ES2913069T3

ES2913069T3 - Composiciones de vesículas

Info

Publication number: ES2913069T3
Application number: ES12751825T
Authority: ES
Inventors: Ananth Annapragada; Indrani Dasgupta; Eric Tanifum; Mayank Srivastava; Mostafa Analoui
Original assignee: University of Texas System; Sensulin LLC
Current assignee: University of Texas System; Sensulin LLC
Priority date: 2011-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: JP5998158B2; CA2822021A1; MX2013004146A; US20120231067A1; KR101845281B1; EP2680822A1; US9278068B2; AU2012223210A1; BR112013022170A2; CA2822021C; BR112013022170B1; AU2012223210B2; MX345504B; EP2680822A4; US20140227349A1; KR20140074860A; US8679531B2; CN103429226A; JP2014506924A; WO2012119117A1

Abstract

Composición de vesículas que puede inyectarse a un paciente, que comprende: (A) una primera composición de liposomas, que comprende una pluralidad de lípidos, que comprende: (1) DPPC; (2) colesterol; y (3) un conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico, en la que la primera composición de liposomas encapsula la insulina; y en la que la primera composición de liposomas comprende aproximadamente el 56,4% en moles de DPPC; aproximadamente el 40% en moles de colesterol; y aproximadamente el 3,6% en moles de conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico; y (B) una segunda composición de liposomas, que comprende una pluralidad de lípidos, que comprende: (1) DPPC; (2) colesterol; (3) un conjugado de DSPE-PEG-glucosilo; (4) un conjugado de DSPE-PEG-galactosilo; y (5) un conjugado de DSPE-PEG-manopiranosidilo, en la que la segunda composición de liposomas encapsula la insulina; y en la que la segunda composición de liposomas comprende aproximadamente el 56,4% en moles de DPPC; aproximadamente el 40% en moles de colesterol; aproximadamente el 1,2% en moles de conjugado de DSPE-PEG-glucosilo; aproximadamente el 1,2% en moles de conjugado de DSPE-PEG-galactosilo; y aproximadamente el 1,2% en moles de conjugado de DSPE-PEG- manopiranosidilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de vesículas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad a la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/448.556, presentada el 2 de marzo de 2011.

Declaración con respecto a la investigación o al desarrollo patrocinados por el gobierno federal Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo R43 DK083819 otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

Antecedentes

La diabetes es una enfermedad provocada por una deficiencia de insulina o una resistencia a la insulina en el organismo. La diabetes de tipo I es una enfermedad autoinmunitaria que daña a las células beta de los islotes de Langerhans en el páncreas, lo que da como resultado una cantidad inadecuada de insulina en el organismo. Sin tratamientos con insulina, la diabetes de tipo I es mortal. La diabetes de tipo II resulta de una producción insuficiente de insulina o de la incapacidad del organismo del paciente de responder de manera apropiada a la insulina. La resistencia a la insulina asociada con la diabetes de tipo II impide la entrada de niveles adecuados de glucosa en sangre en las células para su almacenamiento como energía, lo que da como resultado hiperglucemia en el torrente circulatorio. Tradicionalmente, la diabetes de tipo I se trata mediante inyecciones subcutáneas repetidas de insulina cada día. La diabetes de tipo II también se trata con insulina, a menudo en combinación con otros medicamentos tomados por vía oral o mediante inyección. Se requieren múltiples inyecciones de insulina al día, así como la cuidadosa monitorización de los niveles de glucemia del paciente a través del control alimentario y análisis de sangre. Se usan bombas de insulina como alternativa a múltiples inyecciones diarias de insulina mediante una jeringa. Sin embargo, las bombas de insulina son costosas, deben llevarse puestas la mayor parte del tiempo y requieren análisis de sangre para determinar la cantidad de insulina que va a suministrarse al paciente. El análisis de sangre requiere la extracción de una muestra de sangre del paciente, habitualmente a partir de un dedo, y analizar la muestra de sangre para determinar la concentración de glucosa. Los sistemas de monitorización de la glucemia que están disponibles usan un sensor colocado justo debajo de la piel para monitorizar periódicamente la cantidad de glucosa en el líquido intersticial. Estos sistemas requieren calibración, lo que normalmente da como resultado dos pinchazos en el dedo al día, y son costosos. Además, existe un periodo de latencia entre la concentración de glucosa en el torrente circulatorio y la concentración de glucosa en el líquido intersticial.

El documento de Efstatios Karathanasis et al. " Glucose-sensing pulmonary delivery of human insulin to the systemic circulation of rats” International Journal of Nanomedicine, vol. 2, n.° 3, 1 de enero de 2007, páginas 501 513, ISSN: 1176-9114 se refiere a la liberación autorregulada de insulina usando un aglomerado de partículas liposómicas de tamaño nanométrico, que presentan reticulaciones que pueden escindirse por la glucosa. Tras la instilación de las micropartículas sensibles a la glucosa, los acontecimientos hiperglucémicos desencadenan una aceleración de la liberación de insulina logrando una normoglucemia poco después de detectar la glucosa sistémica elevada. Se usó concanavalina A (Con A) como agente de reticulación que se une a azúcares.

Existe la necesidad de un sistema o dispositivo que suministre cantidades controladas de insulina directamente en respuesta a concentraciones de glucosa aumentadas, sin requerir que el paciente o profesional médico monitorice continuamente el nivel de glucemia, determine la cantidad apropiada de insulina que va a inyectarse e inyecte la insulina periódicamente a lo largo del día.

Sumario

Se proporcionan composiciones de vesículas que comprenden un compuesto terapéutico. La composición de vesículas puede inyectarse a un paciente, y comprende:

(A) una primera composición de liposomas, que comprende una pluralidad de lípidos, que comprende:

(1) DPPC;

(2) colesterol; y

(3) un conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico,

en la que la primera composición de liposomas encapsula la insulina; y

en la que la primera composición de liposomas comprende

aproximadamente el 56,4% en moles de DPPC; aproximadamente el 40% en moles de colesterol; y aproximadamente el 3,6% en moles de conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico; y

(B) una segunda composición de liposomas, que comprende una pluralidad de lípidos, que comprende:

(1) DPPC;

(2) colesterol;

(3) un conjugado de DSPE-PEG-glucosilo;

(4) un conjugado de DSPE-PEG-galactosilo; y

(5) un conjugado de DSPE-PEG-manopiranosidilo, en la que la segunda composición de liposomas encapsula la insulina; y

en la que la segunda composición de liposomas comprende

aproximadamente el 56,4% en moles de DPPC; aproximadamente el 40% en moles de colesterol; aproximadamente el 1,2% en moles de conjugado de DSPE-PEG-glucosilo; aproximadamente el 1,2% en moles de conjugado de DSPE-PEG-galactosilo; y aproximadamente el 1,2% en moles de conjugado de DSPE-PEG-manopiranosidilo.

El compuesto terapéutico es insulina. Las composiciones de vesículas pueden liberar el compuesto terapéutico en respuesta a la presencia de un desencadenante externo. Las composiciones de vesículas pueden comprender una pluralidad de vesículas biocompatibles. Las vesículas biocompatibles pueden comprender un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente que lo necesita, y una o más reticulaciones entre dos o más de las vesículas biocompatibles, comprendiendo cada reticulación un resto de detección química y un resto detectado. En algunas realizaciones, el compuesto terapéutico proporciona efectos paliativos, curativos o de otro modo beneficiosos a un paciente. Las composiciones de vesículas son adecuadas para inyección a un paciente. Los aspectos adicionales de la invención son tal como se enumeran en las reivindicaciones.

También se proporcionan composiciones de vesículas para su uso en métodos para el tratamiento de un estado médico, comprendiendo los métodos administrar una composición de vesículas a un paciente que necesita tratamiento, en las que la composición de vesículas se carga con un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente que lo necesita; y liberar el compuesto terapéutico en el paciente en respuesta a un acontecimiento desencadenante.

La descripción general y la siguiente descripción detallada son únicamente a modo de ejemplo y explicativas. Otras realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica, en vista de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

En las figuras adjuntas, las fórmulas químicas, las estructuras químicas y los datos experimentales que se proporcionan, junto con la descripción detallada proporcionada a continuación, describen realizaciones de ejemplo de la invención reivindicada.

La figura 1 ilustra una realización de una composición de vesículas.

La figura 2 ilustra una realización de una composición de vesículas.

La figura 3 ilustra una realización de una composición de vesículas.

La figura 4 muestra imágenes representativas de células HeLa que muestran el efecto del tratamiento con derivado de ácido borónico sobre la localización nuclear o citoplásmica de NF-^kB.

La figura 5A demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (CCP) entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB en células HeLa tratadas con ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).

La figura 5B demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (CCP) entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB en células HeLa tratadas con ácido 3-aminofenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).

La figura 5C demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (CCP) entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB en células HeLa tratadas con ácido 5-amino-2,4-diflourofenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).

La figura 5D demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (CCP) entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB en células HeLa tratadas con ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).

La figura 5E demuestra el coeficiente de correlación de Pearson (CCP) entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB en células HeLa tratadas con ácido 4-aminopirimidinborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un control no tratado (UTC) y lipopolisacárido (LPS).

La figura 6A demuestra las fracciones supervivientes de células HeLa tratadas con ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un UTC y LPS.

La figura 6B demuestra las fracciones supervivientes de células HeLa tratadas con ácido 3-aminofenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un UTC y LPS.

La figura 6C demuestra las fracciones supervivientes de células HeLa tratadas con ácido 5-amino-2,4-diflourofenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un UTC y LPS.

La figura 6D demuestra las fracciones supervivientes de células HeLa tratadas con ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un UTC y LPS.

La figura 6E demuestra las fracciones supervivientes de células HeLa tratadas con ácido 4-aminopirimidinborónico libre (barra oscura), así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un UTC y LPS.

La figura 7 muestra un gráfico representativo para el cálculo de la constante de unión para el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico.

La figura 8 muestra la estructura, la afinidad de unión a glucosa, el porcentaje de supervivencia de células HeLa a 80 nM y el CCP entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB en células HeLa a 80 nM, de diversos derivados de ácido borónico.

La figura 9 ilustra gráficos de liberación acumulada para cuatro composiciones de vesículas de ácido borónicoazúcar representativas.

La figura 10A ilustra gráficos acumulados para la liberación de insulina a partir de composiciones de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico-azúcar desencadenada con 5 mM, 7 mM y 10 mM de glucosa, en comparación con el desencadenamiento con 5 mM, 7 mM y 10 mM de PBS.

La figura 10B ilustra gráficos diferenciales para la liberación de insulina a partir de composiciones de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico-azúcar desencadenada con 5 mM, 7 mM y 10 mM de glucosa, en comparación con el desencadenamiento con 5 mM, 7 mM y 10 mM de PBS.

La figura 11A ilustra gráficos acumulados para la liberación de insulina a partir de composiciones de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico-azúcar (“ácido 4-aminocarbonilfenilborónico-AVT”) y composiciones de vesículas de concanavalina A (“ConA-AVT”) desencadenada con 10 mM, 30 mM y 40 mM de glucosa.

La figura 11B ilustra gráficos diferenciales para la liberación de insulina a partir de composiciones de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico-azúcar (“ácido 4-aminocarbonilfenilborónico-AVT”) y composiciones de vesículas de concanavalina A (“ConA-AVT”) desencadenada con 10 mM, 30 mM y 40 mM de glucosa.

Descripción detallada

La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada tomada junto con las figuras adjuntas y los ejemplos, que forman parte de esta divulgación. La terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares a modo de ejemplo únicamente. Tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen el plural. El término “pluralidad”, sin embargo, significa más de uno. La referencia a un valor numérico particular incluye al menos ese valor particular, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Cuando se expresa un intervalo de valores, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta otro valor particular. El valor particular forma otra realización. Cuando se usa el término “aproximadamente” junto con un número, se pretende que incluya el 10% del número. Por ejemplo, “aproximadamente 10” puede significar desde 9 hasta 11.

En la medida en que se use el término “incluye” o “que incluye” en la memoria descriptiva o en las reivindicaciones, se pretende que sea inclusivo de una manera similar al término “que comprende” tal como se interpreta ese término cuando se emplea como palabra de transición en una reivindicación. Además, en la medida en que se emplea el término “o” (por ejemplo, A o B), se pretende que signifique “A o B o ambos”. Cuando los solicitantes pretenden indicar “sólo A o B pero no ambos”, entonces se empleará el término “sólo A o B pero no ambos”. Por tanto, el uso del término “o” en el presente documento es el uso inclusivo y no el exclusivo.

Determinadas características de la invención que, por claridad, se describen en el presente documento en el contexto de realizaciones independientes también pueden proporcionarse en combinación en una realización individual. Al contrario, diversas características de la invención que, por brevedad, se describen en el contexto de una realización individual también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación.

La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a las figuras 1, 2 y 3. En la figura 1, se muestra un esquema de una realización de una composición 1 de vesículas. Tal como se muestra en la figura 1, la composición 1 de vesículas comprende una pluralidad de vesículas 2 biocompatibles. En una realización, la pluralidad de vesículas 2 biocompatibles pueden ser, por ejemplo, no tóxicas y biodegradables. Tal como se muestra en la figura 1, la composición 1 de vesículas comprende además uno o más restos 3 de detección química. En una realización, el uno o más restos 3 de detección química pueden ser, por ejemplo, uno o más restos químicos que pueden unirse reversiblemente con un resto de conjugado. Tal como se muestra en la figura 1, la composición 1 de vesículas comprende además uno o más restos 4 detectados. En una realización, el uno o más restos 4 detectados pueden ser, por ejemplo, restos químicos que pueden unirse reversiblemente con un resto 3 de detección química, por ejemplo. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “resto detectado” puede abarcar tanto restos detectados unidos que están unidos a una vesícula biocompatible (tal como se muestra en la figura 1) como restos detectados libres que son restos detectados no unidos a una vesícula biocompatible pero están presente en el entorno fisiológico (es decir, el entorno dentro del organismo de un paciente). Volviendo a la figura 1, una primera vesícula 2 biocompatible se une a un resto 3 de detección química, mientras que una segunda vesícula 2 biocompatible se une a un resto 4 detectado. El resto 3 de detección química y el resto 4 detectado, cuando se unen juntos, forman una reticulación 5.

La figura 2 ilustra otra realización de una composición 1 de vesículas. Una primera vesícula 2 biocompatible se une a un grupo 6 de unión polimérico, y el grupo 6 de unión polimérico se une a un resto 3 de detección química. Una segunda vesícula 2 biocompatible se une a un resto 4 detectado. El resto 3 de detección química y el resto 4 detectado, cuando se unen juntos, forman una reticulación 5.

La figura 3 ilustra todavía otra realización de una composición 1 de vesículas. Una vesícula 2 biocompatible se une a un primer grupo 6 de unión polimérico, y el primer grupo 6 de unión polimérico se une a un primer resto 3 de detección química. Una segunda vesícula 2 biocompatible se une a un segundo grupo 6 de unión polimérico, y el segundo grupo 6 de unión polimérico se une a un segundo resto 3 de detección química. Dos restos 4 detectados se unen juntos y cada resto 3 de detección química se une a un resto 4 detectado. Los restos 3 de detección química y los restos 4 detectados, cuando se unen juntos, forman una reticulación 5.

Una vesícula biocompatible puede ser cualquier partícula biocompatible que puede portar un compuesto terapéutico. La vesícula biocompatible puede tener una forma aproximadamente esférica con una porción interna. El compuesto terapéutico puede portarse en la porción interna de la vesícula, en la pared de la vesícula, unido a la superficie externa de la vesícula, o mediante cualquier otro medio adecuado. La vesícula biocompatible puede comprender polímeros, lípidos, proteínas, hidratos de carbono, otras macromoléculas, agua y sales, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la vesícula biocompatible puede comprender un liposoma compuesto por una pluralidad de lípidos. Los lípidos pueden comprender lípidos saturados. En una realización, la vesícula biocompatible puede estar compuesta por diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), o cualquier combinación de las mismas. La vesícula biocompatible puede tener una vida útil de almacenamiento suficiente como para ser adecuada como sistema de suministro de un compuesto terapéutico. En una realización, la vesícula biocompatible puede tener una estabilidad de vida útil de almacenamiento de al menos seis meses a desde aproximadamente 2°C hasta aproximadamente 8°C, o una estabilidad de vida útil de almacenamiento de al menos siete días a temperatura ambiente.

Las composiciones de vesículas adecuadas incluyen un compuesto terapéutico. El compuesto terapéutico es insulina. En una realización, el compuesto terapéutico puede cargarse en o sobre las vesículas biocompatibles. En una realización, la composición de vesículas puede liberar el compuesto terapéutico al entorno fisiológico de un paciente. El entorno fisiológico del paciente es habitualmente el torrente circulatorio, pero puede ser cualquier entorno dentro del organismo del paciente al que se suministra la composición de vesículas. En una realización, el compuesto terapéutico se liberará a partir de la composición de vesículas en respuesta a la presencia de un resto detectado libre en el entorno fisiológico. En una realización, el resto detectado libre en el entorno fisiológico que desencadena la liberación del compuesto terapéutico es sintomático del estado que va a tratarse mediante el compuesto terapéutico. En formulaciones en las que la vesícula es adecuada para inyección a un paciente, el porcentaje en peso del compuesto terapéutico, basado en el peso total de la composición de vesículas, puede estar en el intervalo de desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 30%, o desde aproximadamente el 0,2% hasta aproximadamente el 20%, o desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10%. El compuesto terapéutico puede administrarse a un paciente para proporcionar efectos paliativos, curativos o de otro modo beneficiosos. En algunas realizaciones, la insulina puede estar presente en una concentración en el intervalo de desde 0,1 mg/ml hasta 10 mg/ml, o desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, o desde aproximadamente 1 mg/ml hasta 3 mg/ml, tal como 2 mg/ml.

En algunas realizaciones, la cantidad de compuesto terapéutico liberado se refiere a la cantidad de resto detectado presente en el entorno fisiológico del paciente. Por ejemplo, la cantidad de compuesto terapéutico liberado y la cantidad de resto detectado en el entorno pueden ser linealmente proporcionales o pueden estar relacionadas mediante una función no lineal. Por consiguiente, un aumento en la concentración de resto detectado libre en el entorno fisiológico puede desencadenar un aumento en la cantidad de compuesto terapéutico liberado a partir de la composición de vesículas. Por ejemplo, la composición de vesículas puede liberar el compuesto terapéutico insulina en respuesta a la presencia de restos detectados libres que son azúcares en el entorno fisiológico. Cuando aumenta la concentración de restos detectados libres de azúcares, también puede aumentar la concentración de insulina liberada. Los azúcares de ejemplo pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, la liberación de insulina puede desencadenarse por la presencia de glucosa en el entorno fisiológico.

En algunas realizaciones, el resto de detección química puede unirse directamente a la vesícula biocompatible. Puede posicionarse un resto de grupo de unión entre el resto de detección química y la vesícula biocompatible. En realizaciones en las que la vesícula biocompatible es un liposoma, el resto de grupo de unión puede unirse a un lípido que forme parte del liposoma. El resto de grupo de unión puede ser un resto de polímero biodegradable, tal como, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). El resto de grupo de unión puede proporcionar flexibilidad entre la vesícula biocompatible y el resto de detección química. Un modo de caracterizar la flexibilidad del resto de grupo de unión es la densidad de enlaces insaturados en cada unidad de repetición del resto de polímero. En una realización, cada unidad de repetición del polímero que comprende el resto de grupo de unión puede contener al menos un enlace insaturado. Otro modo de caracterizar la flexibilidad del resto de grupo de unión es por su longitud. Cuando el resto de grupo de unión es PEG, cada resto de PEG puede tener independientemente un peso molecular en el intervalo de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 10.000 Da, tal como, por ejemplo, en el intervalo de desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 5.000 Da. En una realización, el resto de grupo de unión de PEG comprende aproximadamente 10-100 unidades de repetición de etilenglicol. En otra realización, el resto de grupo de unión de PEG comprende aproximadamente 30-60 unidades de repetición de etilenglicol.

El resto detectado puede unirse, tal como mediante un enlace covalente, al resto de detección química. El resto detectado puede ser un resto detectado unido que se une a una vesícula biocompatible que, junto con un resto de detección química, forma una reticulación en la composición de vesículas. Alternativamente, el resto detectado puede ser un resto detectado libre que compite con los restos detectados unidos para unirse con un resto de detección química. En una realización, el resto detectado libre en el entorno fisiológico puede servir como desencadenante para liberar el compuesto terapéutico mediante la unión competitiva con un resto de detección química y, por tanto, escindir las reticulaciones entre vesículas biocompatibles.

El resto detectado puede estar relacionado con la enfermedad o el estado que va a tratarse mediante el compuesto terapéutico. Por ejemplo, en algunas realizaciones en las que el estado que va a tratarse mediante el compuesto terapéutico es diabetes u otro trastorno metabólico que da como resultado hiperglucemia, el resto detectado libre que desencadena la liberación del compuesto terapéutico es un azúcar. Los azúcares de ejemplo pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el azúcar es glucosa. En realizaciones en las que el estado que va a tratarse es diabetes u otro trastorno metabólico que da como resultado hiperglucemia y el resto detectado libre es un azúcar, el compuesto terapéutico es insulina.

El resto de detección química y el resto detectado son grupos químicos que pueden unirse reversiblemente entre sí. La unión puede ser un enlace químico, tal como un enlace covalente. El enlace covalente entre el resto de detección química y el resto detectado puede escindirse en presencia de restos detectados libres en competición en el entorno. Cuando la composición de vesículas se ha suministrado a un paciente, el enlace covalente entre el resto de detección química y el resto detectado puede escindirse en presencia de restos detectados libres en el entorno fisiológico. Cuando se unen restos de detección química diferentes a cada vesícula biocompatible, las reticulaciones formadas por los diferentes restos de detección química y los restos detectados pueden tener fuerzas diferentes. El grado de escisión de las reticulaciones y la tasa de liberación del compuesto terapéutico pueden depender del número de reticulaciones fuertes, débiles y moderadas presentes.

Los restos de detección química adecuados incluyen un derivado de ácido borónico. Los derivados de ácido borónico de ejemplo pueden incluir fenilboronatos, piridilboronatos y ciclohexilboronatos. En una realización, el derivado de ácido borónico puede ser ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenilborónico; ácido 2,4-diclorofenilborónico; ácido 4-aminocarbonilfenilborónico; ácido 3-clorofenilborónico; ácido 4-hidroxifenilborónico; ácido 4-propilfenilborónico; ácido 3-[(E)-2-nitrovinil)fenilborónico; anhídrido 4-clorocarbonilfenilborónico; ácido ciclopenten-1-ilborónico; ácido 2-bromopiridin-3-borónico; ácido 2,4-diterc-butoxipirimidin-5-ilborónico; ácido 2,4-bis(benciloxi)pirimidin-5-borónico; ácido 5-fenil-2-tienilborónico; ácido 5-formiltiofen-3-borónico; o cualquier combinación de los mismos.

El resto detectado es un azúcar en realizaciones en las que el resto de detección química es un derivado de ácido borónico. Los azúcares adecuados pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el resto detectado puede ser glucosa cuando el resto de detección química es un derivado de ácido borónico. En algunas realizaciones, cada vesícula biocompatible puede tener sólo una clase de derivado de ácido borónico unido a la misma. En otras realizaciones, cada vesícula biocompatible puede tener una clase cualquiera de derivado de ácido borónico unido a la misma. Cuando se unen derivados de ácido borónico diferentes a cada vesícula biocompatible, las reticulaciones formadas por los diferentes derivados de ácido borónico pueden tener fuerzas diferentes. El grado de escisión de las reticulaciones y la tasa de liberación del compuesto terapéutico pueden depender del número de reticulaciones fuertes, débiles y moderadas presentes.

Las vesículas biocompatibles, los restos de detección química, los restos detectados y las reticulaciones que forman la composición de vesículas pueden disponerse de diversas maneras. Las vesículas biocompatibles pueden tener, cada una, múltiples restos unidos, siendo los restos restos de detección química, restos detectados, o ambos. Alternativamente, las vesículas bioquímicas pueden tener, cada una, sólo un resto unido, o bien un resto de detección química o bien un resto detectado. Además, las vesículas biocompatibles pueden tener, cada una, varios restos unidos, teniendo algunas vesículas biocompatibles un resto unido y teniendo otras vesículas biocompatibles más de un resto unido. En algunas realizaciones, las vesículas biocompatibles pueden tener tanto los restos de detección química como los restos detectados unidos a la misma vesícula biocompatible. En una realización, las vesículas biocompatibles pueden tener, cada una, sólo restos de detección química o sólo restos detectados unidos. Las composiciones de vesículas adecuadas pueden estar compuestas por tan sólo dos vesículas biocompatibles. Las composiciones de vesículas adecuadas también pueden comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 108 vesículas biocompatibles. En una realización, la composición de vesículas puede comprender entre aproximadamente 102 y aproximadamente 107 vesículas biocompatibles. En una realización, la composición de vesículas puede comprender entre aproximadamente 103 y aproximadamente 107 vesículas biocompatibles. Los restos unidos a las vesículas biocompatibles pueden disponerse en cualquier geometría que permite que se formen y escindan las reticulaciones entre los restos de detección química y los restos detectados. Los restos de detección química o detectados pueden disponerse sobre la vesícula biocompatible en cualquier geometría. En algunas realizaciones, los restos estarán igualmente espaciados sobre la vesícula biocompatible. En otras realizaciones, los restos se unirán a la vesícula biocompatible de manera aleatoria. Independientemente de la geometría de las partículas biocompatibles, los restos unidos y las reticulaciones que forman, la composición de vesículas puede adoptar una geometría plegada o de otro modo aglomerada. En algunas realizaciones, la composición de vesículas puede tener un diámetro en el intervalo de desde aproximadamente 0,1 micrómetros hasta aproximadamente 50 micrómetros. En una realización, la composición de vesículas puede tener un diámetro en el intervalo de desde aproximadamente 0,5 micrómetros hasta aproximadamente 30 micrómetros. En una realización, la composición de vesículas puede tener un diámetro en el intervalo de desde aproximadamente 1 micrómetro hasta aproximadamente 20 micrómetros.

La composición de vesículas puede ser adecuada para inyección a un paciente. Un método para medir la idoneidad para inyección es analizar el grado de inflamación provocado por una composición de PEG-lípidos que comprende el resto de detección química. Una medida del grado de inflamación es un ensayo de proteína NF-Kp. En una realización, la composición de PEG-lípidos que comprende el resto de detección química analizada usando un ensayo de NF-Kp da como resultado un CCP de menos de aproximadamente 0,2. En una realización, cuando la concentración de la composición de PEG-lípidos que comprende el resto de detección química está en el intervalo de desde aproximadamente 40 nM hasta 160 nM, por ejemplo, aproximadamente 80 nM, el CCP entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-Kp es menor de aproximadamente 0,2, por ejemplo, menor de aproximadamente 0,1. En una realización, la composición de PEG-lípidos que comprende el resto de detección química puede provocar menos inflamación que la molécula individual de resto de detección química, tal como se mide mediante un ensayo de translocación de NF-Kp.

Otro método para medir la idoneidad para inyección de la composición de vesículas es medir la toxicidad celular del resto de detección química. La composición de vesículas es adecuada para inyección si el resto de detección química se caracteriza por dar lugar a una supervivencia celular mayor de aproximadamente el 82%, tal como se mide según un ensayo MTT de proliferación celular. El resto de detección química puede caracterizarse por dar lugar a una supervivencia celular mayor del 82%, tal como se mide según un ensayo MTT de proliferación celular, cuando el resto de detección química se dosifica a una concentración en el intervalo de desde aproximadamente 40 nM hasta aproximadamente 160 nM.

En otra realización, se proporciona un método para administrar un compuesto terapéutico a un paciente que lo necesita, comprendiendo el método inyectar una composición de vesículas por vía parenteral al paciente, incluyendo la composición de vesículas un compuesto terapéutico, y liberar el compuesto terapéutico en el paciente en respuesta a un acontecimiento desencadenante. La composición de vesículas puede estar compuesta por un compuesto terapéutico, vesículas biocompatibles, uno o más restos de detección química, uno o más restos detectados, y reticulaciones entre los restos de detección química y detectados. En una realización, el acontecimiento desencadenante es sintomático del estado que va a tratarse mediante el compuesto terapéutico. En una realización, el acontecimiento desencadenante puede ser la presencia de resto detectado libre en el entorno fisiológico. En algunas realizaciones, un aumento en la concentración de resto detectado libre en el entorno fisiológico puede dar como resultado la liberación del compuesto terapéutico.

En una realización, el método puede comprender administrar una composición de vesículas en la que el sensor químico es un derivado de ácido borónico, el resto detectado es un azúcar y el compuesto terapéutico es insulina. En una realización, los derivados de ácido borónico pueden incluir fenilboronatos, piridilboronatos y ciclohexilboronatos. En una realización, el derivado de ácido borónico puede ser ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenilborónico; ácido 2,4-diclorofenilborónico; ácido 4-aminocarbonilfenilborónico; ácido 3-clorofenilborónico; ácido 4-hidroxifenilborónico; ácido 4-propilfenilborónico; ácido 3-[(E)-2-nitrovinil)fenilborónico; anhídrido 4-clorocarbonilfenilborónico; ácido ciclopenten-1-ilborónico; ácido 2-bromopiridin-3-borónico; ácido 2,4-diterc-butoxipirimidin-5-ilborónico; ácido 2,4-bis(benciloxi)pirimidin-5-borónico; ácido 5-fenil-2-tienilborónico; ácido 5-formiltiofen-3-borónico; o cualquier combinación de los mismos. En realizaciones en las que el resto de detección química es un derivado de ácido borónico, el resto detectado puede ser un azúcar. Los azúcares de ejemplo pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, cuando el resto de detección química es un derivado de ácido borónico, el resto detectado es glucosa. En algunas realizaciones, cada vesícula biocompatible tiene sólo una clase de derivado de ácido borónico unido a la misma. Cuando se unen derivados de ácido borónico diferentes a cada vesícula biocompatible, las reticulaciones formadas por los diferentes derivados de ácido borónico pueden tener fuerzas diferentes. El grado de escisión de las reticulaciones y la tasa de liberación del compuesto terapéutico pueden depender del número de reticulaciones fuertes, débiles y moderadas presentes.

En una realización, el acontecimiento desencadenante puede ser hiperglucemia en el paciente. En algunas realizaciones, un aumento en la concentración de glucosa en el entorno fisiológico en el paciente puede desencadenar la liberación del compuesto terapéutico. En otras realizaciones, un aumento en la concentración de azúcar en el entorno fisiológico en el paciente puede desencadenar un aumento en el compuesto terapéutico liberado a partir de la composición de vesículas. En todavía otras realizaciones, la presencia de azúcar en el entorno fisiológico puede desencadenar la liberación del compuesto terapéutico en una cantidad proporcional a la del azúcar. En una realización, el azúcar puede ser glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el azúcar es glucosa. En algunas realizaciones, el acontecimiento desencadenante puede ser cuando la concentración de azúcar en el entorno fisiológico en el paciente es mayor de aproximadamente 100 mg/dl.

En una realización, la composición de vesículas puede administrarse entre dos veces al día y una vez a la semana, durante una duración indefinida de días. En una realización, la composición de vesículas puede administrarse una vez al día, durante una duración indefinida de días. En algunas realizaciones, la composición de vesículas puede caracterizarse además por estar compuesta por vesículas aglomeradas.

En una realización, se proporciona un método para tratar un estado médico, comprendiendo el método administrar una composición de vesículas a un paciente que necesita tratamiento, cargándose la composición de vesículas con un compuesto terapéutico para el tratamiento de un paciente que lo necesita, y liberar el compuesto terapéutico en el paciente en respuesta a un acontecimiento desencadenante. La composición de vesículas puede comprender vesículas biocompatibles, uno o más restos de detección química, uno o más restos detectados, y reticulaciones entre los restos de detección química y detectados. La composición de vesículas puede comprender una aglomeración de vesículas biocompatibles. La composición de vesículas puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo, por ejemplo, mediante inyección. Alternativamente, la composición de vesículas puede administrarse mediante una bomba o mediante inhalación. En una realización, la composición de vesículas puede administrarse entre dos veces al día y una vez a la semana, durante una duración indefinida de días. En una realización, la composición de vesículas puede administrarse una vez al día, durante una duración indefinida de días.

Los métodos descritos en el presente documento incluyen administrar una composición de vesículas en la que el sensor químico es un derivado de ácido borónico, el resto detectado es un azúcar y el compuesto terapéutico es insulina. Los derivados de ácido borónico incluyen fenilboronatos, piridilboronatos y ciclohexilboronatos. En una realización, el derivado de ácido borónico puede comprender ácido 3-(N,N-dimetilamino)fenilborónico; ácido 2,4-diclorofenilborónico; ácido 4-aminocarbonilfenilborónico; ácido 3-clorofenilborónico; ácido 4-hidroxifenilborónico; ácido 4-propilfenilborónico; ácido 3-[(E)-2-nitrovinil)fenilborónico; anhídrido 4-clorocarbonilfenilborónico; ácido ciclopenten-1-ilborónico; ácido 2-bromopiridin-3-borónico; ácido 2,4-diterc-butoxipirimidin-5-ilborónico; ácido 2,4-bis(benciloxi)pirimidin-5-borónico; ácido 5-fenil-2-tienilborónico; ácido 5-formiltiofen-3-borónico; o cualquier combinación de los mismos. En realizaciones en las que el resto de detección química es un derivado de ácido borónico, el resto detectado comprende un azúcar. Los azúcares de ejemplo pueden incluir glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, o cualquier combinación de las mismas. En una realización en la que el resto de detección química es un derivado de ácido borónico, el resto detectado comprende glucosa. En algunas realizaciones, cada vesícula biocompatible puede tener sólo una clase de derivado de ácido borónico unido a la misma. En otras realizaciones, cada vesícula biocompatible puede tener una clase cualquiera de derivado de ácido borónico unido a la misma o más de una clase de ácido borónico unido a la misma. Cuando se unen derivados de ácido borónico diferentes a cada vesícula biocompatible, las reticulaciones formadas por los diferentes derivados de ácido borónico pueden tener fuerzas diferentes. El grado de escisión de las reticulaciones y la tasa de liberación del compuesto terapéutico pueden depender del número de reticulaciones fuertes, débiles y moderadas presentes.

Pueden tratarse varios estados médicos mediante los métodos de la invención, incluyendo trastornos metabólicos. Los ejemplos de trastornos metabólicos pueden incluir cualquier estado médico relacionado con el metabolismo del organismo, especialmente diabetes. Un compuesto terapéuti

ejemplo, insulina y sus variantes) puede mantener niveles de normoglucemia durante 24-72 horas. Un nivel de normoglucemia de azúcar en el torrente circulatorio es normalmente de aproximadamente 126 mg/dl.

Ejemplos

Ejemplo 1. Ensayo de NF-^kB para detectar la inflamación

Se estudió el potencial inflamatorio de diversos compuestos de ácido borónico midiendo la translocación nuclear de NF-^kB en células HeLa mediante inmunocitoquímica y microscopía de contacto alto de alto rendimiento. Se sembraron 15.000 células HeLa en placas de 96 pocillos la noche anterior a los experimentos. El día de los experimentos, se trataron las células con los ácidos borónicos (tabla 1, a continuación) a tres concentraciones diferentes (40 nM, 80 nM y 160 nM) durante 2 h. Al final de la incubación, se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 min y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,01% en PBS durante 10 min. Se lavaron las células con PBS tres veces. Se bloquearon los sitios inespecíficos con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en PBS y se incubaron con el anticuerpo anti-NF-KB durante 1 h, seguido por incubación con anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Después de lavar las células al final de la incubación, se trataron las células con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 1 min y se mantuvieron a 4°C hasta su análisis posterior. Se adquirieron imágenes de las células con un sistema de microscopios de alto rendimiento automatizado Beckman-Coulter 100 y se analizaron usando el software Cytseer (Vala Sciences, CA). Se cuantificó la colocalización de NF-^kB midiendo el CCP entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB. El CCP es una medida del solapamiento entre las intensidades de píxeles de las imágenes nucleares y de NF-^kB de la misma célula. Los valores de CCP pueden oscilar entre -1 y 1. Una correlación positiva (valor de CCP positivo) indica translocación nuclear de NF-^kB. Una correlación negativa (valor de CCP negativo) indica ausencia de translocación nuclear.

La figura 4 muestra imágenes representativas de células HeLa que ilustran el efecto del tratamiento con ácido borónico sobre la localización nuclear o citoplásmica de NF-^kB. Se muestra el DAPI mediante círculos blancos, mientras que NF-^kB está representado por gris claro. Los círculos blancos rodeados por gris claro indican NF-^kB citoplásmica, mientras que la obliteración de los círculos blancos por la señal gris en el núcleo indica NF-^kB nuclear. (A) UTC, NF-^kB citoplásmica; (B) control positivo, translocación nuclear de NF-^kB en células tratadas con LPS; (C) tratamiento con ácido 2,4-di(terc-butoxi)pirimidin-5-il-borónico (80 nM, 2 h), NF-^kB predominantemente citoplásmica; y (D) tratamiento con ácido 5-isoquinolinborónico (80 nM, 2 h), NF-^kB predominantemente nuclear.

La figura 5 demuestra el CCP entre las fracciones nuclear y citoplásmica de la molécula de NF-^kB en células HeLa tratadas con ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre (barra oscura), ácido 3-aminofenilborónico, ácido 5-amino-2,4-diflourofenilborónico, ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico y ácido 4-aminopirimidinborónico, así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un UTC y LPS. Sorprendentemente, el conjugado de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico fue menos inflamatorio que el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre.

La tabla 1 y la figura 8 enumeran los resultados de CCP para diversos derivados de ácido borónico.

1

Ejemplo 2. Ensayo MTT para determinar la citotoxicidad

Se estudió la citotoxicidad de los derivados de ácido borónico de la tabla 1 mediante un ensayo MTT. Se sembraron 150.000 células HeLa en placas de 96 pocillos la noche anterior a los experimentos. El día de los experimentos, se trataron las células con los derivados de ácido borónico a tres concentraciones diferentes (40 nM, 80 nM y 160 nM) durante 2 h. Al final de la incubación, se realizaron ensayos MTT (kit de ensayo basado en MTT de toxicología in vitro, Sigma Aldrich, MO) según el protocolo del fabricante.

La figura 6 demuestra las fracciones supervivientes de células HeLa tratadas con ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre (barra oscura), ácido 3-aminofenilborónico, ácido 5-amino-2,4-diflourofenilborónico, ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico y ácido 4-aminopirimidinborónico, así como con cada uno de los derivados de ácido borónico como conjugados de DSPE-PEG-COOH (barra clara), en comparación con un UTC y LPS. Sorprendentemente, el conjugado de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico fue menos citotóxico que el ácido 4-aminocarbonilfenilborónico libre.

La tabla 1 y la figura 8 enumeran la tasa de supervivencia celular para diversos derivados de ácido borónico. Ejemplo 3. Ensayo de unión

Se determinó la afinidad de unión de derivados de ácido borónico a la glucosa mediante un ensayo de competición usando concanavalina A (ConA) como patrón competitivo y concentraciones variables de los derivados de ácido borónico. Se activaron perlas magnéticas terminadas en carboxilo suspendiendo las perlas en tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 100 mM (pH 4,5). Se conjugó glucosamina (100 mg/ml) con las perlas magnéticas activadas usando acoplamiento de carbodiimida con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) como agente de reticulación. Se llevó a cabo la reacción de conjugación en una placa de 96 pocillos. Se ejecutó la reacción durante 24 h. Se separaron las perlas colocando la microplaca sobre un separador magnético y se lavaron exhaustivamente con PBS a pH 7,2 para retirar la glucosa no unida, la EDC en exceso y la W-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS).

Se coincubaron las perlas terminadas en glucosa durante 1 h con ConA 2,4 |iM (un aglutinante conocido de hidratos de carbono) etiquetada de manera fluorescente con isotiocianato de fluoresceína (ConA-FITC) y se titularon con concentraciones que oscilaban entre 2,5 |iM y 20 |iM de cada derivado de ácido borónico sometido a prueba. Se usaron los siguientes controles: (A) se trataron perlas magnéticas terminadas en carboxilo (no conjugadas con glucosa) con ConA-FITC para determinar la unión inespecífica; y (B) se trataron perlas conjugadas con glucosa con una alta concentración de ConA no fluorescente para determinar la unión máxima. Se lavaron los pocillos tres veces con PBS a pH 7,2 para retirar los derivados de ácido borónico y la FITC-ConA no unidos. Se resuspendieron las perlas en PBS y se agitaron durante 15 min a ta antes de medir la fluorescencia de FITC (excitación: 495 nm, emisión superior: 520 nm; 6 destellos por pocillo; promedio de n=3 pocillos en un lector de microplacas Flexstation 11384 para cuantificar la cantidad de glucosa unida a los ácidos borónicos). Se midió la intensidad de fluorescencia y se usó como indicación de la cantidad de ConA unida a la superficie de las perlas, o [ConAs]. Se esperaba que se inhibiera la interacción ConA-azúcar por los derivados de ácido borónico, que pueden unirse a las moléculas de azúcar y desplazar la ConA-FITC unida, provocando de ese modo una disminución en la intensidad de fluorescencia de la mezcla.

Se calculó la constante de unión de los derivados de ácido borónico a partir de la intensidad de fluorescencia. La reducción de la intensidad de fluorescencia se relaciona con [ConAs] mediante

(Ec. 2)

La ecuación 2.

La relación entre [ConAs] y la cantidad de ácido borónico [BA] se proporciona mediante la ecuación 3.

El simple reordenamiento da lugar a la ecuación 4, a partir de la cual puede derivarse la razón de las dos constantes de equilibrio (KoonA/KBA).

La concentración de sitios de azúcar (S1) puede calcularse a partir de la ordenada en el origen de un gráfico de

1

1/[ConAs] frente a 1/[BA].

La tabla 1 enumera las afinidades de unión a azúcar relativas (log(KconA/KBA)) de diversos derivados de ácido borónico, en comparación con ConA.

La figura 8 muestra la estructura y la afinidad de unión a glucosa (M-1) para diversos derivados de ácido borónico.

Ejemplo 4. Síntesis de conjugados de lípido-PEG-grupo de unión-ácido borónico.

Se prepararon todos los conjugados de lípido-PEG-grupo de unión-ácido borónico y azúcar acoplando el derivado de amina de los restos de ácido borónico-grupo de unión o de azúcar con DSPE-PEG-COOH usando la química de carbodiimida. En general, se disolvieron 50 mg de DSPE-PEG-COOH en 2 ml de dimetilformamida (DMF) anhidra, seguido por la adición de EDC (2,0 equivalentes) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (3,0 equivalentes), y se permitió que la mezcla se agitara durante 30 min a ta. Se añadió el derivado de amina del ácido borónico o azúcar y se permitió que la mezcla de reacción se agitara durante la noche. Para las aminas obtenidas en forma de la sal de amonio, estas se desalinizaron mediante agitación en 500 |il de DMF y 35 |il de trietilamina durante 30 min a ta antes de la adición a la mezcla de reacción. Se diluyó la mezcla de reacción con 4 ml de tampón MES (50 mM, pH 4,18), se transfirió a un casete de diálisis de 3K de MWCO y se dializó dos veces frente a 2 l del mismo tampón, luego dos veces frente a 2 l de agua, seguido por liofilización para obtener el conjugado deseado. Se confirmó la identidad y la pureza del producto final mediante espectrometría de 1H-RMN.

Ejemplo 5. Síntesis de liposomas funcionalizados con azúcar/ácidos borónico y sus conjugados

Síntesis de conjugados de fosfolípido-polietilenglicol-glicosilo. Se sintetizaron especies de lípido-PEG-glicosilo conjugando el grupo carboxilo de DSPE-PEG-COOH con el grupo amino de glucosamina, galactosamina y manopiranósido, usando la química de acoplamiento de carbodiimida descrita en G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, Elsevier Science USA (1996) 169-185. Se realizó el acoplamiento en la posición C2 de las moléculas de azúcar, manteniendo de ese modo las posiciones C3, C4 y C5 sin modificar.

Carga de liposomas con insulina. Se disolvió insulina recombinante humana en tampón citrato (100 mM, pH 2,5) hasta una concentración de 15 mg/ml. Se disolvieron lípidos (el 56,4% en moles de DPPC, el 40% en moles de colesterol y el 1,2% en moles de cada uno de DSPE-PEG-glucosa, DSPE-PEG-galactosa, DSPE-PEG-manopiranósido) en etanol y se hidrataron con la disolución de insulina a 50°C durante 15 min. La concentración final de lípido era de 50 mM. Se hizo pasar la mezcla hidratada ocho veces a través de una membrana con trazas grabadas (track-etched) Nuclepore de 400 nm a 50°C a una presión de 100 psi. Los liposomas originales tenían un diámetro medio de 244,1 nm (diámetros promedio de liposoma adecuados pueden ser de desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 300 nm) y una concentración de lípidos de aproximadamente 50 mM. Se encapsuló la insulina mediante carga pasiva. Se mantuvo el pH de la formulación liposómica a 5,6 (punto isoeléctrico de la insulina). Se dializaron los liposomas frente a tampón citrato (100 nM, pH 5,6) para retirar la insulina no encapsulada. En este ejemplo, la insulina no encapsulada se retira para mitigar o impedir que la insulina tenga un efecto inmediato y, quizás, innecesario sobre el entorno fisiológico. En algunas realizaciones, se pretende que la composición de vesículas libere y/o proporcione insulina principal o únicamente en respuesta a la presencia de una cantidad umbral de glucosa en el entorno fisiológico del paciente (es decir, que tenga un efecto de “respuesta a la glucosa”), tal como cuando el paciente está experimentando un estado hiperglucémico. En el presente ejemplo, la insulina encapsulada estaba presente en una concentración de aproximadamente 15 mg/ml, aunque se contempla que la concentración de la insulina encapsulada puede ser aproximadamente la misma que, o puede ser menor o mayor que, la concentración inicial de insulina. La insulina no encapsulada puede estar presente en una concentración de aproximadamente el 0%-5% de la insulina encapsulada, o hasta aproximadamente 0,75 mg/ml, aunque pueden ser aceptables o preferidas mayores concentraciones de insulina no encapsulada, dependiendo de la necesidad del paciente y del medio por el que se introduce la composición de vesículas en el entorno fisiológico del paciente.

Síntesis de conjugados de fosfolípido-polietilenglicol-derivado de ácido borónico. Se sintetizó lípido-PEG-ácido borónico conjugando el grupo carboxilo de DSPE-PEG-COOH con los restos de ácido borónico funcionalizados con amino usando la química de acoplamiento de carbodiimida descrita en G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, Elsevier Science USA (1996) 169-185. La composición de lípidos para el liposoma funcionalizado con ácido borónico fue la siguiente: el 56,4% en moles de DPPC, el 40% en moles de colesterol y el 3,6% en moles de DSPE-PEG-ácido borónico.

Las especies representativas de conjugados de lípido-PEG-derivado de ácido borónico incluyen:

Conjugado de ácido 3-aminofenilborónico. Picos característicos de 1H-RMN: 8 ppm 7,98 (s, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,31 (d, 1H), 7,03 (t, 1H), 5,33 (s, 1H, NH), 5,21 (s, 2H, NH), 1,55 (t, 3H), 1,49 (t, 3H).

Conjugado de ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico. Picos característicos de 1H-RMN (300 MHz, acetona-d6): 8 ppm 8,15 (d, 1H), 8,00 (dd, 1H), 7,90 (m, 1H), 5,70 (s, 1H, NH), 5,50 (s, 1H, NH), 1,55 (t, 3H), 1,40 (t, 3H).

Conjugado de ácido 4-aminopirimidilborónico. Picos característicos de 1H-RMN (300 MHz, acetona-d6): 8 ppm 7,85 (s, 2H), 5,25 (s, 1H, NH), 5,20 (s, 2H, NH), 1,40 (t, 6H).

Conjugado de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico. Picos característicos de 1H-RMN (300 MHz, acetona-d6): 8 ppm 7,85 (d, 2H), 7,80 (d, 2H), 5,30 (s, 1H, NH), 5,25 (s, 2H, NH), 1,40 (t, 6H).

Ácido 5-amino-2,4-difluorofenilborónico

Los procedimientos de carga de insulina, extrusión y purificación fueron similares a los usados para los liposomas de azúcar descritos anteriormente. El liposoma tenía un diámetro medio de 184+0,162 nm (diámetros

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promedio de liposoma adecuados pueden ser de desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 300 nm). La insulina encapsulada estaba presente en una concentración de aproximadamente l5 mg/ml.

Preparación de composiciones de vesículas. Se mezclaron dos clases de formulaciones liposómicas cargadas con insulina, funcionalizadas o bien con moléculas de azúcar o bien con derivados de ácido borónico, y se agitaron a ta para formar composiciones de vesículas. Se prepararon las mezclas usando varias razones molares de especie de azúcar con respecto a especie de ácido borónico sobre la superficie externa de los liposomas, que oscilaban entre 1:2 y 1:50, para determinar el exceso de ácidos borónicos requeridos para la formación de la composición de vesículas. El pH de la mezcla también variaba entre 7 y 11, con el fin de seleccionar composiciones de vesículas que se forman a pH fisiológico.

Tabla 2

Confirmación de la reticulación química de restos de ácido borónico y de azúcar. Para confirmar que se formaron las composiciones de vesículas mediante reticulación química de los restos de ácido borónico y de azúcar, se expusieron los aglomerados a 10 mM de glucosa. Los aglomerados se escindieron fácilmente en presencia de glucosa, debido a la unión competitiva de los ácidos borónicos con la glucosa libre. Esto se demostró por el aumento en la frecuencia de partículas con un tamaño inferior a 1 |im desde el 13% hasta el 37% tras la incubación con glucosa.

Ejemplo 6. Liberación in vitro de insulina a partir de las composiciones de vesículas de boronato-azúcar.

Se cargó un pequeño volumen (500 |il) de los aglomerados en el interior de una membrana de diálisis tubular (MWCO de 100.000), se selló con clips y se dializó frente a una disolución de PBS (pH 7,4) durante 30 min antes de la escisión con glucosa para monitorizar la difusión pasiva de la insulina sin desencadenante. A esto le siguió la adición de disolución de glucosa a los aglomerados en el interior de la membrana a intervalos regulares para escindir las composiciones de vesículas y desencadenar la liberación de insulina. Se extrajeron alícuotas de la fase externa cada 15 min y se sometió a ensayo la concentración de insulina leyendo la absorbancia a 214 nm. Se continuó el ensayo durante varias horas para verificar la detención de la liberación de insulina encapsulada. La figura 9 ilustra gráficos de liberación acumulada para cuatro composiciones de vesículas de boronato-glucosa diferentes (ácido 4-aminocarbonilfenilborónico, ácido 3-aminofenilborónico, ácido 3-fluoro-4-aminoetilfenilborónico y ácido 5-amino-2,4-difluorofenilborónico), en ausencia de desencadenante de glucosa. La composición de vesículas de ácido 3-aminofenilborónico y la composición de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico liberaron el 12% y el 17% de su contenido de insulina, respectivamente.

Se sometió a ensayo la liberación de insulina a partir de la composición de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico tras la adición de concentraciones variables de desencadenante de glucosa durante varias horas. Las concentraciones de desencadenante se eligieron para imitar los niveles de glucemia en condiciones de normoglucemia y de hiperglucemia. También se realizó un ensayo de control en el que la composición de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico se desencadenó con PBS en lugar de glucosa. La composición de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico presentó una liberación súbita de insulina en el plazo de dos minutos después de la introducción del desencadenante de glucosa. La tasa de liberación se ralentiza a lo largo del tiempo hasta que se añade otra dosis de glucosa, lo que desencadena un nuevo episodio de liberación e súbita. En este ejemplo, la concentración mínima de glucosa requerida para escindir la composición de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico y liberar insulina fue de 10 mmol/l, que corresponde a un nivel de glucemia de 180 mg/dl. No se observó liberación súbita de insulina cuando la composición de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico se desencadenó con concentraciones de glucosa análogas a hipoglucemia (aproximadamente 9 mg/dl) o normoglucemia (aproximadamente 126 mg/dl), lo que demuestra que la composición de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico de ejemplo es adecuada para mantener niveles de normoglucemias. Además, la tasa de liberación de insulina a partir de estas composiciones de vesículas depende de la concentración de glucosa, haciendo de ese modo que las presentes realizaciones sean útiles en mitigar o evitar el hiperinsulinismo.

La figura 10 ilustra gráficos (a) acumulados y (b) diferenciales para la liberación de insulina a partir de

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composiciones de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico (ácido 4-aminocarbonilfenilborónico-AVT) desencadenada con 5 mM, 7 mM y 10 mM de glucosa, en comparación con el desencadenamiento con 5 mM, 7 mM y 10 mM de PBS.

La figura 11 ilustra gráficos (a) acumulados y (b) diferenciales para la liberación de insulina a partir de composiciones de vesículas de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico y ConA desencadenada con 10 mM, 30 mM y 40 mM de glucosa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición de vesículas que puede inyectarse a un paciente, que comprende:

(1) DPPC;

(2) colesterol; y

(3) un conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico,

en la que la primera composición de liposomas encapsula la insulina; y

en la que la primera composición de liposomas comprende

(1) DPPC;

(2) colesterol;

(3) un conjugado de DSPE-PEG-glucosilo;

(4) un conjugado de DSPE-PEG-galactosilo; y

en la que la segunda composición de liposomas comprende

2. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico comprende un resto de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico.

3. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico comprende:

en la que n = 30-60.

4. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que al menos una de las composiciones de liposomas primera y segunda libera una cantidad de insulina en respuesta a la presencia de un azúcar.

5. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que un derivado de ácido borónico, en el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico, es menos citotóxico y/o menos inflamatorio que un derivado de ácido borónico en su forma libre.

6. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que una molécula del conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico de la primera composición de liposomas se une covalentemente a al menos una de una molécula del conjugado de DSPE-PEG-glucosilo, del conjugado de DSPE-PEG-galactosilo y del conjugado de DSPE-PEG-manopiranosidilo de la segunda composición de liposomas para formar al menos una reticulación borónico-glucosilo reversible, en la que al menos una de las reticulaciones borónico-glucosa, borónico-galactosa o borónico-manopiranósido se escinde fácilmente en presencia de glucosa debido a la unión competitiva del ácido borónico con glucosa libre.

7. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que al menos una de las composiciones de liposomas primera y segunda libera una cantidad de insulina en respuesta a la escisión de al menos una de las reticulaciones borónico-glucosa, borónico-galactosa o borónico-manopiranósido, debido a la unión competitiva del ácido borónico con glucosa libre.

8. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico de la primera composición de liposomas y al menos uno del conjugado de DSPE-PEG-glucosilo, del conjugado de DSPE-PEG-galactosilo y del conjugado de DSPE-PEG-manopiranosidilo de la segunda composición de liposomas forman juntos al menos una reticulación borónico-glucosilo reversible entre la primera composición de liposomas y la segunda composición de liposomas.

9. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que la tasa de liberación de insulina depende de la concentración de glucosilo, galactosilo y/o manopiranosidilo.

10. Composición de vesículas según la reivindicación 1, en la que una molécula del conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico de la primera composición de liposomas se une covalentemente a al menos una de una molécula del conjugado de DSPE-PEG-glucosilo, del conjugado de DSPE-PEG-galactosilo y del conjugado de DSPE-PEG-manopiranosidilo de la segunda composición de liposomas.

11. Composición de vesículas según la reivindicación 1,

(i) en la que el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico comprende un resto de ácido 4-aminocarbonilfenilborónico y la razón (v/v) entre la primera composición de liposomas y la segunda composición de liposomas es de 1:20, y el pH de la composición de vesículas es de 8;

(ii) en la que el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico comprende un resto de ácido 3-aminofenilborónico y la razón (v/v) entre la primera composición de liposomas y la segunda composición de liposomas es de 1:5, y el pH de la composición de vesículas es de 7,5;

(iii) en la que el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico comprende un resto de ácido 5-amino-2,4-difluorofenilborónico y la razón (v/v) entre la primera composición de liposomas y la segunda composición de liposomas es de 1:5, y el pH de la composición de vesículas es de 8; o

(iv) en la que el conjugado de DSPE-PEG-derivado de ácido borónico comprende un resto de ácido 3-fluoro-4-aminometilfenilborónico y la razón (v/v) entre la primera composición de liposomas y la segunda composición de liposomas es de 1:10, y el pH de la composición de vesículas es de 8.

12. Composición de vesículas según la reivindicación 11, en la que la primera composición de liposomas se reticula químicamente con la segunda composición de liposomas.

13. Composición de vesículas según la reivindicación 12, en la que la primera composición de liposomas y la segunda composición de liposomas forman un aglomerado.

14. Composición de vesículas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso como medicamento o para su uso en un método de terapia.

15. Composición de vesículas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método de tratamiento de la diabetes en un sujeto.

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