WO2001017566A2 - L-selectin-kontrastmittel - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft neue Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen und entzündlichen Prozessen sowie von pathologischen Veränderungen, die mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytären Liganden verbunden sind, sowie Verfahren zu deren Herstellung.
Description
L-Selectin-Kontrastmittel
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Kontrastmittel zur bildgebenden Diagnostik und beschreibt neue Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknoten Veränderungen und entzündlichen Prozessen sowie von pathologischen Veränderungen, die mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytaren Liganden verbunden sind.
Unter endothelialen und leukozytaren Liganden werden im folgenden die Liganden in den Lymphknoten Sgp50/GlyCAM- l, (Imai et al.. 1993), CD34 (Baumheter et al.. 1993), MadCAM-1 (Berg et al.. 1993), Sgp200 (Hemmench et al.. 1994), die Liganden auf Leukozyten PSGL-1 (Moore et al.. 1992) und KGla-Ligand (Sackstein et al. , 1997) sowie die L-Selectinliganden auf entzündeten vaskularen Endothehen (Zakrzewicz et al., 1997: Girard und Springer, 1995) verstanden.
Als bildgebende Verfahren können die Kernspintomographie, Ultraschallbildgebung, Bildgebung unter Verwendung von Rontgenstrahlen (Röntgen oder Computertomographie), szintigraphische Bildgebung unter Verwendung von Radionukliden (Gammakamerabildgebung, SPECT, PET) und die Bildgebung mittels Nahinfrarotstrahlung (NIR-Strahlung) dienen.
Lymphknotenveranderungen werden bisher mittels Bildgebung unter Verwendung von Rontgenstrahlen (Computertomographie) auigrund der Voiumenzunanme diagnostiziert oder in der Kernspintomographie durch Gabe von Kontrastmitteln dargestellt, die von Makrophagenpopulationen des Lymphknotens unspezifisch aufgenommen werden (Magnetite bzw. hochmolekulare gadohniumhaltige Kontrastmittel für die Magnetresonanzbildgebung) Entzündliche Prozesse werden Disher unspezifisch durch den Nachweis des erhöhten Austπtts von Plasmaflussigkeit in das entzündete Gewebe direkt oder unter assistierender KontrastmitteigaDe dargestellt Anernativ onnen derartige Prozesse auch durch Leukozytenpopulationen diagnostiziert werden, die vorner mit geeigneten
Signalmolekulen in vitro oder in vivo markiert wurden. Ais Signalmolekuie dienen dabei spezifische radionuklidmarkierte Antikörper gegen
Leukozytenoberflachenantigene oder Magnetite. die von bestimmten
Leukozytenpopulationen in vitro phagozyαert wurden. Alle diese Verfahren versuchen. Lymphknotenveranderungen unα entzündliche Prozesse indirekt darzustellen.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existiert kein nachweislich funktionierender direkter und spezifischer Nachweis von Lymphknotenveränderungen und entzündlichen Prozessen sowie von pathologischen Veränderungen, die mit der spezifischen Expression von endothelialen Liganden verbunden sind, mittels bildgebender Diagnostik.
Die Internationale Patentanmeldung WO 93/06835 beschreibt ein Adhasionsmolekul auf Leukozyten, sogenanntes L-Selectin, und gibt bereits Hinweise auf dessen Verwendung zur Darstellung von entzündlichen Prozessen. Insbesondere wird die Struktur der cDNA-Nukleotidsequenz dieses Moleküls und der entsprechenden Aminosäuresequenz offenbart. Es wird vorgeschlagen, dieses Protein als Kontrastmittel zur Darstellung von entzündlichen Prozessen zu benutzen, indem man das Protein mit Radionukliden oder paramagnetischen Substanzen markiert. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung derartiger Kontrastmittel fehlt allerdings. Es gibt keine Hinweise darauf, wie die Markierung der Proteine erfolgen soll, und auch keine Beispiele dafür, daß die markierten Proteine tatsächlich m vivo den gewünschten Effekt zeigen.
Es besteht nach wie vor ein großer Bedarf an spezifischen Kontrastmitteln für die Darstellung von Lymphknotenveränderungen oder entzündlichen Prozessen sowie ein Bedarf an spezifischen Mitteln zur Darstellung von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen Liganden verbunden sind.
Au gaoe der vorliegenden Erfindung ist es daner. diese speziπscnen Kontrastmittel sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird mit den neuen Kontrastmitteln und den Verfahren zu deren
Herstellung gelöst.
Die neuen Kontrastmittel enthalten einen Rezeptor. z.B. Adhäsionsmoleküle wie das L-Selectin-Molekül. in seiner biologisch korrekten räumlichen Ausrichtung, so daß das Kontrastmittel spezifisch und selektiv an endotheliale Liganden binden kann. Biologisch korrekte Ausrichtung bedeutet, daß das N-terminale Proteinende mit der ligandenbindungsfähigen Lektin-Domäne nach außen, von der Zelle oder von einem Träger oder der Signaleinheit weg zeigt, während das C-terminale Proteinende der vollständigen oder einer verkürzten Proteinsequenz in die Zelle bzw. nach innen zur Zelle oder zu einem Träger oder zu der Signaleinheit hin zeigt. Unter dem Begriff Rezeptor wird eine molekulare Einheit verstanden, weiche spezifisch an die oben definierten endothelialen und leukozytaren Liganden bindet.
Besonders überraschend war die Erkenntnis, daß das Kontrastmittel dann besonders gut an seine Zielstruktur bindet, wenn der Rezeptor als Multimer vorliegt. Das bedeutet, daß das Kontrastmittel bevorzugt dann an die endothelialen Liganden bindet, wenn wenigstens zwei Adhäsionsmoleküle, z.B. zwei L-Selectin-Moleküle, definiert und gerichtet an eine Signaleinheit gekoppelt sind.
Die Erfindung betrifft daher Kontrastmittel zur Darstellung von
Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen Liganden verbunden sind, und welche dadurch gekennzeichnet sind, daß ein Rezeptor, ein Rezeptorfragment oder eine Gruppe von Rezeptoren für spezifisch exprimierte endotheliale und/oder leukozytäre Liganden in definierter Ausrichtung an eine Signaleinheit gekoppelt sind. Der Rezeptor ist bevorzugt ein L-Selectin-Molekül, ein L-Selectin-Derivat oder ein Fragment von L-Selectin. Die Signaleinheiten variieren je nach Verwendungszweck: für die Kernspintomographie muß die Signaleinheit aus paramagnetischen oder superparamagnetischen Teilchen bestehen, bevorzugt sind superparamagnetische Eisenoxidteilchen. Für diesen Verwendungszweck können auch Gadoliniumkomplexe oder sonstige paramagnetische Metallkomplexe verwendet
werden. Für die Bildgebung mittels Röntgenstrahlen werden bevorzugt iodhaltige Moleküle oder solche mit Schwermetallatomen verwendet. Für die Ultraschallbildgebung werden stabilisierte Gasbläschen eingesetzt. In der Radiodiagnostik verwendet man Radionuklide als Signaleinheit. Schließlich können Nahinfrarotfabstoffe als Signaleinheiten für Kontrastmittel in der Nahinfrarotdiagnostik eingesetzt werden.
Die Multimerisierung des Rezeptors kann auf zweierlei Weise erfolgen. Erstens können mehrere Rezeptoren (z.B. L-Selectin) definiert und gerichtet an eine Signaleinheit gekoppelt werden. Zweitens können bereits multimerisierte Rezeptoren (z.B. multimeres L-Selectin) an die Signaleinheit gekoppelt werden.
a) Gerichtete Kopplung des Rezeptors an die Signaleinheit
Um eine gerichtete Kopplung monomeren L-Selectins an partikuläre Träger zu ermöglichen, wurden Proteinformen erstellt, die am C-Terminus mit einer Kopplungsgruppe versehen sind, um so die korrekte räumliche Ausrichtung zu gewährleisten (Beispiel 2). Eine Kopplungsstruktur, die die Anforderungen von hoher Affinität und geringer Größe optimal erfüllt, ist der Polyhistidin-Tag (multi-His, z.B. bestehend aus 4 oder mehr Histidinmolekülen), der mit Ni- oder Co-komplexierten Chelatoren (im folgenden vereinfacht Nickelchelator genannt) interagiert.
Die gerichtete Kopplung kann erfolgen, indem ein multi-His-getaggtes Selectin über z. B. Ni2+-Ionen an einen geeigneten Chelator gebunden wird. Die Chelatoren werden dazu an die Signaleinheit gekoppelt. Ist die Signaleinheit ein ferrimagnetisches Nanopartikel. wie z.B. ein Dextranmagneüt, so erfolgt die Kopplung durch Oxidation mit Natiumperiodat. Die Kopplungschemie basiert auf der Oxidaüon von Diolgruppen, die in Carboxydextran vorliegen. Da derartige Diolgruppen auch in Stärke vorliegen, sind auch solche ferrimagnetischen Nanopartikel geeignet, deren Hüllmateriaiien aus Stärke, Carboxydextran oder vergleichbaren Materialien bestehen. Weiterhin können die Chelatoren an mit Dextran oder vergleichbaren Hüllmaterialien beschichteten nichtradioaktiven und radioaktiven Kolloidpartikeln gekoppelt werden. Die Chelatoren
können ebenfalls an kompakte oder gefüllte oberflächenmodifizierte Polymerkugeln gekoppelt werden. Die Füllung der Polymerkugein kann aus einem Gas. einem röntgendichten Material, einer radioaktiven Substanz oder Fluoreszenzfarbstoffen wie z.B. NLR-Farbstoffen bestehen. Die Chelatoren können auch an Dendrimerstrukturen gekoppelt werden, die wiederum mit fluoreszierenden Farbstoffen, röntgendichten, paramagnetischen. ferrimagnetischen Signaleinheiten oder mit gasgefüllten oberflächenmodifizierten polymeren Signalmolekülen dotiert sind. Die an partikuläre Träger (Nanopartikel. Kolloidpartikel, Polymerkugeln) gekoppelten Chelatoren, welche die Bindung an die multi-His-modifizieren Rezeptoren ermöglichen, können radioaktive Metalle oder Metallionen enthalten, die in der diagnostischen Bildgebung ein Signal geben.
Die gerichtete Kopplung von Selectinen kann weiterhin über andere molekulare Eigenschaften erreicht werden. So können beispielsweise die Signaleinheiten auf ihrer Oberfläche oder an ihrer Struktur Streptavidin oder andere Avidinvarianten tragen und biotinylierte Selectine binden und umgekehrt. An die Signaleinheiten kann auch ein selectinspezifischer Antikörper gekoppelt werden, der außerhalb des aktiven Zentrums des Selectins bindet, und somit dessen Bindungsfähigkeit nach Kopplung an die Signalpartikel nicht zerstört. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kontrastmittel besteht daher darin, daß der C-Terminus eines L- Selectin-Moleküls an ein Streptavidin-, Avidin- oder Biotinmolekül gekoppelt ist, die Signaleinheit ein Biotin-, Streptavidin- oder Avidinmolekül enthält, und die Kopplung durch die spezifische Bindung zwischen Streptavidin und Biotin bzw. Avidin und Biotin beim Zusammengeben der L-Selectin-Moleküle mit der Signaleinheit entsteht.
b) Kopplung mit Hilfe multimerisierter Rezeptoren
Eine zweite Möglichkeit, L-Selectin-Moleküle gerichtet an eine Signaleinheit zu koppeln, ist, L-Selectin-Chimären zu verwenden (Beispiel 3). L-Selectin-Ig-Chimären bestehen aus L-Selectin und Immunglobulindomänen. Dabei bestimmt die Art des verwendeten Immunglobulinfragmentes (Ig) den Multimerisierungsgrad der
Chimären: Ig der γ-Klasse tragen 2 Fab-Fragmente. die gegen L-Selectin ausgetauscht wurden. Somit tragen L-Selectin-lgG-Chimären 2 L-Selectinfragmente pro Molekül.
Ig der μ-Klasse tragen bis zu 10 Fab-Fragmente. die gegen L-Selectin ausgetauscht wurden. Folglich tragen die L-Selectin-IgM-Chimaren bis zu 10 L-Selectinfragmente pro Molekül. Der Abstand der Ligandenbindungszentren der L-Selecune in den Chimarenuntereinheiten entspricht dem ursprünglichen Abstand der Fab-Fragmente und betragt im allgemeinen zwischen i und 8 nm, meist ca. 5 nm.
Chimäre Moleküle können auch aus L-Selectin und weiteren multimeπsierenden Proteinen gebildet werden. Das Mannose-binding-Protein kann, bestehend aus 4 Untereinheiten, somit mit 4 L-Selectin-Einheiten dotiert werden. Das cartilage oligomenc matπx Protein (COMP. Tomschy et al., 1996) wiederum besteht aus 5 Untereinheiten, die N-terminal mit dem C-terminalen Ende des L-Selectins verknüpft werden können.
Die chimaren Moleküle aus Selectin und dem Fc-Teil von Antikörpern können entweder über einen Antikörper gegen den Fc-Teil oder über Protein A, Protein L bzw. Protein G - bakterielle Zellwandmolekule, die den Fc-Teil von Immunglobuhnen binden - geπchtet (und bereits multimeπsiert!) an Partikeloberflachen gebunden werden. Die Kopplung von Protein G an die Oberflache von Dextranmagnetiten wird in Beispiel 14 beschrieben.
Alle oben genannten chimaren Moleküle aus Selectin und einem Multimeπsierungsteil können am C-terminalen Ende weitere Modifikationen tragen, z.B. einen multi-His-tag
(Beispiel 4), an den wiederum Chelatoren binden können, die ihrerseits an
Signaleinheiten gekoppelt sind, wie in Beispiel 5 beschπeben.
Mit dem Rezeptor oder den Rezeptorgruppen sind verschiedene Signaleinheiten verbunden, je nachdem, in welchem diagnostischen Verfahren das Kontrastmittel verwendet werden soll.
Zum Beispiel können als Signaleinheiten ferπmagnetische Partikel (Magnetite, Ferπte. Cobaltferrite a.a.) verwendet verden. die aus einem monokπstallinen femmagneuschen Kern und aus einer Hülle bestehen (Beispiel 13 und 14) Die Hülle ist kovalent mit dem Kern verbunden oder umschließt den Kern vollständig ohne direkte chemische Bindung Die Hülle kann aus Dextran, Starke oder nieder- oder
hochmoiekularen aliphatischen oder aromatischen Ketten bestehen Die Hülle verfugt entweder direkt über funktionelle Gruppen (Amino-, Carboxyl-, Thiolgruppen. o a.), die zur weiteren Kopplung verwendet werden können, oder über Gruppen, die nach chemischer Aktivierung zur weiteren Kopplung funktionalisiert werden Derartige Verbindungen sind z B in WO 92 ' 12 35. WO 92/22586. EP 0 186 616 und der US 4, 101.435 beschπeben.
Es können auch Verbindungen verwendet werden, die aus der Kombination von ferπmagnetischen Partikeln und daran kovalent gekoppelten Verbindungen bestehen, wobei die kovalent gekoppelten Verbindungen mit funktioneilen Gruppen versehen sein können oder dotierbare langerkettige aliphatische Verbindungen enthalten können
Als Signaleinheiten können ferner paramagnetische Metalle und Metallverbindungen eingesetzt werden (insbesondere Gadohniumkomplexe) Hierbei wird das Metallatom von einem Chelator komplexiert. der darüber hinaus direkt oder über einen Trager vermittelt weitere funktionelle Gruppen (Amino-, Carboxyl-, Thiolgruppen, o.a.) aufweist, die zur weiteren Kopplung verwendet werden können. Der Chelator kann hierbei auch auf Dendπmeren dotiert sein (Beispiel 15), wie sie z.B. in DE 43 444 60 beschneben werden. Die genannten Anforderungen werden auch von Verbindungen erfüllt, die aus der Kombination von Chelator und einem weiteren Element bestehen, das seinerseits funktionelle Gruppen aufweist, die zur weiteren Kopplung verwendet werden können. Erfindungsgemaß können als solches Element dotierbare Dendnmere. dotierbare langerketüge aliphatische Verbindungen oder dotierbare Partikel mit einem Durchmesser von 4-200 nm. bestehend aus Magnetiten, Polystyren. Dextran. Starke usw. verwendet werden
Als Signaleinheiten können rontgendichte Moleküle (z.B. Iod- Verbindungen), Metalle, Metallverbindungen und Kolloide (z B kolloidale Goldpartikel, siehe Beispiel 6, 7 bzw. 12) eingesetzt werden. Hierbei werden die Rezeptoren oder Rεzεptorgruppen mit den rontgendichten Substanzen in Analogie zum oben genannten direkt oder indirekt verbunden. So werden lodhaltige Verbindungen mit Kopplungsgruppen eingesetzt, an die Chelatoren zur Bindung von multi-His-L-Selectinen oder Fc-bindende Substanzen
zur Bindung von L-Selectin-Chimären gekoppelt wurden. Indirekt verbunden bedeutet, daß die röntgendichten Moleküle in Signaleinheiten eingelagert werden, wobei letztere mit den Rezeptoren oder Rezeptorgruppen direkt verbunden werden.
Als Signaleinheiten können radioaktive Moleküle. Metalle, Metallverbindungen und Kolloide (z.B. kolloidale 198Au- oder 199Au-Partikel. siehe Beispiel 10 und 11 ) dienen. die in Analogie zum oben genannten an die Rezeptoren oder Rezeptorgruppen gebunden werden.
Die Bindung von L-Selectin an seine Liganden erfolgt bevorzugt unter Scherkrafteinfluß (Finger et al., 1996). Werden partikuläre Signaleinheiten an L-Selectin gekoppelt, so werden dadurch zusätzlich Scherkräfte induziert, die zu einer verbesserten Bindung des L-Selectin-Partikel-Konstruktes im Vergleich zu reinem L-Selectin führen (siehe Beispiel
8).
Als Signaleinheiten können fluoreszierende Farbstoffe (z.B. NIR-Farb Stoffe) verwendet werden. Diese können entweder direkt in Analogie zum oben genannten an die Rezeptoren oder Rezeptorgruppen gekoppelt werden, oder indirekt mit diesen verbunden werden (Beispiel 18 und 19). So können die Farbstoffe in Dendrimere dotiert werden, in kompakte oder hohle farbstoffenthaltende Polymerpartikeln eingebunden werden oder direkt an Substanzen (Protein A, Protein L, Protein G oder spezifische gegen die Multimerisierungsdomäne gerichtete Antikörper) gekoppelt werden, die wiederum an die Multimerisierungsdomänen chimärer L-Selectinmoleküle binden. Geeignete Farbstoffmoleküle und deren Herstellung werden z.B. in WO 96/17628 beschrieben.
Als Signaleinheiten können gasgefüllte oberflächenmodifizierte Polymerkugeln genutzt werden, die in Analogie zum oben genannten an die Rezeptoren oder Rezeptorgruppen gekoppelt werden (siehe Beispiele 20 bis 22).
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Klonierung und Expression von L-Selectin Aus der Igt 10 cDNA Bank der humanen Lymphomzellinie Raji wurde ein Klon isoliert, der den gesamten kodierenden Bereich von L-Selectin enthält und von 5 '- und 3 '- nicht translatierten Bereichen flankiert ist. Dieser wurde in den pCRII- Vektor des TA-CloningSystems® integriert. Das daraus resultierende Konstrukt wurde als LamTA4 bezeichnet und bildete die Grundlage für die Herstellung der L-Selectin Konstrukte. Dabei ergibt sich die Abkürzung zur Benennung (siehe auch die
Internationale Patentanmeldung WO 93/06835) des L-Selectin Konstruktes aus dem einklomerten Sequenzabschnitt. "sL"' steht für ''soluble" L-Selectin . das der löslichen Form des Moleküls entspricht, wie sie im humanen Serum vorkommt. Diese Form enthält die Lectin-, die EGF und 2 SCR-Domänen. Dagegen fehlen dieser Form die cytoplasmatische und die transmembranäre Domäne, wobei bei der Konstruktion die physiologische Schnittstelle, an der sL-Selectin von der Zelloberfläche proteolytisch abgetrennt wird, eingehalten wird. Das sL-Fragment wurde mittels PCR aus dem Ausgangsklon LamTA4 generiert und wieder in den Vektor pCRII des TA- CloningSystems® integriert. Das rekombinante sL-Selectin wurde in einer glykosylierten Form wie folgt hergestellt. Der sL-Selectin Sequenzabschnitt wurde in den Vektor pCR3.1 des TA CloningSystems® für die Expression in K562-Zellen und in den Vektor pMPSV-HE für die Expression in BHK-Zellen einkloniert. Anschließend wurden Klone isoliert und mittels Geniticin (im Falle des pCR3.1- Vektors) bzw. nach Kotransfektion mit Puromycin-resistenzvermittelnden Vektoren (im Falle des pMPSV-HE-Vektors) selektiert. Die Kulturüberstände von L-Selectin- sezernierenden K562- bzw. BHK-Zellen wurden mittels
Immunaffinitätschromatographie über CNBr aktivierte Sepharose-Matπx, an die der Antikörper DREG200 (Kishimoto et al. , 1990) gebunden wurde, gereinigt. Die Quantifizierung der Mengen von L-Selectin zur Bestimmung der Ausbeute erfolgte mittels ELISA unter Verwendung der Antikörper DREG200 und DREG55 (Kishimoto et al.. 1990).
Beispiel 2: Klonierung und Expression von multi-His-L-Selectin
Unter Verwendung eines partiell komolementaren PCR-Pπmers. der zusatzlich die
Sequenz von sechs Histidinen (multi-His) tragt, wurde ausgehend von dem
Ursprungsklon LamTA4 (siehe Beispiel 1) ein L-Selectin-Konstrukt mit C-terrmnaler Kopplungsgrunpe geneπert. Das sL-Selectin-multi-His-Fragment (kodiert das Protein mulü-His-L-Selectin) wurde in die Expressionsvektoren pCR 3 1 (Invitrogen) und unter Berücksichtigung des Leserasters in SRa-GS-Seq (Berlex Lab. , Inc.) und den Baculo Transfer Vektor pBBS 250 (Berlex Lab.. Inc.) einklomert. BHK-Zellen wurden mit multi-His-sL-Selectin-Konstrukt unter Zugabe eines Gemticin- resistenzvermittelnden Vektors transfiziert. Es wurden Klone isoliert, die in die Kulturuberstande das Protein multi-His-L-Selectin sezernieren.
Zur Expression des multi-His-L-Selectins in Insektenzellen wurde das mulü-His-sL- Selectin-Konstrukt in den Baculo Transfer Vektors überfuhrt und anschließend in das virale Genom transferiert. Mit diesen rekombinanten Viren wurden Sf9-, High Five™ und Estigmena acrea-Zellen infiziert. Die rekombinanten Proteine wurden, wie im Beispiel 1 beschπeben, mittels Immunaffinitatschromatographie an DREG200 gereinigt.
Beispiel 3: Herstellung und Expression von L-Selectin- Ig-Chimären Die L-Selectin-IgG-Chimaren, die pro Molekül 2 L-Selectine tragen, wurden von folgenden Konstrukten ausgehend hergestellt: Maus-L-Selectin-Humane-IgG-Chimare (hlgG-mLS) im pCMV5-Expressιonsvektor (Watson et al., 1990), Ratten-L-Select n- Humane-IgG-Chimare (hlgG-rLS) im pCDM8-Expressιonsvektor (Tamatam et al., 1993). Humane-L-Selectin-Humane-IgG-Chimare (hlgG-hLS) im pCMV5- Expressionsvektor (Mebius und Watson, 1993). Immunglobuline der μ-Klasse tragen 5 μ-globuhnahnliche sternförmig angeordnete Moleküle und somit 10 Fab-Fragmente, die gegen L-Selectin ausgetauscht wurden. Somit tragen L-Selectin-IgM-Chimaren 10 L-Selectinfragmente pro Molekül. Ausgehend von einem Konstrukt im pCDM8- Expressionsvektor Λurde die Maus-L-Selectm-Humane-IgM-Chimare hergestellt (Maly et al., 1996)
Die rekombinanten Expressionsvektoren wurden in E. coh amphfiziert, gereinigt und anschließend in eukarvotische Zellen transfiziert
Die rekombinanten Vektoren der Maus-L-Selectin-Humane-IgM-Chimaren wurden in COS-7 und in CHO-Kl Zellen mit einem Geniticin-resistenzvermittelnden Vektor kotransnziert. Stabil produzierende Klone beider Zellinien wurden isoliert. Zusätzlich wurde das cDNA-Fragment, das für das Chimarenprotein kodiert, mit Restπktionsendonukleasen aus dem Vektor pCDM8 herausgeschnitten und in den Vektor pcDNA3 subklomert. Mit diesem Konstrukt wurden HEK293 Zellen transfiziert und Klone isoliert. Die Aufreinigung der hlgM-mLS Chimären erfolgte mittels Immunaffinitätschromatographie an MEL-14 (Bowen et al., 1990). Die Produktion und Reinigung der Chimären wurde mittels ELISAs verfolgt (MEL-14 als Fangantikorper und anti-hlgG-Phosphatase als Deteküonsantikόrper) .
Die IgG-Chimaren Human-, Ratten- und Maus-L-Selectin-Humane-IgG-Chimaren) wurden durch Kotransfektion mit dem Vektor pcDNA3 in stabil produzierenden HEK293 und CHO-Kl Zellen hergestellt. Die Aufreinigung der hlgG-LS Chimären erfolgte mittels Affinitätschromatographie an Protein G (Pharmacia): Nach dem Auftragen des Kulturüberstandes auf die Säule, wurde die Matrix mit 20 mM
Natπumphosphat (pH 7,0) gewaschen. Eluiert wurde mit 0, 1 M Glycin (pH 2,5), die Eluate wurden mit gesättigter K2HPO4-Lόsung neutralisiert.
Beispiel 4: Herstellung und Expression von L-Selectin-Ig-multi-His-Chimären Die Maus-L-Selectin-Humane-IgG-Chimare (hlgG-mLS) im pCMV5-
Expressionsvektor (siehe Beispiel 3) wurde unter Verwendung eines partiell komplementären PCR-Pπmers, der zusätzlich die Sequenz von sechs Hisüdinen (multi-His) trägt, um eine am Fc-Fragment der Chimäre ansetzende C-terminale Histidin-Kopplungsgruppe verlängert (siehe Beispiel 2) . Die Amplifikation, Reinigung und Transfektion des rekombinanten Expressionsvektors sowie die Isolierung von stabil produzierenden HEK293 Zellklonen erfolgte, ebenso wie die Produktion und Reinigung der mulü-His-Chimaren in Analogie zu der im Beispiel 3 beschriebenen Prozedur.
Beispiel 5: Synthese von radioaktiven Chelator-Signaleinheiten und Kopplung von multi-His-L-Selectinen als szintigraphische Kontrastmittel
U.a. sind Calcein und Newport Green ( Molecular Probes, Inc. ) Nickelionen komplexierende Chelatoren, die an muiti-His-Proteine binden können. Darüber hinaus sind Calcein und Newport Green iodierbar und können so als Signaleinheit zur szintigraphischen Bildgebung eingesetzt werden. Mit 1 nMol Newport Green wurden 10 μl 0.25 M Phosphatpuffer pH 6,5-7,5 (Iodierungspuffer), der 0,2 mCi Na123I enthielt, sowie 5 μl Chloramin T (8 mg/ ml in Iodierungspuffer) für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl Na2S2O5 (8 mg/ml in Iodierungspuffer) sowie von 100 μl NaI (2 mg/ ml in Iodierungspuffer) beendet. Anschließend wurden 1 nMol L-Selectin-IgG-multi-His-Chimäre (hergestellt nach Beispiel 4) und 1 μl 50 mM NiAcetat (50 nMol) zum iodierten Newport Green hinzugegeben. Nach 20 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Produkt (L-Selecun-IgG-multi-His-Chimäre)-(Ni)-(Newport Green)-(123I) über eine PD10- Säule in Phosphatpuffer von den niedermolekularen Substanzen (Nickelionen, ungebundenem Newport Green sowie Iodierungsreaktiven) gereinigt. Der Erhalt der Bindungsfähigkeit der iodierten L-Selectin-Chimäre wurde auf Cryoschnitten mit anschließender Mikroautoradiographie nachgewiesen.
Beispiel 6: Synthese von kolloidalem Gold
Für einen 100 ml Ansatz wurden 80 ml aqua dest. und 50 μl 20% HAuCl4 vorgelegt und auf 60 °C erwärmt. Nach Zugabe einer Lösung, die 4 ml 1 % NaCitrat, 18 ml aqua dest. sowie 80 μl 1 % Tannin enthielt, wurde das Reaktionsgemisch auf 95°C für 10 Minuten erhitzt. Der Farbumschlag der Lösung von gelb zu rot zeigt die Bildung der Kolloidteilchen. Das Produkt wurde abgekühlt und sterilfiltriert. Der Durchmesser der Kolloide beträgt 8-12 nm.
Beispiel 7: Synthese von L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-kolloidalem Gold- Konstrukten Zu 10 ml kolloidalem Gold (Herstellung siehe Beispiel 6) wurden 300 μl Protein G (2 mg/ml. in aqua dest) für 1 Stunde bei Raumtemperatur gegeben. Freies, in Lösung vorliegendes ungebundenes Protein G wurde durch mehrfaches Waschen gegen Puffer
(10 tuM HEPES pH 7 4. 150 mM NaCl), mittels Zentπfugation bei 30.000 g mit einem Sorvall 80AT3-Rotor abgetrennt Die Protein G-Goldkolloide wurden in 300 μl Puffer aufgenommen. Durch Tracermessungen Konnte gezeigt werden, daß ca 15 Protein G-Molekule auf einem 10 nm kolloidalem Goidpartikel gebunden wurden Anschließend wurden die IgG-Selectinchimaren an diese Konstrukte gekoppelt. 50 ug Maus- oder Ratten-L-Selectin-IgG-Chimare wurden zu je 300 μl Protein G-kolloidales Gold gegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur konnten ca. 80-90 % der eingesetzten Chimarenmenge an die Protein G-Goldkolloide gebunden werden. Die Bindungsfahigkeit der IgG-Selectinchimaren-Protein G-Goldkolloid-Konstrukte an L- Selecünliganden wurde an Gefrierschnitten peπpherer Lymphknoten und anschließender Silberfärbung gezeigt
Beispiel 8: Surface plasmon resonance (SPR) Messungen mit L-Selectin-Ig- Chimären-Protein G- olIoidalem Gold-Konstrukten Maus- bzw Ratten-L-Selectinchimaren-Protein G-Goldkolloid-Konstrukte (Herstellung siehe Beispiel 7) wurden mit BIAcore Laufpuffer HBS+Ca2+ (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% P20, 1 mM CaCl2) einhundertfach verdünnt Als Negativkontrolle wurden die Konstrukte in HBS ohne Ca + Zugabe verdünnt Anschließend wurden die Substanzen über einen SA-Pioneer-Chip (BIAcore 2000 / BIAcore AB, Freiburg) bei einer Flußgeschwindigkeit von 20 μl/min gegeben Vorher wurden die Flußzellen mit jeweils 100 RU multivalenten Polyacrvlamid-Biotin-deπvatisierten Liganden (Syntesome GmbH, München) beladen Fc- 1 = N-Acetyllactosamin (Negativkontrolle), Fc-2 = sialyl- Lewis'' ( L-Selectinligand), Fc-3 = Sulfo-Tyrosιn-sιalyl-Lewιs,c (optimierter L- Selectinligand) Die Bindung der L-Selectinchimaren-Goldkolloid-Konstrukte erfolgte ausschließlich bei Anwesenheit von Calciumionen an Fc-2 mit 250 RU, an Fc-3 mit 700 RU Ohne Zugabe von Calαum bzw bei Verwendung von reinen L-Selectinchimaren (ohne Goldkolloidbeladung) wurde keine Bindung bzw Meßsignale im Bereich von 1 RU festgestellt
Beispiel 9: Wirknachweis mit L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Goldkolloid- Konstrukten
NMRI-Mäusen wurde je Tier 12 μg Maus- bzw. Ratten-L-Selectinchimären-Protein G- Goldkolloid-Konstrukte (Herstellung siehe Beispiel 7: Stoffmenge bezogen auf den L- Selectinchimärenanteil) bzw. als Kontrolle unbeladene Protein G-Goldkolloid- Konstrukte intravenös injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die peripheren Lymphknoten entnommen und in Gefrierschnitten mit nachfolgender Silberfärbung analysiert. Direkt nach dem "first pass" bis zu einem Zeitraum von 30 Minuten nach Injektion konnten im Falle der mit Selectinchimären-Konstrukten behandelten Tiere Goldkolloide an der luminalen Seite der hochendothelialen Venolen im Lymphknoten nachgewiesen werden. Tiere, die die Kontrollsubstanz erhielten, zeigten keinerlei Goldkolloide in den Lymphknoten.
Beispiel 10: Synthese von 198Au-Kolloid-Protein G-L-Selectin-Ig-Chimären- Konstrukten (als szintigraphisches Kontrastmittel)
100 μg der L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Goldkolloid-Konstrukte (Herstellung siehe Beispiel 7) wurden in der Neutronenstrahlaktivierungsanlage des Kernreaktors BERII in aqua dest. bestrahlt, bis eine spezifische Aktivität von 300 - 500 MBq /100 μg bezogen auf den L-Selectin- Anteil erreicht wurde.
Beispiel 11: In-vivo-szintigraphische Messung nach Gabe von 1231-Newport
Green-L-Selectin-Kontrastmittel bzw. 198Au-Kolloid-Protein G-L-Selectin-Ig-
Chimären-Kontrastmittel
Die Kaninchen wurden mit Ketamin / Xylazin narkotisiert. Die Konstrukte gemäß Beispiel 10 mit einer spezifischen Aktivität von 300 - 500 MBq /100 μg bezogen auf den L-Selectin-Anteil wurden intravenös injiziert. Mittels dynamischer Messung im Minutentakt und abschließend mit einer statischen Messung nach 30 Minuten wurden die Tiere mit der Gammakamera SP4HR (Elscint, jetzt General Electrics) untersucht. Dabei wurden vor allem die Lymphknoten untersucht. Die Tiere wurden unter der Kamera positioniert, und die erste Untersuchung erfolgte vor der Gabe des
Kontrastmittels. Im Anschluß an die Injektion wurde das Tier zu verschiedenen o.g. Zeitpunkten untersucht. Dabei wurde für die Bildgebung mit 123Iod-Isotopen ein APC
3-Kollimator und für die Darstellung der 198Au-Isotope ein APC 6-Kollimator verwendet. Lage, Größe und Erscheinungsbild der einzelnen Lymphknoten wurden bestimmt.
Beispiel 12: Tn-vivo-Röntgenbildgebung nach Gabe von L-Selectin-Ig-Chimären- Protein G-Goldkolloid-Kontrastmittel
Die Tiere (Mäuse) wurden mit 0.05 ml Ketamin/Rompun (2: 1) i. p. narkotisiert. Jeweils 25 μg der L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Goldkolloide (hergestellt nach Beispiel 7) bzw. Protein G-Goldkolloide (als Negativkontrolle) wurden intravenös injiziert. Nach 30 Minuten wurden die Tiere mit einem 7fach zoomfähigen
Mammographen (Picker) untersucht und die zervikalen und poplitealen Lymphknoten bei 25 kV und 10 mAs Bestrahlung dargestellt. Die Darstellung der Kontrastmittelanreicherung in den Lymphknoten erfolgte bei 45 kV und 4,5 mAs Bestrahlung.
Beispiel 13: Synthese von partikulären Chelator-Magnetiten und Kopplung von multi-His-L-Selectin als Magnetresonanz-Kontrastmittel
Kopplung von NTA (Nitrilotriessigsäure-Derivat; -N-[Bis-Carboxymethyl-]Lysin) an Dextranmagnetite
Die Dextranmagnetite (US 4, 101 ,435) wurden in wässriger Lösung mit einem 31fachen Teilchenüberschuß an Natriumperiodat (bezogen auf das Carboxydextran der Dextranmagnetithülle) für 30 min unter Rühren im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) oxidiert. Anschließend wurde das Natriumperiodat quantitativ über eine Gelfiltration abgetrennt. Die Dextranmagnetite wurden in Phosphatpuffer (0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0) eluiert. Anschließend wurde NTA zu den oxidierten Dextranmagnetiten hinzugegeben und für 2 h bei RT unter gelegentlichem Schütteln im Dunkeln inkubiert. Dabei konnte NTA im Überschuß an die Dextranmagnetite gekoppelt werden. Anschließend wurde 1/10 Volumen des Reduktionsmittels Dimethylboran (150 mM in H20) hinzugegeben und für weitere 2 h bei RT unter gelegentlichem
Schütteln im Dunkeln inkubiert. Der letzte Schritt wurde wiederholt, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C über Nacht. Die Abtrennung des ungebundenen NTA vom an die
Oberflache der Dextranmagnetite gebundenen NTA erfolgte über Gel- oder
Ultrafiltration. Die Dextranmagnetite wurden in PBS oder in 0.1 M HEPES (jeweils pH 7.0-7.4) eluiert und durch die Zugabe von 5 mg/ml Carboxydextran
(Endkonzentration) stabilisiert Die Partikel wurden steπlfiltπert, und es wurde Natnumazid in einer Endkonzentration von 0. 1 % hinzugegeben. Anschließend wurde der Eisengehalt der Suspension sowie die mittlere Teilchengroße der Partikel bestimmt.
Um die Kopplungseffizienz des NTA an die Partikeloberfläche zu überprüfen, wurden die Dextranmagnetite zunächst mit 10 mM EDTA in PBS oder 0.1 M HEPES für 1 h bei RT unter gelegentlichem Schuttein inkubiert. Anschließend wurde das EDTA über Gel- oder Ultrafiltration abgetrennt, und die Probe mit Co24, Nι2τ oder vergleichbaren zweiwertigen Ionen inkubiert, die von dem Chelator κomplexιert werden. Überschüssige Ionen wurden dann über Gel- oder Ultrafiltrauon von den Partikeln abgetrennt. Die Anzahl an auf der Partikeloberflache gebundenen NTA-Molekulen konnte durch eine ICP-Messung der gebundenen Ionen bei Subtraktion der Ionen, die an un modifizierte Dextranmagnetite binden, ermittelt werden.
Kopplung von multi-His-L-Selectin an NTA-Dextranmagnetite
Die NTA-tragenden Dextranmagnetite wurden zunächst mit Ni2+-Ionen (o. a. Ionen) und dann mit mulü-His-getaggten Selectinmolekulen in PBS oder 0.1 M HEPES mit 0.2% Milch (zur Reduktion unspezifischer Bindungen) für 10 min bei RT inkubiert. Ungebundene Selectinmolekule wurden über geeignete Ultrafiltrationseinheiten oder über Magnetsaulen (Miltenyi Biotec) bei angelegtem Magnetfeld) abgetrennt. Die resultierenden Kontrastmittel-Konstrukte wurden in vitro auf ihre Bindungsfahigkeu z.B. im Gefrierschnitt peπpherer Maus-Lymphknoten überprüft und konnten dann für In-vivo-Expeπmente zur Bildgebung eingesetzt werden
Beispiel 14: Synthese von Protein G-Magnetiten und Kopplung von L-Selectin-Ig- Chimären
Kopplung von Protein G an Dextranmagnetite Die Dextranmagnetite wurden zunächst wie im obigen Beispiel beschneben, mit Natπumpeπodat oxidien Überschüssiges Natπumpeπodat wurde über Gelfiltration
abgetrennt. die Dextranmagnetite wurden in Natriumazetatpuffer (100 mM Natriumazetatpuffer pH 3.9) eluiert.
Anschließend wurde Protein G hinzugeben und für 2 h bei RT im Dunkein unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Reduktion mit Dimethylboran erfolgte wie im obigen Beispiel beschrieben. Vor der Inkubation, die über Nacht stattfindet, wurde zusätzlich zur Stabilisierung der Partikel 5 mg/ml Carboxydextran (Endkonzentration) hinzugegeben. Die Abtrennung des ungebundenen Protein G erfolgte über Ultrafiltration. Die Partikel wurden sterilfiltriert, und es wurde Natriumazid in einer Endkonzentration von 0.1 % hinzugegeben. Anschließend wurde der Eisengehalt der Suspension sowie die Teilchengröße der Partikel bestimmt. Die Kopplungseffizienz konnte ermittelt werden, indem der Versuch in Anwesenheit kleinerer Mengen an radioaktiv markiertem Protein G durchgeführt wurde .
Kopplung von L-Selectin-Ig-Chimären
Anschließend wurden die Protein G tragenden Dextranmagnetite mit den IgG- Selectinchimären für mindestens 2 h bei RT oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die resultierenden Kontrastmittel-Konstrukte wurden in vitro auf ihre Bindungsfähigkeit z. B. im Gefrierschnitt peripherer Maus-Lymphknoten überprüft und konnten dann für In-vivo-Experimente zur Bildgebung eingesetzt werden. Bei ausreichend magnetischen Partikeln konnten zuvor die ungebundenen IgG-Selectinchimären über Magnetsäulen (Miltenyi Biotec) bei angelegtem Magnetfeld abgetrennt werden.
Beispiel 15: Synthese von Dendrimer-Chelator-Signaleinheiten und Kopplung von multi-His-L-Selectin
Verwendet wurden Metallchelator-tragende Dendrimere DSM-64-NTA-Gd-DTPA (Herstellung siehe WO 99/32154), die als Signaleinheit für MR-Bildgebung bis zu 28 Gadolinium-DTPA-Komplexe enthielten. 10 μg der Dendrimere, mit einer Bindungskapazität von bis zu 30 multi-His-Proteinen pro Dendrimer wurden durch Inkubation mit 50 mM Nickelacetat mit Ni2+-Ionen für 10 Minuten bei Raumtemperatur beladen und über PD IO-Gelchromatographie von ungebundenen Ni2"1"- Ionen gereinigt. Anschließend wurde der Ansatz mit 7 mg multi-His-getaggten Selectinmolekülen in 10 mM HEPES (pH 7.4) für 1 Stunde bei RT inkubiert. Ungebundene Selectinmoieküle wurden über Gelchromatographie von den multi-His-
L-Selectin-Dendrimeren abgetrennt. Der Beladungsgrad betrug durchschnittlich 10-15 multi-His-L-Selectine pro Dendrimer.
Die Bindungsfähigkeit dieser Kontrastmittel-Konstrukte wurde in vitro im Gefrierschnitt an peripheren Maus-Lymphknoten überprüft, indem die Komplexe nach Inkubation auf dem Gefrierschnitt mit dem nichtblockierenden Antikörper LAM1-14 (Mihelcic et al., 1994) und anschließender Färbung mit einem fluoreszierenden Sekundärantikörper detektiert wurden.
Beispiel 16: MR-Messung von Ex-vivo-Agar-Phantomen Die L-Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Magnetit-Konstrukte (hergestellt nach Beispiel 14) wurden Tieren (Mäusen, Ratten, Kaninchen) intravenös injiziert. Zu vorher festgelegten Zeitpunkten (z.B. 5 Minuten, 0,5 Stunden, 1 Stunde) wurden die Tiere getötet (durch Injektion einer Überdosis Narkosemittels), und verschiedene Organe (Lymphknoten. Milz, Leber) wurden entnommen und gewogen. Beispiel In-vivo-Gabe: 4 Tiere (NMRI, Schering SPF, 18 - 22 g, weibl.) Narkose: 0.05 ml Ketamin/Rompun (2: 1) i. p. Maus 1 u. 2: Kontrolltiere
Maus 3: erhielt ca. 443 (" 24.2 μg) μl DDM128N-Protein G i. v. (V. caudalis) als Kontrolle. Maus 4: erhielt ca. 525 (~ 24.3 μg) μl DDM128N-Protein G-Maus-L-Selectin-Ig- Chimären i. v. (V. caudalis)
Nach 5 Minuten wurden die peripheren Lymphknoten (inguinal, iliacal, zervikal, popliteal, axial), ein Stück der Leber und der Milz entnommen und gewogen. Vorbereitung des Agar-Phantoms: Anfertigung eines Agar-Phantoms: 2 % Agar- Lösung (für Mikrobiologie) mit 0,05 mM Magnevist®. Agar wurde in der Mikrowelle erhitzt (Einstellungen: qick digest: power 70 - 80 %, fan speed 100, time 10 min; pressure 10) bis die Lösung klar war und die Luftblasen verschwunden waren. Die erste Schicht (ca. 1-2 cm) wurde in ein rechteckiges Plastikgefäß eingefüllt, Abkühlung für ca. 30 - 60 min bei Zimmertemperatur. Die Organe wurden auf dem Agar angeordnet und mit einer 2. Schicht flüssigem Agar überschichtet. Die
Abkühlung erfolgte bis zur Aushärtung, danach wurde das Phantom im Kühlschrank gelagert.
MR-Messung: Das Phantom wurde mit verschiedenen Sequenzen gemessen. Zur
Positionsbestimmung wurde eine Tl-gewichtete Sequenz benutzt (z. B. TR 400 / TE
15, Rare Factor = 2, Averages = 4. Matrix 256 x 256, Schichtdicke 3 mm).
Anschließend wurde das Phantom mittels Eisen (Magnetit)-sensitiver Sequenzen vermessen (T2-gewichtet: TR/TE 2500/14. Rare Factor = 16. Averages = 4,
Schichtdicke 3 mm, Matrix 256 x 256; Gradienten-Echo: TR/TE 400/15, Averages =
4, Flipwinkel 30°). Für die Auswertung mit einem Bildverarbeitungsprogramm wurden ROI's (regions of interest) auf die einzelnen Organe gelegt, die
Signalintensitäten bestimmt und verglichen.
Beispiel 17: In-vivo-MR-Messung nach Gabe von L-Selectin-Magnetit- Konstrukten
Die Tiere (Mäusen, Ratten, Kaninchenj wurden narkotisiert (z. B. Ketamin / Xylazin) und die Konstrukte nach Beispiel 14 wurden intravenös injiziert. Zu vorher festgelegten Zeitpunkten (z.B. 5 Minuten, 1 Stunde, 4 Stunden) wurden die Tiere mit der Magnet-Resonanz-Tomographie untersucht. Dabei wurden vor allem die Lymphknoten und entzündete Areale untersucht. Die Tiere wurden im MR-Gerät positioniert und die erste Untersuchung erfolgte vor der Gabe des Kontrastmittels. Im Anschluß an die Injektion wurde das Tier zu verschiedenen o.g. Zeitpunkten mit verschiedenen Sequenzen untersucht. Zur Positionsbestimmung wurde eine Tl- gewichtete Sequenz benutzt (z. B. TR 400 / TE 15, Rare Factor = 2. Averages = 4, Matrix 256 x 256, Schichtdicke 3 mm). Anschließend wurden die Tiere mittels Eisensensitiver Sequenzen dargestellt (z. B. T2-gewichtet: TR/TE 2500/14, Rare Factor = 16, Averages = 4, Schichtdicke 3 mm. Matrix 256 x 256: Gradienten-Echo: TR/TE 400/15, Averages = 4, Flipwinkel 30°). Für die Auswertung mit einem
Bildverarbeitungsprogramm wurden ROI's (regions of interest) auf die einzelnen Organe gelegt, die Signalintensitäten bestimmt und verglichen. Lage, Größe und Erscheinungsbild der einzelnen Lymphknoten wurden bestimmt.
Beispiel 18: Direkte und indirekte Kopplung von NER- Farbstoffen an L-Selectin-
Ig-Chimären l, r-Bis-(4-sulfobutyl)indotricarbocyanin-5-carbonsäure wird in Anlehnung an bekannte Literaturverfahren durch Umsetzung mit 3-Aminopropyl-t-butylcarbamat. Freisetzung der Aminogruppe durch saure Spaltung mit Trifluoressigsäure. in Aminopropyl]-bis-l, r-(4-sulfobutyl)indotricarbocyanin-5-carbonsäureamid übergeführt. Dieser, im folgenden als NIR-Farbstoff bezeichnet, wurde direkt mit den Maus- und Ratten-L-Selectin-Ig-Chimären kovalent gekoppelt. Die Kopplung erfolgt über eine Aminogruppe des Farbstoffes an die oxidierte Chimäre. Dabei erfolgte die Oxidation mittels Natriumperiodat mit einem 31fachen Molekülüberschuß bezogen auf die Stoffmenge der Chimäre (100 μg) für 30 min unter Rühren im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT). Anschließend wurde das Natriumperiodat quantitativ über eine Gelfiltration abgetrennt und die Farbstoffinkubation mit 50fachem Überschuß an NIR- Farbstoff angeschlossen. Anschließend wurde 1/10 Volumen des Reduktionsmittels Dimethylboran (150 mM in H20) hinzugegeben und für weitere 2 h bei RT unter gelegentlichem Schütteln im Dunkeln inkubiert. Nicht gebundener Farbstoff und Reduktionsmittel wurde durch Ultrafiltration in Phosphatpuffer (0.1 M Phosphatpuffer pH 7.0) abgetrennt. Die L-Selectin-Ig-Chimären konnten mit je 2-5 NIR- Farbstoff molekülen beladen werden, deren Fluoreszenzquantenausbeute bei etwa 50% des Ausgangswertes lag. Die Bindungsfähigkeit der NIR-L-Selectin-Ig-Chimären wurde in vitro im Gefrierschnitt an peripheren Maus-Lymphknoten überprüft, indem die Lokalisation der NIR-fluoreszierenden Komplexe nach Inkubation direkt mittels NIR-CCD-Mikroskopkamera gezeigt wurde. Bei der indirekten Markierung wurde 15 μg Protein G mittels Natriumperiodat mit einem 30fachen Molekülüberschuß bezogen auf die Stoffmenge an Protein G - wie für die direkte Markierung beschrieben - oxidiert, zwischengereinigt und mit 50fachem Überschuß an NIR-Farbstoff Lil96 inkubiert. Reduktion mit Dimethylboran und anschließende Reinigung erfolgten wie oben beschrieben. Anschließend wurden in einem Volumen von 100 μl in 10 mM HEPES (pH 7.4) 10 μg der NIR-Protein G- nnϊ'iσn e Tπt ^c.'.imo'ar n ^tot m ng π.π VTau<=- bz Ratten-L-Se!ectin-Tg- Chimären (60 μg) über Nacht bei 4°C versetzt. Eine Abtrennung der einzelnen Ausgangskomponenten vom sich gebildeten L-Selectin-Ig-Chimären-NIR-Protein G-
Komplex war nicht erforderlich, da sich dieser zu 90% gebildet hatte, und die verbliebenen 10% der L-Selectin-Ig-Chimaren die Bindung der Komplexe in vitro im Gefπerschmtt an peπphere Maus-Lymphknoten kompetitiv nicht behinderten.
Beispiel 19: In-vivo-NIR-Messung nach Gabe von L-Selectin-NIR-Konstrukten
Die Tiere (Mäuse, Kaninchen) wurden narkotisiert (z. B. Ketamin / Xylaz ), und die Konstrukte wurden intravenös injiziert. NMRI-Mäusen wurde je Tier 12 μg direkt markierte NIR-Maus-L-Selectinchimären (siehe Beispiel 18) intravenös injiziert. Eine Stunde nach der Injektion konnten die peripheren zervikalen und poplitealen Lymphknoten unter NIR-Fluoreszenz mit einer NIR-CCD-Kamera (RTE/CCD-576, Visitron Systems GmbH) direkt dargestellt werden.
Beispiel 20: Funktionalisierte gasgefüllte Mikrokapseln
(a) Herstellung der Mikrokapselsuspension
In einem 20 1 Reaktor werden 7 1 einer wäßrigen l%igen Octoxynol-Losung bei einem pH-Wert von 2 5 vorgelegt und mit einem Rotor-Stator-Mischer bei hohem Schergefalle gemischt, so dass eine Selbstbegasung mit starker Schaumbildung erfolgt 100 g Cyanacrylsaurebutylester werden rasch (<1 Minute) zugegeben und dispergiert Es wird 60 Minuten unter Selbst-begasung polymeπsiert, wobei sich gasgefüllte Mikrokapseln ausbilden In einem Scheidetrichter wird das Flotat separiert, der Unterstand abgelassen und das Flotat mit 3 1 einer waßπgen 0.02%igen Octoxynol-Losung resuspendiert Die so erhaltene Mikrokapselsuspension hat einen Polymergehalt von 9 46 mg ml, eine Dichte von 0 943 g/ml und einen pH-Wert von 3 5
(b) Funktionalisierung der gasgefüllten Mikrokapseln durch partielle Seitenkettenhydroiyse
2500 g einer Mikrokapselsuspension gemäß (a) werden unter Ruhren mit 501g
Natronlauge der Konzentration 8 * 10"2 mol/1 versetzt Es resultiert im Reaktionsansatz ein pH- Wert von 12 1 Es wird 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt Anschließend wird der pH- Wert mit 1 N Salzsaure auf pH 3 5 eingestellt
Beispiei 21: Bindung von L-Seiektin an funktionalisierte gasgefüllte Mikrokapseln
Die Mikrokapselsuspension gemäß Beispiel 20 wird durch mindestens 5maiige Flotation gereinigt. 1 ml der gereinigten Mikrokapselsuspension mit einer Konzentration von 5*109 Partikeln pro ml werden in 10 mM Acetat, pH 4.0 umgepuffert und mit 0.1 M EDC/NHS aktiviert. .Anschließend wird mit 0.25 mg Protein G (5facher Überschuß) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch eine ISminύtige Inkubation mit IM Ethanolamin abgeschlossen. Die gasgefullten Mikrokapseln, an denen Protein G gebunden wurde, werden durch mehrfaches Waschen mittels Zentrifugation bei max. 500 g gereinigt. Die gereinigten, gasgefüllten Protein G-bindenden Mikrokapseln werden über Nacht mit 100 μg L- Selektin-Ig-Chimaren inkubiert. 50 % der L-Selektinmenge wurde an den Mikrokapseln gebunden (FACS-Messung: Sättigungsreihe mit anti-Selektin-Antikorpern).
Beispiel 22: In-vivo-sonographische Messung nach Gabe von L-Selectin-Ig- Chimären-Protein G-Polymermikrokapseln
Die Kaninchen wurden mit Ketamin / Xylazin narkotisiert. 1 ml der echogenen L- Selectin-Ig-Chimären-Protein G-Polymermikrokapseln (L-Selectin-
Polymermikrokapseln, siehe Beispiel 21) mit einer Konzentration von 1*109 Partikel/ml in isotoner wässriger Dispersion wurden intravenös injiziert. Als Kontrolle wurden Protein G-Polymermikrokapseln ohne L-Selectin-Ig-Chimären-Beladung injiziert. Direkt nach Gabe des Kontrastmittels wurde mit der sonographischen Bildgebung der cervicalen und poputealen Lymphknoten im Harmonie Imaging Modus begonnen. Aufgrund der hepatischen Clearance ungebundener Polymermikrokapseln erreichte nach 30 Minuten das Signal-Hintergrundsverhältnis der sich im Target anreichernden L-Selectin-Polymermikrokapseln optimale Werte.
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Claims
1. Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytaren Liganden verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß ein Rezeptor, ein Rezeptorfragment oder eine Gruppe von Rezeptoren für spezifisch exprimierte endotheliale Liganden in definierter Ausrichtung an eine Signaleinheit gekoppelt sind.
2. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die definierte Ausrichtung des Rezeptors dadurch zustande kommt, daß das C-terminale Ende des
Rezeptors an die Signaleinheit gekoppelt wird, während das die Bindungsdomäne enthaltende N-terminale Ende des Rezeptors von der Signaleinheit weg gerichtet ist.
3. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor aus mindestens 2 Molekülen besteht.
4. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens 2 Moleküle einen Abstand am N-terminalen Ende von 1-8 nm zeigen, oder aber einen Abstand aufweisen, der dem Abstand der N-terminalen Enden von chimaren Molekülen entsprechen, also z.B. Rezeptoren die gegen die Fab-Fragmente von Immunglobulingrundgerüsten substitutiert wurden.
5. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein L-Selectin-Derivat ist.
6. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor L- Selectin ist.
7. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor eine L-Selectin-Ig-Chimäre ist.
8. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein paramagnetisches Teilchen enthält.
9. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein superparamagnetisches Teilchen enthält.
10. Kontrastmittel gemäß Anspruch 6. dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein superparamagnetisches Eisenoxidteilchen ist.
11. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein mit Gas gefülltes Teilchen ist.
12. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein paramagnetisches Metallatom enthält.
13. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein Schwermetallion enthält.
14. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein iodhaltiges Molekül enthält.
15. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein Radionuklid enthält.
16. Kontrastmittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Signaleinheit ein Farbstoffmolekül enthält, welches Nahinfrarotstrahlung absorbiert.
17. Kontrastmittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor mit Hilfe einer 'Kopplungsgruppe an die Signaleinheit gekoppelt ist.
18. Kontrastmittel gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsgruppe ein Polyhistidinrest ist.
19. Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozyt ren Liganden verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß ein multimerisieπer Rezeptor, welcher an die endothelialen Liganden bindet, an eine Signaleinheit gekoppelt wird.
20. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der multimerisierte Rezeptor eine L-Selectin-Ig-Chimäre ist.
21. Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytaren Liganden verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Rezeptoren, welche an die endothelialen Liganden binden, definiert und gerichtet mit Hilfe einer Kopplungsgruppe an eine
Signaleinheit gekoppelt werden.
22. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsgruppe ein Polyhistidinrest ist.
23. Verfahren zur Herstellung von Kontrastmitteln zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytaren Liganden verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß der C-Terminus eines L-Selectin-Moleküls an ein Streptavidin-, Avidin- oder Biotinmolekül gekoppelt ist, die Signaleinheit ein Biotin-, Streptavidin- oder Avidinmolekül enthält, und die Kopplung durch die spezifische Bindung zwischen Streptavidin und Biotin bzw. Avidin und Biotin beim
Zusammengeben der L-Selectin-Moleküle mit der Signaleinheit entsteht.
24. Verwendung von L-Selectin-Ig-Chimären zur Herstellung von Kontrastmitteln für die Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder von pathologischen Veränderungen, welche mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytaren Liganden verbunden sind.
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