BR112013022170B1

BR112013022170B1 - Composições de vesícula

Info

Publication number: BR112013022170B1
Application number: BR112013022170-4A
Authority: BR
Inventors: Eric Tanifum; Mayank Srivastava; Mostafa Analoui; Ananth Annapragada; Indrani Dasgupta
Original assignee: Sensulin, Llc; Board Of Regents Of The University Of Texas System
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2022-05-24
Also published as: US9278068B2; EP2680822A1; JP5998158B2; US20140227349A1; EP2680822A4; CA2822021A1; ES2913069T3; US8679531B2; KR20140074860A; CN107029245A; MX345504B; CA2822021C; AU2012223210A1; MX2013004146A; US20120231067A1; KR101845281B1; EP2680822B1; WO2012119117A1; CN103429226A; BR112013022170A2

Abstract

COMPOSIÇÕES DE VESÍCULA. A presente invenção refere-se a composições de vesícula, compreendendo um composto terapêutico. As composições de vesícula podem ser capazes de liberar o composto terapêutico em resposta à presença de um desencadeador externo. As composições de vesícula podem compreender uma série de vesículas biocompatíveis. As vesículas biocompatíveis podem compreender um composto terapêutico para o tratamento de um paciente que dele necessite, e uma ou mais reticulações entre duas ou mais vesículas biocompatíveis, cada reticulação compreendendo uma porção de sensibilização química e uma porção sensibilizada. Em uma modalidade, o composto terapêutico pode ser qualquer composto que proporcione efeitos benéficos paliativos, curativos ou outros efeitos a um paciente.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente U.S Provisório N° 61/448.556, depositado em 2 de Março de 2011, o qual está ora incorporado por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL OU DESENVOLVIMENTO

[002] Esta invenção foi elaborada com o apoio do Governo sob R43 DK083819 concedido pelo National Institute of Health. O Governo possui alguns direitos nesta invenção.

ANTECEDENTES

[003] O diabetes é uma doença ocasionada por uma deficiência de insulina ou a uma resistência à insulina no corpo. Diabetes tipo I é uma doença autoimune que danifica as células beta das ilhotas de Langerhans no pâncreas, resultando em uma quantidade inadequada de insulina no corpo. Sem tratamentos de insulina, o diabetes tipo I é fatal. Diabetes do tipo II, resulta de uma produção insuficiente de insulina ou uma incapacidade do corpo do paciente em responder adequadamente à insulina. A resistência à insulina associada ao diabetes Tipo II impede que os níveis adequados de açúcar no sangue ingressem nas células para serem armazenados em forma de energia, o que resulta em hiperglicemia na corrente sanguínea. Tradicionalmente, o diabetes do Tipo I é tratado por injeções subcutâneas repetidas de insulina, diariamente. O diabetes Tipo II também é tratado com insulina, muitas vezes em combinação com outros medicamentos tomados por via oral ou por injeção. Múltiplas injeções de insulina por dia são necessárias, bem como a monitoração cuidadosa dos níveis de glicose no sangue do paciente através do controle da dieta e exames de sangue. As bombas de insulina são utilizadas como uma alternativa para múltiplas injeções diárias de insulina com uma seringa. No entanto, as bombas de insulina são caras, devendo ser usadas a maior parte do tempo, e necessitam de testes de sangue para se determinar a quantidade de insulina a ser liberada ao paciente. Testes de sangue requerem que o paciente tire uma amostra de sangue, normalmente de um dedo, para testar a amostra de sangue determinando a concentração de glicose. Sistemas de monitoração de glicose no sangue estão disponíveis, os quais usam um sensor colocado sob a pele para monitorar periodicamente, a quantidade de glicose no fluido intersticial. Estes sistemas requerem calibração, geralmente resultando em duas picadas no dedo por dia, e são dispendiosos. Além disso, existe um intervalo de tempo entre a concentração de glicose na corrente sanguínea e a concentração de glicose no fluido intersticial.

[004] Há uma necessidade quanto a um sistema ou dispositivo que forneça quantidades controladas de insulina diretamente, em resposta ao aumento da concentração de glicose, sem exigir que o paciente ou profissional médico monitore continuamente o nível de glicose no sangue, determine a quantidade apropriada de insulina a ser injetada, e injete insulina periodicamente ao longo do dia.

SUMÁRIO

[005] As composições de vesícula são fornecidas compreendendo um composto terapêutico. As composições de vesícula podem ser capazes de liberar o composto terapêutico, em resposta à presença de um disparo externo. As composições de vesícula podem compreender uma série de vesículas biocompatíveis. As vesículas biocompatíveis podem compreender um composto terapêutico para o tratamento de um paciente em necessidade do mesmo, e uma ou mais ligações cruzadas entre duas ou mais das vesículas biocompatíveis, cada ligação transversal compreendendo uma porção de sensibilização química e uma porção sensibilizada. Em algumas modalidades, o composto terapêutico pode ser qualquer composto que forneça um paliativo, um curativo, ou de outro modo os efeitos benéficos para uma patente. As composições de vesícula podem ser adequadas para injeção ao paciente.

[006] As composições de vesícula também são fornecidas compreendendo uma série de vesículas biocompatíveis, as vesículas bio- compatíveis compreendendo um composto terapêutico para o tratamento de um paciente em necessidade do mesmo, e uma ou mais ligações cruzadas entre duas ou mais das vesículas biocompatíveis, cada ligação cruzada compreendendo uma porção de ácido borônico ou uma porção de radical derivado de ácido borônico e uma porção de açúcar.

[007] Além disso, são fornecidos métodos para administração de um composto terapêutico a um paciente com necessidade do mesmo. Estes métodos podem compreender injetar uma composição de vesícula parenteralmente a um paciente que necessite de tratamento, a composição de vesícula compreendendo um composto terapêutico, e liberação do composto terapêutico ao paciente, em resposta a um evento desencadeante.

[008] Também são fornecidos métodos para o tratamento de uma condição médica, os métodos compreendendo a administração de uma composição de vesícula a um paciente com necessidade de tratamento, em que a composição de vesícula é introduzida com um composto terapêutico para o tratamento de um paciente que dele necessite, e liberando o composto terapêutico ao paciente, em resposta a um evento desencadeante.

[009] A descrição geral e a descrição detalhada seguinte são apenas exemplificativas e explicativas, não tendo intenção de restringir a invenção, tal como descrito nas reivindicações. Outras modalidades serão evidentes para os peritos na técnica, tendo em conta a descrição detalhada aqui fornecida.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[010] Nas figuras anexas, as fórmulas químicas, as estruturas químicas e os dados experimentais são dados os quais, juntamente com a descrição pormenorizada apresentada abaixo, descrevem exemplos de modalidades da invenção reivindicada.

[011] A figura 1 ilustra uma modalidade de uma composição de vesícula.

[012] A figura 2 ilustra uma modalidade de uma composição de vesícula.

[013] A Figura 3 ilustra uma modalidade de uma composição de vesícula.

[014] A Figura 4 mostra imagens representativas de células He-La, mostrando o efeito do tratamento com um derivado de ácido borô- nico na localização nuclear ou citoplasmática de NF-KB.

[015] A Figura 5A mostra o coeficiente de correlação de Pearson (PCC) entre as porções nuclear e citoplasmática da molécula NF-kB em células HeLa tratadas com ácido 4-aminocarbonilfenilborônico livre (barra escura), assim como cada um dos derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um controle não tratado (UTC) e lipopolissacarídeo (LPS).

[016] A Figura 5B mostra o coeficiente de correlação de Pearson (PCC) entre as porções nuclear e citoplasmática da molécula NF-kB em células HeLa tratadas com ácido 3-aminofenilborônico (barra escura), assim como cada um de os derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um controle não tratado (UTC) e lipopolissacarídeo (LPS).

[017] A Figura 5C demonstra o coeficiente de correlação de Pearson (PCC) entre as porções nuclear e citoplasmática da molécula NF-kB em células HeLa tratadas com ácido 5-amina-2,4- difluorfenilborônico livre (barra escura), bem como cada um destes de- rivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um controle não tratado (UTC) e lipopolissacarídeo (LPS).

[018] A Figura 5D mostra o coeficiente de correlação de Pearson (PCC) entre as porções nuclear e citoplasmática da molécula NF-kB em células HeLa tratadas com ácido 3-flúor-4-aminometilfenilborônico livre (barra escura), bem como cada um destes derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um controle não tratado (UTC) e lipopolissacarídeo (LPS).

[019] A Figura 5E mostra o coeficiente de correlação de Pearson (PCC) entre as porções nuclear e citoplasmática da molécula NF-kB em células HeLa tratadas com livre (barra escura) e ácido 4- aminopirimidinaborônico, bem como cada um dos derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um controle não tratado (UTC) e lipopolissacarídeo (LPS).

[020] A Figura 6A demonstra as porções remanescentes de célu las HeLa tratadas com ácido 4-aminocarbonilfenilborônico livre (barra escura), bem como cada um destes derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um UTC e LPS.

[021] A Figura 6B mostra as porções sobreviventes de células HeLa tratadas com ácido 3-aminofenilborônico livre (barra escura), bem como cada um destes derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um UTC e LPS.

[022] A Figura 6C demonstra as porções remanescentes de célu las HeLa tratadas com ácido 5-amina-2,4-difluorfenilborônico livre (barra escura) assim como cada um destes derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um UTC e LPS.

[023] A Figura 6D demonstra as porções remanescentes de célu las HeLa tratadas com ácido 3-flúor-4-aminometilfenilborônico livre (barra escura), bem como cada um destes derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com uma UTC e LPS.

[024] A Figura 6E demonstra as porções remanescentes de células HeLa tratadas com ácido 4-aminopirimidinaborônico livre (barra escura), bem como cada um destes derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um UTC e LPS.

[025] A Figura 7 mostra um gráfico representativo para o cálculo constante de ligação para ácido 4-aminocarbonilfenilborônico.

[026] A Figura 8 mostra a estrutura, afinidade de ligação da glico se, percentagem de sobrevivência de células HeLa a 80 nM, e o CCP entre as porções nucleares e citoplasmáticos da molécula NF-kB em células HeLa de 80 nM, de vários derivados de ácido borônico.

[027] A Figura 9 ilustra gráficos de liberação cumulativa para quatro ácidos bóricos representativos - composições de vesícula de açúcar.

[028] A Figura 10A ilustra gráficos cumulativos de liberação de insulina de ácido 4-aminocarbonilfenilborônico - composições de vesículas de açúcar desencadeadas com 5 mM, 7 mM, e 10 mM de glicose, em comparação com o desencadeamento com 5 mM, 7 mM, 10 mM de PBS.

[029] A Figura 10B ilustra gráficos diferenciais para a liberação de insulina de ácido 4-aminocarbonilfenilborônico - composições de vesículas de açúcar desencadeadas com 5 mM, 7 mM, e 10 mM de glicose, em comparação com o desencadeamento com 5 mM, 7 mM e 10 mM de PBS.

[030] A Figura 11A ilustra gráficos cumulativos para a liberação de insulina de ácido 4-aminocarbonilfenilborônico - composições de vesícula de açúcar (ácido "4-aminocarbonilfenilborônico AVT") e composições de vesícula de concanavalina A ("ConA-AVT") desencadeados com 10 mM, 30 mM e 40mM de glicose.

[031] A Figura 11B ilustra gráficos diferenciais para a liberação de insulina de ácido 4 - aminocarbonilfenilborônico - composições de vesícula de açúcar (ácido "4-aminocarbonilfenilborônico AVT") e composições de vesícula de Concanavalina A ("ConA-AVT") desencadeados com 10 mM, 30 mM, e 40 mM de glicose.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[032] A presente invenção pode ser mais facilmente compreendida fazendo-se referência à seguinte descrição detalhada com ligação às figuras e exemplos anexos, que formam uma parte desta descrição. Esta invenção não está limitada aos dispositivos específicos, os métodos, as aplicações, condições, ou parâmetros descritos e/ou aqui apresentados. A terminologia aqui utilizada destina-se a descrever concretizações particulares por meio de exemplo apenas, não se destinando a ser limitativa. Como utilizado na especificação e nas reivindicações, as formas singulares "um", "uma", e "o" incluem as formas no plural. O termo "pluralidade", no entanto, significa mais do que um. A referência a um determinado valor numérico inclui, pelo menos, aquele valor em particular, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Quando um intervalo de valores é expresso, uma outra modalidade inclui daquele valor em particular e/ou para o outro valor em particular. O valor particular forma modalidades diferentes. Sempre que o termo "cerca de" é usado em conjunção com um número, pretende-se incluir + ou - 10% do nú-mero. Por exemplo, "cerca de 10" pode significar 9 a11.

[033] Na medida em que o termo "inclui" ou "incluindo" é usado no relatório descritivo ou nas reivindicações, pretende-se ser inclusivo de maneira semelhante ao termo "compreendendo" como o termo é interpretado quando empregado como uma palavra de transição em uma reivindicação. Além disso, na medida em que o termo "ou" é utilizado (por exemplo, A ou B) pretende-se dizer com "A ou B, ou ambos." Quando os requerentes pretendem indicar "apenas A ou B, porém não ambos, então o termo "apenas A ou B porém não ambos" será empre-gado. Assim, o uso do termo "ou" no presente é de emprego inclusivo, e não exclusivo.

[034] Algumas características da invenção que são, por motive de clareza, aqui descritas no contexto de concretizações separadas, podem igualmente ser fornecidas em conjunto em uma única modalidade. Inversamente, várias características da invenção que são, simplesmente descritas no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer combinação subjacente.

[035] A presente invenção pode ser mais facilmente entendida por referência aos às Figuras 1, 2 e 3. Na Figura 1, é mostrada uma representação esquemática de uma modalidade de uma composição de vesícula 1. Como mostrado na Figura 1, uma composição de vesícula 1 compreende uma série de vesículas biocompatíveis 2. Em uma modalidade, a série de vesículas biocompatíveis 2 poderá ser, por exemplo, não tóxica e biodegradável. Como mostrado na Figura 1, uma composição de vesícula 1 compreende ainda uma ou mais porções de sensibilização de produtos químicos 3. Em uma modalidade, a uma ou mais porções de sensibilização de químicos 3 podem ser, por exemplo, um ou mais grupos químicos que são capazes de ligação reversível, com uma porção conjugada. Como mostrado na Figura 1, uma composição de vesícula 1 compreende ainda uma ou mais porções de sensibilização 4. Em uma modalidade, a uma ou mais porções de sensibilização 4 pode(m) ser, por exemplo, porções químicas capazes de ligação reversível com uma porção de sensibilização química, por exemplo, 3. Como aqui empregado, a frase "porção sensibilizada" pode abranger tanto porções sensibilizadas de ligação ligadas a uma vesícula biocompatível (como mostrado na Figura 1), e porções de e detecção livres que são porções sensibilizadas não ligadas a uma vesícula biocompatível, mas que estão presentes no meio fisiológico (isto é, o meio dentro do corpo de um paciente). Voltando à Figura 1, uma primeira vesícula biocompatível 2 está presa a uma porção de sensibilização química 3, enquanto que uma segunda vesícula biocompatível 2 está presa a uma porção sensibilizada 4. A porção de sensibilização química 3 e a porção sensibilizada 4, quando ligadas em conjunto, formam uma forma de reticulação 5.

[036] A Figura 2 ilustra uma outra modalidade de uma composição de vesícula 1. Uma primeira vesícula biocompatível 2 está ligada a um ligante de polímero 6, e o ligante de polímero 6 está ligado a uma porção 3 de sensibilização química. Uma segunda vesícula biocompa- tível 2 está ligada a uma porção 4 sensibilizada. A porção de sensibilização 3 e a porção sensibilizada 4, quando ligadas em conjunto, formam a reticulação 5.

[037] A Figura 3 ilustra ainda uma outra modalidade de uma composição de vesícula 1. Uma vesícula biocompatível 2 está ligada a um primeiro ligante de polímero 6, e o primeiro polímero ligante 6 está ligado a uma primeira porção de sensibilização química 3. Uma segunda vesícula biocompatível 2 está ligada a um segundo ligante de polímero 6, e o segundo polímero ligante 6 está ligada a uma segunda porção de sensibilização 3 química. Duas porções 4 sensibilizadas estão ligadas umas às outras e cada porção de sensibilização química 3 está ligada a uma porção sensibilizada 4. As porções de sensibilização químicas 3 e as porções sensibilizadas 4, quanto unidas juntas, formam uma reticulação 5.

[038] Uma vesícula biocompatível pode ser qualquer particular biocompatível capaz de transportar um composto terapêutico. A vesícula biocompatível pode ter aproximadamente, a forma esférica, com uma porção interna. O composto terapêutico pode ser transportado na parte interior da vesícula, na parede da vesícula, ligado à superfície exterior da vesícula, ou por quaisquer outros meios adequados. A vesícula biocompatível pode compreender polímeros biocompatíveis, lipídios, proteínas, carboidratos, outras macromoléculas, águas e sais, ou qualquer combinação destes. Por exemplo, a vesícula biocompatí- vel pode compreender um lipossoma constituído por uma série de lipídios. Os lipídios podem compreender lipídios saturados. Em uma modalidade, a vesícula biocompatível pode ser constituída por diestearoil- fosfatidiletanolamina (DSPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), ou qualquer combinação dos mesmos. A vesícula biocompatível pode ter uma vida útil suficiente para ser adequada como um sistema de liberação de um composto terapêutico. Em uma modalidade, a vesícula bio- compatível pode ter uma estabilidade de vida útil de pelo menos seis meses a cerca de 2°C a cerca de 8°C, ou de uma estabilidade de vida útil de pelo menos sete dias a temperatura ambiente.

[039] As composições de vesículas adequadas podem incluir um composto terapêutico. Em uma modalidade, o composto terapêutico pode ser colocado dentro ou sobre as vesículas biocompatíveis. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode ser capaz de liberar o composto terapêutico para o meio fisiológico de um paciente. O meio fisiológico do paciente é normalmente a corrente sanguínea, mas pode ser qualquer meio dentro do corpo do paciente no qual a composição de vesícula é fornecida. Em uma modalidade, o composto terapêutico irá ser liberado a partir da composição de vesícula, em resposta à pre- sença de uma porção livre sensibilizada no meio fisiológico. Em uma modalidade, a porção livre sensibilizada no meio fisiológico que desencadeia a liberação do composto terapêutico é sintomática da condição a ser tratada pelo composto terapêutico. Em formulações em que a vesícula é adequada para injeção em um paciente, a percentagem em peso do composto terapêutico com base no peso total da composição de vesícula pode ficar na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 30%, ou desde cerca de 0,2% a cerca de 20%, ou desde cerca de 1% a cerca de 10%. O composto terapêutico pode ser qualquer composto administrado a um paciente para fornecer efeitos paliativos, curativos, ou outros efeitos benéficos. Exemplos de compostos terapêuticos podem incluir insulina e ciprofloxacina. Em algumas modalidades em que o composto terapêutico é a insulina, a insulina pode estar presente em uma concentração na faixa de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml, ou desde cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 5 mg/ml, ou desde cerca 1 mg/mL a 3 mg/mL, como por exemplo, 2 mg/ml.

[040] Em algumas modalidades, a quantidade de composto terapêutico liberado está relacionada com a quantidade de porção sensibilizada presente no meio fisiológico do paciente. Por exemplo, a quantidade de composto terapêutico liberado e a quantidade da porção sensibilizada no meio pode ser linearmente proporcional, ou pode estar relacionada com uma função não linear. Por conseguinte, um aumento na concentração da porção livre sensibilizada no meio fisiológico pode desencadear um aumento na quantidade de composto terapêutico liberado a partir da composição de vesícula. Por exemplo, a composição de vesícula pode liberar o composto terapêutico insulina, em resposta à presença de porções livres sensibilizadas tratando-se de açúcares no meio fisiológico. Quando a concentração de porções sensibi-lizadas livres de açúcar aumenta, a concentração de insulina liberada pode também aumentar. Exemplos de açúcares podem incluir glicose, galactose, maltose, lactose, frutose, sacarose, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, a liberação de insulina pode ser desencadeada pela presença de glicose no meio fisiológico. Em concretizações alternativas, os açúcares podem ser utilizados para desencadear a liberação de outros compostos terapêuticos que não a insulina.

[041] Em algumas modalidades, a porção de sensibilização quí mica pode ser ligada diretamente à vesícula biocompatível. Uma porção ligante pode ser posicionada entre a porção química de sensibilização e a vesícula biocompatível. Em concretizações em que a vesícula biocompatível é um lipossoma, a porção ligante pode ser presa a um lipídio, que é parte do lipossoma. A porção ligante pode ser uma porção de polímero biodegradável, tal como, por exemplo, polietileno glicol (PEG). A porção ligante pode proporcionar flexibilidade entre a vesícula biocompatível e a porção de sensibilização química. Uma forma de caracterizar a flexibilidade da porção ligante é a densidade de ligações insaturadas, em cada unidade de repetição da porção de polímero. Em uma modalidade, cada unidade de repetição do polímero compreendendo a porção ligante pode conter pelo menos uma ligação insaturada. Outra forma de caracterizar a flexibilidade da porção ligan- te é pelo seu comprimento. Quando a porção ligante é o PEG, cada porção PEG independentemente pode ter um peso molecular na faixa de cerca de 100 a cerca de 10.000 Da, tal como, por exemplo, na faixa de cerca de 500 até cerca de 5000 Da. Em uma modalidade, a porção ligante de PEG compreende cerca de 10-100 unidades de repetição de etilenoglicol. Em uma outra modalidade, a porção ligante de PEG compreende cerca de 30-60 unidades de repetição de etilenoglicol.

[042] A porção sensibilizada pode ser capaz de ser conectada,por exemplo, por uma ligação covalente, a uma porção de sensibilização química. A porção sensibilizada pode ser uma porção sensibilizada ligada a uma vesícula biocompatível, que, juntamente com uma porção de sensibilização química, forma uma ligação cruzada na composição de vesícula. Alternativamente, a porção sensibilizada pode ser uma porção livre sensibilizada, que compete com porções ligadas sensibilizadas para ligação com uma porção de sensibilização química. Em uma modalidade, a porção livre sensibilizada no meio fisiológico pode se prestar como um disparo para liberar o composto terapêutico por ligação competitiva com uma porção de sensibilização, e assim, clivar as reticulações entre as vesículas biocompatíveis.

[043] A porção sensibilizada pode estar relacionada com a doença ou condição a ser tratada pelo composto terapêutico. Por exemplo, em algumas modalidades em que a condição a ser tratada pelo composto terapêutico é a diabetes ou outro distúrbio metabólico, que resulta em hiperglicemia, a porção livre sensibilizada que desencadeia a liberação do composto terapêutico é um açúcar. Exemplos de açúcares podem incluir glicose, galactose, maltose, lactose, frutose, sacarose, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, o açúcar é a glicose. Em concretizações em que a condição a ser tratada é diabetes ou outro distúrbio metabólico, tendo como resultado a hiperglice- mia e a porção livre sensibilizada é um açúcar, o composto terapêutico pode ser insulina. Em algumas modalidades em que a condição a ser tratada é inflamação, o composto químico que desencadeia a liberação do composto terapêutico pode ser óxido nítrico. Em algumas concretizações, beta amilóide 42 pode desencadear a liberação de um composto terapêutico para o tratamento potencial de formação de placa. Em outras modalidades, a albumina, fosfatase alcalina, alanina transaminase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), nitrogênio uréia no sangue (BUN), cloreto de cálcio, dióxido de carbono, creatini- na, bilirrubina direta, gama-glutamil transpeptidase (Gamma-GT) glicose, lactato desidrogenase (LDII), fósforo, potássio, sódio, bilirrubina total, colesterol total, proteína total, ácido úrico, ou qualquer combina- ção dos mesmos, podem agir como uma porção livre sensibilizada.

[044] A porção química de sensibilização e a porção sensibilizada são grupos químicos que podem ser capazes de ligação química reversível uns aos outros. A ligação pode ser uma ligação química, tal como uma ligação covalente. A ligação covalente entre a porção química de sensibilização e a parte sensibilizada pode ser capaz de clivar na presença de porções livres de competição sensibilizadas no meio ambiente. Quando a composição de vesícula foi liberada a um paciente, a ligação covalente entre a porção química de sensibilização e a parte sensibilizada pode ser capaz de clivar na presença de porções livres sensibilizadas no meio fisiológico. Onde diferentes unidades de sensibilização químicas forem unidas a cada vesícula biocompatível, as ligações cruzadas formadas pelas diferentes unidades de sensores químicos e as porções de sensibilizadas podem ter diferentes resis-tências. O grau de clivagem de ligações cruzadas e da taxa de liberação do composto terapêutico pode depender do número de ligações cruzadas, fortes, fracas e moderadas presentes.

[045] As porções químicas adequadas de sensibilização podem incluir um ácido borônico ou um derivado de ácido borônico. Exemplos de derivados de ácido borônico podem incluir fenilboronatos, piridilboro- natos e cicloexilboronatos. Em uma modalidade, o derivado de ácido borônico pode ser ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenil-borônico, ácido 2,4- diclorofenilborônico, ácido 4-aminocarbonilfenilborônico, ácido 3-clorofe- nilborônico, ácido 4-hdroxifenilborônico, ácido 4-propilfenilborônico; ácido 3-[(E)-2-nitrovinil) fenilborônico; anidrido 4-clorocarbonilfenilborônico ácido ciclopenteno-1-il-borônico, ácido 2-bromopiridina-3-borônico, ácido 2,4-di-terc-butoxipirimidin-5-il-borônico, ácido 2,4-bis(benzilóxi)pirimidina- 5-borônico, ácido 5-fenil-2-tienilborônico, ácido 5-formiltiofeno-3-borônico, ou qualquer combinação destes.

[046] A porção sensibilizada pode ser um açúcar em modalida- des em que a detecção do radical químico é um ácido borônico ou um derivado de ácido borônico. Açúcares adequados podem incluir glicose, galactose, maltose, lactose, frutose, sacarose, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, a porção sensibilizada pode ser glicose, onde a detecção de radical químico é o ácido bórico ou um derivado de ácido borônico. Em algumas modalidades, cada vesícula biocompatível pode ter apenas um tipo de ácido borônico ou de derivado de ácido borônico a ela ligada. Em outras modalidades, cada vesícula biocompatível pode ter ou um tipo de ácido borônico ou um derivado de ácido borônico a ela ligada, ou mais do que um tipo de ácido borônico ligado à sua superfície. Sempre que diferentes derivados de ácido borônico são anexados a cada vesícula biocompatível, as liga-ções cruzadas formadas pelos diferentes derivados de ácido borônico podem ter diferentes resistências. O grau de clivagem das ligações cruzadas e da taxa de liberação do composto terapêutico pode depender do número de ligações cruzadas, fortes fracas e moderadas presentes.

[047] As vesículas biocompatíveis, porções químicas de sensibilização, porções sensibilizadas, e ligações cruzadas que formam a composição de vesícula podem ser dispostas em quaisquer modos diferentes. As vesículas biocompatíveis podem ter cada qual, várias porções unidas, sendo as porções de sensibilização porções químicas, porções sensibilizadas, ou ambas. Alternativamente, as vesículas bioquímicas podem cada qual, ter apenas uma porção ligada, ou uma porção de sensibilização química ou uma porção sensibilizada. Além disso, as vesículas biocompatíveis podem, cada qual, ter qualquer número de porções associadas com algumas vesículas biocompatíveis tendo uma porção anexada e outras vesículas biocompatíveis com mais do que uma porção anexada. Em algumas concretizações, as vesículas biocompatíveis podem ter ambas as porções químicas de sensibilização e porções sensibilizadas ligados à mesma vesícula bio- compatível. Em uma modalidade, as vesículas biocompatíveis possuem cada qual, apenas porções de sensibilização químicas ou apenas porções sensibilizadas unidas. Composições de vesícula adequadas também podem ser constituídas por apenas duas vesículas biocompa- tíveis. Composições de vesículas adequadas também pode compreender entre cerca de 10 e cerca de 108 vesículas biocompatíveis. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode compreender entre cerca de 102 e cerca de 107 vesículas biocompatíveis. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode compreender entre cerca de 103 e cerca de 107 vesículas biocompatíveis. As porções associadas às vesículas biocompatíveis podem ser dispostas em qualquer geometria que permita ligações cruzadas serem formadas e a clivagem entre as porções de sensibilização química e porções sensibilizadas. As porções de sensibilização químicas ou sensibilizadas podem ser dispostas na vesícula biocompatível em qualquer geometria. Em algumas modalidades, as porções serão igualmente espaçadas em torno da vesícula biocompatível. Em outras concretizações, as porções serão ligadas à vesícula biocompatível, de uma forma aleatória. Independentemente da geometria das partículas biocompatíveis, as porções ligadas, e as ligações cruzadas que elas formam, a composição de vesícula pode assumir uma geometria dobrada ou de outra forma aglomerada. Em algumas modalidades, a composição de vesícula pode ter um diâmetro na faixa de cerca de 0,1 micrômetros a cerca de 50 mi- crômetros. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode ter um diâmetro na faixa de cerca de 0,5 micrômetros a cerca de 30 mi- crômetros. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode ter um diâmetro na faixa de cerca de 1 micrômetro a cerca de 20 micrô- metros.

[048] A composição de vesícula pode ser adequada para injeção em um paciente. Um método para se medir a aptidão para a injeção consiste em testar o grau de inflamação causada por uma composição PEG-lipídica que compreende a porção de sensibilização química. Uma medida para o grau da inflamação é um ensaio NF-kβ de proteína. Em uma modalidade, a composição PEG-lípidica compreendendo a porção de sensibilização química testada usa um ensaio NF-kβ resultando em um PCC de menos do que cerca de 0,2. Em uma modalidade, quando a concentração da composição PEG-lípidica compreendendo a porção de sensibilização química fica na faixa de cerca de 40 nM a 160 nM, por exemplo, cerca de 80 nM, o PCC entre a porção nuclear e citoplasmática da molécula NFkβ é inferior a cerca de 0,2, por exemplo, menos do que cerca de 0,1. Em uma modalidade, a composição PEG-lípidica compreendendo a porção de sensibilização química pode ser capaz de causar menos inflamação do que a molécula simples da porção de sensibilização química, conforme medido por um ensaio NF-kβ de translocação.

[049] Um outro método para se medir a aptidão para a injeção da composição de vesícula é medir a toxicidade das células da porção de sensibilização química. A composição de vesícula é adequada para injeção, se a unidade de sensibilização química for caracterizada por dar origem a mais do que 82% de sobrevivência celular, de acordo com um ensaio de proliferação celular MTT. A porção de sensibilização química pode ser caracterizada por dar origem a mais que 82% de sobrevivência celular, como medido de acordo com um ensaio de proliferação celular MTT, quando a porção de sensibilização química for doseada a uma concentração na faixa de cerca de 40 nM a cerca de 160 nM.

[050] Em uma outra modalidade, é proporcionado um método para a administração de um composto terapêutico a um paciente que dele necessite, compreendendo o método a injeção de uma composição de vesícula parentericamente ao doente, a composição de vesícula, incluindo um composto terapêutico, e liberando o composto terapêutico para aquele paciente, em resposta a um evento desencadeante. A composição de vesícula pode ser constituída por um composto terapêutico, vesículas biocompatíveis, uma ou mais porções de sensibilização química, um ou mais porções sensibilizadas e ligações cruzadas entre as porções de sensibilização química e porções sensibilizadas. Em uma modalidade, o evento de disparo é sintomático da condição a ser tratada pelo composto terapêutico. Em uma modalidade, o evento desencadeador pode ser a presença da porção livre sensibilizada no meio fisiológico. Em algumas modalidades, um aumento na concentração de porção livre sensibilizada no meio fisiológico pode resultar na liberação de composto terapêutico.

[051] Em uma modalidade, o método pode compreender a administração de uma composição vesicular em que o sensor químico é um ácido borônico ou um derivado de ácido borônico, a porção sensibilizada é um açúcar, e o composto terapêutico é a insulina. Em uma modalidade, os derivados de ácido borônico podem incluir fenilboronatos, piridilboronatos e cicloexilboronatos. Em uma modalidade, o derivado de ácido borônico pode ser ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenilborônico, ácido 2,4-diclorofenilborônico, ácido 4-aminocarbonilfenilborônico ácido 3-clorofenilborônico, ácido 4-hidroxifenilborônico ácido 4- propilfenilborônico, ácido 3-[(E)-2-nitrovinil) fenilborônico; anidrido 4- clorocarbonilfenilborônico; ácido ciclopenten-1-il borônico, ácido 2- bromopiridina-3-borônico, ácido 2,4-di-terc-butoxipirimidin-5-il-borôni- co; ácido 2,4-bis(benzilóxi)pirimidina-5-borônico, ácido 5-fenil-2-tienil- borônico, ácido 5-formiltiofeno-3-borônico, ou qualquer combinação dos citados. Em concretizações em que a porção de sensibilização química é um ácido borônico ou um derivado de ácido borônico, a porção sensibilizada pode ser um açúcar. Exemplos de açúcares pode incluir glicose, galactose, maltose, lactose, frutose, sacarose, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, em que a porção de sensibilização química é o ácido bórico ou um derivado de ácido borô- nico, a porção sensibilizada é a glicose. Em algumas modalidades, cada vesícula biocompatível possui apenas um tipo de ácido borônico ou um derivado de ácido borônico a ela ligada. Em outras modalidades, cada vesícula biocompatível tem ou um tipo de ácido borônico ou um derivado de ácido borônico a ela ligada, ou mais do que um tipo de ácido borônico a ela ligada. Sempre que diferentes derivados de ácido borônico são ligados a cada vesícula biocompatível, as reticulações formadas pelos diferentes derivados de ácido borônico podem ter diferentes resistências. O grau de clivagem das reticulações e da taxa de liberação do composto terapêutico pode depender do número de reti- culações fortes fracas e moderadas presentes.

[052] Em uma modalidade, o evento de disparo pode ser a hiper-glicemia do paciente. Em algumas modalidades, um aumento na concentração de glicose no meio fisiológico no paciente, pode desencadear a liberação do composto terapêutico. Em outras modalidades, um aumento na concentração de açúcar no meio fisiológico no paciente pode provocar um aumento no composto terapêutico liberado a partir da composição de vesícula. Em ainda outras modalidades, a presença de açúcar no meio fisiológico pode desencadear a liberação do composto terapêutico, em uma quantidade proporcional àquela do açúcar. Em uma modalidade, o açúcar pode ser glicose, galactose, maltose, lactose, frutose, sacarose, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, o açúcar é a glicose. Em algumas modalidades, o evento desencadeante pode se dar, quando a concentração de açúcar no meio fisiológico do paciente é superior a cerca de 100 mg/dL.

[053] Em uma modalidade, a composição de vesícula pode ser administrada entre duas vezes ao dia a uma vez por semana, por um período indefinido de dias. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode ser administrada uma vez ao dia, durante um período indefinido de dias. Em algumas modalidades, a composição de vesícula pode ser ainda caracterizada como sendo constituída de vesículas aglomeradas.

[054] Em uma modalidade, é proporcionado um método para tratamento de uma condição médica, compreendendo o método a administração de uma composição de vesícula a um paciente com necessidade de tratamento, a composição de vesícula sendo introduzida com um composto terapêutico para o tratamento de um paciente que dele necessite, e liberação do composto terapêutico ao paciente, em resposta a um evento desencadeante. A composição de vesícula pode compreender vesículas biocompatíveis, uma ou mais porções de sensibilização química, uma ou mais porções sensibilizadas e ligações cruzadas entre porções de sensibilização e porções sensibilizadas. A composição de vesícula pode compreender um aglomerado de vesículas biocompatíveis. A composição de vesícula pode ser administrada por quaisquer meios adequados, incluindo, por exemplo, injeção. Alternativamente, a composição de vesícula pode ser administrada por meio de bomba ou por inalação. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode ser administrada entre duas vezes em um dia ou uma vez por semana, durante um período indefinido de dias. Em uma modalidade, a composição de vesícula pode ser administrada uma vez por dia, durante um período indefinido de dias.

[055] Os métodos aqui descritos podem incluir a administração de uma composição vesicular em que o sensor químico é um ácido borônico ou um derivado de ácido borônico, a porção sensibilizada é um açúcar, e o composto terapêutico é a insulina. Derivados de ácido borônico podem incluir fenilboronatos, piridilboronatos e cicloexilboro- natos. Em uma modalidade, o derivado de ácido borônico pode com- preender ácido 3-(N,N-dimetilamino) fenil-borônico, ácido 2,4- diclorofenilborônico, ácido 4-aminocarbonilfenilborônico, ácido 3- clorofenilborônico, ácido 4-hidroxifenilborônico ácido 4-pro- pilfenilborônico, ácido 3-[(E)-2-nitrovinil)fenilborônico; anidrido 4- clorocarbonilfenilborônico borônico, ácido ciclopenten-1-il-borônico, ácido 2 - bromopiridina-3-borônico, ácido 2,4-di-terc-butoxipirimidin-5- il-borônico, ácido 2,4 bis(benzilóxi) pirimidina-5-borônico, ácido 5-fenil- 2-tienilborônico, ácido 5-formiltiofeno-3-borônico, ou quaisquer combinações dos citados. Em concretizações em que a porção de sensibilização química é um ácido borônico ou um derivado de ácido borônico, a unidade sensibilizada pode compreender um açúcar. Exemplos de açúcares podem incluir glicose, galactose, maltose, lactose, frutose, sacarose, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade onde a porção de sensibilização química é o ácido bórico ou um derivado de ácido borônico, a unidade sensibilizada compreende glicose. Em algumas modalidades, cada vesícula biocompatível pode ter apenas um tipo de ácido bórico ou um derivado de ácido borônico a ela ligada. Em outras modalidades, cada vesícula biocompatível pode ter ou um tipo de ácido bórico ou um derivado de ácido borônico a ela ligada, ou mais do que um tipo de ácido borônico a ela ligada. Sempre que diferentes derivados de ácido borônico são anexados a cada vesícula biocompa- tível, as ligações cruzadas formadas pelos diferentes derivados de ácido borônico podem ter diferentes resistências. O grau de clivagem das ligações cruzadas e a taxa de liberação do composto terapêutico pode depender do número de ligações cruzadas presentes quer sejam, fortes fracas e moderadas.

[056] As composições de vesículas podem incluir ainda, um me canismo de direcionamento. O mecanismo de direcionamento pode ser qualquer método de direcionar a composição de vesícula para um destino específico no corpo do paciente. Em uma modalidade, o me- canismo de direcionamento pode ser um receptor celular, um anticorpo, um biomarcador, ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a composição de vesícula pode incluir um agente de contraste, um agente de diagnóstico, ou ambos.

[057] Um determinado número de condições clínicas pode ser tratado pelos métodos da invenção, incluindo os distúrbios metabólicos. Como exemplos de doenças metabólicas podem-se incluir qualquer condição médica relacionada com o metabolismo do corpo, especialmente da diabetes. Um composto terapêutico para o tratamento da diabetes (por exemplo, a insulina e suas variantes) é capaz de manter os níveis normoglicêmicos durante 24-72 horas. Um nível normoglicê- mico de açúcar no sangue é tipicamente de cerca de 126 mg / dL.

[058] Os métodos da invenção também podem ser utilizados para tratar a infecção pulmonar. Quando os métodos da invenção são o tratamento da infecção pulmonar, o composto terapêutico pode ser um antibiótico. O antibiótico pode ser qualquer antibiótico adequado para tratar a infecção pulmonar. Em concretizações onde a condição médica a ser tratada é uma infecção pulmonar, o composto terapêutico pode ser, por exemplo, a ciprofloxacina.

EXEMPLOS Exemplo 1. Ensaio NF-kB para inflamação.

[059] O potencial inflamatório de vários compostos de ácido borônico foi estudado através da medição da translocação nuclear de NF-kB, em células HeLa por imunocitoquímica e microscopia de alto contato e alto rendimento. 15.000 células HeLa foram cultivadas em placas de 96 poços na noite anterior aos experimentos. No dia das experiências, as células foram tratadas com os ácidos borônicos (Tabela 1, abaixo), em três concentrações diferentes (40 nM, 80 nM e 1 60 nM) durante 2 h. No final da incubação, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e foram fixadas em parafor- maldeído a 4% durante 15 min e permeabilizadas com 0,01% de Triton X-100 em PBS durante 10 min. As células foram lavadas três vezes com PBS. O sítios não específicos foram bloqueados com 5% de soro de albumina bovina (BSA) em PBS e incubadas com o anti-NF-kB durante 1h, seguido de incubação com anticorpo secundário marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Após lavagem das células no final da incubação, as células foram tratadas com 4 ',6-diamidina-2-fenilindol (DAPI), durante 1 min, e mantidas a 4°C até análise posterior. Imagens das células foram adquiridas com um microscópio de alto débito automático Beckman-Coulter 100 e analisados utilizando o software Cytseer (Sciences Vala, CA). A co-localização de NF-kB foi quantificada pela medição da PCC entre a porção nuclear e citoplasmática da molécula NF-kB. O PCC é uma medida da sobreposição entre as intensidades de pixel das imagens nucleares e NF-kB da mesma célula. Os valores PCC podem variar de -1 a 1. Uma correlação positiva (valor PCC) indica translocação nuclear de NF-kB. Uma correlação negativa (valor PCC negativo) indica uma ausência de translocação nuclear.

[060] A Figura 4 mostra imagens representativas de células HeLa que ilustram o efeito do tratamento com ácido borônico na localização nuclear ou citoplasmática de NF-kB. DAPI é apresentado por círculos brancos, ao passo que o NF-kB é representado pela cinza claro. Círculos brancos cercados por cinza claro indicam NF-kB citoplasmático enquanto a obliteração dos círculos brancos pelo sinal cinza no núcleo indica NF-kB nuclear. (A) UTC, citoplasmático NF-kB; (B) controle positivo, translocação nuclear de NF-kB em células tratadas com LPS; (C) Tratamento com ácido 2,4-di (terc-butóxi) pirimidina-5-il-borônico (80 nM, 2 horas), predominantemente citoplasmática de NF-kB, e (D) Tratamento com o ácido 5-isoquinolinaborônico (80 nM, 2 horas), predominantemente NF-kB nuclear.

[061] A Figura 5 demonstra o PCC entre as porções nuclear e citoplasmática da molécula NF-kB em células HeLa tratadas com ácido 4-aminocarbonilfenilborônico, ácido 3-aminofenilborônico, ácido 5- amino-2,4-difluorfenilborônico, ácido 3-flúor-4-aminometilfenilborônico e ácido 4- aminopirimidinaborônico, (barra escura), bem como cada um destes derivados de ácido borônico como conjugados de DSPE- PEG-COOH (barra clara), em comparação com um UTC e LPS . Surpreendentemente, o ácido 4- aminocarbonilfenilborônico conjugado foi menos inflamatório do que o ácido 4- aminocarbonilfenilborônico livre.

[062] A Tabela 1 e a Figura 8 relacionam os resultados do PCC para vários derivados de ácido borônico.Tabela 1

[063] A citotoxicidade dos derivados de ácido borônico da Tabela 1, foi estudada pelo ensaio MTT. 150.000 células HeLa foram plaque- adas em placas de 96 cavidades na noite anterior às experiências. No dia das experiências, as células foram tratadas com os derivados de ácido borônico, a três concentrações diferentes (40 nM, 80 nM e 160 nM) durante 2 h. No final da incubação, os ensaios MTT (kit baseado no ensaio In Vitro Toxicology MTT, Sigma Aldrich, MO) foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante.

[064] A Figura 6 demonstra as porções remanescentes de células HeLa tratadas com ácido 4-aminocarbonilfenilborônico livre (barra escu-ra), ácido 3-aminofenilborônico, ácido 5-amino--2,4-difluorfenilborônico, ácido 3-flúor-4-aminometilfenilborônico, e ácido 4-aminopirimidinoborô- nico, bem como cada um destes derivados de ácido borônico como con-jugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), em comparação com um UTC e LPS. Surpreendentemente, o ácido 4-aminocarbonilfenilborônico conjugado foi menos citotóxico do que o ácido 4-aminocarbonilfenil- borônico livre.

[065] A Tabela 1 e a Figura 8 relacionam a taxa de sobrevivência das células para diversos derivados de ácido borônico.

Exemplo 3. Ensaio de ligação.

[066] A afinidade de ligação dos derivados de ácido borônico pa ra a glicose foi determinada por ensaio de competição usando Conca- navalinA (ConA) como padrão competitivo, e variando as concentrações dos derivados de ácido borônico. Contas magnéticas carbóxi- terminadas foram ativadas por suspensão das contas em 100 mM de ácido 2 (N-morfolino) etanossulfônico (MES) em solução tampão (pH 4,5). Conjugou-se glucosamina (100 mg/mL) com as contas magnéti- cas ativadas utilizando acoplamento de carbodiimida com 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) como agente de reticulação. A reação de conjugação foi realizada em uma placa de 96 poços. A reação foi realizada em 24 h. As contas foram separadas colocando-se a microplaca em um separador magnético sendo lavadas cuidadosamente com PBS a pH 7,2 para remover a glicose não acoplada, o excesso de EDC e N-hidroxisulfossuccinimida (sulfo-NHS).

[067] As contas terminadas em glicose foram coincubadas por 1 h com ConA 2,4 μM (um aglutinante conhecido de carboidratos) por fluorescência marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-ConA), e titulou-se com concentrações que variaram de 2,5 μM a 20 μM de cada derivado de ácido borônico testado. Foram utilizados os seguintes controles: (A) contas magnéticas terminadas em carbóxi (não conjugado à glicose) foram tratadas com Con A-FITC para determinar a ligação não específica e (B) contas conjugadas à glicose foram tratadas com uma concentração elevada de ConA não fluorescente para se determinar a ligação máxima.

[068] As cavidades foram lavadas três vezes com PBS a pH 7,2,para remover os derivados de ácido borônico não ligados e FITC- ConA. As contas foram novamente suspensas em PBS e agitadas durante 15 min à temperatura ambiente antes de medir a FITC de fluorescência (excitação: 495 nm, emissão de topo: 520 nm; 6 flashes por poço; média de n = 3 poços em um leitor de microplacas Flexstation II384 para se quantificar a quantidade de glicose ligada aos ácidos borônicos). A intensidade de fluorescência foi medida e utilizada como uma indicação da quantidade de ConA ligada à superfície das contas ou [ConAs]. A interação ConA-açúcar foi prevista para inibição pelos derivados de ácido borônico, que podem se ligar às moléculas de açúcar e deslocar o limite de ConA-FITC, ocasionado uma diminuição na intensidade de fluorescência da mistura.

[069] A constante de ligação dos derivados de ácido borônico foi calculada a partir da intensidade de fluorescência. A redução da inten-sidade de fluorescência está relacionada a [ConAs] pela Equação 2.

[070] A relação entre [ConAs] e a quantidade de ácido borônico [BA] é dada pela Equação 3.

[071] O simples rearranjo rende a Equação 4, a partir da qual a relação entre as duas constantes de equilíbrio (KConA/KBA) pode ser de-rivada.

[072] A concentração dos sítios de açúcar (SI) pode ser calculado a partir da intersecção de um lote de 1/[ConAs] versus 1/[BA].

[073] A Figura 7 mostra um gráfico representativo para o cálculo da constante de ligação para o ácido 4-aminocarbonilfenilborônico.

[074] A Tabela 1 lista as afinidades de ligação relativas do açúcar (log(KConA/KBA)) de vários derivados de ácido borônico, em comparação com ConA.

[075] A Figura 8 mostra a estrutura e a afinidade de ligação da glicose (M-1) para os vários derivados de ácido borônico.

Exemplo 4. Síntese de conjugados de lípidio-PEG-ligante-ácido borô- nico.

[076] Todos os conjugados de lipídio-PEG-ligante-ácido borônico e açúcar foram preparados por acoplamento do derivado de amina de ácido borônico -ligante ou porções de açúcar, com DSPE-PEG-COOH, utilizando a química carbodiimida. De modo geral, 50 mg de DSPE- PEG-COOH, foram dissolvidos em 2 mL de dimetilformamida anidra (DMF), seguido da adição de EDC (2,0 equivalentes) e N- hidroxissuccinimida (NHS) (3,0 equivalentes), sendo a mistura deixada agitar durante 30 minutos à temperatura ambiente. O derivado de amina de ácido borônico ou açúcar foi adicionado e a mistura de reação foi deixada a agitar durante a noite. Para as aminas obtidas sob a forma do sal de amónio, estes foram dessalgados por agitação em 500 μL de DMF e 35 μL de trietilamina durante 30 minutos à temperatura ambiente antes da adição à mistura de reação. A mistura de reação foi diluída com 4 mL de tampão MES (50 mM, pH 4,18), transferida para uma cassete de diálise MWCO 3K, e dialisada duas vezes contra 2 L do mesmo tampão, e depois duas vezes contra 2 L de água, seguido por liofilização para se obter o conjugado desejado. A identidade e pureza do produto final foi confirmada por espectrometria de RMN 1H.

Exemplo 5. Síntese de lipossomas funcionalizados com açúcar/ácidos borônicos e seus conjugados.

[077] Síntese de conjugados fosfolipídios-polietileno glicol-glicosila. Espécies de PEG-Glicosila foram sintetizados por conjugação do grupo carboxila de DSPE-PEG-COOH no grupo amino de glucosa- mina, galactosamina, e manopiranosideo, utilizando a química de aco-plamento carbodiimida descrito em G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, Elsevier Science EUA (1996 ) 169-185, aqui incorporado por referência. O acoplamento foi feito na posição C2 das moléculas de açúcar, mantendo, assim, as posições C3, C4 e C5 não modificadas.

[078] Carregamento de lipossomas com insulina.

[079] Insulina humana recombinante foi dissolvida em tampão de citrato (100 mM, pH 2,5) a uma concentração de 15 mg / mL. Lipidios (56,4% molar de DPPC, 40% molar de colesterol, e 1,2% molar de cada um de DSPE-PEG-Glicose, DSPE-PEG-galactose, DSPE-PEG- manopiranósideo) foram dissolvidos em etanol e hidratados com a so-lução de insulina a 50°C durante 15 min. A concentração final de lipídios era de 50 mM. A mistura hidratada passou oito vezes através de uma membrana de 400 nm Nucleopore track-etch a 50°C a uma pressão de 100 psi. Os lipossomas-mãe tinham um diâmetro médio de 244,1 nm (os diâmetros médios de lipossoma adequados podem ficar entre cerca de 100 nm a cerca de 300 nm) e uma concentração de lipídio de cerca de 50 mM. A insulina foi encapsulada por carga passiva. O pH da formulação de lipossomas foi mantido a 5,6 (ponto isoelé- trico da insulina). Os lipossomas foram dialisados contra tampão de citrato (100 nM, pH 5,6) para remover a insulina não encapsulada. Neste exemplo, a insulina não encapsulada é removida para atenuar ou prevenir que a insulina tenha um efeito imediato e talvez desnecessário no meio fisiológico. Em algumas modalidades, a composição de vesícula é destinada a libertar e / ou fornecer insulina principalmente ou exclusivamente em resposta à presença de uma quantidade limite de glicose no meio fisiológico do paciente (isto é, tendo um efeito de "glicose responsiva"), tal como quando o paciente está experimentando uma condição hiperglicêmica. No exemplo presente, a insulina encapsulada estava presente em uma concentração de aproximadamente 15 mg/ml, embora se considere que a concentração de insulina encapsulada pode ser aproximadamente a mesma, ou pode ser menor ou maior do que a concentração de partida de insulina. A insulina não encapsulada pode estar presente em uma concentração de cerca de 0% - 5% da insulina encapsulada, ou até cerca de 0,75 mg / mL, embora as concentrações mais elevadas de insulina não encapsulada possam ser aceitáveis, ou preferidas, dependendo da necessidade do paciente e do meio através do qual a composição de vesícula é introduzida no meio fisiológico do paciente.

Síntese de conjugados de fosfolipídio-polietilenoglicol-derivado de áci- do borônico

[080] Lipídio-PEG-ácido borônico foi sintetizado por conjugação do grupo carboxila de DSPE-PEG-COOH para as porções de ácido borônico amino funcionalizadas, utilizando a química de acoplamento carbodiimida descrita em G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, EUA Elsevier Science (1996) 169 - 185, aqui incorporada por referência. A composição de lipídios para o lipos- soma ácido borônico funcionalizado foi a seguinte: 56,4% molar de DPPC, 40% molar de colesterol, e 3,6% em moles de DSPE-PEG- ácido borônico.

[081] Espécies conjugadas representativas de lipídio-PEG-derivado de ácido borônico

[082] Conjugado de ácido 3-aminofenilborônico Características picos 1H RMN: δ ppm 7,98 (s, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,31 (d, 1H), 7,03 (t, 1H), 5,33 (s, 1H, NH), 5,21 (s, 2H, NH), 1,55 (t, 3H), 1,49 (t, 3H).

[083] Conjugado de ácido 3-flúor-4-aminometilfenilborônico.

[084] Características: 1H RMN (300 MHz, acetona-d6) picos: δ ppm 8,15 (d, 1H), 8,00 (dd, 1H), 7,90 (m, 1H), 5,70 (s, 1H, NH), 5,50 (s , 1H, NH), 1,55 (t, 3H), 1,40 (t, 3H).

[085] Conjugado de ácido 4-aminopirimidilborônico.

[086] Características 1H RMN (300 MHz, acetona-d6) picos: δ ppm 7,85 (s, 2H), 5,25 (s, 1H, NH), 5,20 (s, 2H, NH), 1,40 (t, 6H).

[087] Conjugado de ácido 4-aminocarbonilfenilborônico.

[088] Características 1H RMN (300 MHz, acetona-d6) picos:δ ppm 7,85 (d, 2H), 7,80 (d, 2H), 5,30 (s, 1H, NH), 5,25 (s, 2H, NH ), 1,40 (t, 6H).

ácido 5-amino--2,4-difluorfenilborônico.

[089] Os processos de carga de insulina, extrusão e purificação de insulina foram semelhantes aos utilizados para os lipossomas de açúcar acima descritos. Os lipossomas tinham um diâmetro médio de 184±0,162 nm (diâmetros médios de lipossoma adequados podem ser de cerca de 100 nm a cerca de 300 nm). A insulina encapsulada estava presente em uma concentração de aproximadamente 15 mg / ml.

Preparação das Composições de Vesícula

[090] Dois tipos de insulina foram carregados a formulações de lipossomas funcionalizadas, ou com moléculas de açúcar ou derivados de ácido borônico, foram misturados e agitados à temperatura ambiente, para formar composições de vesículas. As misturas foram preparadas utilizando várias razões molares das espécies de açúcar para espécies de ácido borônico na superfície externa dos lipossomas, variando de 1:2 a 1:50 para determinar o excesso de ácidos borônicos necessários para a formação da composição de vesícula. O pH da mistu- ra foi também variou entre 7 e 11, a fim de selecionar composições de vesículas formadas a pH fisiológico.Tabela 2

[091] Confirmação de reticulação química de ácido borônico e porções de açúcar

[092] Para confirmar se as composições de vesícula foram for madas por reticulação química do ácido borônico e porções de açúcar, os aglomerados foram expostos a 10 mM de glicose. Os aglomerados foram prontamente clivados na presença de glicose, devido à ligação competitiva dos ácidos borônicos com a glicose livre. Isto ficou de-monstrado pelo aumento da frequência de partículas de tamanho inferior a 1μ de 13% para 37% após incubação com a glicose.

Exemplo 6. Liberação in vitro de insulina de composições de boronato- de vesícula de açúcar.

[093] Um pequeno volume (500 μL) dos aglomerados foi carregado dentro de uma membrana de diálise tubular (100.000 MWCO), seladas com clips, e dialisadas contra uma solução de PBS (pH 7,4) durante 30 min antes da clivagem com glicose para controlar a difusão passiva da insulina sem desencadeador. A Isto seguiu-se a adição de solução de glicose para os aglomerados dentro da membrana, a inter- valos regulares para clivar as composições de vesícula e desencadear a liberação de insulina. As alíquotas foram removidas da fase externa, a cada 15 min, e a concentração de insulina foi analisada por leitura da absorbância a 214 nm. O ensaio foi continuado por várias horas para se verificar uma interrupção na liberação de insulina encapsulada.

[094] A Figura 9 ilustra gráficos de liberação cumulativa para quatro diferentes composições de vesícula (ácido 4-aminocarbonilfenil- borônico, ácido 3-aminofenilborônico, ácido 3-flúor-4-aminoetilfenil- borônico, e ácido 5-amino--2,4-difluorfenilborônico), na ausência de fator desencadeante de glicose. A composição de vesícula de ácido 3- aminofenilborônico e a composição de vesícula do ácido 4- aminocarbonilfenilborônico liberaram 12% e 17% do seu conteúdo de insulina, respectivamente.

[095] A liberação de insulina a partir da composição de vesicular do ácido 4-aminocarbonilfenilborônico após adição de várias concen-trações de desencadeador de glicose foi ensaiada por várias horas. As concentrações de disparo foram escolhidas para imitar os níveis de glicose no sangue em condições normoglicêmicas e hiperglicêmicas. Um ensaio de controle foi também realizado em que a composição de vesícula de ácido 4- aminocarbonilfenilborônico foi desencadeada com PBS em vez de glicose. A composição de vesícula do ácido 4- aminocarbonolfenilborônico exibiu uma liberação brusca de insulina dentro de dois minutos após a introdução do desencadeador de glicose. A taxa de liberação diminui ao longo do tempo até que seja adicionado mais uma dose de glicose, o que provocou um novo episódio de liberação brusca. Neste exemplo, a concentração mínima de glicose necessária para clivar a composição de vesícula do ácido 4-aminocar- bonilfenilborônico e liberar a insulina foi de 10 mmol/L, o que corresponde a um nível de glicose no sangue de 180 mg/dL. Nenhuma liberação brusca de insulina foi observada quando a composição de vesí- cula de ácido 4-aminocarbonilfenilborônico foi desencadeada com concentrações de glicose análogas à hipoglicemia (cerca de 9 mg/dl) ou de normoglicemia (cerca de 126 mg/dL), o que demonstra que a composição de vesícula exemplar do ácido 4-aminocarbonilfenilbo- rônico é adequada para a manutenção de níveis normais de glicose no sangue. Além disso, a taxa de liberação de insulina a partir dessas composições de vesículas é dependente da concentração de glicose, tornando as presentes concretizações úteis para atenuar ou evitar a hiperinsulinemia.

[096] A figura 10 ilustra gráficos (a) cumulativos e (b) diferenciais para a liberação de insulina a partir das composições de vesícula do ácido 4-aminocarbonilfenilborônico (ácido 4-aminocarbonilfenilborônico AVT) desencadeadas com 5 mM, 7 mM, e 10 mM de glicose, em com-paração com desencadeamento com 5 mM, 7 mM, 10 mM, e PBS.

[097] A figura 11 ilustra gráficos (a) cumulativos e (b) diferenciais para a liberação de insulina a partir de ácido 4-aminocarbonilfe- nilborônico e composições de vesículas ConA desencadeadas com 10 mM, 30 mM e 40 mM de glicose.

[098] Os versados na técnica apreciarão que, numerosas alterações e modificações podem ser feitas às formas de realização aqui reveladas, e que tais alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da invenção. Pretende-se, portanto, que as rei-vindicações anexas cubram todas essas variações equivalentes que se enquadrem no verdadeiro espírito e âmbito da invenção.

Claims

1. Composição de vesícula, caracterizada pelo fato de que compreende: (1) uma primeira composição de lipossoma, compreendendo uma pluralidade de lipídios, compreendendo: (1) 40-70% molar de um primeiro lipídio selecionado de DSPE, DPPE, DPPC, DSPC, ou uma combinação dos mesmos; (2) 20-50% molar de um colesterol; e (3) 1-15% molar de um conjugado de lipídio-PEG compre-endendo uma porção de sensibilização química em que dita uma porção de sensibilização química é uma porção de derivado de ácido borônico; em que a primeira composição de lipossoma encapsula in-sulina; e (8) uma segunda composição de lipossoma compreendendo uma pluralidade de lipídios, compreendendo: (9) 40-70% molar de um segundo lipídio selecionado de DSPE, DPPE, DPPC, DSPC, ou qualquer combinação dos mesmos; (10) 20-70% molar de um colesterol; e (11) 1-15% molar de um conjugado de lipídio-PEG-açúcar, em que a segunda composição de lipossoma encapsula insulina.

2. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição de porção de derivado de ácido borônico do conjugado de lipídio-PEG e uma porção de açúcar do conjugado de lipídio-PEG-ligante-açúcar são ligados covalentemente pa-ra formar uma ligação reversível borônico-açúcar entre o primeiro lipos- sima e o segundo lipossoma, em que a ligação borônico-açúcar é pron-tamente clivada na presente de uma porção livre devido a ligação com-petitiva do ácido borônico com a porção livre sentida.

3. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado de lipídio-PEG compre-endendo o derivado de ácido borônico compreende uma porção de ácido 4-aminocarbonilfenilborônico.

4. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado de lipídio-PEG compre-endendo o derivado de ácido borônico compreende:

em que n = 30-60.

5. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado de lipídio-PED-ligante- açúcar compreende: uma porção fosfolipídica; uma porção de polietileno glicol e

uma porção de glicosila.

6. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a porção de glicosila compreende uma porção de glucosila.

7. Composição de vesícula, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a porção de glicosila compreende uma porção de galactosila.

8. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a porção de glicosila compreende uma porção de manopiranosidila.

9. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma ou mais da primeira e a segunda composição de lipossoma libera uma quantidade de insulina em resposta à presença de um açúcar, opcionalmente em que a quantidade de insulina liberada é dependente da concentração do açúcar.

10. Composição de vesícula, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a quantidade do respectivo composto terapêutico liberado é dependente de uma concentração de açúcar.

11. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro composto terapêutico e o segundo composto terapêutico são os mesmos.

12. Composição de vesícula para uso no tratamento da di-abetes, caracterizada pelo fato de que compreende: (1) uma primeira composição de lipossoma compreendendo uma pluralidade de lipídios, compreendendo: (1) um primeiro lipídio selecionado de DSPE, DPPE, DPPC, DSPC ou qualquer combinação dos mesmos, (2) colesterol, e (3) um conjugado de lipídio-PEG compreendendo uma porção de derivado de ácido borônico, em que a porção de derivado de ácido borônico é menos citotóxica e/ou menos inflamatória do que a porção do derivado de ácido borônico em sua forma livre; e (8) uma segunda composição de lipossoma, compreendendo uma pluralidade de lipídios, compreendendo: (9) um segundo lipídio selecionado de DSPE, DPPE, DPPC, DSPC ou qualquer combinação dos mesmos; (10) colesterol; e (11) um conjugado de lipídio-PEG-ligante-açúcar compreendendo uma porção glicosila compreendendo uma porção de glucosila, uma porção de galactosila ou uma porção de manopiranosidila, em que a segunda composição de lipossoma encapsula in-sulina.

13. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o conjugado de lipídio-PEG com-preendendo o derivado de ácido borônico compreende uma porção de ácido 4-aminocarbonilfenilborônico.

14. Composição de vesícula de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a porção do derivado de ácido borô- nico do conjugado de lipídio-PEG e a porção de glicosila do conjugado lipídio-PEG-ligante-açúcar são covalentemente ligadas entre si para formar uma ligação reversível borônico-glicosil entre o primeiro liposso- ma e o segundo lipossoma, e em que a ligação borônico-glicosil é pron-tamente clivada na presença de uma porção livre sentida devido a liga-ção competitiva do ácido borônico com a porção livre sentida.

15. Composição capaz de ser injetada em um paciente, ca-racterizada pelo fato de que compreende: (1) um primeiro lipossoma, compreendendo uma pluralidade de lipídios, compreendendo: (1) 40-70% molar de DPPC; (2) 20-50% molar de um colesterol; e (3) 1-15% molar de um conjugado de DSPE-PEG- derivado de ácido borônico, em que o primeiro lipossoma encapsula insulina; e (8) um segundo lipossoma, compreendendo uma pluralidade de lipídios, compreendendo: (9) 40-70% molar de DPPC; (10) 20-50% molar de um colesterol; (11) 1-15% molar de um conjugado de DSPE-PEG-glicosila; (12) 1-15% molar de um conjugado de DSPE-PEG- galactosila; e (13) 1-15% molar de um conjugado de DSPE-PEG- manopiranosidila, em que o segundo lipossoma encapsula insulina.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracte-rizada pelo fato de que o primeiro lipossoma compreende: (1) 56,4% molar de DPPC; (2) 40% molar de colesterol; e (3) 3,6% molar de conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borônico.

17. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracte-rizada pelo fato de que o segundo lipossoma compreende: (1) 56,4% molar de DPPC; (2) 40% molar de colesterol; (3) 1,2% molar de conjugado de DSPE-PEG-glicosila; (5) 1,2% molar de conjugado de DSPE-PEG-galactosila; e (6) 1,2% molar de conjugado de DSPE-PEG-manopirano- sidila.

18. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracte-rizada pelo fato de que uma molécula de conjugado de DSPE-PEG- derivado de ácido borônico do primeiro lipossoma é covalentemente ligada a uma ou mais de uma molécula de conjugado de DSPE-PEG- glicosila, de conjugado de DSPE-PEG-galactosila e de conjugado de DSPE-PEG-manopiranosidila do segundo lipossoma para formar uma ou mais ligações reversíveis borônico-glicosil, em que a ligação borô- nico-glicose, borônico-galactose ou borônico-manopiranosidila é prontamente clivada na presença de glicose devido a ligação competitiva do ácido borônico com glicose livre.

19. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracte-rizada pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo lipossomas libera insulina em resposta à clivagem de uma ou mais das ligações borôni- co-glicose, borônico-galactose ou borônico-manopiranosidila.

20. Composição de vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e 15 a 19, caracterizada por ser para uso como um medicamento para uso no tratamento de diabetes em um indivíduo.