DE10013849A1 - L-Selectin-Kontrastmittel - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft neue Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen und entzündlichen Prozessen sowie von pathologischen Veränderungen, die mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytären Liganden verbunden sind, sowie Verfahren zu deren Herstellung.
Description
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Kontrastmittel zur bildgebenden Diagnostik und
beschreibt neue Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen und
entzündlichen Prozessen sowie von pathologischen Veränderungen, die mit der
spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytären Liganden verbunden
sind.
Unter endothelialen und leukozytären Liganden werden im folgenden die Liganden in
den Lymphknoten Sgp50/GlyCAM-1, (Imai et al., 1993), CD34 (Baumheter et al., 1993),
MadCAM-1 (Berg et al., 1993), Sgp200 (Hemmerich et al., 1994), die Liganden auf
Leukozyten PSGL-1 (Moore et al., 1992) und KG1a-Ligand (Sackstein et al., 1997)
sowie die L-Selectinliganden auf entzündeten vaskulären Endothelien (Zakrzewicz et al.,
1997; Girard und Springer, 1995) verstanden.
Als bildgebende Verfahren können die Kernspintomographie, Ultraschallbildgebung,
Bildgebung unter Verwendung von Röntgenstrahlen (Röntgen oder
Computertomographie), szintigraphische Bildgebung unter Verwendung von
Radionukliden (Gammakamerabildgebung, SPECT, PET) und die Bildgebung mittels
Nahinfrarotstrahlung (NIR-Strahlung) dienen.
Lymphknotenveränderungen werden bisher mittels Bildgebung unter Verwendung von
Röntgenstrahlen (Computertomographie) aufgrund der Volumenzunahme diagnostiziert
oder in der Kernspintomographie durch Gabe von Kontrastmitteln dargestellt, die von
Makrophagenpopulationen des Lymphknotens unspezifisch aufgenommen werden
(Magnetite bzw. hochmolekulare gadoliniumhaltige Kontrastmittel für die
Magnetresonanzbildgebung).
Entzündliche Prozesse werden bisher unspezifisch durch den Nachweis des erhöhten
Austritts von Plasmaflüssigkeit in das entzündete Gewebe direkt oder unter
assistierender Kontrastmittelgabe dargestellt. Alternativ können derartige Prozesse auch
durch Leukozytenpopulationen diagnostiziert werden, die vorher mit geeigneten
Signalmolekülen in vitro oder in vivo markiert wurden. Als Signalmoleküle dienen dabei
spezifische radionuklidmarkierte Antikörper gegen Leukozytenoberflächenantigene oder
Magnetite, die von bestimmten Leukozytenpopulationen in vitro phagozytiert wurden.
Alle diese Verfahren versuchen, Lymphknotenveränderungen und entzündliche Prozesse
indirekt darzustellen.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existiert kein nachweislich funktionierender direkter und
spezifischer Nachweis von Lymphknotenveränderungen und entzündlichen Prozessen
sowie von pathologischen Veränderungen, die mit der spezifischen Expression von
endothelialen Liganden verbunden sind, mittels bildgebender Diagnostik.
Die Internationale Patentanmeldung WO 93/06835 beschreibt ein Adhäsionsmolekül auf
Leukozyten, sogenanntes L-Selectin, und gibt bereits Hinweise auf dessen Verwendung
zur Darstellung von entzündlichen Prozessen. Insbesondere wird die Struktur der cDNA-
Nukleotidsequenz dieses Moleküls und der entsprechenden Aminosäuresequenz
offenbart. Es wird vorgeschlagen, dieses Protein als Kontrastmittel zur Darstellung von
entzündlichen Prozessen zu benutzen, indem man das Protein mit Radionukliden oder
paramagnetischen Substanzen markiert. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung
derartiger Kontrastmittel fehlt allerdings. Es gibt keine Hinweise darauf, wie die
Markierung der Proteine erfolgen soll, und auch keine Beispiele dafür, daß die
markierten Proteine tatsächlich in vivo den gewünschten Effekt zeigen.
Es besteht nach wie vor ein großer Bedarf an spezifischen Kontrastmitteln für die
Darstellung von Lymphknotenveränderungen oder entzündlichen Prozessen sowie ein
Bedarf an spezifischen Mitteln zur Darstellung von pathologischen Veränderungen,
welche mit der spezifischen Expression von endothelialen Liganden verbunden sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, diese spezifischen Kontrastmittel
sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird mit den neuen Kontrastmitteln und den Verfahren zu deren
Herstellung gelöst.
Die neuen Kontrastmittel enthalten einen Rezeptor, z. B. Adhäsionsmoleküle wie das L-
Selectin-Molekül, in seiner biologisch korrekten räumlichen Ausrichtung, so daß das
Kontrastmittel spezifisch und selektiv an endotheliale Liganden binden kann. Biologisch
korrekte Ausrichtung bedeutet, daß das N-terminale Proteinende mit der
ligandenbindungsfähigen Lektin-Domäne nach außen, von der Zelle oder von einem
Träger oder der Signaleinheit weg zeigt, während das C-terminale Proteinende der
vollständigen oder einer verkürzten Proteinsequenz in die Zelle bzw. nach innen zur
Zelle oder zu einem Träger oder zu der Signaleinheit hin zeigt. Unter dem Begriff
Rezeptor wird eine molekulare Einheit verstanden, welche spezifisch an die oben
definierten endothelialen und leukozytären Liganden bindet.
Besonders überraschend war die Erkenntnis, daß das Kontrastmittel dann besonders gut
an seine Zielstruktur bindet, wenn der Rezeptor als Multimer vorliegt. Das bedeutet, daß
das Kontrastmittel bevorzugt dann an die endothelialen Liganden bindet, wenn
wenigstens zwei Adhäsionsmoleküle, z. B. zwei L-Selectin-Moleküle, definiert und
gerichtet an eine Signaleinheit gekoppelt sind.
Die Erfindung betrifft daher Kontrastmittel zur Darstellung von
Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen
Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen Liganden
verbunden sind, und welche dadurch gekennzeichnet sind, daß ein Rezeptor, ein
Rezeptorfragment oder eine Gruppe von Rezeptoren für spezifisch exprimierte
endotheliale und/oder leukozytäre Liganden in definierter Ausrichtung an eine
Signaleinheit gekoppelt sind. Der Rezeptor ist bevorzugt ein L-Selectin-Molekül, ein L-
Selectin-Derivat oder ein Fragment von L-Selectin. Die Signaleinheiten variieren je nach
Verwendungszweck: für die Kernspintomographie muß die Signaleinheit aus
paramagnetischen oder superparamagnetischen Teilchen bestehen, bevorzugt sind
superparamagnetische Eisenoxidteilchen. Für diesen Verwendungszweck können auch
Gadoliniumkomplexe oder sonstige paramagnetische Metallkomplexe verwendet
werden. Für die Bildgebung mittels Röntgenstrahlen werden bevorzugt iodhaltige
Moleküle oder solche mit Schwermetallatomen verwendet. Für die
Ultraschallbildgebung werden stabilisierte Gasbläschen eingesetzt. In der
Radiodiagnostik verwendet man Radionuklide als Signaleinheit. Schließlich können
Nahinfrarotfabstoffe als Signaleinheiten für Kontrastmittel in der Nahinfrarotdiagnostik
eingesetzt werden.
Die Multimerisierung des Rezeptors kann auf zweierlei Weise erfolgen. Erstens können
mehrere Rezeptoren (z. B. L-Selectin) definiert und gerichtet an eine Signaleinheit
gekoppelt werden. Zweitens können bereits multimerisierte Rezeptoren (z. B. multimeres
L-Selectin) an die Signaleinheit gekoppelt werden.
Um eine gerichtete Kopplung monomeren L-Selectins an partikuläre Träger zu
ermöglichen, wurden Proteinformen erstellt, die am C-Terminus mit einer Kopplungs
gruppe versehen sind, um so die korrekte räumliche Ausrichtung zu gewährleisten
(Beispiel 2). Eine Kopplungsstruktur, die die Anforderungen von hoher Affinität und
geringer Größe optimal erfüllt, ist der Polyhistidin-Tag (multi-His, z. B. bestehend aus 4
oder mehr Histidinmolekülen), der mit Ni- oder Co-komplexierten Chelatoren (im
folgenden vereinfacht Nickelchelator genannt) interagiert.
Die gerichtete Kopplung kann erfolgen, indem ein multi-His-getaggtes Selectin über z. B. Ni2+-Ionen an einen geeigneten Chelator gebunden wird. Die Chelatoren werden dazu
an die Signaleinheit gekoppelt. Ist die Signaleinheit ein fernmagnetisches Nanopartikel,
wie z. B. ein Dextranmagnetit, so erfolgt die Kopplung durch Oxidation mit
Natiumpenodat. Die Kopplungschemie basiert auf der Oxidation von Diolgruppen, die
in Carboxydextran vorliegen. Da derartige Diolgruppen auch in Stärke vorliegen, sind
auch solche fernmagnetischen Nanopartikel geeignet, deren Hüllmaterialien aus Stärke,
Carboxydextran oder vergleichbaren Materialien bestehen. Weiterhin können die
Chelatoren an mit Dextran oder vergleichbaren Hüllmaterialien beschichteten
nichtradioaktiven und radioaktiven Kolloidpartikeln gekoppelt werden. Die Chelatoren
können ebenfalls an kompakte oder gefüllte oberflächenmodifizierte Polymerkugeln
gekoppelt werden. Die Füllung der Polymerkugeln kann aus einem Gas, einem
röntgendichten Material, einer radioaktiven Substanz oder Fluoreszenzfarbstoffen wie
z. B. NIR-Farbstoffen bestehen. Die Chelatoren können auch an Dendrimerstrukturen
gekoppelt werden, die wiederum mit fluoreszierenden Farbstoffen, röntgendichten,
paramagnetischen, fernmagnetischen Signaleinheiten oder mit gasgefüllten
oberflächenmodifizierten polymeren Signalmolekülen dotiert sind.
Die an partikuläre Träger (Nanopartikel, Kolloidpartikel, Polymerkugeln) gekoppelten
Chelatoren, welche die Bindung an die multi-His-modifizierten Rezeptoren ermöglichen,
können radioaktive Metalle oder Metallionen enthalten, die in der diagnostischen
Bildgebung ein Signal geben.
Die gerichtete Kopplung von Selectinen kann weiterhin über andere molekulare
Eigenschaften erreicht werden. So können beispielsweise die Signaleinheiten auf ihrer
Oberfläche oder an ihrer Struktur Streptavidin oder andere Avidinvananten tragen und
biotinylierte Selectine binden und umgekehrt. An die Signaleinheiten kann auch ein
selectinspezifischer Antikörper gekoppelt werden, der außerhalb des aktiven Zentrums
des Selectins bindet, und somit dessen Bindungsfähigkeit nach Kopplung an die
Signalpartikel nicht zerstört. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Kontrastmittel besteht daher darin, daß der C-Terminus eines L-
Selectin-Moleküls an ein Streptavidin-, Avidin- oder Biotinmolekül gekoppelt ist, die
Signaleinheit ein Biotin-, Streptavidin- oder Avidinmolekül enthält, und die Kopplung
durch die spezifische Bindung zwischen Streptavidin und Biotin bzw. Avidin und Biotin
beim Zusammengeben der L-Selectin-Moleküle mit der Signaleinheit entsteht.
Eine zweite Möglichkeit, L-Selectin-Moleküle geachtet an eine Signaleinheit zu
koppeln, ist, L-Selectin-Chimären zu verwenden (Beispiel 3). L-Selectin-Ig-Chimären
beistehen aus L-Selectin und Immunglobulindomänen. Dabei bestimmt die Art des
verwendeten Immunglobulinfragmentes (Ig) den Multimensierungsgrad der Chimären:
Ig der γ-Klasse tragen 2 Fab-Fragmente, die gegen L-Selectin ausgetauscht wurden.
Somit tragen L-Selectin-IgG-Chimären 2 L-Selectinfragmente pro Molekül. Ig der µ-
Klasse tragen bis zu 10 Fab-Fragmente, die gegen L-Selectin ausgetauscht wurden.
Folglich tragen die L-Selectin-IgM-Chimären bis zu 10 L-Selectinfragmente pro
Molekül. Der Abstand der Ligandenbindungszentren der L-Selectine in den
Chimärenuntereinheiten entspricht dem ursprünglichen Abstand der Fab-Fragmente und
beträgt im allgemeinen zwischen 1 und 8 nm, meist ca. 5 nm.
Chimäre Moleküle können auch aus L-Selectin und weiteren multimerisierenden
Proteinen gebildet werden. Das Mannose-binding-Protein kann, bestehend aus 4
Untereinheiten, somit mit 4 L-Selectin-Einheiten dotiert werden. Das cartilage
oligomeric matrix Protein (COMP, Tomschy et al., 1996) wiederum besteht aus 5
Untereinheiten, die N-terminal mit dem C-terminalen Ende des L-Selectins verknüpft
werden können.
Die chimären Moleküle aus Selectin und dem Fc-Teil von Antikörpern können entweder
über einen Antikörper gegen den Fc-Teil oder über Protein A, Protein L bzw. Protein G
- bakterielle Zellwandmoleküle, die den Fc-Teil von Immunglobulinen binden - gerichtet
(und bereits multimerisiert!) an Partikeloberflächen gebunden werden. Die Kopplung
von Protein G an die Oberfläche von Dextranmagnetiten wird in Beispiel 13
beschrieben.
Alle oben genannten chimären Moleküle aus Selectin und einem Multimerisierungsteil
können am C-terminalen Ende weitere Modifikationen tragen, z. B. einen multi-His-tag
(Beispiel 4), an den wiederum Chelatoren binden können, die ihrerseits an
Signaleinheiten gekoppelt sind, wie in Beispiel 5 beschrieben.
Mit dem Rezeptor oder den Rezeptorgruppen sind verschiedene Signaleinheiten
verbunden, je nachdem, in welchem diagnostischen Verfahren das Kontrastmittel
verwendet werden soll.
Zum Beispiel können als Signaleinheiten ferrimagnetische Partikel (Magnetite, Ferrite,
Cobaltferrite u. ä.) verwendet werden, die aus einem monokristallinen ferrimagnetischen
Kern und aus einer Hülle bestehen (Beispiel 12 und 13). Die Hülle ist kovalent mit dem
Kern verbunden oder umschließt den Kern vollständig ohne direkte chemische Bindung.
Die Hülle kann aus Dextran, Stärke oder nieder- oder hochmolekularen aliphatischen
oder aromatischen Ketten bestehen. Die Hülle verfügt entweder direkt über funktionelle
Gruppen (Amino-, Carboxyl-, Thiolgruppen, o. ä.), die zur weiteren Kopplung verwendet
werden können, oder über Gruppen, die nach chemischer Aktivierung zur weiteren
Kopplung funktionalisiert werden. Derartige Verbindungen sind z. B. in WO 92/12735,
WO 92/22586, EP 0 186 616 und der US 4,101,435 beschrieben.
Es können auch Verbindungen verwendet werden, die aus der Kombination von
ferrimagnetischen Partikeln und daran kovalent gekoppelten Verbindungen bestehen,
wobei die kovalent gekoppelten Verbindungen mit funktionellen Gruppen versehen sein
können oder dotierbare längerkettige aliphatische Verbindungen enthalten können.
Als Signaleinheiten können ferner paramagnetische Metalle und Metallverbindungen
eingesetzt werden (insbesondere Gadoliniumkomplexe). Hierbei wird das Metallatom
von einem Chelator komplexiert, der darüber hinaus direkt oder über einen Träger
vermittelt weitere funktionelle Gruppen (Amino-, Carboxyl-, Thiolgruppen, o. ä.)
aufweist, die zur weiteren Kopplung verwendet werden können. Der Chelator kann
hierbei auch auf Dendrimeren dotiert sein (Beispiel 14), wie sie z. B. in DE 43 44 460
beschrieben werden.
Die genannten Anforderungen werden auch von Verbindungen erfüllt, die aus der
Kombination von Chelator und einem weiteren Element bestehen, das seinerseits
funktionelle Gruppen aufweist, die zur weiteren Kopplung verwendet werden können.
Erfindungsgemäß können als solches Element dotierbare Dendrimere, dotierbare
längerkettige aliphatische Verbindungen oder dotierbare Partikel mit einem Durchmesser
von 4-200 nm, bestehend aus Magnetiten, Polystyren, Dextran, Stärke usw. verwendet
werden.
Als Signaleinheiten können röntgendichte Moleküle (z. B. Iod-Verbindungen), Metalle,
Metallverbindungen und Kolloide (z. B. kolloidale Goldpartikel, siehe Beispiel 6, 7 bzw.
11) eingesetzt werden. Hierbei werden die Rezeptoren oder Rezeptorgruppen mit den
röntgendichten Substanzen in Analogie zum oben genannten direkt oder indirekt
verbunden. So werden iodhaltige Verbindungen mit Kopplungsgruppen eingesetzt, an
die Chelatoren zur Bindung von multi-His-L-Selectinen oder Fc-bindende Substanzen
zur Bindung von L-Selectin-Chimären gekoppelt wurden. Indirekt verbunden bedeutet,
daß die röntgendichten Moleküle in Signaleinheiten eingelagert werden, wobei letztere
mit den Rezeptoren oder Rezeptorgruppen direkt verbunden werden.
Als Signaleinheiten können radioaktive Moleküle, Metalle, Metallverbindungen und
Kolloide (z. B. kolloidale 198Au- oder 199Au-Partikel, siehe Beispiel 9 und 10) dienen,
die in Analogie zum oben genannten an die Rezeptoren oder Rezeptorgruppen gebunden
werden.
Als Signaleinheiten können fluoreszierende Farbstoffe (z. B. NIR-Farbstoffe) verwendet
werden. Diese können entweder direkt in Analogie zum oben genannten an die
Rezeptoren oder Rezeptorgruppen gekoppelt werden, oder indirekt mit diesen verbunden
werden (Beispiel 17 und 18). So können die Farbstoffe in Dendrimere dotiert werden, in
kompakte oder hohle farbstoffenthaltende Polymerpartikeln eingebunden werden oder
direkt an Substanzen (Protein A, Protein L, Protein G oder spezifische gegen die
Multimerisierungsdomäne gerichtete Antikörper) gekoppelt werden, die wiederum an die
Multimerisierungsdomänen chimärer L-Selectinmoleküle binden. Geeignete
Farbstoffmoleküle und deren Herstellung werden z. B. in WO 96/17628 beschrieben.
Als Signaleinheiten können gasgefüllte oberflächenmodifizierte Polymerkugeln genutzt
werden, die in Analogie zum oben genannten an die Rezeptoren oder Rezeptorgruppen
gekoppelt werden (siehe Beispiele 19 bis 21).
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Aus der Igt10 cDNA Bank der humanen Lymphomzellinie Raji wurde ein Klon isoliert,
der den gesamten kodierenden Bereich von L-Selectin enthält und von 5'- und 3'- nicht
translatierten Bereichen flankiert ist. Dieser wurde in den pCRII-Vektor des TA-
CloningSystems© integriert. Das daraus resultierende Konstrukt wurde als LamTA4
bezeichnet und bildete die Grundlage für die Herstellung der L-Selectin Konstrukte.
Dabei ergibt sich die Abkürzung zur Benennung (siehe auch die Internationale
Patentanmeldung WO 93/06835) des L-Selectin Konstruktes aus dem einklonierten
Sequenzabschnitt. "sL" steht für "soluble" L-Selectin, das der löslichen Form des
Moleküls entspricht, wie sie im humanen Serum vorkommt. Diese Form enthält die
Lectin-, die EGF und 2 SCR-Domänen. Dagegen fehlen dieser Form die
cytoplasmatische und die transmembranäre Domäne, wobei bei der Konstruktion die
physiologische Schnittstelle, an der sL-Selectin von der Zelloberfläche proteolytisch
abgetrennt wird, eingehalten wird. Das sL-Fragment wurde mittels PCR aus dem
Ausgangsklon LamTA4 generiert und wieder in den Vektor pCRII des TA-
CloningSystems© integriert. Das rekombinante sL-Selectin wurde in einer glykosylierten
Form wie folgt hergestellt. Der sL-Selectin Sequenzabschnitt wurde in den Vektor
pCR3.1 des TA CloningSystems® für die Expression in K562-Zellen und in den Vektor
pMPSV-HE für die Expression in BHK-Zellen einkloniert. Anschließend wurden Klone
isoliert und mittels Geniticin (im Falle des pCR3.1-Vektors) bzw. nach Kotransfektion
mit Puromycin-resistenzvermittelnden Vektoren (im Falle des pMPSV-HE-Vektors)
selektiert. Die Kulturüberstände von L-Selectin-sezernierenden K562- bzw. BHK-Zellen
wurden mittels Immunaffinitätschromatographie über CNBr aktivierte Sepharose-
Matrix, an die der Antikörper DREG200 (Kishimoto et al., 1990) gebunden wurde,
gereinigt. Die Quantifizierung der Mengen von L-Selectin zur Bestimmung der Ausbeute
erfolgte mittels ELISA unter Verwendung der Antikörper DREG200 und DREG55
(Kishimoto et al., 1990).
Unter Verwendung eines partiell komplementären PCR-Primers, der zusätzlich die
Sequenz von sechs Histidinen (multi-His) trägt, wurde ausgehend von dem
Ursprungsklon LamTA4 (siehe Beispiel 1) ein L-Selectin-Konstrukt mit C-terminaler
Kopplungsgruppe generiert. Das sL-Selectin-multi-His-Fragment (kodiert das Protein
multi-His-L-Selectin) wurde in die Expressionsvektoren pCR3.1 (Invitrogen) und unter
Berücksichtigung des Leserasters in SRa-GS-Seq (Berlex Lab., Inc.) und den Baculo
Transfer- Vektor pBBS 250 (Berlex Lab., Inc.) einkloniert. BHK-Zellen wurden mit
multi-His-sL-Selectin-Konstrukt unter Zugabe eines Geniticin-resistenzvermittelnden
Vektors transfiziert. Es wurden Klone isoliert, die in die Kulturüberstände das Protein
multi-His-L-Selectin sezernieren.
Zur Expression des multi-His-L-Selectins in Insektenzellen wurde das multi-His-sL-
Selectin-Konstrukt in den Baculo Transfer Vektors überführt und anschließend in das
virale Genom transferiert. Mit diesen rekombinanten Viren wurden Sf9-, High Five™
und Estigmena acrea-Zellen infiziert. Die rekombinanten Proteine wurden, wie im
Beispiel 1 beschrieben, mittels Immunaffinitätschromatographie an DREG200 gereinigt.
Die L-Selectin-IgG-Chimären, die pro Molekül 2 L-Selectine tragen, wurden von
folgenden Konstrukten ausgehend hergestellt: Maus-L-Selectin-Humane-IgG-Chimäre
(hIgG-mLS) im pCMVS-Expressionsvektor (Watson et al., 1990), Ratten-L-Selectin-
Humane-IgG-Chimäre (hIgG-rLS) im pCDM8-Expressionsvektor (Tamatani et al.,
1993), Humane-L-Selectin-Humane-IgG-Chimäre (hIgG-hLS) im pCMV5-
Expressionsvektor (Mebius und Watson, 1993). Immunglobuline der µ-Klasse tragen 5
µ-globulinähnliche sternförmig angeordnete Moleküle und somit 10 Fab-Fragmente, die
gegen L-Selectin ausgetauscht wurden. Somit tragen L-Selectin-IgM-Chimären 10 L-
Selectinfragmente pro Molekül. Ausgehend von einem Konstrukt im pCDM8-
Expressionsvektor wurde die Maus-L-Selectin-Humane-IgM-Chimäre hergestellt (Maly
et al., 1996).
Die rekombinanten Expressionsvektoren wurden in E. coli amplifiziert, gereinigt und
anschließend in eukaryotische Zellen transfiziert.
Die rekombinanten Vektoren der Maus-L-Selectin-Humane-IgM-Chimären wurden in
COS-7 und in CHO-K1 Zellen mit einem Geniticin-resistenzvermittelnden Vektor
kotransfiziert. Stabil produzierende Klone beider Zellinien wurden isoliert. Zusätzlich
wurde das cDNA-Fragment, das für das Chimärenprotein kodiert, mit
Restriktionsendonukleasen aus dem Vektor pCDM8 herausgeschnitten und in den
Vektor pcDNA3 subkloniert. Mit diesem Konstrukt wurden HEK293 Zellen transfiziert
und Klone isoliert. Die Aufreinigung der hIgM-mLS Chimären erfolgte mittels
Immunaffinitätschromatographie an MEL-14 (Bowen et al., 1990). Die Produktion und
Reinigung der Chimären wurde mittels ELISAs verfolgt (MEL-14 als Fangantikörper
und anti-hIgG-Phosphatase als Detektionsantikörper).
Die IgG-Chimären (Human-, Ratten- und Maus-L-Selectin-Humane-IgG-Chimären)
wurden durch Kotransfektion mit dem Vektor pcDNA3 in stabil produzierenden
HEK293 und CHO-K1 Zellen hergestellt. Die Aufreinigung der hIgG-LS Chimären
erfolgte mittels Affinitätschromatographie an Protein G (Pharmacia): Nach dem
Auftragen des Kulturüberstandes auf die Säule, wurde die Matrix mit 20 mM
Natriumphosphat (pH 7,0) gewaschen. Eluiert wurde mit 0,1 M Glycin (pH 2,5), die
Eluate wurden mit gesättigter K2HPO4-Lösung neutralisiert.
Die Maus-L-Selectin-Humane-IgG-Chimäre (hIgG-mLS) im pCMVS-Expressionsvektor
(siehe Beispiel 3) wurde unter Verwendung eines partiell komplementären PCR-Primers,
der zusätzlich die Sequenz von sechs Histidinen (multi-His) trägt, um eine am Fc-
Fragment der Chimäre ansetzende C-terminale Histidin-Kopplungsgruppe verlängert
(siehe Beispiel 2). Die Amplifikation, Reinigung und Transfektion des rekombinanten
Expressionsvektors sowie die Isolierung von stabil produzierenden HEK293 Zellklonen
erfolgte, ebenso wie die Produktion und Reinigung der multi-His-Chimären in Analogie
zu der im Beispiel 3 beschriebenen Prozedur.
U. a. sind Calcein und Newport Green (Molecular Probes, Inc.) Nickelionen
komplexierende Chelatoren, die an multi-His-Proteine binden können. Darüber hinaus
sind Calcein und Newport Green iodierbar und können so als Signaleinheit zur
szintigraphischen Bildgebung eingesetzt werden. Mit 1 nMol Newport Green wurden 10 µl
0,25 M Phosphatpuffer pH 6,5-7,5 (Iodierungspuffer), der 0,2 mCi Na123I enthielt,
sowie 5 µl Chloramin T (8 mg/ml in Iodierungspuffer) für 2 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl Na2S2O5 (8 mg/ml in
Iodierungspuffer) sowie von 100 µl NaI (2 mg/ml in Iodierungspuffer) beendet.
Anschließend wurden 1 nMol L-Selectin-IgG-multi-His-Chimäre (hergestellt nach
Beispiel 4) und 1 µl 50 mM NiAcetat (50 nMol) zum iodierten Newport Green
hinzugegeben. Nach 20minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Produkt
(L-Selectin-IgG-multi-His-Chimäre)-(Ni)-(Newport Green)-(123I) über eine PD10-Säule
in Phosphatpuffer von den niedermolekularen Substanzen (Nickelionen, ungebundenem
Newport Green sowie Iodierungsreaktiven) gereinigt. Der Erhalt der Bindungsfähigkeit
der iodierten L-Selectin-Chimäre wurde auf Cryoschnitten mit anschließender
Mikroautoradiographie nachgewiesen.
Für einen 100 ml Ansatz wurden 80 ml aqua dest. und 50 µl 20% HAuCl4 vorgelegt und
auf 60°C erwärmt. Nach Zugabe einer Lösung, die 4 ml 1% NaCitrat, 18 ml aqua dest.
sowie 80 µl 1% Tannin enthielt, wurde das Reaktionsgemisch auf 95°C für 10 Minuten
erhitzt. Der Farbumschlag der Lösung von gelb zu rot zeigt die Bildung der
Kolloidteilchen. Das Produkt wurde abgekühlt und sterilfiltriert. Der Durchmesser der
Kolloide beträgt 8-12 nm.
Zu 10 ml kolloidalem Gold (Herstellung siehe Beispiel 6) wurden 300 µl Protein G
(2 mg/ml, in aqua dest.) für 1 Stunde bei Raumtemperatur gegeben. Freies, in Lösung
vorliegendes ungebundenes Protein G wurde durch mehrfaches Waschen gegen Puffer
(10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl), mittels Zentrifugation bei 30.000 g mit einem
Sorvall 80AT3-Rotor abgetrennt. Die Protein G-Goldkolloide wurden in 300 µl Puffer
aufgenommen. Durch Tracermessungen konnte gezeigt werden, daß ca. 15 Protein G-
Moleküle auf einem 10 nm kolloidalem Goldpartikel gebunden wurden.
Anschließend wurden die IgG-Selectinchimären an diese Konstrukte gekoppelt. 50 µg
Maus- oder Ratten-L-Selectin-IgG-Chimäre wurden zu je 300 µl Protein G-kolloidales
Gold gegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur konnten ca. 80-90% der
eingesetzten Chimärenmenge an die Protein G-Goldkolloide gebunden werden. Die
Bindungsfähigkeit der IgG-Selectinchimären-Protein G-Goldkolloid-Konstrukte an L-
Selectinliganden wurde an Gefrierschnitten peripherer Lymphknoten und anschließender
Silberfärbung gezeigt.
NMRI-Mäusen wurde je Tier 12 µg Maus- bzw. Ratten-L-Selectinchimären-Protein G-
Goldkolloid-Konstrukte (Herstellung siehe Beispiel 7; Stoffmenge bezogen auf den L-
Selectinchimärenanteil) bzw. als Kontrolle unbeladene Protein G-Goldkolloid-
Konstrukte intravenös injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die peripheren
Lymphknoten entnommen und in Gefrierschnitten mit nachfolgender Silberfärbung
analysiert. Direkt nach dem "first pass" bis zu einem Zeitraum von 30 Minuten nach
Injektion konnten im Falle der mit Selectinchimären-Konstrukten behandelten Tiere
Goldkolloide an der luminalen Seite der hochendothelialen Venolen im Lymphknoten
nachgewiesen werden. Tiere, die die Kontrollsubstanz erhielten, zeigten keinerlei
Goldkolloide in den Lymphknoten.
100 µg der L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Goldkolloid-Konstrukte (Herstellung
siehe Beispiel 7) wurden in der Neutronenstrahlaktivierungsanlage des Kernreaktors
BERII in aqua dest. bestrahlt, bis eine spezifische Aktivität von 300-500 MBq/100 µg
bezogen auf den L-Selectin-Anteil erreicht wurde.
Die Kaninchen wurden mit Ketamin/Xylazin narkotisiert. Die Konstrukte gemäß
Beispiel 9 mit einer spezifischen Aktivität von 300-500 MBq/100 µg bezogen auf den
L-Selectin-Anteil wurden intravenös injiziert. Mittels dynamischer Messung im
Minutentakt und abschließend mit einer statischen Messung nach 30 Minuten wurden
die Tiere mit der Gammakamera SP4HR (Elscint, jetzt General Electrics) untersucht.
Dabei wurden vor allem die Lymphknoten untersucht. Die Tiere wurden unter der
Kamera positioniert, und die erste Untersuchung erfolgte vor der Gabe des
Kontrastmittels. Im Anschluß an die Injektion wurde das Tier zu verschiedenen o. g.
Zeitpunkten untersucht. Dabei wurde für die Bildgebung mit 123Iod-Isotopen ein APC 3-
Kollimator und für die Darstellung der 198Au-Isotope ein APC 6-Kollimator verwendet.
Lage, Größe und Erscheinungsbild der einzelnen Lymphknoten wurden bestimmt.
Die Tiere (Mäuse) wurden mit 0.05 ml Ketamin/Rompun (2 : 1) i. p. narkotisiert. Jeweils
25 µg der L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Goldkolloide (hergestellt nach Beispiel 7)
bzw. Protein G-Goldkolloide (als Negativkontrolle) wurden intravenös injiziert. Nach 30
Minuten wurden die Tiere mit einem 7fach zoomfähigen Mammographen (Picker)
untersucht und die zervikalen und poplitealen Lymphknoten bei 25 kV und 10 mAs
Bestrahlung dargestellt. Die Darstellung der Kontrastmittelanreicherung in den
Lymphknoten erfolgte bei 45 kV und 4,5 mAs Bestrahlung.
Die Dextranmagnetite (US 4,101,435) wurden in wässriger Lösung mit einem 31 fachen
Teilchenüberschuß an Natriumperiodat (bezogen auf das Carboxydextran der
Dextranmagnetithülle) für 30 min unter Rühren im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT)
oxidiert. Anschließend wurde das Natriumperiodat quantitativ über eine Gelfiltration
abgetrennt. Die Dextranmagnetite wurden in Phosphatpuffer (0.1 M Phosphatpuffer
pH 7.0) eluiert. Anschließend wurde NTA zu den oxidierten Dextranmagnetiten
hinzugegeben und für 2 h bei RT unter gelegentlichem Schütteln im Dunkeln inkubiert.
Dabei konnte NTA im Überschuß an die Dextranmagnetite gekoppelt werden.
Anschließend wurde 1/10 Volumen des Reduktionsmittels Dimethylboran (150 mM in
H2O) hinzugegeben und für weitere 2 h bei RT unter gelegentlichem Schütteln im
Dunkeln inkubiert. Der letzte Schritt wurde wiederholt, gefolgt von einer Inkubation bei
4°C über Nacht. Die Abtrennung des ungebundenen NTA vom an die Oberfläche der
Dextranmagnetite gebundenen NTA erfolgte über Gel- oder Ultrafiltration. Die
Dextranmagnetite wurden in PBS oder in 0.1 M HEPES (jeweils pH 7.0-7.4) eluiert und
durch die Zugabe von 5 mg/ml Carboxydextran (Endkonzentration) stabilisiert. Die
Partikel wurden sterilfiltriert, und es wurde Natriumazid in einer Endkonzentration von
0.1% hinzugegeben. Anschließend wurde der Eisengehalt der Suspension sowie die
mittlere Teilchengröße der Partikel bestimmt.
Um die Kopplungseffizienz des NTA an die Partikeloberfläche zu überprüfen, wurden
die Dextranmagnetite zunächst mit 10 mM EDTA in PBS oder 0,1 M HEPES für 1 h bei
RT unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Anschließend wurde das EDTA über Gel-
oder Ultrafiltration abgetrennt, und die Probe mit Co2+, Ni2+ oder vergleichbaren
zweiwertigen Ionen inkubiert, die von dem Chelator komplexiert werden. Überschüssige
Ionen wurden dann über Gel- oder Ultrafiltration von den Partikeln abgetrennt. Die
Anzahl an auf der Partikeloberfläche gebundenen NTA-Molekülen konnte durch eine
ICP-Messung der gebundenen Ionen bei Subtraktion der Ionen, die an unmodifizierte
Dextranmagnetite binden, ermittelt werden.
Die NTA-tragenden Dextranmagnetite wurden zunächst mit Ni2+-Ionen (o. ä. Ionen) und
dann mit multi-His-getaggten Selectinmolekülen in PBS oder 0.1 M HEPES mit 0.2%
Milch (zur Reduktion unspezifischer Bindungen) für 10 min bei RT inkubiert.
Ungebundene Selectinmoleküle wurden über geeignete Ultrafiltrationseinheiten oder
über Magnetsäulen (Miltenyi Biotec) bei angelegtem Magnetfeld abgetrennt.
Die resultierenden Kontrastmittel-Konstrukte wurden in vitro auf ihre Bindungsfähigkeit
z. B. im Gefrierschnitt peripherer Maus-Lymphknoten überprüft und konnten dann für In-
vivo-Experimente zur Bildgebung eingesetzt werden.
Die Dextranmagnetite wurden zunächst wie im obigen Beispiel beschrieben, mit
Natriumperiodat oxidiert. Überschüssiges Natriumperiodat wurde über Gelfiltration
abgetrennt, die Dextranmagnetite wurden in Natriumazetatpuffer (100 mM
Natriumazetatpuffer pH 3.9) eluiert.
Anschließend wurde Protein G hinzugeben und für 2 h bei RT im Dunkeln unter
gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Reduktion mit Dimethylboran erfolgte wie im
obigen Beispiel beschrieben. Vor der Inkubation, die über Nacht stattfindet, wurde
zusätzlich zur Stabilisierung der Partikel 5 mg/ml Carboxydextran (Endkonzentration)
hinzugegeben. Die Abtrennung des ungebundenen Protein G erfolgte über Ultrafiltration.
Die Partikel wurden sterilfiltriert, und es wurde Natriumazid in einer Endkonzentration
vom 0.1% hinzugegeben. Anschließend wurde der Eisengehalt der Suspension sowie die
Teilchengröße der Partikel bestimmt. Die Kopplungseffizienz konnte ermittelt werden,
indem der Versuch in Anwesenheit kleinerer Mengen an radioaktiv markiertem Protein
G durchgeführt wurde.
Anschließend wurden die Protein G tragenden Dextranmagnetite mit den IgG-
Selectinchimären für mindestens 2 h bei RT oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die
resultierenden Kontrastmittel-Konstrukte wurden in vitro auf ihre Bindungsfähigkeit z. B.
im Gefrierschnitt peripherer Maus-Lymphknoten überprüft und konnten dann für In-
vivo-Experimente zur Bildgebung eingesetzt werden. Bei ausreichend magnetischen
Partikeln konnten zuvor die ungebundenen IgG-Selectinchimären über Magnetsäulen
(Miltenyi Biotec) bei angelegtem Magnetfeld abgetrennt werden.
Verwendet wurden Metallchelator-tragende Dendrimere DSM-64-NTA-Gd-DTPA
(Herstellung siehe WO 99/32154), die als Signaleinheit für MR-Bildgebung bis zu 28
Gadolinium-DTPA-Komplexe enthielten. 10 µg der Dendrimere, mit einer
Bindungskapazität von bis zu 30 multi-His-Proteinen pro Dendrimer wurden durch
Inkubation mit 50 mM Nickelacetat mit Ni2+-Ionen für 10 Minuten bei Raumtemperatur
beladen und über PD10-Gelchromatographie von ungebundenen Ni2+-Ionen gereinigt.
Anschließend wurde der Ansatz mit 7 mg multi-His-getaggten Selectinmolekülen in
10 mM HEPES (pH 7.4) für 1 Stunde bei RT inkubiert. Ungebundene Selectinmoleküle
wurden über Gelchromatographie von den multi-His-L-Selectin-Dendrimeren
abgetrennt. Der Beladungsgrad betrug durchschnittlich 10-15 multi-His-L-Selectine pro
Dendrimer.
Die Bindungsfähigkeit dieser Kontrastmittel-Konstrukte wurde in vitro im Gefrierschnitt
an peripheren Maus-Lymphknoten überprüft, indem die Komplexe nach Inkubation auf
dem Gefrierschnitt mit dem nichtblockierenden Antikörper LAM1-14 (Mihelcic et al.,
1994) und anschließender Färbung mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper
detektiert wurden.
Die L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Magnetit-Konstrukte (hergestellt nach Beispiel
13) wurden Tieren (Mäusen, Ratten, Kaninchen) intravenös injiziert. Zu vorher
festgelegten Zeitpunkten (z. B. 5 Minuten, 0,5 Stunden, 1 Stunde) wurden die Tiere
getötet (durch Injektion einer Überdosis Narkosemittels), und verschiedene Organe
(Lymphknoten, Milz, Leber) wurden entnommen und gewogen.
Beispiel In-vivo-Gabe: 4 Tiere (NMRI, Schering SPF, 18-22 g, weibl.)
Narkose: 0.05 ml Ketamin/Rompun (2 : 1) i. p.
Maus 1 u. 2: Kontrolltiere
Maus 3: erhielt ca. 443 (~ 24.2 µg) µl DDM128N-Protein G i. v. (V. caudalis) als Kontrolle.
Maus 4: erhielt ca. 525 (~ 24.3 µg) µl DDM128N-Protein G-Maus-L-Selectin-I Chimären i. v. (V. caudalis).
Beispiel In-vivo-Gabe: 4 Tiere (NMRI, Schering SPF, 18-22 g, weibl.)
Narkose: 0.05 ml Ketamin/Rompun (2 : 1) i. p.
Maus 1 u. 2: Kontrolltiere
Maus 3: erhielt ca. 443 (~ 24.2 µg) µl DDM128N-Protein G i. v. (V. caudalis) als Kontrolle.
Maus 4: erhielt ca. 525 (~ 24.3 µg) µl DDM128N-Protein G-Maus-L-Selectin-I Chimären i. v. (V. caudalis).
Nach 5 Minuten wurden die peripheren Lymphknoten (inguinal, iliacal, zervikal,
popliteal, axial), ein Stück der Leber und der Milz entnommen und gewogen.
Vorbereitung des Agar-Phantoms: Anfertigung eines Agar-Phantoms: 2% Agar-Lösung
(für Mikrobiologie) mit 0,05 mM Magnevist®. Agar wurde in der Mikrowelle erhitzt
(Einstellungen: qick digest: power 70-80%, fan speed 100, time 10 min. pressure 10)
bis die Lösung klar war und die Luftblasen verschwunden waren. Die erste Schicht (ca.
1-2 cm) wurde in ein rechteckiges Plastikgefäß eingefüllt, Abkühlung für ca. 30-60 min
bei Zimmertemperatur. Die Organe wurden auf dem Agar angeordnet und mit einer 2.
Schicht flüssigem Agar überschichtet. Die Abkühlung erfolgte bis zur Aushärtung,
danach wurde das Phantom im Kühlschrank gelagert.
MR-Messung: Das Phantom wurde mit verschiedenen Sequenzen gemessen. Zur
Positionsbestimmung wurde eine T1-gewichtete Sequenz benutzt (z. B. TR 400/TE 15,
Rare Factor = 2, Averages = 4, Matrix 256 × 256, Schichtdicke 3 mm). Anschließend
wurde das Phantom mittels Eisen (Magnetit)-sensitiver Sequenzen vermessen (T2-
gewichtet: TR/TE 2500/14, Rare Factor = 16, Averages = 4, Schichtdicke 3 mm, Matrix
256 × 256; Gradienten-Echo: TR/TE 400/15, Averages = 4, Flipwinkel 30°). Für die
Auswertung mit einem Bildverarbeitungsprogramm wurden ROI's (regions of interest)
auf die einzelnen Organe gelegt, die Signalintensitäten bestimmt und verglichen.
Die Tiere (Mäusen, Ratten, Kaninchen) wurden narkotisiert (z. B. Ketamin/Xylazin)
und die Konstrukte nach Beispiel 13 wurden intravenös injiziert. Zu vorher festgelegten
Zeitpunkten (z. B. 5 Minuten, 1 Stunde, 4 Stunden) wurden die Tiere mit der Magnet-
Resonanz-Tomographie untersucht. Dabei wurden vor allem die Lymphknoten und
entzündete Areale untersucht. Die Tiere wurden im MR-Gerät positioniert und die erste
Untersuchung erfolgte vor der Gabe des Kontrastmittels. Im Anschluß an die Injektion
wurde das Tier zu verschiedenen o. g. Zeitpunkten mit verschiedenen Sequenzen
untersucht. Zur Positionsbestimmung wurde eine T1-gewichtete Sequenz benutzt (z. B.
TR 400/TE 15, Rare Factor = 2, Averages = 4, Matrix 256 × 256, Schichtdicke 3 mm).
Anschließend wurden die Tiere mittels Eisensensitiver Sequenzen dargestellt (z. B. T2-
gewichtet: TR/TE 2500/14, Rare Factor = 16, Averages = 4, Schichtdicke 3 mm, Matrix
256 × 256; Gradienten-Echo: TR/TE 400/15, Averages = 4, Flipwinkel 30°). Für die
Auswertung mit einem Bildverarbeitungsprogramm wurden ROI's (regions of interest)
auf die einzelnen Organe gelegt, die Signalintensitäten bestimmt und verglichen. Lage,
Größe und Erscheinungsbild der einzelnen Lymphknoten wurden bestimmt.
1,1'-Bis-(4-sulfobutyl)indotricarbocyanin-5-carbonsäure wird in Anlehnung an bekannte
Literaturverfahren dufch Umsetzung mit 3-Aminopropyl-t-butylcarbamat, Freisetzung
der Aminogruppe durch saure Spaltung mit Trifluoressigsäure, in Aminopropyl]-bis-1,1'-
(4-sulfobutyl)indotricarbocyanin-5-carbonsäureamid übergeführt. Dieser, im folgenden
als NIR-Farbstoff bezeichnet, wurde direkt mit den Maus- und Ratten-L-Selectin-Ig-
Chimären kovalent gekoppelt. Die Kopplung erfolgt über eine Aminogruppe des
Farbstoffes an die oxidierte Chimäre. Dabei erfolgte die Oxidation mittels
Natriumperiodat mit einem 31fachen Molekülüberschuß bezogen auf die Stoffmenge
der Chimäre (100 µg) für 30 min unter Rühren im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT).
Anschließend wurde das Natriumperiodat quantitativ über eine Gelfiltration abgetrennt
und die Farbstoffinkubation mit 50fachem Überschuß an NIR-Farbstoff angeschlossen.
Anschließend wurde 1/10 Volumen des Reduktionsmittels Dimethylboran (150 mM in
H2O) hinzugegeben und für weitere 2 h bei RT unter gelegentlichem Schütteln im
Dunkeln inkubiert. Nicht gebundener Farbstoff und Reduktionsmittel wurde durch
Ultrafiltration in Phosphatpuffer (0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0) abgetrennt. Die L-
Selectin-Ig-Chimären konnten mit je 2-5 NIR-Farbstoffmolekülen beladen werden, deren
Fluoreszenzquantenausbeute bei etwa 50% des Ausgangswertes lag. Die
Bindungsfähigkeit der NIR-L-Selectin-Ig-Chimären wurde in vitro im Gefrierschnitt an
peripheren Maus-Lymphknoten überprüft, indem die Lokalisation der NIR
fluoreszierenden Komplexe nach Inkubation direkt mittels NIR-CCD-Mikroskopkamera
gezeigt wurde.
Bei der indirekten Markierung wurde 15 µg Protein G mittels Natriumperiodat mit einem
30fachen Molekülüberschuß bezogen auf die Stoffmenge an Protein G - wie für die
direkte Markierung beschrieben - oxidiert, zwischengereinigt und mit 50fachem
Überschuß an NIR-Farbstoff Li196 inkubiert. Reduktion mit Dimethylboran und
anschließende Reinigung erfolgten wie oben beschrieben. Anschließend wurden in
einem Volumen von 100 µl in 10 mM HEPES (pH 7.4) 10 µg der NIR-Protein G-
Konjugate mit äquimolaren Stoffmengen an Maus- bzw. Ratten-L-Selectin-Ig-Chimären
(60 µg) über Nacht bei 4°C versetzt. Eine Abtrennung der einzelnen
Ausgangskomponenten vom sich gebildeten L-Selectin-Ig-Chimären-NIR-Protein G-
Komplex war nicht erforderlich, da sich dieser zu 90% gebildet hatte, und die
verbliebenen 10% der L-Selectin-Ig-Chimären die Bindung der Komplexe in vitro im
Gefrierschnitt an periphere Maus-Lymphknoten kompetitiv nicht behinderten.
Die Tiere (Mäuse, Kaninchen) wurden narkotisiert (z. B. Ketamin/Xylazin), und die
Konstrukte wurden intravenös injiziert. NMRI-Mäusen wurde je Tier 12 µg direkt
markierte NIR-Maus-L-Selectinchimären (siehe Beispiel 17) intravenös injiziert. Eine
Stunde nach der Injektion konnten die peripheren zervikalen und poplitealen
Lymphknoten unter NIR-Fluoreszenz mit einer NIR-CCD-Kamera (RTE/CCD-576,
Visitron Systems GmbH) direkt dargestellt werden.
In einem 20-l-Reaktor werden 7 l einer wäßrigen 1%igen Octoxynol-Lösung bei einem
pH-Wert von 2.5 vorgelegt und mit einem Rotor-Stator-Mischer bei hohem Schergefälle
gemischt, so dass eine Selbstbegasung mit starker Schaumbildung erfolgt. 100 g
Cyanacrylsäurebutylester werden rasch (<1 Minute) zugegeben und dispergiert. Es wird
60 Minuten unter Selbstbegasung polymerisiert, wobei sich gasgefüllte Mikrokapseln
ausbilden. In einem Scheidetrichter wird das Flotat separiert, der Unterstand abgelassen
urLd das Flotat mit 3 l einer wäßrigen 0,02%igen Octoxynol-Lösung resuspendiert. Die so
erhaltene Mikrokapselsuspension hat einen Polymergehalt von 9.46 mg/ml, eine Dichte
von 0.943 g/ml und einen pH-Wert von 3.5.
2500 g einer Mikrokapselsuspension gemäß (a) werden unter Rühren mit 501 g
Natronlauge der Konzentration 8.10-2 mol/l versetzt. Es resultiert im Reaktionsansatz
ein pH-Wert von 12.1. Es wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend
wird der pH-Wert mit 1 N Salzsäure auf pH 3.5 eingestellt.
Die Mikrokapselsuspension gemäß Beispiel 19 wird durch mindestens 5malige Flotation
gereinigt. 1 ml der gereinigten Mikrokapselsuspension mit einer Konzentration von
5.109 Partikeln pro ml werden in 10 mM Acetat, pH 4.0 umgepuffert und mit
0.1 M EDC/NHS aktiviert. Anschließend wird mit 0.25 mg Protein G (5facher
Überschuß) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch eine
15minütige Inkubation mit 1 M Ethanolamin abgeschlossen.
Die gasgefüllten Mikrokapseln, an denen Protein G gebunden wurde, werden durch
mehrfaches Waschen mittels Zentrifugation bei max. 500 g gereinigt. Die gereinigten,
gasgefüllten Protein G-bindenden Mikrokapseln werden über Nacht mit 100 µg L-
Selektin-Ig-Chimären inkubiert.
50% der L-Selektinmenge wurde an den Mikrokapseln gebunden (FACS-Messung:
Sättigungsreihe mit anti-Selektin-Antikörpern).
Die Kaninchen wurden mit Ketamin/Xylazin narkotisiert. 1 ml der echogenen L-
Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Polymermikrokapseln (L-Selectin-
Polymermikrokapseln, siehe Beispiel 20) mit einer Konzentration von 1.109 Partikel/ml
in isotoner wässriger Dispersion wurden intravenös injiziert. Als Kontrolle wurden
Protein G-Polymermikrokapseln ohne L-Selectin-Ig-Chimären-Beladung injiziert. Direkt
nach Gabe des Kontrastmittels wurde mit der sonographischen Bildgebung der
cerricalen und poplitealen Lymphknoten im Harmonic Imaging Modus begonnen.
Aufgrund der hepatischen Clearance ungebundener Polymermikrokapseln erreichte
nach 30 Minuten das Signal-Hintergrundsverhältnis der sich im Target anreichernden L-
Selectin-Polymermikrokapseln optimale Werte.
Literatur:
Baumheter, S., Singen M. S., Henzel, W., Hemmerich, S., Renz, M., Rosen, S. D., and Lasky, L. A. (1993). Binding of L-selectin to the vascular sialomucin CD34. Science 262, 436-8.
Berg, E.-L., McEvoy, L. M., Berlin, C., Bargatze, R. F., and Butcher, E. C. (1993). L selectin-mediated lymphocyte rolling on MAdCAM-1. Nature 366, 695-8.
Bowen, B. R., Fennie, C., and Lasky, L. A. (1990). The Mel 14 antibody binds to the lectin domain of the murine peripheral lymph node homing receptor. J Cell Biol 110, 147-53.
Girard, J. P., and Springer, T. A. (1995). High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today 16, 449-57.
Hemmerich, S., Butcher, E. C., and Rosen, S. D. (1994). Sulfation-dependent recognition of high endothelial venules (HEV)-ligands by L-selectin and MECA 79, and adhesion-blocking monoclonal antibody. J Exp Med 180, 2219-26.
Imai, Y., Lasky, L. A., and Rosen, S. D. (1993). Sulphation requirement for GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin. Nature 361, 555-7.
Kishimoto, T. K., Jutila, M. A., and Butcher, E. C. (1990). Identification of a human peripheral lymph node homing receptor: a rapidly down-regulated adhesion molecule. Proc Natl Acad Sci USA 87, 2244-8.
Maly, P., Thall, A., Petryniak, B., Rogers, C. E., Smith, P. L., Marks, R. M., Kelly, R. J., Gersten, K. M., Cheng, G., Saunders, T. L., Camper, S. A., Camphausen, R. T., Sullivan, F. X., Isogai, Y., Hindsgaul, O., von Andrian, U. H., and Lowe, J. B. (1996). The alpha(1,3)fucosyltransferase Fuc-TVII controls leukocyte trafficking through an essential role in L-, E-, and P-selectin ligand biosynthesis. Cell 86, 643-53.
Mebius, R. E., and Watson, S. R. (1993). L- and E-selectin can recognize the saure naturally occurring ligands on high endothelial venules. J Immunol 151, 3252-60.
Mihelcic, D., Schleiffenbaum, B., Tedder, T. F., Sharar, S. R., Harlan, J. M., and Winn, R. K. (1994). Inhibition of leukocyte L-selectin function with a monoclonal antibody attenuates reperfusion injury to the rabbit ear. Blood 84, 2322-8.
Moore, K. L., Stults, N. L., Diaz, S., Smith, D. F., Cummings, R. D., Varki, A., and McEver, R. P. (1992). Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin (CD62) on myeloid cells. J Cell Biol 118, 445-56.
Sackstein, R., Fu, L., and Allen, K. L. (1997). A hematopoietic cell L-selectin ligand exhibits sulfate-independent binding activity. Blood 89, 2773-81.
Tamatani, T., Kuida, K., Watanabe, T., Koike, S., and Miyasaka, M. (1993). Molecular mechanisms underlying lymphocyte recirculation. III. Characterization of the LECAM-1 (L-selectin)-dependent adhesion pathway in rats. J Immunol 150, 1735-45.
Tomschy, A., Fauser, C., Landwehr, R., and Engel, J. (1996). Homophilic adhesion of E- cadherin occurs by a co-operative two-step interaction of N-terminal domains. Embo J IS, 3507-14.
Watson, S. R., Imai, Y., Fennie, C., Geoffroy, J. S., Rosen, S. D., and Lasky, L. A. (1990). A homing receptor-IgG chimera as a probe for adhesive ligands of lymph node high endothelial venules. J Cell Biol 110, 2221-9.
Zakrzewicz, A., Gräfe, M., Terbeek, D., Bongrazio, M., Auch-Schwelk, W., Walzog, B., Graf, K., Fleck, E., Ley, K., and Gaehtgens, P. (1997). L-selectin-dependent leukocyte adhesion to microvascular but not to macrovascular endothelial cells of the human coronary system. Blood 89, 3228-35.
Literatur:
Baumheter, S., Singen M. S., Henzel, W., Hemmerich, S., Renz, M., Rosen, S. D., and Lasky, L. A. (1993). Binding of L-selectin to the vascular sialomucin CD34. Science 262, 436-8.
Berg, E.-L., McEvoy, L. M., Berlin, C., Bargatze, R. F., and Butcher, E. C. (1993). L selectin-mediated lymphocyte rolling on MAdCAM-1. Nature 366, 695-8.
Bowen, B. R., Fennie, C., and Lasky, L. A. (1990). The Mel 14 antibody binds to the lectin domain of the murine peripheral lymph node homing receptor. J Cell Biol 110, 147-53.
Girard, J. P., and Springer, T. A. (1995). High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today 16, 449-57.
Hemmerich, S., Butcher, E. C., and Rosen, S. D. (1994). Sulfation-dependent recognition of high endothelial venules (HEV)-ligands by L-selectin and MECA 79, and adhesion-blocking monoclonal antibody. J Exp Med 180, 2219-26.
Imai, Y., Lasky, L. A., and Rosen, S. D. (1993). Sulphation requirement for GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin. Nature 361, 555-7.
Kishimoto, T. K., Jutila, M. A., and Butcher, E. C. (1990). Identification of a human peripheral lymph node homing receptor: a rapidly down-regulated adhesion molecule. Proc Natl Acad Sci USA 87, 2244-8.
Maly, P., Thall, A., Petryniak, B., Rogers, C. E., Smith, P. L., Marks, R. M., Kelly, R. J., Gersten, K. M., Cheng, G., Saunders, T. L., Camper, S. A., Camphausen, R. T., Sullivan, F. X., Isogai, Y., Hindsgaul, O., von Andrian, U. H., and Lowe, J. B. (1996). The alpha(1,3)fucosyltransferase Fuc-TVII controls leukocyte trafficking through an essential role in L-, E-, and P-selectin ligand biosynthesis. Cell 86, 643-53.
Mebius, R. E., and Watson, S. R. (1993). L- and E-selectin can recognize the saure naturally occurring ligands on high endothelial venules. J Immunol 151, 3252-60.
Mihelcic, D., Schleiffenbaum, B., Tedder, T. F., Sharar, S. R., Harlan, J. M., and Winn, R. K. (1994). Inhibition of leukocyte L-selectin function with a monoclonal antibody attenuates reperfusion injury to the rabbit ear. Blood 84, 2322-8.
Moore, K. L., Stults, N. L., Diaz, S., Smith, D. F., Cummings, R. D., Varki, A., and McEver, R. P. (1992). Identification of a specific glycoprotein ligand for P-selectin (CD62) on myeloid cells. J Cell Biol 118, 445-56.
Sackstein, R., Fu, L., and Allen, K. L. (1997). A hematopoietic cell L-selectin ligand exhibits sulfate-independent binding activity. Blood 89, 2773-81.
Tamatani, T., Kuida, K., Watanabe, T., Koike, S., and Miyasaka, M. (1993). Molecular mechanisms underlying lymphocyte recirculation. III. Characterization of the LECAM-1 (L-selectin)-dependent adhesion pathway in rats. J Immunol 150, 1735-45.
Tomschy, A., Fauser, C., Landwehr, R., and Engel, J. (1996). Homophilic adhesion of E- cadherin occurs by a co-operative two-step interaction of N-terminal domains. Embo J IS, 3507-14.
Watson, S. R., Imai, Y., Fennie, C., Geoffroy, J. S., Rosen, S. D., and Lasky, L. A. (1990). A homing receptor-IgG chimera as a probe for adhesive ligands of lymph node high endothelial venules. J Cell Biol 110, 2221-9.
Zakrzewicz, A., Gräfe, M., Terbeek, D., Bongrazio, M., Auch-Schwelk, W., Walzog, B., Graf, K., Fleck, E., Ley, K., and Gaehtgens, P. (1997). L-selectin-dependent leukocyte adhesion to microvascular but not to macrovascular endothelial cells of the human coronary system. Blood 89, 3228-35.
Claims (24)
1. Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen
Prozessen oder von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen
Expression von endothelialen und/oder leukozytären Liganden verbunden sind,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Rezeptor, ein Rezeptorfragment oder eine Gruppe
von Rezeptoren für spezifisch exprimierte endotheliale Liganden in definierter
Ausrichtung an eine Signaleinheit gekoppelt sind.
2. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die definierte
Ausrichtung des Rezeptors dadurch zustande kommt, daß das C-terminale Ende des
Rezeptors an die Signaleinheit gekoppelt wird, während das die Bindungsdomäne
enthaltende N-terminale Ende des Rezeptors von der Signaleinheit weg gerichtet ist.
3. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor aus
mindestens 2 Molekülen besteht.
4. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens 2
Moleküle einen Abstand am N-terminalen Ende von 1-8 nm zeigen, oder aber einen
Abstand aufweisen, der dem Abstand der N-terminalen Enden von chimären
Molekülen entsprechen, also z. B. Rezeptoren die gegen die Fab-Fragmente von
Immunglobulingrundgerüsten substitutiert wurden.
5. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein L-
Selectin-Derivat ist.
6. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor L-
Selectin ist.
7. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor eine L-
Selectin-Ig-Chimäre ist.
8. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
paramagnetisches Teilchen enthält.
9. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
superparamagnetisches Teilchen enthält.
10. Kontrastmittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
superparamagnetisches Eisenoxidteilchen ist.
11. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
mit Gas gefülltes Teilchen ist.
12. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
paramagnetisches Metallatom enthält.
13. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
Schwermetallion enthält.
14. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
iodhaltiges Molekül enthält.
15. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
Radionuklid enthält.
16. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein
Farbstoffmolekül enthält, welches Nahinfrarotstrahlung absorbiert.
17. Kontrastmittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß
der Rezeptor mit Hilfe einer Kopplungsgruppe an die Signaleinheit gekoppelt ist.
18. Kontrastmittel gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die
Kopplungsgruppe ein Polyhistidinrest ist.
19. Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln zur Darstellung von
Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen
Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder
leukozytären Liganden verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß ein
multimerisierter Rezeptor, welcher an die endothelialen Liganden bindet, an eine
Signaleinheit gekoppelt wird.
20. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der multimerisierte
Rezeptor eine L-Selectin-Ig-Chimäre ist.
21. Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln zur Darstellung von
Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen
Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder
leukozytären Liganden verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere
Rezeptoren, welche an die endothelialen Liganden binden, definiert und gerichtet mit
Hilfe einer Kopplungsgruppe an eine Signaleinheit gekoppelt werden.
22. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsgruppe
ein Polyhistidinrest ist.
23. Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln zur Darstellung von
Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen
Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder
leukozytären Liganden verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß der C-
Terminus eines L-Selectin-Moleküls an ein Streptavidin-, Avidin- oder
Biotinmolekül gekoppelt ist, die Signaleinheit ein Biotin-, Streptavidin- oder
Avidinmolekül enthält, und die Kopplung durch die spezifische Bindung zwischen
Streptavidin und Biotin bzw. Avidin und Biotin beim Zusammengeben der L-
Selectin-Moleküle mit der Signaleinheit entsteht.
24. Verwendung von L-Selectin-Ig-Chimären zur Herstellung von Kontrastmitteln für
die Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder
von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von
endothelialen und/oder leukozytären Liganden verbunden sind.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10013849A DE10013849A1 (de) | 1999-09-08 | 2000-03-15 | L-Selectin-Kontrastmittel |
| AU75158/00A AU7515800A (en) | 1999-09-08 | 2000-09-06 | L-selectin contrast agents |
| EP00964128A EP1210125A2 (de) | 1999-09-08 | 2000-09-06 | L-selectin-kontrastmittel |
| PCT/EP2000/008693 WO2001017566A2 (de) | 1999-09-08 | 2000-09-06 | L-selectin-kontrastmittel |
| JP2001521354A JP2003508499A (ja) | 1999-09-08 | 2000-09-06 | Ｌ−セレクチン造影剤 |
| NO20021128A NO20021128D0 (no) | 1999-09-08 | 2002-03-07 | L-selektinkontrastmidler |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19943710 | 1999-09-08 | ||
| DE10013849A DE10013849A1 (de) | 1999-09-08 | 2000-03-15 | L-Selectin-Kontrastmittel |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10013849A1 true DE10013849A1 (de) | 2001-03-15 |
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ID=7921780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10013849A Withdrawn DE10013849A1 (de) | 1999-09-08 | 2000-03-15 | L-Selectin-Kontrastmittel |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10013849A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004108747A2 (de) * | 2003-06-06 | 2004-12-16 | Faustus Forschungs Cie. Translational Cancer Research Gmbh | Lektin-konjugate |
-
2000
- 2000-03-15 DE DE10013849A patent/DE10013849A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004108747A2 (de) * | 2003-06-06 | 2004-12-16 | Faustus Forschungs Cie. Translational Cancer Research Gmbh | Lektin-konjugate |
| WO2004108747A3 (de) * | 2003-06-06 | 2005-03-24 | Faustus Forschungs Cie | Lektin-konjugate |
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| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: IDF INSTITUT F. DIAGNOSTIKFORSCHUNG GMBH, DE |
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