CN104837482A

CN104837482A - 纳米颗粒制剂

Info

Publication number: CN104837482A
Application number: CN201380055336.1A
Authority: CN
Inventors: 吉米·贝尔; 伊丽莎白-路易丝·托马斯; 利·布罗迪; 迈利兹-萨胡里·阿里索鲁; 安德鲁·米勒; 加里·佛洛斯特
Original assignee: Creative Co Of Kingdom; Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council; United Kingdom Research and Innovation
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: CN104837482B; JP6483017B2; EP2890365A1; JP2015530382A; AU2013308245B2; WO2014033453A1; CA2882705A1; US20150224054A1; HK1211862A1; GB201215289D0; CA2882705C; EP2890365B1; AU2013308245A1; US10201499B2

Abstract

本发明涉及用于以一种或多种治疗剂给药的纳米颗粒制剂，所述制剂包括：阳离子胆固醇衍生物；中性磷脂；胆固醇或中性胆固醇衍生物；以及磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物。

Description

纳米颗粒制剂

技术领域

本发明涉及纳米颗粒制剂。具体而言，涉及但不限于，用于治疗代谢和癌症的治疗剂的纳米颗粒辅助给药。

背景技术

细胞代谢失调是包括癌症在内的许多慢性疾病进程的中心前提。近来，人们对通过使用小分子对异常细胞和组织进行再转化的代谢工程的潜力重新燃起了兴趣。但是，通过所述方法获得充分和持久的代谢影响可能很困难，这是因为需要鉴定合适的小分子，并开发出适合的给药模式。

代谢工程提供了一种强力且有效的工具，因为其允许对细胞代谢活动进行系统操作及微调。需要对失调或致癌状态的代谢进行再改造的方法。该方法可以尤其是应用于预防或治疗肥胖症，一系列癌症和任何与代谢失调相关的病症。

肥胖症是全球性的健康隐患，且与许多副发病变相关，包括第二型糖尿病、高血压和心血管疾病，以及为许多类型的癌症进程带来独立风险因子。全球范围内肥胖症增加的社会和经济负担，意味着对介入性治疗策略的迫切需求。

肝脏尤其对控制身体新陈代谢具有根本性作用。大量流行病学研究表明，致肥胖状态与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝硬化，以及尤其是5年存活率仅为4-8％的最致命的癌症之一：肝细胞性肝癌(HCC)相关。研究表明，热量摄入过剩后可能发生肝功能异常，这是由于肝甘油基三酸酯合成过量而导致肝细胞中脂质过量累积造成的。脂肪的累积还可能伴随着渐进的炎症，即脂肪性肝炎，该炎症被认为会介导HCC进程。

目前，用于处理肥胖症的最有效治疗方法集中在改善饮食和常规锻炼上。推荐的饮食模式包括水果、蔬菜和全谷物，其中包含大量纤维和水分，能够稀释每体积食物中供新陈代谢的能量含量。此前的研究表明，膳食纤维含量是能量密度的决定因素，而高膳食纤维含量的饮食对新陈代谢综合征的症状有益，包括降低体重、总体脂和血糖水平。评估还暗示，最发达国家的膳食纤维摄入显著降低，且主要膳食纤维类型从来自坚果、种子和块茎的高可发酵度碳水化合物变成了低可发酵度的谷物纤维。

特别地，研究表明，提高啮齿动物的可发酵碳水化合物摄入，提高了大肠短链脂肪酸产量，降低了体重并提高了胰岛素敏感性。若干人类实验也表明，可发酵碳水化合物能够帮助抑制食欲和降低体重。

虽然可发酵碳水化合物引起食欲变化的原理很大程度上仍然未知，一种假设是短链脂肪酸(碳水化合物结肠内发酵的终产物)增加了食欲减退激素的循环浓度。但是，对人类而言，难以证实所述由提高可发酵碳水化合物输入而导致的食欲减退始终与食欲减退激素的循环浓度相关联。

事实上，本发明的发明人发现，通过富含可发酵碳水化合物的膳食或直接给予(例如，腹腔内注射)引起锻炼脂肪酸浓度长期提高，从而获得的食欲减退效果，可能不仅是食欲减退激素提高的结果，而是作用于中枢神经系统的直接结果。但是，短链脂肪酸的医疗用途的相关问题之一，在于它们容易被结肠细胞和肝脏代谢，只有极低浓度到达外周循环。因此，所述化合物难于以无毒而又具有有益治疗效果的浓度来给药。

短链脂肪酸，例如丁酸盐，已知由肠道微生物发酵未消化膳食碳水化合物产生，且已知显示出潜在的医疗作用。例如，已知丁酸盐可作为组蛋白脱乙酰基酶类(HDAC)的抑制剂，因此具有在多种癌细胞类型中强制细胞周期停滞、分化和/或细胞凋亡的能力(Chen et al.CurrCancer Drug Targets,2003,3(3),219-36)。此外，已知其能够降低结肠癌细胞的生长，并在结肠癌细胞中诱导细胞凋亡，由此可用于代谢综合征的治疗(Canini et al.World J Gastroenterol2011,17(12),1519-28)。

但是，丁酸盐本身并未曾在体内使用中获得多少成功，因为其半排出期很短。因此，需要以高浓度给药，来得到有益效果。相应地，此前的研究集中在提供一种有控制地的丁酸盐给药方法。

例如，Coradini et al.Cancer Therapy 2004,2,201-16描述了透明质酸作为用于治疗人固体瘤的HDAC抑制剂(例如丁酸盐)适用载体的用途。Hamer et al.Aliment Pharmacol Ther 2008,27,104-119描述了丁酸盐对结肠功能的作用，并总结了以pH依赖性缓释涂层包覆的片剂进行丁酸盐给药，生成丁酸盐的益生菌的消耗，含有丁酸盐衍生物(例如三丁酸甘油基酯)的前药，以及使用直肠灌肠剂来将丁酸盐递送到末端结肠。

短链脂肪酸的其他给药策略的例子包括WO2006/127977中所述的例子，该文件详细描述了特定糖-丁酸盐杂交分子作为前药样小分子的用途。WO2006/07634描述了一种基于前药，通过连接短链脂肪酸与氨基酸(例如丝氨酸)来短链脂肪酸的途径。WO2006/128888描述了用于缓释各短链脂肪酸的包含共价连接的胆固醇-丙酸盐/丁酸盐衍生物的固体酯类纳米颗粒。此外，WO2002/024195涉及烷氧基化酰基甘油，其作为载体，包含以烷氧基形式存在的短链脂肪酸，且可用于治疗肠胃疾病，例如结肠炎。但是，这些现有技术例子中，无一能够以天然形式将所述治疗剂递送到选定的目标器官，并进行有效释放并分布到要求的所需位点。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于，提供适用于促进治疗剂向中枢神经系统长期给药的纳米制剂。

本发明的一个方面中，提供用于以一种或多种治疗剂给药的纳米颗粒制剂，所述制剂包括：(i)阳离子胆固醇衍生物；(ii)中性磷脂；(iii)胆固醇或中性胆固醇衍生物；以及(iv)磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物。

使用本发明特别设计的基于脂质的纳米颗粒，可以实现治疗剂向目标器官的有控制给药。对于短链脂肪酸，可能对肝细胞血脂水平带来有益效果，降低体脂沉积，并降低相关癌症生长率。

本文所称的术语“中性”指的是，在选定pH下，实体以不带电或中性两性离子形式存在。术语“阳离子(的)”指的是，在选定pH下，实体以带正电荷形式存在。合适的pH可以是例如7.4+/-0.5。

术语“磷脂”指的是含有包含磷酸基团(通常带负电荷)的亲水头基、疏水尾基的脂质。合适的例子包括基于以下基团的脂质：磷脂酸(磷脂)(PA)；磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)；磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)；磷脂酰丝氨酸(PS)；磷脂酰肌醇(PI)；磷脂酰肌醇磷酸(PIP)；磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)；磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)；神经酰胺磷酸胆碱(鞘磷脂)(SPH)；神经酰胺磷酰乙醇胺(鞘磷脂)(Cer-PE)；以及神经酰胺磷脂酰甘油基。

术语“短链脂肪酸”指的是由1-6个碳原子构成的脂肪族羧酸，其可以是直链或支链结构。合适的短链脂肪酸包括：甲酸；乙酸；丙酸；丁酸(酪酸)；异丁(2-甲基丁)酸；戊酸(缬草酸)；异戊酸(3-甲基丁酸)；以及羊油酸(己酸)和类似物，包括卤代衍生物，如二氯乙酸(DCA)。在另一方面，术语“脂肪酸”，是指包括C_7-24碳链的直链或支链结构的、饱和或不饱和羧酸或其衍生物。通常情况下，饱和脂肪酸包含C_12-24的碳链。

术语“纳米颗粒”是指运输和性质上可以看做一个整体单位的小颗粒，且其平均颗粒直径(例如通过光散射技术测定)通常来说在1-500nm(优选为1-250nm)范围内。术语“超微颗粒”可与“纳米颗粒”作为同义词使用。脂质体是一种可以看作人工制备的由双层脂膜组成的囊泡的纳米颗粒示例类型。

术语“聚二乙醇化”是指实体，通常为基于聚合物或脂质的实体，与聚二乙醇(PEG)高分子链共价连接。所述PEG链衍生自分子式为C_2nH_4n+2O_n+1且分子量小于的20000g/mol的分子。所述制剂还可以进一步包括一种或多种需用纳米颗粒给药的治疗剂。借助于纳米颗粒的物理性质和构成，可以将所述治疗剂给药至所需的解剖学部位，允许药剂随后在此释放。所述释放可以是直接位于目标细胞或气管内，或先释放到周围组织中，然后通过循环系统释放到身体其他部位，例如大脑。

所述治疗剂可以通过化学连接(即共价键)与纳米颗粒表面连接，通过包含在颗粒物理结构中，或通过包封在颗粒内容积中，来与纳米颗粒相连接。例如，在优选实施例中，纳米颗粒为脂质体，例如阳离子脂质体，其中所述脂质体可以基本类似球体并包含一种或多种脂质双层膜。在该实施例中，该脂质体的封装含水体积或疏水内部结构中，可以包含一种或多种只了解。如此使用脂质体技术的优点之一，在于可以靶定某些组织，例如肝脏，有控制地释放治疗剂，从而提高药剂的循环量，并协助其在更长时间内更为一致地给药。

当治疗剂包封在纳米颗粒或脂质体中时，包封治疗剂的浓度可以在0.1-100mM范围内，优选为0.5-15mM范围内，更优选为1-10mM范围内。在特别优选的实施例中，包封浓度在1-7mM范围内。

尤其适用于本发明的制剂的一组治疗剂是短链脂肪酸。所述短链脂肪酸包括，例如，乙酸、丙酸、丁酸和/或戊酸。短链脂肪酸受体(例如FFAR₂和FFAR₃)在人体中随处可见，因此是治疗糖尿病和肥胖症及相关癌症的理想目标。

特别地，乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐相对于其他小分子治疗成分，对人类的毒理学数据更好，因此从治疗角度而言更为优选。此外，本发明的发明人发现，乙酸在包封在本发明的纳米颗粒制剂中的性质、在该制剂中的自身稳定性及其对食欲抑制、保持体脂和抑制相关癌症生长的显著积极作用方面尤为有效。体内分布实验表明，肝脏、心脏、肾脏和肌肉组织都大量摄入了本发明制剂的脂质体。

并无数据表明纳米颗粒的粒径构成一种限制因素。但是，从实用角度而言，纳米颗粒的平均尺寸(直径，通过例如光散射技术测量)可以在1-500nm范围内，优选为10-300nm，更优选为20-250nm。更具体而言，可以领会，对于所述纳米颗粒的物理构造及对治疗剂的包封而言，优选的纳米颗粒平均粒径为30-200nm，尤其是40-120nm。粒径在40-120nm范围内的纳米颗粒更容易形成，并呈现出储藏和给药中更高的稳定性。本文所述实施例中的纳米颗粒平均粒径是以纳米粒度及电位分析仪Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments,Ltd.,UK)测定的，其利用了动态光散射原理来测量粒径以及利用了电用光散射来测量电动电位。

当在纳米颗粒内包封一种或多种治疗剂时，优选地，被包封药剂的浓度范围在0.1-100nM之内，优选为0.1-50mM、0.1-25mM或0.5-15mM。更优选地，被包封药剂的浓度范围在1-10nM之内，因为这能够产生更稳定的纳米颗粒和适量的药剂，以得到所需的生物效果。被包封药剂的浓度可以使用核磁共振光谱法来测定。本文实施例中，用Bruker Biospin扫描仪(Bruker,USA)，以5mm反转模式BBI探针，以下列参数采集¹H NMR波谱：500.13MHz,扫频宽度12ppm(6009Hz),数据点32k,采集时间2.726秒,弛豫延时3秒(总循环延时5.726秒),脉冲宽度6μs(相对于55度脉冲),64平均值，温度298K。使用了MestRe-C软件来分析采集的波谱。自由感应衰减(FID)信号通过变迹来降低噪音并经过傅里叶变换。使用样条函数来进行基线校正，并整合峰值以相对定量。被包封药剂浓度相对于1.3ppm乳酸盐的参照峰值进行测定。

本发明的制剂包含阳离子胆固醇衍生物。所述衍生物可以包含基于胆固醇的碳氢骨架作为头基，所述头基与极性有机尾基(例如聚胺烃链)相连接。虽然该头基可以是基于常见胆固醇骨架的任何骨架，但尤其优选为胆固醇，且可以通过3-羟基与尾基相连接。适用的具体阳离子胆固醇衍生物包括4-氮杂-N¹-胆固醇氧羰基-1,7-庚烷二胺(ACH)、N¹-胆固醇氧基-羰基-3,7-二氮杂1,9-壬烷二胺(CDAN)、N¹⁰-胆固醇氧羰基-4,8,13-三氮杂-1,16-十六烷二胺(CTAH)、N¹-胆固醇氧基-羰基-4,9-二氮杂-1,12-十二烷二胺(CDAD)和N¹⁵-胆固醇氧羰基3,7,12三氮杂-1.15十五烷二胺(CTAP)。对于尾基的结构，优选为基于下列通式的聚胺侧基：H₂N(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH(CH₂)_zNHC(O)-，其中x＝1-10，y＝1-10，z＝1-10。在此实施例中，x优选为1至4，y优选为1至4，z优选为1至4。相信该基于胆固醇的阳离子酯类提高了肝细胞对此纳米颗粒的摄入。此外，其有助于保证所有治疗剂保持包封状态。在一个实施例中，所述阳离子胆固醇衍生物为N¹-胆固醇氧基-羰基-3,7-二氮杂1,9-壬烷二胺(CDAN)。

本发明的制剂还包含中性磷脂。适用于包含在该制剂中的中性磷脂包括磷脂酰乙醇胺，例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；磷脂酰胆碱，如二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)和二硬脂酰磷脂胆碱(DSPC)；磷脂酰甘油基；磷脂酰甘油基，例如二油酰磷脂酰甘油基(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油基(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油基(DSPG)；磷脂酰丝氨酸，例如二油酰磷脂酰丝氨酸或二棕榈酰磷脂酰丝氨酸；以及，二磷脂酰甘油基。中性磷脂可以是饱和的中性磷脂，优选为磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺脂质。当该中性磷脂是磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺脂质时，该脂质优选为包含C_7-24脂肪酸链，更优选为C_8-22，最优选为C_10-20。特别地，优选为包含C_10-20脂肪酸链的磷脂酰胆碱脂质。当所述脂质的脂肪酸链在C_10-20范围内时，相信会形成更稳定的纳米颗粒。最优选地，所述中性磷脂为二硬脂酰磷脂胆碱(DSPC)。

本发明的制剂还包含胆固醇(IUPAC名称:(3β)-胆固醇-5-烯-3-醇)或胆固醇中性衍生物。所述胆固醇中性衍生物可以包含基于胆固醇的碳氢骨架，该骨架可以通过3-羟基(例如通过酯键)共价连接在基于碳氢的链上。合适的所述衍生物包括：胆固醇乙酸酯；胆固醇丁酸酯，胆固醇戊酸酯；胆固醇辛酸酯；胆固醇月桂酸酯；胆固醇油酸酯；胆固醇十七烷酸酯；胆固醇硬脂酸酯；胆固醇亚油酸酯；胆固醇反亚油酸酯；胆固醇棕榈酸酯；胆固醇棕榈反油酸酯；胆固醇豆蔻酸酯；胆固醇山嵛酸酯；胆固醇芥酸酯；胆固醇花生四烯酸酯；胆固醇10-十一碳烯酸酯；以及，胆固醇苯乙酸酯。该成分被认为向纳米颗粒提供了一定水平的硬度，允许纳米颗粒储藏相关治疗剂，直到需要给药的时刻；给药时，纳米颗粒能够分散所述活性成分。最优选地，所述制剂包含胆固醇，因为该成分提供强度和分散的良好平衡，且其毒理学性质对人类有益。

本发明的制剂还可以包含磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物。所述磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱衍生物可以包含C_10-24的饱和脂肪酸链，优选为C_12-20。合适的磷脂酰乙醇胺衍生物包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；合适的磷脂酰胆碱衍生物包括如二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)和二硬脂酰磷脂胆碱(DSPC)。最优选地，所述衍生物为二硬脂酰磷脂胆碱(DSPC)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。对于PEG部分而言，所述磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱中性衍生物可以共价连接至聚乙二醇甘油链，其可以用平均分子量表示。例如，n＝9的PEG链的平均分子量可以是约400Da，表示为PEG400。所述PEG链可以在550-5000范围内，优选为1200-3000，更优选为1500-2500。最优选地，所述PEG链的平均分子量为约2000。

该纳米颗粒制剂还可以包含荧光磷脂，作为可视化工具。示例性脂质包括1,2二油酰基-sn-甘油基基-3-磷酸乙醇胺-N-(5-二甲氨基-1-萘磺酰基，1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(L-芘磺酰基)，1,2--二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)，1-油酰基-2-[6-[(7-硝基-2--1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]己酰]-sn-甘油基-3-磷酸基-L-丝氨酸，25-{N-[(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)-甲基]氨基}-27-降胆固醇，油酰基-2-[6-[(7-硝基-2--1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]己酰]-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)，优选的荧光脂质是1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)。

通常而言，本发明的纳米颗粒的粒径为150nm或以下，或100nm或以下。通过仔细的纳米工程方法，纳米颗粒制剂的粒径可以控制保持在150nm以下，优选为100nm。从肿瘤组织的性质考虑，该粒径范围被认为是在固体肿瘤中累积纳米颗粒的优选粒径。肿瘤组织被认为具有对大分子试剂的普遍亲和性，称为增强的渗透和滞留作用(EPR)，这导致大分子试剂在肿瘤组织中累积。肿瘤的性质，例如增强的血管生成、异质性和破坏性血管基础结构、淋巴引流损坏和“泄漏性”内皮细胞层，均被认为是促成了大分子结构在肿瘤组织中累积的因素。

相应地，本发明的又一实施例中，所述纳米颗粒制剂可以进一步包含肿瘤靶向剂。本发明的包含肿瘤靶向剂的纳米颗粒，通常包含针对在哺乳动物肿瘤细胞中相对于非肿瘤组织过度表达的受体的配体。

所述肿瘤靶向剂的示例之一包含叶酸盐部分。本发明的优选实施例中，所述肿瘤靶向剂是磷脂-聚乙二醇甘油基-叶酸盐化合物。更优选地，所述磷脂-聚乙二醇甘油基-叶酸盐化合物是DSPE-PEG(2000)-叶酸盐[二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇甘油基(2000)-叶酸盐]。

通常来说，纳米颗粒制剂中的叶酸盐部分的含量为总制剂的1-2mol％，不包括任何治疗剂在内。若所述纳米颗粒为脂质体，则脂质体中所含的叶酸盐部分的含量一般是总脂质体制剂的1-2mol％。

对于肿瘤靶向剂，叶酸盐是这种靶向部分的良好示例，基于叶酸盐的靶向体系是一种向肿瘤选择性投递治疗剂或成像剂的有效途径。已知晚期侵袭性或未分化肿瘤的叶酸盐受体(FR)密度增加，表明癌症治疗能够受益于广泛的FR介导药物给药方法。FR在若干肿瘤类型中过度表达，例如脑癌、肾癌、肺癌和乳腺癌，且尤其是上皮癌，例如卵巢癌。FR配体，即叶酸盐(或叶酸)是一种用于核苷酸生物合成的维生素，增殖的癌细胞需要高浓度FR配体。

除各种药物给药用途外，叶酸盐靶向技术还成功应用于治疗剂的放射成像、癌细胞的荧光成像、MRI造影剂和钆(Gd)脂质。纳米颗粒，尤其是脂质体，由于诸多证据证实的增强渗透与滞留作用(EPR)的存在，能够在肿瘤组织中积累，EPR则依赖于肿瘤中～40kDa及以上的胶体大分子的被动累积。EPR作用的产生是异常肿瘤内皮导致的，是其“泄漏”允许纳米颗粒渗入肿瘤组织的结果。肿瘤组织中的脂质体累积可以通过使用受体靶向部分来增强，所述受体靶向分子后结合在脂质体表面，或连接在嵌入脂质体双层膜内的脂质上。FR结合亲和性(Kd＝1×1^-10M(1×10^-10M))在其配体叶酸盐与成像剂或治疗部分结合后并不受到影响，因此，连接在脂质PEG两亲分子远端的叶酸盐配体能够用于开发FR靶向的脂质体体系。

此外，可以包括可用于改进磁共振成象和核共振成像的其他脂质。说明性示例包括：Gd-DTPA-双(硬脂酸酰胺)(Gd-BSA)；Gd-DTPA-双(硬脂酸酰胺)(GdDTPA-BMA)；l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基基-3-磷酸乙醇胺二乙烯-三胺五乙酸:Gd3+(DMPEDTPA:Gd3+)；D35-1.2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；Gd(III)2-{4,7-双-羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N"-胺基-甲基]-l,4,7,10-四-氮杂环十二碳-1-基}-乙酸(Gd.DOTA.DSA)；Gd(III)l,4,7,10-四氮杂环十二烷-l,4,7,10-四乙酸单(N1-胆固醇氧基-3-羰基-l,2-乙二胺)胺基(Gd.DOTA.Chol)；Gd(III)l,4,7,10-四氮杂环十二烷-l,4,7,10-四乙酸单(N1-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)胺基(Gd.DOTA.DSPE)和Gd(III)二亚乙基三胺-l,l,4,7,10-五(乙酸)-10-乙酸单(Nl-胆固醇氧基-3-羰基-l,2-乙二胺)胺基(Gd.DTPA.Chol)。

实施例中，所述纳米颗粒制剂的组成，以成分(i)至(iv)的摩尔比例而言，满足以下范围：(i)10至50；(ii)10至50；(iii)20至70；and(iv)1至20。更优选地，成分(i)至(iv)的摩尔比例满足以下范围：(i)20至40；(ii)20至40；(iii)25至55；and(iv)1至10。在特别优选的实施例中，成分(i)至(iv)的摩尔比例满足以下范围：(i)30至35；(ii)30至35；(iii)30至35；and(iv)1至5。

本发明的纳米颗粒制剂可能可以用于递送多种治疗剂，因此对制备药物具有广泛用途。具体而言，该制剂在与适当的治疗剂联用以预防或治疗肥胖症或癌症时，表现出优秀的疗效。在本发明的一个优选方面中，该纳米颗粒制剂包含包封短链脂肪酸(最优选为乙酸，其在用于预防或治疗肥胖症或癌症时疗效最佳)的脂质体。可以使用本发明纳米颗粒制剂来缓解的癌症具体形式包括：肝癌，例如肝细胞性肝癌、胆管细胞型肝癌和血管内皮细胞癌；结肠癌；以及肾癌，例如肾细胞癌和尿路上皮细胞癌。可以使用本发明技术缓解或治疗的其他病症包括代谢综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病、第二型糖尿病、高血压、心血管疾病、高胆固醇血症、癫痫症和中风(包括中风后遗症神经病学损伤)。

本发明的一个相关方面中，提供一种含有本发明纳米颗粒制剂以及一种或多种药学可接受的赋形剂的药学组合物。所述药学组合物可用作药物，尤其是用于预防或治疗如上所述的肥胖症或癌症。此外，该药学组合物可用于预防或治疗任何上述病症。

本发明的又一方面中，提供一种制备上述纳米颗粒制剂的方法，所述方法包括：提供含有所述(i)至(iv)部分的有机溶剂溶液，并蒸发所述溶剂以获得所述(i)至(iv)混合物的薄膜；以预定体积的极性溶液再水化所述薄膜，所述极性溶液可选地含有一种或多种治疗剂；搅动所述极性溶液，从而令所述(i)至(iv)混合物和所述一种或多种可选的治疗剂在所述极性溶液中形成分散系；可选地，用缓冲液处理所述分散系直至约pH7；以及可选地，过滤纯化所述分散系。

通常来说，以上述摩尔比例混合成分(i)至(iv)，可以在任何有机溶剂中混合，但优选为二氯甲烷(CH₂Cl₂)、氯仿(CHCl₃)、二甲基甲酰胺、甲苯、丙酮、乙酸乙酯。特别地，可以使用质子惰性有机溶剂，例如丙酮、二氯甲烷或氯仿。从可溶性角度而言，氯仿是极为优选的。可以使用极性溶液对最初生成的薄膜进行再水化，所述极性溶液可选地包含一种或多种治疗剂。所述极性溶液通常为质子溶剂，例如水、乙醇和甲醇，或所述溶液的畸形可以通过溶于其中的极性化合物来提高。例如，含有酸性化学物质的水溶液，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、乙酸、丙酸或丁酸。当所述一种或多种治疗剂为短链脂肪酸时，该极性溶剂优选为含有一种或多种短链脂肪酸的水溶液，最优选为乙酸溶液。

所述用于再水化薄膜的极性溶液中的一种或多种治疗剂的优选浓度范围为1mM-10M，更优选为50mM-2M，最优选为75mM-1.5M。例如，优选地，所述一种或多种治疗剂的浓度约为1M。可以通过搅拌、摇动或超声处理含纳米颗粒成分的极性溶液，以搅动制剂。从实用角度出发，优选为超声处理所需成分，因为其能够在极性溶液中产生更均匀的纳米颗粒分散混合物。例如，如本文实施例中，超声波处理可以使用MXB系列超声水浴(Grant Instruments,UK)最高设定在30℃下进行一小时。本文实施例中，搅动和缓冲处理后，优选地，使用膜或动态透析，例如使用尺码适用于100kD分子量的纳米颗粒的Float-A-Lyzer G2，按照Spectrum Labs的说明，通过透析过滤来纯化纳米颗粒混合物。

本发明的制备纳米颗粒制剂的方法中，所述分散系在缓冲处理到约pH 7之后且在分散系过滤纯化之前，在0-10℃温度下进行低温培养。如此进行低温培养步骤，令一种或多种治疗剂的包封更为有效，尤其是当治疗剂为乙酸盐时。

本发明的优选实施例中，该纳米颗粒制剂是包含以下内容的阳离子脂质体：(i)包含通式为H₂N(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH(CH₂)_zNHC(O)-的聚胺侧基的阳离子胆固醇衍生物，其中x＝1至4，y＝1至4，z＝1至4；(ii)含有C_10-20饱和脂肪酸链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和中性磷脂；(iii)胆固醇或选自以下各项的中性胆固醇衍生物：胆固醇乙酸酯、胆固醇丁酸酯、胆固醇戊酸酯、胆固醇辛酸酯、胆固醇十二烷酸酯、胆固醇油酸酯、和胆固醇硬脂酸酯；以及(iv)含有C_12-20饱和脂肪酸链和分子量约1500-2000的PEG链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物，其中包封有选自乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的短链脂肪酸。本发明的又一优选实施例中，该纳米颗粒制剂是包含以下内容的阳离子脂质体：(i)包含通式为H₂N(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH(CH₂)_zNHC(O)-的聚胺侧基的阳离子胆固醇衍生物，其中x＝1至4，y＝1至4，z＝1至4；(ii)含有C_10-20饱和脂肪酸链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和中性磷脂；(iii)胆固醇；以及(iv)含有C_12-20饱和脂肪酸链和分子量约1500-2000的PEG链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物，其中包封有选自乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的短链脂肪酸，且成分(i)至(iv)含量的摩尔比例各为20-40:20-40:25-55:1-10。本发明的更优选实施例中，该纳米颗粒制剂是包含以下内容的阳离子脂质体：(i)包含通式为H₂N(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH(CH₂)_zNHC(O)-的聚胺侧基的阳离子胆固醇衍生物，其中x＝1至4，y＝1至4，z＝1至4；(ii)含有C_10-20饱和脂肪酸链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和中性磷脂；(iii)胆固醇；以及(iv)含有C_12-20饱和脂肪酸链和分子量约1500-2000的PEG链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物，其中包封有浓度为10-10mM的选自乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的短链脂肪酸，且成分(i)至(iv)含量的摩尔比例各为20-40:20-40:25-55:1-10，且脂质体平均粒径在40-120nm的范围内。

本发明的又一个优选实施例中，该纳米颗粒制剂是包含以下内容的阳离子脂质体：(i)CDAN；(ii)含有C_10-20饱和脂肪酸链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和中性磷脂；(iii)胆固醇；以及(iv)含有C_12-20饱和脂肪酸链和分子量约2000的PEG链的磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物，其中包封有浓度为10-10mM的选自乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的短链脂肪酸。

在本发明的更优选实施例中，该纳米颗粒制剂是包含以下内容的阳离子脂质体：(i)包含通式为H₂N(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH(CH₂)_zNHC(O)-的聚胺侧基的阳离子胆固醇衍生物，其中x＝1至4，y＝1至4，z＝1至4；(ii)含有C_10-20饱和脂肪酸链的磷脂酰胆碱的饱和中性磷脂；(iii)胆固醇；以及(iv)含有C_12-20饱和脂肪酸链和分子量约2000的PEG链的磷脂酰乙醇胺饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物，其中包封有乙酸盐，且脂质体平均粒径在40-120nm的范围内。下面，将通过仅作为举例目的的实施例，并引用以下附图，详细说明本发明的细节内容。对于本文中的实施例，用丙酸和丁酸可以获得相仿结果。

附图说明

图1：本发明实施例2的制剂所含乙酸盐浓度变化下的纳米颗粒粒径分布。

图2：本发明实施例2的制剂所含乙酸盐浓度变化下的包封乙酸盐的¹H-NMR量化。

图3：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(i)(CDAN)含量变化下的纳米颗粒粒径分布。

图4：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(i)(CDAN)含量变化下的包封乙酸盐的¹H-NMR量化。

图5：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(ii)(DSPC)含量变化下的纳米颗粒粒径分布。

图6：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(ii)(DSPC)含量变化下的包封乙酸盐的¹H-NMR量化。

图7：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(ii)性质变化(DOPE和DLPC)下的纳米颗粒粒径分布。

图8：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(ii)性质变化(DOPE和DLPC)下的包封乙酸盐的¹H-NMR量化。

图9：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(iii)(胆固醇)含量变化下的纳米颗粒粒径分布。

图10：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(iii)(胆固醇)含量变化下的包封乙酸盐的¹H-NMR量化。

图11：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(iv)(DSPE-PEG)的PEG基团分子量性质变化下的纳米颗粒粒径分布。

图12：本发明实施例2的方法制得的制剂中成分(iv)(DSPE-PEG)的PEG基团分子量性质变化下的包封乙酸盐的¹H-NMR量化。

图13：本发明实施例2方法制得的制剂的各热稳定性下的纳米颗粒粒径分布。

图14：本发明实施例2方法制得的制剂的各热稳定性下的包封乙酸盐的¹H-NMR量化。

图15：对照移植瘤模型和以本发明实施例2的制剂处理的模型的肿瘤生长率。

图16：本发明实施例2的制剂每天2次腹腔灌注对高脂肪饲养的动物增重的影响。

图17：本发明实施例2的制剂每天2次腹腔灌注对高脂肪饲养动物的全身肥胖度的影响。

图18：脂质体结合的生物分布。(A)用LIP-FDG纳米颗粒(10MBq包封18F-FDG)注射C57BL/6小鼠后2小时的代表性PET、CT和PET/CT融合影像。(B)18F-FDG(对照)或LIPFDG(n＝4/组)注射后30分钟的兴趣区(ROI)记录数据的曲线下面积。(C-G)C57BL/6小鼠腹腔内注射LIP-Rhd后2小时采集到的代表性组织学图像。(C)肝脏；(D)心脏；(E)肌肉；(F)脾脏；(G)肺部。(H)腹腔内注射LIP-XG-Rhd后2小时采集到的移植性肿瘤的代表性组织学图像。(I-K)LITA-Gd或LITA(对照)纳米颗粒(n＝4/组)腹腔内注射后0、24、48小时后在ROI中记录到的T1值。(I)肝脏；(J)肾脏；以及(K)皮下脂肪。结果显示为平均值±SD。用学生t检验分析数据；*＝p<0.05,***＝p<0.001。

图19：乙酸盐包封和量化。(A)4mM乙酸盐溶液的4.5ppm至-0.5ppm ¹H NMR图谱；(B)含白蛋白的4mM乙酸盐溶液的4.5ppm至-0.5ppm ¹H NMR图谱；(C)含白蛋白(2g)的LITA溶液的4.5ppm至-0.5ppm ¹H NMR图谱；(D)含白蛋白(4g)的LITA溶液的4.5ppm至-0.5ppm ¹H NMR图谱。丙酸三甲基硅脂在0ppm处提供参照。通常在2.03ppm处可观察到乙酸盐的峰值。展示了(E)不含乳酸盐的LITA纳米颗粒的NMR图谱以及(F)含乳酸盐(5.2mg乳酸钠)的LITA纳米颗粒的NMR图谱。使用Zetasizer Nano分析仪(Malvern，UK)来测定脂质体制剂的粒径，(G)和(H)分别展示了对照(含HEPES)和LITA(脂质体包封的乙酸盐)的粒径分布。(I)对照和LITA脂质体的平均粒径。

图20：线粒体热量测定。以乙酸盐(5mM)处理或不以乙酸盐(对照)处理HT-29细胞，并以体外Seahorse实验分析ATP产量。(A)ATP产量；(B)剩余呼吸；n＝4/组；**＝p<0.01；使用学生t实验分析数据(GraphPad Prism软件)；OCR：耗氧率(pMoles/min)。

图21：LITA纳米颗粒对HFD饲喂的小鼠的补偿作用。高脂饲喂(HFD)5周后的小鼠，每3天注射一次脂质体包封乙酸盐(LITA)纳米颗粒或对照(HEPES)，持续5周。(A)体重(g)变化；(B)累积食物摄入(g/week)；(C)全身肥胖度(％)的变化；(D)IHCL的变化；(E)血浆脂质和其他循环多肽(葡糖(mmol/L),胰岛素,三酸甘油酯(mmol/L),三酸甘油酯(mmol/L),瘦蛋白(ng/ml),脂肪连接蛋白(ng/ml),脂肪酶(U/L),自由脂肪酸(FFA)(μmol/L)；(F)发炎标记TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和KC/GRO在血清中的水平(([血清](pg/ml))。(G)LITA处理组与对照组相比的UCP2、PPARα、ACOX1、CPTA1、HDAC1和HDAC2的肝脏mRNA水平倍数变化；(H)HDAC蛋白的表达(对β-肌动蛋白正态化)；(I)组蛋白残留物acH4K12、acH3K9和m²H3K9(对总组蛋白正态化)表达。用学生t检验或双因素方差分析及邦弗朗尼事后检验分析数据；n＝8/组；*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。

图22：LITA纳米颗粒对HFD饲喂的小鼠的补偿作用。高脂饲喂(HFD)5周后的小鼠，每3天进行一次脂质体包封乙酸盐(LITA)纳米颗粒或对照(HEPES)的长期注射，持续5周。(A)器官重量-胰脏、肾脏、肝脏、肌肉、WAT、BAT、皮下、腹膜后、附睾、肠系膜；(B)微阵列数据(-log10(p值)vs log2倍数变化)；n＝8/组；*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。

图23：LITA纳米颗粒对HFD饲喂的小鼠的预防性作用。高脂饲喂(HFD)小鼠，并每3天注射一次脂质体包封乙酸盐(LITA)纳米颗粒或对照(HEPES)，持续6周。(A)体重(g)整体变化；(B)全身肥胖度(％)整体变化；(C)IHCL整体变化；(D)饱腹和空腹血浆水平；(E)饱腹和空腹血清葡糖(mmol/l)和胰岛素水平(ng/ml)(n＝18/组)、血浆脂质水平(mmol/L)(n＝12/组)、LDL、TriG、HDL、Chol、FFA和3OH-BTA；(F)LITA处理组与对照组动物(n＝6-8/组)相比的皮下和肠系膜脂肪组织mRNA表达倍数变化(白色柱为ATGL，黑色柱为HSL)；(G)LITA处理组与对照组动物(n＝6-8/组)相比的肝脏mRNA表达倍数变化，其中基因(Apo-B、Mttp、UCP-2、PPARα、PPARγ、PGC1a、ACOX1、CPT1、SREBP1、ACC、FASN、FOX01、GLUT2、IRS1、IRS2、TNFα、IL-6)按照功能分组(VLDL代谢、线粒体功能、β氧化、脂肪酸合成、葡糖代谢和发炎)；(H)肝脏切片的H&E染色；(I)线粒体每单位周长嵴数(n＝4/组)；(J)先例体复合物I-V(n＝5/组)的蛋白表达倍数变化。对适用数据，用学生t检验或双因素方差分析及邦弗朗尼事后检验进行多重比较(GraphPad Prism)；n＝24/组；*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。

图24：LITA纳米颗粒对HFD饲喂的小鼠的预防性作用。高脂饲喂(HFD)小鼠，并每3天注射一次脂质体包封乙酸盐(LITA)纳米颗粒或对照(HEPES)，持续6周。(A)每周食物摄入平均值(g)；(B)第五周开始时过夜禁食后进行的葡糖耐受测试(GTT，葡糖mmol/L/min)(n＝10/组)；(C)其他循环多肽(脂肪连接蛋白(ng/ml)、胃饥饿素(ng/ml)和GIP(ng/ml)(n＝6/组)、瘦蛋白(pg/ml)和白细胞介素-6(pg/ml)(n＝18/组)；(D)肝脏功能的3种标记的血清内浓度：丙氨酸转氨酶(ALT)、止血环酸(AST)和碱性磷酸酶(ALP)(均为U/L)(n＝12/组)；n＝24/组；**＝p<0.01；用双因素方差分析及邦弗朗尼事后检验分析数据(GraphPad Prism)。

图25：长期LITA纳米颗粒给药对线粒体形态和氧化磷酸化的作用。持续6周高脂饲喂(HFD)并注射LITA或对照纳米颗粒的小鼠的线粒体形态。(A)1200x放大的代表性透射电子显微镜图像(TEM)，用于计算线粒体数目；(B)4800x放大的代表性透射电子显微镜图像(TEM)，用于计算每个线粒体的嵴数目；(C)每一图像上的线粒体数目；(D)WB代表性图像，展示了线粒体复合物I-V；(E)预防性NFD研究中的对照和LITA对照小鼠的氧化磷酸化复合物I、III、V的平均荧光强度(MFI)；n＝12/组；以双因素方差分析来分析数据。

图26：LITA纳米颗粒对NFD饲喂小鼠的预防性作用。以正常脂肪饲料(NFD)饲喂小鼠，并每3天注射LITA纳米颗粒或对照(HEPES)，持续6周。A)体重(g)整体变化；(B)全身肥胖度(％)整体变化；(C)IHCL整体变化；(D)饱腹和空腹血浆脂质水平(mmol/L)(n＝6/组)；(E)饱腹和空腹血清葡糖(mmol/l)和胰岛素水平(ng/ml)(n＝8/组)；(F)LITA处理组与对照组动物(n＝6/组)相比的皮下和肠系膜脂肪组织mRNA表达倍数变化；(G)LITA处理组与对照组动物(n＝6/组)相比的肝脏mRNA表达倍数变化，其中基因按照功能分组；(H)肝脏切片的H&E染色；(I)线粒体每单位周长嵴数(n＝4/组)；(J)先例体复合物I-V(n＝5/组)的蛋白表达倍数变化。对适用数据，用学生t检验或双因素方差分析及邦弗朗尼事后检验进行多重比较(GraphPad Prism)；n＝24/组；*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。

图27：LITA纳米颗粒对NFD饲喂小鼠的预防性作用。以正常脂肪饲料(NFD)饲喂小鼠，并每3天注射LITA纳米颗粒或对照(HEPES)，持续6周。(A)每周食物摄入平均值(g)(n＝24/组)；(B)第五周开始时过夜禁食后进行的葡糖耐受测试(GTT)(n＝10/组)；(C)其他循环多肽(脂肪连接蛋白(ng/ml)(n＝6/组)、C-多肽(pg/ml)、胃饥饿素(pg/ml)、GIP(pg/ml)、胰岛素(pg/ml)、瘦蛋白(pg/ml)、MCP-1(pg/ml)、抵抗素(ng/ml)、白细胞介素-6(pg/ml)和TNF-α(pg/ml)(n＝12/组)；(D)肝脏功能的3种标记的血清内浓度：丙氨酸转氨酶(ALT)、止血环酸(AST)和碱性磷酸酶(ALP)(均为U/L)(n＝6/组)；(E)脂肪组织集中点的重量(n＝12/组)；**＝p<0.01；用双因素方差分析及邦弗朗尼事后检验分析数据(GraphPad Prism)。

图28：LITA纳米颗粒对鼠科HT-29结肠直肠瘤的作用。对小鼠进行HT-29结肠直肠癌细胞接种，并在确认肿瘤明显后，每3天以LITA纳米颗粒或对照(HEPES)纳米颗粒注射，持续4周。4周实验期间的(A)LITA注射和对照注射动物的代表性肿瘤移植物；(B)肿瘤粒径(mm²)；(C)肿瘤重量(mg)；(D)肿瘤体积(mm³)；以及(E)长期LITA给药后的移植性肿瘤的量化mRNA变化(对对照HEPES脂质体正态化)。用学生t检验或双因素方差分析及邦弗朗尼事后检验分析数据(GraphPad Prism)；n＝6/组；*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。

图29：对照(CON)或实施例2纳米颗粒(TX)处理的大鼠的损伤体积的MRI评估：阻塞后24h(1D)和1week(1WK)。

图30：接受对照(CON)或实施例2纳米颗粒(TX)的大鼠的(a)行进距离和(b)平均速度。

具体实施方式

实施例

实施例1：制备脂质体纳米颗粒

取适量体积的N¹-胆固醇氧基-羰基-3,7-二氮杂1,9-壬烷二胺(CDAN)、1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG2000)的有机溶剂(通常为CHCl₃)储备液，以32:32:35：1的摩尔比在5mL圆底烧瓶中混合以形成薄膜。该薄膜随后以一定量的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)(4mM,NaCl 135mM,pH 6.5)再水化，并进行超声处理，以生成脂质分散系，缓冲处理到pH7，并通过透析过滤进行纯化，以制得预定总脂质浓度的脂质体悬浮液。

实施例2：制备包封短链脂肪酸的脂质体。

取适量体积的N¹-胆固醇氧基-羰基-3,7-二氮杂1,9-壬烷二胺(CDAN)、1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG2000)的有机溶剂(通常为CHCl₃)储备液，以32:32:35：1的摩尔比在5mL圆底烧瓶中混合以形成薄膜。该薄膜随后以一定量的乙酸溶液(1M,CH₃CO₂H,pH 2.0)再水化，并进行超声处理，以生成脂质分散系，缓冲处理到pH7，并通过透析过滤进行纯化，以制得预定总脂质浓度的脂质体悬浮液。

制得脂质体包封的乙酸盐纳米颗粒(也称为“LITA”)，其中1mL溶液中含有约10¹¹纳米颗粒/ml。对粒径进行测定，如图1所示。

实施例3：制备荧光标记的脂质体。

取适量体积的N¹-胆固醇氧基-羰基-3,7-二氮杂1,9-壬烷二胺(CDAN)、1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)(DOPE-罗丹明)和1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG2000)的有机溶剂(通常为CHCl₃)储备液，以32:32:35：1的摩尔比在5mL圆底烧瓶中混合以形成薄膜。该薄膜随后以一定量的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)(4mM,NaCl 135mM,pH 6.5)再水化，并进行超声处理，以生成脂质分散系，缓冲处理到pH7，并通过透析过滤进行纯化，以制得预定总脂质浓度的脂质体悬浮液。

要制得含有包封短链脂肪酸的脂质体，可以使用实施例3的脂质组合物，执行实施例2的步骤。

实施例4：包封不同浓度的乙酸盐

使用不同浓度乙酸盐制备如实施例2所述的纳米颗粒。使用的乙酸盐浓度为1mM、10mM、100mM和1M。所得的纳米颗粒的粒径分布如图1所示。制成后，对每种浓度下包封的乙酸含量进行量化，结果如图2所示。如图所示，包封在纳米颗粒内的一系列乙酸盐浓度可以制得一系列粒径的纳米颗粒。

实施例5：不同的脂质组合物

按照实施例2制备含有包封乙酸盐的纳米颗粒制剂。

a)CDAN含量变化范围为10％-32％以及50％。纳米颗粒粒径分布如图3所示，其中可以看出，CDAN含量增加，造成颗粒粒径分布的减小。图4显示了以不同CDAN水平制得的纳米颗粒的乙酸盐¹H-NMR量化，且可以看出，每种都可以制得包封的乙酸盐。但是30％左右的摩尔比例被证实更为有效。

b)成分(ii)(DSPC)的含量变化范围为10％-32％以及50％。纳米颗粒粒径分布如图5所示，其中可以看出，DSPC含量增加，造成颗粒粒径分布更广，但粒径绝对值更小。图6显示了以不同DSPC水平制得的纳米颗粒的乙酸盐¹H-NMR量化，且可以看出，每种都可以制得包封的乙酸盐。但是30％左右的摩尔比例被证实更为有效。

c)成分(ii)的性质变化范围为DSPC到DOPE和DLPC。纳米颗粒粒径分布如图7所示，其中可以看出，DOPE和DLPC提供的粒径分布范围更宽，从约30-100nm。图8显示了所述成分制得的纳米颗粒的乙酸盐¹H-NMR量化，且可以看出，两种情况下都可以制得包封的乙酸盐。但得到的包封水平低于DSPC。

d)成分(iii)的变化范围为1％-10％。纳米颗粒粒径分布如图9所示，其中可以看出，10％胆固醇相对于1％，提供了极广的粒径分布。图10展示了所述成分制得的纳米颗粒的乙酸盐¹H-NMR量化，且可以看出，两种情况下都可以制得包封的乙酸盐。

e)成分(iv)(DSPE-PEG)的PEG基团性质变化，分子量变化范围为2000-5000。纳米颗粒粒径分布如图11所示，其中可以看出，分子量增加到5000得到的纳米颗粒小于分子量2000时的纳米颗粒。图12显示了以所述成分制得的纳米颗粒的乙酸盐¹H-NMR量化，且可以看出，每种都可以制得包封含量相仿的的乙酸盐。

实施例6：纳米颗粒制剂和热稳定性性质

根据实施例2制备含包封乙酸盐的纳米颗粒制剂，且在透析过滤之前或之后，在热(35℃)或冷(4℃)的不同温度条件下培养18小时，测试纳米颗粒粒径稳定性(即抗聚集的稳定性)。与图1和图2(室温下根据实施例2以1M乙酸盐制备)相比，图13中的结果显示，室温下在合理时间范围内制得的纳米颗粒是最优的。此外，图14中的¹H-NMR量化表明，冷透析过滤(约4℃)能够提高纳米颗粒内乙酸盐滞留的持久性。

实施例7：肝脏中的生物分布研究

根据实施例3所述，制备包含罗丹明脂质的纳米颗粒，然后对小鼠给药。标准计量给药(200μL)后2小时，对小鼠进行肝脏组织学分析。通过罗丹明荧光检测确认纳米颗粒。使用DAPI(4,6-双脒基-2-苯基吲哚)染色来展示视野内存在的完整肝细胞。使用荧光滤镜来消除非特异性背景荧光或其他非特异性实验人工产物。数据显示，纳米颗粒集中在肝脏内并介导乙酸盐向肝脏细胞的功能性给药。特别地，该数据暗示着阳离子脂质(例如，CDAN)有益于向肝脏进行包封后乙酸盐的功能性给药。

实施例8：结肠直肠癌的体内移植型模型

以每T-25烧瓶(Nunc，USA)2.5x10⁵细胞的密度接种所需细胞系，并在补充10％牛胎血清(FCS)(Sigma-Aldrich,UK)的Deulbecco改良伊戈尔培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich,UK)上以37℃、5％CO₂单层培养。每3-5天维护细胞一次，传代不超过15代。一旦细胞达到约80％汇合度，则除去培养基，收获细胞，以PBS洗涤，并添加胰蛋白酶(Sigma-Aldrich,UK)约5分钟。除去培养基，并以PBS洗涤3次，重新悬浮在无血清DMEM中，并以1000RPM离心5分钟。除去培养基，并以血球计计数。

制备结肠癌细胞系HT-29，并用25表针将含5x10⁶细胞的100μl无血清培养基皮下注射到balb/c裸鼠右侧。携带肿瘤的小鼠分为数组(n＝8)，接受含有每次注射约5x10⁸脂质体的200μL实施例2所述纳米颗粒制剂或对照纳米颗粒的腹腔内给药。鉴定裸鼠皮下移植型肿瘤需要14-20天。一旦肿瘤明显，则每三天进行长期注射给药，同时以游标卡尺测量肿瘤，假设形状为椭圆体，用以下等式来测定估计体积：体积＝长度*宽度*深度*π/6。

移植型肿瘤模型生长曲线(图15)显示，接受实施例2的纳米颗粒制剂的实验组，与对照组相比，其生长显著下降(p<0.001)。处理组之间的差异为新型纳米颗粒对结肠直肠癌尤其具有抗癌性质提供了充分而确凿的证据。

结果表示为平均值±平均值标准误差(SEM)，n＝每组动物或生物副本数目。用GraphPad Prism4(GraphPad Software,USA)执行分析。使用双因素方差分析法分析数据，以P<0.5来判定统计显著性。

实施例9：累积增重和全身肥胖度的下降

使用10周时长的体内模型对实施例2的制剂进行临床前相关性分析。小鼠用独立通风笼具分为每笼4只(IVCs)，饲养条件为22℃,70％湿度和12:12(6.30am–6.30pm)光：暗循环。小鼠可自由饮水，且在5周龄时开始饲喂占千卡摄入60％的高脂饮食，由SSNIFF(England,UK)提供并列举如下(表1)。

	高脂饮食
		粗脂肪	34
粗蛋白	24.1
		粗纤维	6
粗灰分	6.1
		淀粉	2.2
糖	22.4
		能量	21.4MJ ME/kg

表1

以高脂饲料饲喂小鼠5周，期间每周至少记录3次食物摄入和增重。小鼠5周龄时开始给予实施例2纳米颗粒或含HEPES的对照纳米颗粒，连续5周每3天腹腔内注射。注射体积为200μL，其中每次注射含有约5x10⁸纳米颗粒。在进行纳米颗粒疗法期间，小鼠仍保持高脂饲喂。第五周和第十周时，通过¹H MRS(磁共振扫描)测定全身肥胖度，这是通过实验前和实验后扫描脂肪含量进行的，以测定在体内环境中，进食高脂饲料时纳米颗粒是否对全身肥胖度有作用。

扫描前，动物禁食过夜16-18小时。扫描时，用2-3％异氟烷2/min氧气麻醉小鼠，俯卧置于RF线圈上，令肝脏位于线圈中央，并以4.7T Unity Inova MR扫描仪(Varian Inc,USA)进行扫描。扫描期间，使用呼吸垫来监控呼吸率，使用直肠探针来测量线圈温度，其中线圈温度以暖风机保持在37℃。

通过对全鼠的水峰进行匀场，以优化磁场均匀性。采集三维定位像来沿鼠腹设定一系列连续纵向层面，以覆盖全肝脏。使用通过全身MRI(磁共振成像)布置的2x2x2mm³体元的PRESS序列，以以下参数进行局部¹H肝脏MRS：TR 10s、TE 9ms、平均数64、普宽20000Hz。扫描总时间为约每只动物30分钟。使用MestRe-C软件来进行用¹H肝脏MRS测定IHCL的统计分析。

10周结束时，与对照组相比，纳米颗粒给药组的累积增重下降，如图16所示。除减重外，全身肥胖度也下降了，如图17所示。从该数据可以得到结论，哪怕保持高脂饲喂，该纳米颗粒也能起到对抗全身肥胖度在饮食影响下上升(如对照组)的保护作用，该下降是纳米颗粒的治疗性质的结果。

实施例10：纳米颗粒的制备和生物分布

使用各种成像模式来确认脂质体载体向肝脏和恶性组织的被动、非靶向给药。通过引入磷脂双层膜的包封产物(表2)来区分脂质体结合物。

表2

表2简述：(1)LIP：用于包封18F-FDG、乙酸盐和HEPES的标准脂质体结合物；(2)LIP-XG：以较高DSPE PEG2000百分比修饰的脂质体，用于提高恶性疾病动物模型中的肿瘤摄入；(3)LIP-Rhd：含有1％罗丹明(Rhd，一种用于组织学分析的荧光脂质)的脂质体；(4)LIP-XG-Rhd：含有额外1％罗丹明的LIP-XG，用于组织学分析；(5)LIP-Gd：以钆(Gd)修饰的脂质体，用于MRI生物分布分析；LIP：脂质体；LITA：以脂质体包封的乙酸盐；DSPC：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱；CDAN：N¹-胆固醇氧基-羰基-3,7-二氮杂1,9-壬烷二胺；DSPEPEG2000：1,2-二硬脂酰甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)-2000；DOTA：钆特酸葡胺；DOPE-罗丹明：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)；DSA：数字减影血管造影术。

以自由18F-FDG或包封18F-FDG的脂质体(LIP-FDG)对C57BL/6小鼠进行腹腔内注射后，对小鼠进行短期生物分布评估。注射后30分钟采集的LIPEDG组的代表性PET、CT和PET/CT融合影像如图18A所示。以脂质体给药的18F-FDG到达了包括肝脏、肾脏和肌肉在内的所有组织，在心脏和肌肉中观察到的18F-FDG摄入增加(图18B)。使用组织学技术检查以罗丹明(LIP-Rhd)标记的脂质体的组织特异性累积(图18C-G)。在肝脏和脾脏中观察到的LIP-Rhd浓度最高，心脏、肾脏和脑中的则最低(表3)。

表3

表3简述：对小鼠腹腔内注射200μl LIP-Rhd纳米颗粒溶液。注射后的第2、16、24和48小时采集器官并染色(n＝3/时间点)；在所述时间点上标记罗丹明的存在(Y)或不存在(-)。增强向恶性组织给药的纳米颗粒制剂在移植瘤中的摄入如图18H所示。通过使用磁共振成像(MRI)追踪脂质体(将脂质-钆复合物嵌入脂膜制得的脂质体(LIP-Gd))的生物分布，来评估纳米颗粒的长期累积。小鼠进行基线扫描后，腹腔内注射LIP-Gd或对照物，注射后24小时和48小时再次扫描。T1时的肝脏、肾脏和皮下脂肪变化分别如图18I-K所示。纳米颗粒优先聚集在肝脏中，如T1、注射后24小时和48小时的显著减少所示(24h:LIP-Gd:495.9±37.4msec,对照:804.1±81.8msec；p<0.05；48h:LITA-Gd:503±66msec,对照:738±80msec；p<0.05)。

实施例11：脂质体包封的乙酸盐制剂及其量化

确认目标组织对脂质体的优先摄入后，用乙酸盐(实施例2的“LITA”)或低离子强度缓冲液(HEPES)对照进行脂质体包封。制备+/-白蛋白的LITA制剂和无脂质体乙酸盐溶液，白蛋白已知会与乙酸盐结合，降低其NMR信号。白蛋白抑制了自由溶液中的乙酸盐NMR信号，而LITA纳米颗粒溶液中未观察到此种抑制(图19A-D)，这表明乙酸盐成功地包封在脂质体内。为了能够量化脂质体乙酸盐，以已知浓度的乳酸作为内标物扫描LITA制剂。脂质体乙酸盐浓度计算为26.45μg(2.2mM)/100μl(图19E-F)。每次LITA-注射中的乙酸盐浓度为2.6mg/kg，这比此前用于鼠科模型的胃内或口腔给药的浓度低一个数量级。脂质体制剂之间并无粒径区别(LITA:102.3±7.5nm；对照:95.9±9.0nm,p＝0.6,图19G-I)。

实施例12：乙酸盐对线粒体呼吸的体外作用

体外测定线粒体呼吸，来测定乙酸盐是否被用作能源，其中乙酸盐浓度与LITA实验方案中所用的剂量相仿(每100μl注射液中2.2mM)。据观察，乙酸盐(5mM)显著提高了ATP生成(p<0.01)(图20)。

实施例13：长期LITA-纳米颗粒给药对高脂饲喂的C57BL/6小鼠的补偿作用

用多个检查不同新陈代谢产出的体内模型评估LITA纳米颗粒(实施例2)的新陈代谢潜力。首先，通过高脂饲喂(HFD)小鼠5周来建立致肥胖背景。随后的5周内，对小鼠每3天1次进行LITA或对照纳米颗粒的腹腔内注射，同时保持HFD。两组之间观察到体重差异(图21A)或累积食物差异(图21B)。HFD最初5周后，以及接下来的5周长期注射后，通过¹H MRS测定全身肥胖度和IHCL。全身肥胖度(LITA:9.0±16.7％；对照:40±21.8％,p＝0.02)(图21C)和IHCL(LITA:-0.11±0.06,对照:2.4±0.9,p<0.0001)(图18D)在LITA处理的动物中显著降低。白色脂肪组织(WAT)亦下降(LITA:3.4±1.2g,对照:4.3±1.2g,p<0.01)，而棕色脂肪组织(BAT)水平变化较小(图22A)。观察到了循环葡萄糖、胰岛素或脂质的变化(图21E)。注射LITA的动物的确表现出血清趋化因子KC/GRO(p<0.05)的降低(代表着炎症症状降低)和IL-10(致炎症细胞因子生成受抑制的一种标记)增加(p<0.05)(图21F)。肝脏mRNA的量化RT-PCR表明LITA处理的动物中UCP-2表达显著降低(图21G)。RT-PCR肝脏分析表明，LITA诱导的HDAC1表达下降(p<0.001)(图21G)，而免疫印迹分析表明了HDAC2(p<0.051)和HDAC7(p<0.001)的显著差异(图21H)。组蛋白赖氨酸蛋白对总组蛋白的正态化分析表明了LITA组中剩余acH4K12的降低(图21I)。微阵列分析也确认了包括1类HDAC在内的代谢相关基因表达中的显著变化(图22B)。

实施例14：LITA纳米颗粒长期给药对HFD的C57BL/6小鼠的预防作用

在第二种饮食模型中，评估了LITA纳米颗粒(实施例2)对致肥胖饮食相关结果的发展的预防潜力。HFD饲喂的小鼠每3天腹腔内注射LITA或对照纳米颗粒，持续6周。观察到体重(图23A)或每周食物摄入(图24A)方面的差异。与此前的模型相一致地，长期LITA处理显著降低了肥胖累积(LITA:24.1±9.7％；对照:30.8±9.7％,p＝0.03)(图23B)和IHCL(LITA:-0.01±0.7,对照:0.03±0.05,p＝0.05)(图23C)。LITA注射降低了血清胰岛素水平(LITA:0.6±0.3ng/ml,对照:1.1±0.7ng/ml,p<0.05)，并提高了空腹血糖(LITA:8.6±1.8mmol/L,对照:7.4±1.5mmol/L,p＝0.02)(图23D)。注射LITA的小鼠的葡糖耐受试验(GTT)中发现葡糖清除率的降低趋势(图24B)。使用内稳态模型评估(HOMA)指数，观察到胰岛素敏感性的差异(LITA:6.1±2.5,对照:6.7±2.3,p＝NS)。LITA处理动物中还观察到血糖炎性标记下降的趋势(TNF-α:LITA:5.4±3.4pg/ml,对照:10.6±8.5pg/ml,p＝0.06；IL-6:LITA:17.4±17.6pg/ml,对照:39.7±35.5pg/ml,p＝0.06)(图24C)。血清脂质浓度差异微小(图23E)，但注射LITA的小鼠表现出皮下脂肪组织(SAT)脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)mRNA表达的下降(p<0.01)(图23F)，暗示着外围脂肪调用的降低。注射LITA的动物中，血清自由脂肪酸(FFA)大幅下降(LITA:0.36±0.08nmol/L,对照:0.75±0.2nmol/L,p<0.05)，而血清中的酮、3-羟基丁酸浓度提高(LITA:0.29±0.1nmol/L,对照:0.18±0.03nmol/L,p<0.05)(图23E)。通过标准肝功能测试和mRNA定量RT-PCR评估肝功能。在注射LITA动物中观察到作为肝功能标记的天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)在血清中的浓度降低(AST:LITA:106±26U/L,对照:201±87U/L,p＝0.02and ALP:LITA:57.5±14U/L,对照:76.9±20U/L,p＝0.02)(图24D)。长期LITA注射还导致了参与脂肪酸合成(FAS)的基因的mRNA表达的显著降低，其中包括固醇调控因子-结合蛋白-1(SREBP1)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶基因(FASN)(图23G)。LITA给药还导致了参与β-氧化的基因基因的mRNA表达的显著降低，其中包括肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT1)、乙酰辅酶A氧化酶-1(ACOX1)和VLDL合成；微粒体甘油三酯转运蛋白(Mttp)(图23G)。与此前的HFD模型一致地，注射LITA的小鼠表现出降低的UCP-2水平(图23G)。此外，LITA处理的小鼠与对照处理小鼠相比，表现出肝脏的微空泡化下降(图23H)。对肝脏线粒体形态的透射电子显微镜分析表明，线粒体数目并无差别(图25A-C)，但注射LITA的小鼠具有嵴/周长增加的趋势(p＝0.07,图23I)。LITA动物中观察到氧化性磷酸化作用复合物III(+62％)、IV(+91％)、V(+69％)蛋白表达的显著增加(图23J和图25D)。长期LITA注射还导致了叉头框蛋白O1(FOXO1)mRNA在肝脏中的表达下降(图23G)，表明糖异生作用下降。此外，LITA给药后，还观察到肝脏对葡糖的摄入降低，表现为葡糖转运蛋白2(GLUT2)mRNA下降(图23G)和空腹葡糖上升(图23D)，而伴行的食物摄入并无差异。

实施例15：长期LITA纳米颗粒给药对正常脂肪饲喂(NFD)的C57BL/6小鼠的预防作用。

下一模型中，评估了LITA给药对正常饮食背景的作用。NFD饲喂的小鼠每3天腹腔内注射LITA(实施例2)或对照纳米颗粒，持续6周。观察到体重(图26A)或每周食物摄入(图27A)方面的差异。观察到全身肥胖度的差异(LITA:3.9±4.4％,对照:6.6±9.1％,p＝NS)(图26B)。注射LITA的小鼠中观察到IHCL的显著降低(LITA:-0.01±0.08,对照:0.05±0.05,p<0.05)(图26C)，记录了饱腹或空腹胰岛素或血糖水平(图26D)差异或长期注射5周后的GTT测试差异(图27B)。注射LITA动物中观察到HOMA-IR指数的显著降低，暗示着增强的胰岛素敏感性(LITA:1.9±1.4；对照:3.6±1.5,p＝0.03)。LITA注射小鼠的血清炎性标记抵抗素和TNF-α显著降低(抵抗素:LITA:13.6±1.8ng/ml,对照:17.2±4.8ng/ml,p<0.05；TNF-α:LITA:14.8±8.5pg/ml,对照:46.9±33.1pg/ml,p<0.01)。LITA注射动物的血清中，三酸甘油酯水平(LITA:0.79±0.09mmol/L,对照:1.03±0.22mmol/L,p＝0.05)(图26E)和瘦蛋白水平(LITA:1921±935pg/ml,对照:2889±1209pg/ml,p<0.001)(图27C)也显著降低，而胆固醇、HDL或LDL水平则无差异(图26E)。LITA给药后，WAT和肠系膜AT也显著降低(WAT:LITA:1.36±0.24g,对照:1.5±0.17g,p<0.05；肠系膜:LITA:0.16±0.04g,对照:0.19±0.01g,p<0.05)(图27D)。从附睾和皮下集中点处分离脂肪细胞，并记录各组间的平均数量、体积或表面面积。从注射LITA的动物分离的AT表明，与对照相比，激素敏感性脂肪酶(HSL)mRNA的表达下降(与对照相比的倍数变化:0.05±0.08,p<0.001)(图26F)，反映出外围脂质调用的下降。与预防性HFD模型的结果相似地，肝脏mRNA样本的定量RT-PCR分析显示，LITA诱导了参与VLDL代谢(Apo-B、Mttp)、β-氧化作用(ACOX-1、CPT-1)、线粒体氧化作用(PPARγ、PGC-1)、葡糖代谢(GLUT-2、IRS-1、IRS-2)和发炎(TNFα)的基因表达的降低(图26G)。组织学检查表明，所有NFD小鼠均具有正常肝脏结构，而LITA注射小鼠的微空洞化低于对照组(图26H)，表明炎症的降低。比较了组间的线粒体氧化磷酸化复合物活性(图25E)。

实施例16：LITA纳米颗粒给药对移植瘤转移的代谢作用

LITA纳米颗粒(实施例2)的给药使得肿瘤粒径的显著降低(LITA:107±113mm2,对照:270±87mm2,p＝0.04)(图28A-C)。肿瘤体积进展在注射LITA的动物中显著降低(肿瘤体积(第四周):LITA:123±119mm3,对照:254±93mm3,p<0.05)(图28D)。注射LITA的动物中，移植瘤mRNA的定量RT-PCR表明，1类HDACs表达的显著下降：HDAC 1(p<0.05)、HDAC 2(p<0.05)、HDAC 3(p<0.001)和HDAC 4(p<0.01)(图28E)。此外，注射LITA的动物中，负责表观沉默mRNA的“沉默交配型信息调节因子同系物”，即SirT蛋白，也显著减少(SirT1,p<0.05)(图28E)。

实施例17：纳米颗粒对大鼠MCAO中风模型的作用

使用大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型，测定实施例2纳米颗粒(包封有乙酸盐)对中风后脑组织的保护和回复的潜在疗效。

方法

实验动物：获取斯普拉-道来氏(Sprague-Dawley)大鼠(雄性，230-250g,n＝20Harlan)，并允许适应5-7天之后，再诱导大脑中动脉闭塞(MCAO)。将大鼠随机分配为相似体重的两组。

诱导中风：诱导MCAO前，进行神经评分(见下)。为了诱导MCAO，以2％异氟烷、混合氧气-空气(30:70)麻醉大鼠。以中线切口暴露颈总动脉，并从颈动脉获取血样，并取得血浆(见下)。将末端以硅橡胶涂覆的5-0单丝尼龙缝线(0.33mm直径,4-5mm长度)插入颈内动脉并沿动脉前行20-22mm，以阻断流向大中脑动脉(MCA)的血液。阻塞时，腹腔内注射载体或处理(1ml)，然后允许动物从MCAO期间的麻醉中回复。90分钟的MCAO后，麻醉动物，并完全取出细丝，以允许MCA再灌注。皮下注射盐水(3ml)以降低可能的脱水。手术期间，使用加热毯和结肠探针保持体温。

2周观察期内，每天对动物腹膜内给药对照纳米颗粒(1ml)或实施例2的纳米颗粒(1ml)。实验期内，全程记录体重和神经评分。

处理评估：阻塞后24小时和2周时，执行磁共振成像(MRI)。2周时，还执行纹状体的¹H磁共振波谱(MRS)分析。后一时间点的MRI和MRS之前，先进行开场实验，以评估大鼠的自发活动性。

后一时间点的MRI和MRS后，以4％多聚甲醛(PFA，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，见下)灌注固定脑部。灌注后，收获大脑并以4％PFA进一步固定1周，然后置于30％蔗糖(PBS)中，以进行后续的冷冻切片和免疫荧光检验。

磁共振法：以异氟烷、混合氧气-空气(30:70)麻醉大鼠。小心地将大鼠头部定位在内径为43mm的正交体积MRI线圈中央，然后放入7T Agilent MR扫描仪的磁孔内。阻塞后24小时、1周和2周时，执行T2加权MRI，以展示MCAO损伤的粒径和程度。T2加权MRI图像中的损伤体积手动分段。

行为-神经评分-开场实验：执行开场实验以评估自发活动性和类焦虑行为。行为测试是在安静和昏暗的行为室中，白色无特征的活动场中进行的。将大鼠单独置于活动场中，通过置于活动场正上方天花板上的录像机记录其行为30分钟。大鼠走动的总距离和平均速度通过EthoVision XT软件(Noldus,Wageningen,Netherlands)进行测量。记录结束后，将大鼠送回笼子，每组动物实验之间，用70％IMS溶液彻底清洁活动场。

实验结果

损伤体积的MRI评估：以实施例2的纳米颗粒处理的大鼠在阻塞后24小时的MRI评估损伤体积小于对照组(91.33±24.63mm³vs 143.4±44.1)。从阻塞后24小时到阻塞后1周，两组的损伤均有降低(图29)。

行为评估-开场实验：与阻塞后以对照纳米颗粒给药的大鼠相比，以实施例2的纳米颗粒给药的大鼠行进的距离更远(P<0.05)，速度也更快(P<0.05)(图30)。

总结

上述结果表明，纳米颗粒包封的乙酸盐充当了有力的多功能药用活性成分(API)，能够预防和逆转肥胖症和癌症的指示性病理特征的发展。使用组织学和成像对18F-FDG、罗丹明和钆标记的脂质体进行生物分布评估，确认了LITA纳米颗粒具有天然肝脏亲和性。特别地，脂质体膜中DSPE-PEG²⁰⁰⁰摩尔百分比的提高，使得脂质体有限聚集在肿瘤组织。

在受试的所有饮食模型中，长期LITA给药均显著降低了补偿性和预防性HFD示例的肝细胞内脂肪(IHCL)和肥胖度。这些变化的发生独立于降低的食物摄入或体重。应当注意，LITA给药不仅减缓了聚集，还活跃地降低了IHCL。肝脏脂质积累是一系列逐渐衰弱的肝脏状态的关键性媒介，且与胰岛素抗性和糖尿病进程强烈相关。LITA诱导的IHCL降低暗示着纳米颗粒不仅能够预防NAFLD，还可以调控后续的肝细胞癌(HCC)的发展进程。据观察，LITA注射在HFD和NFD模型中分别降低了FFA和三酸甘油酯的循环水平。数据表明，LITA给药降低了参与外周脂质调用、肝脏脂肪生成和脂质摄入的蛋白的表达，提供了一种显著降低IHCL的未来机制。此外，除了降低肥胖症和IHCL外，对肝功能的检验表明，还存在其他益处。HFD和NFD模型中均观察到UCP-2表达的降低，反映了线粒体跨膜质子泄漏降低，电化学势干扰降低，且细胞器效率上升。HFD模型中每单位周长嵴数的增加趋势，以及OXPHOS复合物蛋白表达的增加，都表明ATP生成量的提高。此外，LITA诱导的血清AST和ALP下降表明其功能增强。

LITA给药使得NFD和HFD模型的TNF-α在肝脏中的表达降低，且有TNF-α、IL-6和抵抗素在血清中的浓度降低的趋势。此外，若LITA给药继续，则可以预期，在所有饮食示例中均观察到的脂肪量和IHC下降将对炎性倾向的长期改善具有益处。LITA给药后的变化在所有饮食示例中并不一致，其中脂肪酸合成、循环FFA、炎症和肝功能的胰岛素和血清标记的降低，均只限于HFD示例。正常饮食条件下，肝脏乙酸盐的增加与长期禁食期间的脂肪酸氧化的上调有关。可以料想，在NFD背景中，将肝脏乙酸盐水平升高诠释为饥饿信号的补偿性内稳态机理，将导致对LITA给药的沉默代谢反应。

乙酸盐补充使得肝脏乙酰辅酶A生成提高，在线粒体摄入后，乙酰辅酶A可以进入TCA循环以提高ATP生成，如HFD模型的细胞组织中观察到那样，或进入生酮途径，如预防性HFD模型中观察到的那样。由于生酮途径仅发生在肝脏线粒体中，因此LITA在血清中诱导羟基丁酸酯升高是一个重要的发现，间接证实了乙酸盐体内递送至肝脏线粒体。由于肝脏中明显缺乏线粒体乙酰辅酶A合成酶(AceCS2)表达，可以料想，来自LITA纳米颗粒的乙酸盐被胞质酶(AceCS1)转化成了乙酰辅酶A，然后浸入了线粒体。但是，数据结果却与此相反，在NFD和HFD模型中，长期LITA注射均降低了控制β-氧化途径的基因的表达。乙酸盐代谢的方式和速率可以解释这些差异，其中脂质体纳米颗粒提供的给药更为稳定，且主要是对肝脏给药，与之相比，快速浓注或口腔喂食则导致更迅速的全局摄入。

综上所述，实验结果支持LITA诱导的线粒体乙酰辅酶A积累抑制β-氧化从而降低脂质摄入、脂质生成和肝脏摄入的机理。此外在，这些变化也与作为燃料的乙酸盐的可用度产生代谢信号，通过抑制唐分解和葡萄糖异生作用途径来阻碍对葡糖的使用的假设。在LITA注射动物中，从碳水化合物代谢切换到其他代谢可能预期得到不同的呼吸产出，但代谢笼分析并未发现任何差异。但是，这些结果受到若干报告乙酸盐取代脂肪成为氧化燃料因而灌注乙酸盐维持了能量支出的论文的支持。

SCFAs的抗肿瘤生成效果与HDAC酶(在细胞基因表达中起到关键作用的表观遗传标记物)表达的变化有关。癌细胞中的SCFA的无效代谢被认为造成了乙酰辅酶A在细胞核中的积累，乙酰辅酶A在细胞核中充当可改变参与细胞增殖、凋亡和分化的基因的表达的HDAC抑制剂。虽然此前的研究试图通过补充SCFA、丁酸盐来靶向并中断结肠癌细胞中改变的细胞代谢，这些结果支持该假设；LITA长期给药显著降低了肿瘤生长，并降低了数类HDACs中的mRNA表达。因此，可预期，LITA补充诱导了燃料选择从有氧糖酵解到线粒体β-氧化的切换，代表着将癌细胞代谢重新改编到正常的非增殖性状态，尤其是组蛋白脱乙酰酶(SirT1，对细胞凋亡的抑制和促进肿瘤发生具有关键性作用)表达的下降。

总而言之，LITA给药全面改善了肥胖症和癌症的动物模型的代谢状况，包括癌症生长降低，以及许多不同代谢综合征相关结果的改善，包括IHCL、体脂、血清胰岛素、FFA和发炎状态的下降。对中风模型的给药也证实是有价值的。

Claims

1.适于递送一种或多种治疗剂的纳米颗粒制剂，所述制剂包括：

i)阳离子胆固醇衍生物；

ii)中性磷脂；

iii)胆固醇或中性胆固醇衍生物；以及

iv)磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，进一步包括一种或多种治疗剂。

3.根据权利要求2所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述治疗剂密封在所述纳米颗粒中。

4.根据权利要求2或3所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述一种或多种治疗剂包括至少一种短链脂肪酸。

5.根据权利要求4所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述短链脂肪酸选自乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。

6.根据权利要求5所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述短链脂肪酸为乙酸盐。

7.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述纳米颗粒为阳离子脂质体。

8.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述纳米颗粒的平均粒径在1-500nm之间，优选为40-120nm。

9.根据权利要求3至8中任一项所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，密封后的治疗剂的浓度在0.1-20mM之间，优选为1-10mM之间。

10.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述阳离子胆固醇衍生物包括具有聚胺碳氢化合物侧链的胆固醇。

11.根据权利要求10所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述聚胺碳氢化合物侧链的通式为：H₂N(CH₂)_xNH(CH₂)_yNH(CH₂)_zNHC(O)-，其中x＝1至10，y＝1至10，z＝1至10。

12.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述中性磷脂为饱和中性磷脂。

13.根据权利要求12所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述饱和中性磷脂是磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺磷脂。

14.根据权利要求13所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺磷脂包含C_12-20脂肪酸链。

15.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物包含C_12-20脂肪酸链。

16.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱的饱和脂肪酸聚乙二醇化中性衍生物包含分子量为至少100，优选为至少1000的聚二乙醇链。

17.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，(i)至(iv)部分的摩尔比例如下：

(i)20至40；

(ii)20至40；

(iii)25至55；以及

(iv)1至10。

18.根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，进一步包括肿瘤靶向剂。

19.根据权利要求18所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述肿瘤靶向剂包括针对肿瘤细胞中的受体的配体；相对于所述受体在哺乳动物非肿瘤组织细胞的表达，该受体在所述肿瘤细胞中过量表达。

20.根据权利要求19所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述肿瘤靶向剂包括叶酸部分。

21.根据权利要求19所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述肿瘤靶向剂为磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物。

22.根据权利要求21所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物为DSPE-PEG(2000)-叶酸，即二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的纳米颗粒制剂，其特征在于，所述叶酸部分在所述制剂中的含量为总制剂的1-2mol％。

24.根据权利要求2至23中任一项所述的纳米颗粒制剂用作药剂的用途。

25.根据权利要求2至23中任一项所述的纳米颗粒制剂用于预防或治疗代谢失调的用途，所述代谢失调包括肥胖症、心血管疾病、第二类型糖尿病、中风、癫痫症或癌症。

26.用于制备根据权利要求2至23中任一项所述的纳米颗粒制剂的方法，所述方法包括：

提供含有所述(i)至(iv)部分的有机溶剂溶液，并蒸发所述溶剂以获得所述(i)至(iv)混合物的薄膜；

以预定体积的含有一种或多种治疗剂的极性溶液再水化所述薄膜；

搅动所述极性溶液，从而令所述(i)至(iv)混合物和所述一种或多种治疗剂在所述极性溶液中形成分散系；

可选地，用缓冲液处理所述分散系直至约pH7；以及

可选地，过滤纯化所述分散系。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，对所述极性溶液的搅动是通过超声处理进行的。

28.根据权利要求26或27所述的方法，其特征在于，对所述分散系的纯化是通过渗析过滤进行的。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其特征在于，在用缓冲液处理所述分散系直至约pH7之后和纯化之前，对所述分散系进行0至10℃的低温培养。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其特征在于，用于再水化所述薄膜的极性溶液中所含的一种或多种治疗剂的浓度为1nM至10M之间，优选为50nM至2M之间。

31.含有根据权利要求1至23中任一项所述的纳米颗粒制剂以及一种或多种药学可接受的赋形剂的药学组合物。

32.根据权利要求31所述的药学组合物用作药物的用途。

33.根据权利要求31所述的药学组合物用于预防或治疗代谢失调的用途，所述代谢失调包括肥胖症、心血管疾病、第二类型糖尿病、中风、癫痫症或癌症。