KR20230012461A - 알파-시누클레인 침착의 mri를 위한 표적화된 조영제 - Google Patents

알파-시누클레인 침착의 mri를 위한 표적화된 조영제 Download PDF

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KR20230012461A
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phospholipid
syn
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에릭 에이. 타니퓸
시엔웨이 선
아난스 애나프라가다
칼로 메디시
Original Assignee
텍사스 칠드런스 하스피탈
알제카 바이오사이언시스, 엘엘씨
에릭 에이. 타니퓸
시엔웨이 선
아난스 애나프라가다
칼로 메디시
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Abstract

리포솜 조성물("ADx-003")이 제공되며, ADx-003은 제1 인지질; 리포솜 조성물을 안정화시킬 수 있는 입체적으로 벌키한 부형제; 제1 중합체에 의해 유도체화된 제2 인지질; 거대환식 가돌리늄계 이미징제; 및 제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질을 포함하고, 제2 중합체는 표적화 리간드에 접합되고, 표적화 리간드는 하기 화학식 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내어진다:
Figure pct00059

상기 식 중, X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고; Y는 -CH-CH=CH- 또는 (II)이고; A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고; A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OCH3, -NO2, -N(CH3)2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다.

Description

알파-시누클레인 침착의 MRI를 위한 표적화된 조영제
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/975,265호로부터의 우선권을 주장하고, 이것은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
파킨슨병("PD": Parkinson's disease) 및 알츠하이머병("AD": Alzheimer's disease)과 같은 신경퇴행성 장애는 상이한 뇌 위치에서 미스폴딩된 단백질 응집체의 병리학적 침착물을 특징으로 한다. 이 미스폴딩된 단백질 응집체는 PD에서는 루이소체("LB": Lewy body) 및 루이 신경돌기("LN": Lewy neurite) 및 AD에서는 아밀로이드-베타("Aβ") 플라크 및 과인산화된 타우 매듭의 형태의 알파-시누클레인("α-syn") 응집체를 포함한다. PD는 AD 다음에 제2의 가장 흔한 신경퇴행성 질환이고, 운동완서, 강직, 진전 및 자세 불안정을 포함하는 운동 증후군을 임상적으로 특징으로 한다. 운동 증후군은 루이 병리학의 세포질 침착을 동반하는 흑질에서의 도파민성 뉴런의 퇴행에 의해 야기된다. PD 사후분석 연구에서의 α-syn의 구역 분포는 루이 병리학이 후구 및 하부 뇌간으로부터 기원하고, 중추 신경계의 다른 영역으로 계속해서 확산한다는 것을 제시한다. 높은 수준의 LB 및 LN이 임의의 PD-관련된 운동 증후군의 환자 증세 발생 전에 연수/교뇌 피개 및 전방 후각 구조(브라크(Braak) 1 및 2 병기)에서 관찰된다. 그 병리학이 흑질 및 중뇌 및 전뇌의 기저 부분 내의 다른 핵으로 확산할 때 PD-관련된 운동 증후군은 중간 병기(브라크 3 및 4 병기)에서 오직 증세 발생하기 시작한다. PD 치매("PDD"), LB에 의한 치매("DLB") 및 다계통 위축증("MSA": multiple system atrophy)을 포함하는 몇몇 다른 신경퇴행성 장애(총체적으로 "시누클레인증"이라 칭함)의 발병은 PD와는 별도로 미스폴딩된 α-syn 응집체를 또한 특징으로 한다.
부검 연구로부터의 루이 병리학과 흑질선조체 변성, 인지 기능장애 및 운동 기능이상 사이의 상관관계는 α-syn 응집체의 비침습적 검출 및 정량화가 가능하게 할 수 있는 기술이 살아 있는 개체에서 LB 장애의 조기 진단 및 임상 평가를 위한 귀중한 도구라는 것을 제시한다. 초기 검출은 임상 실험에 대한 풍부한 환자 코호트의 동원, 질환 역전 치료의 평가, 및 새로운 약물 후보의 치료 효능의 검증에 더 더 좋은 기회를 제공할 수 있다. 그러나, LB 장애는 대개 다발성 단백질병증을 제시한다. 예를 들면, 치매가 발생한 PD 환자에 집중된 연구는 신피질에서의 α-syn 축적과 별도로 약 60%의 환자에서 Aβ 축적이 또한 널리 펴져 있다는 것을 밝혀냈다. 게다가, 사례의 약 3%는 α-syn 및 Aβ와 함께 타우 침착을 보여주었다.
몇몇 Aβ 양전자 방출 단층촬영("PET": positron emission tomography) 이미징제의 최근의 허가는 AD 약물 임상 실험의 코호트의 풍부함을 크게 개선하였다. 이는 또한 타우병증 및 시누클레인증인 다른 단백질병증에 대한 유사한 물질에 대한 조사를 북돋았다. α-syn 피브릴에 대한 보통의 내지 높은 결합 친화도를 갖는 다양한 분자 스캐폴드(도 1)는 과거 십년에 걸쳐 보고되었지만, 어느 것도 적어도 부분적으로 Aβ 피브릴에 비해 α-syn에 대한 낮은 선택도로 인해 임상 변형에서 성공적이지 않았다. 실제로, α-syn 병리학의 생체내 검출에 대한 이미징제의 개발은 몇몇 도전에 직면하고, 이들 중 하나는 시험관내 스크리닝 검정에 대해 높은 친화도를 갖는 다양한 분자 스캐폴드 및 α-syn 피브릴에 대한 선택도가 결여된다.
추가로, 이러한 스캐폴드가 자기 공명 영상화("MRI": magnetic resonance imaging)와 사용하기에 적합하면, 그 결과는 (PET와 비교하여) 접근가능성의 용이성 및 낮은 비용으로 인해 변형가능할 수 있었다. 높은 T1 이완률, 아밀로이드 표적화된 리포솜-가돌리늄(Gd) 나노입자 조영제(인지질 및 리포솜 이중충의 내부 표면 및 외부 표면에 접합된, 가돌리늄(3+) 2-[4,7,10-트리스(카복실라토메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데크-1-일]아세테이트("가도테레이트" 또는 "Gd(III)-DOTA")를 포함하는 고도로 안정한 거대환식 가돌리늄계 이미징제를 함유)는 AD의 형질전환 마우스 모델에서 아밀로이드 플라크의 생체내 MRI가 가능하게 하였다. 미국 특허 출원 17/162,126호를 참조하고, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
α-syn 침착물의 MRI에 대한 안정한 표적화된 리포솜 Gd 조영제에 대한 시급한 수요가 있다.
일 양태에서, 리포솜 조성물("ADx-003")이 제공되는데, ADx-003은 제1 인지질; 리포솜 조성물을 안정화시킬 수 있는 입체적으로 벌키한 부형제; 제1 중합체에 의해 유도체화된 제2 인지질; 거대환식 가돌리늄계 이미징제(imaging agent); 및 제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질을 포함하고, 제2 중합체는 표적화 리간드에 접합되고, 표적화 리간드는 하기 화학식 I, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내어진다:
Figure pct00001
상기 식 중, X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고; Y는 -CH-CH=CH- 또는
Figure pct00002
이고; A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고; A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OCH3, -NO2, -N(CH3)2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다.
추가의 양태에서, 제1 인지질은 수소화된 대두(soy) L-α-포스파티딜콜린("HSPC")을 포함하고; 리포솜 조성물을 안정화시킬 수 있는 입체적으로 벌키한 부형제는 콜레스테롤("Chol")을 포함하고; 제1 중합체에 의해 유도체화된 제2 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000)("DSPE-mPEG2000")을 포함하고; 거대환식 가돌리늄계 이미징제는 Gd(III)-DOTA를 포함하고, 제4 인지질, 예를 들어
Figure pct00003
또는 이의 염(예를 들어, 나트륨염)에 접합된다. 일부 양태에서, 변수 x는 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 일 양태에서, 변수 x는 16이다(접합체: "Gd(III)-DOTA-DSPE").
일부 양태에서, 제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질(제2 중합체는 표적화 리간드에 접합됨)은
Figure pct00004
또는 이의 염(예를 들어, 암모늄 포스페이트 염)을 포함한다. 일부 양태에서, 변수 n은 약 10 내지 약 100, 예를 들어 약 60 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 77, 또는 약 79의 임의의 정수일 수 있다. 변수 m은 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 예를 들어, n은 77일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 77일 수 있고, m은 16일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 16일 수 있다.
일 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체의 표적화 리간드 양태는 하기를 포함한다:
Figure pct00005
.
일 양태에서, n은 77이고, m은 16이고("DSPE-PEG3400"), 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체는 하기를 포함한다:
Figure pct00006
("DSPE-PEG3400-XW-01-11 접합체").
대안적으로, n은 79이고, m은 16이고("DSPE-PEG3500"), 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체는 하기를 포함한다:
Figure pct00007
("DSPE-PEG3500-XW-01-11 접합체").
일 양태에서, 대상체에서 α-syn 침착물을 영상화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 리포솜 조성물의 검출 가능한 분량을 대상체에게 도입하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 리포솜 조성물이 하나 이상의 α-syn 침착물과 회합되기에 충분한 시간을 허용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 α-syn 침착물과 회합되는 리포솜 조성물을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 대상체에서 α-syn 침착물을 영상화하는 방법의 리포솜 조성물은 ADx-003을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 대상체에서 α-syn 침착물을 영상화하는 방법의 리포솜 조성물은 Gd(III)-DOTA-DSPE 및 DSPE-PEG3400-XW-01-11 접합체 또는 DSPE-PEG3500-XW-01-11 접합체를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 대상체에서 α-syn 침착물을 영상화하는 방법의 리포솜 조성물은 HSPC, Chol, DSPE-mPEG2000, Gd(III)-DOTA-DSPE, 및 DSPE-PEG3400-XW-01-11 접합체 또는 DSPE-PEG3500-XW-01-11 접합체를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 리포솜 조성물은 환자에서 α-syn 침착물을 영상화하기 위한 용도에 적합하고, 그 용도는 리포솜 조성물의 검출 가능한 분량을 환자에게 도입하는 것; 리포솜 조성물이 하나 이상의 α-syn 침착물과 회합되기에 충분한 시간을 허용하는 것; 및 하나 이상의 α-syn 침착물과 회합된 리포솜 조성물을 검출하는 것을 포함한다. 일 양태에서, 검출하는 것은 MRI를 사용하여 검출하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 그 용도는 하나 이상의 α-syn 침착물과 회합된 리포솜 조성물을 검출하는 것에 따라 PD를 갖는 것으로서 환자를 확인하는 것을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체가 제공되는데, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체의 인지질-중합체 양태는
Figure pct00008
또는 이의 염(예를 들어, 암모늄 포스페이트 염)을 포함한다. 일부 양태에서, 변수 n은 약 10 내지 약 100, 예를 들어 약 60 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 77, 또는 약 79의 임의의 정수일 수 있다. 변수 m은 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 예를 들어, n은 77일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 77일 수 있고, m은 16일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 16일 수 있다.
일 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체의 표적화 리간드 양태는 하기, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 의해 표시된다:
Figure pct00009
상기 식 중, X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고; Y는 -CH-CH=CH- 또는
Figure pct00010
이고; A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고; A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OCH3, -NO2, -N(CH3)2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다.
일 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체는 DSPE-PEG3400-XW-01-11 접합체 또는 DSPE-PEG3500-XW-01-11 접합체를 포함한다.
일 양태에서, 하기, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 화합물이 제공된다:
Figure pct00011
상기 식 중, X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고; Y는 -CH-CH=CH- 또는
Figure pct00012
이고; A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고; A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OCH3, -NO2, -N(CH3)2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다.
일 양태에서, 상기 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00013
.
다른 양태에서, α-syn 응집체를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은
Figure pct00014
(상기 식 중, X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고; Y는 -CH-CH=CH- 또는
Figure pct00015
이고; A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고; A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OCH3, -NO2, -N(CH3)2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택됨) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 화합물의 유효량을 샘플 또는 대상체로 도입하는 단계; 샘플 또는 대상체에서 화합물이 α-syn 응집체와 회합하기에 충분한 시간을 제공하는 단계; 및 샘플 또는 대상체에서 α-syn 응집체와 회합된 화합물을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 더 용이하게 이해될 수 있고, 여기서
도 1은 α-syn 응집체 결합 리간드를 대표하는 선행 기술의 화학 구조를 제공한다.
도 2는 α-syn 침착의 MRI를 위한 표적화된 조영제를 포함하는 리포솜의 예시적인 횡단면 도시를 제공한다.
도 3은 1-인다노닐-, 1,3-인단디오닐-, α-테트랄로닐- 및 4-옥소쿠마리닐-디엔 유도체를 포함하는 새로운 α-syn 리간드의 화학 구조를 제공한다.
도 4는 새로운 α-syn 리간드의 분자 설계의 도식적 표시를 제공한다.
도 5는 1-인다노닐-, 1,3-인단디오닐-, α-테트랄로닐- 및 4-옥소쿠마리닐-디엔 유도체를 포함하는 새로운 α-syn 리간드에 대한 합성 식을 제공한다.
도 6은 디엔 유도체의 E,E 구성에서 핵 오버하우저 효과("NOE": Nuclear Overhauser Effect)의 도식적 표시를 제공한다.
도 7은 1-인다노닐-디엔 및 1,3-인단디오닐-디엔 유도체를 포함하는 새로운 α-syn 리간드에 대한 합성 식을 제공한다.
도 8은 티오펜이 디엔 브리지로 삽입된 1-인다노닐- 및 1,3-인단디오닐-디엔 유도체를 포함하는 새로운 α-syn 리간드의 화학 구조를 제공한다.
도 9는 화합물 36, 화합물 45 및 화합물 48에서의 NOE 상호작용의 도식적 표시를 제공한다.
도 10은 브리징 디엔의 이중 결합 중 하나가 화합물 내에 경직성을 증가시키기 위해 고리계 내에 마스킹된 기타 유도체에 대한 합성 식을 제공한다.
도 11은 브리징 디엔의 제2 이중 결합이 마스킹된 기타 유도체를 포함하는 새로운 α-syn 리간드의 화학 구조를 제공한다.
도 12는 새로운 α-syn 리간드에 대한 방출 스펙트럼 및 결합 친화도(Kd) 데이터의 표(표 1)를 보여준다.
도 13은 리간드 8(XW-01-11) 및 리간드 32(XW-01-64)를 사용한 유리 리간드 대 α-syn 또는 Aβ 피브릴에 결합된 것의 대표적인 흡수/방출 스펙트럼을 보여준다.
도 14는 새로운 α-syn 리간드에 의한 피브릴 결합 시 형광 및 방출 최대에서의 관찰된 심색단 이동, 형광의 증가 및 형광 양자 수율의 표(표 2)를 보여준다.
도 15는 α-syn 피브릴과 비교하여 Aβ 피브릴에 대한 새로운 α-syn 리간드의 해리 상수를 비교하는 표(표 3)를 보여준다.
도 16은 항-α-syn 항체 및 리간드 8(XW-01-11) 및 리간드 32(XW-01-64)와 동시염색된 PD 뇌 조직 절편의 공초점 현미경검사 영상을 보여준다.
도 17은 항-α-syn 항체 및 리간드 8(XW-01-11)과 동시염색된 PD 뇌 조직 절편의 공초점 현미경검사 영상을 보여준다.
도 18은 항-Aβ 항체에 대한 리간드 8(XW-01-11) 및 각각의 항-α-syn과 동시염색된 PD 및 AD 뇌 조직 절편의 비교용 공초점 현미경검사 영상을 보여준다.
도 19는 DSPE-PEG3400-XW-01-11 접합체의 제조를 위한 예시적인 합성 도식을 보여준다.
도 20은 α-syn 피브릴과 항온처리될 때 리간드 8(XW-01-11) 표지된 리포솜 나노입자 대 대조군 리포솜에 대한 동적 광 산란("DLS": Dynamic Light Scattering) 그래프를 보여준다.
ADx-003인 신규의 α-syn-표적화된 리포솜-Gd 조영제는 고도로 안정한 거대환식 Gd-DOTA 영상화 모이어티에 기초하여 개발되었다. ADx-003은 일반적으로 도 2에서 횡단면 형태로 도시된 것과 같이 이해될 수 있다.
이와 같이, 일 양태에서, ADx-003은 제1 인지질; 리포솜 조성물을 안정화시킬 수 있는 입체적으로 벌키한 부형제; 제1 중합체에 의해 유도체화된 제2 인지질; 거대환식 가돌리늄계 이미징제; 및 제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질을 포함하고, 제2 중합체는 표적화 리간드에 접합된다. 거대환식 가돌리늄계 이미징제는 제4 인지질에 접합될 수 있다.
인지질
일부 양태에서, 적합한 인지질은 2개의 탄화수소 사슬이 약 14개 내지 약 24개의 탄소 원자 길이이고, 변하는 불포화 정도를 갖는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 적합한 인지질은 HSPC, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DPPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DSPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민("DSPE"), 및 이들의 2개 이상의 혼합물을 포함한다. 적합한 인지질은 자연 발생 또는 합성일 수 있다.
일부 양태에서, 적합한 인지질은 WO2005107820A1에 열거된 임의의 것을 포함할 수 있고, 이것의 문단 [0031] 내지 [0033]의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
중합체-유도체화된 인지질
일부 양태에서, 리포솜 조성물의 리포솜은 융통성 있는 수용성 (친수성) 중합체 사슬을 함유하거나 이에 의해 코팅된 표면을 포함할 수 있다. 이 중합체 사슬은 리포솜과 혈액 혈장 성분 사이의 상호작용을 방지할 수 있고, 그 혈장 성분은 혈액의 세포에 의한 리포솜의 흡수 및 혈액으로부터의 리포솜의 제거에서 역할을 한다. 리포솜은 단핵 식세포계, 주로 간 및 비장(세망내피계)의 장기에 의한 흡수를 피할 수 있다.
일 양태에서, 유도체화된 인지질에서의 중합체는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")일 수 있다. PEG는 임의의 다양한 분자량을 가질 수 있다. 하나의 예에서, PEG 사슬은 약 1,000 내지 10,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 리포솜이 형성되면, PEG 사슬은 이러한 코팅의 부재와 비교하여 리포솜의 혈액 순환 시간을 연장시키기에 충분한 친수성 사슬의 표면 코팅을 제공할 수 있다.
일부 양태에서, 제1 중합체에 의해 유도체화된 제2 인지질은 DSPE-mPEG2000을 포함한다. 일부 양태에서, 제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질(제2 중합체는 표적화 리간드에 접합됨)은
Figure pct00016
또는 이의 염(예를 들어, 암모늄 포스페이트 염)을 포함하고, 여기서, 변수 n은 약 10 내지 약 100, 예를 들어 약 60 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 77, 또는 약 79의 임의의 정수일 수 있다. 변수 m은 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 예를 들어, n은 77일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 77일 수 있고, m은 16일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 16일 수 있다. 일부 양태에서, 제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질은 DSPE-PEG3400 또는 DSPE-PEG3500을 포함한다.
일부 양태에서, 적합한 중합체는 WO2005107820A1에 열거된 임의의 것을 포함할 수 있고, 이것의 문단 [0034] 내지 [0038]의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 양태에서, 중합체에 의해 유도체화된 인지질은 WO2016057812A1 및 미국 특허 출원 17/162,126호에 열거된 임의의 조합일 수 있고, 이들의 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
입체적으로 벌키한 부형제
일부 양태에서, 리포솜은 안정화 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포솜 조성물은 Chol을 포함하도록 제형화될 수 있다. 다른 양태에서, 리포솜 조성물은 지방 알코올, 지방 산, 콜레스테롤 에스테르, 다른 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
거대환식 가돌리늄계 이미징제
리포솜 조성물은 거대환식 Gd계 이미징제를 포함한다. 일부 양태에서, 거대환식 가돌리늄계 이미징제는 인지질에 접합된 Gd(III)-DOTA, 예를 들어
Figure pct00017
또는 이의 염(예를 들어, 나트륨염)을 포함한다. 일부 양태에서, 변수 x는 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 일 양태에서, 변수 x는 16이고, 접합체는 Gd(III)-DOTA-DSPE이다. Gd(III)-DOTA-DSPE의 제법은 미국 특허 출원 17/162,126호에 기재되어 있다.
다른 양태에서, 거대환식 가돌리늄계 이미징제는 하기를 포함한다:
Figure pct00018
.
인지질-중합체-표적화 리간드 접합체
본 발명의 다른 양태는 화학식 II에 따른 구조를 갖는 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체를 제공한다:
Figure pct00019
상기 식 중, PL은 인지질이고; AL은 지방족 연결이고; HP는 친수성 중합체이고; X는 결합, -O-, -RiO-, -RiO(C=O), Ri-N(Rii) O(C=O), Ri-N(Rii)(C=O)- 또는 Ri-N(Rii)이고; TL은 화학식 I에 따른 구조를 갖는 표적화 리간드이다.
인지질-중합체-표적화 리간드 접합체는 리포솜에 존재하는 것과 같은 막으로의 접합체의 혼입을 촉진하는 인지질-중합체 영역을 포함한다. 인지질은 구조가 당업자에게 잘 공지된 양극성 화합물이다. 일부 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체에서의 인지질(PL)은 하기 구조식에 의해 표시될 수 있다:
Figure pct00020
.
화학식은 친수성 포스페이트 기 및 인지질에 보통 존재하는 2개의 소수성 지방 산 사슬을 예시한다. 변수 s는 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 예를 들어, s는 14 또는 16일 수 있다. 다양한 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체에서의 인지질 기는 HSPC, DPPC, DSPE, DSPC 또는 DPPE 중 하나일 수 있다. 적합한 인지질 및 중합체 유도체화된 인지질은 또한 본원에 달리 개시된 것을 포함할 수 있다.
접합체는 또한 친수성 중합체(HP)를 포함한다. 친수성 중합체는 중합체가 물 중에 가용성이 되게 하는 극성 또는 하전된 작용기를 함유하는 중합체이다. 친수성 중합체의 예는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리비닐 알코올 및 폴리알킬렌 옥사이드를 포함한다. 일부 양태에서, 친수성 중합체는 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체이다. 친수성 폴리(알킬렌 옥사이드)는 약 10개 내지 약 100개의 반복 단위를 포함할 수 있고, 예를 들어 500 내지 10,000 달톤의 범위의 분자량을 가질 수 있다. 친수성 폴리(알킬렌 옥사이드)는 예를 들어 PEG, 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 옥사이드), 및 기타를 포함할 수 있다. 친수성 중합체 HP는 본원에 기재된 것과 같은 아미드 또는 카바메이트 기를 통해 인지질 모이어티에 접합될 수 있다. 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체에서의 HP는 아미드, 카바메이트, 폴리 (알킬렌 옥사이드), 트리아졸, 이들의 조합, 및 기타를 통해 방향족 모이어티에 접합될 수 있다.
일부 양태에서, 친수성 중합체(HP)는 하기 구조식 중 하나에 의해 표시된다:
Figure pct00021
,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
, 또는
Figure pct00024
.
일부 양태에서, 변수 r은 약 10 내지 약 100, 예를 들어 약 60 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 77, 또는 약 79의 임의의 정수일 수 있다.
몇몇 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체에서의 인지질-중합체 모이어티 PL-HP-는 하기 구조식 중 하나에 의해 표시될 수 있다:
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
, 또는
Figure pct00028
.
일부 양태에서, 변수 r은 약 10 내지 약 100, 예를 들어 약 60 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 77, 또는 약 79의 임의의 정수일 수 있다. 변수 s는 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 예를 들어, r은 77일 수 있고, s는 14일 수 있고; r은 79일 수 있고, s는 14일 수 있고; r은 77일 수 있고, s는 16일 수 있고; r은 79일 수 있고, s는 16일 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, AL에 의해 표시된 "지방족 연결"은 인지질 PL과 친수성 중합체 HP 사이의 연결에 유용한 임의의 지방족 기를 포함한다. 이러한 지방족 연결은 하나 이상의 모이어티, 예컨대 아미드, 카바메이트, 및 기타를 통해 이종원자를 포함할 수 있는 예를 들어 C2-C10 알킬렌 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기 접합체에서:
Figure pct00029
지방족 연결 AL, -CH2CH2NH(C=O)CH2O-는 아미드 모이어티를 포함한다. 추가로, 예를 들어 하기 접합체에서:
Figure pct00030
지방족 연결 AL, -CH2CH2NH(C=O)O-는 카바메이트 모이어티를 포함한다. AL은 디카복실산, 예컨대 숙신산으로부터 유래된 지방족 연결을 포함할 수 있고, 2개의 아미드, 2개의 카바메이트, 아미드 및 카바메이트, 및 기타를 포함할 수 있다.
이러한 지방족 연결은 인지질과 친수성 중합체 사이의 연결을 위해 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 인지질-PEG 화합물, 및 PL-AL-PEG-NH2, PL-AL-PEG-CO2H, 및 기타로 표시될 수 있는 작용기화된 인지질-PEG 접합 전구체의 상업적 원천에서 발견될 수 있다. 이것은 지방족 연결의 존재가 암시되는 지방족 연결에 대한 언급 없이 약칭된 형태의 이러한 화합물을 지칭하도록 당해 분야에서 및 상업적 원천에서 흔하다. 예를 들어, 지방족 연결 기가 아미드 함유 기 -CH2CH2NH(C=O)CH2O-인 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] CAS 147867-65-0호는 당해 분야에서 및 상업적으로 "DSPE-mPEG-2000"이라 흔히 칭해진다. "DSPE-mPEG-2000"과 같은 종래의 약칭된 방식으로 본원에 인용된 상업 재료는 상응하는 지방족 연결을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 다양한 양태에서, AL에 의해 표시된 지방족 링커는 카바메이트 또는 아미드를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 리포솜, 방법 및 접합체는 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체를 포함할 수 있고, 여기서 AL은 카바메이트, 아미드, 또는 이러한 접합체의 혼합물을 포함한다.
하나의 구체적인 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체가 제공되는데, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체의 인지질-중합체 양태는
Figure pct00031
또는 이의 염(예를 들어, 암모늄 포스페이트 염)을 포함한다. 일부 양태에서, 변수 n은 약 10 내지 약 100, 예를 들어 약 60 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 약 75 내지 약 85, 약 77, 또는 약 79의 임의의 정수일 수 있다. 변수 m은 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나일 수 있다. 예를 들어, n은 77일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 14일 수 있고; n은 77일 수 있고, m은 16일 수 있고; n은 79일 수 있고, m은 16일 수 있다. 일부 양태에서, 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체의 인지질-중합체 양태는 DSPE-PEG3400 또는 DSPE-PEG3500을 포함한다.
화학식 II의 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체는 또한 하기 기술된 표적화 리간드(TL)를 포함한다.
표적화 리간드
리포솜 조성물은 중합체에 의해 유도체화된 적어도 하나의 인지질을 포함하고, 중합체는 표적화 리간드에 접합된다. 이와 같이, 일부 양태에서, 인지질은 스페이서 사슬을 포함하도록 변형된다. 스페이서 사슬은 친수성 중합체일 수 있다. 친수성 중합체는 표적화 리간드에 커플링하기 위해 통상적으로 말단 작용기화될 수 있다. 작용기화된 말단 기는 예를 들어 말레이미드 기, 브로모아세타미드 기, 디설파이드 기, 활성화된 에스테르, 또는 알데하이드 기일 수 있다. 하이드라지드 기는 많은 생물학적 관련 화합물에 생성될 수 있는 알데하이드에 대해 반응성이다. 하이드라지드는 또한 활성 에스테르 또는 카보디이미드-활성화된 카복실 기에 의해 아실화될 수 있다. 아실화 종으로서 반응성인 아실 아지드 기는 하이드라지드로부터 쉽게 얻어질 수 있고, 아미노 함유 리간드의 부착을 허용한다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 리포솜의 표면으로부터 접근 가능할 수 있고, 예를 들어 하나 이상의 분자 또는 항원에 특이적으로 결합하거나 부착할 수 있다. 이 표적화 리간드는 리포솜을 특이적 세포 또는 조직, 예를 들어 α-syn 플라크에 지시하거나 표적화할 수 있고, 세포 또는 조직 상의 또는 이와 연관된 분자 또는 항원에 결합할 수 있다.
일 양태에서, 화합물은 화학식 I, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 따라 제공된다:
Figure pct00032
상기 식 중, X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고; Y는 -CH-CH=CH- 또는
Figure pct00033
이고; A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고; A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OCH3, -NO2, -N(CH3)2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다. 화학식 I의 화합물은 때때로 "표적화 리간드" 및 "결합 리간드"로서 본원에서 상호교환 가능하게 칭해진다. 표적화 리간드는 침착물(본원에서 플라크라고도 칭함) 또는 피브릴에서 발견된 것과 같은 α-syn 및 특히 미스폴딩된 α-syn에 대한 높은 친화도 결합을 나타낸다.
화학식 I에 포함된 화합물은 상이한 헤테로사이클릭 화합물을 제공하도록 위치 X에서 변할 수 있다. 일부 양태에서, X는 1-인다논 헤테로사이클릭 기를 제공하는 -CH2-이다. 일부 양태에서, X는 테트랄론 헤테로사이클릭 기를 제공하는 -CH2-CH2-이다. 일부 양태에서, X는 1,3-인단디온 헤테로사이클릭 기를 제공하는 -CHO-이다. 추가의 양태에서, X는 4-하이드록시쿠마린 헤테로사이클릭 기를 제공하는 -O-CO-이다. 이 헤테로사이클릭 기는 때때로 "제1 방향족 기"라 본원에서 칭해진다.
화학식 I에 포함된 화합물은 상이한 디엔을 제공하도록 위치 Y에서 변할 수 있다. 이와 같이, 일 양태에서, Y는 -CH-CH=CH-이고, 디엔 브리지가 제공된다. 일 양태에서, 디엔 브리지는 E,E 구성을 갖는다. 다른 양태에서, Y는
Figure pct00034
이고, 이로써 전자-농후 티오펜 기의 형태의 디엔을 실행한다.
일부 양태에서, 화합물의 제2(가장 오른쪽) 방향족 기는 변형될 수 있다. 고리 내의 변형은 제2 방향족 기로서 피리딘을 제공하도록 질소 원자에 의한 위치 A 또는 B에서의 메틸리딘의 대체를 포함할 수 있거나; 이것은 제2 방향족 기로서 피리미딘을 제공하도록 질소 원자에 의한 위치 A 또는 B에서의 메틸리딘의 대체를 포함할 수 있다. 위치 A, B, 또는 둘 다가 질소에 의해 대체될 때, 대체를 겪는 위치는 고리에 외부인 치환기를 가지지 않을 것이다.
화학식 I에 포함된 화합물은 하나 이상의 치환기가 제1 방향족 기 및/또는 제2 방향족 기 주위에 첨가된 화합물을 또한 포함할 수 있다. 적합한 치환기의 예는 할로겐, 하이드록실, 메톡시, 니트로, 디메틸아민, 및 저급 알킬 또는 아릴 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 제2 방향족 고리의 원주 주위에 수소 원자는 파라-치환된 페닐 기에 의해 대체된다.
화학식 I에 포함된 적합한 화합물은 예를 들어 도 3 및 도 8과 관련하여, 화합물 8((E)-2-((E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)알릴리덴)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온), 화합물 32(4'-((E)-3-((E)-6-하이드록시-1-옥소-1,3-디하이드로-2H-인덴-2-일리덴)프로프-1-엔-1-일)-[1,1'-비페닐]-4-카복실산) 및 화합물 37((Z)-2-((5-(4-(하이드록시메틸)페닐)티오펜-2-일)메틸렌)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온)을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 화합물은 화합물 8이다:
Figure pct00035
.
화학식 I의 결합 리간드는 α-syn, 예컨대 침착물 및 피브릴에 존재하는 α-syn에 대해 높은 친화도를 갖는 화합물을 포함한다. 특히, 피브릴 및 침착물에 존재하는 α-syn이 통상적으로 응집된 α-syn이므로, 결합 리간드는 응집된 α-syn에 대한 높은 친화도를 갖는다. 일부 양태에서, 화합물은 α-syn 특이적이다. 일부 양태에서, 화합물은 Aβ에 대해서보다 α-syn에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 본원에 사용된 것과 같이 α-syn-특이적은 미스폴딩된 단백질 질환 및 장애와 연관된 다른 단백질과 비교하여 배타적으로 또는 우선적으로 이미징제가 α-syn에 결합한다는 사실을 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같이 용어 "특이적으로 결합하는"은 결합 리간드와 제2 화학 종의 상호작용을 지칭하고, 여기서 상호작용은 화학 종에서 특정 구조(예를 들어, 항원 결정부위 또는 에피토프)의 존재에 따라 달라진다. 예를 들어, 표적화 리간드는 일반적으로 단백질보다 α-syn의 특이적 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다.
화학식 I의 범위 내의 화합물은 α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)에 대한 다양한 상이한 결합 친화도를 갖는다. 일부 양태에서, 화합물은 약 500 nM 이하의 Kd로 응집된 α-syn에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 양태에서, 화합물은 약 200 nM 이하의 Kd로 응집된 α-syn에 대한 결합 친화도를 갖는다. 다른 양태에서, 화합물은 약 100 nM 이하의 Kd로 응집된 α-syn에 대한 결합 친화도를 갖는다. 추가의 양태에서, 화합물은 약 50 nM 이하의 Kd로 응집된 α-syn에 대한 결합 친화도를 갖는다.
일부 양태에서, 화합물은 방사선표지를 추가로 포함한다. 방사선표지된 화합물은 방사성핵종에 의해 대체된 하나 이상의 원자를 갖는다. 방사선표지의 예는 3H, 14C, 35S, 125I, 121I, 112In, 99mTc를 포함한다. 화합물은 또한 18F, 11C, 및 15O와 같이 양전자 방출 단층촬영에 유용한 원자를 포함하도록 변형될 수 있다.
화학식 I에 포함된 적합한 화합물은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 유기 및 무기 산에 의해 형성된 것을 포함하는 산 부가염으로서 존재할 수 있다. 이러한 산 부가염은 보통 약제학적으로 허용 가능할 것이다. 그러나, 약제학적으로 허용 불가능한 염의 염은 해당 화합물의 제조 및 정제에서 유용할 수 있다. 염기성 부가염은 또한 형성될 수 있고 약제학적으로 허용 가능할 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본원에 정의된 것과 같이 물 또는 오일-가용성 또는 분산성이고 치료학적으로 허용 가능한 화학식 I에서 포함된 화합물의 염 또는 양쪽성 형태를 나타낸다. 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 또는 별개로 유리 염기의 형태의 적절한 화합물을 적합한 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, L-아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트(베실레이트), 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄퍼설포네이트, 시트레이트, 디글루코네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 겐티세이트, 글루타레이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히푸레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 말로네이트, DL-만델레이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스포네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 피로글루타메이트, 숙시네이트, 설포네이트, 타르트레이트, L-타르트레이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트(p-토실레이트) 및 운데카노에이트를 포함한다. 화합물에서의 염기성 기는 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 및 벤질 및 펜에틸 브로마이드로 4급화될 수 있다. 치료학적으로 허용 가능한 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브롬산, 황산 및 인산, 및 유기 산, 예컨대 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산을 포함한다. 염은 또한 화합물과 알칼리 금속 또는 알칼리토 이온과의 배위에 의해 형성될 수 있다. 그렇기 때문에, 화학식 I의 화합물의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 및 칼슘염이 고려된다.
리포솜
"리포솜"은 일반적으로 내부 공동을 함유하는 구형 또는 거의 구형인 입자를 지칭한다. 리포솜의 벽은 지질의 이중층을 포함할 수 있다. 이 지질은 인지질일 수 있다. 많은 지질 및/또는 인지질은 리포솜을 제조하도록 사용될 수 있다. 하나의 예는, 인지질에 의해 예시된 것과 같이, 물 중의 이중층 베시클로 자발적으로 형성할 수 있거나, 소수성 모이어티가 이중층 막의 내부 소수성 영역과 접촉하고 극성 헤드 기 모이어티가 막의 외부 극성 표면을 향해 배향된, 지질 이중충으로 안정하게 혼입될 수 있는, 소수성 모이어티 및 극성 헤드 기 모이어티를 갖는 양극성 지질이다. 리포솜은 본원에서 실시예, 및 미국 특허 출원 17/162,126호, WO2016057812A1 및 WO2012139080A1에 기재된 것을 포함하여 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고, 이들의 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 도 2는 α-syn 침착의 MRI를 위한 표적화된 조영제를 포함하는 리포솜의 예시적인 횡단면 도시를 제공한다.
일 양태에서, ADx-003은 HSPC; Chol; DSPE-mPEG2000; DSPE-PEG3400-XW-01-11 접합체; 및 Gd(III)-DOTA-DSPE를 포함한다. 일 양태에서, ADx-003은 HSPC; Chol; DSPE-mPEG2000; DSPE-PEG3500-XW-01-11 접합체; 및 Gd(III)-DOTA-DSPE를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 인지질은 DPPC, DSPC, 또는 DPPC와 DSPC의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 양태에서, ADx-003에서의 성분의 지질 조성 및 몰비(%)는 HSPC:Chol:DSPE-mPEG2000:Gd(III)-DOTA-DSPE:DSPE-PEG3400/3500-화학식 I 접합체 = 약 31.5: 약 40: 약 2.5: 약 25: 약 1이다. 일부 양태에서, HSPC:Chol:DSPE-mPEG2000:Gd(III)-DOTA-DSPE:DSPE-PEG3400/3500-화학식 I 접합체 중 어느 하나의 몰비는 10% 이하만큼 조정될 수 있고, 이와 같이, 31.5±10%: 40±10%: 2.5±10%: 25±10%: 1±10%이다. 일 양태에서, ADx-003에서의 성분의 지질 조성 및 몰비(%)는 HSPC:Chol:DSPE-mPEG2000:Gd(III)-DOTA-DSPE:DSPE-PEG3400/3500-화학식 I 접합체 = 약 32.5: 약 40: 약 2: 약 25: 약 0.5이다. 일 양태에서, ADx-003에서의 성분의 지질 조성 및 몰비(%)는 HSPC:Chol:DSPE-mPEG2000:Gd(III)-DOTA-DSPE:DSPE-PEG3400/3500-화학식 I 접합체 = 약 32: 약 40: 약 2.5: 약 25: 약 0.5이다.
일 양태에서, ADx-003에서의 HSPC 함량은 약 24 mg/mL 내지 약 32 mg/mL(총 지질)이다. 일 양태에서, ADx-003에서의 Chol 함량은 약 14 mg/mL 내지 약 19 mg/mL이다. 일 양태에서, ADx-003에서의 DSPE-mPEG2000 함량은 약 5 mg/mL 내지 약 7 mg/mL이다. 일 양태에서, ADx-003에서의 Gd(III)-DOTA-DSPE 함량은 30 mg/mL 내지 45 mg/mL이다. 일 양태에서, ADx-003에서의 DSPE-PEG3400/3500-화학식 I 접합체 함량은 약 2 mg/mL 내지 약 3 mg/mL이다. 일 양태에서, ADx-003에서의 유리 가돌리늄 함량은 2.5 ㎍/mL 미만을 포함하여 100 ㎍/mL 이하이다.
일 양태에서, 리포솜 조성물은 6.4 내지 8.4의 pH를 갖는다. 추가의 양태에서, 리포솜은 200 내지 400 mOsmol/kg의 삼투압몰농도를 갖는다. 추가의 양태에서, 리포솜은 150 nm(D50) 미만을 포함하고, 약 140 nm(D50)을 포함하고, 약 120 nm(D50)을 포함하는 약 200 nm(D50) 미만의 동적 광 산란에 의해 측정된 것과 같이 베시클 크기(Z-평균)를 갖는다.
명확하도록, 수와 함께 용어 "약"은 수의 ±10%를 포함하도록 의도된다. 이는 "약"이 독립형 숫자를 수식하든 또는 수의 범위의 어느 한 말단 또는 말단 둘 다에서의 수를 수식하든 사살이다. 다시 말해서, "약 10"은 9 내지 11을 의미한다. 마찬가지로, "약 10 내지 약 20"은 9 내지 22 및 11 내지 18을 고려한다. 용어 "약"의 부재에서, 정확한 수가 의도된다. 다시 말해서, "10"은 10을 의미한다.
α-syn을 검출하는 방법
α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기 화학식 I에 따른 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 샘플 또는 대상체로 도입하는 단계를 포함한다:
Figure pct00036
(상기 식 중, X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고; Y는 -CH-CH=CH- 또는
Figure pct00037
이고; A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고; A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OCH3, -NO2, -N(CH3)2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택됨). 상기 방법은 또한 샘플 또는 대상체에서 화합물이 α-syn과 회합하기에 충분한 시간을 제공하는 단계, 및 샘플 또는 대상체에서 α-syn과 회합된 화합물을 검출하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, α-syn은 전장, 140개의 아미노산 α-시누클레인 단백질, 예를 들어 "α-syn-140"을 지칭한다. 다른 이소폼 또는 단편은 예를 들어 엑손 3의 소실로 인해 41번 내지 54번 잔기가 결여된 알파-시누클레인-126인 "α-syn-126"; 및 예를 들어 엑손 5의 소실로 인해 103번 내지 130번 잔기가 결여된 알파-시누클레인-112인 "α-syn-112"일 수 있다.
α-syn 응집체는 PD, DLB 및 MSA와 같은 LB를 특징으로 하는 병리학적 병태에서 불용성 피브릴을 형성한다. α-syn은 LB 피브릴의 주요 구조 성분이다. α-syn은 PD를 겪거나 PD를 갖는 것으로 의심되는 개체의 뇌에 존재할 수 있다. 다양한 α-syn 펩타이드는 PD와 연관된 뉴런 손상과 연관될 수 있다. 질환과 연관된 다양한 α-syn 이소폼은 α-syn-140, α-syn-126 및 α-syn-112를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
검출의 방법에 사용된 화합물은 화학식 I에 따른 임의의 α-syn 표적화 리간드일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 표적화 리간드는 Y가 -CH-CH=CH-인 화학식 I의 화합물이지만, 추가의 양태에서 표적화 리간드는 A 및 B가 둘 다 탄소 원자인 화학식 I의 화합물이다. 추가의 양태에서, 표적화 리간드는 도 3 및 도 8의 화합물 8, 화합물 32 및 화합물 37로부터 선택되지만, 훨씬 추가의 양태에서 화합물은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00038
.
일부 양태에서, 검출의 방법에 사용된 화합물은 화학식 II의 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체를 형성하도록 인지질-중합체에 연결된다. 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체는 본원에 기재된 임의의 인지질(PL) 및 친수성 중합체(HP)를 포함할 수 있다. 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체는 리포솜에서 혼입될 수 있다. 화학식 I의 화합물이 형광을 통해 직접 검출될 수 있거나, 방사선표지된 화합물을 포함하도록 변형될 수 있거나, 다른 수단을 통해 검출될 수 있지만, 화합물을 리포솜으로 혼입하는 것은 검출에 대한 옵션을 증가시킬 수 있다.
상기 방법은 화학식 I에 따른 화합물의 유효량을 샘플 또는 대상체에게 도입하는 단계를 포함한다. 샘플은 대상체로부터 얻은 조직 샘플(예를 들어, 신경 조직 샘플)과 같은 α-syn을 포함할 수 있는 조직의 일부일 수 있고, 이 경우에 상기 방법은 생체외 분석에 사용된다. 단순히 화합물을 샘플로 도입하는 것은 샘플을 화합물과 접촉시키는 것을 지칭한다. 대안적으로, 화합물은 생체외 분석을 수행하기 위해 대상체로 도입될 수 있다. "대상체"는 본원에 사용된 것과 같이 임의의 동물일 수 있고, 환자라 또한 칭해질 수 있다. 대상체는 척추 동물, 포유류, 예컨대 조사 동물(예를 들어, 마우스 또는 래트), 가축 농장 동물(예를 들어, 소, 말, 돼지), 또는 애완동물(예를 들어, 개, 고양이)일 수 있다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다.
상기 방법은 또한 샘플 또는 대상체에서 화합물이 α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)과 회합하기에 충분한 시간을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 화학식 I의 결합 리간드는 α-syn, 및 특히 응집된 α-syn에 대한 친화도를 갖고, 따라서 샘플 또는 대상체에 존재하는 α-syn과 회합할 것이다. 화합물이 α-syn과 회합하기 위해 필요한 시간의 양은 샘플의 성질, 투여 방법, 및 사용된 화합물의 친화도와 같은 다수의 변수에 따라 변할 수 있다. 화합물이 α-syn과 회합하기에 충분한 시간의 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 샘플 또는 대상체에서 화합물이 α-syn과 회합하기에 충분한 시간의 양은 적어도 2분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 또는 적어도 8시간일 수 있다.
상기 방법은 샘플 또는 대상체에서 α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)과 회합된 화합물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 검출하는 단계는 MRI를 사용하여 검출하는 단계를 포함한다. 다른 예에서, 검출하는 단계는 형광 영상화("FI")에 의해 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출하는 단계는 방사능 콘트라스트 향상제를 사용하여 SPECT 영상화 및/또는 PET 영상화에 의해 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 방사능 콘트라스트 향상제는 예를 들어 국립 보건 연구원(National Institute of Health)의 분자 영상화 및 조영제 데이터베이스(Molecular Imaging and Contrast Agent Database)에서의 SPECT 영상화 및/또는 PET 영상화와 사용하기 위해 적절하다고 여겨진 물질을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서 PET 영상화를 포함하는 당업자에 의해 공지된 영상화 방법론의 임의의 다른 적합한 유형이 고려된다.
일부 양태에서, 영상이 생성되어서 대상체에서 검출된 α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)의 위치를 보여준다. 따라서, 일부 양태에서, 유효량의 이미징제(즉, 표적화 리간드 또는 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체)를 대상체에게 투여함으로써 대상체의 조직 영역의 영상을 생성하고 이미징제가 분포된 대상체의 조직 영역의 영상을 생성하기 위한 방법이 제공된다. 조직 영역의 영상을 생성하기 위해, 검출 가능한 유효량의 이미징제가 관심 조직 영역에 도달하는 것이 필요하지만, 이미징제가 단독으로 이 영역에서 국소화되는 것이 필요하지 않다. 그러나, 일부 양태에서, 이미징제가 관심 조직 영역에 주로 존재하도록 이미징제는 국소로 표적화되거나 투여된다. 영상의 예는 2차원 횡단면도 및 3차원 영상을 포함한다. 일부 양태에서, 시각 영상을 생성하기 위해 이미징제에 의해 생성된 데이터를 분석하기 위해 컴퓨터를 사용한다. 영상을 생성하기 위한 하나의 예시적인 방법은 MRI이다. MRI 스캐너는 신체에서 장기의 영상을 생성하기 위해 강한 자기장, 자기장 구배 및 라디오파를 사용한다.
영상화 시스템은 통상적으로 3가지 기본 성분을 포함한다: (1) 이미징제의 여기를 유도하기 위한 적절한 소스; (2) 이미징제로부터 방출을 분리하거나 구별하기 위한 시스템; 및 (3) 검출 시스템. 검출 시스템은 휴대용이거나 수술중 현미경과 같은 다른 유용한 영상화 장치로 통합될 수 있다. 예시적인 검출 시스템은 내시경, 카테터, 단층촬영 시스템, 휴대용 영상화 시스템 또는 수술중 현미경을 포함한다.
많은 표적화 리간드는 단백질 미스폴딩 장애에 관여된 다른 단백질, 예컨대 Aβ 또는 타우 단백질에 대해서보다 α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)에 대해 더 높은 친화도를 나타낸다. 이 더 높은 친화도 때문에, 단독의 또는 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체에 존재할 때 결합 리간드는 α-syn의 수준을 미스폴딩으로 처리되는 다른 단백질의 수준과 구별할 수 있다. 특히, 응집된 Aβ의 수준으로부터 응집된 α-syn의 수준을 구별하는 데 관심 있다. 따라서, 일부 양태에서, α-syn은 Aβ의 검출보다 높은 특이성으로 검출된다. 다른 양태에서, α-syn은 Aβ의 검출보다 1.5배 이상 초과, Aβ의 검출보다 2배 이상 초과, Aβ의 검출보다 3배 이상 초과, Aβ의 검출보다 5배 이상 초과, 또는 Aβ의 검출보다 10배 이상 초과인 특이성으로 검출된다.
일부 양태에서, 샘플 또는 대상체에서 α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)을 검출하고/하거나 영상화하는 방법은 대상체가 미스폴딩된 α-syn과 회합된 질환을 갖는지를 진단하기 위해, 또는 대상체에서 질환의 진행을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 대상체는 PD를 발생시키거나, PD를 갖거나, PD에 대한 치료 중에 있을 위험에 있거나; α-syn의 이상조절, 미스폴딩, 응집 또는 침착과 연관된 질환, 예컨대 MSA를 가질 위험에 있거나; α-syn의 이상조절, 미스폴딩, 응집 또는 침착과 연관된 질환을 갖거나; α-syn의 이상조절, 미스폴딩, 응집 또는 침착과 연관된 질환에 대한 치료 중이고; 기타 등등일 수 있다.
상기 방법은 α-syn 단백질(예를 들어, 응집된 α-syn)을 검출하는 것에 기초하여 대상체에서 PD를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. α-syn 미스폴딩 및 응집은 PD 발병과 연관되는 것으로 나타났다. PD의 진단은 대조군 샘플에 검출된 α-syn 단백질의 영상 또는 양 또는 건강한 대상체로부터 얻은 영상을 비교하는 것을 또한 포함할 수 있다. 상기 방법은 샘플 또는 대상체에서 가용성, 미스폴딩된 α-syn 단백질의 존재에 따라 대상체에서 α-syn 응집과 연관된 질환의 존재를 결정하거나 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 샘플 또는 대상체에서 가용성, 미스폴딩된 α-syn 단백질의 존재에 따라 대상체에서 MSA의 존재를 결정하거나 진단하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 α-syn 조절 치료에 의해 α-syn 응집과 연관된 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 다양한 기전을 통해 α-syn 항상성을 표적화하는 몇몇 신규의 치료제는 현재 개발 중에 있다. α-syn 조절 치료는 α-syn의 생성을 억제하는 것, 예를 들어 적합한 억제제에 의해 α-syn의 응집을 억제하는 것, 능동 또는 수동 면역치료 접근법, 및 기타를 포함할 수 있다. α-syn 항상성을 표적화하는 치료학적 접근법은 능동 면역화, 예컨대 PD01A+ 또는 PD03A+, 또는 수동 면역화, 예컨대 PRX002를 포함할 수 있다. 가용성, 미스폴딩된 α-syn의 존재를 검출하기 위한 본원에 기재된 방법은 환자가 α-syn 조절 치료에 의해 치료될 수 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. PD에 대한 치유가 현재 없지만, 레보도파, 도파민 작용제 및 모노아민 산화효소 B 억제제와 같은 다양한 약물은 PD의 운동 증후군을 치료하는 데 유용하다.
이미징제를 포함하는 인지질-중합체-표적화 리간드 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 주사용 용도에 적합한 약제학적 조성물은 무균 수성 용액 또는 분산액 및 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 그 형태는 무균이어야 하고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
α-syn을 검출하기 위한 키트
본 발명의 다른 양태는 대상체에서 α-syn(예를 들어, 응집된 α-syn)을 검출하고/하거나 영상화하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 일반적으로 하나 이상의 별개의 조성물로서 또는 선택적으로, 시약의 상용성이 허용되는 혼합물로서 표적화 리간드 및 다른 성분 및 시약을 보유하기 위한 하나 이상의 용기를 갖는 패키지를 포함한다. 키트는 설명서 및 리포솜 조성물을 포함할 수 있다. 설명서는 리포솜 조성물의 검출 가능한 분량을 샘플 또는 대상체로 도입하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 리포솜 조성물이 α-syn과 회합되기에 충분한 시간을 허용하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 설명서는 α-syn과 회합된 리포솜 조성물을 검출하도록 사용자에게 지시할 수 있다. 키트는 화학식 I의 표적화 리간드 및/또는 화학식 II에 의해 표시된 인지질-중합체-표적화 접합체를 포함할 수 있다.
키트에 포함된 설명서는 패키징 재료에 부착될 수 있거나, 패키지 인서트로서 포함될 수 있다. 설명서가 통상적으로 서면화된 또는 인쇄된 재료이지만, 이것은 이렇게 제한되지 않는다. 이러한 설명서를 저장하고 이것을 최종 사용자에 소통할 수 있는 임의의 매체는 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM), 및 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 것과 같이, 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
키트의 성분은 상이한 물리적 상태일 수 있다. 예를 들어, 일부 성분은 동결건조될 수 있고, 일부는 수성 용액에 있을 수 있다. 일부는 동결될 수 있다. 개별 성분은 키트 내에 별개로 패키징될 수 있다. 본 발명의 방법 또는 연관된 시험, 치료 또는 보정을 수행하기 위한 다른 유용한 도구는 완충액, 효소, 형광 시약, MRI에 대한 향상제(예를 들어, 상자성 이온), 겔, 플레이트, 검출 가능한 라벨, 용기 등을 포함하여 키트에 또한 포함될 수 있다. 키트는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 얻기 위한 샘플링 장치, 예컨대 주사기 또는 침을 또한 포함할 수 있다.
용어 "유효량"은 연관된 방법을 수행하기에 효과적인 화합물(예를 들어, α-syn 표적화 리간드)의 수 또는 양을 정량화하도록 의도된다. 예를 들어, 검출 가능한 수준에서 샘플 또는 대상체에 존재하는 α-syn과 회합하는, α-syn 표적화 리간드, 또는 α-syn 표적화 리간드를 포함하는 접합체의 유효량. 유효량은 대상체에서 사용될 때 투여와 연관된 원치 않는 부작용을 최소화하기에 충분히 낮을 수 있다. 치료학적 유효량은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명은 이성질체(예를 들어, 부분입체이성질체 및 거울상이성질에), 호변이체, 염, 용매화물, 다형, 프로드럭, 및 기타를 포함하는 임의의 이의 약제학적으로 허용되는 형태로 본원에 기재된 화합물을 포함한다. 특히, 화합물이 광학 활성이면, 본 발명은 구체적으로 화합물의 거울상이성질체의 각각뿐만 아니라 거울상이성질체의 라세미 혼합물을 포함한다. 용어 "화합물"은 명시적으로 기술되든 또는 아니든(가끔은 "염"이 명시적으로 기술되지만) 임의의 또는 모든 이러한 형태를 포함한다.
용어 "진단"은 대상체가 질환을 발생시킬 가능성 또는 대상체에서의 질환의 존재 또는 성질을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 용어 진단은 또한 질환 또는 질환의 에피소드의 중증도 및 가능한 결과 또는 일반적으로 예후라 칭하는 회복의 가망을 결정하는 것을 포함한다. "진단"은 치료의 초기 선택, 치료의 변형(예를 들어, 용량 또는 투여 섭생의 조정), 및 기타를 포함하는 진단이 치료를 지도하는 합리적인 치료의 맥락에서의 진단을 또한 포함할 수 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명확히 기술하지 않는 한 그 범위의 상한과 하한 사이에 하한의 단위의 1/10까지 각각의 개재하는 값 및 그 기술된 범위에서의 임의의 다른 기술된 또는 개재하는 값이 본 발명 내에 포함된다. 이들 유사한 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 기술된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계로 처리되어 또한 본 발명 내에 포함된다. 기술된 범위가 제한의 하나 또는 둘 다를 포함할 때, 한계를 포함한 것들의 어느 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위는 또한 본 발명에 포함된다.
본 출원에 사용된 모든 과학 용어 및 기술 용어는 달리 기술되지 않는 한 당해 분야에서 보통 사용된 의미를 갖는다. 본원에 제공된 정의는 본원에 흔히 사용된 소정의 용어의 이해를 쉽게 하기 위한 것이고, 본 출원의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 예, 재료, 양 및 절차는 본원에 기재된 것과 같은 본 발명의 사상 및 정신에 따라 광범위하게 해석되어야 한다.
실시예
Sigma-Aldrich, TCI, Alfa Aesar 또는 Acros Organics로부터 모든 시약을 얻었고, 추가의 정제 없이 사용하였다. 양성자 핵 자기 공명(1H NMR)은 Bruker 600 또는 500 NMR 분광기에서 600 MHz 또는 500 MHz에서 기록되었다. 탄소 핵 자기 공명(13C NMR)은 각각 Bruker 300 또는 500 NMR 분광기에서 75 MHz 또는 125 MHz에서 기록되었다. 화학 이동은 1H NMR에 대한 아세톤(2.05 ppm), 클로로폼(7.26 ppm) 또는 디메틸설폭사이드(2.50 ppm)의 내부 표준품; 및 13C NMR에 대한 잔류 아세톤(206.26 ppm), 클로로폼(77.00 ppm) 또는 디메틸설폭사이드(39.52 ppm)의 내부 표준품으로부터 백만분율(ppm)로 보고된다. NMR 피크 다중성은 하기와 같이 나타난다: s(일중항), d(이중항), t(삼중항), q(사중항), dd(이중항의 이중항), td(삼중항의 이중항), dt(이중항의 삼중항) 및 m(다중항). 커플링 상수(J)는 헤르츠(Hz)로 주어진다. Ohio State University Mass Spectrometry 및 Proteomics Facility로부터 고해상 질량 스펙트럼을 얻었다. TLC는 EMD Chemical Inc.로부터 실리카 겔 60 F254 플레이트에서 수행되었고, 성분은 자외선 광(254 nm) 및/또는 포스포몰리브덴산, 에탄올 중의 20 중량% 용액에 의해 가시화되었다. SiliFlash 실리카 겔(230 내지 400 메쉬)은 모든 칼럼 크로마토그래피에 사용되었다.
실시예 1: 표적화 리간드의 분자 설계
선행 기술 화합물 1은 α-syn 응집체에 대한 높은 친화도 및 선택도를 갖는 새로운 구조의 개발을 향한 구조 활성 관계("SAR") 연구를 위한 스캐폴드로서 선택되었다. 분자 설계(도 4)는 제1 방향족 기(A), 브리지(B) 및 제2 방향족 기(C)인 분자의 3개 부분에 관한 것이었다. (A)에 대해, 1-인다논 및 1,3-인단디온은 새로운 유도체에 대한 출발 점으로서 선택되었다. (B)에 대해, 디엔은 일부 유도체에서 유지되었다. 유도체를 또한 도입하였고, 여기서 이중 결합 중 하나는 분자 내의 전자 밀도를 증가시키기 위해 전자-농후 티오펜 모이어티로 대체되었다. 게다가, 분자 내의 전체 증가된 경직성을 갖는 유도체는 2개의 상이한 고리계에서 제2 이중 결합을 "잠금"함으로써 도입되었다. 제2 방향족 기(C) 주위의 유도체화는 전자-농후 및 전자-결핍 방향족 고리 둘 다뿐만 아니라 헤테로사이클을 포함하였다.
실시예 2: 표적화 리간드의 화학 합성
도 5와 관련하여, 디엔 브리지(B)를 유지시키면서 고리 A가 1-인다노닐-(식 i, 도 3에 도시된 것과 같이 화합물 7 내지 화합물 15를 생성하기 위해), 1,3-인다디오닐-(식 ii, 도 3에 도시된 것과 같이 화합물 16 내지 화합물 22를 생성하기 위해), α-테트랄론-(식 iii, 도 3에 도시된 것과 같이 화합물 23 내지 화합물 24를 생성하기 위해) 또는 쿠마리닐-(식 iv, 도 3에 도시된 것과 같이 화합물 25 내지 화합물 28을 생성하기 위해) 모이어티 중 어느 하나로 대체된 유도체의 제1 시리즈는 원하는 케토 기질과 상응하는 신남알데하이드 유도체의 산 또는 염기-촉매화된 알돌 축합 반응에 의해 이용되었다.
이와 같이, 아세트산(10 mL) 중의 알데하이드(1.0 당량) 및 인돌리논(1.0 당량)의 용액에 37% HCl(0.5 mL)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 110℃에서 밤새 교반하고, 실온으로 냉각시켰다. 냉각된 용매를 얼음물에 붓고 여과시켰다. 고체를 메탄올로 재결정화하였다.
대안적으로, 디클로로메탄/메탄올(1:2, 10 mL) 중의 알데하이드(1.0 당량) 및 인돌리논(1.0 당량)의 용액에 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(0.25 mmol)를 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안　교반하였다. 고체를 여과시키고, 메탄올로 재결정화하였다.
특히 이것이 화합물 8, (E)-2-((E)-3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)알릴리덴)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온과 관련되면서, 화합물은 적색의 고체(436 mg, 79% 수율)로서 원하는 생성물(8)을 제공하도록 1-인다논(250 mg, 1.89 mmol) 및 4-하이드록시-3-메톡시신남알데하이드(337 mg, 1.89 mmol)에 의해 산성 프로토콜에 의해 제조되었다. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 9.52 (s, 1H), 7.74 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.69 (td, J1 = 1.2 Hz, J2 = 7.2 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.47 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.29 (dt, J1 = 1.8 Hz, J2 = 10.2 Hz, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.13 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.09 (dt, J1 = 10.2 Hz, J2 = 15.6 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.93 (s, 2H), 3.86 (s, 3H); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ 192.9, 149.6, 148.9, 148.4, 143.3, 139.3, 135.1, 134.9, 134.2, 128.4, 127.9, 127.1, 123.7, 122.6, 122.5, 116.1, 111.0, 56.2, 30.7. C19H17O3 [M+H]+에 대해 계산된 HRMS (ESI) 293.1172, 관측치, 293.1171.
조기 실행은 모노-케토 기질이 더 깨끗한 반응 생성물 및 산성 조건 하에 더 양호한 수율을 생성시키지만, 디-케토 기질이 염기성 조건을 선호한다는 것을 제시하였다. 따라서, 유사한 반응 조건 하에 이들 기질을 수반하는 후속하는 반응을 수행하였다. 생성된 디엔의 1H 및 13C NMR 스펙트럼 둘 다가 단일 생성물과 일치하는 피크를 보여주어서, 2개의 가능한 이성질체(E,E 또는 Z,E) 중 오직 하나가 형성된다는 것을 제시한다. 이종핵 다중 결합 전도성("HMBC": heteronuclear multiple bond connectivity) 및 NOE 스펙트럼의 추가의 분석은 단리된 생성물이 강조된 양성자 사이에 관찰된 NOE 향상으로 인해 E,E 구성을 갖는다는 것을 제시한다(도 6).
브리징 디엔 시스템의 이중 결합 중 하나가 분자 내의 전자 밀도를 증가시키기 위해 전자-농후 티오펜 모이어티로 대체된 유도체는 식 vii 내지 ix(도 7)에 도시된 것과 같이 2개의 단계에서 합성되었다. 처음에, 5-브로모-2-티오펜카복스알데하이드는 티오브로모 중간체 36을 생성하기 위해 알돌 축합 반응 조건 하에 1-인다논(또는 6-하이드록실-1-인다논)에 노출되었고, 이것은 화합물 37 내지 화합물 44를 생성하기 위해 스즈키 커플링 반응 조건(식 vii) 하에 다양한 아릴보론산 에스테르에 노출되었다. 유사하게, 이 시리즈에서의 다른 유도체는 상응하는 티오브로마이드 중간체 45 및 48을 생성하기 위해 각각 1-인다논(식 vii 및 viii) 및 α-테트랄론과 4-브로모-2-티오펜카복스알데하이드 및 5-브로모-2-티오펜카복스알데하이드의 알돌 축합으로부터 제조되었다. 이후, 이 중간체는 각각 화합물 46 및 화합물 47 및 화합물 49 내지 화합물 51을 얻도록 상이한 아릴보론산 에스테르에 노출되었다.
더 구체적으로는, 도 7 및 도 8과 관련하여, 1-인다노닐- 및 1,3-인단디오닐-디엔 유도체의 제2 시리즈는 식 v 및 식 vi에 도시된 것과 같은 화합물 29 내지 화합물 35를 생성하기 위해 각각의 아릴보론산 에스테르의 스즈키 커플링을 통해 제2 고리를 1-인다노닐-디엔 브로마이드(7 및 11) 및 1,3-인단디오닐-디엔 브로마이드(17)에 부착함으로써 생성되었다. 이와 같이, 1,4-디옥산/H2O(4:1, 10 mL) 중의 인돌리논 유도체(1.0 당량), 보론산 유도체(2.0 당량) 및 K2CO3(1.0 당량)의 용액을 20분 동안 아르곤에 의해 탈기시키고, Pd(PPh3)4(0.1 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 다시 탈기시키고(5분), 110℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물(5 mL)로 켄칭하고, 수성 층을 에틸 아세테이트(30 mL)로 추출하고, 포화 NaHCO3(10 mL)으로 세척하고, 염수(10 mL)로 세척하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4 위에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 칼럼 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하였다.
화합물 36, 화합물 45 및 화합물 48의 NOE(도 9) 및 HMBC 스펙트럼의 분석은 각각의 알돌 축합 반응으로부터의 계속하는 이중 결합이 모두 Z 구성을 갖는다는 것을 보여주었다.
브리징 디엔의 이중 결합 중 하나가 분자 내의 경직성을 증가시키기 위해 고리계 내에 마스킹된 기타 유도체는 도 10에 도시된 것과 같이 이용되었다. 각각의 케토-유도체와 상응하는 알데하이드 사이의 단일 알돌 축합 반응에서 이 시리즈의 모든 구성원이 이용되었다. 도 11은 기타 유도체의 화학 구조를 제공한다.
모든 화합물에 대한 구조 설명은 각각의 개별 화합물의 1H 및 13C NMR 및 고해상 질량 스펙트럼의 분석에 의해 달성된다. 모든 화합물의 UV/VIS 흡수 및 방출 스펙트럼은 포스페이트 완충 식염수("PBS")에서 기록되었다. 합성 피브릴 결합 연구를 위해 형광 현미경검사 연구에 적합한 형광 특성을 갖는 모든 화합물을 선택하였다.
실시예 3: 합성 α-Syn 피브릴에 대한 결합 친화도(K d )
모든 합성된 화합물(19 및 28 제외)은 PBS에서 양호한 방출 스펙트럼을 보여주었다(도 12, 표 1). 결합 친화도가 결정되었다. 결합 친화도는 단일 생물분자와 이의 리간드/결합 파트너 사이의 결합 상호작용의 강도이다. 결합 친화도는 측정되고, 이분자 상호작용의 강도를 평가하고 순위화하기 위해 사용된 평형 해리 상수(Kd)에 의해 보고된다. Kd 값이 더 작을수록, 표적에 대한 리간드의 결합 친화도가 더 크다. Kd 값이 더 클수록, 표적 분자 및 리간드는 서로에 더 약하게 끌리고 결합할 수 있다.　
α-Syn 피브릴 형성
하기 절차를 통해 R-peptide(1 mg 카탈로그 S-1001-2호. Mol. Wt. 14460)로부터 구입한 펩타이드로부터 피브릴을 제조하였다: 0.5 mg의 α-syn을 센트리콘 중의 0.2 mL의 물(10000 MWCO)에 현탁시켰다. 이 현탁액에 0.2 mL의 포스페이트 완충액(10 mM, pH 7.5)을 첨가하였다. 원심분리기(18000 g/초)에서 5분 동안 스피닝함으로써 가용성 재료를 제거하였다. 상기 공정을 4회 반복하였다. 제4 시간 후, 펩타이드를 마이크로관(200 ㎕)으로 옮기고, 2.5 ㎕의 300 mM MnCl(물에서 제조됨)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 항온처리기에서 40℃에서 5일 내지 7일 동안 교반하였다(용액이 혼탁하게 변했다). 형성된 피브릴을 6분 동안 21,000 g/초에서 스핀 다운하였다. 상청액을 버리고, 피브릴 펠릿을 200 ㎕의 PBS 완충액(pH = 7.4)에 재현탁시켰다.
α-syn 피브릴/리간드 결합 검정
PBS 중의 0.1 nM 내지 10 μM의 다양한 농도에서의 리간드 용액(pH = 7.5, 197 ㎕)을 α-syn 피브릴(3 ㎕, 2.5 μM 최종 농도)을 함유하는 마이크로관에 첨가하였다. 혼합물을 진탕에 의해 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 피브릴을 분리시키도록 혼합물을 21,000 g/초에서 15분 동안 스핀 다운하였다. 침전물을 Tris-HCl로 2회 세척하고, 200 ㎕의 완충액에 재현탁시켰다. 분자의 여기 및 방출 최대를 사용하여 SpectraMax-384 플레이트 판독기에서 형광을 측정하였다. 모든 데이터 점은 삼중으로 수행되었다. MATLAB 소프트웨어(R2019B)를 사용하여 비선형 회귀에 의해 데이터를 식 Y = Bmax Х X/(X + Kd)로 적합화함으로써 결합 부위의 Kd 및 최대 수(Bmax) 값을 결정하였다.
Kd 값 ≥ 2 μM(화합물 7, 11, 16-18, 28, 52-54 및 56)을 나타낸 모든 화합물은 불충분한 결합제로 여겨졌고, 무결합("NB")으로 보고되었다.
일반적으로, 1-인다논-디엔 유도체는 8 대 20 및 10 대 22에 의해 예시된 것과 같이 상응하는 1,3-인단디온-디엔보다 더 양호한 결합인 것으로 나타났다. 1-인다논-디엔 모이어티에서의 임의의 방향족 치환(활성화, 13 또는 탈활성화, 14 및 15)은 각각 비치환된 유도체 10 및 8과 비교하여 결합 친화도를 감소시킨다. α-테트랄론-디엔 및 쿠마린-디엔 유도체는 모두 8, 20, 23 및 25에 의해 예시된 것과 같이 상응하는 1-인다논-디엔 및 1,3-인단디온-디엔 유도체에 비해 더 열등한 결합을 보여주었다. 18.8 nM의 Kd를 갖는 화합물 32와 별도로, 제2 고리를 제2 방향족 기(C)에 부착하는 것은 1-인다논-디엔 또는 1,3-인단디온-디엔 시스템 중 어느 하나의 결합 친화도를 개선하는 것으로 보이지 않는다. 유사하게, 디엔 브리지에서의 이중 결합 중 하나를 전자-농후 티오페닐 모이어티(화합물 8 대 39)로 대체하는 것은 약간 보통의 Kd 값(화합물 37, 화합물 39 및 화합물 42) 이외에 α-syn 피브릴에 대한 리간드의 결합 친화도에 대한 긍정적인 영향을 갖지 않는다. C(화합물 52 내지 화합물 58)에 의해 융합된 고리에서 브리징 디엔의 제2 이중 결합을 마스킹함으로써 시스템이 더 경질이 되게 하는 것은 낮은 결합 및 무결합으로 이어진다.
실시예 4: α-Syn 대 Aβ 피브릴에 대한 형광 특성 및 리간드 결합 선택도
α-syn 응집체가 PD 및 다른 시누클레인증에서 마주친 가장 우세한 미스폴딩된 단백질 응집체를 나타내지만, 몇몇 연구는 Aβ 및 타우 응집체가 대개 α-syn과 중첩한다는 것을 제시한다. 생체내 적용을 위한 잠재적인 α-syn 물질은 이러한 경우에 거짓 양성을 최소화하도록 (특히 Aβ에 대해) 고도로 민감하면서 선택적이어야 한다. 11개의 리간드의 예비 α-syn 피브릴 결합 연구는 높은 내지 보통의 친화도(Kd ≤ 100 nM)를 보여주었다. Aβ 피브릴과 비교된 α-syn에 대한 이들 리간드의 형광 특성 및 결합 친화도가 추가로 평가되었다. 유리 리간드의 및 α-syn 또는 Aβ 피브릴 중 어느 하나의 존재 하의 흡수 및 방출 최대 및 형광 양자 수율이 결정되었다. 리간드 8(XW-01-11) 및 리간드 32(XW-01-64)에 대한 데이터(도 13)에 의해 예시된 것처럼, 모든 리간드는 수성 배지 중에 0.5 μM 이하의 농도에서 최소 형광을 보여주지만, 이는 α-syn 또는 Aβ 피브릴 중 어느 하나의 첨가 시 현저히 증가되었다.
형광의 증가는 α-syn 피브릴에 대한 리간드 결합 시 형광 양자 수율의 8배 내지 15배 증가 및 Aβ 피브릴에 대한 결합 시 추가 2배 내지 3배 증가가 동반되며 유리 분자로부터 리간드-피브릴 복합체로의 흡수 및 방출 최대 둘 다의 심색단 이동이 동반된다(도 14, 표 2).
이들 리간드에 의한 피브릴 결합 시 형광 및 방출 최대에서의 관찰된 심색단 이동, 형광의 증가 및 형광 양자 수율은 β-시트 결합 리간드의 다른 관찰과 일치한다.
포화 결합 검정에서 Aβ 피브릴에 대한 결합 친화도가 평가되었다.
Aβ 피브릴 형성
R-Peptide(Bogart, GA)로부터 β-아밀로이드(1-40) 펩타이드를 구매하였다. Eric 등(PLoS One, 2012, 7(10), e48515)에 의해 개략된 프로토콜에 따라 피브릴을 제조하였다. Aβ(1-40)를 433 ㎍/ml의 최종 농도(100 μM)로 PBS, pH 7.4에 용해시켰다. 피브릴의 형성을 유도하도록 실온에서 4일 동안 700 rpm에서 자석 막대를 사용하여 용액을 교반하였다. 스톡 용액을 분취하고, 추가의 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다. 피브릴의 균질한 현탁액을 유지시키기 위해 결합 검정을 위해 분취액을 제거하기 전에 스톡 용액을 완전히 교반하였다.
Aβ 피브릴/리간드 결합 검정
PBS 중의 1 nM 내지 100 μM의 다양한 농도에서의 리간드 용액(pH = 7.5, 180 ㎕)을 β-아밀로이드 피브릴(20 ㎕, 10 μM 최종 농도)을 함유하는 마이크로관에 첨가하였다. 혼합물을 진탕에 의해 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 피브릴을 분리시키도록 혼합물을 21,000 g/초에서 12분 동안 스핀 다운하였다. 침전물을 Tris-HCl로 2회 세척하고, 200 ㎕의 완충액에 재현탁시켰다. 분자의 여기 및 방출 최대를 사용하여 SpectraMax-384 플레이트 판독기에서 형광을 측정하였다. 모든 데이터 점은 삼중으로 수행되었다. MATLAB 소프트웨어(R2019B)를 사용하여 비선형 회귀에 의해 데이터를 식 Y = Bmax Х X/(X + Kd)로 적합화함으로써 결합 부위의 Kd 및 최대 수(Bmax) 값을 결정하였다.
결과(도 15, 표 3)는, 화합물 29와 별도로, 모든 다른 화합물이 α-syn 피브릴에 대한 이중 디지트와 비교하여 Aβ 피브릴에 대한 나노몰 범위의 세자리의 해리 상수를 갖는다는 것을 보여준다. 2개의 단백질 응집체 사이의 각각의 화합물의 Kd 값의 비교는 가장 높은 친화도(Kd = 9.7 nM)를 갖는 화합물 8이 Aβ에 대해 14.4배 선택도를 갖는다는 것을 제시한다. 약간 더 보통의 α-syn 결합제(Kd = 18.8 nM)인 화합물 32는 Aβ에 대해 26배 선택도를 갖는다. 또한 보통의 α-syn 결합제(Kd = 34.9 nM)인 화합물 37은 Aβ에 대해 11.2배 선택도를 갖는다.
실시예 5: 형광 인간 PD 및 AD 조직 염색
α-syn 응집체를 향한 적절한 형광 특성, 높은 친화도 및 선택도를 고려하면, 각각 14.4배, 26배 및 11.2배의 Aβ 선택도에 대한 α-syn을 갖는 리간드 8, 리간드 32 및 리간드 37은 인간 PD 및 AD 환자의 신경병리학적으로 검증된 사후분석 뇌 샘플의 시험관내 형광 염색에서 추가로 평가되었다. PD 뇌의 뇌교 및 전두-피질로부터의 절편을 투과시키고, 항체[항-알파-시누클레인(aa 121-125) 항체, 클론 Syn 211] 및 각각의 화합물의 1 μM 용액으로 순차적으로 처리하고, 공초점 현미경검사에 의해 가시화하였다. 도 16, I 열은 세포 핵을 강조하는 형광 호크스트(HOECHST) 염색을 보여주어서, 조직 내의 세포 바디의 관점을 제공한다. II 열은 리간드 형광을 도시한다. III 열은 항체로부터의 형광을 도시한다. IV 열은 처음의 3개의 영상을 통합함으로써 생성된 복합 영상이다. A 행은 화합물 8(XW-01-11)로 처리된 PD 뇌로부터의 전두 피질의 절편으로부터 얻은 영상을 보여준다. 영상에서 볼 수 있는 것처럼, 리간드는 조직 내의 루이 병리학을 선명하게 표지한다. 패턴 및 표지 강도는 항체 채널에서 유사하게 보인다. 복합 영상은 리간드 및 항체 신호의 동시국소화를 보여주어서, 이들이 동일한 병리학에 결합한다는 것을 확인시켜준다. 유사하게, B 행인 리간드 32(XW-01-64)로 처리된 절편은 리간드에 의한 루이 병리학의 선명한 표지를 보여주고, 이는 항체의 패턴 및 강도를 염색함으로써 확증된다. 리간드 8에 의해 관찰된 것처럼, 리간드 32 및 항체 영상을 통합함으로써 영상화된 복합물은 또한 신호 둘 다의 동시국소화를 보여주고, 이는 사후분석 인간 PD 뇌 절편에서 루이 병리학을 표지하는 데 이들 리간드의 효율을 확인시켜준다. 처리된 조직의 클로즈업 Z-적층 영상(C 행)에서, 병리학은 리간드 및 항체 채널에서 어두운 홀(화살표)을 둘러싸는 것으로 보인다. 핵 염색, 리간드, 및 항체 신호를 통합함으로써 생성된 복합 영상은 리간드 및 항체 채널에서의 어두운 스팟이 실제로 고배율에서 더 두드러진 핵(D 행)에 의해 점유된 스팟이라는 것을 보여준다. 핵의 인접함 및 위치는, 예상된 것처럼, 관찰된 병리학이 세포질 봉입체이고 세포외 응집체가 아니라는 것을 제시한다.
리간드 및 항체 Syn211 조직 염색 실험에 의해 표지된 부위를 추가로 규명하기 위해, 인접한 피질 절편을 화합물 8 및 이후 Syn211 또는 Syn303 중 어느 하나로 처리하였다. 예상된 것처럼, 화합물 8 및 Syn211로 처리된 절편(도 17, 제1 행)은 복합 영상에서 동시국소화하는 동일한 리간드 및 항체 표지 패턴을 보여준다. 리간드 및 항체 둘 다는 조직에 존재하는 병리학의 모든 형태를 표지하는 것으로 보인다. 다른 한편, 리간드 및 항체 Syn303으로 처리된 조직 절편(도 17, 제2 행)은 리간드 채널에서의 작은 신경돌기 둘 다(상부 화살표), 그러나 오직 항체 채널에서의 성숙 루이소체(하부 화살표)의 효과적인 표지를 보여준다. 이 발견은 표지된 병리학이 α-syn이고, 리간드가 병리학의 모든 구성을 표지한다는 것을 제시한다.
인간 조직에서의 응집체에 대한 α-syn 대 Aβ 피브릴 결합에서의 관찰된 선택도를 평가하기 위해, 리간드 8, 리간드 32 및 리간드 37의 등몰량 농도는 AD 환자의 신경병리학적으로 검증된 사후분석 뇌 샘플로부터의 피질 절편과 함께 상기 기재된 것과 같은 PD 조직에서 추가로 평가되었다. 도 18은 α-syn 대 Aβ에 대한 14.4배의 선택도를 갖는 상부 결합제(8)로부터의 데이터를 보여준다. A 행에서 관찰될 수 있는 것처럼, PD 조직은 병리학의 큰 침착물 및 미세한 침착물의 선명한 표지를 보여준다(II 열). 유사한 표지 패턴 및 효율은 항체 채널에서 관찰된다(III 열). 신호 둘 다를 호크스트 신호와 통합함으로써 생성된 복합 영상(IV 열)은 리간드 및 항체 신호의 동시국소화를 보여준다. PD 조직과 달리, AD 조직으로부터의 형광 영상(B 행)은 미만성 플라크로 구성된 더 미세한 응집체가 아니라 리간드 채널에서 대부분 치밀한 코어 Aβ 플라크(II 열)를 보여준다. 항체, 항-β-아밀로이드, 17-24 항체(4G8)는 치밀한 코어 및 미만성 Aβ 병리학(III 열) 둘 다를 강조한다. 신호 둘 다를 호크스트 신호와 통합함으로써 생성된 복합 영상은 치밀한 코어 플라크로부터의 리간드 및 항체 신호의 중첩(IV 열)을 보여준다. 이 데이터는 리간드가 피브릴 Aβ보다 더 높은 효율로 피브릴 α-syn을 표지한다는 것을 제시한다. 처리된 AD 조직으로부터의 고배율 영상(C 행)은, 예상된 것처럼, 관찰된 Aβ 병리학이 PD 조직에서 발견된 세포내 루이 병리학과 달리 세포외라는 것을 보여준다.
인간 조직 획득
NIH Neurobiobank로부터 인간 PD 뇌 조직 및 AD 뇌 조직을 얻었다.
인간 PD 뇌 조직에서의 α-syn 병리학의 표지
중뇌 조직(전두 피질 5469)을 Tissue-Tek O.C.T. 화합물로 포매하고, 액체 질소에서 30분 동안 유지시켰다. 포매된 조직을 -20℃ 아래에서 Lecia Biosystems Cryostat로 30 μm 두꺼운 절편으로 슬라이싱하고, Precleaned Microscope Slide에 탑재하였다. 절편을 1× PBS로 2회 세척하고, 20분 동안 10% 포르말린 용액으로 로딩하였다. 절편을 1× PBS로 3회 세척하고, 10분 동안 0.1% Triton-X 100으로 투과시켰다. 절편을 1× PBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 2% 노르말 당나귀 혈청과 항온처리하였다. 절편을 4℃에서 밤새 항-알파-시누클레인(aa 121-125) 항체, 클론 Syn 211(복수 무)(1% 당나귀 혈청 중의 1:1000)와 항온처리하고, 1× PBS로 3회 세척하였다. 절편을 Alexa Fluor 488(PBS 중의 1:200)로 표지된 형광 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 절편을 1× PBST로 3회 세척하고, 시험되는 화합물로 처리하였다. 각각의 조직 절편을 PBS에 용해된 5 μM의 시험 화합물과 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 절편을 1× PBST로 3회 세척하고, 2분 동안 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher(에탄올 중의 1:20)로 로딩하였다. 절편을 1× PBS로 3회 세척하고, 커버슬립하였다. 조직을 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 647에 대해 표준 여기/방출 필터를 사용하여 Lecia DMi8 Motorized Fluorescence Microscope으로 영상화하였다.
인간 AD 뇌 조직에서 β-아밀로이드 플라크의 염색
중뇌 조직(전두 피질 5590)을 Tissue-Tek O.C.T. 화합물로 포매하고, 액체 질소에서 30분 동안 유지시켰다. 포매된 조직을 -20℃ 아래에서 Lecia Biosystems Cryostat로 30 μm 두꺼운 절편으로 슬라이싱하고, Precleaned Microscope Slide에 탑재하였다. 절편을 1× PBS로 2회 세척하고, 이후 20분 동안 10% 포르말린 용액으로 로딩하였다. 절편을 1× PBS로 3회 세척하고, 10분 동안 0.1% Triton-X 100으로 투과시켰다. 절편을 1× PBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 2% 노르말 당나귀 혈청과 항온처리하였다. 절편을 4℃에서 밤새 정제된 항-β-아밀로이드, 17-24 항체(4G8)(1% 당나귀 혈청 중의 1:500)와 항온처리하고, 1× PBS로 3회 세척하였다. 절편을 Alexa Fluor 488(PBS 중의 1:200)로 표지된 형광 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 절편을 1× PBST로 3회 세척하고, 시험되는 화합물로 처리하였다. 각각의 조직 절편을 PBS에 용해된 5 μM의 시험 화합물과 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 절편을 1× PBST로 3회 세척하고, 2분 동안 TrueBlack Linpofuscin Autofluorescence Quencher(에탄올 중의 1:20)로 로딩하였다. 절편을 1× PBS로 3회 세척하고, 커버슬립하였다. 조직을 Alexa Fluor 488 또는 Alexa Fluor 647에 대해 표준 여기/방출 필터를 사용하여 Lecia DMi8 Motorized Fluorescence Microscope으로 영상화하였다.
인간 뇌 조직 HRP-DAB 염색
중뇌 조직(전두 피질 5469 또는 전두 피질 5590)을 Tissue-Tek O.C.T. 화합물로 고정하고, 액체 질소에서 30분 동안 유지시켰다. 동결기 조직을 -20℃ 아래에서 Lecia Biosystems Cryostat로 30 μm 두꺼운 절편으로 슬라이싱하고, Precleaned Microscope Slide에 탑재하였다. 절편을 1× PBS로 2회 세척하고, 20분 동안 10% 포르말린 용액으로 로딩하였다. 절편을 1× PBS로 3회 세척하고, 50 ㎕의 퍼옥사이드 블록을 각각의 절편에 적용하고, 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 절편을 1× PBS로 2회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 2% 노르말 당나귀 혈청과 항온처리하였다. 절편을 4℃에서 밤새 항-알파-시누클레인(aa 121-125) 항체, 클론 Syn 211(복수 무)(1% 당나귀 혈청 중의 1:1000) 또는 정제된 항-β-아밀로이드, 17-24 항체(4G8)(1% 당나귀 혈청 중의 1:500)와 항온처리하고, 1× PBS로 3회 세척하였다. 절편을 비오티닐화된 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, 1× PBST로 3회 세척하였다. 절편을 스트렙타비딘/HRP 표지와 30분 동안 항온처리하고, 1× PBST로 3회 세척하였다. 절편을 증류수와 10분 동안 항온처리하고, DAB Chromagen(50 ㎕의 DAB Chromagen을 1 mL의 DAB 기질과 배합)과 항온처리하였다. 절편을 증류수로 3회 세척하고, 10분 동안 알코올의 등급을 통해 탈수시켰다. 마지막으로, 절편을 자일렌에 의해 세척하여 커버슬립하고, 실온에서 2일 동안 저장하고, 명시야 현미경에 의해 영상화하였다.
실시예 6: DSPE-PEG3400-XW-01-11 접합체의 합성
도 19와 관련하여, 에틸 브로모아세테이트(2.3 g, 13.5 mmol)를 DMF(10 mL) 중의 6-하이드록시-1-인다논(1.0 g, 6.8 mmol), K2CO3(2.8 g, 20.2 mmol) 및 KI(112 mg, 0.7 mmol)의 용액에 일 부분으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 90oC에서 밤새 교반하였다. 이 때, TLC(실리카, 1:3 EtOAc-헥산)는 반응이 완료되었다는 것을 보여주었다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 용리제로서 에틸 아세테이트(50 mL)를 사용하여 셀라이트의 패드를 통해 여과시키고, 여과액을 농축시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 원하는 생성물(1.4 g, 90%)을 백색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.26 (dd, J 1 = 2.4 Hz, J 2 = 8.4 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.64 (s, 2H), 4.26 (q, J = 7.8 Hz, 2H), 3.06 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.69 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.29 (t, J = 7.8 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 206.7, 168.4, 157.6, 148.9, 138.2, 127.7, 124.4, 105.8, 65.3, 61.5, 36.9, 25.1, 14.1.
37% HCl(0.2 mL)을 생성물(700 mg, 3.0 mmol) 및 아세트산(10 mL) 중의 4-하이드록시-3-메톡시신남알데하이드(588 mg, 3.3 mmol)의 용액에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃에서 밤새 교반하고, 실온으로 냉각시켰다. 냉각된 용매를 얼음물에 붓고 여과시켰다. 고체를 메탄올에 재결정화하여 원하는 생성물(768 mg, 70%)을 갈색의 고체로서 제공하였다. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 13.09 (s, 1H), 9.52 (s, 1H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.32-7.24 (m, 3H), 7.13 (dd, J 1 = 6.0 Hz, J 2 = 9.0 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.06 (td, J 1 = 3.0 Hz, J 2 = 7.8 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.79 (s, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 2H); 13C NMR (150 MHz, DMSO-d 6) δ 192.7, 170.6, 148.4, 142.6, 140.4, 135.8, 134.2, 127.9, 123.7, 122.4, 106.3, 65.3, 56.2, 29.9.
생성물(120 mg, 0.3 mmol) 및 건조 DMF(8 mL) 중의 DSPE-PEG3400-NH2(500 mg, 0.1 mmol)의 용액에 HSTU(160 mg, 0.4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 메탄올/물 혼합물(1:1, 8 mL)로 희석하고, 2000 MWCO 투석 카세트에 로딩하고, MES 완충액(10 mM, 2×5 리터)에 대해 8시간 동안 투석하고, 2일 동안 물(3×5 리터)에 대해 투석하였다. 동결 건조에 의해 물을 제거하여 DSPE-PEG3400-XW-01-11(242 mg, 48%)을 황색의 고체로서 얻었다. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.23 (dd, J 1 = 2.4 Hz, J 2 = 5.6 Hz, 1H), 7.19-7.17 (m, 2H), 7.15 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.02-6.99 (m, 3H), 6.78 (dd, J 1 = 8.4 Hz, J 2 = 10.8 Hz, 1H), 5.09 (brs, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.30 (dd, J 1 = 2.4 Hz, J 2 = 12.0 Hz, 1H), 4.12-4.06 (m, 2H), 4.01 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.98 (brs, 2H), 3.81-3.77 (m, 5H), 3.73 (s, 2H), 3.49 (dd, J 1 = 2.4 Hz, J 2 = 7.8 Hz, 2H), 3.48-3.46 (m, 3H), 3.35-3.32 (m, 4H), 3.20-3.18 (m, 2H), 2.21-2.18 (m, 4H), 1.93-1.92 (m, 4H), 1.50-1.47 (m, 4H), 0.761 (t, J = 6.0 Hz, 6H); HRMS (MALDI) C219H410N2O92P에 대한 계산치 [M+H]+ 4571.7203, 관측치, 4571.7069.
실시예 7: 화합물 8(XW-01-11)-표지된 리포솜의 제작
32:2.5:40:25:0.5의 몰비(%)로 HSPC:DSPE-mPEG2000:Chol:Gd-DOTA-DSPE:DSPE-PEG3400-XW-01-11을 포함하는 지질 혼합물을 60℃ 내지 65℃에서 에탄올(600 ㎕)에 용해시켰다. 에탄올에 용해된 DHPE-로다민(200 ㎕ 중의 1 mg)을 첨가하고, 용액이 60℃ 내지 65℃에서 45분 동안 히스티딘 완충 식염수(HBS)(10 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, 약 pH 7.6)에 의해 수화되게 보장한다. 수화된 지질 용액을 원하는 크기(Dynamic Light Scattering (DLS) 기기(Brookhaven Instruments Corp., 미국 뉴욕주 호트스빌))의 리포솜을 형성하기 위해 고압 압출기(Northern Lipids, 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버)를 사용하여 60℃ 내지 65℃에서 400 nm(5회 통과), 이어서 200 nm(8회 통과) Nucleopore 막을 통해 순차적으로 압출하였다. 리포솜 현탁액을 300 kDa 분자량 컷오프 막(Spectrum Laboratories Inc., 미국 캘리포니아주)을 사용하여 히스티딘-완충 식염수(HBS)에 대해 투석하여 비캡슐화된 재료를 제거하였다. 대조군 리포솜(비표적화된 리포솜)을 동일한 프로토콜을 사용하여 제조하지만, DSPE-PEG3400-XW-01-11 분획은 mPEG2000으로 대체되었다.
실시예 8: α-Syn 피브릴에 대한 화합물 8(XW-01-11) 표적화된 리포솜의 결합의 시험관내 평가
도 20은 (a) 본 발명의 표적화된 리포솜과 α-syn 피브릴 사이의 반응을 도시하는 카툰; (b) 실시예 7에서 제조된 리간드 8(XW-01-11) 표지된 리포솜의 용액이 194 nm의 평균 유체역학 직경을 갖는다는 것을 보여주는 DLS 그래프; (c) 피브릴에 대한 XW-01-11의 높은 친화도에 의해 함께 보유된, 나노입자와 피브릴 사이의 응집체의 형성으로 인한, 실시예 7 표적화된 리포솜과 1 nM α-syn 피브릴의 1.5시간 동안의 항온처리 후 유체역학 직경(2346 nm)의 큰 증가를 보여주는 DLS 그래프; (d) 비표적화된 나노입자의 예시적인 용액(즉, DSPE-PEG3400-XW-01-11 분획은 mPEG2000에 의해 대체됨)이 169 nm의 평균 유체역학 직경을 갖는다는 것을 보여주는 DLS 그래프; (e) 1.5시간 동안 비표적화된 나노입자의 예시적인 용액과 1 nM α-syn 피브릴과의 항온처리가 500 nm 초과의 유체역학 직경을 갖는 임의의 입자를 생성하지 않는다는 것을 보여주는 DLS 그래프(비표적화된 나노입자와 α-syn 피브릴 사이의 상호작용의 부재를 나타냄)를 보여준다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보, 및 전자로 이용 가능한 자료의 완전한 개시내용은 참고로 포함된다. 상기 상세한 설명 및 실시예는 오직 이해의 명확함을 위해 주어진다. 이로부터 불필요한 제한이 없는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명이 도시되고 기재된 정확한 상세내용으로 제한되지 않고, 당업자에게 명확한 변형에 대해 청구항에 의해 정의된 본 발명 내에 포함될 것이다.

Claims (20)

  1. 화학식 I에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00039

    상기 식 중,
    X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고;
    Y는 -CH-CH=CH- 또는
    Figure pct00040
    이고;
    A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
    R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -Me로부터 독립적으로 선택되고;
    A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OMe, -NO2, -NMe2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00041
    .
  3. 제1항에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00042
    .
  4. 제1항에 있어서, 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00043
    .
  5. 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체로서,
    인지질-중합체는
    Figure pct00044

    (상기 식 중, 변수 n은 약 70 내지 약 90의 임의의 정수이고, 변수 m은 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나임)을 포함하고;
    표적화 리간드는 하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 것인 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체:
    Figure pct00045

    상기 식 중,
    X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고;
    Y는 -CH-CH=CH- 또는
    Figure pct00046
    이고;
    A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
    R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -Me로부터 독립적으로 선택되고;
    A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OMe, -NO2, -NMe2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다.
  6. 제5항에 있어서, 하기를 포함하는 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체:
    Figure pct00047

    상기 식 중, n은 77 또는 79이다.
  7. 제5항에 있어서, 하기를 포함하는 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체:
    Figure pct00048

    상기 식 중, n은 77 또는 79이다.
  8. 제5항에 있어서, 하기를 포함하는 인지질-중합체-표적화 리간드 접합체:
    Figure pct00049

    상기 식 중, n은 77 또는 79이다.
  9. 제1 인지질;
    리포솜 조성물을 안정화시킬 수 있는 입체적으로 벌키한 부형제;
    제1 중합체에 의해 유도체화된 제2 인지질;
    거대환식 가돌리늄계 이미징제(imaging agent); 및
    제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질
    을 포함하는 리포솜 조성물로서, 제2 중합체는 표적화 리간드에 접합되고, 표적화 리간드는 하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내어지는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00050

    상기 식 중,
    X는 -CH2-, -CH2-CH2-, -CHO- 또는 -O-CO-이고;
    Y는 -CH-CH=CH- 또는
    Figure pct00051
    이고;
    A 및 B는 C 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
    R1, R2, R3 및 R4는 -H, 할로겐, -OH 및 -Me로부터 독립적으로 선택되고;
    A 및/또는 B가 N일 때 인접한 R5 및/또는 R7이 -H임을 제외하고는 R5, R6 및 R7은 -H, 할로겐, -OH, -OMe, -NO2, -NMe2, C1-C6 알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 C4-C6 아릴 기로부터 독립적으로 선택된다.
  10. 제9항에 있어서, 제1 인지질은 수소화된 대두(soy) L-α-포스파티딜콜린("HSPC")을 포함하는 것인 리포솜 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 리포솜 조성물을 안정화시킬 수 있는 입체적으로 벌키한 부형제는 콜레스테롤("Chol")을 포함하는 것인 리포솜 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 제1 중합체에 의해 유도체화된 제2 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000)("DSPE-mPEG2000")을 포함하는 것인 리포솜 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 거대환식 가돌리늄계 이미징제는 하기를 포함하는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00052
    .
  14. 제9항에 있어서, 거대환식 가돌리늄계 이미징제는 제4 인지질에 접합되어 하기 화학식 또는 이의 염을 구성하는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00053

    상기 식 중, 변수 x는 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나이다.
  15. 제14항에 있어서, 변수 x는 16(접합체: "Gd(III)-DOTA-DSPE")인 리포솜 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 표적화 리간드는 하기를 포함하는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00054
    .
  17. 제9항에 있어서, 표적화 리간드는 하기를 포함하는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00055
    .
  18. 제9항에 있어서, 표적화 리간드는 하기를 포함하는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00056
    .
  19. 제9항에 있어서, 제2 중합체에 의해 유도체화된 제3 인지질은 하기 화학식 또는 이의 염을 포함하는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00057

    상기 식 중, 변수 n은 약 70 내지 약 90의 임의의 정수이고, 변수 m은 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나이다.
  20. 제9항에 있어서, 제3 인지질, 제2 중합체, 및 표적화 리간드의 접합체는 하기를 포함하는 것인 리포솜 조성물:
    Figure pct00058

    상기 식 중, n은 77 또는 79이다.
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