CN107315056B - 测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法 - Google Patents

测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107315056B
CN107315056B CN201710553631.XA CN201710553631A CN107315056B CN 107315056 B CN107315056 B CN 107315056B CN 201710553631 A CN201710553631 A CN 201710553631A CN 107315056 B CN107315056 B CN 107315056B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dtpa
rat
plasma
column
biological sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710553631.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107315056A (zh
Inventor
郭继芬
孟繁华
虞林
李照丰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wan Shu (beijing) Medical Science And Technology Co Ltd
Original Assignee
Wan Shu (beijing) Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wan Shu (beijing) Medical Science And Technology Co Ltd filed Critical Wan Shu (beijing) Medical Science And Technology Co Ltd
Priority to CN201710553631.XA priority Critical patent/CN107315056B/zh
Publication of CN107315056A publication Critical patent/CN107315056A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107315056B publication Critical patent/CN107315056B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及测定大鼠血浆生物样品中的DTPA‑Ca的方法。具体的说，本发明涉及测定大鼠血浆生物样品中的DTPA‑Ca的方法，该方法使用液相色谱‑串联质谱法测定经处理的大鼠血浆生物样品中的DTPA‑Ca的含量，包括如下步骤：(1)生物样品的处理，(2)液相色谱‑串联质谱测定，(3)数据处理与分析。本发明方法呈现出如本发明说明书所述优异效果，例如，本发明方法具有优异的色谱分离效果，以及具有优异的目的物质回收率。

Description

测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种可靠的方法用以测定生物体例如人、大鼠给予上述DTPA-金属螯合剂后生物样品例如血、尿等中的上述金属螯合剂的含量，以评估这些金属螯合剂的治疗效果或其在体内的行为。
特别地，本发明涉及一种测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法。
背景技术
铅污染以及铅中毒对人体健康的危害已经受到广泛关注。铅是人体非必需元素，主要通过呼吸道、消化道进入人体吸收，能够在体内蓄积，对全身各系统和器官有毒性作用，主要影响神经、消化、血液系统，铅污染和铅中毒是需要重点解决的公共卫生问题[HaoFT,Du XQ,Niu YM,et al.Progress in research of the lead intoxication[J].Chin JInd Med(中国工业医学杂志),2008,21:200-202.1；Zhou QQ,Hu FF,Xia CY,et al.Studyprogress on health hazards in occupational lead-exposed workers[J].Chin J IndMed(中国工业医学杂志),2013,26:353-356]。在治疗方面，依地酸二钠钙被作为首选药物用于临床[Zhou JY,Duan Z,Deng JX,et al.Clinical observation on chronic leadpoisoning treated with different dosages of CaNa-EDTA[J].Occup Health EmergResue(职业卫生与应急救援),2002,20:159-160]。依地酸二钠钙治疗铅中毒有良好的疗效，但在络合铅的同时，也络合排出体内的锌、钙、锰、铁、铜等，会造成体内必需微量元素的平衡失调，出现毒副作用，最重要的毒副作用是锌缺失引起的肾损害。
Ca-DTPA(又可记作DTPA-Ca)又名二亚乙基三胺五乙酸三钠钙盐和Zn-DTPA(又可记作DTPA-Zn)又名二亚乙基三胺五乙酸三钠锌盐，二者同属氨羧络合剂，于2004年8月由美国FDA批准同时上市，用于进入放射性核素严重污染场所工作或停留前以及放射性核素沾染后的治疗[Cada DJ,Levien T,Baker DE.Pentetate calcium trisodium(Ca-DTPA)andpentetate zinc trisodium(Zn-DTPA)[J].Hospital pharmacy,2005,40:65-71]。Zn-DTPA与Ca-DTPA在体内能选择性地与放射性核素镧(140La)、铈(144Ce)、钷(147Pm)、镅(124Am)、钚(239Pu)等的阳离子形成稳定性的可溶性络合物，很快经肾脏排出体外，从而减少了体内放射性物质的沉积量。由于Ca2+同DTPA的络合常数要小于Zn2+[Xue HL.The chelatortreatment of common metal intoxication[J].Chem Ind Occup Saf Health(化工劳动保护),1989,10:22-26]，Ca-DTPA中DTPA更易于与核素的阳离子络合，因此其促排作用强于Zn-DTPA。但毒理学研究显示，Ca-DTPA易造成内源性的锌缺失，从而使得与锌有关的酶的活性受到严重的影响，其中包括DNA与RNA聚合酶、羧肽酶、碳酸酐酶等，可造成肝肾、肠黏膜的损伤和造血抑制等不良反应[Shen BY,Ruan TM,Wu DC.Effect of Zn-DTPA on thedecorporation of ultra-Uranium,ultra-Plutonium and Lanthanide and itsapplication[J].Foreign Med Sci(Radit Med Nucl Med)[国外医学(放射医学核医学分册)],1988,12:70-74；Zhao XC,Wu DC.Toxicity of DTPA and its application on thedecorporation of nuclide[J].Foreign Med Sci(Radit Med)[国外医学(放射医学分册)],1980,4:211-215]。Zn-DTPA的安全性较高，虽也能造成锰和镁等微量元素的缺失，但不会引起缺锌而产生严重的毒副作用，其毒性约为Ca-DTPA的1/10～1/30[Zhang ZY,XuXW,Zhu Z.Pentetate zinc trisodium[J].Chin Pharm J(中国药学杂志),2007,42:557-558]。
已有文献采用石墨炉原子吸收分光光度计法测定铅含量，考察了Zn-DTPA对慢性铅中毒小鼠的促排作用[Yang S,Chen L,Yin YY,et al.Study of the effect ofpentetate zinc trisodium on excretion of lead in lead poisoned mice[J].PharmJ Chin PLA(解放军药学学报),2011,27:147-149]，然而石墨炉原子吸收分光光度计法测定方法复杂、成本高、灵敏度低，对于例如血、尿等生物样品中的量难以满足测定要求。
另外，还有文献[陈立，等，ICP-MS法分析Zn-DTPA对铅中毒小鼠的促排作用，药学学报(Acta Pharmaceutica Sinica)2014,49(11):1588-1592]报道，应用电感偶合等离子体质谱(ICP-MS)测定生物样本中铅的浓度，考察核素促排药Zn-DTPA对铅中毒小鼠的促排作用。小鼠一次性腹腔注射乙酸铅溶液，每只染铅1mg，建立急性铅中毒模型，染铅后4h腹腔注射Zn-DTPA，连续给药5天。同时设正常对照组、染铅模型组、Zn-DTPA与Ca-DTPA联用组。每天收集尿液，在实验的第2、4和6天分别处死部分小鼠，取全血、双侧股骨、脑，消解处理后，用ICP-MS测定铅含量。据信结果表明Zn-DTPA能显著增加尿铅的排出，降低血液、股骨和脑组织中的铅含量。
然而，由于DTPA-Ca和DTPA-Zn不但可以用于排除体内重金属铅，还可以排除体内的镧、铈、钷、镅、钚等重金属甚至作为临床应用药品还可用于确诊或疑似被钚、镅、钜体内污染受试者的治疗，并提高这些金属元素的清除速率。在如此广泛的应用环境下，仅仅考察铅在体内的分布和含量显然不足以评价DTPA这种金属螯合剂的体内行为。
因此，本领域仍然期待有可靠的方法来测定生物体例如人、大鼠给予上述金属螯合剂后生物样品例如血、尿等中的上述金属螯合剂的含量，以评估这些金属螯合剂的治疗效果或其在体内的行为。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可靠的方法来测定生物体例如人、大鼠给予上述金属螯合剂后生物样品例如血、尿等中的上述金属螯合剂的含量，以评估这些金属螯合剂的治疗效果或其在体内的行为。已经出人意料的发现，使用本发明液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法，能够有效的实现上述目的。特别是，本发明使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca，呈现出优异的方法学特征。本发明因此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面涉及一种测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法，该方法使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定经处理的大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的含量，包括如下步骤：
(1)生物样品的处理：
(1a)取含有或不含有DTPA-Ca的大鼠血浆50μL，置于1.5mL离心管中，加内标溶液即25μg/mL的EDTA-Zn水溶液10μL或者不加内标溶液，0.1％氨水50μL，100μg/mL氯化锌溶液400μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上；
(1b)上样后依次用1mL水、1mL甲醇清洗，最后用含5％氨水的甲醇1mL洗脱；
(1c)收集该洗脱液，吹干，用含0.05％氨水的50％甲醇150μL复溶，吸取20μL进行LC-MS/MS分析；
(1d)标准曲线的制备：取不同浓度的DTPA-Ca标准系列溶液分别加至空白大鼠血浆中，配制成相当于浓度为1、2、5、10、20、50、100、和200μg/mL的标准曲线血浆样品；取该血浆样品50μL，依次加入内标溶液10μL，0.1％氨水50μL，100μg/mL氯化锌溶液400μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上，接着照以上(1b)和(1c)操作，根据LC-MS/MS分析结果绘制标准曲线，该标准曲线用于计算各种样品中的目标物质含量；
(2)液相色谱-串联质谱测定：
(2a)提供高效液相色谱仪和串联质谱仪，所述高效液相色谱仪配备梯度泵和进样器，所述串联质谱仪配备电喷雾离子源和数据处理系统；
(2b)色谱条件：所用的分析柱为SHISEIDO Proteonavi品牌的色谱柱(其规格例如为5μm，250×4.6mm I.D.)，柱前连接C18保护柱(其规格例如为4×3.0mm I.D.，例如美国Phenomenex公司的保护柱)，柱温25℃，流动相为甲醇-2mM甲酸铵(例如，其中含0.03％氨水)(50:50，v/v)，流速0.45mL/min；
(2c)质谱条件：电喷雾离子化源(例如使用Turbo Ionspray源)，负离子方式检测；喷射电压为-4000V；源温度为400℃；卷帘气(CUR)为20；碰撞气(CAD)为4；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应分别为用于定量分析的离子反应分别为m/z 226.6→m/z 204.5、m/z 454.2→m/z 364.3(DTPA-Zn，CE分别为-15V、-36V)和m/z 444.2→m/z319.2(内标EDTA-Zn，CE为-34V)，扫描时间为150msec；
(3)数据处理与分析
(3a)通过上述液相色谱-串联质谱测定得到生物样品中的目标物质含量；和，任选的
(3b)用非房室模型计算选自下列的一下或多个药动学参数：Cmax、Tmax、t1/2、MRT、AUC0-t、Vz、CL；其中，Cmax为实测的最大血药浓度，Tmax为口服给药后血药浓度达峰时间，t1/2为药物末端消除半衰期，MRT为药物在体内平均滞留时间，血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t由梯形法计算得到，Vz为稳态时表观分布容积，CL为清除率；以及，任选的
(3c)计算给药的生物利用度：在等当用药剂量下，用第二给药方式所得AUC值除以第一给药方式所得AUC值再乘以100％所得百分数，作为第二给药方式相对于第一给药方式的相对生物利用度。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述大鼠血浆是从给予或未给予Ca-DTPA的大鼠静脉血置于含肝素钠的离心管中，2000～4000g离心10～30min(例如3000g离心20min)获得的血浆。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所获得的大鼠血浆任选的被置于-20℃冰箱中冻存，以等待测定。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述大鼠静脉血是从大鼠眼眶静脉窦采血获得的。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所用的内标为EDTA-ZnNa2·xH2O。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述固相萃取小柱在上样前，先用2×1mL甲醇活化，再用2×1mL水平衡。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述大鼠例如是Sprague-Dawley(SD)大鼠，本领域通常简称为SD大鼠。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述高效液相色谱仪例如是美国安捷伦公司Agilent 1200型液相色谱仪。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述串联质谱仪例如是美国AB Sciex公司API 4000型串联质谱仪；例如其配有Turbo Ionspray离子化源以及Analyst1.5数据处理系统。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述用于药动学参数计算用的软件为软件，例如其版本为5.2.1版。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(3a)中，各组的参数均用平均数据即“均数±标准差”的方式表示；进一步的，所述平均数据是以样本数大于等于3所得的平均数。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述第二给药方式相对于第一给药方式的相对生物利用度，以F(相对)％表征，该F(相对)％是通过以下计算式算得的：
上式中：
AUC是曲线下面积(其单位例如是h*μg/mL)，
D是给药剂量(其单位例如是mg/kg)。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，当所述第一给药方式是静脉注射给药(即静注给药)时，所述第二给药方式相对于该静注给药方式而言的生物利用度为其绝对生物利用度，即以F(绝对)％表征，该F(绝对)％是通过以下计算式算得的：
例如，气管吸入给药相对于静脉注射给药的绝对生物利用度F(绝对)％可用下式计算：
又例如，气管吸入给药相对于肌内注射给药的相对生物利用度F(相对)％可用下式计算：
在本发明中，Proteonavi色谱柱是一种采用在多孔球形硅胶填料表面键合丁基(C4)的高性能蛋白质-多肽分析专用色谱柱，该填料既具有硅胶类填料的高分离能力和耐压性，又具有耐酸性、抑制蛋白质的吸附等特长。该色谱柱有时以Proteonavi s5标示。尽管本发明分析的DTPA金属络合剂是一种典型的小分子物质，分子量远小于普通的蛋白质-多肽，然而，已经出人意料的发现，本发明仅在使用上述Proteonavi色谱柱的色谱柱的条件下本发明方法才能获得优良的方法学性能。例如，在使用YMC-C18、Agilent Extard-C18、资生堂PAK CR-18(其与本文所用Proteonavi柱是同一生产商)等C18柱时，DTPA金属络合物极其难以洗脱下来，例如在使用本发明色谱条件但改用这些C18柱时DTPA-Za的保留时间大于38min且拖尾严重，然而无法解释的是内标物质却并未如此严重的延长保留时间(在不同的C18柱上保留时间约在5～6min之间)。又例如，在使用ZORBAX EDIPSR-C8、Dikma钻石-C8、费罗门Gemini-C8等C8柱时，DTPA金属络合物在色谱柱中不保留，即保留时间极其短暂，例如在使用本发明色谱条件但改用这些C8柱时DTPA-Za的保留时间小于1.5min且与容易与溶剂等混杂在一起而无法获得有效分离。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述固相萃取小柱是型号为WAX的固相萃取小柱，其例如购自Waters公司。Waters Oasis WAX固相萃取小柱在商业上通常是设计作为混合型弱阴离子交换反相吸附剂，对强酸性化合物具有高的选择性和灵敏度的固相萃取小柱。已经出人意料的发现，仅在当使用上述Oasis WAX型固相萃取小柱的情况下，本发明方法才能获得优良的方法学性能。而当改用其它品牌的固相萃取小柱例如美国艾杰尔的Cleanert PWAX固相萃取小柱、StrataTM-X固相萃取小柱以及甚至是同一厂商的Oasis MAX型固相萃取小柱时，远远无法获得上述Oasis WAX型固相萃取小柱所获得的优良结果。例如在照下文表2结果所涉及的方法进行试验时，用上述三种其它品牌/型号的固相萃取小柱时，回收率2μg/mL、18μg/mL、180μg/mL三种浓度回收率分别在74～79％、83～87％、84～93％范围内且各种小柱在三种不同浓度下所得RSD在17～32％范围内波动，这种不同浓度下回收率呈现巨大差异且RSD大范围波动的结果在生物样品分析中是不可接受的。另外，在进行生物样品处理时，在将样品上样到固相萃取小柱后，用含少量氨水的洗脱液进行洗脱是必要的，否则各浓度下的回收率比之于本发明下文表2回收率结果低20个百分点以上。
在本发明上述操作方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的实例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
DTPA金属络合剂，例如DTPA的钙金属络合剂或者DTPA的锌金属络合剂，它们的体外检测，例如在一些化学制品、制剂中的检测，仍然是目前本领域技术人员遇到的一项巨大检测难题，而它们体内生物样品中的检测难度更是远远的比体外检测困难。特别是，目前国内外都没有这些化合物体内分析的报导。
DTPA的钙金属络合剂，可缩写为Ca-DTPA或者DTPA-Ca，其通常亦称为Ca-DTPA(DTPA-CaNa3)；DTPA的锌金属络合剂，可缩写为Zn-DTPA或者DTPA-Zn，其通常亦称为Zn-DTPA(DTPA-ZnNa3)。
Ca-DTPA、Zn-DTPA以及本发明中使用到的内标物质EDTA-Zn(为其二钠盐水合物EDTA-Zn Na2·xH2O)的分子式分别为以下式A、式B和式C：
其中，Ca-DTPA可以静脉注射和吸入给药，分别以注射剂和粉吸入剂制剂形式提供于临床，首批样品于2004年在美国获得批准。Ca-DTPA在临床上的适应症与应用为：Ca-DTPA作为一种缓解放射螯合剂被用于确诊或疑似被钚、镅、钜体内污染受试者的治疗，并提高这些金属元素的清除速率。
Ca-DTPA的剂量与给药方面，FDA的规范要求在受污染24h内给予首剂量的Ca-DTPA进行治疗，24h后，建议使用Zn-DTPA维持螯合治疗。螯合治疗在体内受污染后的24h内使用效果最好；在确诊或者怀疑受到污染时应及时给予螯合治疗；如若不能立刻治疗，在条件允许时应立刻给予螯合治疗。在体内污染后的一段时间螯合治疗仍然有效。放射性污染物在体内循环过程中或在间质液中时，Ca的螯合效果最佳。螯合疗效随着体内污染过后放射性污染物被隔离在肝和骨中而降低。如若确诊或疑似体内污染并非由钚、镅、钜引起，需进行其他治疗。具体的给药方法是，污染途径未确定或有可能存在多途径污染时静脉注射Ca-DTPA；将5ml的Ca-DTPA溶液(1g/5ml)用时3-4分钟缓慢静脉推注给药，或将5ml的Ca-DTPA溶液于5％葡萄糖水溶液、林格氏乳酸溶液、生理盐水中稀释成100-250ml静脉输液给药；若受试者由于吸入而受污染，24h内给予雾化的Ca-DTPA可作为治疗途径使用。
另外，Zn-DTPA可以静脉注射和吸入给药，分别以注射剂和粉吸入剂制剂形式提供于临床，首批样品于2004年在美国获得批准。Zn-DTPA在临床上的适应症与应用为：Zn-DTPA适用于确诊或疑似的钚、镅、钜造成的体内污染，并加快其清除速率。
Zn-DTPA的剂量与给药方面，FDA的规范要求，在受污染24h内给予首剂量的Ca-DTPA进行治疗；在此期间Ca-DTPA比Zn-DTPA疗效更好；如果Ca-DTPA无效，给予Zn-DTPA进行首次治疗。给药第二天若额外的螯合疗法被建议给予，使用Zn-DTPA进行常规治疗。若Zn-DTPA无效，螯合治疗使用Ca-DTPA维持。含Zn的伴随矿物质补充剂应被给予。对成年人和青少年，静脉注射1g剂量的Zn-DTPA；对于12岁以下的儿童，静脉注射14mg/Kg的Zn-DTPA，用量切勿超过1g。24h后的螯合持续治疗使用Zn-DTPA，对成年人和青少年，静脉注射1g剂量的Zn-DTPA，每天一次；对于12岁以下的儿童，静脉注射14mg/Kg的Zn-DTPA，每天一次，用量勿超过1g。DTPA的螯合治疗在体内受污染后的24h内使用效果最好。在确诊或者怀疑受到污染时应及时给予螯合治疗。如若不能立刻治疗，在条件允许时应立刻给予螯合治疗。在体内污染后的一段时间螯合治疗仍然有效。放射性污染物在体内循环过程中或在间质液中时，Zn-DTPA的螯合效果最佳。螯合疗效随着体内污染过后放射性污染物被隔离在肝和骨中而降低。如若确诊或疑似体内污染并非由钚、镅、钜引起，需进行其他治疗。具体的给药方法是，污染途径未确定或有可能存在多途径污染时静脉注射Zn-DTPA；将5ml的Zn-DTPA溶液(1g/5ml)用时3-4分钟缓慢静脉推注给药，或将5ml的Zn-DTPA溶液于5％葡萄糖水溶液、林格氏乳酸溶液、生理盐水中稀释成100-250ml静脉输液给药；若受试者仅由于吸入途径而受污染，24h内给予雾化的Zn-DTPA可以作为治疗途径使用。
通过建立本发明方法，为DTPA的金属螯合物在给予动物(例如大鼠、人等)后体内生物样品(例如血液、尿液、唾液等)中这些物质的含量测定提供了可能。本发明建立的分析方法具有优异的方法学性能。
附图说明
图1：Zn-DTPA和EDTA-Zn Na2·xH2O的二级质谱图；图中，A：Zn-DTPA；B：EDTA-ZnNa2·xH2O(内标)。
图2：大鼠血浆样品的MRM色谱图；图中，A:空白血浆；B:加标空白血浆；C:给药血浆样品；其中，Peak I:Zn-DTPA；Peak II:EDTA-Zn Na2·xH2O(内标)。
图3：Ca-DTPA方法确证阶段的一条标准曲线。
具体实施方式
本发明所提供的以下实施例仅用于解释目的而不是用于，也不应被解释为以任何方式限制本发明。本领域那些技术人员将会认识到在不超越本发明的精神或范围的情况下可对以下实施例做出常规变化和修改。
本发明的一个目的在于更好地理解DTPA-Ca的体内处置规律，本发明试验建立并验证了定量检测生物样品中DTPA-Ca的含量的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法，同时考察DTPA-Ca在大鼠体内的药代动力学及生物利用度情况。
1概要
Ca-DTPA粉雾剂(喷替酸钙三钠盐，DTPA-CaNa3)在临床上拟作为一种放射性核素促排药用于肺内放射性核素的清除。为了更好地理解Ca-DTPA粉雾剂的体内处置规律，本试验建立并验证了定量检测生物样品中Ca-DTPA的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法，同时考察Ca-DTPA粉雾剂经气管给药后的大鼠血浆药代动力学。
在本发明中，已经发现，摄入DTPA-Ca的大鼠血浆在直接进行处理(而未添加100μg/mL氯化锌溶液)时，动物之间、同一动物的不同取样时间等，所得样品经检测，其中DTPA-Ca含量波动极大，测定精密度远不能满足一般的测定要求。已经出人意料的发现，当在对血浆样品进行处理时，加入100μg/mL氯化锌溶液后，可以稳定的测定到DTPA-Zn的存在。本发明人推测，出现这一现象的原因在于，由于溶液pH值为7时，喷替酸(DTPA)与Zn的络合常数约是DTPA与Ca络合的3倍，pH值8～9时，约为2倍，由此，在中性或弱碱性条件下，环境中若含有Zn2+，则DTPA-Ca Na3络合物很容易转化成DTPA-Zn Na3络合物，给定量检测带来困难和误差。已经发现，在生物样品处理过程中加入过量的ZnCl2水溶液，使Ca-DTPA全部转化成Zn-DTPA来进行检测。
已经发现，大鼠经气管喷入Ca-DTPA粉雾剂(50mg/kg)后的体内吸收和消除均较快，原药的达峰时间为2.43±1.13min，t1/2为1.04±0.21h，体内平均驻留时间MRT(0-t)为1.02±0.18h，给药后4.0h血药浓度均降低至峰浓度的1/10以下，6.0h后血药浓度均降至定量限以下。
2实验材料
2.1药品、试剂与材料
Ca-DTPA(DTPA-CaNa3)，白色粉末，批号20131016，含量80.96％；
Ca-DTPA粉雾剂，白色粉末，批号：20130131，含量：51.36％，自制。
Ca-DTPA乙二胺四乙酸二钠锌盐水合物(内标，EDTA-Zn_Na2·xH2O)，白色结晶性粉末，纯度＞98.0％，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
甲醇(色谱纯)为美国Fisher公司产品；甲酸(分析纯)、甲酸铵(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司；氨水(分析纯)购自陇西化工股份有限公司；水为娃哈哈去离子水。
固相萃取小柱购自Waters公司，型号为WAX 1cc。
2.2仪器
液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS)：美国AB Sciex公司API 4000型串联质谱仪(配有Turbo Ionspray离子化源以及Analyst 1.5数据处理系统)；美国安捷伦公司Agilent1200四元梯度泵和自动进样器。
BA11OS型万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；QB-600型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司出品)；TDW-1型恒温加热仪(北京通达科技有限责任公司)；WYK-45D型空气压缩机(天津达因仪器厂)。
2.3实验动物
Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体重为260±20g，许可证号为SCXK(京)2012-0001，合格证号：11400700051827，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
3实验方法
3.1 LC-MS/MS条件
色谱条件：分析柱为SHISEIDO Proteonavi(5μm，250×4.6mm I.D.，日本SHISEIDO公司)，连接C18保护柱(4×3.0mm I.D.，美国Phenomenex公司)，柱温25℃，流动相为甲醇-2mM甲酸铵(含0.03％氨水)(50:50，v/v)，流速0.45mL/min，内标为EDTA-Zn Na2·xH2O。
质谱条件：电喷雾离子化源(Turbo Ionspray源)，负离子方式检测；喷射电压为-4000V；源温度为400℃；卷帘气(CUR)为20；碰撞气(CAD)为4；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应分别为m/z 226.6→m/z 204.5、m/z 454.2→m/z 364.3(DTPA-Zn，CE分别为-15V、-36V)和m/z 444.2→m/z 319.2(内标EDTA-Zn，CE为-34V)，扫描时间为150msec。
3.2生物样品处理
取血浆50μL，加内标溶液(25μg/mL浓度的EDTA-Zn Na2·xH2O水溶液)10μL，50μL的0.1％氨水，400μL的100μg/mL氯化锌溶液，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上。固相萃取小柱上样前先用2×1mL甲醇活化，再用2×1mL水平衡。上样后依次用1mL水、1mL甲醇清洗，最后用1mL甲醇(含5％氨水)洗脱。收集洗脱液吹干，用150μL 50％甲醇(含0.05％氨水)复溶，吸取20μL进行LC-MS/MS分析，测定并计算生物样品中的目标物质的含量。
3.3 Ca-DTPA粉雾剂动物实验方法
雄性SD大鼠7只，经气管给予50mg/kg的Ca-DTPA粉雾剂。动物给药前未禁食，自由饮水，分别于给药前及给药后0.03、0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4和6h眼眶静脉窦采血0.2mL，置于含肝素钠的离心管中，3000g离心20min，取血浆置于-20℃冰箱中冻存待测。
另外的，还可通过类似方式经静脉注射给药注射液，并在不同时间取样，同法测定并计算静脉给药的药动学参数，此静脉给药结果与吸入给药结果比较，可以得到吸入给药的生物利用度。
3.4数据处理与分析
药动学参数用软件(Version 5.2.1，美国)的非房室模型计算。Cmax为实测的最大血药浓度，Tmax为气管吸入口服给药后血药浓度达峰时间，t1/2为药物末端消除半衰期，MRT为药物在体内平均滞留时间，Vz为稳态时表观分布容积，CL为清除率。组平均数据用“均数±标准差”(Mean±SD，n≥3)表示。另外，还可以由梯形法计算得到血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t。
当需要时，可由以下方式计算生物利用度：由气管吸入和静注(或肌注，例如当它们进行了比较试验时)的AUC比值计算得到相应剂量Zn-DTPA粉雾剂的绝对(或相对)生物利用度，计算公式如下：
式中，AUC：曲线下面积(h*μg/mL)；D：给药剂量(mg/kg)
4结果与评价
4.1 LC-MS/MS定量方法学及验证
4.1.1方法的选择性
由于在样品处理时添加了过量的氯化锌，在LC-MS/MS分析时呈现的检测物质是DTPA的锌结合物，而非钙结合物。
将空白血浆、加标空白血浆和大鼠给药后的血浆样品，按“3.2”项下操作，LC-MS/MS分析，得到MRM色谱图。经色谱图比较可见，大鼠血浆中的内源性物质均不干扰待测物及内标的测定。待测物的二级全扫描质谱图见图1，大鼠血浆样品的MRM色谱图见图2。Zn-DTPA和EDTA-Zn Na2·xH2O的色谱保留时间(tR)分别为4.1min和4.4min。
4.1.2标准曲线和定量下限
取不同浓度的DTPA-Ca标准系列溶液分别加至空白大鼠血浆中，配制成相当于浓度为1、2、5、10、20、50、100、和200μg/mL的标准曲线血浆样品；取该血浆样品50μL，依次加入内标溶液10μL，0.1％氨水50μL，100μg/mL氯化锌溶液400μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上，接着上样后依次用1mL水、1mL甲醇清洗，最后用含5％氨水的甲醇1mL洗脱；收集该洗脱液，吹干，用含0.05％氨水的50％甲醇150μL复溶，吸取20μL进行LC-MS/MS分析；根据LC-MS/MS分析结果绘制标准曲线，该标准曲线用于计算各种样品中的目标物质含量；
以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得Ca-DTPA的直线回归方程，标准曲线见图3。Ca-DTPA在1～200μg/mL的范围内，浓度与峰面积比之间呈良好的线性关系(r2>0.994)。由6个样本分析的精密度和准确度，确定定量下限为1μg/mL。
4.1.3方法的精密度与准确度
用大鼠空白血浆加标配制Ca-DTPA低、中和高浓度(2，18和180μg/mL)的QC样品，在一日内对每一浓度进行6样本分析，得到本法的日内精密度和准确度，连续进行6样本分析，得到日间精密度和准确度。表1的结果显示，方法的精密度和准确度均符合生物样品定量分析要求。
表1：Ca-DTPA测定的精密度与准确度(n＝18)
加入量(μg/mL) 测得量(μg/mL) 日内精密度(％) 日间精密度(％) 相对偏差(％)
2.0 2.0 10.0 10.5 1.0
18.0 18.4 7.0 4.1 2.4
180.0 171.0 8.3 11.4 -5.0
4.1.4回收率和基质效应
配制3个浓度的大鼠血浆QC样品，每一浓度进行3样本分析，与相同浓度的标准溶液样品进行峰面积比较得到回收率，数据见表2。
表2：排灵测定的提取回收率(n＝3)
添加浓度(μg/mL) 回收率(Mean±SD)(％) RSD(％)
2.0 96.2±8.2 8.5
18.0 94.1±8.7 9.3
180.0 90.9±8.6 9.4
在3个QC浓度水平，应用空白血浆提取后加标(即，加内标物质)的方法，考察了Ca-DTPA在大鼠血浆样品中的基质效应，结果见表3。实验结果表明大鼠血浆中Ca-DTPA的基质效应均在85％～115％之间，血浆基质对Ca-DTPA的测定没有显著的影响。
表3：Ca-DTPA测定的基质效应(n＝5)
4.1.5稳定性考察
在3个QC浓度水平，考察了Ca-DTPA血浆样品在各种实验条件下的稳定性。结果表明，Ca-DTPA的RSD均小于9.9％，RE在-8.5～9.7％的范围内(表4)，其稳定性符合本试验要求。
表4：血浆样品中Ca-DTPA转化为Zn-DTPA后的稳定性(n＝4)
4.2 Ca-DTPA粉雾剂的大鼠药代动力学
本发明研究了雄性大鼠经气管给予50mg/kgCa-DTPA粉雾剂后的血浆药代动力学，在不同取样时间点，测定药的血浆药物浓度(在本申请中未具体提供这些数据)，根据这些数据可以绘制药-时曲线。
再用Winnonlin药代动力学程序(5.2.1版)对所测数据进行分析，可以得到主要的药代动力学参数。结果显示，大鼠经气管吸入50mg/kgCa-DTPA粉雾剂后t1/2在0.7～1.6h范围内，Cmax分别在50～90μg/mL范围内，AUC(0-t)分别在40～80h*μg/mL范围内。另外，经计算，大鼠气管吸入Ca-DTPA粉雾剂后，原药的吸收和消除均较快，达峰时间(Tmax)达2～3min，体内平均驻留时间MRT(0-t)达0.8～1.2h，给药后4.0h血药浓度均降低至峰浓度的1/10以下，6.0h后血药浓度均降至定量限以下。
另外，还可以用与上述类似的方法，用静脉注射给药方式测定Ca-DTPA注射液的药代动力学参数，用两种给药方法所得AUC值计算吸入给药相对于静脉给药的生物利用度。
本发明建立并验证了定量检测生物样品中Ca-DTPA的LC-MS/MS方法，方法的特异性、重现性和准确性均符合药代动力学研究的要求。大鼠气管吸入Ca-DTPA粉雾剂后，原药吸收和消除均较快，体内平均驻留时间MRT(0-t)短。这些结果表明本发明液相色谱-串联质谱法对于测定生物样品中的DTPA金属络合物是可行的。
参考资料
国家食品与药品监督管理局：《化学药品非临床药代动力学研究技术指导原则》，2005.3。
以上通过本发明较佳实施例对本发明的精神作了详细阐述。本领域技术人员理解，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法，该方法使用液相色谱-串联质谱法测定经处理的大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的含量，包括如下步骤：
(1)生物样品的处理：
(1a)取含有或不含有DTPA-Ca的大鼠血浆50μL，置于1.5mL离心管中，加内标溶液即25μg/mL的EDTA-Zn水溶液10μL或者不加内标溶液，接着依次添加0.1％氨水50μL、100μg/mL氯化锌溶液400μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上；
(1b)上样后依次用1mL水、1mL甲醇清洗，最后用含5％氨水的甲醇1mL洗脱；
(1c)收集该洗脱液，吹干，用含0.05％氨水的50％甲醇150μL复溶，吸取20μL进行LC-MS/MS分析；
(1d)标准曲线的制备：取不同浓度的DTPA-Ca标准系列溶液分别加至空白大鼠血浆中，配制成相当于浓度为1、2、5、10、20、50、100、和200μg/mL的标准曲线血浆样品；取该血浆样品50μL，依次加入内标溶液10μL，0.1％氨水50μL，100μg/mL氯化锌溶液400μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上，接着照以上(1b)和(1c)操作，根据LC-MS/MS分析结果绘制标准曲线，该标准曲线用于计算各种样品中的目标物质含量；
(2)液相色谱-串联质谱测定：
(2a)提供高效液相色谱仪和串联质谱仪，所述高效液相色谱仪配备梯度泵和进样器，所述串联质谱仪配备电喷雾离子源和数据处理系统；
(2b)色谱条件：所用的分析柱为SHISEIDO Proteonavi品牌的色谱柱，其规格为5μm，250×4.6mm I.D.，柱前连接C18保护柱，其规格为4×3.0mm I.D.的美国Phenomenex公司的保护柱，柱温25℃，流动相为体积比为50:50的甲醇-2mM甲酸铵，该甲酸铵中含0.03％氨水，流速0.45mL/min；
(2c)质谱条件：电喷雾离子化源，其使用TurboIonspray源，负离子方式检测；喷射电压为-4000V；源温度为400℃；卷帘气即CUR为20；碰撞气即CAD为4；扫描方式为多反应监测即MRM，用于定量分析的离子反应分别为用于定量分析的离子反应分别为：
DTPA-Zn：m/z 226.6→m/z 204.5、m/z 454.2→m/z 364.3，其CE分别为-15V、-36V，和
内标EDTA-Zn：m/z 444.2→m/z 319.2，其CE为-34V，
扫描时间为150msec；
(3)数据处理与分析
(3a)通过上述液相色谱-串联质谱测定得到生物样品中的目标物质含量；和，任选的
(3b)用非房室模型计算选自下列的一下或多个药动学参数：Cmax、Tmax、t1/2、MRT、AUC0-t、Vz、CL；其中，Cmax为实测的最大血药浓度，Tmax为口服给药后血药浓度达峰时间，t1/2为药物末端消除半衰期，MRT为药物在体内平均滞留时间，血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t由梯形法计算得到，Vz为稳态时表观分布容积，CL为清除率；以及，任选的
(3c)计算给药的生物利用度：在等当用药剂量下，用第二给药方式所得AUC值除以第一给药方式所得AUC值再乘以100％所得百分数，作为第二给药方式相对于第一给药方式的相对生物利用度。
2.根据权利要求1的方法，其中所述大鼠血浆是从给予或未给予Ca-DTPA的大鼠静脉血置于含肝素钠的离心管中，2000～4000g离心10～30min获得的血浆。
3.根据权利要求1的方法，其中所获得的大鼠血浆任选的被置于-20℃冰箱中冻存，以等待测定。
4.根据权利要求2的方法，其中所述大鼠静脉血是从大鼠眼眶静脉窦采血获得的。
5.根据权利要求1的方法，其中所用的内标为EDTA-Zn Na2·xH2O。
6.根据权利要求1的方法，其中所述固相萃取小柱在上样前，先用2×1mL甲醇活化，再用2×1mL水平衡。
7.根据权利要求1的方法，其中所述大鼠是Sprague-Dawley大鼠即SD大鼠。
8.根据权利要求1的方法，其中：
所述高效液相色谱仪是美国安捷伦公司Agilent 1200型液相色谱仪；
所述串联质谱仪是美国AB Sciex公司API 4000型串联质谱仪；其配有Turbo Ionspray离子化源以及Analyst 1.5数据处理系统；
用于药动学参数计算用的软件为软件，其版本为5.2.1版；
步骤(3a)中，各组的参数均用平均数据即“均数±标准差”的方式表示；和
所述平均数据是以样本数大于等于3所得的平均数。
9.根据权利要求1的方法，其中所述第二给药方式相对于第一给药方式的相对生物利用度，以相对F％表征，该相对F％是通过以下计算式算得的：
上式中：
AUC是曲线下面积，其单位是h*μg/mL，
D是给药剂量，其单位是mg/kg。
10.根据权利要求1的方法，其中所述固相萃取小柱是型号为WAX的固相萃取小柱。
CN201710553631.XA 2017-07-08 2017-07-08 测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法 Active CN107315056B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710553631.XA CN107315056B (zh) 2017-07-08 2017-07-08 测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710553631.XA CN107315056B (zh) 2017-07-08 2017-07-08 测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107315056A CN107315056A (zh) 2017-11-03
CN107315056B true CN107315056B (zh) 2019-09-24

Family

ID=60178558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710553631.XA Active CN107315056B (zh) 2017-07-08 2017-07-08 测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107315056B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109030668B (zh) * 2018-10-24 2021-03-09 上海司太立制药有限公司 钆塞酸二钠中间体的高效液相分析方法
EP4317964A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 RemeGen Co., Ltd. Method for measuring content of dtpa in adc by means of using lc-ms/ms
CN114904019B (zh) * 2022-06-10 2023-08-25 中国科学院西北高原生物研究所 一种测定硫化汞或含硫化汞物质中汞经口绝对生物利用度的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103278555A (zh) * 2013-05-02 2013-09-04 莱阳恒润食品有限公司 一种食品中代森锰锌残留量检测方法
CN103344724A (zh) * 2013-07-19 2013-10-09 利民化工股份有限公司 一种代森锰锌的分析方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10325752A1 (de) * 2003-06-06 2004-12-30 Faustus Forschungs Cie. Translational Cancer Research Gmbh Lektin-Konjugate

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103278555A (zh) * 2013-05-02 2013-09-04 莱阳恒润食品有限公司 一种食品中代森锰锌残留量检测方法
CN103344724A (zh) * 2013-07-19 2013-10-09 利民化工股份有限公司 一种代森锰锌的分析方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analysis of EDTA and DTPA;Mika Sillanpaa等;《Talanta》;19971231;全文 *
Andrea Scozzafava等.carbonic anhydrase inhibitors:synthesis of sulfonamides incorporating dtpa tails and of their zinc comp *
Determination of Chelating Agents and Metal Chelates by Capillary Zone Electrophoresis;Wolfgang Buchberger等;《Mikrochim. Acta》;19951231;全文 *
exes with powerful topical antiglaucoma properties.《Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters》.2001, *
Speciation of Zn-aminopolycarboxylic complexes by electrospray ionization mass spectrometry and ion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometry;ZuLiang Chen等;《Rapid Commun. Mass Spectrom.》;20091231;全文 *
反相高效液相色谱法测定二乙烯三胺五醋酸注射液的含量;陈红红等;《中国现代应用药学杂志》;19981231;第15卷(第6期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107315056A (zh) 2017-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107315056B (zh) 测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Ca的方法
Xing et al. Vitamin C supplementation is necessary for patients with coronavirus disease: An ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry finding
Yi et al. Study of the accumulation and distribution of arsenic species and association with arsenic toxicity in rats after 30 days of oral realgar administration
US9737260B2 (en) Methods for determining total body skeletal muscle mass
Ma et al. A pilot study of gas chromatograph/mass spectrometry-based serum metabolic profiling of colorectal cancer after operation
EP3559675B1 (en) A method for monitoring of amino acids in biological material
Palumbo et al. Simultaneous determination of 5-aminosalicylic acid, acetyl-5-aminosalicylic acid and 2, 5-dihydroxybenzoic acid in endoscopie intestinal biopsy samples in humans by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection
CN102353732B (zh) 一种珍龙醒脑制剂的质量检测方法
Myers et al. High-performance liquid chromatography of ciprofloxacin and its metabolites in serum, urine and sputum
CN107167541B (zh) 测定大鼠血浆生物样品中的DTPA-Zn的方法
CN107167540B (zh) 测定人尿液生物样品中的DTPA-Zn的方法
CN111781290A (zh) 用于准确测定人血清中多种抗癫痫药物血药浓度的试剂盒及检测方法
CN107340343B (zh) 测定人血浆生物样品中的DTPA-Zn的方法
Kubala-Kukuś et al. Analysis of elemental concentration censored distributions in breast malignant and breast benign neoplasm tissues
Bahgat et al. HPLC-DAD technique for the quantification of a recently approved anti-diabetic triple combination along with two toxic official impurities: Toxicity confirmation aided by molecular docking application
Michalke et al. Aluminium (Al) speciation in serum and urine after subcutaneous venom immunotherapy with Al as adjuvant
Ramakrishna et al. A new stability indicating method development and validation report for the assay of nivolumab by RP-UPLC
Varlamova et al. Pharmacokinetic profile, tissue residue depletion and anthelmintic efficacy of supramolecular fenbendazole
CN108663442B (zh) 一种阿法骨化醇片剂有关物质的检查方法
CN104833756B (zh) 一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法
Zakeri-Milani et al. Comparative in vitro dissolution and in vivo bioequivalence of 2 pentoxifylline sustained release formulations
Toro et al. Development and validation of a fully automated method for the chromatographic determination of content uniformity of drug tablets
Borges et al. Comparative bioavailability study with two gemfibrozil tablet formulations in healthy volunteers
Raviteja et al. High Pressure Liquid Chromatographic Method for the Determination of Mobocertinib in Pharmaceutical Dosage Form and Study of Its Degradation
Maeda et al. Automated determination of 5-fluorouracil and its metabolite in urine by high-performance liquid chromatography with column switching

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant