA
HPA,
Lektine des Menschen:
1 ) C-Typ-Lektine
Familie der Collectine: Clq, MBL, HSP-A, HSP-D, Collectin 43, α-Ficolin, ß-
Ficolin, Conglutinin, P35
Familie der Siglecs: Siglecl (Sialoadhäsin), Siglec 2 (CD22), Siglec 3, Siglec 4,
Siglec 5, Siglec 6, Siglec 7, Siglec 8, Siglec 9, Siglec 10
Familie der Lecticane: Aggrecan, Versican, Neurocan, Brevican
Cytokine: IL-3, TFN-α, Thrombomodulin, CD11b/CD18, CD66b, Elastin/Laminin- bindendes Protein, CD44, EN4, CD36, Hevein, Pseudohevein
Adhäsionsmoleküle: Galactosylrezeptor, PECAM-1 (CD31 ), EpCAM, ICAM-1
(CD54), ELAM-1 (CD62E), VCAM-1 (CD106), CD72, Vitronectin, LEC-CAM, insbesondere LEC-CAM-1 C-Typ Lektine, die mit Zellen des Immunsystems assoziiert sind: NK-Zell- Domänen wie Ly-49, CD23, oder CQ69, Monozyten- und Makrophagen-Lektin, CD72, T&B-Lymphoblastoid-Mucin-artiges Lektin, P47, LSLCL Gen-Produkt weitere Lektine: Hepatischer Asialoglycoprotein-Rezeptor, Tetranectin, P58/ERGIC-53, LOX-1, Koagulationsfaktoren IX/X-bindendes Protein, Polycystin- 1-C-Typ-Lektin, Mucin-artige Proteine mit C-Typ-Lektindomänen, Myelinassoziiertes Glycoprotein, Endosialin (TEM1 ), Endoglyx, Lipopolysaccharide- bindendes Protein
2) S-Typ-Lektine S-Lac-Lektine Galektine: Galektin-1 , Galektin-3, Galektin-9
Besonders bevorzugt sind die pflanzlichen Lektine, hier besonders LEA, GSA-1 B4, UEA-1 , ConA und WGA, das tierische Lektin LFA und die körpereigenen Lektine des Menschen, hier besonders LOX-1 , Thrombomodulin, Endosialin, Endoglyx und Galektin-1.
Eine weitere funktionelle Komponente der erfindungsgemäßen Konjugate ist eine mittels geeigneter Methoden an das Lektin gekoppelte Signaleinheit, die unter physiologischen Bedingungen stabil am Lektin verbleibt. Diese Signaleinheit umfasst ein Lanthanidenion, vorzugsweise ein Gadoliniumion oder Europiumion. Das Lanthanidenion ist dabei vorzugsweise an einen geeigneten Chelator gebunden. Einige nicht beschränkende Beispiele geeigneter chelatbildender Moleküle oder Chelatoren sind EDTA, DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), DOTA (1 ,4,7,10- Tetraazacyclododecan-Λ/,Λ/,/V,Λ/-tetraessigsäure), DFO (Deferoxamin). Besonders bevorzugt sind DTPA oder DFO.
Zum Erreichen einer höheren Metallionenbeladung des Konjugats können als Signaleinheit auch durch geeignete Methoden oligomerisierte oder polymerisierte Chelator-Einheiten verwendet werden. Als bifunktionale verbrückende Reagenzien können beispielsweise geeignete Diole, wie z. B. Ethylenglykol, 1 ,3-Propylenglykol oder Λ/,Λ/-Bis-(2-hydroxyethylglycin), oder Diamine, wie z. B. Ethylendiamin, 1 ,3- Propylendiamin oder 1 ,6-Hexamethylendiamin, verwendet werden, so dass die Chelator-Monomere über Ester- oder Amidfunktionen aneinander gekoppelt werden. Die Zahl der durch die oben beschriebenen bifunktionalen Einheiten verknüpften Monomere beträgt n = 2 bis 20, bevorzugt n = 2 bis 15, besonders bevorzugt n = 2 bis 12 und ganz besonders bevorzugt n = 3 bis 10. Auch natürlich vorkommende Polymere und Fragmente davon, wie z.B. Chitosan, Dextran oder Polylysin, die in variablen stöchiometrischen Verhältnissen mit den Chelator-Einheiten verbunden worden sind, können zur Erhöhung der Metallionenbeladung verwendet werden.
Die monomeren oder oligomeren Chelator-Einheiten der Signaleinheit können kovalent an das Lektin, Fragment oder Derivat davon gekoppelt werden und fungieren so gleichzeitig als kovalente Linker.
Die Kopplung der Signaleinheit an das Lektin, das Fragment oder das Derivat davon erfolgt durch Verwendung einer geeigneten funktionellen Gruppe des Lektins ohne dessen biologische Funktion zu beeinträchtigen. Erforderlichenfalls kann diese funktionelle Gruppe durch Modifizierung des nativen Lektins eingeführt worden sein Auch die Verwendung eines biotinylierten Lektins kann zur Ankopplung einer avidinylierten Signaleinheit eingesetzt werden. Vorzugsweise erfolgt die Kopplung der Signaleinheit über eine freie Stickstoff-Funktion des Lysins im Lektin. Als Linker zur Ankopplung einer Signaleinheit an das Lektin können grundsätzliche alle bekannten Linkermoleküle eingesetzt werden, die einen sicheren Transport der Signaleinheit zum Zielort ermöglichen und den sicheren Verbleib der Signaleinheit am Zielort erlauben. Ein geeigneter Linker zur Ankopplung der Signaleinheit ist nichttoxisch und beeinträchtigt weder das biologische Verhalten und die Spezifität des Lektins, des Fragments oder des Derivats davon noch die Aktivität der Signaleinheit in erheblichem Maße. Geeignete Linker können in Abhängkeit von der Art der zur Kopplung vorgesehenen Substanz und der Art der reaktiven funktioneilen Gruppe auf dem Lektin ausgewählt werden. Ein Reihe von Linkern zur Kopplung diagnostischer und therapeutischer Substanzen an verschiedene funktionelle Gruppen auf Proteinen sind im Stand der Technik bereits bekannt und können erforderlichenfalls für die speziellen erfindungsgemäßen Konjugate angepasst und eingesetzt werden. Zur Synthese des Lektin-Linker-Konjugats wird erforderlichenfalls die spezifische Bindungsstelle des Lektins durch einen geeigneten, temporär bindenden und nach erfolgter Ankopplung wieder zu entfernenden Liganden geschützt. Hierbei kann es sich beispielsweise um spezifisch bindende Oligo- oder Polysaccharide handeln, die nach erfolgter Kopplung zum Beispiel durch Affinitätschromatographie wieder entfernt werden können. Bei dieser Schutzgruppe kann es sich beispielsweise um Chitobiose handeln.
In einem speziellen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden spezifisch exprimierte Lektine auf der Oberfläche von Endothelzellen der vaskulären Gefäßwand nachgewiesen. Hierzu werden erfindungsgemäß divalente Zucker eingesetzt, die einerseits eine selektive Bindungsaffinität gegenüber den Lektinen auf der Endothelzelle und andererseits eine zweite Affinität gegenüber dem Lektin, Fragment oder Derivat davon der zielsuchenden Einheit der erfindungsgemäßen Lektinkonjugate besitzen. Dabei kann der divalente Zucker entweder vor der Applikation an die spezifische Bindungsstelle des konjugierten Lektins gebunden werden oder aber separat appliziert werden, so dass der Zucker zuerst an das spezifisch exprimierte Lektin auf der Endothelzelle bindet und dann erst von dem konjugierten Lektin erkannt und gebunden wird.
Zur Erzielung eines therapeutischen Effekts wird die zielsuchende Einheit, d. h. das Lektin, das Fragment oder das Derivat davon, bzw. das Konjugat aus zielsuchender Einheit und Signaleinheit mit einem therapeutischen Wirkstoff in einer derartigen Weise versehen, dass an dem durch das Target charakterisierten Zielort der Wirkstoff problemlos wieder freigesetzt werden kann.
Der therapeutische Wirkstoff ist vorzugsweise eine cytotoxische Substanz. Diese kann z. B. ein Metallkomplex wie c/s-Platin oder geeignete Derivate davon sein. Auch andere cytostatisch wirksame Substanzen, wie Alkylantien, Antibiotika, Antimetabolite, Hormone oder Mitose-Hemmstoffe sind als Wirkstoffe einsetzbar. Auch Wachstumsfaktoren, Toxine, rekombinante Proteine oder Vektoren für Gen- Transfektionen sind verwendbar. Bei der Verwendung von Radionukliden wird das radioaktive Teilchen durch einen geeigneten Chelator, wie beispielsweise DTPA oder DFO, an das Lektin gekoppelt. Auch hier können höhere Metallionenkonzentrationen pro Mol Lektin durch Verwendung höher oligomerisierter oder polymerisierter Chelator-Einheiten erzielt werden. Im Falle von nicht-metallischen Radionukliden kann das radioaktive Element in geeignete Gruppen eingebaut werden und so an das Protein gekoppelt werden.
Als Radionuklide können 123l, 125l, 130l, 131l, 133l, 135l, 47Sc, 72As, 72Se, 90Y, 88Y, 97Ru,
100pdι 101mRhι 119Sb) 128Baι 19 ^ 211^ 212^ 212pdj 109pd] 111 ,^ 67^ 68Ga) 67ClJι
75Br, 76Br, 77Br, 99mTc, 11C, 13N, 15O und 18F verwendet werden. Besonders bevorzugt sind 125l, 111ln , 99mTc und 18F.
Vorzugsweise wird der Wirkstoff an das Lektin, das Fragment oder das Derivat davon gebunden. Die Kopplung des Wirkstoffs erfolgt über kovalente Linker unter Verwendung einer geeigneten funktionellen Gruppe des Lektins ohne dessen biologische Funktion zu beeinträchtigen. Erforderlichenfalls kann diese funktionelle Gruppe durch Modifizierung des nativen Lektins, z. B. durch chemische oder gentechnische Methoden, eingeführt worden sein. Vorzugsweise erfolgt die Kopplung des Wirkstoffs über eine freie Stickstoff-Funktion des Lysins im Lektin.
Als Linker zur Ankopplung eines Wirkstoffes an das Lektin können grundsätzliche alle bekannten Linkermoleküle eingesetzt werden, die einen sicheren Transport des Wirkstoffs zum Zielort ermöglichen und eine Freisetzung des Wirkstoffs am Zielort ermöglichen. Ein geeigneter Linker zur Ankopplung der Signaleinheit bzw. des Wirkstoffs ist nicht-toxisch und beeinträchtigt weder das biologische Verhalten und die Spezifität des Lektins, des Fragments oder des Derivats davon noch die Aktivität des Wirkstoffes in erheblichem Maße. Bevorzugte Linker zur Kopplung von Metallionen wurden bereits oben angeführt.
Andere geeignete Linker können in Abhängigkeit von der Art der zur Kopplung vorgesehenen Substanz und der Art der reaktiven funktionellen Gruppe auf dem Lektin ausgewählt werden. Ein Reihe von Linkern zur Kopplung diagnostischer und therapeutischer Substanzen an verschiedene funktionelle Gruppen auf Proteinen sind im Stand der Technik bereits bekannt und können erforderlichenfalls für die speziellen erfindungsgemäßen Konjugate angepasst und eingesetzt werden.
Erforderlichenfalls wird dabei die spezifische Bindungsstelle des Lektins durch einen geeigneten, temporär bindenden und nach erfolgter Ankopplung wieder zu entfernenden Liganden geschützt. Hierbei kann es sich beispielsweise um spezifisch bindende Oligo- oder Polysaccharide handeln, die nach erfolgter Kopplung zum Beispiel durch Affinitätschromatographie wieder entfernt werden können. Bei dieser Schutzgruppe kann es sich beispielsweise um Chitobiose handeln.
Bei den erfindungsgemäßen Lektin-Wirkstoff-Konjugaten ist das Lektin, Fragment oder Derivat der zielsuchenden Einheit vorzugsweise so gestaltet, dass die pathologisch veränderte Endothelzelle das Lektin zuerst an ihre Glykokalix binden kann, dann das Lektin in die Zelle aufgenommen und wieder in den subendothelialen Bereich abgegeben werden kann, wonach eine selektive und zielgerichtete Aufnahme in den Krankheitsherd möglich wird.
Ein therapeutischer Effekt kann auch durch eine selektive Markierung der Endothelzelle mit anschließender Transzytose erzielt werden, so dass auf der subendothelialen Seite der vaskulären Gefäßwand eine hohe Wirkstoffakkumulation bzw. eine hohe Wirkstoffkonzentration erreicht wird. Die hohe Akkumulation erleichtert dann den passiven Wirkstofftransport in Richtung krankes Gewebe durch Diffusion.
Bevorzugt handelt es sich bei den zu behandelnden pathophysiologischen Zuständen im Gewebe um Entzündungs- oder Tumorerkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens eine Signaleinheit und mindestens ein Wirkstoff an dasselbe Lektin gekoppelt. Durch die gemeinsame Kopplung einer Signaleinheit und eines Wirkstoffs an ein und dasselbe Lektin wird eine diagnostische Verfolgung der Wirkstoffakkumulation im Körper eines Patienten möglich. In einem speziellen Aspekt der Erfindung können die Konjugate auch lediglich aus einer Kombination von zielsuchender Einheit, d. h. Lektin, Fragment oder Derivat davon, und therapeutischem Wirkstoff bestehen. Für diese Ausführungsform sind Kombinationen aller oben genannten Lektine, Fragmente und Derivate mit allen oben genannten Wirkstoffen möglich. Besonders bevorzugt sind hierfür die körpereigenen Lektine des Menschen und hier ganz besonders LOX-1 , die Leukozyten- und Makrophagen-Rezeptoren, das Elastin/Laminin-bindende Protein, CD11b/CD18, MBL, Thrombomodulin, Vitronectin und EpCAM.
Das molare Verhältnis zwischen Lektin, Fragment oder Derivat davon und der jeweiligen an das Lektin gekoppelten Signaleinheit bzw. des jeweiligen gekoppelten Wirkstoffes kann zur optimalen Erfüllung der speziellen Aufgabe des jeweiligen Lektinkonjugats in einem empirisch bestimmbaren Rahmen variiert werden. Derartige Optimierungsversuche liegen ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet.
Lektin, Signaleinheit und gegebenenfalls Wirkstoff können in getrennten Syntheseverfahren aufgebaut und nach Wunsch kombiniert werden. Durch diesen modularen Aufbau ist eine Variation der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Konjugate, z. B. ein Wechsel der Lektinspezifität, bequem möglich.
In einer speziellen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Lektinkonjugate auf der Oberfläche eines polymeren Trägers immobilisiert oder im Inneren eines polymeren Trägers eingeschlossen sein. Spezielle Beispiele solcher polymeren Träger sind Nano- oder Mikropartikel auf Polystyrol- oder Chitosanbasis, BSA/PLA (Polymilchsäure)-Mikropartikel oder Latexpartikel, z. B. aus Polystyrol. Die Größe des Polymerträgers ist dabei so gewählt, dass der normale Blutfluss in den Blutgefäßen durch die Anwesenheit des Lektin-Konjugats nicht gestört wird.
Auf diese Weise können hohe Konzentrationen der gewünschten Efffektoreinheit am Zielort erreicht werden. Die mit einer Signaleinheit gekoppelten erfindungsgemäßen Konjugate sind in verschiedenen bildgebenden diagnostischen Verfahren, vorzugsweise in der MRI („Nuclear resonance imaging") zum Nachweis spezifischer Targets, z. B. charakteristischer Kohlenhydratstrukturen oder spezifisch exprimierter Lektine, auf vaskulären Endothelzellen oder gegebenenfalls dem darunter liegenden Gewebe einsetzbar. In einem weiteren Aspekt kann die Endothel-Markierung für das MRI auch durch ein weniger selektiv wirkendes Lektin erfolgen, so dass das gesamte vaskuläre Endothelium vollständig durch das Lektin-Signaleinheit-Konjugat markiert wird und somit durch Bestimmung des Blutgefäßvolumens in einem gegebenen Volumenelement eine vollständige Abbildung der Blutgefäße möglich wird.
Figurenbeschreibung:
Fig. 1 Konzentrations-Wirkungs-Kurve der Verbindung 1 (LEA-DTPA-Gd) im Vergleich zu Omniscan [Aqua[5,8-bis(carboxymethyl)-11-[2,-(methylamino)-2-oxo- ethyl]-3-oxo-2, 5, 8, 11 -tetraazatridecan-13-oato-(3-)-N5, N8, Ni ! , O3, 05, 08, Oi ^ , d 3]- gadoliniumhydrat und Magnevist [1-Desoxy-1-(methylamino)-D-glucitol-dihydrogen- N,N-bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]-glycinato-(5-)-]gadolinat(2-)(2:1)]; die relative Signaländerung ist bezogen auf den Signalwert von PBS.
Fig. 2 MRI-Aufnahmen unter Verwendung des Latex-LEA-Konjugats 3.4 als Kontrastmittel und der Spin-Echo-Technik in der humanen Vena saphena magna: Vene (Kontrolle), ohne Kontrastmittel, Vene ist im negativen Kontrast zu erkennen; Vene (1 Woche), mit Kontrastmittel, Vene ist in der Draufsicht am rechten Rand des Röhrchens zu sehen; Vene (frisch), mit Kontrastmittel, Draufsicht auf den Venenquerschnitt; PBS als Negativkontrolle; Magnevist als Positivkontrolle
Fig. 3 MRI-Aufnahmen von Lebergefäßen der Maus unter Verwendung des Latex- LEA-Konjugats 3.4 als Kontrastmittel
Fig. 3A Lebergefäße der Maus im negativen Kontrast, kein Kontrastmittel
Fig 3B Substanz 3.4 als Kontrastmittel, Lebergefäße der Maus sind weiß, Kontrastmittel befindet sich in den Gefäßen (Konzentration 5,75 mg/ml)
Fig. 3C Kontrastmittel in der Maus mit 1 ml PBS herausgespült, Gefäße sind immer noch etwas weißlich gefärbt
Fig 3D Kontrastmittel mit 4 ml PBS herausgespült, Lebergefäße sind immer noch weiß und enthalten Kontrastmittel
In den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen werden einige bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung näher beschrieben. BEISPIELE
BEISPIEL 1 Synthese von LEA-DTPA-Gd (Substanz 1)
a) Herstellung von Nitriloessigsäuregadolinat, Trinatriumsalz (Gd(NTA)2Na3:
Gd2O3 + 6 HCI → 2 GdCI3 + 3 H2O
GdCI3 + 2 Na3NTA → Gd(NTA)2NA3 + 3 NaCI
2,10 g Gd2O3 (5,8 mmol) werden in 0,046 g HCI (37 %, 1 ,27 mmol) suspendiert und zum Sieden erhitzt. Zum vollständigen Auflösen wird tropfenweise weitere HCI (37 %) zugegeben bis die siedende Lösung klar wird. Die GdCI3-Lösung wird auf 60 ml verdünnt, und danach werden bei 40° C 6,38 g Na3NTA (23.2 mmol) zugegeben. Die Lösung wird auf 100 ml aufgefüllt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 3 M NaOH auf pH = 6 eingestellt.
b) Konjugation von DTPABA (Diethylentriaminopentaessigsäure-bisanhydrid)
10 mg LEA (1 ,41 x 10"4 mmol) werden in 0,22 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) in einem Eppendorff-Röhrchen gelöst. 11 ,2 mg DTPABA (0,031 mmol, 220facher Uberschuss) werden in 0,028 ml DMSO suspendiert und dann in 4 Portionen zur Proteinlösung gegeben. Zwischen den einzelnen Zugaben wird der pH-Wert durch den Zusatz von 3 M NaOH auf pH 8,5 eingestellt. Nach der letzten Zugabe wird die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
c) Komplexierung von Gd(lll)
Zur Entfernung von ungebundenem DTPABA wird die Reaktionslösung mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) durch Gelfiltration mit Citratpuffer (0,1 M; pH 6,5) aufgetrennt. Die Proteinfraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Proteinlösung werden mit 0,030 ml Gd(NTA)2-Lösung (Herstellung wie unter a)) versetzt und 24 h bei 4° C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)2 und freie H3NTA abzutrennen. Produkteigenschaften:
MGLektin 71.000 g/mol; das Konjugat wird mittels AAS und Proteinbestimmung charakterisiert.
BEISPIEL 2 LEA-DTPA-Gd, eingekapselt in Chitosan-Nanopartikel
Natrium-bis(ethylhexyl)sulfosuccinat (0,03-0,1 M) wird in 40 ml r/-Hexan gelöst. Zu dieser Lösung werden unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur 100 μl 0,1 % Chitosan-Essigsäure-Lösung, 200 μl LEA-DTPA-Gd-Lösung (unterschiedliche Konzentrationen), 10 μl Ammoniaklösung und 10 μl 0,01-1 ,0 %iger Glutaraldehyd- Lösung zugegeben. Die Reaktionslösung wird homogen und klar. Auf diese Weise bilden sich die Chitosan-Nanopartikel mit eingekapseltem LEA-DTPA-Gd-Konjugat. Beim nächsten Syntheseschritt wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der trockene Rückstand in 5 ml Tris-Cl-Puffer (pH = 7,4) im Ultraschallbad resuspendiert. Danach wird tropfenweise 1 ml 30 %iger CaCI2-Lösung zugegeben. Der Aktivator präzipitiert in Form von Calcium-Diethylhexylsulfosuccinat [Ca(DEHSS)2]. Das Präzipitat wird 30 Minuten bei 4 °C und 5000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wird verworfen und der Überstand, der die Nanopartikel enthält, wird isoliert und zweimal bei 60000 UpM jeweils für 2 h zentrifugiert. Das isolierte Pellet (mit den Nanopartikeln) wird in 5 ml Tris-Cl-Puffer (pH = 7,4) suspendiert und bei 4 °C aufbewahrt.
Das so hergestellte Kontrastmittel wird mittels AAS, FACS, SEM charakterisiert.
BEISPIEL 3 Synthese von LATEX-LEA-DTPA-Gd unter verschiedenen Bedingungen
I) Herstellung der Substanzen 3.1 , 3.2, 3.3 unter Verwendung von vorgefertigtem
LEA-DTPA-Gd-Konjugat:
2 mg Polystyrol-COOH (400 nm), 2 mg EDC [ = 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid-Hydrochlorid] und 0,73 mg LEA-DTPA-Gd-Konjugat (siehe Beispiel
1 ) (LEA-DTPA-Gd: EDC = 1 :1000) werden in 0,4 ml tridestilliertem Wasser (bzw. in Phosphatpuffer für Substanz 3.3; LEA-DTPA-Gd: EDC = 1 :100) gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 18 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Lösung abzentrifugiert und der Überstand, der das Polystyrol-LEA-DTPA-Gd-Konjugat enthält, mittels FPLC gereinigt. Im Falle der Substanzen 3.1 sowie 3.3 wird vor der FPLC-Reinigung nicht zentrifugiert.
II). Herstellung des Konjugats unter vorheriger Umsetzung des Polymers mit LEA (Substanz 3.4):
Der Aktivator und die ionischen Verunreinigungen in der Latex-Suspension werden durch Zentrifugieren (3 x 10 Min. bei 4000 UpM in PBS) getrennt. 36,0 mg Latex- Partikel werden in 4 ml PBS resuspendiert. Nach Zugabe von 35,0 mg EDC [1-(3- Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid] wird das Reaktionsgemisch 3.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des Aktivators durch Waschen (einmal 3 Min. bei 4000 UpM zentrifugieren) werden 10 mg LEA zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann einmal bei 4000 UpM zentrifugiert, um freies Lektin abzutrennen. Abschließend wird das Polymer in 1 ml PBS resuspendiert und bei 4° C aufbewahrt. Als nächster Arbeitsschritt wird die Konjugation mit DTPABA durchgeführt. Diese erfolgt analog den Schritten b) bzw. c) im Beispiel 1. Die Beladung mit Gadolinium (III) nach Beispiel 1 c) erfolgt mit 2 x 0,030 ml Gd(NTA)2-Lösung.
BEISPIEL 4 Synthese von PLA-LEA-Gadolinium-Konjugaten
a) Synthese von BSA/PLA-Mikropartikeln (Durchmesser ca. 2 μm)
260 mg Poly-(D, -Milchsäure) werden in 5 ml Dichlormethan gelöst und in 80 ml BSA-Lösung (25% Gew.Λ ol.) bei 24000 UpM, 3 Min. mittels Ultra Turrax T25 emulgiert. Die resultierende Emulsion wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es bilden sich feste Mikropartikel, die durch Zentrifugieren (3300 x g, 15 Min.) gesammelt und sechsmal mit tridestilliertem Wasser gewaschen werden. Die Suspensionen werden dann bei 4° C aufbewahrt. Die Mikropartikelkonzentration wird durch Abwiegen von 1 ,5 ml Suspension nach dem Lyophilisieren bestimmt. b) Herstellung der Konjugate:
Synthese von BSA/PLA-LEA-Gd (Substanz 4.1)
Prinzip: Das Lektin wird kovalent an BSA/PLA-Mikropartikel gebunden. Die Mikropartikel werden zuerst mit Glutaraldehyd (25 %ige wässerige Lösung) aktiviert und danach wird als zweiter Schritt die Inkubation mit LEA durchgeführt.
50 mg BSA/PLA-Mikropartikel werden durch Zentrifugieren (3300 x g, 10 Min.) in PBS (10 mM, pH = 7,4) gewaschen. Das Pellet wird beim Vortexen in 1 ml PBS resuspendiert. Danach wird 1 ml 25 %iger wässerige Glutaraldehyd-Lösung zugegeben und das Gemisch wird zur Aktivierung der Aminogruppen 6 h geschüttelt. Zur Abtrennung von nicht reagiertem Glutaraldehyd wird die BSA/PLA-Suspension abzentrifugiert und noch viermal mit PBS (10 mM, pH 7,4) gewaschen. Anschließend wird 0,25 mg LEA in PBS zu 1 ml BSA/PLA-Suspension zugegeben. Die Reaktionslösung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das LEA- Mikropartikel-Konjugat wird dann zentrifugiert, erneut in 1 ml PBS suspendiert und bei 4° C gelagert.
Die Menge an gebundenem Lektin wird mit der Differenzmethode (Lektin im Ansatz/Lektin im Überstand nach der Konjugation) ermittelt. Die Proteinbestimmung erfolgt nach der Amidoschwarzmethode.
Konjugation mit DTPA:
Zu 0,5 ml der Mikropartikelsuspension werden 3,5 mg DTPABA (0,009 mmol, 220facher Uberschuss) in 0,007 ml DMSO zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 3 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Die Suspension wird 1 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
Komplexierung von Gd(lll):
Das Reaktionsgemisch wird 3 Minuten lang bei 4000 UpM abzentrifugiert. Das Pellet wird verworfen und der Überstand, enthaltend die Mikropartikel, wird mittels FPLC gegen Citratpuffer (0,1 M; pH = 6,5) aufgetrennt. Die BSA/PLA-LEA-Fraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Lösung werden mit 3 x 0,030 ml Gd(NTA)2-Lösung versetzt und 24 h bei 4 °C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)2 und freie H3NTA abzutrennen.
Synthese von BSA-Gd/PLA-LEA-Gd (Substanz 4.2):
Zuerst wird das für diese Verbindung benötigte BSA-DTPABA-Gd-Konjugat folgendermaßen hergestellt.
20 mg BSA (0,3 x 10"3 mmol) werden in 0,44 ml HEPES-Puffer (0,1 M; pH = 8.8) in einem Eppendorff-Röhrchen gelöst. 23,6 mg DTPABA (0,066 mmol, 220facher Uberschuss) werden in 0,059 ml DMSO suspendiert und dann in drei Portionen zur Proteinlösung gegeben. Zwischen den Zugaben wird der pH-Wert durch Zugabe von 3 M NaOH auf pH = 8.5 eingestellt. Nach der letzten Zugabe wird noch weitere 2 h bei Raumtemperatur nachgerührt.
Zur Entfernung von ungebundenem DTPABA wird die Reaktionslösung mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) durch Gelfiltration mit Citratpuffer (0,1 M; pH = 6.5) aufgetrennt. Die Proteinfraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Proteinlösung werden mit 0,056 ml Gd(NTA)2-Lösung (0,016 mmol) versetzt und 24 h bei 4° C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)2 und freie H3NTA abzutrennen.
50 mg BSA-DTPA-Gd/PLA-Mikropartikel werden durch Zentrifugieren (3300 x g, 10 Min.) in PBS (10 mM, pH = 7,4) gewaschen. Das Pellet wird beim Vortexen in 1 ml PBS resuspendiert. Danach wird 1 ml 25 %iger wässeriger Glutaraldehyd-Lösung zugegeben und das Gemisch wird zur Aktivierung der Aminogruppen 6 h geschüttelt. Zur Abtrennung von nicht reagiertem Glutaraldehyd wird die BSA-DTPA-Gd/PLA- Suspension abzentrifugiert und noch viermal mit PBS (10 mM, pH 7,4) gewaschen. Anschließend werden 0.25 mg LEA zu 1 ml BSA-DTPA-Gd/PLA-Suspension zugegeben. Die Reaktionslösung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das LEA-BSA-DTPA-Gd-Mikropartikel-Konjugat wird dann zentrifugiert, erneut in 0,5 ml PBS suspendiert und bei 4° C gelagert. Konjugation mit DTPA:
Zu der Mikropartikelsuspension (0,5 ml) werden 3,5 mg DTPABA (0,009 mmol, 220facher Uberschuss) in 0,007 ml DMSO zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 3 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Die Suspension wird 1 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
Komplexierung von Gd(lll):
Das Reaktionsgemisch wird 3 Minuten lang bei 4000 UpM abzentrifugiert. Das Pellet wird verworfen und der Überstand, enthaltend die Mikropartikel, wird mittels FPLC gegen Citratpuffer (0,1 M; pH = 6,5) aufgetrennt. Die BSA/PLA-LEA-Fraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Lösung werden mit 3 x 0,030 ml Gd(NTA)2-Lösung versetzt und 24 h bei 4 °C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt , um ungebundenes Gd(NTA)2 und freie H3NTA abzutrennen.
Die Menge an gebundenem Lektin wird mit der Differenzmethode (Lektin im Ansatz/Lektin im Überstand nach der Konjugation) ermittelt. Die Proteinbestimmung erfolgt nach der Amidoschwarzmethode.
BEISPIEL 5
Immobilisierung von Lektinkonjugaten auf der Oberfläche eines polymeren Trägers
Als Träger werden Polykondensate der chelatisierenden Verbindung DTPABA mit jeweils [N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin)], Ethylendiamin, Hexamethylendiamin und Ethylenglykol hergestellt. Die Kettenlänge der Polykondensate variiert zwischen n = 5-9 Einheiten.
I . Polykondensation:
0,7146 g DTPABA (2 mmol) werden in 10 ml DMSO (abs.) in einem 100-ml- Rundkolben mit Öffnung für Inertgas gelöst. 0,3264 g Bicin bzw. bifunktionales Reagenz (2 mmol) werden zugegeben und das Gemisch wird 72 h lang unter N2 gerührt. Das Polykondensat wird in der 10fachen Menge Aceton präzipitiert, filtriert und mit Aceton gewaschen. Das Produkt wird in Wasser gelöst und nochmals mit Aceton (lOfache Menge) präzipitiert, filtriert und gewaschen. Dann wird es bei 40 ° C unter Vakuum bis zum konstanten Gewicht getrocknet.
II. Konjugation der Polykondensate mit LEA (Lycopersicon esculentum agglutinin):
10 mg LEA (1 ,41 x 10'4 mmol) werden in 0,50 ml Phosphatpuffer (0,1 M; pH 7,4) in einem Eppendorff-Röhrchen gelöst und anschließend werden 10 mg Polykondensat zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 3 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Danach wird die Lösung 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
III . Komplexierung der Polykondensate mit Gadolinium:
Zur Entfernung ungebundener Substanzen werden die Reaktionslösungen mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) durch Gel-Filtration mit Citratpuffer (0,1 M; pH = 6,5) aufgetrennt. Die Proteinfraktion mit dem kovalent gebundenen Polykondensat wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Proteinlösungen werden mit jeweils 120 μl Gd(NTA)2 Lösung (0,016 mmol) versetzt und bei 4 ° C 24 h lang gerührt. Anschließend werden die Lösungen lyophilisiert, in destilliertem Wasser gelöst und mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)2 und freie H3NTA abzutrennen.
Alle Verbindungen werden mittels 1H-, 13C-NMR, Massenspektrometrie, AAS oder Proteinbestimmungen charakterisiert.
BEISPIEL 6 Anwendung in der MRI-Diagnostik
a) Messungen der Relaxation
Die Verdünnungsreihen der verschiedenen Substanzen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,4) hergestellt; die Konzentrationen lagen zwischen 10"6 M und 1 ,0 M. PBS wurde als Standard verwendet. Die gelöste Testsubstanz wurde als 30- bis 100-nM-Aliquot in ein Eppendorff-Kunststoffröhrchen gefüllt und in der Detektorspule für die MRI-Messungen positioniert. Die molare Konzentration wurde im Falle der Makromoleküle auf Basis des Trägers, für den die analytischen Daten bekannt sind, und unter Berücksichtigung des molaren Verhältnisses zwischen Träger und Gadolinium berechnet. Für die kleinen Moleküle, wie z. B. Gd-DTPA oder kleinere Polymere, wurde die molare Konzentration auf der Basis des absoluten Molekulargewichts der entsprechenden Substanz bestimmt. Im Falle der Nanopartikel wurde die Konzentration der Nanopartikel-Suspension und die absolute Menge an Gadolinium, bezogen auf die Gesamtoberfläche des Nanopartikels im Gesamtvolumen, als Basis für die Berechnung der Konzentration in der Lösung verwendet.
Relaxationen wurden berechnet, indem die Signalverstärkung, die in PBS gemessen worden ist, mit den Werten, die in den graduell verdünnten Konzentrationsreihen der Gd-DTPA-Verbindungen erzielt worden sind, verglichen wurden.
Resultate:
Substanz 1 (LEA-DTPA-Gd): MRI-Daten: SE (Spin-Echo) = 950 % bei 1 x 10"3 M, kein SE bei 1 x 10"5 .
Aus der Konzentrations-Wirkungs-Kurve (Fig. 1 ) ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäße Verbindung 1 eine Signalerhöhung bei geringeren Konzentrationen als Omniscan und Magnevist bewirkt.
MRI-Bilder: bei 1 x 10"4 M schwache Abbildung der Lebervenen der Maus (Spin- Echo- und Flash-3D-Technik).
Substanz 2: MRI-Daten: SE = 110 % bei 1 x 10'4 M, kein SE bei 1 x 10"5 M. MRI- Bilder der Lebervene der Maus in Spin-Echo-Technik.
Substanz 3.4: MRI-Bilder, siehe Fig. 2 und 3.
b) Venendarstellungen
Die humanen Venen wurden bei der operativen Behandlung von varikösen Venen entfernt. Sie wurden sofort in 2,5 %igem Glutaraldehyd, gepuffert mit PBS, eingelegt. Nach der Fixierung in dieser Lösung für 18 bis 24 Stunden bei 4°C wurden die Venen in PBS überführt und bis zu 6 Wochen bei +4°C gelagert. Bei der Operation wird die Vene umgestülpt, was zu Folge hat, dass das Endothel im Gegensatz zur natürlichen Ausrichtung unter physiologischen Bedingen nach außen gerichtet ist.
Kurz vor der Untersuchung im MRI wurden die Venen in 2 cm große Fragmente geschnitten, in 0,15 M Ammoniumchlorid-Lösung für zwei Stunden bis zu einer Woche bei 4°C eingelegt, danach für mindestens eine Stunde in PBS mit 0,1 % HSA, 0,1 mM Calciumionen und 0,1 mM Magnesiumionen (PBS Inc.) gelagert. Danach wurden die Venen eine Stunde in PBS-Inα, das 10 mg/ml Latex-400-LEA-Gd (Substanz 3.4) enthielt, eingelegt. Als Kontrolle diente eine Vene, die in PBS-Inc. ohne Zusatz von Additiven eingelegt worden war.
MRI-Untersuchungen wurden durchgeführt während die Venensegmente in PBS Inc. oder in PBS Inc. mit Substanz 3.4 eingelegt waren. Danach wurden die Venen in 5 ml PBS Inc. als Spülung gelegt, es wurde zwei Minuten geschüttelt, danach wurde die Vene ein weiteres Mal mit PBS Inc. gespült und erneut im MRI untersucht.
MRI-Experimente wurden unter Verwendung der Spin-Echo-Frequenz und anschließend unter Verwendung der FLASH-3D-Sequenz durchgeführt.
Die Daten wurden in Form digitaler Bilder so aufgezeichnet, das quantitative Daten aus den Bildern extrahiert werden können.
In Fig. 2 sind die Ergebnisse der MRI-Messung unter Verwendung des Latex-LEA- Konjugats 3.4 in der humanen Vena saphena magna zu erkennen. Diese zeigen deutlich die Anlagerung des erfindungsgemäßen Konjugats an das Endothel der Vena saphena magna.
c) Perfusion der Maus
Jede Maus wurde mit Ketamin und Rompun narkotisiert, dann wurden kleine Venflons in eine der Carotis-Arterien und in eine der Jugularvenen eingeführt. Die Maus wurde dann in ein Falconröhrchen, das an einem Ende geöffnet war, um den Eintritt von Luft zu gewährleisten, eingebracht und das Falconröhrchen wurde innerhalb der Detektorspule des MRI-Geräts positioniert. MRI-Messungen wurden von verschiedenen Organen der Maus (Gehirn, Darm, Leber, Niere und Lunge) vor der Perfusion mit der Testsubstanz durchgeführt. Die Perfusion von 0,2 ml der Testsubstanz innerhalb von 60 Sekunden wurde direkt mittels MRI verfolgt. Nach der MRI-Messung wurde die Maus durch Perfusion mit L15 in verschiedenen Volumina zwischen 1,0 und 2,5 ml in die Jugularvene durchgespült. Die Maus wurde sofort wieder im Detektor platziert und die MRI-Messungen wurden erneut durchgeführt.
Als Beispiel zur Anwendung des Latex-Konjugats 3.4 sind in Fig. 3A bis 3D 4 MRI- Aufnahmen von der Leber der Maus dargestellt. Aus diesen Aufnahmen ist deutlich die Kontrastierung der Blutgefäße in der Leber durch Einsatz einer erfindungsgemäßen Verbindung zu erkennen. Ferner zeigt sich, dass trotz vollständigen Spülens des Blutgefäßsystems der Maus das Kontrastmittel in den Blutgefäßen verbleibt (Fig. 3C und 3D).

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Konjugat, umfassend mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens eine Signaleinheit sowie gegebenenfalls mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein L-Selektin ist, und die Signaleinheit ein Lanthanidenion umfasst.
2. Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an charakteristische Kohlenhydratstrukturen der Glykokalix von durch pathophysiologische Vorgänge veränderten Endothelzellen bindet.
3. Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an spezifische Lektine auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet.
4. Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der zielsuchenden Einheit um ein Lektin viralen, bakteriellen, pflanzlichen, tierischen oder humanen Ursprungs handelt.
5. Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass an das Lektin, Fragment oder Derivat davon ein divalenter Zucker gebunden ist, welcher eine selektive Bindungsaffinität für spezifische Lektine auf der Oberfläche von Endothelzellen besitzt.
6. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an endotheliale Marker für Entzündungskrankheiten bindet.
7. Konjugat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an VCAMPGPI, Klasse I MHC Antigen, ICAM-1 , VCAM-1 , ELAM-1 , E- Selektin, P-Selektin oder VLA-4 bindet.
8. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an für Tumorzellen charakteristische endotheliale Marker bindet.
9. Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an die Zelloberflächenmoleküle 4Ff2, EndoGlyx-1 , Endoglin oder Endosialin bindet.
10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 -9, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit monovalent ist.
11. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lektin LEA, ein fukose-spezifisches Lektin wie UEA-1, ein mannose- bindendes Lektin wie MBL oder ConA, ein galactosid-bindendes Lektin wie GSA-1 B4, ein sialinsäure-bindendes Lektin wie LFA ist, oder dass das Lektin ein körpereigenes Lektin des Menschen wie LOX-1 , Thrombomodulin, Endosialin, Endoglyx oder Galektin-1 ist.
12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Lanthanidenion ein Gadolinium- oder Europiumion ist.
13. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektoreinheit einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, der aus cytotoxischen und cytostatischen Substanzen ausgewählt ist.
14. Konjugat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der therapeutische Wirkstoff aus Radionukliden, Metallkomplexen, Alkylantien, Antibiotika, Antimetaboliten, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Mitose- Hemmern, Toxinen, rekombinanten Proteinen oder Vektoren für Gen- Transfektionen ausgewählt ist.
15. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektoreinheit ein chelatbildendes Molekül umfasst.
16. Konjugat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das chelatbildende Molekül Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), 1 ,4,7,10-Tetraazacyclododecan- Λ/, V,/V,/V-tetraessigsäure (DOTA), Deferoxamin (DFO) oder ist.
17. Konjugat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektoreinheit mehrere chelatbildende Moleküle umfasst, die über ein bifunktionales Brückenmolekül aneinander gekoppelt sind.
18. Konjugat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das bifunktionale Brückenmolekül aus Diolen, z. B. Ethylenglykol, 1 ,3-Propylenglykol oder Λ/,Λ/,- Bis-(2-hydroxyethylglycin), oder Diaminen, z. B. Ethylendiamin, 1 ,3- Propylendiamin oder 1 ,6-Hexamethylendiamin, ausgewählt ist.
19. Konjugat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Chelator- Einheit an natürlich vorkommende Polymere oder Fragmente davon, wie z.B. Chitosan, Dextran oder Polylysin, gekoppelt ist.
20. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat auf der Oberfläche eines polymeren Trägers immobilisiert ist oder im Inneren eines polymeren Trägers eingeschlossen ist.
21. Konjugat nach Anspruch 20 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem polymeren Träger um Nano- oder Mikropartikel auf Polystyrol- oder Chitosanbasis, um BSA/PLA-Mikropartikel oder um Latexpartikel handelt.
22. Konjugat nach einem der Ansprüche 1-21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat ein LEA-DTPABA-Gd-Konjugat oder LEA-DTPA-Gd-Konjugat ist.
23. Zusammensetzung, enthaltend ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1-22 sowie gegebenenfalls zusätzliche therapeutische Wirkstoffe, signalerzeugende Komponenten, physiologisch annehmbare Träger und Hilfsstoffe.
24. Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 1-22 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 23 in einem bildgebenden Verfahren.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Verfahren MRI ist.
26. Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 22 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 23in einem therapeutischen Verfahren.
27. Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 1-22 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 23 in einem therapeutischen Verfahren, bei dem gleichzeitig die Wirkstoffakkumulation im Körper des Patienten verfolgt wird. _ . . . -- .. - - . . . -
28. Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1-22, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine wässerige Lösung des Komplexsalzes eines Lanthanidenelements hergestellt wird, b) das gewünschte Lektin, Fragment oder Derivat mit einem chelatbildenden Molekül konjugiert und ungebundenes chelatbildendes Molekül entfernt wird, und c) das konjugierte Lektin mit der Lanthanidensalz-Lösung umgesetzt wird, um das Lanthanidenion über das chelatbildende Molekül an das Konjugat zu binden, d) gegebenenfalls ein therapeutischer Wirkstoff an das Lektin oder an das Konjugat nach Schritt c) gebunden wird.
29. Herstellung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Komplexsalz des Lanthanidenelements Nitriloessigsäuregadolinat- Trinatriumsalz (Gd(NTA)2Na3) ist, das Lektin LEA ist und das chelatbildende Molekül aus der Gruppe bestehend aus EDTA, DTPA, DTPABA und DFO ausgewählt ist.
0. Konjugat, umfassend mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein Erdnuß-Lektin, Lektinextrakt der Orangenschale, Maciura pom/fera-Lektin, Dolichos b/7/orιys-Agglutinin oder Sojabohnen-Agglutinin ist.
EP04739672A 2003-06-06 2004-06-07 Lektin-konjugate Withdrawn EP1635879A2 (de)

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