MX2013004146A - Composiciones de vesicula. - Google Patents
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Abstract
Se proporcionan composiciones de vesícula que comprenden un compuesto terapéutico. Las composiciones de vesícula pueden ser capaces de liberar el compuesto terapéutico en respuesta a la presencia de un activador externo. Las composiciones de vesícula pueden comprender una pluralidad de vesículas biocompatibles. Las vesículas biocompatibles pueden comprender un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo y una o más reticulaciones entre dos o más de las vesículas biocompatibles, cada reticulación comprendiendo una porción de percepción química y una segunda porción. En algunas modalidades, el compuesto terapéutico puede ser cualquier compuesto que proporciona efectos curativos, paliativos o de otra manera benéficos para un paciente.
Description
COMPOSICIONES DE VESÍCULA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se dirige a composiciones de vesícula que comprenden , un compuesto terapéutico las cuales son capaces de liberar el compuesto terapéutico en respuesta a la presencia de un activador externo, dichas Las composiciones de vesícula pueden comprender una pluralidad vesículas biocompatibles que comprenden un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo, y una o más reticulaciones entre dos o más de las vesículas biocompatibles comprendiendo una porción sensible a los químicos y una porción percibida.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La diabetes es una enfermedad causada por la deficiencia de insulina o una resistencia a la insulina en el cuerpo. La diabetes Tipo I es una enfermedad autoinmune que daña las células beta de las isletas de Langerhans en el páncreas, resultando en una cantidad inadecuada de insulina en el cuerpo. Sin tratamientos de insulina, la diabetes tipo I es fatal. La diabetes tipo II resulta de una producción insuficiente de insulina o la inhabilitada del cuerpo del paciente para responder apropiadamente a la insulina. La resistencia a la insulina asociada con la diabetes tipo II evita que niveles adecuados de azúcar en la sangre ingresen dentro de las células para almacenarse para energía, resultando en hiperglicemia en el flujo sanguíneo. Tradicionalmente, la diabetes tipo I se trata por las inyecciones subcutáneas repetidas de insulina cada día. La diabetes Tipo II también se trata con insulina, comúnmente en combinación con otros medicamentos tomados oralmente o mediante inyección. Se requieren inyecciones múltiples de insulina por día, así como el monitoreo cuidadoso de los niveles de glucosa en la sangre del paciente a través del control de la dieta y pruebas de sangre. Las bombas de insulina se usan como una alternativa a múltiples inyecciones de insulina dianas por una jeringa. Sin embargo, las bombas de insúlina son costosas, deben llevarse la mayoría del tiempo y requieren de pruebas sanguíneas para determinar la cantidad de insulina a enviarse dentro del paciente. Las pruebas sanguíneas
requieren que el paciente proporcione una muestra de sangre, usualmente de un dedo, y para probar de la muestra sanguínea la concentración de glucosa. Los sistemas de nhonitoreo de glucosa en la sangre están disponibles los cuales usan un sensor colocado justo bajo la piel para monitorear periódicamente la cantidad de glucosa en el fluido intersticial. Estos sistemas requieren calibración, típicamente resultando en dos pinchazos de dedo por día y son costosos. Además, existe un tiempo de retraso entre la concentración de glucosa en el flujo sanguíneo y la concentración de glucosa en el fluido intersticial.
Existe una necesidad de un sistema o dispositivo que libera cantidades controladas de insulina directamente en respuesta a concentraciones de glucosa incrementadas, sin requerir que el paciente o el profesional médico monitoree continuamente el nivel de glucosa en la sangre, determinar la cantidad apropiada de insulina a inyectarse e inyectar periódicamente insulina en todo el día.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Se proporcionan composiciones de vesícula que comprenden un compuesto terapéutico. Las composiciones de vesícula pueden ser capaces de liberar el compuesto terapéutico en respuesta a la presencia de un activador externo. Las composiciones de vesícula pueden comprender una pluralidad vesículas biocompatibies. Las vesículas biocompatibies pueden comprender un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo, y una o más reticulaciones entre dos o más de las vesículas biocompatibies, cada reticulación comprendiendo una porción sensible a los químicos y una porción percibida. En algunas modalidades, el compuesto terapéutico puede ser cualquier compuesto que proporciona efectos paliativos, curativos o de otra manera benéficos para un paciente. Las composiciones de vesícula pueden ser apropiadas para inyectarse en un paciente.
Las composiciones de vesícula también se proporcionan que comprenden una pluralidad de vesículas biocompatibies, las vesículas biocompatibies comprendiendo un compuesto
terapéutico para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo y una o más reticulaciones entre dos o más de las vesículas biocompatibles, cada reticulación comprendiendo una porción de ácido borónico o una porción derivada de ácido borónico y una porción de azúcar.
Además, se proporcionan métodos para administrar un compuesto terapéutico a un paciente en necesidad del mismo. Estos métodos pueden comprender inyectar una composición de vesícula parenteralmente en un paciente en necesidad de tratamiento, la composición de vesícula comprendiendo un compuesto terapéutico y liberando el compuesto terapéutico en el paciente en respuesta a un evento de activación.
También se proporcionan métodos para el tratamiento de una condición médica, los métodos comprendiendo la administración de una composición de vesícula en un paciente en necesidad del tratamiento, en donde la composición de vesícula se carga con un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo y liberando él compuesto terapéutico en el paciente en respuesta a un evento de activación.
;
La descripción general y la siguiente descripción detallada son ejemplárizadoras y solamente explicativas y no se intenta que sean restrictivas de la invención, como se ¡define en las reivindicaciones. Otras modalidades llegarán a ser aparentes para aquellos expertos !en la técnica en vista de la descripción detallada proporcionada en este documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En las figuras que la acompañan, las fórmulas químicas, estructuras químicas y datos experimentales que junto con la descripción detallada proporcionada posteriormente, describen las modalidades ejemplárizadoras de la invención reclamada.
La Figura 1 ¡lustra una modalidad de una composición de vesícula.
La Figura 2 ilustra una modalidad de una composición de vesícula.
La Figura 3 ilustra una modalidad de una composición de vesícula.
La Figura 4 muestra imágenes representativas de las células HeLa mostrando el efecto del tratamiento derivativo del ácido borónico en la ubicación citoplásmica nuclear de NF-KB.
La Figura 5A demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) entre las fracciones citoplásmicas y nucleares de la molécula NF-?? en las células HeLa con el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre (barra negra), así como cada uno de los derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).
La Figura 5? demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) entre las fracciones citoplásmicas y nucleares de la molécula NF-?? en las células HeLa tratadas con ácido 3-aminofenilborónico libre (barra oscura), así como cada uno de aquellos derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara) como se compara con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).
La Figura 5C demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) entre las fracciones citoplásmicas y nucleares de la molécula NF-?? en las células HeLa tratadas con ácido 5-amino-2,4-difluorofenilborónico libre (barra oscura), así como cada uno de los derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).
La Figura 5D demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) entre las fracciones citoplásmicas y nucleares de la molécula NF-?? en las células HeLa tratadas con ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico libre (barra oscura) así como cada uno de aquellos derivados de
ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).
La Figura 5E demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) entre las fracciones citoplásmicas y nucleares de la molécula NF-?? en las células HeLa tratadas con el ácido 4-aminopirimidinoborónico y libre (barra oscura), así como cada uno de aquellos derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara a un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).
La Figura 6A demuestra las fracciones sobrevivientes de las células HeLa tratadas con ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre (barra oscura) así como cada uno de aquellos derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un UTC y LPS.
La Figura 6B demuestra las fracciones sobrevivientes de las células HeLa tratadas con ácido 3-aminofenilborónico libre (barra oscura), así como cada uno de los derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un UTC y LPS.
La Figura 6C demuestra las fracciones sobrevivientes de las células HeLa tratadas con ácido 5-amino-2,4-difluorofenilborónico libre (barra oscura), así como cada uno de los derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un UTC y LPS.
La Figura 6D demuestra las fracciones sobrevivientes de las células HeLa tratadas con ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico libre (barra oscura), así como cada uno de los derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un UTC y LPS.
La Figura 6E demuestra las fracciones sobrevivientes de las células HeLa tratadas con ácido 4-aminopirimidinoborónico libre (barra oscura), así como cada uno de los derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), como se compara con un, UTC y LPS.
La Figura 7 muestra un esquema representativo para el cálculo de la constante de unión para el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico.
La Figura 8 ilustra esquemas de liberación cumulativa para cuatro composiciones de vesícula de azúcar-ácido borónico representativas.
La Figura 9A ilustra esquemas cumulativos para la liberación de la insulina del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico - composiciones de vesícula de azúcar activados con 5 mM, 7 mM y10 m de glucosa, como se compara para activarse con 5 mM, 7 mM y 10 mM de PBS.
La Figura 10A ilustra esquemas cumulativos para la liberación de la insulina del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico - composiciones de vesícula de azúcar ("ácido 4-aminocarbonilfenilborónico AVT") y composiciones de vesícula de Concavanalina A ("ConA-AVT") activada con 10 mM, 30 mM y 40 mM de glucosa.
La Figura 10B ilustra esquemas diferenciales para la liberación de la insulina del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico - composiciones de vesícula de azúcar ("ácido 4-aminocarbonilfenilborónico AVT") y composiciones de vesícula de Concavanalina A ("ConA-AVT") activada con 10 mM, 30 mM y 40 mM de glucosa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención puede entenderse más rápidamente con referencia á la siguiente descripción detallada tomada junto con las figuras y ejemplos que la acompañan, las cuales forman
una parte de esta divulgación. Esta invención no se limita a dispositivos, métodos, aplicaciones, condiciones o parámetros específicos descrito y/o mostrados en este documento. La terminología usada en este documento es para el propósito de describir modalidades particulares por medio de ejemplo solamente, y no se intenta que sea limitante. Como se usa en la especificación y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno", y "el" incluyen el plural. El término "pluralidad" sin embargo significa más de uno. Con referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto claramente establezca otra cosa. Cuando un rango de valores se expresa, otra modalidad incluye desde el valor particular y/o el otro valor particular. El valor particular forma otra modalidad. En donde el término "aproximadamente" se usa junto con un número, se intenta que incluya ± 10% del número. Por ejemplo "aproximadamente 10" puede significar desde 9 a 11.
A la extensión que el término "incluye" o "incluyendo" se usa en la especificación o las reivindicaciones, se intenta que sea inclusive en una manera similar al término "comprendiendo" como ese término se interpreta cuando se emplea en una palabra de transición en una reivindicación. Por lo tanto, a la extensión que el término "o" se emplea (por ejemplo A o B) se intenta que signifique "A o B o ambos". Cuando los solicitantes intentan indicar "solamente A o B pero no ambos", entonces el término "solamente A o B, pero no ambos" se empleará. Además, el uso del término "o" en este documento es el inclusive, y no el uso exclusivo.
Ciertas características de la invención que son, para claridad, descritas en este documento en el contexto de las modalidades separadas, también puede proporcionarse en combinación en una sola modalidad. Por el contrario, varias características de la invención que son, para brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también pueden proporcionarse por separado en cualquier sub-combinación.
La presente invención puede entenderse más rápidamente con referencia a las Figuras 1 , 2 y 3. En la Figura 1 , un esquema de una modalidad de una composición de vesícula 1 se muestra.
Como se muestra en la Figura 1 , la composición de vesícula 1 comprende una pluralidad de vesículas biocompatibles 2. En una modalidad, la pluralidad de vesículas biocompatibles 2 pueden por ejemplo, ser no tóxicas y biodegradables. Como se muestra en la Figura 1 , la composición de vesícula 1 además comprende una o más porciones perceptibles químicas 3. En una modalidad, una o más porciones perceptibles químicas que son capaces de unirse reversiblemente con una porción conjugada. Como se muestra en la Figura 1 , las composiciones de vesícula 1 además comprende una o más porciones perceptibles 4. En una modalidad, una o más porciones percibidas 4 pueden ser, por ejemplo, porciones químicas que son capaces de unirse reversiblemente con una porción de percepción química, por ejemplo 3. Como se usa en este documento, la frase "porción percibida" puede abarcar ambas porciones percibidas de unión que se unen a una vesícula biocompatible (como se muestra en la Figura 1 ) y las porciones percibidas libres que son porciones percibidas que no se unen a una vesícula biocompatible pero están presentes en el ambiente fisiológico (es decir, el ambiente dentro del cuerpo de un paciente). ' Regresando ahora a la Figura 1 , una primera vesícula biocompatible 2 se une a una porción de percepción química 3, mientras una segunda vesícula biocompatible 2 se une a una porción percibida 4. La porción de percepción química 3 y la porción percibida 4, cuando sé unen juntas forman la reticulación 5.
La Figura 2 ilustra otra modalidad de una composición de vesícula 1. Una primera vesícula biocompatible 2 se une a un enlazador de polímero 6 y el enlazador de polímero 6 se une a una porción de percepción química 3. Una segunda vesícula biocompatible 2 se une a una porción percibida 4. La porción de percepción química 3 y la porción percibida 4, cuando se unen juntas forman la reticulación 5.
La Figura 3 ilustra aún otra modalidad de una composición de vesícula 1. Una vesícula biocompatible 2 se une a un primer enlazador de polímero 6 y el primer enlazador de polímero 6 se une a una primera porción de percepción química 3. Una segunda vesícula biocompatible 2 se une a un segundo enlazador de polímero 6 y el segundo enlazador de polímero 6 se une a una
segunda porción de percepción química 3. Dos porciones percibidas 4 se unen juntas y cada porción de percepción química 3 se une a una porción percibida 4. Las porciones de percepción química 3 y las porciones percibidas 4, cuando se unen juntas forman una reticulación 5.
Una vesícula biocompatible puede ser cualquier partícula biocompatible capaz de portar un compuesto terapéutico. La vesícula biocompatible puede ser aproximadamente esférica en forma con una porción interna. El compuesto terapéutico puede portarse en una porción interna de la vesícula, en la pared de la vesícula, unida a la superficie externa de la vesícula, o mediante cualquier otro medio apropiado. La vesícula biocompatible puede comprender polímeros, lípidos, proteínas, carbohidratos, otras macromoléculas, aguas y sales o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la vesícula biocompatible puede comprender un liposoma comprendido de una pluralidad de lípidos. Los lípidos pueden comprender lípidos saturados. En una modalidad, la vesícula biocompatible puede comprender un liposoma comprendido de una pluralidad de lípidos. Los lípidos pueden comprender lípidos saturados. En una modalidad, la vesícula biocompatible puede comprenderse de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dipalmitoilfosfatidiniletanolamina (DPPE), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC) o cualquier combinación de los mismos. La vesícula biocompatible puede tener una vida autónoma suficiente para ser apropiada como un sistema de liberación para un compuesto terapéutico. En una modalidad, la vesícula biocompatible puede tener una estabilidad de vida autónoma de al menos seis meses en desde aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C o una estabilidad de vida autónoma de al - menos siete días a temperatura ambiente.
Las composiciones de vesícula apropiadas pueden incluir un compuesto terapéutico. En una modalidad, el compuesto terapéutico puede cargarse en o sobre las vesículas biocompatibles. En una modalidad, la composición de vesícula puede ser capaz de liberar el compuesto terapéutico en el ambiente fisiológico de un paciente. El ambiente fisiológico del paciente es ordinariamente el flujo sanguíneo, pero puede ser cualquier ambiente dentro del cuerpo del paciente dentro del cual la composición de vesícula se (ibera. En una modalidad, el compuesto terapéutico sé liberará de la
composición de vesícula en respuesta a la presencia de una porción percibida libre én el ambiente fisiológico En una modalidad, la porción percibida libre en el ambiente fisiológico que activa la liberación del compuesto terapéutico es sintomática de la condición pensada para tratarse por el compuesto terapéutico. En las formulaciones en donde la vesícula es apropiada para inyectarse en un paciente, el porcentaje en peso del compuesto terapéutico con base en el peso total de la composición de vesícula puede estar en el rango de desde aproximadamente 0.1% a aproximadamente 30% o desde aproximadamente 0.2% a aproximadamente 20% o desde aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%. El compuesto terapéutico puede ser cualquier compuesto administrado a un paciente para proporcionar efectos paliativos, curativos o de otra manera benéficos. Los compuestos terapéuticos ejemplarizadores pueden incluir insulina y ciprofloxacino. En algunas modalidades, en donde el compuesto terapéutico es insulina, la insulina puede estar presente en una concentración en el rango de desde 0.1 mg/ml a 10 mg/ml, o desde aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml o desde aproximadamente 1 mg/ml a 3 mg/ml, tal como 2 mg/ml.
En algunas modalidades, la cantidad de liberación del compuesto terapéutico se relaciona a la cantidad de porción percibida presente en el ambiente fisiológico del paciente. Por ejemplo, la cantidad de compuesto terapéutico liberado y la cantidad de porción percibida en el ambiente pueden ser linealmente proporcionales o pueden relacionarse por una función no lineal. Por consiguiente, un incremento en la concentración de la porción percibida libre en el ambiente fisiológico puede activar un incremento en la cantidad de compuesto terapéutico liberado de la composición de vesícula. Por ejemplo, la composición de vesícula puede liberar la insulina del compuesto terapéutico en respuesta a la presencia de porciones percibidas libres que son azúcares en el ambiente fisiológico. Cuando la concentración de las porciones percibidas libres de azúcar incrementa, la concentración de insulina liberada también puede incrementarse. Los azúcares ejemplarizadores pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, la liberación de insulina puede activarse por la presencia de glucosa en el ambiente fisiológico. En modalidades alternas, los
azúcares pueden usarse para activar la liberación de los compuestos terapéuticos diferentes a la insulina.
En algunas modalidades, la porción de percepción química puede unirse directamente a la vesícula biocompatible. Una porción enlazadora puede posicionarse entre la porción de percepción química y la vesícula biocompatible. En modalidades en donde la vesícula biocompatible es una liposoma, la porción enlazadora puede unirse a un lípido que es parte de la liposoma. La porción enlazadora puede ser una porción de polímero biodegradable, tal como por ejemplo, polietilenglicol (PEG). La porción enlazadora puede comprender flexibilidad entre la vesícula biocompatible y la porción de percepción química. Una forma de caracterizar la flexibilidad de la porción enlazadora es la densidad de las uniones no saturadas en cada unidad de repetición de la porción del polímero. En una modalidad, cada unidad de repetición del polímero comprendiendo la porción enlazadora que puede contener al menos un enlace no saturado. Cualquier medio de caracterización de la flexibilidad de la porción enlazadora es mediante su longitud. En donde la porción enlazadora es PEG, cada porción PEG independiente puede tener un peso molecular en el rango de desde aproximadamente 100 a aproximadamente 10,000 Daltons, tal como por ejemplo, en el rango de desde aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000 Da. En una modalidad, la porción enlazadora PEG comprende aproximadamente 10-100 unidades de repetición de etilenglicol. En otra modalidad, la porción enlazadora PEG comprende aproximadamente 30-60 unidades de repetición de etilenglicol.
La porción percibida puede ser capaz de ser unida, tal como mediante un enlace covalente, a la porción de percepción química. La porción percibida puede ser una porción percibida de unión que se une a una vesícula biocompatible, que junto con una porción de percepción química, forma una reticulación en la composición de vesícula. Alternativamente, la porción percibida puede ser una porción percibida libre, que compite con las porciones percibidas libres en el ambiente fisiológico que puede servir como un activador para liberar el compuesto terapéutico mediante
competitivamente unirlo con una porción de percepción química y por lo tanto penetrar las reticulaciones entre las vesículas biocompatibles.
La porción percibida puede relacionarse a la enfermedad o condición observada para tratarse por el compuesto terapéutico. Por ejemplo, en algunas modalidades en donde la condición observada a tratarse por el compuesto terapéutico es diabetes u otra enfermedad metabólica que resulta en híperglicemia, la porción percibida libre que activa la liberación del compuesto terapéutico es un azúcar. Los azúcares ejemplarizadores pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, el azúcar es glucosa. En modalidades, en donde la condición a tratarse es diabetes u otra enfermedad metabólica que resulta en hiperglicemia y la porción percibida libre es un azúcar, el compuesto terapéutico puede ser insulina. En algunas modalidades, en donde la condición observada a tratarse es inflamación, el compuesto químico que activa la liberación del compuesto terapéutico puede ser óxido nítrico. En algunas modalidades, el amiloide beta 42 puede activar la liberación de un compuesto terapéutico para tratar la formación de placa potencial. En otras modalidades, la albúmina, la fosfatasa alcalina, la transaminasa alanina (ALT), el aspartato de aminotransferasa (AST), el nitrógeno de la urea en sangre (BUN), el cloruro de calcio, el dióxido de carbono, la creatinina, la bilirrubina directa, la transpeptidasa de gamma-glutamilo (Gamma-GT), glucosa, dehidrogenasa de lactato (LDH), el fósforo, el potasio, el sodio, la bilirrubina total, el colesterol total, la proteína total, el ácido úrico o cualquier combinación de los mismos puede actuar como una porción percibida libre.
La porción de percepción química y la porción percibida son grupos químicos que pueden ser capaces de unirse inversamente uno con el otro. La unión puede ser un enlace químico, tal como un enlace covalente. El enlace covalente entre la porción de percepción química y la porción percibida pueden ser capaces de penetrar en la presencia de las porciones percibidas de libre competencia en el ambiente. Cuando la composición de vesícula ser ha liberado en un paciente, la unión covalente entre la porción de percepción química y la porción percibida pueden ser capaces
i
de penetrar en la presencia de las porciones percibidas libres en el ambiente fisiológico. En donde las diferentes porciones de percepción química se unen a cada vesícula compatible, las reticulaciones formadas por las diferentes porciones de percepción químicas y las porciones percibidas pueden tener diferentes resistencias. El grado de penetración de las reticulaciones y el. grado de liberación del compuesto terapéutico pueden depender del número de reticulaciones moderadas, fuertes y débiles presentes.
Las porciones de percepción química apropiadas pueden incluir un ácido borónico o un derivado del ácido borónico. Los derivados ejemplarizadores del ácido borónico pueden incluir fenilboronatos, piridilboronatos y ciclohexilboronatos. En una modalidad, el derivado del ácido borónico puede ser ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenil borónico, ácido 2,4-diclorofenilborónico; ácido 4-aminocarbonilfenilborónico; ácido 3-clorofenilborónico, ácido 4-hidroxifenilborónico; ácido 4-propilfenilborónico; ácido 3-[(E)-2-nitrovinil)fenilborónico; anhídrido 4-clorocarbonilfenilborónico; ácido ciclopenten-1-ilborónico; ácido 2-bromopiridina-3-borónico; ácido 2,4-ditert-butoxipirimidin-5-ilborónico; ácido 2,4-bis(benciloxi)pirimidina-5-borónico; ácido 5-fenil-2-tienilborónico; ácido 5-formiltiofeno-3-borónico o cualquier combinación de los mismos.
La porción percibida puede ser un azúcar en modalidades en las cuales la porción de percepción química es un ácido borónico o un derivado del ácido borónico. Los azúcares apropiados pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa ó cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, la porción percibida puede ser glucosa en donde la porción de percepción química es ácido borónico o un derivado de ácido borónico. En algunas modalidades, cada vesícula biocompatible puede tener solamente una clase de ácido borónico o derivado de ácido borónico unido al mismo. En otras modalidades, cada vesícula biocompatible puede tener una clase de ácido borónico o derivado de ácido borónico unido al mismo o más de una clase de ácido borónico unido a su superficie. En donde los diferentes derivados de ácido borónico se unen a cada vesícula biocompatible, las reticulaciones formadas por los diferentes derivados de ácido borónico pueden tender diferentes resistencias. El grado de penetración de las
reticulaciones y la proporción de liberación del compuesto terapéutico puede depender del número de reticulaciones moderadas, débiles y fuertes presentes.
Las vesículas biocompatibles, las porciones de percepción químicas, las porciones percibidas, y las reticulaciones formando la composición de vesícula pueden colocarse en cualquier número de formas. Las vesículas biocompatibles pueden tener múltiples porciones unidas, las porciones siendo porciones de percepción química, porciones percibidas, o ambas. Alternativamente, las vesículas biocompatibles cada una puede tener solamente una porción unida, ya sea una porción de percepción química o una porción percibida. También, las vesículas biocompatibles cada una puede tener cualquier número de porciones unidas con algunas vesículas biocompatibles teniendo una porción unida y otras vesículas biocompatibles teniendo más de una poción unida. En algunas modalidades, las vesículas biocompatibles pueden tener ambas porciones de percepción químicas y las porciones percibidas unidas a la misma vesícula biocompatible. En una modalidad, las vesículas biocompatibles cada una teniendo solamente porciones de percepción química o solamente porciones percibidas unidas. Las composiciones de vesícula apropiadas pueden comprenderse de tan poco como dos vesículas biocompatibles. Las composiciones de vesícula biocompatibles también pueden comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 10e vesículas biocompatibles. En una modalidad, la composición de vesícula puede comprender entre aproximadamente 102 y aproximadamente 107 de vesículas biocompatibles. En una modalidad, la composición de vesículas puede comprender entre aproximadamente 103 y aproximadamente 107 vesículas biocompatibles. Las porciones unidas a las vesículas biocompatibles pueden colocarse en cualquier geometría que permitirá a las reticulaciones formarse y penetrarse entre las porciones de percepción química y las porciones percibidas. Las porciones percibidas o de percepción química pueden colocarse en la vesícula biocompatible en cualquier geometría. En algunas modalidades, las porciones se espaciarán igualmente cerca de la vesícula biocompatible. En otras modalidades, las porciones se unirán a la vesícula biocompatible en un diseño aleatorio. Sin importar la geometría de las partículas biocompatibles, las porciones unidas y las reticulaciones que forman, la composición de vesícula
puede asumir una geometría doblada o de otra manera aglomerada. En algunas modalidades, la composición de vesícula puede tener un diámetro en el rango de desde aproximadamente 0.1 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros. En una modalidad, la composición de vesícula puede tener un diámetro en . el rango de desde aproximadamente 0.5 micrómetros a aproximadamente 30 micrómetros. En una modalidad, la composición de vesícula puede tener un diámetro en el rango de desde aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 20 micrómetros.
La composición de vesícula puede ser apropiada para inyección dentro de un paciente. Un método para medir la idoneidad para inyección es para probar el grado de inflamación causada por una composición de lípidos PEG comprendiendo la porción de percepción química. Una medida para el grado de inflamación es una prueba de proteína NF- ß. En una modalidad, la composición de lípidos PEG comprendiendo la porción de percepción química probada usando una prueba NF-?ß resulta en un PCC de menos de aproximadamente 0.2. En una modalidad, cuando la concentración de la composición de lípidos PEG comprendiendo la porción de percepción química esté en el grado de desde aproximadamente 40 nM a 160 nM, por ejemplo, aproximadamente 80 nM, el PCC entre la fracción citoplásmica y nuclear de la molécula NF-?ß es menos de aproximadamente 0.2, por ejemplo menos que aproximadamente 0.1. En una modalidad, la composición de lípidos PEG comprendiendo la porción de percepción química puede ser capaz de causar menos inflamación que la molécula sola de porción de percepción química, como se mide por la prueba de translocación NF-?ß.
Otro método para medir la idoneidad para inyección de la composición de vesícula es para medir la toxicidad celular de la porción de percepción química. La composición de vesícula es para medir la toxicidad celular de la porción de percepción química. La composición de vesícula es apropiada para inyección si la porción de percepción química se caracteriza como dando elevación a más de aproximadamente 82% de la supervivencia celular como se mide de acuerdo con una prueba de proliferación celular MTT. La porción de percepción química puede caracterizarse para
elevarse a más de 82% de la supervivencia celular como se mide de acuerdo con una prueba de proliferación celular MTT, cuando la porción de percepción química se dosifica en una concentración en el rango de desde aproximadamente 40 nM a aproximadamente 60 nM.
En otra modalidad, se proporciona un método para administrar un compuesto terapéutico a un paciente en necesidad del mismo, el método comprendiendo inyectar una composición de vesícula parentalmente dentro del paciente, la composición de vesícula incluyendo un compuesto terapéutico y liberando el compuesto terapéutico dentro del paciente en respuesta a un evento de activación. La composición de vesícula puede comprenderse de un compuesto terapéutico, vesículas biocompatibles, una o más porciones de percepción químicas. En una modalidad, el evento de activación es sintomático de la conducción observada para tratarse por el compuesto terapéutico. En una modalidad, el evento de activación puede ser la presencia de la porción percibida libre en el ambiente fisiológico. En algunas modalidades, un incremento en la concentración de la porción percibida libre en el ambiente fisiológico puede resultar en la liberación del compuesto terapéutico.
En una modalidad, el método puede comprender administrar una composición de vesícula en donde el sensor químico es un ácido borónico o derivado del ácido borónico, la porción percibida es un azúcar y el compuesto terapéutico es insulina. En una modalidad, los derivados del ácido borónico pueden incluir fenilboroatos, piridilboronatos y ciclohexilboronatos. En una modalidad, el derivado del ácido borónico puede ser ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenil borónico; ácido 2,4-diclorofenilborónico; ácido 4-aminocarbonilfenilborónico; ácido 3-clorofenilborónlco; ácido 4-hidroxifenilborónico; ácido 4-propilfenilborónico; ácido 3-[(E)-2-nitrovinil)fenilborónico; anhídrido 4-clorocarbonilfenilborónico; ácido ciclopenten-1-il borónico; ácido 2-bromopir¡dina-3-borónico; ácido 2,4-d¡tert-butoxipirimid¡n-5-ilborónico; ácido 2,4-bis(benc¡loxi)pirimidina-5-borón¡co; ácido 5-fenil-2-tienilborónico; ácido 5-formiltiofeno-3-borónico o cualquier combinación de los mismos. En modalidades en las cuales la porción de percepción química es un ácido borónico o un derivado del ácido borónico, la porción percibida puede ser un azúcar. Los azúcares ejemplarizadores
pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, en donde la porción de percepción química es ácido borónico o un derivado del ácido borónico, la porción percibida es glucosa. En algunas modalidades, cada vesícula biocompatible tiene solamente una clase de ácido borónico o derivado de ácido borónico unido al mismo. En otras modalidades, cada vesícula biocompatible tiene una clase de ácido borónico o derivado del ácido borónico unido al mismo o más de una clase de ácido borónico unido al mismo. En donde los diferentes derivados del ácido borónico se unen a ciada vesícula biocompatible, las reticulaciones formadas por los diferentes derivados del ácido borónico pueden tener diferentes resistencias. El grado de penetración de las reticulaciones y la proporción de liberación del compuesto terapéutico pueden depender de las reticulaciones débiles, fuertes y moderadas presentes.
En una modalidad, el evento de activación puede ser hiperglicemia dentro dél paciente.: En algunas modalidades, un incremento en la concentración de glucosa en el ambiente 'fisiológico en el paciente puede activar la liberación del compuesto terapéutico. En otras modalidades, un incremento en la concentración de azúcar en el ambiente fisiológico en el paciente puede activar un incremento en el compuesto terapéutico liberado de la composición de vesícula. En aún otras modalidades, la presencia de azúcar en el ambiente fisiológico puede activar la liberación del compuesto terapéutico en una cantidad proporcional a esa del azúcar. En una modalidad, el azúcar puede ser glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad, el azúcar es glucosa. En algunas modalidades, el evento de activación puede ser cuando la concentración de azúcar en el ambiente fisiológico en el paciente es mayor que aproximadamente 100 mg/dL.
En una modalidad, la composición de vesícula puede administrarse entre dos veces en un día una vez a la semana, para una duración indefinida de días. En una modalidad, la composición de vesícula puede administrarse una vez por día, por una duración indefinida de días. En algunas
modalidades, la composición de vesícula puede además caracterizarse como siendo comprendida de vesículas aglomeradas.
En una modalidad, se proporciona un método para tratar una condición médica, el método comprendiendo administrar una composición de vesícula en un paciente en necesidad de tratamiento, la composición de vesícula siendo cargada con un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente en necesidad del mismo, y la liberación del compuesto terapéutico dentro del paciente en respuesta a un evento de tratamiento. La composición de vesícula puede comprender vesículas bíocompatibles, una o más porciones de percepción química, una o más porciones de percepción y reticulaciones entre las porciones de percepción química y las porciones percibidas. La composición de vesícula puede comprender una aglomeración de vesículas bíocompatibles. La composición de vesícula puede administrarse por cualquier medio apropiado, incluyendo por ejemplo, mediante inyección. Alternativamente, la composición de vesícula puede administrarse por bomba o inhalación. En una modalidad, la composición de vesícula puede administrarse dos veces en un día una vez a la semana por una duración indefinida de días. En una modalidad, la composición de vesícula puede administrarse una vez por día, por una duración indefinida de días.
Los métodos descritos en este documento pueden incluir administrar una composición de vesícula en donde el sensor químico es un ácido borónico o derivado del ácido borónico, la porción percibida es un azúcar, y el compuesto terapéutico es insulina. Los derivados del ácido borónico pueden incluir fenilboronatos, piridilnoronatos y cíclohexiboronatos. En otra modalidad, el derivado del ácido borónico puede comprender ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenil borónico; ácido 2,4-diclorofenilborónico; ácido 4-aminocarbonilfenilborónico; ácido 3-clorofenílborónico; ácido 4-hidroxifenilborónico; ácido 4-propilfenilborónico; ácido 3-[(E)-2-nitrovinil)fenilborónico; anhídrido 4-clorocarbonilfenilborónico; ácido ciclopenten-1-il borónico; ácido 2-bromopiridina-3-bórónico; ácido 2,4-ditert-butoxipirimidin-5-ilborónico; ácido 2,4-bis(benciloxi)pirimidina-5-borónico; ácido 5-fenil-2-tienilborónico; ácido 5-formiltiofeno-3-borónico o cualquier combinación de los mismos. En
modalidades en las cuales la porción perceptible química es un ácido borónico o un derivado del ácido borónico, la porción percibida puede comprender un azúcar. Los azúcares ejemplarizadores pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de los mismos. En una modalidad en donde la porción perceptible química es ácido borónico o un derivado del ácido borónico, la porción perceptible comprende glucosa. En algunas modalidades, cada vesícula biocompatible puede comprender solamente una clase de ácido borónico o derivado de ácido borónico unido al mismo. En otras modalidades, cada vesícula biocompatible puede tener una clase de ácido borónico o derivado de ácido borónico unido al mismo o más de una clase de ácido borónico unido al mismo. En donde los diferentes derivados del ácido borónico se unen a cada uno de la vesícula biocompatible, las reticulaciones formadas por los diferentes derivados del ácido borónico pueden tener diferentes resistencias. El grado de penetración de las reticulaciones y la proporción de la liberación del compuesto terapéutico puede depender del número de reticulaciones fuertes, débiles y moderadas presentes.
Las composiciones de vesícula también pueden incluir un mecanismo de señalización. El mecanismo de señalización puede ser cualquier método para dirigir la composición de vesícula a un destino específico dentro del cuerpo del paciente. En una modalidad, el mecanismo de señalización puede ser un receptor celular, un anticuerpo, un biomarcador o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, la composición de vesícula puede incluir un agente de contraste, un agente de diagnóstico o ambos.
Un número de condiciones médicas pueden tratarse por los métodos de la inventiva, incluyendo las enfermedades metabólicas. Los ejemplos de las enfermedades metabólicas pueden incluir cualquier condición médica relacionada con el metabolismo del cuerpo, especialmente la diabetes. Un compuesto terapéutico o para tratar la diabetes (es decir, insulina y sus variantes) es capaz de sostener los niveles normoglicémicos por 24-72 horas. Un nivel normoglicémico de azúcar en el flujo sanguíneo es típicamente aproximadamente 126 mg/dl.
Los métodos de la invención también pueden usarse para tratar infecciones pulmonares. Cuando los métodos de la invención son tratamientos para la infección pulmonar, el compuesto terapéutico puede ser un antibiótico. El antibiótico puede ser cualquier antibiótico apropiado para tratar la infección pulmonar. En modalidades la condición médica tratada fue la infección pulmonar, el compuesto terapéutico puede ser por ejemplo, ciprofloxacino.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 . Prueba de inflamación NF-?? para inflamación.
El potencial inflamatorio de varios compuestos del ácido borónico se estudiaron mediante medir la translocación nuclear de las células NF-?? HeLa mediante inmunocitoquímica y microscopía de alto contacto completamente alta. 15,000 células HeLa se colocaron en placas de 96 pozos la noche antes de los experimentos. En el día de los experimentos, las células se trataron con ácidos borónicos (Tabla 1 posterior) en tres diferentes concentraciones (40 nM, 80 nM y 160 nM) por 2 horas. Al final de la incubación, las células se lavaron con solución salina estabilizada con fosfato (PBS) y se fijaron en 4% de paramaldehído por 15 minutos y se permeabilizaron con 0.01% de Tritón X-100 en PBS por 10 minutos. Las células se lavaron con PBS tres veces. Los sitios no específicos se bloquearon con 5% de albúmina en suero de bovino (BSA) en PBS y se incubaron con el anti NF-?? por 1 hora, seguido por la incubación con anticuerpo secundario marcado con (FITC) de isotiocianato de fluoresceína. Después de lavar las células al final de la incubación, las células se trataron con 4'-6-diamidino-2-fenil¡ndola (DAPI) por 1 minuto y se conservaron a 4°C hasta después del análisis. Las imágenes de las células fueron adquiridas con un sistema de microscopio completamente alto automatizado Beckman-Coulter 100 y se analizó usando el programa Cytseer (Vala Sciences, CA). La co-localización de NF-?? se cuantificó mediante medir el PCC entre la fracción citoplásmica y nuclear de la molécula NF-??. El PCC es una medida de la superposición entre las intensidades de píxeles de las imágenes nucleares y NF-KB de la misma célula. Los valores PCC pueden oscilar desde -1 a 1. Una correlación positiva (valor PCC) indica la translocación nuclear de NF-KB. Una correlación negativa (valor PCC negativo) indica una ausencia de la translocación nuclear.
La Figura 4 muestra imágenes representativas de las células HeLa ilustrando el efecto del tratamiento del ácido borónico en la localización citoplásmica o nuclear de NF-??. DAPl se muestra mediante círculos blancos, mientras NF-?? se representa por gris claro. Los circuios blancos circundados por gris claro indicando el NF-?? citoplásmico, mientras la obliteración de los circuios bancos por la señal gris en el núcleo indica el NF-?? nuclear. (A) UTC, NF-?? citoplásmico; (B) control positivo, translocación nuclear de NF-?? en las células tratadas con LPS; (C) Tratamiento con ácido 2,4-di(tert-butoxi)pirimidina-5-il-borónico (80 nM, 2 horas), predominantemente NF-KB citoplásmico y (D) tratamiento con ácido 5-isoquinolinaborónico (80 nM, 2 horas), predominantemente NF-?? nuclear.
La Figura 5 demuestra el PCC entre las fracciones citoplásmicas y nucleares de la molécula NF-?? en las células HeLa tratadas con ácido 4-amínocarbonilfenilborónico libre (barra oscura), ácido 3-aminofenilborónico, ácido 5-amino-2,4-difluorofenilborónico, ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico y ácido 4-aminopirimidinaborónico así como cada uno de los derivados del ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara) como se compara con un UTC y LPS. Sorpresivamente, el conjugado del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico fue menos inflamatorio que el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre.
La Tabla 1 y la Tabla 2 listan los resultados PCC para varios derivados del ácido borónico. La Tabla 2 muestra la estructura, la afinidad de unión de glucosa, el porcentaje de sobrevivencia de las célula HeLa en 80 nM y PCC entre las fracciones citoplásmicas y nucleares de la molécula NF-?? en las células HeLa en 80 nM de varios derivados del ácido borónico.
Tabla 1
Tabla 2
Ejemplo 2. Prueba MTT para citotoxicidad
La citotoxicidad de los derivados del ácido borónico de la Tabla 1 se estudió mediante la prueba MTT. 15,000 células HeLa se colocaron en placas de 96 pozos la noche antes de los experimentos. En el día de los experimentos, las células se trataron con derivados de ácidos borónicos en tres diferentes concentraciones (40 nM, 80 nM y 160 nM) por 2 horas. Al final de la incubación, las pruebas MTT (equipo de prueba basada en toxicología MTT In vitro, Sigma Aldrich, MO) se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.
La Figura 6 demuestra las fracciones supervivientes de las células HeLa tratadas con ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre (barra oscura), ácido 3-aminofenilborónico, ácido 5-amino-2,4-
dilfuorofenilborónico, ácido 3-fluoro-4-am¡nometilfenilborónico y ácido 4-aminopirimidinoborónico así como cada uno de aquellos derivados del ácido borónico como conjugados del DSPE-PEG-COOH (barra clara) como se compara con un UTC y LPS. Sorpresivamente, el conjugado del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico fue menos citotóxico que el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre.
La Tabla 1 y la Tabla 2 listan la proporción de supervivencia celular para varios derivados del ácido borónico.
Ejemplo 3. Prueba de Enlace
La afinidad de enlace de los derivados del ácido borónico para la glucosa se determinó mediante la prueba de competición usando ConcanavalinA (ConA) como el estándar competitivo y variando las concentraciones de los derivados del ácido borónico. Los lechos magnéticos carboxi terminados se activaron por la suspensión de los lechos en 100 mM de estabilizador de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) (pH 4.5). La glucosamina (100 mg/ml) se conjugó para los lechos magnéticos activados usando carbodiimida acoplada con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) como un reticulador. La reacción de conjugación se llevó a cabo en una placa de 96 pozos. La reacción se corrió por 24 horas. Los lechos se separaron mediante colocar la microplaca en un separador magnético y se lavaron completamente con PBS en pH 7.2 para remover la glucosa no unida, exceso de EDC y W-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS).
Los lechos terminados de glucosa se co-incubaron por 1 horas con 2.4 µ? ConA (un enlazante conocido de carbohidratos) fluorescentemente marcados con isotiocianato de fluoresceína (ConA-FITC), y graduados con concentraciones oscilando desde 2.5 µ? a 20 µ? de cada derivado de ácido borónico probado. Los siguientes controles se usaron: (A) lechos magnéticos carboxi-terminados (no conjugados a glucosa) se trataron con ConA-FITC para determinar el enlace no específico y (B) los lechos conjugados de glucosa se trataron con una alta concentración de ConA no fluorescente para determinar el enlace máximo.
Los pozos se lavaron tres veces con PBS en pH 7.2 para remover los derivados del ácido borónico no unido y el FITC-ConA. Los lechos se re-suspendieron en PBS y se agitaron por 15 minutos a ta antes de medir la fluorescencia FITC (excitación: 495 nm, emisión superior: 520 nm, 6 vasos por pozo, promedio de n=3 pozos en un lector de microplaca Flexstation II384 para cuantificar la cantidad de glucosa unida a los ácidos borónicos). La intensidad de la fluorescencia se midió y se usó como una indicación de la cantidad de enlace ConA a la superficie de los lechos o [ConAs]. La interacción ConA-azúcar se esperaba que se inhibiera por los derivados del ácido borónico, que pueden unir las moléculas de azúcar y desplazar la unión ConA-FITC, por lo tanto causando una disminución de la intensidad de la fluorescencia de la mezcla.
La constante de unión de los derivados del ácido borónico se calculó de la intensidad de fluorescencia. La. reducción de la intensidad de fluorescencia se relaciona a [ConAs] por la Ecuación 2.
La relación entre [CosA] y la cantidad de ácido borónico [BA] se proporciona por la
Ecuación 3.
El re-arreglo simple produce la Ecuación 4, de la cual la proporción de las dos constantes de equilibrio ( ????/???) puede derivarse.
[RA] Kü onA
[ConAs] S, [ConAjS, KCIBA EC. 4
La concentración de los sitios de azúcar (S1 ) puede calcularse de la intercepción de un esquema de 1 /[ConAs] vs 1/[BA].
La Figura 7 muestra un esquema representativo para el cálculo de la constante de unión para el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico.
La Tabla 1 lista las afinidades de unión de azúcar relativas (log(KConA KBA)) de los varios derivados del ácido borónico comparadas con el ConA.
La Tabla 2 muestra la estructura y la afinidad de la unión de glucosa (M"1) para varios derivados del ácido borónico.
Ejemplo 4. Síntesis de los conjugados del ácido lípido-PEG-enlazante-borónico
Todos los conjugados de azúcar y el ácido lípido-PEG-enlazante-borónico se prepararon mediante acoplar el derivado amina del ácido borónico-enlazante o las porciones de azúcar con DSPE-PEG-COOH usando química de carbodiimida. En general, 50 mg de DSPE-PEG-COOH se disolvieron en 2 mL de dimetilformamida anhídrida (DMF), seguida por la adición de EDC (2.0 equivalentes) y N-Hidroxisuccinimida (NHS) (3.0 equivalentes) y la mezcla se.permitió agitar por 30 minutos a ta. El derivado de amina del ácido borónico o el azúcar se agregaron y la mezcla de reacción se permitió agitar durante la noche. Para las aminas obtenidas en la forma de la sal de amonio, estas fueron desaladas mediante agitarse en 500 pL de DMF y 35 pL de trietilamina por 30 minutos a ta antes de la adición a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se diluyó con 4 mL de estabilizador MES (50 mM, pH 4.18), transferida en una cinta de diálisis 3K MWCO y se dializó de nuevo dos veces en contra de 2 L de agua, seguido por el secado por congelación para obtener el conjugado deseado. La identidad y la pureza del producto final se confirmaron por 1H de espectrometría NMR:
Ejemplo 5. Síntesis de liposomas funcionalizadas con azúcar/ácidos borónicos v suslconiuqados.
Síntesis de los conjugados de fosfolípidos-polietilenglicol-giclosilo. Las especies lípidos-PEG-Glicosil se sintetizaron mediante la conjugación del grupo carboxilo de DSPE-PEG-COOH para el grupo amino de glucosamina, galactosamina y manopiranósido usando la química de
acoplamiento carbodiimida descrita en G. T. Hermanson, Técnicas de Bioconjuigado, Academia Press, Elsevier Science EUA (1996) 169-185, incorporado en este documento como referencia. El acoplamiento se realizó en la posición C2 de las moléculas de azúcar, por lo tanto conservando las posiciones C3, C4 y C5 sin modificarse.
Carga de los liposomas con insulina. La insulina recombinante humana se disolvió en estabilizador de citrato (100 mM, ph 2.5) a una concentración de 105 mg/ml. Los lípidos (56.4 moles % DPPC, 40 moles % de colesterol y 1 .2 moles % de cada uno de DSPE-PEG-Glucosa, DSPE-PEG-Galactosa, DSPE-PEG-Manopiranosido) se disolvieron en etanol y se hidrataron con la solución de insulina a 50°C por 15 minutos. La concentración de lípidos finales fue 50 mM. La mezcla hidratada se pasó ocho veces a través de una membrana de lista etch de 400 nm de nucleoporo a 50°C en una presión de 100 psi. Las liposomas madres tuvieron un diámetro medio de 244.1 nm (diámetros de liposoma promedio apropiados pueden ser desde aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm) y una concentración de lípidos de aproximadamente 50 mM. La insulina se encapsuló por la carga pasiva. El pH de la formulación liposomal se mantuvo en 5.6 (punto isoeléctrico de la insulina). Los liposomas se dializaron en contra del estabilizador de citrato (100 nM, pH 5.6) para remover la insulina no encapsulada. En este ejemplo,' la insulina no encapsulada se remueve para mitigar o prevenir la insulina de tener un efecto inmediato y tal vez innecesario en el ambiente fisiológico. En algunas modalidades, la composición de vesícula se intenta para liberar y/o proporcionar insulina primeramente o solamente en respuesta a la presencia de una cantidad de inicio de glucosa en el ambiente fisiológico del paciente (es decir, teniendo un efecto de "respuesta de la glucosa") tal como cuando el paciente está experimentando una condición hiperglicémica. En el presente ejemplo, la insulina encapsulada estuvo presente en una concentración de aproximadamente 15 mg/ml, aunque se contempla que la concentración de la insulina encapsulada puede ser aproximadamente la misma como o puede ser menos que o mayor que la concentración inicial de insulina. La insulina no encapsulada puede estar presente en una concentración de aproximadamente 0% -5% de la insulina encapsulada o más de aproximadamente 0.75 mg/ml, aunque concentraciones mayores de insulina no encapsulada
pueden ser aceptables o preferidas, dependiendo de la necesidad del paciente y él medio por el cual la composición de vesícula se introduce en el ambiente fisiológico del paciente.
Síntesis de conjugados del derivado del ácido glicol-borónico fosfolípido-polietileno. El ácido lípido-PEG-borónico se sintetizó mediante conjugar el grupo carboxilo de DSPE-PEG-COOH a las porciones del ácido borónico usando la química de acoplamiento carbodiimida descrita en G.T. Hermanson, Técnicas Bioconjugadas, Academia Press. Elsevier Science EUA (1996) 169-185, incorporada en este documento como referencia. La composición de lípidos para la liposoma funcionalizada del ácido borónico fue la siguiente: 56.4 mol % DPPC, 40 mol % de colesterol y 3.6 mol % del ácido DSPE-PEG-borónico.
Las especies del conjugado derivado del ácido lípido-PEG-borónico representativo incluyen:
1.
Conjugado del ácido 3-aminofenilborónico. Característica H NMR picos: 8 ppm 7.98 (s, 1 H), 7.59 (d, 1 H), 7.31 (d, 1 H), 7.03 (t, 1 H), 5.33 (s, 1 H, NH), 5.21 (s, 2H, NH), 1.55 (t, 3H), 1.49 (t,3H).
Conjugado del ácido 3-Fluoro-4-aminometilfenilborónico. Característica: H NMR (300 MHz, acetona-d6) picos: 8 ppm 8.15 (d, 1 H), 8.00 (dd, 1 H), 7.90 (m,' 1 H), 5.70 (s, 1 H, NH), 5.50 (s, 1 H, NH), 1.55 (t, 3H), 1.40 (t, 3H).
Conjugado del ácido 4-aminopirimidilborónico. Característica: 1H NMR (300 MHz, acetona-d6) picos: 8 ppm 7.85 (s, 2H), 5.25 (s, 1 H, NH), 5.20 (s, 2H, NH), 1 .40 (t, 6H).
Conjugado del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico. Característica: 1H NMR (300 MHz, acetona d6) picos: 8 ppm 7.85 (d, 2H), 7.80 (d, 2H), 5.30 (s, 1 H, NH), 5.25 (s, 2H, NH), 1 .40 (t, 6H).
Ácido 5-Amino-2,4-difluorofenilborónico.
Los procesos de carga de insulina, extrusión y purificación fueron similares para esos usados para las liposomas de azúcar anteriormente descritas. La liposoma tuvo un diámetro medio de 184 ± 0.162 nm (los diámetros de liposoma promedios pueden ser desde aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm). La insulina encapsulante estuvo presente en una concentración de aproximadamente 15 mg/mL.
Preparación de composiciones de vesícula. Dos clases de formulaciones de liposomas cargadas con insulina, funcionalizadas con moléculas de azúcar o derivados del ácido borónico, se
mezclaron y agitaron a ta para formar las composiciones de vesícula. Las mezclas se prepararon usando varios ratios de moles de las especies de azúcar para las especies del ácido borónico en la superficie externa de las liposomas oscilando desde 1 :2 a 1 :50 para determinar el exceso de ácidos borónicos requeridos para la formación de la composición de vesícula. El pH de la mezcla también se varió entre 7 y 11 , para seleccionar las composiciones que se forman en el pH fisiológico.
Tabla 3
Confirmación de la reticulación química del ácido borónico y las porciones de azúcar. Para conformar que las composiciones de vesícula se formaron por la reticulación química del ácido borónico y las porciones de azúcar, los aglomerados se expusieron a 10 mM de glucosa. Los aglomerados se penetraron rápidamente en la presencia de glucosa, debido a la unión competitiva de los ácidos borónicos con la glucosa libre. Esto se demostró por el incremento en la frecuencia de las partículas dimensionadas bajo 1 pm desde 13% a 37% en la incubación con glucosa.
Ejemplo 6. Liberación in vitro de la insulina de las composiciones de vesícula de azúcar-boronato
Un volumen pequeño (500 µ?) de los aglomerados se cargaron dentro de una membrana de diálisis tubular (100,000 MWCO), sellada con sujeciones, y se dializo en contra de una solución PBS (pH 7.4) por 30 minutos antes de la penetración con glucosa para monitorear la difusión
pasiva de la insulina sin el activador. Esto se siguió mediante la adición de la solución de glucosa para los aglomerados dentro de la membrana en intervalos regulares para penetrar las composiciones de vesícula y activar la liberación de la insulina. Las alícuotas se removieron de la fase externa cada 15 minutos y la concentración de insulina se probó mediante la lectura de la absorbencia en 214 nm. La prueba se continuó por varias horas para verificar la detención en la liberación de la insulina encapsulada.
La Figura 8 ¡lustra los esquemas de liberación cumulativos para cuatro diferentes composiciones de vesícula de glucosa-boronato (ácido 4-aminocarbonilfenilboróriico, ácido 3-aminofenilborónico, ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico y ácido 5-amino-2,4difluorofenilborónico) en la ausencia del activador de glucosa. La composición de vesícula del ácido 3-aminofenilborón¡co y la composición de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico liberó 12% y 17% de su contenido de insulina, respectivamente.
La liberación de insulina de la composición de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico en la adición de varias concentraciones del activador de glucosa se probó por varias horas. Las concentraciones del activador se seleccionan para imitar los niveles de glucosa en la sangre en condiciones normoglicémicas e hiperglícemicas. Una prueba de control también se realizó en donde la composición de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico se activa con el PBS en lugar de la glucosa. La composición de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico exhibió una liberación de estallido de la insulina dentro de dos, minutos después de la introducción del activador de glucosa. La proporción de liberación disminuye en el tiempo hasta que otra dosis de glucosa se agrega, lo cual actúa un nuevo episodio de liberación de estallido. En este ejemplo, la concentración mínima de glucosa requerida para la penetración de la composición de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico y la liberación de insulina fue de 10 mmol/L, lo cual corresponde a un nivel de glucosa en la sangre de 1580 mg/dl. No se observó liberación de estallido de la insulina cuando la composición de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico se activó con los análogos de las concentraciones de glucosa para
hipoglicemia (aproximadamente 9 mg/dl) o normoglicemia (aproximadamente 126 mg/dL), demostrando que el ejemplo de la composición de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico es apropiado para mantener los niveles de glucosa en la sangre normales. También, la proporción de liberación de insulina de estas composiciones de vesícula es dependiente de la concentración de glucosa, por lo tanto haciendo las presentes modalidades útiles en la mitigación y evitando el hiper-insulinismo.
La Figura 9 ilustra esquemas (a) cumulativos y (b) diferenciales de la liberación de la insulina de las composiciones de vesícula del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico (AVT ácido 4-aminocarbonilfenilborónico) activado con 5 mM, 7 mM y 10 mM de glucosa, como se compara para activarse con 5 mM, 7 mM y 10 mM de PBS.
La Figura 10 ilustra esquemas (a) cumulativos y (b) diferenciales de la liberación de insulina del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico y las composiciones de vesícula ConA activadas con 10 mM, 30 mM y 40 mM de glucosa.
Aquellos expertos en la técnica apreciarán que numerosos cambios y modificaciones pueden hacerse a las modalidades descritas en este documento y que dichos cambios y modificaciones pueden hacerse sin apartarse del espíritu de la invención. Esto es, por lo tanto intentado para que las reivindicaciones anexas cubran todas dichas variaciones equivalentes para que caigan dentro del alcance y espíritu verdadero de la invención.
Claims (22)
1. Una composición de vesícula, comprendiendo: (A) una primera composición de liposoma comprendiendo: (1 ) un primer fosfolípido; (2) colesterol y (3) un conjugado derivado del ácido fosfolípido-polietilenglicol-borónico, en donde la primera composición de liposoma encapsula un primer compuesto terapéutico y (B) una segunda composición de liposoma comprendiendo: (1 ) un segundo fosfolípido; (2) colesterol y (3) un conjugado fosfolípido-propilenglicol-glicosilo, en donde la segunda composición de liposoma encapsula un segundo compuesto terapéutico.
2. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el conjugado derivado del ácido fosfolípido-polietilenglicol-borónico comprende: una porción fosfolípida; una porción de polietilenglicol y una porción derivada del ácido borónico.
3. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 2, en donde la porción derivada del ácido borónico comprende una porción del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico.
4. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el conjugado derivado del ácido fosfolípido-polietilenglicol-borónico comprende: en donde n = 30-60.
5. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación í, en donde el conjugado fosfolípido-polietilenglicol-glicosilo comprende: una porción fosfolípida, una porción de polietilenglicol una porción de glicosilo.
6. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 5, en donde la porción de glicosilo comprende una porción de glucosilo.
7. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 5, en donde la porción de glicosilo comprende una porción de galactosilo.
8. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 5, en donde la porción de glicosilo comprende una porción de manopiranosidilo.
9. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el primer compuesto terapéutico y el segundo compuesto terapéuticos cada uno comprende insulina.
10. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 1 , en donde al menos una de la primera y la segunda composición de liposoma libera una cantidad de su compuesto terapéutico respectivo en respuesta a una presencia de un azúcar.
11. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 10, en donde la cantidad del compuesto terapéutico respectivo liberado es dependiente de una concentración del azúcar.
12. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el primer compuesto terapéutico y el segundo compuesto terapéutico con los mismos.
13. Una composición de vesícula útil en el tratamiento de la diabetes, comprendiendo: (A) una primera composición de liposoma comprendiendo: (1 ) un primer fosfolípido; (2) colesterol y (3) un conjugado derivado del ácido fosfolípido-polietilenglicol borónico comprendiendo una porción derivada del ácido borónico que es menos citotóxica y/o menos inflamatoria que la porción derivada del ácido borónico en su forma libre, en donde la primera composición de liposoma encapsula la insulina y (B) una segunda composición de liposoma comprendiendo: (1 ) un segundo fosfolípido; (2) colesterol y (3) un conjugado fosfolípido-polietilenglicol-glicosilo comprendiendo una porción de glicosilo comprendiendo una porción de glucosilo, una porción galactosilo o una porción manopiranosidilo, en donde la segunda composición de liposoma encapsula la insulina.
14. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 3, en donde el conjugado derivado del ácido fosfolípido-polietilenglicol borónico comprende una porción del ácido 4-aminocarbonilfenilborónico.
15. La composición de vesícula de conformidad con la reivindicación 13, en donde la porción derivada del ácido borónico del conjugado derivado del ácido fosfolípido-polietilenglicol borónico y la porción glicosilo del conjugado fosfolípido-polietilenglicol glicosilo se unen covalentemente uno con otro.
16. Una composición capaz de ser inyectada a un paciente, comprendiendo: (A) una primera liposoma, comprendiendo: (1 ) DPPC; (2) colesterol y (3) un conjugado derivado del ácido DSPE-PEG-borónico, en donde la primera liposoma encapsula la insulina y (B) una segunda liposoma comprendiendo: (1 ) DPPC; (2) colesterol (3) un conjugado DSPE-PEG-glucosilo; (4) un conjugado DSPE-PEG-galactosilo y (5) un conjugado DSPE-PEG-manopiranosidilo, en donde la segunda liposoma encapsula la insulina.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde la primera liposoma comprende: (1 ) 40-70 moles de % de DPPC; (2) 20-50 moles de % de colesterol y (3) 1-15 moles de % del conjugado derivado del ácido DSPE-PEG-borónico.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde la primera liposoma comprende: (1 ) aproximadamente 56.4 moles de % de DPPC; (2) aproximadamente 40 moles de % de colesterol y (3) aproximadamente 3.6 moles de % del conjugado derivado del ácido DSPE-PEG-borónico.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde la segunda liposoma comprende: (1 ) 40-70 moles de % de DPPC; (2) 20-50 moles de % de colesterol; (3) 1-15 moles de % del conjugado DSPE-PEG-glucosilo, (4) 1.15 moles de % del conjugado DSPE-PEG-galactosilo y (5) -15 moles de % del conjugado derivado del ácido DSPE-PEG-manopiranosidilo.
20. - La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde la segunda liposoma comprende: (1 ) aproximadamente 56.4 moles de % de DPPC; (2) aproximadamente 40 moles de % de colesterol; (3) aproximadamente 1.2 moles de % del conjugado DSPE-PEG-glucosilo, (4) aproximadamente 1.2 moles de % del conjugado DSPE-PEG-galactosilo y (5) aproximadamente 1.2 moles de % del conjugado derivado del ácido DSPE-PEG-manopiranosidilo
21. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde una molécula del conjugado derivado del ácido DSPE-PEG-borónico de la primera liposoma se une covalentemente a al menos una de una molécula del conjugado DSPE-PEG-glucosilo, el conjugado DSPE-PEG-galactosilo y el conjugado DSPE-PEG-manopiranosidilo de la segunda liposoma. ,
22. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde al menos una de la primera y la segunda liposomas libera una cantidad de insulina en respuesta a una presencia de glucosa.
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