KR102035187B1 - 지질-기반 나노입자들 - Google Patents

지질-기반 나노입자들 Download PDF

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KR102035187B1
KR102035187B1 KR1020197007384A KR20197007384A KR102035187B1 KR 102035187 B1 KR102035187 B1 KR 102035187B1 KR 1020197007384 A KR1020197007384 A KR 1020197007384A KR 20197007384 A KR20197007384 A KR 20197007384A KR 102035187 B1 KR102035187 B1 KR 102035187B1
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아난스 안나프라가다
제이슨 엘. 에릭슨
에릭 에이. 타니품
인드라니 다스굽타
스티븐 씨. 쿡
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보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
알제카 바이오사이언시스, 엘엘씨
보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 휴스턴 시스템
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Abstract

지질-기반 나노입자 조성물들이 제공된다. 일반적으로, 조성물들은 지질-친수성 중합체-아밀로이드 결합 리간드 공액체들을 포함하며, 리포솜 조성물들일 수 있다. 리포솜 조성물들을 포함하는 조성물들은 알츠하이머병의 특징인 아밀로이드-β 플라크 침착들의 치료 및/또는 영상화에 유용할 수 있다.

Description

지질-기반 나노입자들{LIPID-BASED NANOPARTICLES}
관련 출원들에 대한 교차-참조
본 출원은 2011년 4월 6일자로 출원된, 미국 가출원 특허 제 61/472,605호의 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에 이의 전문이 참조병합된다.
연방정부가 후원하는 연구 또는 개발에 대한 성명(STATEMENT)
본 발명은 미국 국방부가 수여하는 W81XWH-09-2-0139 하에 정부의 원조로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 여하한 권리를 갖는다.
알츠하이머병("AD")은 기억 상실과 여타 인지 결함(cognitive deficit)들을 특징으로 하는 신경퇴행성 질병이다. AD는 치매의 가장 흔한 형태이며, 65세 이상인 경우 8명 중 1명, 85세 이상인 경우 2명 중 1명에 영향을 미친다. AD는 미국 내 사망 원인 중 6번째이다. 550만명 이상의 미국인들이 AD를 앓고 있으며, 이는 연간 추정 2천억 미국 달러의 비용이 든다. 2050년에는, AD가 2천만명 이상의 미국인들에 영향을 미칠 것이며 (2011년 달러를 기준으로) 연간 치료 비용(price tag)이 1조 1천억 미국 달러에 달할 것으로 예상된다. 전 세계적으로, 2011년도 추정 수치는 3천7백만명 이상이었으며, 관련 비용은 6천억 달러(USD)였다.
AD의 치료 및 인지에 있어서 상당한 방해요인은 효과적인 진단 시험들의 부족이다. 현재, 전형적으로 AD는 사후 조직병리학적 분석에 의해서만 확정적으로 진단받는다. 주로, 살아있는 환자들에 대한 진단은 인지 장애(cognitive impairment)를 감지하기 위한 정신 감정(psychiatric testing)에 의존한다. 그러나, 임상적 증상들을 인식할 수 있기 전에, AD의 주요한 신경병리학적 특징(hallmark)들인 세포 외 아밀로이드-β("Aβ") 플라크 침착(plaque deposit)들 및 세포 내 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle)들이 장기간 나타난다. 또한, Aβ 침착들은 출혈성 뇌졸중의 주요한 위험 요소에 해당한다.
따라서, 두개 내의(intracranial) Aβ 플라크 침착들을 생체 내에서(in vivo) 영상화(imaging)하는데 적합한 진단용의 조성물 및 방법들의 필요성, 그리고 Aβ 플라크 침착들의 방지를 목적으로 하는 치료법에 대한 효과의 모니터링(monitor)의 필요성이 존재한다. 현재의 접근법들은 하나 이상의 무수한 결점들로 고민되고 있으며, 상기 결점들에는 침습성(invasiveness), Aβ 침착들에 대한 영상화제(imaging agent)들의 특이성 결여, 부적합한 분해능(resolution), 영상화제들의 효과적인 혈액-뇌장벽(blood-brain barrier: "BBB")의 통과(cross) 불능, 일부 영상화제들의 Aβ 침착들 부근 내에서 부적절하게 격심한 염증 전(high pro-inflammatory) 반응 유도 경향, 및 부적절한 세포독성이 포함된다. 따라서, 더욱더 두개 내의 Aβ 플라크 침착들을 생체 내에서 영상화하는데 적합하나, 현재의 접근법들의 하나 이상의 결점들로 고민하지 않는 조성물들과 방법들에 대한 필요성이 존재한다. 더욱더, AD의 치료 또는 예방을 돕거나 치료하는데 적합한 조성물들과 방법들에 대한 필요성이 존재한다.
일 실시형태에서, 식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염(salt)이나 프로드러그(prodrug)가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00001
여기서 R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, 식 I의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DPPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민("DSPE"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DSPC"), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민("DPPE") 및 이와 유사한 것들과 공액결합(conjugated)하여, 지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체(conjugate)를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계(introducing);
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합(associated)되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅱ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00002
여기서 R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, 식 Ⅱ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 인지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅲ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00003
여기서 R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, 식 Ⅲ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅲ 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅲ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅲ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅳ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00004
여기서 R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, 식 Ⅳ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅴ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00005
여기서 R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, 식 Ⅴ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅴ 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅴ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅴ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅵ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00006
여기서 R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, 식 Ⅵ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅵ 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅵ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅵ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅶ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00007
여기서 R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이며; 그리고 여기서 a, b, c, d, e는 C, N, O 또는 S이다.
일 실시형태에서, 식 Ⅶ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅶ 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅶ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅶ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물이 제공되고, 상기 리포솜 조성물은:
인지질;
콜레스테롤, 또는 또 다른 안정화 첨가제(stabilizing excipient), 이를 테면 또 다른 스테롤이나 지방산;
비방사성 가돌리늄-함유 조영 증강제(nonradioactive gadolinium-containing contrast enhancing agent);
중합체에 의해 유도된 인지질; 및
식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 방향족 화합물을 포함하는 공액체, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같은 지질-친수성 중합체-방향족 공액체의 형태로의 공액체를 포함한다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물은:
DPPC;
콜레스테롤;
(디에틸렌트리아민펜타아세트산)-비스(스테아릴아미드), 가돌리늄 염("Gd-DTPA-BSA")
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]("DSPE-mPEG-2000"; CAS No. 147867-65-0); 및
DSPE-PEGn-메톡시-XO4[여기서, n(즉, 에틸렌 글리콜의 반복 단위의 개수)은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60임]을 포함한다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
인지질; 콜레스테롤, 또는 또 다른 안정화 첨가제, 이를 테면 또 다른 스테롤이나 지방산; 비방사성 가돌리늄-함유 조영 증강제; 중합체에 의해 유도된 인지질; 그리고 식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 방향족 화합물을 포함하는 공액체, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같은 지질-친수성 중합체-방향족 공액체의 형태로의 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 형광 영상(fluorescence imaging: FI)에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 자기 공명 영상(MRI)에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography: CT) 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물이 제공되고, 상기 리포솜 조성물은 인지질; 콜레스테롤, 또는 또 다른 안정화 첨가제, 이를 테면 또 다른 스테롤이나 지방산; 비방사성 요오드화된 조영 증강제; 중합체에 의해 유도된 인지질; 그리고 식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 방향족 화합물을 포함하는 공액체, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같은 지질-친수성 중합체-방향족 화합물 공액체의 형태로의 공액체를 포함한다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물은 DPPC; 콜레스테롤; 아이오딕사놀(iodixanol); DSPE-mPEG-2000; 및 DSPE-PEGn-메톡시-XO4(여기서, n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60임)를 포함한다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
인지질; 콜레스테롤, 또는 또 다른 안정화 첨가제, 이를 테면 또 다른 스테롤이나 지방산; 비방사성 요오드화된 조영 증강제; 중합체에 의해 유도된 인지질; 그리고 식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 방향족 화합물을 포함하는 공액체, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같은 지질-친수성 중합체-방향족 화합물 공액체의 형태로의 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
첨부된 도면들에서, 화학식들, 화학 구조들 및 실험 데이타는 하기에 제공되는 상세한 설명과 함께 제시되며, 주장하는 발명의 예시적인 실시형태들을 설명한다.
도 1은 지질-친수성 중합체-방향족 리간드 공액체, DSPE-PEGn-메톡시-XO4("Me-XO4")의 합성에 대한 예시적인 도식을 나타낸다.
도 1a는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4의 예시적인 투과 전자 현미경("TEM") 영상들을 나타낸다.
도 1b는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4의 추가적인 예시적 TEM 영상들을 나타낸다.
도 2a는 Me-XO4-표지된 리포솜들의 합성 Aβ(1-40) 피브릴(fibril)들에 대한 결합 친화도(binding affinity)를 나타낸다.
도 2b는 합성 Aβ(1-40) 피브릴들 상의 결합 부위들에 대하여, Me-XO4-표지된 리포솜들, 크리사민 G(Chrysamine G: "CG") 및 유리된(free) 메톡시-XO4 리간드 간의 경쟁에 대한 예시적인 결과들을 나타낸다.
도 3은 생체 외에서(ex vivo) Me-XO4-표지된 리포솜들로 염색된 쥐의 뇌 조직의 예시적인 결과들을 나타낸다.
도 4는 생체 외에서, 쥐의 뇌 조직 상에서 Aβ 플라크 침착들 상의 결합 부위들에 대한 Me-XO4-표지된 리포솜들과 CG 간의 경쟁에 대한 예시적인 결과들을 나타낸다.
도 5는 생체 내에서 Me-XO4-표지된 리포솜들, 및 유리된 메톡시-XO4 리간드로 염색된 쥐의 뇌 조직의 예시적인 결과들을 나타낸다.
도 6은 Me-XO4-표지된 리포솜들이 주사된 쥐 뇌의 시상면(sagittal section)으로부터의 예시적인 공초점 현미경(confocal microscope) 영상들의 광학적 재구성을 나타낸다.
도 7은 유리된 메톡시-XO4 리간드와 Me-XO4 공액체 간의 염증 가능성(inflammatory potential)에 대한 예시적인 비교를 나타낸다.
도 8은 유리된 메톡시-XO4 리간드와 Me-XO4 공액체 간의 세포 독성에 대한 예시적인 비교를 나타낸다.
도 9a는 DSPE-PEG-3-플루오로-4-아미노메틸페닐 보론산 공액체와 유리된 리간드인 3-플루오로-4-아미노메틸페닐 보론산 간의 세포 독성에 대한 비교를 나타낸다.
도 9b는 DSPE-PEG-4-아미노피리미딘 보론산 공액체와 유리된 리간드인 4-아미노피리미딘 보론산 간의 염증 가능성에 대한 비교를 나타낸다.
도 10은 (1) Aβ 피브릴들만 함유한 샘플, 요오드화된 조영제를 캡슐화(encapsulating)하는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4를 함유한 샘플, 및 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4와 Aβ 피브릴들을 함유한 샘플 간의 UV(365 nm) 형광 영상(fluorescence) 비교; (2) Aβ 피브릴들만 함유한 샘플, 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4를 함유한 샘플, 및 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4와 Aβ 피브릴들을 함유한 샘플 간의 상용-등급(commercial-grade) CT 영상들 비교; 및 (3) Aβ 피브릴들만 함유한 샘플, 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4를 함유한 샘플, 및 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4와 Aβ 피브릴들을 함유한 샘플 간의 임상-등급(clinical-grade) CT 영상들 비교를 나타낸다.
일 실시형태에서, 식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00008
여기서 R, R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, R은 H이고, R1은 H이며, R2는 H이고, 그리고 R1'와 R2'는 함께 -0-CH2-0- 결합(linkage)을 형성하여 1,3-벤조디옥솔을 형성한다. 따라서, 식 I의 화합물 중 일 예시는 1,4-퀴녹살린 페닐 1,3-벤조디옥솔일 화합물(IA)이다:
Figure 112019025865763-pat00009
.
또 다른 실시형태에서, R은 H이고, R1은 H이며, R2는 H이고, R1'는 H이며, 그리고 R2'는 NMe2이다. 따라서, 식 I의 화합물 중 또 다른 예시는 1,4-퀴녹살린 바이페닐 화합물(IB)이다:
Figure 112019025865763-pat00010
.
일 실시형태에서, 식 I의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00011
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
또 다른 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00012
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 I 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MR 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅱ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00013
여기서 R, R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, R은 H이고, R1은 H이며, R2는 H이고, R1'는 H이며, 그리고 R2'는 OMe이다. 따라서, 식 Ⅱ의 화합물 중 일 예시는 1,4-퀴녹살린 페닐 피리디닐 화합물(ⅡA)이다:
Figure 112019025865763-pat00014
.
식 Ⅱ의 화합물 중 또 다른 예시는 1,4-퀴녹살린 페닐 피리디닐 화합물(ⅡB)이다:
Figure 112019025865763-pat00015
.
일 실시형태에서, 식 Ⅱ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00016
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
또 다른 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00017
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅱ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MR 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅲ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00018
여기서 R, R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, R은 H이고, R1은 H이며, R2는 H이고, R1'는 OMe이며, 그리고 R2'는 OMe이다. 따라서, 식 Ⅲ의 화합물 중 일 예시는 1,4-퀴녹살린 페닐 피리미디닐 화합물(ⅢA)이다:
Figure 112019025865763-pat00019
.
일 실시형태에서, 식 Ⅲ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅲ 리간드 공액체를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅲ 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00020
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅲ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅲ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MR 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅳ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00021
여기서 R, R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, R은 H이고, R1은 Me이며, R2는 H이고, 그리고 R1'와 R2'는 함께 -0-CH2-0- 결합을 형성하여 1,3-벤조디옥솔을 형성한다. 따라서, 식 Ⅳ의 화합물 중 일 예시는 1,4-벤즈옥사진 페닐 1,3-벤조디옥솔일 화합물(ⅣA)이다:
Figure 112019025865763-pat00022
.
또 다른 실시형태에서, R은 H이고, R1은 Me이며, R2는 H이고, R1'는 H이며, 그리고 R2'는 NMe2이다. 따라서, 식 IV의 화합물 중 또 다른 예시는 1,4-벤즈옥사진 바이페닐 화합물(ⅣB)이다:
Figure 112019025865763-pat00023
.
일 실시형태에서, 식 Ⅳ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00024
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
또 다른 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00025
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅳ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MR 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅴ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00026
여기서 R, R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, R은 H이고, R1은 Me이며, R2는 H이고, R1'는 H이며, 그리고 R2'는 OMe이다. 따라서, 식 Ⅴ의 화합물 중 일 예시는 1,4-벤즈옥사진 페닐 피리디닐 화합물(ⅤA)이다:
Figure 112019025865763-pat00027
.
일 실시형태에서, 식 Ⅴ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅴ 리간드 공액체를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅴ 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00028
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅴ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅴ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MR 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅵ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00029
여기서 R, R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이다.
일 실시형태에서, R은 H이고, R1은 Me이며, R2는 H이고, R1'는 OMe이며, 그리고 R2'는 OMe이다. 따라서, 식 Ⅵ의 화합물 중 일 예시는 1,4-퀴녹살린 페닐 피리미디닐 화합물(ⅥA)이다:
Figure 112019025865763-pat00030
.
일 실시형태에서, 식 Ⅵ의 방향족 헤테로사이클은 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅵ 리간드 공액체를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅵ 리간드 공액체는:
Figure 112019025865763-pat00031
를 포함하며,
여기서 n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60이다.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅵ 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅵ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MR 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 식 Ⅶ의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이나 프로드러그가 제공된다:
Figure 112019025865763-pat00032
여기서 R, R1, R2, R1', R2'는 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이고, a, b, c, d, e는 C, N, O 또는 S이다.
일 실시형태에서, R은 OMe이고, R1은 H이며, R2는 O-알킬이고, R1'는 OH이며, 그리고 R2'는 H이다. 따라서, 식 Ⅶ의 화합물 중 일 예시는 디비닐 벤젠 화합물(ⅦA)["메톡시-XO4"]이다:
Figure 112019025865763-pat00033
.
일 실시형태에서, 식 Ⅶ의 방향족 화합물은 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-식 Ⅶ 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 메톡시-XO4 리간드는 PEG 및 DSPE와 공액결합하여, 도 1에서 "1"(하기에서 때때로 "Me-XO4"로 지칭됨)로 나타내는 DSPE-PEGn-메톡시-XO4 공액체를 형성할 수 있다:
Figure 112019025865763-pat00034
.
일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-식 Ⅶ 리간드 공액체, 예를 들어 Me-XO4, 그리고 더욱더 바람직하게 DPSE-PEG3400-메톡시-XO4(여기서, 3400은 폴리에틸렌 글리콜의 분자량을 의미함)는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-식 Ⅶ 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MR 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다.
일 실시형태에서, 콩고 레드(Congo red)와 이의 유도체들, 티오플라빈(Thioflavin) T와 이의 유도체들, 및 CG와 이의 유도체들을 포함하나 이로 제한되지 않는 하나 이상의 대안적인 아밀로이드 리간드들(즉, 상기에 개시된 아밀로이드 결합 리간드들 이외의 것들)은, 친수성 중합체, 예를 들어 (예를 들어, 500 내지 10,000 Da의 범위의 분자량을 가지는) PEG 및 이와 유사한 것들, 그리고 지질, 예를 들어 DPPC, DSPE, DSPC, DPPE 및 이와 유사한 것들과 공액결합하여, 지질-친수성 중합체-아밀로이드 리간드 공액체를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 지질-친수성 중합체-아밀로이드 리간드 공액체는 리포솜 조성물 내에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 병변(lesion)들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
지질-친수성 중합체-아밀로이드 리간드 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
더욱더, 본 명세서에서 설명되는 리포솜 조성물들은 치료용(therapeutic) 분자들을 아밀로이드 병변들로 전달시킬 수 있으므로, 상기 병변들을 치료할 수 있다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물이 제공되고, 상기 리포솜 조성물은 인지질; 콜레스테롤, 또는 또 다른 안정화 첨가제, 이를 테면 또 다른 스테롤이나 지방산; 비방사성 가돌리늄-함유 조영 증강제; 중합체에 의해 유도된 인지질; 그리고 식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 방향족 화합물을 포함하는 공액체, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같은 지질-친수성 중합체-방향족 공액체의 형태로의 공액체를 포함한다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물은 DPPC; 콜레스테롤; Gd-DTPA-BSA; DSPE-mPEG-2000; 및 DSPE-PEGn-메톡시-XO4(여기서, n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60임)를 포함한다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
인지질; 콜레스테롤, 또는 또 다른 안정화 첨가제, 이를 테면 또 다른 스테롤이나 지방산; 비방사성 가돌리늄-함유 조영 증강제; 중합체에 의해 유도된 인지질; 그리고 식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 방향족 화합물을 포함하는 공액체, 이를 테면 본 명세서에서 설명된 바와 같은 지질-친수성 중합체-방향족 화합물 공액체의 형태로의 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 MRI에 의한 검출 단계를 포함한다. 실제로, 친수성의 상자성(paramagnetic) 킬레이트들, 이를 테면 GdDTPA, GdDOTA, GdHPD03A, GdDTPA-BMA 및 GdDTPA-BSA가 MRI 조영제들로 알려져 있다. Klaveness et al.에 의해 출원된 미국 특허 제 5,676,928호를 참조하며, 이는 본 명세서에서 이의 전문이 참조병합된다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다. 또한, GdDTPA 및 이의 유도체들과 같은 상자성 킬레이트들은 X-선 조영제들로서 사용될 수 있다. VanDeripe에 의해 출원된 미국 특허 제 5,204,085호를 참조하며, 이는 본 명세서에서 이의 전문이 참조병합된다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물이 제공되고, 상기 리포솜 조성물은 인지질; 콜레스테롤; 중합체에 의해 유도된 인지질; 그리고 식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 화합물을 포함하는 공액체를 포함하며, 여기서 상기 리포솜 조성물은 비방사성 요오드화된 조영 증강제를 캡슐화한다.
적합한 인지질들은 본 명세서에 개시된 것들을 포함할 수 있고, Annapragada et al.에 의해 출원된 미국 특허 제 7,785,568호에 기재된 것들을 더 포함할 수 있으며, 이는 본 명세서에서 이의 전문이 참조병합된다. 중합체에 의해 유도된 적합한 인지질들은 본 명세서에 개시된 것들을 포함할 수 있고, 미국 특허 제 7,785,568호에 개시된 것들을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 비방사성 요오드화된 조영 증강제들은 아이오딕사놀 및 아이오헥솔(iohexol)을 포함할 수 있고, 미국 특허 제 7,785,568호에 기재된 것들을 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 리포솜 조성물은 DPPC; 콜레스테롤; 아이오딕사놀; DSPE-mPEG-2000; 및 DSPE-PEGn-메톡시-XO4(여기서, n은 약 10 내지 약 100, 또는 약 30 내지 약 60임)를 포함한다.
일 실시형태에서, 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은:
인지질; 콜레스테롤; 중합체에 의해 유도된 인지질; 그리고 식 Ｉ 내지 Ⅶ 중 어느 하나의 화합물을 포함하는 공액체를 포함하는 검출가능한 양의 리포솜 조성물(여기서, 상기 리포솜 조성물은 비방사성 요오드화된 조영 증강제를 캡슐화함)을 환자 내로 주입하는 단계;
하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합되도록 상기 리포솜 조성물에게 충분한 시간을 주는 단계; 및
상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 검출 단계는 FI에 의한 검출 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 검출 단계는 CT 영상을 포함하는 X-선 영상에 의한 검출 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 검출 단계는 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 의한 검출 단계를 포함하고, 비-방사성 조영 증강제가 방사성 조영 증강제로 대체되며, 이는 예를 들어 National Institute of Health's Molecular Imaging and Contrast Agent Database("MICAD")에서 SPECT 영상 및/또는 PET 영상에 사용하기 적합하다고 여겨지는 조영 증강제들을 포함한다. 본 기술분야의 전문가에 의해 알려진 여타의 적합한 종류의 여하한 영상화 방법론(imaging methodology)이 고려되며, PET 영상을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 환자(subject)의 관심 부위의 영상을 포착(capturing)하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: 조성물을 환자의 혈류 내로 주입하는 단계(여기서, 상기 조성물은 리포솜들을 포함하고; 상기 리포솜들은 하나 이상의 인지질, 중합체에 의해 유도된 하나 이상의 인지질, 인지질-중합체-방향족 화합물 공액체, 및 콜레스테롤을 포함하며; 상기 리포솜들은 하나 이상의 요오드화된 비방사성 조영 증강제를 캡슐화함); 및 상기 관심 부위를 X-선으로 조사(irradiating)하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 관심 부위는 인간의 뇌 부위이고, 더욱 특히 인간의 뇌 상에 침착된 Aβ 플라크를 가지는 인간의 뇌 부위이다.
실시예들
여하한 실시형태들이 하기에 실시예들의 형태로 설명된다. 본 발명의 모든 가능성이 있는 적용을 서술하는 것은 불가능하다. 따라서, 실시형태들이 상당히 자세하게 설명된다 할지라도, 이는 첨부된 청구항들의 범위를 여하한 특정 실시형태 또는 상세한 설명으로 제한하려는 방식이 아니며, 또한 이로 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1: DSPE-PEG 3400 -메톡시-XO4 공액체(1)의 제조.
DSPE-PEGMW=3400-메톡시-XO4 공액체(1)는 표적으로 하는 종으로서 합성되었고(도 1), 이후에 리포솜 제형(formulation)들 내에 포함되었다.
도 1을 언급하자면, 연결기(linker)-메톡시-XO4 잔기(moiety)인 화합물 14의 합성은 일련의 Takai, Suzuki 및 Julia-Kocienski 올레핀화(olefination) 반응들을 통하여 달성되었다. Boc-보호화된 3-단위 PEG 연결기 전구체(precursor) 브로마이드(3)는 대응하는 상업적으로 사용가능한 알코올(2)로부터 좋은 수율로 제조되었다. 또한, Julia-Kocienski 올레핀화 단계를 위한 술폰인 중간체(7)는 뛰어난 수율로 4-하이드록시벤즈알데히드로부터 제조되었다. 또한, 4-하이드록시벤즈알데히드는 별도로 표준 Takai 프로토콜(protocol)를 조건으로 하여, 비닐 아이오다이드(9)를 산출하였다. Suzuki 조건들 하에서 9가 상업적으로 사용가능한 보론산(10)과 반응하여, 좋은 수율로 화합물 11을 산출하였다. 연결기 잔기가 정량적으로 결합(installed)하여 알데히드(12)를 얻었고, 이는 최적화된 Julia-Kocienski 조건들 하에서 술폰(7)에 노출되어, 컬럼 크로마토그래피 정제 후에 69 % 수율로 원하는 E,E-이성질체(13)가 얻어졌다. HCl에 의한 MOM 및 Boc 기들의 전체적인 탈보호화로, 하이드로클로라이드 염으로서 연결기-메톡시-XO4 잔기(14)가 얻어졌다.
지질-PEG 잔기에 대한 공액화(Conjugation)는 표준 카르보디이미드 조건들 하에 14와 DSPE-PEGMW=34OO-COOH를 가함으로써(subjecting) 진행되어, DSPE-PEGMW=3400-MeXO4 공액체(1)[Me-XO4의 서브세트(subset)]가 산출되었다.
실시예 2: Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들의 제조 및 특성 평가(characterization).
각각 약 32.4:40:25:2:0.5:0.1의 몰 비율(molar ratio)로 DPPC, 콜레스테롤, Gd-DTPA-BSA, DSPE-mPEG-2000, Me-XO4 및 로다민-DHPE(광학 검출용)를 포함하는 지질 혼합물(50 mM)이 이용되었다. 여타 비율들이 고려되며, 여기에는 약 32.5:40:25:2:0.5의 몰 비율로 DPPC, 콜레스테롤, Gd-DTPA-BSA, DSPE-mPEG-2000 및 Me-XO4를 포함하는 지질이 포함된다. 게다가, 32.5:40:25:2.5 비율의 DPPC, 콜레스테롤, Gd-DTPA-BSA, Me-XO4 공액체를 얻기 위하여, DSPE-mPEG-2000 모두가 Me-XO4 공액체로 대체될 수 있다. PEG-함유 분자에 대한 상한치는 약 15 내지 25 %일 수 있고, 콜레스테롤에 대한 하한치는 약 15 내지 20 %일 수 있다. 프로핸스(Prohance) 용액 내에서 1.5 시간 동안 수화하자마자, 200 nm 핵기공 막(Nuclepore membrane)을 통과하는 다섯 개의 관(pass)들과 100 nm 막을 통과하는 열 개의 관들을 갖는 Lipexthermoline 압출기로, 65 ℃에서, 연속적으로 혼합물이 압출되었다. 입자 크기 분포는 TEM에 의해 결정되었고(도 1a 및 1b), 이로 인해 평균 직경이 약 100.8 nm이고 PDI가 약 0.05라는 것을 확인하였다.
입자들 내의 Me-XO4 리간드의 농도는 Me-XO4 리간드에 대하여 산출되는 형광 표준 곡선을 사용하여 26 μM로 결정되었다. 상기 프로토콜은 지질 이중층의 내부면들과 외부면들 간에 표적 리간드 분포가 거의 동일하게 되었다. 이는 나노입자들 내의 Me-XO4 리간드의 각각 보고된 농도에 대하여, 전체 Me-XO4 리간드들 중 대략 50 %가 결합하는데 사용가능하다는 것을 암시한다. Me-XO4 리간드는 본질적으로 매우 형광성(highly intrinsically fluorescent)이며, 그래서 나노입자들은 Me-XO4 리간드를 함유한다. 이런 특성은 모든 실험들의 과정에서 나노입자들의 위치들에 대한 리포터(reporter)로서 사용되었다.
실시예 3: 실험관 내에서 ( in vitro ) Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들의 합성 Aβ 피브릴들에 대한 결합 친화도.
실시예 2의 Me-XO4-표지된 리포솜들 및 Me-XO4 리간드 저장 용액이 10 mM Tris-HCl(pH 7.4)에 의해 500 nM로 희석되었다. 소량의 100 μM Aβ 저장 용액이 시험 화합물들에 첨가되어, 20 μM의 최종 피브릴 농도를 얻었다. 적절한 농도의 비-형광 경쟁자(competitor)인 CG의 첨가가 뒤이었다. 결합 혼합물은 RT에서 1시간 동안 배양되었고, 이후에 20분 동안 16,400 rpm으로 원심분리되어, 피브릴들이 분리되었다. 침전물은 tris-HCl로 두 번 세정되었다. 형광은 각각 368 nm 및 450 nm의 여기(excitation) 파장 및 방출 파장을 사용하여, SpectraMax 384 플레이트 판독기(reader)로 측정되었다.
도 2a는 실시예 2의 Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들의 합성 Aβ(1-40) 응집체(aggregate)들에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 도 2b는 결합 부위들에 대하여 유리된 Me-XO4 리간드와 경쟁하는 Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들의 능력을 나타낸다.
실시예 4: 생체 외에서 쥐의 뇌 조직 염색.
실시예 2의 Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들의 Aβ 플라크들과의 결합 능력은 APP/PSEN1 형질전환된 쥐의 세포주(transgenic mouse line)로부터의 뇌 절편(section)들을 염색시킴으로써 평가되었다. 쥐들은 인간의 AD 병리(pathology)에서 관찰되는 것과 유사하게 연령-관련 방식으로 대뇌 피질(cortical) 및 해마(hippocampal) Aβ 플라크가 점진적으로 발생하도록 유전자 조작(engineered)되었다. 안락사시킨 형질전환되지 않은 쥐들(대조군), 5개월 및 7개월 된 APP/PSEN1 쥐들로부터의 시상(Saggital) 절편들(30 ㎛ 두께)이 리포솜들의 3 mM 용액(용액 내의 Me-XO4 농도는 1 μM이었음) 내에서, 2시간 동안, RT에서 배양되었다. 결합하지 않은 리포솜들을 제거하기 위하여 PBS에 의한 광범위한 세정이 뒤이었다. 염색된 조직들은 바탕 형광(background fluorescence)을 감소시키기 위하여 Vecta-Shield 고정용 배지(mounting media)와 함께 고정되었고, 공초점 현미경 하에서 관찰되었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 형질전환되지 않은 쥐들의 슬라이드(패널 I)은 플라크들이 없기 때문에 뚜렷한 형광 지점들이 보이지 않았다. 대뇌 아밀로이드 혈관병증(cerebral amyloid angiopathy)[패널 Ⅳ]뿐만 아니라 뚜렷한 플라크 침착들(패널 Ⅱ 및 Ⅲ)이 5개월 된 쥐들이 아니라, 7개월 된 쥐들로부터의 뇌 절편들 상에서 상기 제제(agent)에 의해 밝게 되었다(highlighted). 유사한 절편들에 유리된 메톡시-XO4 리간드에 함께 동일한 프로토콜이 적용된 경우, 동일한 플라크 침착 패턴이 관찰되었다.
Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들의 뇌 조직 내 Aβ 플라크 침착들과의 선택적 결합 능력을 추가적으로 확인하기 위하여, 염색 프로토콜이 1 μM Me-XO4와 함께 CG의 농도를 증가시키면서 반복되었다. 결과들(도 4)은 CG 농도를 증가시킴에 따라 피질(cortex)[A] 및 해마(B) 둘 모두에서 표지된 플라크들의 개수와 형광 세기가 줄어드는 것을 나타내었다.
실시예 5: 7개월 된 APP/PSEN1 형질전환된 쥐의 세포주에 있어서 생체 내에서 Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들의 대뇌 피질 및 해마의 플라크들로의 전달.
Gd-함유 Me-XO4-표지된 리포솜들이 꼬리 정맥(vain) 주사에 의해 5개월 및 7개월 된 APP/PSEN1 쥐들에 투여되었다. 주사한 다음 48시간 후, 쥐들은 안락사되었고, 쥐들의 뇌들이 공초점 광학 현미경(confocal light microscopic) 연구들을 위하여 절단(sectioned)되었다. 동일한 쥐들에는 양성 대조군(positive control)으로 역할을 하는 분자/유리된 메톡시-XO4 리간들, 및 음성 대조군으로서 식염수(saline) 및 비표적화된 리포솜들이 주사되었다.
여하한 5개월 된 쥐들로부터의 뇌 조직 절편들이 영상화되었을 때, 주목할 만한 형광이 없었다(플라크들이 없음을 나타냄). 식염수 및 비표적화된 리포솜들(패널 Ⅰ)이 주사된 7개월 된 쥐들로부터의 절편들(도 5)도 형광을 나타내지 않았다. 유리된 메톡시-XO4 리간드(패널 Ⅱ 및 Ⅲ)가 주사된 동일한 쥐들은 대뇌 피질 및 해마의 플라크들 둘 모두에서 밝은 염색부분(staining)을 나타내었다. Gd-함유 Me-XO4 리포솜들이 주사된 동물들(패널 Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ)은 유사한 플라크 침착들 및 혈관의 병리를 나타내었다.
이 연구에서 나노입자 처리된 쥐들 중 하나로부터의 슬라이드에 대한 영상들의 광학 재구성(도 6)은 피질(A 부분 내에서 최-상부의 네 개의 화살표들) 및 해마(B 부분 내에서 최-하부의 네 개의 화살표들) 내에서 대개 형광으로 병소 부위(localization)를 나타냈다. Gd-함유 Me-XO4 리포솜들은 BBB 장벽(barrier)을 관통하였고, 뇌를 통하여 침투하여 이동하였다.
실시예 6: Me-XO4의 염증 가능성.
아밀로이드 침착 주위의 염증은 AD 진행에 대하여 주요한 위험 요소라고 여겨진다. 따라서, 영상화제들은 적은(low) 또는 감소된(reduced) 염증 위험성을 나타내는 것이 매우 바람직하다. 일반적으로, 지질-PEG-리간드 공액체들은 사실상 염증성인 경향이 있다. 실제로, 구조에 있어서 지질-PEG-리간드 공액체들과 유사한 지질다당체(lipopolysaccharides: "LPS")들은 알려진 염증성 조성물들 중 가장 최고의 염증성 조성물이다.
Me-XO4의 염증 가능성은 유리된(즉, 결합하지 않은) 메톡시-XO4 리간드, LPS, 및 처리되지 않은 대조군(untreated control: "UTC")과 비교되었다. 시토졸(cytosol)에서부터 핵으로의 NF-kb의 이동(Translocation)은 염증 반응에 있어서 초기에 발생한다. 염증 가능성을 가지는(receiving) 경우, NF-kb가 세포질에서부터 핵으로 이동하고, 유전자 전사를 유도한다. 그러므로, NF-kB의 이동은 염증에 관하여 널리 사용되는 표지(marker)이다. 간단하게, 프로토콜이 하기에 약술된다.
15,000 헬라(Hela) 세포들이 각각 96 홈(well) 플레이트들 내에 평판배양되었고, 하룻밤 동안 놓아두었다. 세포들은 상이한 농도의 시험 화합물들로 2시간 동안 37 ℃ 배양기(incubator) 내에서 처리되었다. 양성 대조군은 1 mg/mL LPS로 처리되었다. 배양 기간 중 마지막에, 배지를 빨아들이고, 세포들은 PBS로 세정되었다. 세포들은 (세포들을 고정하기 위하여) 4 % 파라포름알데히드로 10분 동안 RT에서 처리되었다. 세포들은 얼음처럼 차가운(ice cold) PBS로 두 번 세정되었다. 세포들은 PBS 내의 0.25 % Triton-X-100과 함께 10분 동안 RT에서 배양되었고, 다시 PBS로 세 번(각각 5분씩 세정) 세정되었다. 세포들은 PBS-T(0.1 % Tween-20을 포함하는 PBS) 내의 1 % BSA와 함께 45분 동안 RT에서 배양되었다. 배양 기간 중 마지막에, 세포들은 추가적으로 NF-kB에 대항하는 일차 항체와 함께 PBST 내에서 1:50으로 희석되어 1시간 동안 RT에서 배양되었다. 세포들은 다시 PBS로 세 번(각각 5분씩) 세정되었다. 세포들은 이차 항체와 함께 PBST 내에서 1시간 동안 RT에서 배양되었고, 다시 PBS로 세 번(각각 5분씩) 세정되었다. 100 ㎕의 DAPI(1 μg/mL)가 각각의 홈에 위치되었고, 추가적인 분석 때까지 4 ℃로 유지되었다. 세포들은 Cell Lab IC-100 image cytometer(Beckman-Coulter, CA) 상에서 스캔되었다. 데이타는 Vala Sciences사(CA)로부터의 Cytseer software를 사용하여 추가적으로 분석되었고, 핵 마스크(nuclear mask)를 통하여 나타나는 단백질 강도(intensity)의 피어슨 상관 계수(Pearson's Correlation coefficient: PCC)로 나타내었다.
의외로, Me-XO4가 시험된 최고 농도(500 nM)를 제외하고 시험된 모든 것들에서 유리된 메톡시-XO4 리간드보다 염증성이 덜 하다는 것을 알아내었다. 결과들은 도 7에 나타낸다.
따라서, 본 명세서의 하나 이상의 실시형태들은 공액결합된 및/또는 리포솜 아밀로이드 결합 리간드가 유리된 리간드보다 염증성이 덜하거나 (또는 최소한 더하지 않는)다는 것을 특히 알려주고 있다.
실시예 7: Me-XO4의 세포독성.
Me-XO4의 세포독성은 유리된(즉, 결합하지 않은) 메톡시-XO4 리간드 및 처리되지 않은 대조군과 비교되었다. 시험 화합물들의 독성은 표준 MTT 어세이(assay)들을 사용하여 평가되었다. 15,000 헬라(Hela) 세포들이 각각 96 홈 플레이트들 내에 평판배양되었고, 하룻밤 동안 놓아두었다. 세포들은 세 개의 상이한 농도의 시험 화합물들로 2시간 동안 37 ℃ 배양기 내에서 처리되었다. 양성 대조군은 1 mg/mL LPS로 처리되었다. 배양 기간 중 마지막에, MTS 세포 독성 어세이 키트(Promega사로부터의 Cell titer 96 AQueous Assay kit)가 제조사의 프로토콜에 따라서 사용되었다. 배양 기간 중 마지막에, 세포들은 15 ㎕ MTS 시약/100 ㎕ 배지로 3시간 동안 37 ℃에서 처리되었다. 3시간 배양한 후, 흡광도는 플레이트 판독기(plate reader)를 사용하여 490 nm에서 기록되었다.
의외로, Me-XO4가 유리된 메톡시-XO4 리간드보다 세포독성이 덜 하다는 것을 알아내었다. 결과들은 도 8에 나타낸다. 따라서, 본 명세서의 하나 이상의 실시형태들은 공액결합된 및/또는 리포솜 아밀로이드 결합 리간드가 유리된 리간드보다 독성이 덜하거나 (또는 최소한 더하지 않는)다는 것을 특히 알려주고 있다.
(비교) 실시예 8: 지질-PEG 앵커(anchor)에 공액결합된 보론산 리간드의 세포독성 및 염증 가능성.
3-플루오로-4-아미노메틸페닐보론산의 세포독성은 상기 실시예 7에서 설명된 바와 같은 동일한 프로토콜들에 따라서, 공액결합된 리간드 즉, DSPE-PEG-3-플루오로-4-아미노메틸페닐보론산, LPS 및 처리되지 않은 대조군과 비교되었다. 도 9a는 세포들의 생존 비율(surviving fraction)을 나타낸다. 예상대로, 공액결합된 리간드는 유리된 리간드보다 상당히 더 독성이다.
4-아미노피리미딘 보론산의 염증 가능성은 상기 실시예 6에 설명된 바와 같은 동일한 프로토콜들에 따라서, 공액결합된 리간드 즉, DSPE-PEG-4-아미노피리미딘 보론산, LPS 및 처리되지 않은 대조군과 비교되었다. 도 9b는 헬라(HeLa) 세포들 내에서 NFκB 분자의 핵 및 세포질 비율(fractions) 간의 PCC를 나타낸다. 예상대로, 공액결합된 리간드는 유리된 리간드보다 상당히 더 염증성이다.
실시예 9: 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들의 제조 및 특성 평가.
약 57:40:2.5:0.5의 몰 비율로 DPPC, 콜레스테롤, DSPE-mPEG-2000 및 Me-XO4를 포함하는 지질 혼합물(30 mM)이 에탄올에 용해되었다. 실시예 9에 예시한 바와 같이 요오드화된 조영 증강제를 캡슐화하든지 아니면 (실시예 2에 예시한 바와 같이) 가돌리늄 조영 증강제에 결합 및/또는 가돌리늄 조영 증강제를 캡슐화하든지 여하간에, 예를 들어 각각, 약 40 내지 70:10 내지 50:0.1 내지 10:0.1 내지 10의 몰 비율로 인지질:콜레스테롤:중합체에 의해 유도된 인지질:인지질-친수성 중합체-방향족 화합물 공액체를 포함하는, 다양한 리포솜 조성물들에 대한 여타 구성요소의 몰 비율이 고려된다는 점에 주목해야 한다.
아이오딕사놀(525 mg/ml) 용액은 증류수에 아이오딕사놀 분말을 60 ℃에서 용해시킴으로써 제조되었다. 에탄올 용액이 아이오딕사놀 용액에 의해 수화되었고, 연속해서 400 nm 핵기공 막을 통과하는 여덟 개의 관들을 갖는 Lipexthermoline 압출기(Northern Lipids Inc., Canada)로 압출되었다. 얻어진 용액은 500 kDa 분획분자량(molecular weight cut-off)의 MicroKros® module(Spectrum Laboratories, CA)을 사용하여 정용여과(diafiltered)되어, 캡슐화되지 않은 아이오딕사놀을 제거하였다. 최종 리포솜 용액 내의 요오드 농도는 UV 흡수 분광 광도법(245 nm에서의 λAbs)에 의해 정량화되었고, 약 8.01 mg I/ml 리포솜 조성물이었다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이 다양한 리포솜 조성물들에 대하여 여타 요오드 농도들이 고려되며, 약 5 mg I/ml 리포솜 조성물 내지 200 mg I/ml 리포솜 조성물을 포함한다는 점에 주목해야 한다. 일 특정 실시형태에서, 인지질, 콜레스테롤, 중합체에 의해 유도된 인지질 및 인지질-친수성 중합체-방향족 화합물 공액체를 약 40 내지 70:10 내지 50:0.1 내지 10:0.1 내지 10의 몰 비율로 포함하는 리포솜 조성물은, ml의 리포솜 조성물 당 약 150 mg I를 캡슐화할 수 있다.
최종 생성물 내의 Me-XO4의 농도는 UV 흡수 분광 광도법(365 nm에서의 λAbs)을 사용하여 결정되었다. 리포솜들은 약 50 내지 약 400 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 리포솜들은 약 100 내지 약 150 nm의 평균 직경을 갖는다.
실시예 10: 실험관 내에서 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들의 Aβ 피브릴들과의 결합.
실험관 내에서의 CT 영상 연구들은 아밀로이드 플라크들의 가시화를 활성화시키기 위하여 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들 및 Aβ 피브릴들을 사용하여 실시되었다.
Aβ 피브릴들의 제조: β-아밀로이드[1-40, 초순도(ultrapure), TFA, r펩티드]는 최종 농도가 100 μM될 때까지 PBS 완충용액(buffer)에 용해되었고, RT에서 하룻밤 지속적으로 교반되었다. 20 μM의 피브릴들은 1.25 μM의 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들과 함께 1시간 동안 배양되었다. 결합되지 않은 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들은, 피브릴들을 4 ℃에서 24시간 동안 중력에 의해 가라앉도록 하고, 4 ℃에서 10분 동안 5,000 rpm으로의 저속 원심분리에 의해 분리시킴으로써 제거되었고, 펠릿(pellet)을 형성하였다. 피브릴 펠릿은 세 번 PBS 완충용액으로 세정되었다. 피브릴들은 튜브들을 가볍게 두드림으로써 0.5 ml의 PBS 완충용액 내에 재-현탁되었다.
한천 인체모형(Agar Phantom)들의 제조: 2 % 한천 용액은 80 내지 100 ℃에서 멸균수(sterile water)로 제조되었다. 한천 용액은 RT까지 냉각되었다. 냉각 단계 동안, 한천이 겔이 되기 전에(~45 ℃), 0.5 ml의 시험 샘플(Aβ 피브릴들만; 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들; 또는 Aβ 피브릴들과 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들)이 한천 용액에 첨가되었고, 균질화하기 위하여 진탕되었다. 인체모형들은 완전히 겔화(gel)되었고, 추가적인 사용 전까지 4 ℃로 유지되었다.
따라서, 하기의 한천 인체모형들이 제조되었다:
1. Aβ 피브릴들이 현탁된 한천 인체모형(대조군).
2. 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들이 현탁된 한천 인체모형(대조군).
3. Aβ 피브릴들을 함유한 요오드-캡슐화된 Me-XO4-표지 리포솜들이 현탁된 한천 인체모형.
영상화: 인체모형들은 UV광, 마이크로(micro)-CT 스캐너 및 임상용 CT 스캐너를 사용하여 영상화되었다. UV 조사(radiation)[365 nm] 하에서 샘플들의 사진들이 9 픽셀 카메라로 기록되었다. CT 영상화는 Siemens Inveon 마이크로-CT 스캐너 또는 임상용 GE LightSpeed64-slice MDCT로 실시되었다. 하기의 스캔 파라미터(parameter)들은 마이크로-CT 영상을 위하여 사용되었다: 80 kVp, 500 microA, 750 msec의 노출 시간. 마이크로-CT 영상들이 0.14 mm의 복셀(voxel) 크기로 얻어졌다. 하기의 파라미터들은 임상용 64-MDCT를 위하여 사용되었다: 80 kVp, 320 mA, 1.375 나선 피치 지수(spiral pitch factor). 임상용 CT 영상들이 0.625 mm의 복셀 크기로 얻어졌다.
도 10은: (1) Aβ 피브릴들만 함유한 샘플, 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4를 함유한 샘플, 및 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4와 Aβ 피브릴들을 함유한 샘플 간의 UV(365 nm) 형광의 비교; (2) Aβ 피브릴들만 함유한 샘플, 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4를 함유한 샘플, 및 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4와 Aβ 피브릴들을 함유한 샘플 간의 상용-등급(commercial-grade) CT 영상들의 비교; 및 (3) Aβ 피브릴들만 함유한 샘플, 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4를 함유한 샘플, 및 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4와 Aβ 피브릴들을 함유한 샘플 간의 임상-등급(clinical-grade) CT 영상들의 비교를 나타낸다.
UV 광(365 nm) 하에서, 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4는 밝은 빛으로 형광을 냈다("ADx-CT만"으로 제목을 붙인 세로단). 빛이 균일하게 분포되어 샘플 전체가 여하한 별개의 점들 없이 빛났다. 그러나, Aβ 피브릴들의 클러스터(cluster)가 혼합물 내에 도입되는 경우("ADx-CT + 피브릴들"), 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4가 피브릴들과 결합하면서, 피브릴들 주위의 형광 농도로 인하여 초점이 있는(focal) 밝은 점들이 나타났다. 샘플들이 상용 및 임상용-CT 영상 장치(imaging instrument)들 내에 배치되었을 때 결과들이 확인되었으며, 여기서 요오드화된 조영제를 캡슐화하는 리포솜 Me-XO4와 결합한 Aβ 피브릴들의 클러스터들은 샘플들 내에서 밝은 점들로 나타났다.
상세한 설명 및 청구항에서 사용된 "포함한다" 또는 "포함하는"이라는 용어의 범위는, 청구항에서 연결어(transitional word)로서 이용되는 경우에 이 용어들이 해석되는 바와 같이 "포함한"이라는 용어와 유사한 방식으로 포괄적으로 의도된다. 더욱이, "또는"이라는 용어가 이용되는 범위(예를 들어, A 또는 B)는 "A 또는 B 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 의도된다. "A 또는 B뿐이며 둘 모두는 아니다"를 의도하는 경우, 이후에 "A 또는 B뿐이며 둘 모두는 아니다"라는 용어가 이용될 것이다. 따라서, 본 명세서에서 "또는"이라는 용어의 사용은 포괄적이며, 한정적으로 사용되지 않는다. 상세한 설명 및 청구항들에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a," "an" 및 "the"는 복수형을 포함한다. 마지막으로, "약"이라는 용어가 숫자와 함께 사용되는 경우, 이는 상기 숫자의 ± 10 %를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "약 10"은 9 내지 11을 의미할 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, 본원 출원이 실시형태들의 서술에 의해 설명되고, 실시형태들이 상당히 상세하게 설명되었을지라도, 이는 이러한 상세한 설명으로 첨부된 청구항들의 범위를 제한하려는 여하한 방식 또는 한정하려는 것을 의도하지 않는다. 추가적인 이점들 및 변형(modification)들이 본 기술분야의 전문가들에게 손쉽게 나타날 것이며, 이는 본 출원의 이익을 포함한다. 그러므로, 광범위한 측면에서, 본 출원은 나타낸 상세한 설명들 및 예시적인 실시예들로 제한되지 않는다. 일반적인 발명 개념의 범위 또는 정신으로부터 벗어남 없이 상기 상세한 설명 및 실시예들로부터 새로운 시도(Departure)들이 만들어질 수 있다.

Claims (12)

  1. 리포솜 조성물에 있어서,
    DPPC, DSPE, DSPC 및 DPPE로부터 선택되는 제 1 인지질,
    콜레스테롤,
    PEG와 공액결합(conjugated)한 DPPC, DSPE, DSPC 또는 DPPE인 제 2 인지질, 및
    PEG와 공액결합한 DPPC, DSPE, DSPC 또는 DPPE를 포함하는, 인지질-중합체-방향족 화합물 공액체(conjugate)인 제 3 인지질[상기 인지질-중합체-방향족 화합물 공액체 내의 방향족 화합물은 하기식 Ｉ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ 또는 Ⅶ 중 하나로 나타내고:
    Figure 112019067628766-pat00057

    Figure 112019067628766-pat00058
    ;
    여기서 R, R1, R2, R1' 및 R2'는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이고; 그리고
    a, b, c, d, e는 독립적으로 C, N, O 또는 S임]을 포함하는 막(membrane); 그리고
    하나 이상의 상기 막에 의해 캡슐화(encapsulated)되거나 상기 막에 결합된 비방사성 조영 증강제(nonradioactive contrast enhancing agent)를 포함하는 리포솜 조성물에 있어서,
    상기 비방사성 조영 증강제가 요오드화된 조영 증강제를 포함하는 리포솜 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 비방사성 조영 증강제가 아이오딕사놀(iodixanol) 또는 아이오헥솔(iohexol)을 포함하는 리포솜 조성물.
  3. 삭제
  4. 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하기 위한 리포솜 조성물에 있어서,
    - 상기 리포솜 조성물의 검출가능한 양은 환자 내로 주입되고, 여기서 상기 리포솜 조성물은,
    DPPC, DSPE, DSPC 및 DPPE로부터 선택되는 제 1 인지질,
    콜레스테롤,
    PEG와 공액결합한 DPPC, DSPE, DSPC 또는 DPPE인 제 2 인지질, 및
    PEG와 공액결합한 DPPC, DSPE, DSPC 또는 DPPE를 포함하는, 인지질-중합체-방향족 화합물 공액체인 제 3 인지질[상기 인지질-중합체-방향족 화합물 공액체 내의 방향족 화합물은 하기식 Ｉ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ 또는 Ⅶ 중 하나로 나타내고
    Figure 112019067628766-pat00059

    Figure 112019067628766-pat00060
    ;
    여기서 R, R1, R2, R1' 및 R2'는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이고; 그리고
    a, b, c, d, e는 독립적으로 C, N, O 또는 S임]를 포함하는 막; 그리고
    하나 이상의 상기 막에 의해 캡슐화되거나 상기 막에 결합된 비방사성 조영 증강제를 포함함
    - 상기 리포솜 조성물은 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합(associated)되도록 충분한 시간이 주어지고;
    - 상기 하나 이상의 아밀로이드 침착들과 회합된 상기 리포솜 조성물이 검출되는 것을 특징으로 하는 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하기 위한 리포솜 조성물에 있어서,
    상기 검출이 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography)을 사용하여 검출하는 것을 포함하는 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하기 위한 리포솜 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 비방사성 조영 증강제가 요오드화된 조영 증강제를 포함하는 리포솜 조성물.
  6. 하기의 화합물:
    인지질-중합체-방향족 공액체[상기 인지질-중합체-방향족 공액체 내의 방향족 잔기(moiety)는 하기식 I, II, III, IV, V, VI 또는 VII 중 하나로 나타내고:
    Figure 112019503389822-pat00061
    Figure 112019503389822-pat00062

    Figure 112019503389822-pat00063
    Figure 112019503389822-pat00064

    Figure 112019503389822-pat00065

    Figure 112019503389822-pat00066
    Figure 112019503389822-pat00067

    여기서 R, R1, R2, R1' 및 R2'는 독립적으로 H, F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, OH, O-알킬, O-아릴, NH2, NH-알킬, N-디알킬, 카르복실, 술포닐, 카르바모일 또는 글리코실이고; 그리고
    a, b, c, d, e는 독립적으로 C, N, O 또는 S임].
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 인지질-중합체-방향족 공액체 내의 방향족 잔기는 하기식 IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IVA, IVB, VA, VIA 또는 VIIA 중 하나로 나타내는 화합물:
    Figure 112019067628766-pat00068

    Figure 112019067628766-pat00069
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 인지질-중합체-방향족 공액체가 하기식 중 하나를 포함하고:
    Figure 112019067628766-pat00070

    Figure 112019067628766-pat00071

    Figure 112019067628766-pat00072

    여기서 n이 10 내지 100인 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 인지질-중합체-방향족 공액체 내의 방향족 잔기는 하기식 IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IVA, IVB, VA, VIA 또는 VIIA 중 하나로 나타내는 리포솜 조성물:
    Figure 112019067628766-pat00073

    Figure 112019067628766-pat00074
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 인지질-중합체-방향족 공액체가 하기식 중 하나를 포함하고:
    Figure 112019067628766-pat00075

    Figure 112019067628766-pat00076

    Figure 112019067628766-pat00077

    여기서 n이 10 내지 100인 리포솜 조성물.
  11. 제 4 항에 있어서,
    상기 인지질-중합체-방향족 공액체 내의 방향족 잔기는 하기식 IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IVA, IVB, VA, VIA 또는 VIIA 중 하나로 나타내는 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하기 위한 리포솜 조성물:
    Figure 112019067628766-pat00078

    Figure 112019067628766-pat00079
  12. 제 4 항에 있어서,
    상기 인지질-중합체-방향족 공액체가 하기식 중 하나를 포함하고:
    Figure 112019067628766-pat00080

    Figure 112019067628766-pat00081

    Figure 112019067628766-pat00082

    여기서 n이 10 내지 100인 환자 내의 아밀로이드 침착들을 영상화하기 위한 리포솜 조성물.
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