CN116239482A - 一种近红外型荧光探针及其在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用 - Google Patents

一种近红外型荧光探针及其在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于近红外荧光探针技术领域，涉及一种近红外型荧光探针及其在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用。其化学结构如式(I)所示，

Description

一种近红外型荧光探针及其在制备阿尔兹海默症早期诊断试 剂中的应用
技术领域
本发明属于近红外荧光探针技术领域，涉及一种近红外型荧光探针及其在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前，β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)级联假说被普遍认为是阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)的致病机理之一。因此，Aβ沉积和积累形成的Aβ斑块被认为是AD发病机制中的重要标志，能够直接显示体内Aβ斑块有助于AD的早期诊断。近红外荧光成像由于其安全度高、荧光寿命长、穿透深度高、自荧光干扰小、成本低、检测周期短等特点而受到普遍研究，因而需要一种新的用于早期诊断AD的近红外型荧光探针。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种近红外型荧光探针及其在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用，本发明提供的近红外型荧光探针是一类D-π-A型荧光探针，该荧光探针具有发射波长位于近红外区，能特异性检测β淀粉样蛋白，与β淀粉样蛋白结合后荧光信号明显增强，可用于检测β淀粉样蛋白和阿尔兹海默症的早期诊断。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种近红外型荧光探针，其化学结构如式(I)所示，
Figure BDA0004009083680000021
其中，n＝0～2；
R1为C1-C5烷基或C1-C5羟烷基；R2为C1-C5烷基或C1-C5羟烷基；
W为噻吩环、呋喃环、苯环、萘环或喹啉环；
R3为
Figure BDA0004009083680000022
C1-C5羟烷基表示被羟基取代的C1-C5烷基基团。
进一步地，包括如下所示化合物，
Figure BDA0004009083680000023
另一方面，一种上述近红外型荧光探针的制备方法，包括按如下反应式将式(II)所示的化合物溶于质子性溶剂中后，在碱的催化下与式(Ⅲ)所示的化合物发生Knoevenagel反应制得式(I)所示的化合物的过程，
Figure BDA0004009083680000031
R3为
Figure BDA0004009083680000032
或者，包括按如下反应式将式(X)所示的化合物和式(VII)所示的化合物在碱性条件下通过wittig反应制得式(I)所示的化合物；
Figure BDA0004009083680000033
R3为
Figure BDA0004009083680000034
或者，包括按如下反应式将式(VIII)所示的化合物与丙二腈在碱性条件下通过wittig反应制得式(I)所示的化合物；
Figure BDA0004009083680000035
R3为
Figure BDA0004009083680000036
进一步地，式(II)所示的化合物的制备方法为：将式(IV)所示的化合物与(1,3-二氧戊环-2-基)甲基三苯基溴化膦在非质子性溶剂中，在碱和相转移催化剂的作用下进行wittig反应，再脱去缩醛获得；
或者，包括上述过程，并将脱去缩醛后的产物作为原料代替式(IV)所示的化合物重复上述过程
Figure BDA0004009083680000041
当R1或R2为(C1-C4)羟烷基时，在wittig反应过程中需用3,4-二氢吡喃对-OH进行保护，即转化为-OTHP基团，方法为：将式(II)所示的化合物用无水二氯甲烷溶解，加入3,4-二氢吡喃和对甲苯磺酸吡啶鎓盐，室温反应24～48h。本发明所述室温是指室内环境的温度。
第三方面，一种组合物，包括上述近红外型荧光探针及其药学上可接受的盐。
本发明所述药学上可接受的盐为其与酸形成的盐，所述酸可以为无机酸(例如盐酸、硫酸等)，也可以为有机酸(例如醋酸、枸橼酸、甲磺酸等)。
第四方面，一种制剂，包括上述近红外型荧光探针或其药学上可接受的盐或组合物和药学上可接受的载体。
本发明所述载体为卵磷脂、血清蛋白、甘油等。
第五方面，一种上述近红外型荧光探针、组合物和/或制剂在制备检测β淀粉样蛋白聚集体试剂中的应用。
第六方面，一种上述近红外型荧光探针、组合物和/或制剂在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用。
第七方面，一种阿尔兹海默症早期诊断试剂盒，包括上述近红外型荧光探针和溶剂。
本发明所述溶剂可以为磷酸盐缓冲溶液、生理盐水等。
本发明的有益效果为：
本发明基于“D-π-A”构型设计了近红外型荧光探针，该探针能够靶向结合β淀粉样蛋白，在与β淀粉样蛋白结合后荧光信号明显增强，发射波长会出现蓝移现象。本发明提供的近红外型荧光探针具有发射波长位于近红外区，特异性靶向β淀粉样蛋白、选择性好的特点，对于阿尔兹海默症早期诊断探针的研究发展具有重要意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中荧光探针与Aβ1-42聚集体孵育前后的荧光光谱图；
图2为本发明实施例中荧光探针分别与Aβ1-42聚集体和BSA孵育前后的荧光光谱图；
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本技术领域常规方法，所使用的试剂、设备和原材料均可通过市售获得；实施例中未注明的具体实验条件与方法，均按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
实施例1：中间体的制备
化合物2的制备
纯品化合物1(1.0g)溶于无水二氯甲烷中(20mL),向体系中加入(1，3-二氧戊环-2-基)甲基三苯基溴化膦(3.5g)、无水碳酸钾(3.7g)及微量的18-冠醚-6，回流12-24h。反应完成后，过滤，蒸除溶剂。残余物用四氢呋喃溶解，加入过量的盐酸(2M)，常温下搅拌30min。后滴加饱和碳酸钾溶液调节体系pH值至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析法纯化(PE:EA)得到黄色固体化合物2。
化合物2:MS m/z 176(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ9.58(d,J＝7.9Hz,1H),7.44(d,J＝8.9Hz,2H),7.37(d,J＝15.6Hz,1H),6.68(d,J＝8.9Hz,2H),6.53(dd,J＝15.6,7.9Hz,1H),3.04(s,6H).
Figure BDA0004009083680000061
化合物3的制备
纯品化合物2(40mg)溶于无水二氯甲烷中(10mL),向体系中加入(1，3-二氧戊环-2-基)甲基三苯基溴化膦(147mg)、无水碳酸钾(126mg)及微量的18-冠醚-6，回流反应12-24h。反应完成后，过滤，蒸除溶剂。残余物用四氢呋喃溶解，加入过量盐酸(2M)，常温搅拌30min。后滴加饱和碳酸钾溶液调节体系pH值至中性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，硅胶柱层析法纯化(PE:EA)得到橙色固体化合物3。
化合物3:MS m/z 202(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.55(d,J＝8.1Hz,1H),7.39(d,J＝8.9Hz,2H),7.24(dd,J＝15.0,10.9Hz,1H),6.94(d,J＝15.3Hz,1H),6.81(dd,J＝15.3,10.9Hz,1H),6.67(d,J＝8.8Hz,2H),6.17(dd,J＝15.0,8.1Hz,1H),3.02(s,6H).
Figure BDA0004009083680000071
化合物7的制备
纯品化合物10(200mg)溶于无水乙醇(10ml)，0℃下加入NaBH4(126mg),常温搅拌反应。反应完成后，加水淬灭反应体系，减压蒸除乙醇，DCM萃取体系，收集有机相，无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，硅胶柱层析法纯化(PE:EA)得到无色油状液体化合物11。
纯品化合物11(3.6g)溶于无水乙腈(50ml)，加入三苯基膦氢溴酸盐(10g),80-90℃反应1-3h。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法纯化(DCM:MeOH)得到白色固体化合物7。
化合物11：MS m/z 178(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.22(d,J＝8.7Hz,2H),6.71(d,J＝8.7Hz,2H),4.53(s,2H),2.93(s,6H),1.84(br s,1H).
化合物7：MS m/z 503(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.75-7.55(m,15H),6.77(dd,J＝8.8,2.4Hz,2H),6.36(d,J＝8.6Hz,2H),4.91(d,J＝13.1Hz,2H),2.80(s,6H).
Figure BDA0004009083680000072
化合物8的制备
按照化合物11的制备步骤，以化合物12(100mg,0.57mmol)为原料制备化合物13，并用硅胶柱层析法(PE:EA)纯化得到无色透明液体13。
按照制备化合物7的方法，以化合物13(540mg,3.05mmol)为原料，得到了白色固体8。
化合物13：MS m/z 178(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.29(d,J＝8.8Hz,2H),6.68(d,J＝8.8Hz,2H),6.52(d,J＝15.8Hz,1H),6.14-6.19(m,J＝15.8,6.2Hz,1H),4.29-4.26(m,2H),2.96(s,6H),1.58(s,1H).
化合物8：MS m/z 503(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.89-7.65(m,15H),7.09(d,J＝8.5Hz,2H),6.64-6.58(m,3H),5.66-5.75(m,1H),4.92(dd,J＝14.8,7.4Hz,2H),2.94(6H,s).
Figure BDA0004009083680000081
化合物9的制备
按照化合物11的制备步骤，以化合物14(100mg,0.57mmol)为原料制备化合物15，并用硅胶柱层析法(PE:EA)纯化得到无色透明液体15。
按照制备化合物7的方法，以化合物15(540mg,3.05mmol)为原料，得到了白色固体9。
化合物15：MS m/z 204(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.30(d,J＝8.8Hz,2H),6.68(d,J＝8.5Hz,2H),6.62(dd,J＝15.5,10.3Hz,1H),6.49(d,J＝15.6Hz,1H),6.39(dd,J＝15.1,10.3Hz,1H),5.87(dt,J＝15.1,6.2Hz,1H),4.23(d,J＝6.0Hz,2H),2.97(s,6H).
化合物9：MS m/z 529(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.89-7.65(m,15H),7.09(d,J＝8.5Hz,2H),6.64-6.58(m,3H),5.66-5.75(m,1H),4.92(dd,J＝14.8,7.4Hz,2H),2.94(6H,s).
Figure BDA0004009083680000082
实施例2：化合物A-1、A-2、A-3的制备
化合物A-1的制备
纯品化合物1(100mg)溶于10mL的无水乙醇，向体系中加入1，3-环戊二酮(98mg)和哌啶(50μL)，常温搅拌反应。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法纯化(PE:EA)得到橙色固体化合物A-1。
化合物A-1：MS m/z 230(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.56(Br s,2H),7.67(s,1H),6.72(d,J＝9.3Hz,2H),3.17(s,6H),2.75-2.71(m,2H),2.68-2.64(m,2H).
Figure BDA0004009083680000091
化合物A-2的制备
纯品化合物2(100mg)溶于10mL的无水乙醇，向体系中加入1，3-环戊二酮(84mg)和哌啶(50μL)，常温搅拌反应。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法纯化(PE:EA)得到深紫色固体化合物A-2。
化合物A-2：MS m/z 256(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.24(dd,J＝14.8,12.5Hz,1H),7.60(d,J＝8.9Hz,2H),7.54(d,J＝12.4Hz,1H),7.40(d,J＝14.9Hz,1H),6.68(d,J＝8.9Hz,2H),3.12(s,6H),2.65(s,4H).
Figure BDA0004009083680000092
化合物A-3的制备
纯品化合物3(50mg)溶于10mL的无水乙醇，向体系中加入1，3-环戊二酮(30mg)和哌啶(25μL)，常温搅拌反应。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法纯化(PE:EA)得到黑色固体化合物A-3。
化合物A-3：MS m/z 282(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.83(t,J＝13.4Hz,1H),7.45(d,J＝13.2Hz,1H),7.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.29(dd,J＝14.2,10.8Hz,1H),7.04(d,J＝15.6Hz,1H),6.99(dd,J＝15.0,10.8Hz,1H),6.68(d,J＝8.4Hz,2H),3.07(s,6H),2.67(m,4H).
Figure BDA0004009083680000101
实施例3：化合物B-1、B-2、B-3的制备
化合物B-1的制备
纯品化合物1(100mg)溶于5mL的无水乙醇，向体系中加入1，3-茚满二酮(147mg)和哌啶(50μL)，常温反应。反应完成后，过滤，残余物用乙醇重结晶得到橙黄色固体化合物B-1。
化合物B-1：MS m/z 278(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.53(d,J＝8.9Hz,2H),7.93-7.90(m,2H),7.78(s,1H),7.72-7.70(m,2H),6.74(d,J＝9.0Hz,2H),3.14(s,6H).
Figure BDA0004009083680000102
化合物B-2的制备
纯品化合物2(100mg)溶于5mL的无水乙醇，向体系中加入1，3-茚满二酮(125mg)和哌啶(50μL)，常温反应。反应完成后，过滤出，残余物用乙醇重结晶得到深紫色固体化合物B-2。
化合物B-2：MS m/z 304(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.27(dd,J＝15.1,12.2Hz,1H),7.92-7.89(m,2H),7.73-7.71(m,2H),7.65(d,J＝12.2Hz,1H),7.59(d,J＝8.9Hz,2H),7.31(d,J＝15.1Hz,1H),6.69(d,J＝8.9Hz,2H),3.09(s,6H).
Figure BDA0004009083680000111
化合物B-3的制备
纯品化合物3(30mg)溶于5mL的无水乙醇，向体系中加入1，3-茚满二酮(28mg)和哌啶(10μL)，常温反应。反应完成后，过滤，残余物用硅胶柱层析法纯化(PE:EA)得到黑色固体化合物B-3。
化合物B-3：MS m/z 330(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.92-7.89(m,2H),7.86(d,J＝13.5Hz,1H),7.74-7.72(m,2H),7.57(d,J＝12.4Hz,1H),7.43(d,J＝8.2Hz,2H),7.20(dd,J＝14.4,9.7Hz,1H),6.99(dd,J＝15.1,10.1Hz,1H),6.95(d,J＝15.2Hz,1H),6.69(d,J＝8.2Hz,2H),3.04(s,6H).
Figure BDA0004009083680000112
实施例4：化合物C-1、C-2、C-3的制备
化合物C-1的制备
纯品化合物1(50mg)溶于5mL的无水乙醇，向体系中加入3-羰基-1，1-二羰基苯并噻吩(73mg)和哌啶(25μL)，常温反应。反应完成后，过滤，残余物用乙醇重结晶得到橙黄色固体化合物C-1。
化合物C-1：MS m/z 314(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.07-8.01(m4H),7.95(s,1H),7.87-7.83(m,1H),7.80-7.75(m,1H),6.78(d,J＝9.1Hz,2H),3.16(s,6H).
Figure BDA0004009083680000121
化合物C-2的制备
纯品化合物2(50mg)溶于5mL的无水乙醇，向体系中加入3-羰基-1,1-二羰基苯并噻吩(62mg)和哌啶(25μL)，常温下反应。反应完成后，过滤，残余物用乙醇重结晶得到深紫色固体化合物C-2。
化合物C-2：MS m/z 340(M+1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.93-8.06(m,2H),7.82-7.87(m,1H),7.74-7.82(m,2H),7.58(d,J＝8.9Hz,2H),7.29-7.48(m,J＝26.4,14.4Hz,2H),6.69(d,J＝8.9Hz,2H),3.11(s,6H).
Figure BDA0004009083680000122
化合物C-3的制备
纯品化合物3(20mg)溶于5mL的无水乙醇，向体系中加入3-羰基-1，1-二羰基苯并噻吩(20mg)和哌啶(20μL)，常温反应。反应完成后，过滤,残余物用硅胶柱层析法纯化(PE:THF)得到黑色固体化合物C-3。
化合物C-3：MS m/z 366(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.05-8.02(m,1H),8.00-7.98(m,1H),7.87-7.83(m,1H),7.79-7.76(m,1H),7.71(d,J＝12.7Hz,1H),7.43(d,J＝8.9Hz,2H),7.25(dd,J＝13.8,10.2Hz,1H),7.13(t,J＝13.2Hz,1H),7.01(d,J＝15.1Hz,1H),6.97(dd,J＝15.1,10.2Hz,1H),6.69(d,J＝9.0Hz,2H),3.11(s,6H).
Figure BDA0004009083680000131
实施例5：化合物D-1、D-2、D-3的制备
化合物D-1的制备
将纯品化合物7(45mg)和纯品化合物16(233mg)溶于无水DCM(10mL)中，加入t-BuOK(39mg)，室温搅拌反应2-4h。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法(DCM)纯化，得到黑色固体D-1和黑色固体17。
化合物D-1:MS m/z 310(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ10.65(s,1H),8.18(d,J＝7.5Hz,1H),8.06(d,J＝16.2Hz,1H),7.77(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(d,J＝8.8Hz,2H),7.56(d,J＝16.3Hz,1H),6.74(d,J＝8.9Hz,2H),3.05(s,6H).
Figure BDA0004009083680000132
化合物D-2的制备
将纯品化合物8(71mg)和纯品化合物16(27mg)溶于无水DCM(10mL)中，加入t-BuOK(24mg)，室温搅拌反应2-4h。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法(DCM)纯化，得到黑色固体D-2和黑色固体18。
化合物D-2:MS m/z 336(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ10.66(s,1H),8.15(d,J＝7.5Hz,1H),8.04(dd,J＝15.4,10.1Hz,1H),7.68(d,J＝7.5Hz,1H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.16(d,J＝15.5Hz,1H),6.94(dd,J＝15.4,10.1Hz,1H),6.89(d,J＝15.3Hz,1H),6.69(d,J＝8.4Hz,2H),3.02(s,6H).
Figure BDA0004009083680000141
化合物D-3的制备
将纯品化合物9(55mg)和纯品化合物16(150mg)溶于无水DCM(10mL)中，加入t-BuOK(48mg)，室温搅拌反应2-4h。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法(DCM)纯化，得到黑色固体D-3和黑色固体19。
化合物D-2:MS m/z 362(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ10.66(s,1H),8.16(d,J＝7.4Hz,1H),7.93(dd,J＝15.4,11.2Hz,1H),7.68(d,J＝7.4Hz,1H),7.36(d,J＝7.4Hz,2H),7.13(d,J＝15.4Hz,1H),6.82-6.76(m,2H),6.69-6.66(m,3H),6.58(dd,J＝11.4,11.4Hz,1H),3.00(s,6H).
Figure BDA0004009083680000142
实施例6：化合物E-1、E-2、E-3的制备
化合物E-1的制备
将纯品化合物D-1(14mg)和丙二腈(5mg)溶于无水EtOH(5mL)中，加入醋酸铵(0.39mg)，室温搅拌反应。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法(PE:EA)纯化，得到黑色固体E-1。
化合物E-1:MS m/z 384(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.77(s,1H),8.73(d,J＝7.9Hz,1H),8.15(d,J＝16.1Hz,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.60(d,J＝8.8Hz,2H),7.53(d,J＝16.1Hz,1H),6.74(d,J＝8.8Hz,2H),3.07(s,6H).
Figure BDA0004009083680000151
化合物E-2的制备
将纯品化合物D-2(21mg)和丙二腈(7mg)溶于无水EtOH(5mL)中，加入醋酸铵(0.46mg)，室温搅拌反应。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法(PE:EA)纯化，得到黑色固体E-2。
化合物E-2:MS m/z 358(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.77(s,1H),8.73(d,J＝7.9Hz,1H),8.15(d,J＝16.1Hz,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.60(d,J＝8.8Hz,2H),7.53(d,J＝16.1Hz,1H),6.74(d,J＝8.8Hz,2H),3.07(s,6H).1H),7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.16(d,J＝15.5Hz,1H),6.94(dd,J＝15.4,10.1Hz,1H),6.89(d,J＝15.3Hz,1H),6.69(d,J＝8.4Hz,2H),3.02(s,6H).
Figure BDA0004009083680000152
化合物E-3的制备
将纯品化合物D-3(16mg)和丙二腈(5mg)溶于无水EtOH(5mL)中，加入醋酸铵(0.34mg)，室温搅拌反应。反应完成后，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析法(DCM)纯化，得到黑色固体E-3。
化合物E-3:MS m/z 410(M+1)；1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.76(s,1H),8.70(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(dd,J＝15.3,11.2Hz,1H),7.66(d,J＝7.9Hz,1H),7.36(d,J＝8.8Hz,2H),7.10(d,J＝15.3Hz,1H),6.84-6.76(m,2H),6.72(d,J＝11.9Hz,1H),6.68(d,J＝8.9Hz,2H),6.60(dd,J＝13.3,11.6Hz,1H),3.01(s,6H).
Figure BDA0004009083680000161
实施例7：荧光探针的光学性质评价。
荧光光谱性质评价：
将实施例制备的探针化合物配制成浓度为2mM的母液；将母液用不同溶剂如二氯甲烷、四氢呋喃、DMSO、甲醇和PBS溶液稀释后，用RF-4600荧光分光光度仪(日本，Hitachi公司)记录实施例所述的探针化合物的激发波长和发射波长，记录结果如表1所示。
表1.荧光探针荧光光谱数据
Figure BDA0004009083680000162
Figure BDA0004009083680000171
其中：
λem表示探针的最大发射波长；
λex表示探针的最大吸收波长；
n.d.表示难以观察到(荧光性质较弱)。
表1表明，化合物A-2、A-3、B-2、B-3、C-2、C-3、D-2等，发射波长大于650nm，处于近红外区，具有良好的近红外荧光特性。
实施例8：荧光探针的生物活性评价
1.荧光探针与Aβ1-42聚集体的体外结合实验
将购买的Aβ1-42TFA单体(购买于吉尔生化有限公司)溶于1mL 1％氨水中，分装于10个样品瓶后取一瓶加PBS(pH＝7.4,1mM)使其浓度为100μM，后放入摇床中于37℃，100rpm/min孵育7天。
按照实施例制备的荧光探针分子激发与发射光谱的测定中描述的方法配制探针的PBS溶液，加入孵育得到的Aβ1-42聚集体，使探针最终浓度为1μM，Aβ1-42聚集体最终浓度为5μM。室温下孵育10min后使用荧光分光光度计记录测量其激发光谱和发射光谱。
荧光探针与Aβ1-42聚集体孵育前后的荧光光谱图如图1所示。图1表明，化合物A-3、B-2、B-3、C-2、C-3等，与Aβ1-42聚集体结合后出现“turn on”现象，荧光强度明显增加，是一类比较理想的探针。
2.探针与BSA的体外结合实验
按照实施例制备的荧光探针分子激发与发射光谱的测定中描述的方法配制探针的PBS溶液，记录其荧光强度；分别向含有荧光探针(最终浓度均为1μM)的PBS缓冲液中加入BSA(最终浓度均为23μg/mL)，室温下孵育10min后使用荧光分光光度计记录测量其荧光强度。
荧光探针与BSA孵育前后的荧光光谱图如图2所示，图2表明，探针A-3、B-3、C-3等，与BSA孵育后的荧光强度变化很弱，可以在一定程度上避免BSA的干扰。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种近红外型荧光探针，其特征是，其化学结构如式(I)所示，
Figure FDA0004009083670000011
其中，n＝0～2；
R1为C1-C5烷基或C1-C5羟烷基；R2为C1-C5烷基或C1-C5羟烷基；
W为噻吩环、呋喃环、苯环、萘环或喹啉环；
R3为
Figure FDA0004009083670000012
2.如权利要求1所述的近红外型荧光探针，其特征是，包括如下所示化合物，
Figure FDA0004009083670000013
3.一种权利要求1或2所述的近红外型荧光探针的制备方法，其特征是，包括按如下反应式将式(II)所示的化合物溶于质子性溶剂中后，在碱的催化下与式(Ⅲ)所示的化合物发生Knoevenagel反应制得式(I)所示的化合物的过程，
Figure FDA0004009083670000021
R3为
Figure FDA0004009083670000022
或者，包括按如下反应式将式(X)所示的化合物和式(VII)所示的化合物在碱性条件下通过wittig反应制得式(I)所示的化合物；
Figure FDA0004009083670000023
R3为
Figure FDA0004009083670000024
或者，包括按如下反应式将式(VIII)所示的化合物与丙二腈在碱性条件下通过wittig反应制得式(I)所示的化合物；
Figure FDA0004009083670000025
R3为
Figure FDA0004009083670000026
4.如权利要求3所述的近红外型荧光探针的制备方法，其特征是，式(II)所示的化合物的制备方法为：将式(IV)所示的化合物与(1,3-二氧戊环-2-基)甲基三苯基溴化膦在非质子性溶剂中，在碱和相转移催化剂的作用下进行wittig反应，再脱去缩醛获得；
或者，包括上述过程，并将脱去缩醛后的产物作为原料代替式(IV)所示的化合物重复上述过程；
Figure FDA0004009083670000031
5.如权利要求3所述的近红外型荧光探针的制备方法，其特征是，当R1或R2为C1-C5羟烷基时，在wittig反应过程中采用3,4-二氢吡喃对羟基进行保护；优选地，方法为：将式(II)所示的化合物用无水二氯甲烷溶解，加入3,4-二氢吡喃和对甲苯磺酸吡啶鎓盐，室温反应24～48h。
6.一种组合物，其特征是，包括权利要求1或2所述的近红外型荧光探针及其药学上可接受的盐。
7.一种制剂，其特征是，包括权利要求1或2所述的近红外型荧光探针或其药学上可接受的盐或组合物和药学上可接受的载体。
8.一种权利要求1或2所述的近红外型荧光探针、权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的制剂在制备检测β淀粉样蛋白聚集体试剂中的应用。
9.一种权利要求1或2所述的近红外型荧光探针、权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的制剂在制备阿尔兹海默症早期诊断试剂中的应用。
10.一种阿尔兹海默症早期诊断试剂盒，其特征是，包括权利要求1或2所述的近红外型荧光探针和溶剂。
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