JP2003508499A

JP2003508499A - Ｌ−セレクチン造影剤

Info

Publication number: JP2003508499A
Application number: JP2001521354A
Authority: JP
Inventors: デブス，ニルス−ペーター; シドブ，ザビネ; ホフマン，ビルテ; ブリール，アンドレアス; レスリンク，ゲオルク
Priority date: 1999-09-08
Filing date: 2000-09-06
Publication date: 2003-03-04
Also published as: AU7515800A; WO2001017566A3; NO20021128L; WO2001017566A2; NO20021128D0; EP1210125A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、リンパ節の変化を表し、炎症過程、及び病理学的変化を表すための新規造影剤に関する。本発明の造影剤は内皮及び白血球のリガンドの特異的発現と結合する。本発明はまた、当該造影剤の製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は画像診断のための造影剤の分野に関連し、そして内皮及び／白血球の
リガンドの特異的発現と関連するリンパ節の変化及び炎症過程並びに病理学的変
化の可視化のための新規造影剤を記載している。

【０００２】内皮及び白血球のリガンドは、以下にリンパ節のリガンドＳｇｐ５０／Ｇｌｙ
ＣＡＭ−１（Imai et al., 1993)、ＣＤ３４ (Baumheter et al., 1993)、Ｍａ
ｄＣＡＭ−１ (Berg et al., 1993）、Ｓｇｐ２００ (Hemmerich et al., 1994
）、白血球のリガンドＰＳＧＬ−１（Moore et al., 1992）及びＫＧ１ａリガン
ド（Sackstein et al., 1997）、並びに炎症した血管内皮のＬ−セレクチンリガ
ンド（Zakrzewicz et al., 1997 : Girard and Springer, 1995)が定義される。

【０００３】画像化方法として、核スピン断層撮影法、超音波画像法、Ｘ線の使用による画
像化（Ｘ線又はコンピューター断層撮影法）、放射性核種の使用によるシンチグ
ラフィー画像法（ガンマカメラ画像化、ＳＰＥＣＴ，ＰＥＴ）、及び近赤外線（
ＮＩＲ放射）による画像化が使用される。

【０００４】今日まで、リンパ節の変化は容積の増大に基づいたＸ線の使用（コンピュータ
ー断層撮影法）によって診断されており、あるいはリンパ節のマクロファージ群
によって非特異的に吸収される造影剤（核磁気共鳴画像法のためのマグネタイト
又は高分子ガドリニウム含有造影剤）の投与によって、核スピン断層撮影法にお
いて可視化されている。

【０００５】今日まで、炎症過程は直接的に又は造影剤の投与を介して、炎症組織への血漿
の液体の増大した排出の検出によって非特異的に可視化されてきた。あるいは、
その様な過程は、適当なシグナル分子によってあらかじめｉｎｖｉｔｒｏ又は
ｉｎｖｉｖｏで標識された白血球群によっても診断され得る。シグナル分子と
して、この場合においては特異的な放射性核種標識抗体が、白血球表面抗原又は
ある白血球群によってｉｎｖｉｔｒｏで食作用を受けたマグネタイトに対して
使用される。

【０００６】これらの過程の全てが、リンパ節の変化及び炎症過程を間接的に可視化するこ
とを試みている。

【０００７】現時点で、画像診断法による、内皮のリガンドの特異的発現と関連しているリ
ンパ節及び炎症過程の変化の、はっきりと機能する直接的かつ特異的な検出は存
在していない。

【０００８】国際特許出願ＷＯ９３／０６８３５は、白血球のための接着分子、いわゆるＬ
−セレクチンを記載しており、そして炎症過程の可視化に関するその使用につい
ての詳細を提示している。特に、この分子のｃＤＮＡ−ヌクレオチド配列及び対
応するアミノ酸配列の構造が開示されている。ここでは、このタンパク質を、放
射性核種又は常磁性物質で標識した当該タンパク質によって炎症過程を可視化す
るための造影剤として使用することを提案している。しかしながら、その様な造
影剤の製造についての詳細な記載が欠けている。前記タンパク質の標識がどの様
に行われるかについての詳細、及び標識タンパク質が実際にｉｎｖｉｖｏで所
望の効果を示す例がない。

【０００９】既に述べた様に、内皮のリガンドの特異的な発現と関連している、リンパ節の
変化又は炎症過程の可視化のための特異的造影剤についての大いな必要性、並び
に病理学的変化を可視化するための特異的造影剤についての必要性が存在してい
る。

【００１０】従って、本発明の目的はこれらの特異的造影剤及びそれらの製造のための方法
を提供することである。

【００１１】この目的は、新規造影剤及びそれらの製造のための方法を用いて達成される。

【００１２】新規造影剤は、その生物学的に正しい空間的な配向で、受容体、例えば接着分
子、例えばＬ−セレクチン分子を含み、その結果、当該造影剤は内皮リガンドと
特異的かつ選択的に結合し得る。生物学的に正しい配向とは、リガンド結合性レ
クチンドメインを有するＮ末端タンパク質が、外側へ細胞又は担体若しくはシグ
ナル単位から離れた方向に向き、一方、完全なタンパク質配列又は短くなったタ
ンパク質配列のＣ末端タンパク質の末端が細胞内あるいは細胞に対して又は担体
に対して又はシグナル単位に対して内側に向くことを意味する。用語「受容体」
は、上文で明示した内皮及び白血球リガンドに対して特異的に結合する分子単位
として定義される。

【００１３】当該造影剤が、受容体が多量体として存在する場合に結果として、その標的構
造と特によく結合するという発見は、特に驚きであった。このことは、当該造影
剤が、少なくとも２つの接着分子、例えば２つのＬ−セレクチン分子が定義され
、そしてシグナル単位に向かってカップリングする場合に、結果として好ましく
は結合することを意味する。

【００１４】従って、本発明は内皮リガンドの特異的発現と関連し、そして特異的に発現し
た内皮及び／又は白血球リガンドのための受容体、受容体フラグメント又は受容
体群がシグナル単位に対して定められた配向でカップリングすることを特徴とす
る、リンパ節の変化、炎症過程又は病理学的変化を可視化するための造影剤に関
する。前記受容体は、好ましくはＬ−セレクチン分子、Ｌ−セレクチン誘導体又
はＬ−セレクチンのフラグメントである。前記シグナル単位は前記適用に依存し
て変化し：核スピン断層撮影法の場合、シグナル単位は常磁性又は超常磁性粒子
から成る必要があり；超常磁性酸化鉄粒子が好ましい。この適用のために、ガド
リニウム錯体又は他の常磁性金属錯体も使用され得る。Ｘ線による画像化のため
に、ヨウ素含有分子又は重金属原子を有するものが好ましくは使用される。超音
波画像法のために、安定化した気泡が使用される。放射線診断において、放射性
核種がシグナル単位として使用される。最後に、近赤外染料が、近赤外診断にお
ける造影剤のためのシグナル単位として使用される。

【００１５】前記受容体の多量体化は、２つの異なる方法で実施され得る。第１に、複数の
受容体（例えばＬ−セレクチン）が限定され、そしてシグナル単位に向かってカ
ップリングされ得る。第２に、多量体化した受容体（例えば、多量体Ｌ−セレク
チン）は既にシグナル単位とカップリングされ得る。

【００１６】ａ）シグナル単位に対する受容体の直接的カップリング特定の担体に対する単量体Ｌ−セレクチンの直接的カップリングを可能にする
ために、正しい空間的配向を保証するためのカップリング基をＣ末端上に提供す
る様なタンパク質の形状が作製される（例２）。任意に高親和性及び小さいサイ
ズの必要性を満たすカップリング構造は、ポリヒスチジン及び（ｍｕｌｔｉ−Ｈ
ｉｓ、例えば４又はそれ以上のヒスチジン分子から成るもの）であり、これはＮ
ｉ−又はＣｏ−複合型キレート化剤（単純なニッケルキレート化剤は後述する）
と相互作用する。

【００１７】前記直接的カップリングは、例えばＮｉ²⁺イオンを介して、適当なキレート化
剤と結合するｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓタグ付きセレクチンによって実施され得る。こ
の目的のために、キレート化剤はシグナル単位とカップリングする。シグナル単
位がフェリ磁性ナノ粒子、例えばデキストランマグネタイトである場合、カップ
リングは過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化によって実施される。カップリングの
化学は、カルボキシデキストランに存在するジオール基の酸化に基づいている。
その様なジオール基はデンプンにも存在するので、シェル（Ｓｈｅｌｌ）の材料
がデンプン、カルボキシデキストラン又は類似の材料から成るそれらのフェリ磁
性ナノ粒子も適している。更に、キレート化剤は、デキストラン又は類似のシェ
ル材料でコーティングされる非放射性及び放射性コロイド粒子とカップリングし
得る。キレート化剤はまた、コンパクトな、又は充填された表面修飾型ポリマー
球体とカップリングし得る。ポリマー球体の充填は、ガス、Ｘ線を通さない材料
、放射性物質又は蛍光色素、例えばＮＩＲ色素から成ることがある。キレート化
剤はまたデンドリマー構造とカップリングすることもあり、これは続いて蛍光色
素；Ｘ線を通さない、常磁性、フェリ磁性シグナル単位又はガスを充填した表面
修飾型ポリマーシグナル分子でドーピングされる。

【００１８】ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ修飾型受容体との結合を可能にする特定の担体（ナノ粒子
、コロイド粒子、ポリマー球体）とカップリングするキレート化剤は、診断画像
法においてシグナルを放射する放射性金属又は金属イオンを含むことがある。

【００１９】セレクチンの直接的カップリングは更に他の分子特性によって達成され得る。
この様に、例えばシグナル単位はそれらの表面上又はそれらの構造内にストレプ
トアビジン又は他のアビジン変異体を有することがあり、そしてビオチン化セレ
クチンと結合し、そしてその反対のことも起こり得る。セレクチン特異的抗体も
、セレクチンの活性中心の外側と結合し、そしてその結果、シグナル粒子とのカ
ップリング後にその結合能を破壊しないシグナル単位とカップリングされ得る。
従って、本発明に従う造影剤の製造のための方法は、Ｌ−セレクチン分子のＣ末
端がストレプトアビジン、アビジン又はビオチン分子とカップリングし、そして
シグナル単位がビオチン、ストレプトアビジン又はアビジン分子を含み、そして
カップリングが、Ｌ−セレクチン分子がシグナル単位と複合される場合に、スト
レプトアビジンとビオチン又はアビジンとビオチンの間の特異的結合によって生
まれることにある。

【００２０】ｂ）多量体化受容体の助けを借りるカップリングシグナル単位に向けられるＬ−セレクチン分子の第２のカップリング方法は、
Ｌ−セレクチンキメラを使用することである（例３）。Ｌ−セレクチン−ＩＧキ
メラは、Ｌ−セレクチン及びイムノグロブリンドメインから成る。この場合、使
用するイムノグロブリンフラグメントの型はキメラの多量体化の程度を決定し：
γクラスのＩｇはＬ−セレクチンと交換された２つのＦａｂフラグメントを有す
る。この様に、Ｌ−セレクチン−ＩｇＧキメラは１分子当たり２つのＬ−セレク
チンを有する。

【００２１】 μクラスのＩｇは、Ｌ−セレクチンと交換されたＦａｂフラグメントを最大１
０個有する。Ｌ−セレクチン−ＩｇＭキメラは、その結果として１分子当たり最
大１０個のＬ−セレクチンフラグメントを有する。キメラサブユニット内のリガ
ンド結合中心の距離はＦａｂフラグメントの本来の距離に相当し、そして通常１
〜８nm、多くの場合約５nmである。

【００２２】キメラ分子はまた、Ｌ−セレクチン及び他の多量体化するタンパク質から形成
され得る。４つのサブユニットから成るマンノース結合タンパク質は、この様に
４つのＬ−セレクチン単位でドーピングされ得る。次に、軟骨オリゴマーマトリ
ックスタンパク質（COMP, Tomschy et al., 1996）は、Ｎ末端でＬ−セレクチン
のＣ末端とカップリングし得る５つのサブユニットから成る。

【００２３】セレクチン及び抗体のＦｃ部分から成るキメラ分子は、Ｆｃ部分に対する抗体
を介して、あるいは（そして既に多量体化されている）粒子表面に向かい、イム
ノグロブリンのＦｃ部分と結合する細菌の細胞壁分子である、プロテインＡ、プ
ロテインＬ又はプロテインＧを介して、そのいずれかで結合し得る。デキストラ
ンマグネタイトの表面に対するプロテインＧのカップリングは、例１４に記載す
る。

【００２４】セレクチン及び多量体化部分から成る全ての上述したキメラ分子は、Ｃ末端上
での更なる修飾、例えば、ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓタグ（例４）を有することがあり
、これに引き続いて、例５に記載の様にキレート化剤が結合し、次にシグナル単
位がカップリングする。

【００２５】種々のシグナル単位が、造影剤を使用すべき診断方法に依存して、受容体又は
受容体群と関連している。

【００２６】例えば、シグナル単位として、フェリ磁性粒子（一般にマグネタイト、フェラ
イト、コバルトフェライト）が使用されることがあり、これは単結晶性のフェリ
磁性コア及びシェルから成る（例１３及び１４）。当該シェルはコアと共有結合
し、又は直接的な化学結合無しに完全にコアを囲む。当該シェルは、デキストラ
ン、デンプン又は低分子若しくは高分子脂肪族又は芳香族鎖から成ることがある
。当該シェルは、その配置において、更なるカップリングに使用され得る官能基
（一般にアミノ、カルボキシル、チオール基）を有し、又は更なるカップリング
のために化学的活性化後に官能化される基のいずれかを直接有する。その様な化
合物は、例えばＷＯ９２／１２７３５，ＷＯ９２／２２５８６，ＥＰ０１８
６６１６及びＵＳ４，１０１，４３５に記載されている。

【００２７】使用され得る化合物には、フェリ磁性粒子の組み合わせから成るもの、そして
それに共有結合している化合物があり、このために、この共有結合した化合物は
官能基を備えていることがあり、又は長鎖のドーピング可能な脂肪族化合物を含
むことがある。

【００２８】シグナル単位として、常磁性金属及び金属化合物も使用され得る（特にガドリ
ニウム錯体）。この場合、金属原子は、更に直接的に又は担体を介して媒介され
、そして更なる凍結に使用され得る、更なる官能基（一般的にアミノ、カルボキ
シル、チオール基）を有するキレート化剤によって複合される。この場合、当該
キレート化剤はまた、デンドリマー（例１５）とドーピングされることもあり、
それらは、例えばＤＥ４３４４４６０に記載の通りである。

【００２９】上述した必要性はまた、一部が更なるカップリングに使用され得る官能基を有
する、キレート化剤及び別の元素の組み合わせから成る化合物によってかなえら
れる。本発明に従い、マグネタイト、ポリスチレン、デキストラン、デンプン等
から成る、ドーピング可能なデンドリマー、ドーピング可能な長鎖脂肪族化合物
、又は４〜２００nmの直径を有するドーピング可能な粒子が前記成分として使用
され得る。

【００３０】シグナル単位として、Ｘ線を通さない分子（例えばヨウ素化合物）、金属、金
属化合物及びコロイド（例えばコロイド金粒子、例６，７又は１２を参照のこと
）が使用され得る。それと関連して、受容体又は受容体群は、上述したものに類
似してＸ線を通さない物質と直接的又は間接的に会合する。この様に、カップリ
ング基を有するヨウ素含有化合物が使用され、これにｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−
セレクチンの結合のためのキレート化剤又はＬ−セレクチンキメラの結合のため
のＦｃ結合物質がカップリングする。間接的に結合とは、Ｘ線を通さない分子が
シグナル単位内に保存され、そのために後者のものが受容体又は受容体群と直接
結合することを意味する。

【００３１】シグナル単位として、上述したものと同様に受容体又は受容体群と結合する放
射性分子、金属、金属化合物及びコロイド（例えばコロイド ¹⁹⁸Ａｕ粒子又は ¹ ⁹⁹ Ａｕ粒子、例１０及び１１を参照のこと）が使用され得る。

【００３２】Ｌ−セレクチンの、そのリガンドに対する結合は、好ましくは剪断力の影響下
で実施される（Finger et al., 1996)。特定のシグナル単位がＬ−セレクチンと
カップリングするならば、純粋なＬ−セレクチンと比較して向上した、Ｌ−セレ
クチン粒子構築物の結合を生む、更なる剪断力が誘導される（例８を参照のこと
）。

【００３３】シグナル単位として、蛍光色素（例えばＮＩＲ色素）が使用され得る。これら
は、上述のものと同様に受容体又は受容体群に対して直接的に、あるいは後者の
ものと間接的にカップリングし得る（例１８及び１９）。この様に、デンドリマ
ー内の色素はドーピングされ、コンパクトな、若しくは中空の色素含有ポリマー
粒子と結合し、あるいは物質（プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ又は
多量体化ドメインに対する特異的抗体）と直接カップリングすることがあり、こ
れは引き続いてキメラＬ−セレクチン分子の多量体化ドメインと結合する。適当
な色素分子及びその製造は、例えばＷＯ９６／１７６２８に記載されている。

【００３４】シグナル単位として、ガス充填型、表面修飾型ポリマー球体を使用することが
あり、これは上述したものと同様に受容体又は受容体群とカップリングされる（
例２−２２を参照のこと）。

【００３５】例以下の例は本発明を説明する。例１：Ｌ−セレクチンのクローニング及び発現Ｌ−セレクチンの全コード領域を含み、そして５′及び３′の非翻訳領域と隣
接するクローンが、ヒトリンパ腫細胞系ＲａｊｉのＩｇｔ１０ｃＤＮＡバンク
から単離された。後者のものがＴＡ−クローニング系（商標）のｐＣＲIIベクタ
ーに組込まれた。それから生じるコンストラクトは、ＬａｍＴ４と称され、そし
てＬ−セレクチンコンストラクトの基礎を形成した。これは、クローン化した配
列の一部からＬ−セレクチンコンストラクトを命名するための略語を形成してい
る（国際特許出願ＷＯ９３／０６８３５も参照のこと）。「ｓＬ」は「可溶性」
Ｌ−セレクチンを意味し、これはそれがヒトの血清中で発生する場合に、当該分
子の可溶性型に対応している。この型は、レクチンドメイン、並びにＥＧＦ及び
２つのＳＣＲドメインを含む。しかしながら、後者のものは細胞質ドメイン及び
膜貫通ドメインを欠いており、それにより、この構築において、ｓＬ−セレクチ
ンが細胞表面からタンパク質分解的に分離される、生理学的干渉が維持される。
ｓＬフラグメントは出発材料のクローンＬａｍＴＡ４からのＰＣＲによって生成
し、そしてＴＡ−クローニング系（商標）のベクターｐＣＲIIに再び組込まれる
。組換えｓＬ−セレクチンは以下の様にグリコシル化型で生成された。ｓＬ−セ
レクチン配列の一部は、Ｋ５６２細胞における発現のためのＴＡ−クローニング
系（商標）のベクターｐＣＲ３．１及びＢＨＫ細胞における発現のためのベクタ
ーｐＭＰＳＶ−ＨＥにクローニングされた。

【００３６】続いて、クローンが単離され、そしてゲンチシン（Ｇｅｎｉｔｉｃｉｎ）（ｐ
ＣＲ３．Ｉベクターの場合）によって、又は同時トランスフェクション後にピュ
ーロ−マイシン耐性媒介ベクター（ｐＭＰＳＶ−ＨＥベクターの場合）を用いて
選択される。Ｌ−セレクチンを分泌するＫ５６２又はＢＨＫ細胞の培養上清は、
抗体ＤＲＥＧ２００（Kishimoto et al., 1990）が結合した、ＣＮＢｒ活性型セ
ファロースマトリックス上での免疫親和性クロマトグラフィーによって精製され
た。収率を決定するためのＬ−セレクチンの量の定量は、抗体ＤＲＥＧ２００及
びＤＲＥＧ５５を使用するＥＬＩＳＡによって実施された（Kishimoto et al.,
1990）。

【００３７】例２：Ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−セレクチンのクローニング及び発現更に６個のヒスチジン配列（ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ）を有する部分的に相補的な
ＰＣＲプライマーの使用により、Ｃ末端にカップリング基を有するＬ−セレクチ
ンコンストラクトが、オリジナルのクローンＬａｍＴＡ４から出発して生成した
（例１を参照のこと）。ｓＬ−セレクチン−ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−フラグメント
（タンパク質ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−セレクチンをコードする）を発現ベクタ
ーｐＣＲ３．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＳＲａ−ＧＳ−Ｓｅｑ（Berlex Lab
., Inc.)及びバキュロトランスファーベクターｐＢＢＳ２５０（Berlex Lab., I
nc.)の読み枠を考慮してクローニングした。ＢＨＫ細胞は、ゲンチシン耐性媒介
ベクターに加えて、ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−ｓＬ−セレクチンコンストラクトでト
ランスフェクションされた。培養上清中にタンパク質ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−
セレクチンを分泌するクローンが単離された。

【００３８】前記バキュロトランスファーベクター中のｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−ｓＬ−セレク
チンは、昆虫細胞においてｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−セレクチンを発現する様に
変えられ、そして次にウィルスゲノム内に伝達された。これらの組換えウィルス
を用いて、Ｓｆ９，ＨｉｇｈＦｉｖｅ（商標）及びエスチグメネ・アクレア（
Estigmene acrea)細胞に感染させた。組換えタンパク質は、例１に記載の様に、
ＤＲＥＧ２００上での免疫親和性クロマトグラフィーによって精製された。

【００３９】例３：Ｌ−セレクチン−Ｉｇキメラの生成及び発現１分子当たり２つのＬ−セレクチンを有するＬ−セレクチン−ＩｇＧキメラは
、以下のコンストラクト：ｐＣＭＶ５発現ベクター（Watson et al., 1990)内の
マウス−Ｌ−セレクチン−ヒト−ＩｇＧキメラ（ｈＩｇＧ−ｍＬＳ）、ｐＣＤＭ
８−発現ベクター（Tamatani et al., 1993）内のラット−Ｌ−セレクチン-ヒト
−ＩｇＧキメラ（ｈＩｇＧ−ｒＬＳ）ｐＣＭＶ５−発現ベクター（Mebius and W
atson, 1993)内のヒト−Ｌ−セレクチン−ヒトＩｇＧキメラ（ｈＩｇＧ−ｈＬＳ
）から出発して生成した。μ−クラスのイムノグロブリンは、星型に配置される
５個のμ−グロブリンを有し、そしてその結果、Ｌ−セレクチンのために交換さ
れた１０個のＦａｂフラグメントを有する。従って、Ｌ−セレクチン−ＩｇＭキ
メラは、１分子当たり１０個のＬ−セレクチンフラグメントを有する。ｐＣＤＭ
８−発現ベクター内のコンストラクトから出発して、マウス−Ｌ−セレクチン−
ヒト−ＩｇＭキメラが生成された（Maly et al., 1996)。

【００４０】前記組換え発現ベクターはＥ．コリ（coli）で増幅され、精製され、そして真
核細胞にトランスフェクションされた。

【００４１】マウス−Ｌ−セレクチン−ヒト−ＩｇＭキメラの組換えベクターは、ゲンチシ
ン耐性媒介ベクターを用いてＣＯＳ−７及びＣＨＯ−Ｋ１細胞に同時にトランス
フェクションされた。安定して生成する両細胞系のクローンを単離した。更に、
キメラタンパク質をコードするｃＤＮＡフラグメントが、ベクターｐＣＭＤ８か
ら制限エンドヌクレアーゼを用いて切り出され、そしてベクターｐｃＤＮＡ３内
にサブクローニングされた。このコンストラクトを用いて、ＨＥＫ２９３細胞が
トランスフェクションされ、そしてクローンが単離された。ｈＩｇＭ−ｍＬＳキ
メラの精製は、ＭＥＬ−１４に対する免疫親和性クロマトグラフィーによって行
われた（Bowen et al., 1990）。キメラの生成及び精製はＥＬＩＳＡによって監
視された（捕捉（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）抗体としてＭＥＬ−１４、そして検出抗
体として抗ｈＩｇＧホスファターゼ）。

【００４２】ＩｇＧキメラ（ヒト、ラット及びマウス−Ｌ−セレクチン−ヒト−ＩｇＧキメ
ラ）が、安定に生成するＨＥＫ２９３及びＣＨＯ−Ｋ１細胞における、ベクター
ｐｃＤＮＡ３による同時トランスフェクションによって生成した。ｈＩｇＧ−Ｌ
Ｓキメラの精製は、プロテインＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に対する親和性クロマ
トグラフィーによって行われた。培養上清をカラムに載せた後、マトリックスを
２０mMのリン酸ナトリウム（pH７．０）で洗浄した。それを０．１Ｍグリシン（
pH２．５）で溶出し、そして溶出液を飽和Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 溶液で中和した。

【００４３】例４：Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−Ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−キメラの生成及び発現ｐＣＭＶ５−発現ベクター内のマウス−Ｌ−セレクチン−ヒト−ＩｇＧキメラ
（ｈＩｇＧ−ｍＬＳ）（例３を参照のこと）は、更に６個のヒスチジンの配列（
ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ）（例２を参照のこと）を有する部分的に相補的なＰＣＲプ
ライマーを使用して、当該キメラのＦｃフラグメントに付着するＣ末端のヒスチ
ジンカップリング基によって延長された。当該組換え発現ベクターの増幅、精製
及びトランスフェクション並びに安定に生成するＨＥＫ２９３細胞のクローンの
単離は、例３に記載の方法と同様に、ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓの生成及び精製の様に
行った。

【００４４】例５：放射性キレート化剤−シグナル単位の合成及びシンチグラフィー造影剤と
してのＭｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−セレクチンのカップリング一般に、カルセイン及びニューポートグリーン（Newport Green, Molecular P
robes, Inc.)は、Ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓタンパク質と結合し得るニッケルイオン複
合キレート化剤である。更に、カルセイン及びニューポートグリーンはヨウ素化
されることがあり、そしてその結果シンチグラフィー画像法のためのシグナル単
位として使用され得る。１nmolのニューポートグリーンを用いて、０．２mCi の
Ｎａ ¹²³Ｉ及び５μｌのクロラミンＴ（ヨウ素化緩衝液中で８mg／ml）を含む、
pH６．５〜７．５の１０μｌの０．２５Ｍリン酸緩衝液は、室温で２分間インキ
ュベートされた。反応は１０μｌのＮａ₂ Ｓ₂ Ｏ₅ （ヨウ素化緩衝液中で８mg／
ml）及び１００μｌのＮａＩ（ヨウ素化緩衝液中で２mg／ml）を添加することに
よって完了した。次に、１nmolのＬ−セレクチン−ＩｇＧ−ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ
キメラ（例４に従い生成したもの）及び１μｌの５０nmolの酢酸ニッケル（５０
nmol）をヨウ素化したニューポートグリーンに加えた。室温での２０分間のイン
キュベーション後、生成物（Ｌ−セレクチン−ＩｇＧ−ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓキメ
ラ）−（Ｎｉ）−（ニューポートグリーン）−（ ¹²³Ｉ）を、リン酸緩衝液中の
ＰＤ１０カラム上で、低分子量物質（ニッケルイオン、非結合型ニューポートグ
リーン及びヨウ素化反応物）から精製した。ヨウ素化Ｌ−セレクチンキメラの結
合能の保存が、続くマイクロオートラジオグラフィーによって凍結切片において
検出された。

【００４５】例６：コロイド金の合成１００mlのバッチのために、８０mlの蒸留水及び５０μｌの２０％ＨＡｕＣ
ｌ₄ を導入し、そして６０℃まで加熱した。４mlの１％クエン酸ナトリウム、１
８mlの蒸留水及び８０μｌの１％タンニンを含む溶液を加えた後、反応混合物を
９５℃に１０分間加熱した。黄色から赤への溶液の色の変化は、コロイド粒子の
形成を示す。生成物を冷却し、そして濾過によって滅菌した。コロイドの直径は
８〜１２nmであった。

【００４６】例７：Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ−プロテインＧ−コロイド金コンストラク
トの合成３００μｌのプロテインＧ（蒸留水中で２mg／ml）が、１０mlのコロイド金（
生成については例６を参照のこと）に対して室温で１時間加えられた。溶液中に
存在している、遊離の結合していないプロテインＧは、Ｓｏｒｖａｌｌ８０Ａ
Ｔ３ローターによる３０，０００ｇでの遠心によって、緩衝液（１０mMのＨＥＰ
ＥＳ、pH７．４、１５０mMのＮａＣｌ）から繰り返しの洗浄により分離させた。
プロテインＧ−金コロイドは、３００μｌの緩衝液に溶解した。トレーサーの測
定によって、約１５個のプロテインＧ分子が１０nmのコロイド金粒子に結合した
ことを示すことが可能であった。次に、ＩｇＧ−セレクチンキメラをこれらのコ
ンストラクトにカップリングさせた。５０μｇのマウス又はラット−Ｌ−セレク
チン−ＩｇＧキメラを３００μｌの各プロテインＧ−コロイド金に加えた。室温
での１時間のインキュベーション後、使用した約８０〜９０％の量のキメラがプ
ロテインＧ−金コロイドと結合することができた。ＩｇＧ−セレクチンキメラ−
プロテインＧ−金コロイドコンストラクトの、Ｌ−セレクチンリガンドに対する
結合能が、末梢のリンパ節の凍結切片及び続く銀染色において示された。

【００４７】例８：Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ−プロテインＧ−コロイド金コンストラク
トを用いる表面プラスチン共鳴（ＳＰＲ）測定マウス−又はラット−Ｌ−セレクチンキメラ−プロテインＧ−金コロイドコン
ストラクト（生成については例７を参照のこと）を、ＢＩＡｃｏｒｅランニング
緩衝液ＨＢＳ＋Ｃａ²⁺（１０mMのＨＥＰＥＳ、pH７．４；１５０mMのＮａＣｌ；
０．００５％Ｐ２０；１mMのＣａＣｌ₂ ）で１００倍希釈した。ネガティブコ
ントロールとして、前記コンストラクトをＣａ²⁺を添加していないＨＢＳに希釈
した。次に、前記物質を２０μｌ／分の流速でＳＡ−Ｐｉｏｎｅｅｒチップ（Ｂ
ＩＡｃｏｒｅ２０００／ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を介して
加えた。フローセルは、それぞれの場合における１００ＲＵの多価ポリアクリル
アミド−ビオチン誘導型リガンド（ＳｙｎｔｅｓｏｍｅＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃ
ｈ）：Ｆｃ−１＝Ｎ−アセチルラクトサミン（ネガティブコントロール）、Ｆｃ
−２＝シアリル−ルイス^* （Ｌ−セレクチンリガンド）、Ｆｃ−３＝スルホ−チ
ロシン−シアリル−ルイス^* （最適化されたＬ−セレクチンリガンド）、をあら
かじめ負荷された。Ｌ−セレクチンキメラ−金コロイドコンストラクトの結合は
、２５０ＲＵを有するＦｃ−２、７００ＲＵを有するＦｃ−３上で、カルシウム
イオンの存在下で排他的に行われた。カルシウムの添加無しに、又は純粋なＬ−
セレクチンキメラ（金コロイドの濃縮無し）の使用により、結合又は検出性のシ
グナルは、１ＲＵの範囲で検出されなかった。

【００４８】例９：Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ−プロテインＧ−金コロイドコンストラク
トによる活性検出ＮＭＲＩマウス：各動物は、１２μｇのマウス−又はラット−Ｌ−セレクチン
−キメラ−プロテインＧ−金コロイドコンストラクト（生成については例７を参
照のこと；物質の量はＬ−セレクチンキメラの比率に関連する）、あるいは、コ
ントロールとして非負荷型プロテインＧ−金コロイドコンストラクトを血管内か
ら注射された。種々の時間において、末梢のリンパ節が摘出され、そして凍結切
片、続く銀染色によって解析された。「最初の一通過（ｐａｓｓ）」直後、注射
から最大３０分間経過後、リンパ節の高内皮小静脈の管腔側上の金コロイドは、
セレクチンキメラコンストラクトで処置された動物の場合に検出され得る。コン
トロール物質を得た動物は、リンパ節において全く金コロイドを示さなかった。

【００４９】例１０：１９８Ａｕ−コロイド−プロテインＧ−Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ
コンストラクト（シンチグラフィー造影剤として）の合成１００μｇのＬ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ−プロテインＧ−金コロイドコン
ストラクト（生成については、例７を参照のこと）は、Ｌ−セレクチン部分に関
して３００〜５００ＭＢｑ／１００μｇの比活性が達成されるまで、蒸留水中で
、原子炉ＢＥＲIIの中性子線の活性単位で照射された。

【００５０】例１１：１２３Ｉ−ニューポートグリーン−Ｌ−セレクチン造影剤又は１９８Ａ
ｕ−コロイド−プロテインＧ−Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ造影剤の投与後の
ｉｎｖｉｖｏでのシンチグラフィー測定ウサギがケタミン／キシラジンで麻酔された。例１０に記載のコンストラクト
は、Ｌ−セレクチン部分に関して３００〜５００ＭＢｑ／１００μｇの比活性で
静脈内から注射された。１サイクル当たり１分の動的測定により、そして最終的
には３０分後の静的測定により、当該動物はガンマカメラＳＰ４ＨＲ（Elscint,
now General Electric)を用いて試験された。この場合、主にリンパ節が研究さ
れた。当該動物はカメラのもとに据えられ、そして造影剤を投与する前に最初の
研究が行われた。注射に続いて、当該動物は、様々な上述した時間で試験された
。この場合、ＡＰＣ３−コリメーターが ¹²³ヨウ素同位体による画像化のため
に使用され、そしてＡＰＣ６−コリメーターが ¹⁹⁸Ａｕ同位体の可視化のため
に使用された。個々のリンパ節の位置、サイズ及び外観が決定された。

【００５１】例１２：Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ−プロテインＧ−金コロイド造影剤の投
与後の、ｉｎｖｉｖｏでのＸ線画像法動物（マウス）が、０．０５mlのケタミン／ロンパン（２：１）を用いて腹腔
内から麻酔された。それぞれの場合において、２５μｇのＬ−セレクチン−Ｉｇ
−キメラ−プロテインＧ−金コロイド（例７に従い生成）又はプロテインＧ−金
コロイド（ネガティブコントロールとして）が静脈内から注射された。３０分後
、当該動物は７倍ズームのマンモグラフィー（Ｐｉｃｋｅｒ）で試験され、そし
て頸部及び膝窩のリンパ節が２５kV及び１０mAの照射で可視化された。リンパ節
における造影剤濃度の可視化は、４５kV及び４．５mAの照射で行われた。

【００５２】例１３：特定のキレート化剤−マグネタイトの合成及び磁気共鳴の造影剤として
のＭｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−セレクチンのカップリングデキストランマグネタイトに対するＮＴＡ（ニトリロ三酢酸誘導体；α−Ｎ−
［ビス−カルボキシメチル−］リジン）のカップリングデキストランマグネタイト（ＵＳ４，１０１，４３５）は、３１倍の一部過
剰な過ヨウ素酸ナトリウム（デキストランマグネタイトシェルのカルボキシデキ
ストランに対して）を有する水溶液中で３０分間酸化され、同時に暗室において
室温で撹拌された。次に、過ヨウ素酸ナトリウムがゲル濾過を介して定量的に分
離された。デキストランマグネタイトをリン酸緩衝液（０．１Ｍリン酸緩衝液、
pH７．４）において溶出した。次に、ＮＴＡを酸化したデキストランマグネタイ
トに加え、そして２時間室温でインキュベートし、同時に暗室で断続的に振盪し
た。この場合、デキストランマグネタイトに対して過剰なＮＴＡをカップリング
することができた。次に、１／１０倍量の還元剤ジメチルボラン（１５０mMの水
溶液）を加え、そして更に２時間室温でインキュベートし、同時に暗室で断続的
に振盪した。最後の段階を繰り返し、続けて４℃で一晩インキュベートした。デ
キストランマグネタイトの表面に結合するＮＴＡからの、結合していないＮＴＡ
の分離は、ゲル濾過又は限外濾過を介して行われた。デキストランマグネタイト
はＰＢＳ又は０．１ＭＨＥＰＥＳ（それぞれpH７．０〜７．４）において溶出
され、そして５mg／mlのカルボキシデキストラン（最終濃度）の添加によって安
定化された。粒子は濾過滅菌され、アジ化ナトリウムを０．１％の最終濃度で加
えた。次に、懸濁液の鉄の含有量及び粒子の平均粒径が決定された。

【００５３】粒子平面上のＮＴＡのカップリング効率を試験するために、デキストランマグ
ネタイトを、最初に１０mMのＥＤＴＡ／ＰＢＳ又は０．１ＭＨＥＰＥＳを用い
て室温で１時間インキュベートし、同時に断続的に振盪した。次に、ＥＤＴＡが
ゲル濾過又は限外濾過を介して分離され、そして試料が、キレート化剤によって
錯化されるＣｏ²⁺，Ｎｉ²⁺又は匹敵する２価イオンとインキュベートされた。次
に、過剰なイオンがゲル濾過又は限外濾過を介して粒子から分離された。修飾さ
れていないデキストランマグネタイトと結合するイオンの減算の場合に、結合し
たイオンのＩＣＰ測定によって、粒子表面に結合したＮＴＡ分子の数を決定する
ことが可能であった。

【００５４】ＮＴＡ−デキストランマグネタイトに対するＭｕｌｔｉ−Ｌ−セレクチンのカッ
プリングＮＴＡを担持するデキストランマグネタイトは、最初にＮｉ²⁺イオン（イオン
等）と一緒にインキュベートされ、そして次に０．２％ミルク（非特異的結合を
減少させるため）を有するＰＢＳ又は０．１ＭＨＥＰＥＳ中で、Ｍｕｌｔｉ−
Ｈｉｓ−タグ付きセレクチン分子と一緒に室温で１０分間インキュベートされた
。結合していないセレクチン分子は、適当な限外濾過ユニットを介して又は磁場
が適用される場合には磁気カラムを介して分離された。生じた造影剤コンストラ
クトは、例えば末梢のマウスリンパ節の凍結切片において、それらの結合能につ
いてｉｎｖｉｔｒｏで試験され、そして次に画像化のためにｉｎｖｉｖｏで
の実験に使用され得る。

【００５５】例１４：プロテインＧ−マグネタイトの合成及びＬ−セレクチン−Ｉｇキメラの
カップリングデキストランマグネタイトに対するプロテインＧのカップリングデキストランマグネタイトは最初に、上文の例において、過ヨウ素酸ナトリウ
ムで酸化されたものとして記載した。過剰な過ヨウ素酸ナトリウムはゲル濾過を
介して分離され、そしてデキストランマグネタイトは酢酸ナトリウム緩衝液（１
００mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH３．９）において溶出された。

【００５６】次に、プロテインＧを加え、そして暗室において室温で２時間インキュベート
し、同時に断続的に振盪した。ジメチルボランによる還元は上文の例に記載した
様に行われた。一晩行うインキュベーションの前に、５mg／mlのカルボキシデキ
ストラン（最終濃度）が、粒子を安定化するためにも加えられた。結合していな
いプロテインＧの分離は限外濾過を介して行われた。粒子は濾過滅菌され、そし
てアジ化ナトリウムが０．１％の最終濃度で加えられた。次に、懸濁液の鉄含有
量及び粒子の粒径が決定された。より少量の放射標識したプロテインＧの存在下
で行われた試験によってカップリング効率を決定することが可能であった。

【００５７】Ｌ−セレクチン−Ｉｇキメラのカップリング次に、プロテインＧを担持するデキストランマグネタイトが、ＩｇＧ−セレク
チンキメラと一緒に室温で少なくとも２時間又は４℃で一晩インキュベートされ
た。生じた造影剤コンストラクトは、例えば末梢のマウスリンパ節の凍結切片に
おいて、それらの結合能についてｉｎｖｉｔｒｏで試験され、そして次に画像
化のためにｉｎｖｉｖｏでの実験に使用され得る。十分な磁気粒子の場合、磁
場が適用されるならば磁気カラム(Miltenyi Biotec）を介して事前に結合してい
なかったＩｇＧ−セレクチンを分離することが可能であった。

【００５８】例１５：デンドリマー−キレート化剤−シグナル単位の合成及びＭｕｌｔｉ−Ｈ
ｉｓ−Ｌ−セレクチンのカップリングＭＲ画像法のためのシグナル単位として、最大２８個のガドリニウム−ＤＴＰ
Ａ錯体を含む、金属キレート化剤を担持するデンドリマーＤＳＭ−６４−ＮＴＡ
−Ｇｄ−ＤＴＰＡ（生成についてはＷＯ９９／３２１５４を参照のこと）が使用
された。１つのデンドリマー当たり最大３０個のＭｕｌｔｉ−Ｈｉｓタンパク質
の結合能を有する１０μｇのデンドリマーは、Ｎｉ²⁺イオンを有する５０mMの酢
酸ニッケルと一緒の、室温で１０分間のインキュベーションによって充填され、
そして結合していないＮｉ²⁺イオンのＰＤ１０−ゲルクロマトグラフィーを介し
て精製された。次に、バッチが１０mMのＨＥＰＥＳ（pH７．４）中の７mgのｍｕ
ｌｔｉ−Ｈｉｓ−タグ付きセレクチン分子と一緒に室温で１時間インキュベート
された。結合していないセレクチン分子は、ｍｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−セレクチ
ンデンドリマーによるゲルクロマトグラフィーを介して分離された。縮重の程度
は、１つのデンドリマー当たり平均１０〜１５個のＭｕｌｔｉ−Ｈｉｓ−Ｌ−セ
レクチンであった。

【００５９】この造影剤コンストラクトの結合能は、非ブロッキング抗体ＬＡＭ−１４（Mi
helcic et al., 1994)を用いて凍結切片上で検出され、そして引き続き蛍光二次
抗体を用いて染色された錯体によって、末梢のマウスリンパ節の凍結切片におい
てｉｎｖｉｔｒｏで試験された。

【００６０】例１６：ｅｘｖｉｖｏでのアガーファントムのＭＲ測定Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ−プロテインＧ−マグネタイトコンストラクト
（例１４に従い生成されたもの）を動物（マウス、ラット、ウサギ）において静
脈内から注射した。あらかじめ設定した時間（例えば５分、０．５時間、１時間
）に、当該動物はと殺され（過剰量の麻酔注射による）、そして種々の器官（リ
ンパ節、脾臓、肝臓）が摘出され、そして計量された。ｉｎｖｉｖｏでの投与剤：４匹の動物（NMRI, Schering SPF, 18〜22ｇ、雌
性）麻酔：０．０５mlのケタミン／ロンパン（２：１）（腹腔内）マウス１及び２：コントロール動物マウス３：コントロールとして静脈内（尾の静脈）から約４４３μｌ（２４．
２μｇ）のＤＤＭ１２８Ｎ−プロテインＧを受けたものマウス４：静脈内（尾の静脈）から約５２５μｌ（２４．３μｇ）のＤＤＭ１
２８Ｎ−プロテインＧ−マウス−Ｌ−セレクチン−Ｉｇキメラを受けたもの

【００６１】５分後、末梢のリンパ節（鼡径部、腸骨、膝窩、頸部、軸のもの）、肝臓及び
脾臓の一部が摘出され、そして計量された。

【００６２】アガーファントムの調製：アガーファントムの生成：０．０５mMのＭａｇｎｅ
ｖｉｓｔ（商標）を有する２％アガー溶液（微生物学用のもの）。アガーを、前
記溶液が透明となり、気泡が消失するまで電子レンジ（設定：素速い消化：出力
７０〜８０％、ファンの回転速度１００、時間１０分；電圧１０）で加熱した。
最初の層（約１〜２cm）を長方形のプラスチック容器内に載せ、室温で３０〜６
０分間冷却した。器官をアガー上に配置し、そして第２の液体アガー層で覆った
。冷却は硬化が完了するまで行われ、続いてファントムが冷蔵庫で保存された。

【００６３】ＭＲ測定：ファントムを様々な系列で測定した。位置を決定するために、Ｔ１
強調系列を使用した（例えば、ＴＲ４００／ＴＥ１５、レアファクター＝２、ア
ベレージ＝４、マトリックス２５６×２５６、層の厚さ３mm）。

【００６４】次に、ファントムが鉄（マグネタイト）感受性系列によって測定された（Ｔ２
強調：ＴＲ／ＴＥ２５００／１４、レアファクター＝１６、アベレージ＝４。層
の厚さ３mm、マトリックス２５６×２５６；グラジエントエコー：ＴＲ／ＴＥ４
００／１５、アベレージ＝４、３０°のフリップ角）。画像処理プログラムによ
る評価のためにＲＯＩ（関心領域）が個々の器官に置かれ、そしてシグナル強度
が決定され、そして比較された。

【００６５】例１７：Ｌ−セレクチン−マグネタイトコンストラクトの投与後の、ｉｎｖｉ
ｖｏでのＭＲ測定動物（マウス、ラット、ウサギ）を麻酔し（例えば、ケタミン／キシラジン）
、そして当該コンストラクトを例１４に従い静脈内から注射した。あらかじめ設
定した時間に（例えば５分、１時間、４時間）当該動物を磁気共鳴断層撮影法で
試験した。この場合、主にリンパ節及び炎症領域を研究した。当該動物をＭＲ装
置内に据え、そして造影剤を投与する前に最初の研究が行われた。注射後、当該
動物は上述した異なる時間に様々な系列で試験された。位置を決定するために、
Ｔ１強度系列を使用した（例えば、ＴＲ４００／ＴＥ１５、レアファクター＝２
、アベレージ＝４、マトリックス２５６×２５６、層の厚さ３mm）。次に、当該
動物を鉄感受性系列によって可視化した（例えば、Ｔ２強調：ＴＲ／ＴＥ２５０
０／１４、レアファクター＝１６、アベレージ＝４、層の厚さ３mm、マトリック
ス２５６×２５６；グラジエントエコー：ＴＲ／ＴＥ４００／１５、アベレージ
＝４、３０°のフリップ角）。画像処理プログラムを用いる評価のために、ＲＯ
Ｉ（関心領域）を個々の器官上に置き、シグナル強度を決定し、そして比較した
。個々のリンパ節の位置、サイズ及び外観を決定した。

【００６６】例１８：Ｌ−セレクチン−Ｉｇキメラに対するＮＩＲ色素の直接及び間接カップ
リング３−アミノプロピル−ｔ−ブチルカルバメートを用いる反応、及びトリフルオ
ロ酢酸を用いた酸による開裂によるアミノ基の放出により、文献において知られ
ている方法と同様の方法で、１，１′−ビス−（４−スルホブチル）インドトリ
カルボシアニン−５−カルボン酸がアミノプロピル］−ビス−１，１′−（４−
スルホブチル）インドトリカルボシアニン−５−カルボン酸アミドに変換される
。以後ＮＩＲ色素と称される後者のものは、マウス及びラットＬ−セレクチン−
Ｉｇキメラと直接共有結合した。カップリングは色素のアミノ基を介し、酸化型
キメラに対して行われた。この場合、酸化は、キメラの量（１００μｇ）と比べ
て分子が３１倍過剰な過ヨウ素酸ナトリウムによって行われ、同時に暗室におい
て室温で撹拌された。次に、過ヨウ素酸ナトリウムをゲル濾過により定量的に分
離し、そして色素のインキュベーションを、ＮＩＲ色素に対して５０倍過剰にし
たものと関連付けた。次に、１／１０倍量の還元剤ジメチルボラン（１５０mM水
溶液）を加え、そして室温で更に２時間インキュベートし、同時に暗室で断続的
に振盪した。結合しなかった色素及び還元剤をリン酸緩衝液（０．１Ｍリン酸緩
衝液、pH７．０）中での限外濾過によって分離した。Ｌ−セレクチン−Ｉｇキメ
ラはそれぞれ２〜５個のＮＩＲ色素分子を負荷されることがあり、そしてそれら
の蛍光量子収率は開始時の値の約５０％であった。ＮＩＲ−Ｌ−セレクチン−Ｉ
ｇキメラの結合能は、ＮＩＲ−ＣＣＤ顕微鏡カメラによってインキュベーション
後に直接示されるＮＩＲ−蛍光錯体の局所化によって、末梢のマウスリンパ節上
で、凍結切片においてｉｎｖｉｔｒｏで試験された。

【００６７】間接的な標識の場合、１５μｇのプロテインＧが、直接的な標識について記載
したときのプロテインＧの量と比べて分子が３０倍過剰な過ヨウ素酸ナトリウム
によって酸化され、その間に精製され、そしてＮＩＲ色素Ｌｉ１９６に対して５
０倍過剰にインキュベートされた。ジメチルボランによる還元及び次の精製は上
述の様に行われた。次に、１０μｇのＮＩＲプロテインＧ複合体と等モル量のマ
ウス又はラットＬ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ（６０μｇ）を、１００μｌの量
の１０mMのＨＥＰＥＳ（pH７．４）において４℃で一晩混合した。形成したＬ−
セレクチン−Ｉｇ−キメラ−ＮＩＲ−プロテインＧ複合体からの個々の開始成分
の分離が必要でなかったのは、後者のものが９０％形成され、そして残りの１０
％のＬ−セレクチン−Ｉｇ−キメラが、末梢のマウスリンパ節に対して、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの凍結切片における前記複合体の結合を競合的に妨害しなかったた
めである。

【００６８】例１９：Ｌ−セレクチン−ＮＩＲ−コンストラクトの投与後の、ｉｎｖｉｖｏ
でのＮＩＲ測定動物（マウス、ウサギ）を麻酔し（例えばケタミン／キシラジン）、そしてコ
ンストラクトを静脈内から注射した。動物当たり１２μｇの直接標識したＮＩＲ
−マウス−Ｌ−セレクチンキメラ（例１８を参照のこと）を静脈内からＮＭＲＩ
マウスに注射した。注射から１時間後に、ＮＩＲ−ＣＣＤカメラ（ＲＴＥ／ＣＣ
Ｄ−５７６、ＶｉｓｉｔｒｏｎＳｙｓｔｅｍｓＧｍｂＨ）を用いて、ＮＩＲ
蛍光のもとで末梢の頸部及び膝窩のリンパ節を直接可視化することができた。

【００６９】例２０：官能化された、ガス充填マイクロカプセル（ａ）マイクロカプセル懸濁液の製造 pH２．５の７Ｌの１％オクトキシノール水溶液を２０Ｌの反応装置に導入し、
そしてローターステーターミキサーを用いて高い剪断勾配で混合し、その結果、
強力に泡を産生する自己発泡（ｓｅｌｆ−ｇａｓｓｉｎｇ）が行われる。１００
ｇのシアノアクリル酸ブチルエステルが素早く（＜１分）加えられ、そして分散
される。それを自己発泡のもとで６０分間重合化させ、ガス充填マイクロカプセ
ルが形成される。分液ロートにおいて、浮いた材料が分離され、上清が排出され
、そして浮いた材料が３Ｌの０．０２％オクトキシノール水溶液で再懸濁される
。この様に得られたマイクロカプセル懸濁液は、９．４６mg／mlのポリマー含有
量、０．９４３ｇ／mlの密度及び３．５のpHを有する。

【００７０】（ｂ）部分的な側鎖の加水分解によるガス充填マイクロカプセルの官能化ａ）に従う２５００ｇのマイクロカプセル懸濁液を８×１０^-2 mol／Ｌの濃度
の５０１ｇの水酸化ナトリウム溶液と混合し、同時に撹拌した。１２．１のpHは
、反応バッチをもたらす。それを室温で２０分以上撹拌する。次に、１Ｎの塩酸
を用いてpHを３．５に設定する。

【００７１】例２１：官能化されたガス充填マイクロカプセルに対するＬ−セレクチンの結合例２０に従うマイクロカプセル懸濁液は浮遊によって少なくとも５倍に精製さ
れた。１ml当たり５×１０⁹ 個の粒子を有する精製マイクロカプセル懸濁液をpH
４．０の１０mM酢酸で再び緩衝化し、そして０．１ＭＥＤＣ／ＮＨＳで活性化
する。次に、それを０．２５mgのプロテインＧ（５倍過剰）と一緒に室温で少な
くとも１時間インキュベートする。反応を１Ｍエタノールアミンとの１５分のイ
ンキュベーションにより完了する。

【００７２】プロテインＧが結合したガス充填マイクロカプセルは、最大５００ｇでの遠心
による複数回の洗浄サイクルによって精製される。精製されたガス充填プロテイ
ンＧ結合マイクロカプセルは、１００μｇのＬ−セレクチン−Ｉｇキメラと一緒
に一晩インキュベートされる。

【００７３】５０％の量のＬ−セレクチンが当該マイクロカプセルと結合した（ＦＡＣＳ測
定：抗セレクチン抗体による飽和系）。

【００７４】例２２：Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラ−プロテインＧ−ポリマーマイクロカプ
セルの投与後の、ｉｎｖｉｖｏでの超音波（ｓｏｎｏｇｒａｐｈｙｉｃ）測定ウサギをケタミン／キシラジンで麻酔した。等張性分散水溶液中で１ml当たり
１×１０⁹ 個の粒子の濃度を有する、１mlのエコー発生性のＬ−セレクチン−Ｉ
ｇ−キメラープロテインＧ−ポリマーマイクロカプセル（Ｌ−セレクチン−ポリ
マーマイクロカプセル、例２１を参照のこと）を静脈内から注射した。コントロ
ールとして、Ｌ−セレクチン−Ｉｇ−キメラと結合していないプロテインＧ−ポ
リマーを注射した。造影剤の投与後直接的に、頸部及び膝窩のリンパ節の超音波
画像化をＨａｒｍｏｎｉｃＩｍａｇｉｎｇＭｏｄｕｓにおいて開始した。結
合していないポリマーマイクロカプセルの肝臓でのクリアランスのため、標的に
おいて蓄積するＬ−セレクチン−ポリマーマイクロカプセルのシグナル−バック
グラウンド比は、３０分後に最適な値に達した。

【表１】

【表２】

【表３】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１１月６日（２００１．１１．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者シドブ，ザビネドイツ連邦共和国，14197 ベルリン，クロイツナヒャーシュトラーセ９ (72)発明者ホフマン，ビルテドイツ連邦共和国，10719 ベルリン，ファーザネンシュトラーセ 29 (72)発明者ブリール，アンドレアスドイツ連邦共和国，10245 ベルリン，ゲルトナーシュトラーセ 25 (72)発明者レスリンク，ゲオルクドイツ連邦共和国，16548 グリーニッケ，ニーデルバルニムシュトラーセ 24 Ｆターム(参考） 4C085 HH03 HH07 HH09 JJ02 JJ03 KA03 KA05 KA28 KA29 KB07 KB08 KB18 KB28 LL03 LL17

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】内皮及び／又は白血球のリガンドの特異的発現と関連する、
リンパ節の変化、炎症過程又は病理学的変化の可視化のための造影剤であって、
特異的に発現した内皮のリガンドの受容体、受容体フラグメント又は受容体群が
シグナル単位に対して決められた配向でカップリングすることを特徴とする造影
剤。
【請求項２】前記受容体の決められた配向が、前記受容体のＣ末端がシグ
ナル単位とカップリングし、同時に、結合ドメインを含む前記受容体のためのＮ
末端がシグナル単位から離れた方向を向く様に起こる、請求項１に記載の造影剤
。
【請求項３】前記受容体が少なくとも２つの分子から成る、請求項１に記
載の造影剤。
【請求項４】少なくとも２つの分子がＮ末端において１〜８nmの距離を示
し、さもなければ、キメラ分子、例えばイムノグロブリン骨格のＦａｂフラグメ
ントを置換した受容体、のＮ末端の距離に相当する距離を有する、請求項１に記
載の造影剤。
【請求項５】前記受容体がＬ−セレクチン誘導体である、請求項１に記載
の造影剤。
【請求項６】前記受容体がＬ−セレクチンである、請求項１に記載の造影
剤。
【請求項７】前記受容体がＬ−セレクチン−Ｉｇキメラである、請求項１
に記載の造影剤。
【請求項８】前記シグナル単位が常磁性粒子を含む、請求項１に記載の造
影剤。
【請求項９】前記シグナル単位が超常磁性粒子を含む、請求項１に記載の
造影剤。
【請求項１０】前記シグナル単位が超常磁性酸化鉄粒子である、請求項６
に記載の造影剤。
【請求項１１】前記シグナル単位がガス充填粒子である、請求項１に記載
の造影剤。
【請求項１２】前記シグナル単位が常磁性金属原子を含む、請求項１に記
載の造影剤。
【請求項１３】前記シグナル単位が重金属イオンを含む、請求項１に記載
の造影剤。
【請求項１４】前記シグナル単位がヨウ素含有分子を含む、請求項１に記
載の造影剤。
【請求項１５】前記シグナル単位が放射性核種を含む、請求項１に記載の
造影剤。
【請求項１６】前記シグナル単位が、近赤外線を吸収する色素分子を含む
、請求項６に記載の造影剤。
【請求項１７】前記受容体が、カップリング基によって前記シグナル単位
とカップリングする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の造影剤。
【請求項１８】前記カップリング基がポリヒスチジン遊離基である、請求
項１４に記載の造影剤。
【請求項１９】内皮及び／又は白血球のリガンドの特異的発現と関連する
リンパ節の変化、炎症過程又は病理学的変化の可視化のための造影剤の製造のた
めの方法であって、前記の内皮のリガンドと結合する多量体受容体がシグナル単
位とカップリングする前記方法。
【請求項２０】前記多量体受容体がＬ−セレクチン−Ｉｇキメラである、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】内皮及び／又は白血球のリガンドの特異的発現と関連する
、リンパ節の変化、炎症過程又は病理学的変化の可視化のための造影剤の製造方
法であって、内皮のリガンドと結合する複数の受容体が決められ、そしてカップ
リング基によってシグナル単位の方向へと向く様にカップリングする前記方法。
【請求項２２】前記カップリング基がポリヒスチジン遊離基である、請求
項１８に記載の方法。
【請求項２３】内皮及び／又は白血球のリガンドの特異的発現と関連する
、リンパ節の変化、炎症過程又は病理学的変化の可視化のための造影剤の製造方
法であって、Ｌ−セレクチンのＣ末端がストレプトアビジン、アビジン又はビオ
チン分子とカップリングし、前記シグナル単位がビオチン、ストレプトアビジン
又はアビジン分子を含み、そして前記カップリングが、Ｌ−セレクチン分子をシ
グナル単位と複合させた場合に、ストレプトアビジンとビオチン、又はアビジン
とビオチンとの間の特異的結合によって生成する前記方法。
【請求項２４】内皮及び／又は白血球のリガンドの特異的発現と関連する
、リンパ節の変化、炎症過程又は病理学的変化の可視化のための造影剤の製造の
ためのＬ−セレクチン−Ｉｇキメラの使用。