EP1335936A2 - Hyphenspezifische faktoren aus candida albicans - Google Patents

Hyphenspezifische faktoren aus candida albicans

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EP1335936A2
EP1335936A2 EP01949334A EP01949334A EP1335936A2 EP 1335936 A2 EP1335936 A2 EP 1335936A2 EP 01949334 A EP01949334 A EP 01949334A EP 01949334 A EP01949334 A EP 01949334A EP 1335936 A2 EP1335936 A2 EP 1335936A2
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EP
European Patent Office
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protein
nucleotide
antibody
proteins
candida
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EP01949334A
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English (en)
French (fr)
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EP1335936B1 (de
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Steffen Rupp
Franz-Josef Johannes
Kai Sohn
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Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/788—Of specified organic or carbon-based composition
    • Y10S977/789—Of specified organic or carbon-based composition in array format
    • Y10S977/79—Of specified organic or carbon-based composition in array format with heterogeneous nanostructures
    • Y10S977/791—Molecular array
    • Y10S977/792—Nucleic acid array, e.g. human genome array

Definitions

  • the present invention relates to biochips, in particular nucleotide chips which contain nucleotide sequences coding for hyphen-specific proteins, protein chips which contain hyphen-specific proteins and antibody chips which contain antibodies directed against these hyphen-specific proteins, diagnostic compositions which contain these nucleotide, protein - or contain antibody chips, methods for finding and identifying substances which are therapeutically effective against diseases caused by Candida species, and methods for diagnosing a disease caused by Candida.
  • sprouting mushrooms or yeasts also include asporogenic yeasts, such as yeasts of the genus Candida. Some members of the Candida genus are able to form mycelial clusters, others only multiply by sprouting.
  • Candida albicans is the most commonly isolated human pathogenic fungus.
  • Candida albicans often causes opportunistic infections, i.e. infections caused by normally relatively unproblematic germs in immunosuppressed patients. Such infections take a severe course in these patients and shorten them Survival, for example HIV-infected people or cancer patients treated with chemotherapy or radiotherapy, is crucial.
  • Such microscopic native preparations only allow the detection of polymorphic fungal cells (hyphae, pseudo-hyphae and blastospores) and spores, but without the exact species being able to be determined and suitable therapeutic measures being able to be initiated. In addition to microscopic detection, it is therefore essential to create cultures for exact species identification.
  • a further diagnostic option which has not yet had the hoped-for value, is the detection of Candida antigen in the patient's serum.
  • a high titer speaks for a systemic Candida infection, but is not proof, whereas a negative result cannot rule out a systemic infection.
  • the technical problem on which the present invention is based is therefore to provide means and methods for the diagnosis of infections caused by Candida albicans and for the development of substances which are therapeutically active against diseases caused by Candida.
  • the invention solves the technical problem on which it is based by providing biochips, in particular a nucleotide chip, comprising a fixed support and at least one nucleotide sequence fixed thereon, which code for the identification and transcription of a gene coding for a hypha-specific protein from Candida, in particular Candida albicans , is suitable, whereby this leotide sequence is selected from the group consisting of:
  • a biochip is understood to mean a device which comprises a large number of biological substances, for example nucleotide sequences, proteins or antibodies, in immobilized or fixed form and with the aid of which a small one by means of hybridization and / or binding methods Amount of ligand that can bind to the biological substance under appropriate conditions can be detected in a small sample.
  • a nucleotide chip is understood to mean a device which contains a large number of different nucleic acids or nucleotide sequences such as DNA or RNA in immobilized form and with the aid of which a small amount of a complementary nucleic acid in a small sample sample is used by means of nucleic acid hybridization. liquid or by means of DNA / protein binding assays detected a small amount of binding to nucleic acids, protein ⁇ the can.
  • the nucleotide chips according to the invention contain nucleotide sequences which are fixed to a solid support and which exclusively encode proteins expressed in the hyphal growing form of Candida albicans or which exclusively regulate the expression of hyphen-specific proteins. This means that the nucleotide sequences contained on the nucleotide chips according to the invention are not expressed during the yeast-like growth of Candida.
  • the nucleotide sequences described according to the invention and the proteins encoded thereby have no significant homologies, for example with proteins from Saccharomyces cerevisiae, a related, non-pathogenic, non-hyphal growing fungus.
  • hyphae filamentous growth, ie the formation of hyphae, is an important prerequisite for the development of the virulence properties of Candida (Mitchell, 1998, Curr. Opin. Microbiol., 1, 687-692).
  • Candida albicans forms that do not develop hyphae are avirulent in the model system (Mus musculus) (Lo et al., 1997, Cell 90, 939 to 949).
  • a hyphen-specific protein is therefore understood to mean a protein and / or peptide which is expressed exclusively in species of the Candida genus and is preferably of importance for the virulence of Candida, in particular Candida albicans.
  • the nucleotide sequences specifically used in the pathogenic form of Candida albicans and the proteins encoded by them are therefore excellent diagnostic aids for the detection of local or systemic candidiasis, in particular for the detection of local or systemic Candida albicans infections.
  • nucleotide sequences and proteins used according to the invention prove to be particularly valuable for the development of medicaments for combating candidiasis.
  • the nucleotide sequences and proteins according to the invention can be used as targets for the identification of substances specifically acting on them.
  • substance libraries can be examined for the interaction of the substances present in them with proteins according to the invention or nucleotide sequences according to the invention.
  • the invention therefore relates to a aforementioned nucleotide chip which contains a nucleotide sequence u which is a protein-coding nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 4, 13, 15 and 17.
  • These nucleotide sequences encode the ammosaur sequences shown in SEQ ID Nos. 5, 6, 7, 8, 14, 16 and 18. These sequences are particularly helpful in the Diagnosis of diseases caused by Candida species by enabling the targeted detection of the presence of Candida in surface swabs or organ biopsies.
  • nucleotide sequences according to the invention contained on such a nucleotide chip can be hybridized under stringent conditions with labeled DNA samples, which have been isolated from sources such as skin smears, biosie samples or specially designed fungal cultures or amplified by means of PCR methods. Since the nucleotide sequences according to the invention have no significant homologies with nucleotide sequences of related fungi, the detection of hybridization therefore allows the detection of Candida in a sample infected with fungi. However, the nucleotide sequences used according to the invention not only enable the simple detection of Candida, but also the detection that Candida grows in hyphal form and accordingly has virulent properties.
  • targeted mRNA can be isolated from skin smears or biopsy samples and / or amplified by means of the PCR method. After labeling with suitable labeling agents, the mRNA thus obtained is hybridized with the nucleotide chip containing the nucleotide sequences according to the invention. Since the nucleotide sequences according to the invention are transcribed and expressed exclusively during the hyphal growth of Candida, but not during the yeast-like growth, the detection of hybridization using isolated mRNA allows the detection that Candida the transition is in the hyphal and thus virulent growth phase.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide chip in another preferred embodiment, the nucleotide sequences containing the regula ⁇ innovative elements of hyphenspezifische Candida genes encoding proteins represent te so elemene ⁇ , particularly the transcription of functionally associated with such regulatory elements protein coding regions enable, for example, promoters, transcription termination signals, silencers, enhancers etc.
  • These particularly preferred nucleotide sequences can in particular be promoters, particularly preferably the promoter shown in SEQ ID No. 12.
  • the regulatory elements according to the invention in particular promoters, particularly preferably the promoter shown in SEQ ID No.
  • nucleotide chips which contain regulatory elements of hyphen-specifically expressed protein-coding nucleotide sequences can be used to identify substances of any kind which inhibit the interaction between the regulatory elements and the proteins which bind to them. So using such nucleotide chips it is possible Lich to identify substances that inhibit the expression hyphenspezifischer proteins and therefore potentially as specifically acting drugs ge ⁇ Candida infections can be used gen.
  • the invention relates to the aforementioned nucleotide chip, which has DNA, RNA or PNA sequences as the nucleotide sequence.
  • PNA peptide nucleic acid or polyamide nucleic acid
  • PNA sequences are molecules that are not negatively charged and act in the same way as DNA (Nielsen et al., 1991, Science, 254, 1497-1500; Nielsen et al ., 1997, Biochemistry, 36, 5072-5077; Weiler et al., 1997, Nuc. Acids Res., 25, 2792-2799).
  • PNA sequences comprise a polyamide backbone of N- (2-ammoethyl) glycm units and have no glucose units and no phosphate groups.
  • the nucleic acid molecules according to the invention which can be fixed to a support, can be isolated from natural sources, preferably from Candida albicans.
  • the nucleic acid molecules can be isolated and amplified by means of the PCR method, double-stranded molecules being obtained.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can, however, also be synthesized in vitro by known methods, single-stranded oligonucleotides or peptide oligonucleotides being obtained. By selecting suitable primers, desired regions of the nucleic acids according to the invention, that is to say both individual regions and the entire reading frame of the gene, can be amplified and isolated.
  • oligonucleotides with ammo modifications or biotm groups can be produced which can covalently bind to chemically reactive groups (epoxies) or streptavidm groups or derivatives thereof contained on the surface of the support material.
  • nucleic acids are provided with nucleoside derivatives containing photolabile protective groups.
  • nucleotide sequences which are generated by fusing the nucleotide sequences according to the invention with genes or components of genes from other sources can also be used for the nucleotide chip.
  • shortened nucleotide sequences of the aforementioned type can also be used, provided that these have the specified hyphality.
  • truncated nucleotide sequences have a length of at least 15 base pairs.
  • nucleotide chip also includes nucleotide sequences of the aforementioned type which hybridize with the aforementioned nucleotide sequences according to the invention.
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, as described in Sambrook et al. (Molecular clonmg. A laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press, 2nd edition 1989), preferably under strict conditions. According to the present invention, one speaks of a hybridization if, after washing for 1 hour with 1 x SSC and 0.1% SDS at 55 ° C., preferably at 62 ° C.
  • nucleotide sequence which hybridizes with one of the nucleotide sequences specified in the sequence listing under such washing conditions can be used for the nucleotide chip according to the invention by immobilization on the solid support.
  • the identification and isolation of hybridizing nucleotide sequences can be carried out, for example, using a nucleotide chip according to the invention which contains the aforementioned nucleotide sequences or parts of these molecules or of the complementary strand.
  • the I- dentlock and isolation hybridizing Nuc ⁇ leotidsequenzen inserted nucleotide chip may for example contain nucleotide sequences exactly have substantially the, or the nucleotide sequences or portions shown in SEQ ID Nos. 1 to 4, 12, 13, 15 or 17 of these sequences or complementary strands.
  • nucleotide chip can also contain synthetic fragments which are produced with the aid of conventional synthesis techniques and whose sequence essentially corresponds to that of a nucleotide sequence according to the invention.
  • nucleotide sequences can be isolated from clinical Candida isolates and made available for the nucleotide chip according to the invention which contain deviations or mutations from the nucleotide sequences shown in SEQ ID Nos. 1 to 4, 9 to 13, 15 or 17.
  • the molecules hybridizing with the nucleotide sequences according to the invention also include fragments, derivatives, functional equivalents and / or allelic variants of the nucleotide sequences described above, which encode a protein according to the invention or ensure its hyphen-specific expression.
  • “Fragments” are understood to mean parts of the nucleotide sequences that are long enough to encode the hyphen-specifically expressed protein or to ensure the hyph specificity.
  • the term “derivative”, “functional equivalent” or “mutant modification” means in connection with the present invention that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleotide sequences described above at one or more positions, but have a high degree of homology to these sequences at the nucleotide level.
  • Homology means a sequence identity of at least 40%, in particular an identity of at least 60%, preferably over 80%, and particularly preferably over 90%, 95%, 97% or 99% at the nucleic acid level.
  • the nucleotide chips according to the invention comprise nucleotide sequences fixed or immobilized on a solid support.
  • the term “solid support” means an insoluble matrix.
  • the solid support consists of a hydrophobic or weakly hydrophilic material, such as transparent glass, silicon dioxide, metal oxides, polymers and copolymers of dextrans or amides, For example, acrylamide derivatives, cellulose, nylon, or polymeric materials, such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polystyrene or polymethyl methacrylate or a polycarbonate of bisphenol A.
  • the carrier material is preferably coated with a surface activating agent such as poly before fixing the nucleotide sequences -L-Lysm, Polyethylenimm or Polyalkylamm pretreated to improve the fixation of the nucleotide sequences on the carrier material
  • a surface activating agent such as poly before fixing the nucleotide sequences -L-Lysm, Polyethylenimm or Polyalkylamm pretreated to improve the fixation of the nucleotide sequences on the carrier material
  • glass is used as a carrier with a silane coupling agent, which is an ammo group, an aldehyde group or an epoxy Group, pretreated for the
  • the nucleotide chip according to the invention can also be used for the commercially available, already coated carrier types such as Poly-L-Lysm (Sigma Diagnostics), super-aldehydes (Teleche), su- per-Amme (Telechem), Silane Prep (Sigma), CMT GAPS (Corning
  • Suitable carriers are those which are used for photolithographically produced nucleotide chips, for example those described in Lipshutz et al. (Lipshutz, Fodor, Gingeras and Lockhart, 1999, Nat. Genet., 21, 20-24).
  • carriers with coatings of poly-L-Lysm such as DeRisi et al. (DeRisi, JL, Iyer, VR and Brown, P.
  • poly-prep slides for example poly-prep slides (Sigma Diagnostics), or ammosilanes, such as silane-prep slides (Sigma), CMT GAPS Slides (Coming) and Super Amme (Telechem), or membranes such as CAST Slides or FAST Slides (Schleicher & Schull) are used.
  • ammosilanes such as silane-prep slides (Sigma), CMT GAPS Slides (Coming) and Super Amme (Telechem), or membranes such as CAST Slides or FAST Slides (Schleicher & Schull) are used.
  • epoxy-modified surfaces such as ArrayLmk Biochip (GeneScan Europe) or Epoxysilane Slides (Quantifoil) are particularly preferred.
  • the nucleotide sequences can be bound and fixed to the carrier substrate by chemical or photochemical reactions or by electrostatic interactions.
  • the immobilization or fixation of the nucleic acids on the carrier surfaces used takes place via an electrostatic bond or a covalent bond.
  • the Nuclemsauren can be covalently bound and fixed to suitable functional groups on the surface of the carrier material (Lamture et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, 2121-2125; Guo et al. , 1994, Nucl. Acids Res., 22, 5456-5465).
  • the nucleic acids can also be covalently bound to the surface-active carrier via spacers or a crosslinking agent, for example a bifunctional crosslinking agent.
  • a crosslinking agent for example a bifunctional crosslinking agent.
  • the nucleotide sequences are bound to the support in the case of polylys, aminosilane and membrane-coated nucleotide chips by means of UV crosslinking and in the case of epoxy-modified chips by means of a chemical reaction.
  • the binding of the nucleic acids to the carrier can of course also take place via photochemical reactions.
  • the photolabile protective groups are specifically cleaved off by means of photolysis following the immobilization.
  • a further preferred embodiment of the present invention therefore relates to processes for the production of nucleotide chips according to claim 1, comprising the isolation and / or amplification of at least one nucleotide sequence which encodes a hyphen-specifically expressed protein from Candida and / or comprises regulatory elements of this nucleotide sequence, or which chemical synthesis of this nucleotide sequence, the modification of the nucleotide sequence during or after the synthesis or Pen amplification by the incorporation of functional Grup ⁇ or spacer E units, applying a solution of the isolated or wass ⁇ gen synthesizing ⁇ th nucleotide to solid support material em and the immobilization of the nucleotide sequence at the transmitter by means of chemical or photochemical reaction or electrostatic interaction.
  • Another particularly preferred embodiment of the invention relates to protein chips, comprising a fixed carrier and at least one hyphen-specific protein fixed thereon, selected from the group consisting of:
  • a protein chip is understood to mean a device which contains a large number of different proteins or peptides in immobilized form and with the aid of which a small amount of a ligand, for example a protein or an antibody, which is attached to at least em protein or peptide fixed on the support covalently or non-covalently can bind in a small sample liquid.
  • a ligand for example a protein or an antibody
  • the protein chips according to the invention contain proteins fixed to a solid support, which are expressed exclusively in the hyphal growing form of Candida albicans, or parts thereof.
  • the protein chips according to the invention can therefore be used, for example, for the detection of antibodies which have been formed in the body of an organism, in particular a nipple, as a result of an immunization by antigen determinants of hyphal growing forms of candida, in particular hyphen-specific candida proteins .
  • the binding of at least one antibody from blood, lymph, body secretions or other body fluids of an organism to the protein chip according to the invention thus enables the detection of a systemic Candida infection in this organism which has led to the formation of the bound antibody.
  • the protein chips according to the invention can also be used, for example, to identify and isolate proteins from candida-infected materials that interact in vivo with the proteins contained on the protein chip. After identification and isolation of such merging proteins, the protein chips according to the invention can also be used to identify substances of any kind which can inhibit or require the interaction between the proteins according to the invention and thus merging proteins. Using the protein chips according to the invention, substances that can potentially be detected are suitable as medicaments for combating Candida infections, in particular for inhibiting the transition from yeast-like growth to hyphal growth of Candida.
  • the protem chip according to the invention in addition to the hyphen-specific proteins with the m SEQ ID No. 5, 6, 7, 8, 14, 16 and 18 also includes derivatives, may include functional equivalents or variants of these proteins.
  • derivatives, functional equivalents and variants are understood to mean in particular those derivatives of the proteins with the ammosaur sequences given in SEQ ID Nos. 5 to 8, 14, 16 and 18 which maintain the basic structure of these proteins by substitution obtained from atoms or groups of molecules and whose ammosaic sequences differ from the ammosaurus sequences given in m SEQ ID Nos.
  • the term "homology” denotes the degree of kinship between two polypeptides, which is determined by the extent of the match between these polypeptides.
  • a match can mean both an identical match, ie sequence identity, and a conservative ammosaur exchange Derivatives, variants or functional equivalents used a sequence identity to one each m SEQ ID No. 5 to 8, 14, 16 and 18 given ammosaic sequences of at least 80%, preferably 85% and particularly preferably of over 90%, 95%, 97% and 99% at the ammosaic level. The deviations from the ammosaur sequences shown in m SEQ ID No.
  • 5, 6, 7, 8, 14, 16 or 18 can arise, for example, from deletions, substitutions, insertions, additions, additions, exchanges or recombinations of the nucleotide sequences coding for the ammosaur sequences generated using technical means his. But it can also be naturally occurring variations thereby, example ⁇ as to end was a natural way ammonium acid sequence-changes.
  • Derivatives or variants of the hyphen-specific proteins according to the invention can originate, for example, from clinical isolates of Candida.
  • Such derivatives, functional equivalents or variants can differ from the proteins with the m SEQ ID Nos. 5, 6, 7, 8, 14, 16 and 18 shown, for example, by a changed stability, specificity, modified temperature, pH value - and / or concentration profile, a changed activity and / or a changed effector pattern.
  • Derivatives, functional equivalents or variants can also occur in other conformations or have different subunits or pre- and / or post-translational modifications. Despite the differences that may exist, the hypha-specific proteins with the m SEQ ID Nos.
  • 5, 6, 7, 8, 14, 16 and 18 have amino acid sequences and derivatives, variants or radio tional equivalents, however, certain common characteristics such as activity, molecular weight, immunological reactivity, conformation and / or physical properties, such as the running behavior in gel electrophoresis and its solubility and others.
  • the protem chip according to the invention fragments of the proteins with the ammosaur sequences given in SEQ ID Nos. 5 to 8, 14, 16 and 18 or of the proteins whose ammosaur sequence has a sequence identity of at least 80% to one of the ammosaur sequences defined in SEQ ID No. 5, 6, 7, 8, 14, 16 or 18.
  • fragments are understood to mean in particular those isolated regions of a protein which have fewer amino acids than the native protein, but whose length is sufficient for the isolated fragment to have at least one of the functions characteristic of the native protein, such as Can exert a binding capacity on a second protein, a specific catalytic activity etc.
  • the fragment of a protein comprises a protein region which is an antigenic determinant or an epitope and is therefore particularly binding of an antibody is suitable.
  • the hyphen-specific proteins according to the invention in particular the proteins with the ammosauresis shown in SEQ ID Nos. 5, 6, 7, 8, 14, 16 and 18 sequences that are immobilized on the protein chip according to the invention can have been isolated and purified from natural sources, for example from Candida-infected tissues or specially created Candida cultures, using conventional methods known in the art.
  • the proteins or fragments used can also be of synthetic origin.
  • peptides, ie fragments of the proteins according to the invention can be produced synthetically with the aid of the Mer ⁇ field (1985, Angew. Chem., 97, 801) method.
  • the hypha-specific proteins or peptides can be produced by means of conventional DNA recombination techniques.
  • the protein-coding nucleotide sequences according to the invention can be meserted and cloned using conventional vectors suitable for molecular biology and genetic engineering.
  • the protein-coding nucleotide sequences according to the invention are preferably inserted in such a way that they are under the control of regulatory elements, that is to say are operatively linked to them. These regulatory elements ensure the transcription and synthesis of translatable nuclear acid molecules in pro- and / or eukaryotic cells. Regulatory elements can be promoters, enhancers, operators, silencers and / or transcription termination signals, etc.
  • a suitable culture medium under such loading ⁇ are cultured conditions that allow formation of the de-coded by the nucleotide sequence protein coding hyphenspezifischen protein or a fragment thereof.
  • the protein or fragment thereof can then be isolated and purified from the host cell or the medium in which the host cell was grown using suitable methods.
  • suitable micro-transkr ⁇ pt ⁇ ons / translatons systems can also be used.
  • the hypha-specific proteins or fragments thereof are produced in bacterial expression systems, the proteins preferably being obtained as GST fusion proteins, HIS tag fusion proteins, pMAL fusion proteins, etc.
  • nucleotide chips according to the invention for example glass, silicon dioxide, other silica materials, polymeric materials such as fluoropolymers or metal oxides, can be used as the solid support for the protein chips according to the invention.
  • carrier materials are preferably pretreated before the proteins are immobilized, for example with silane coupling agents.
  • those described by Joos et al. described epoxy-modified supports or membranes are used.
  • the binding and immobilization of the hyphen-specific proteins or fragments on the carrier material takes place by means of a chemical or photochemical reaction or electrostatic interaction.
  • the hyphen-specific proteins and fragments thereof according to the invention can be bound and immobilized on the carrier material, for example, by a large number of commonly used functional groups and / or spacers or chemical crosslinking agents, such as bifunctional crosslinking agents.
  • suitable functional groups which enable proteins to bind to silanized surfaces can be found, for example, in Weetall, 1996, Advances in Molecular and Cell Biology, Vol. 15A, 161-192, JAI Press Inc.
  • the protein to be immobilized is used as GST fusion protein is present, the protein can be bound to the carrier via GSH units present on the carrier surface.
  • a pMAL fusion protein can be immobilized via MBP units on the surface of the carrier material.
  • the immobilization can take place via Ni 2+ - Nit ⁇ lot ⁇ acetic Acid surfaces (Ni-NTA) (Adachi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 97, 7243- 7247).
  • a further preferred embodiment of the present invention therefore relates to processes for the production of protein chips, comprising the isolation of at least one hypha-specifically expressed Candida protein from a suitable source or chemical synthesis or recombinant materials. position of this protein or fragment as ⁇ of, the modification of the protein or fragment during or applying th after isolation, synthesis, or production by the incorporation of functional groups or spacer E hey, a wass ⁇ - gen solution of the isolated or synthesized protein on em solid carrier material and the immobilization of the protein on the carrier by means of chemical or photochemical reaction or electrostatic interaction.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention relates to an antibody chip, comprising a solid support and at least one antibody fixed thereon, which is specific to an protein with the one shown in SEQ ID No. 5, 6, 7, 8, 14, 16 or 18 Ammosa sequence or a fragment thereof or a derivative thereof directed
  • the antibodies fixed on the antibody chip according to the invention are specifically directed against hypha-specific candida proteins
  • the presence of hyphal growing candida cells in fungus-infected skin or mucous membrane smears, organ biopsies or body fluids can be detected using such a chip.
  • proteins can be extracted from the above-mentioned samples and, after labeling, can be incubated with the antibody chip according to the invention. The binding of at least one labeled protein to the antibody chip according to the invention therefore indicates that hyphal growing Candida forms are present in the sample examined.
  • em polypeptide is understood to be an "antibody", which are coded by em or more Immunglobulm genes co ⁇ and specific structures on an antigen, especially an antigen or Determmante em epitope recognizes and specifically it
  • antibody includes not only a complete immunoglobulin, but also a number of fragments that can be obtained by cleavage with various peptidases.
  • antibody also includes modified antibodies, such as oligomeric, reduced, oxidized and labeled antibodies.
  • Antibody also includes antibody fragments that have been generated both by modifying intact antibodies and using DNA recombination technologies.
  • antibody in particular also includes fragments such as Fab, F (ab ') 2 or Fvm that can bind to an antigen determinant.
  • the Fab fragment can be generated by cleaving the intact antibody with the enzyme papam An intact light chain with part of a heavy chain is obtained.
  • F (ab ') 2 can be generated by treatment of the intact antibody with pepsin without subsequent reduction.
  • F (ab') 2 is an em of two Fab 'fragments of existing dimer.
  • Fv is a genetically engineered antibody fragment that includes the variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain. Methods for producing such fragments are described, for example, by Harlow and Lane m "Antibodies : A Laboratory Manual ", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
  • antibody which is specifically directed against em protein or "antibody specific ⁇ fish binds to em protein” means that em antibody under defined immunoassay Bedmgungen recognize an antigen-Determmante or em epitope of a protein and by means of its paratope can bind to it.
  • Antigen determinants usually consist of chemically active groups of molecules, such as amino acids or sugar side chains, on the surface of an antigen, for example a protein, and have a characteristic three-dimensional structure. Under defined conditions, an antibody therefore preferably only binds to a specific protein, while no appreciable binding occurs to other proteins in the same sample.
  • An antibody immobilized on an antibody chip according to the invention can therefore bind to a protein, peptide, carbohydrate, proteoglycan and / or a lipid complex which has a specific relationship with the hyphen-specific protein used according to the invention.
  • An antibody used according to the invention can also be directed against structures which are to be regarded as a post-translational modification of the hyphen-specific proteins.
  • the antibody chip contains both monoclonal and polyclonal antibodies which are able to specifically structure a structure according to the invention identify hyphen-specific protein and bind it if necessary.
  • the monoclonal and polyclonal antibodies contained on the antibody chip of the present invention can be prepared and isolated using methods well known in the art.
  • the methods for producing monoclonal antibodies using Hyb ⁇ dom technology are described, for example, in Schreyer et al. , "Hybridoma Techniques” (1980) or in U.S. Patents No. 4,341,761, No. 4,399,121, No. 4,472,500.
  • the materials mentioned above for protein chips can be used as carrier material for immobilizing the antibodies. These carrier materials are preferably pretreated before immobilization of the antibodies, for example with silane coupling agents.
  • the antibody chips described by Joos et al. described epoxy-modified supports or membranes (Joos et al., 2000, Electrophoresis, 21, 2641-2650) used.
  • the antibodies directed against hyphen-specific proteins are bound to the carrier via a chemical or photochemical reaction or via electrostatic interactions.
  • the inventive are bound measure antibody used, for example, using a variety of commonly used func tional ⁇ groups and / or spacer chemical Ver ⁇ cross-linking agents or, as bifunctional cross-linking agent, the carrier material and immobilized.
  • a further preferred embodiment of the present invention therefore relates to processes for the production of antibody chips, comprising the genetic engineering production, isolation or synthesis of at least one antibody or fragment thereof directed against a hyphen-specific Candida protein, the modification of the antibody or fragment during or after the isolation , Synthesis or production by the incorporation of functional groups or spacer units, the application of a water solution of the isolated or synthesized antibody to a solid carrier material and the immobilization of the antibody on the carrier by means of chemical or photochemical reaction or electrostatic interaction.
  • a further particularly preferred embodiment of the invention relates to an antibody chip, comprising a solid support and at least one antibody fixed thereon, which is specific for an antibody against an protein with the sequence shown in SEQ ID No. 5, 6, 7, 8, 14, 16 or 18 shown amino acid sequence is directed.
  • An antibody chip of this type thus comprises antibodies which are directed against the abovementioned antibodies and can specifically recognize and bind them. The use of such an antibody enables so the detection of antibodies against hyphenspezi ⁇ fish proteins of Candida in the blood, lymph, m Korpersekreten or other body fluids of an organism, and thus the detection of a Candida systemic infection m this organism, which has led to the formation of the antibody contained in the samples.
  • the present invention also relates to a diagnostic composition
  • a diagnostic composition comprising at least one nucleotide chip according to the invention, a protein chip according to the invention and / or an antibody chip according to the invention.
  • the invention therefore also includes diagnostic kits which contain the biochips according to the invention, that is to say nucleotide chips, protein chips and antibody chips, suitable buffer systems and suitable marking systems.
  • the invention relates to methods for diagnosing diseases caused by Candida species, in particular diseases caused by Candida albicans, a sample to be tested in a suitable medium with a nucleotide chip according to the invention, a protem chip according to the invention and / or an antibody chip according to the invention is brought into contact and an interaction between the sample to be tested and at least one of the bio-chips mentioned is detected.
  • the methods according to the invention for the diagnosis of Candida diseases are based on the detection of the presence of nucleotide sequences, proteins, antibodies or fragments thereof, which are related to the hyphen-specific proteins according to the invention.
  • Diseases, disease states or infections caused by Candida species are understood to mean those diseases which are caused exclusively by Candida species, but in particular by Candida albicans.
  • the term therefore also encompasses all diseases caused by Candida -Types such as C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis and C. guilliermondn, or Torulopsis (Candida) glabrata, etc.
  • this term also includes diseases or disease states which primarily have other causes and in which the Candida species are only involved in the overall clinical picture or add additional symptoms, for example opportunistic infections.
  • the term “diseases, disease states or infections caused by Candida species” includes in particular diseases such as Candida mycoses or candidiasis which are essentially m three main forms and let be divided.
  • the first main form of candidiasis is characterized by saprophytic colonization of the skin and mucous membranes, especially in the external genitals, in the mouth, nose and throat and in the digestive tract.
  • the second main form of candidiasis involves infections of the skin and mucous membranes and is significantly affected by factors such as pregnancy, diabetes mellitus, severe diseases or trauma, and Cytostatika- Antibio ⁇ tikatherapie and promotes alcoholism.
  • the third main form comprises deep organ mycoses in patients with cellular immune LM munsupp ⁇ m elected ⁇ weak, particularly in the airways, rare as Candida endocarditis, Candida Menmgitis, Candida Neph ⁇ tis and Candida endophthalmitis.
  • the presence of nucleotide sequences, proteins, antibodies or fragments thereof, which are connected with the hyphen-specific proteins according to the invention indicates a disease caused by Candida.
  • the above-mentioned substances are detected by binding and / or hybridization to at least one of the biochips according to the invention, which specifically recognize the substances to be detected.
  • nucleotide sequences in connection with the hyphen-specific proteins are to be detected in a sample, their detection takes place by hybridization with the nucleotide chip according to the invention.
  • nuclear acids for example DNA or mRNA
  • the extracted nuclear acids are then labeled, for example with fluorescent dyes, enzymes or radioactive groups. If the extracted and labeled DNA hybridizes with the nucleotide chip, this shows the presence of Candida in of the examined sample. Hybridizes extracting ⁇ te mRNA with the inventive nucleotide chip, so has the hm that the sample contains hyphally growing Candida forms.
  • hypha-specific Candida proteins are to be detected in an examination sample, proteins are extracted from the sample and labeled and then incubated with the antibody chip according to the invention, which contains antibodies against hypha-specific proteins.
  • the binding of at least one labeled protein to the antibody chip according to the invention indicates the presence of hyphal growing Candida cells.
  • Antibodies against Candida protems in body fluids can be detected both using the protem chip according to the invention and using the antibody chip according to the invention, which contains antibodies which are directed against the antibodies against hyphen-specific proteins .
  • the present invention also relates to methods for finding and identifying substances which are therapeutically effective against Candida-caused diseases, a substance to be tested in a suitable medium with a nucleotide chip according to the invention, a protein chip according to the invention or an antibody chip according to the invention brought into contact and an interaction between the substance to be tested and at least one of the chips mentioned is detected.
  • the nucleotide and protein chips according to the invention as described above, can be used to add substances, for example proteins Identify which bind in vivo to nucleotide sequences which encode hyphen-specifically expressed proteins or regulate the expression of these proteins, or to which hyphen-specific proteins themselves bind.
  • binding substances in particular proteins
  • the biochips according to the invention can be used to identify further substances which interact with one another can influence or inhibit hypha-specific protein or the nucleotide sequence coding for it and the substance binding to it, in particular a binding protein.
  • Such substances are also potentially suitable as medications for the treatment of diseases caused by Candida.
  • sequence listing is part of this description and contains the sequence listing SEQ ID No. 1 to 18.
  • SEQ ID No. 1 to 18 Each of the ammosaur sequences listed below was derived from the corresponding DNA sequence and then partially verified by sequencing the isolated proteins.
  • SEQ ID No. 1 represents the coding Cap33a DNA sequence from Cont ⁇ g4-2149.
  • SEQ ID No. 2 represents the coding Cap33b DNA sequence from Cont ⁇ g4-2501.
  • SEQ ID No. 3 represents the coding Capl ⁇ p DNA sequence from Cont ⁇ g4-2069.
  • SEQ ID No. 4 represents the coding Capl9p DNA sequence from Cont ⁇ g4-2069.
  • SEQ ID No. 5 represents the ammosaur sequence of Cap33a.
  • SEQ ID No. 6 represents the ammosaur sequence of Cap33b.
  • SEQ ID No. 7 represents the ammosaur sequence of Capl ⁇ p.
  • SEQ ID No. 8 represents the ammosaur sequence of Capl9p.
  • SEQ ID No. 9 represents the entire DNA sequence of Cont ⁇ g4-2149.
  • SEQ ID No. 10 represents the entire DNA sequence of Cont ⁇ g4-2501.
  • SEQ ID No. 11 represents the entire DNA sequence of Cont ⁇ g4-2069.
  • SEQ ID No. 12 represents the promoter range of Capl ⁇ p and Capl9p.
  • SEQ ID No. 13 represents the Capl5p coding DNA sequence from Cont ⁇ g5-3226.
  • SEQ ID No. 14 represents the ammosaic sequence of Capl5p.
  • Capl5p is probably a nucleoside diphosphate kmase.
  • SEQ ID NO. 15 illustrates the Cap20p encoding DNA Se acid sequence from Cont ⁇ g4-2178 represents.
  • SEQ ID No. 16 represents the ammosaic sequence of Cap20p.
  • Cap20p is probably a glutathione peroxidase.
  • SEQ ID No. 17 represents the DNA sequence from Cont ⁇ g5-2806 encoding Cap40p.
  • SEQ ID No. 18 represents the ammosaic sequence of Cap40p.
  • Cap40p is probably a fructose biphosphate aldolase.
  • Figure 1 shows in the left part microscopic images of the virulent, hyphal Candida albicans strain Sc5315 and the avirulent, yeast-like Candida strain Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl). RNA was isolated from both strains and rewritten into cDNA. The labeled cDNA was with a nucleotide chip according to the invention, on which CAP33, CAP19 and CAP18 coding nucleotide sequences were fixed, hybridized. The results of this hybridization can be seen in the right part of FIG. 1.
  • the cDNA from the avirulent strain did not hybridize with any of the nucleotide sequences contained on the nucleotide chip, the cDNA of the virulent strain with all three immobilized nucleotide sequences showed strong hybridization signals.
  • the C. albicans strain Sc5315 is cultivated under conditions in which no hyphae are formed, the same result is obtained as for the avirulent strain Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl).
  • Figure 2a shows microscopic images of the virulent, hyphal Candida albicans strain Sc5315 and the avirulent, yeast-like Candida strain Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl). Below these are shown images of differential proteome analyzes of the two strains after cultivation in ⁇ -MEM medium. From these figures it can be seen that Sc5314, when cultivated in ⁇ -MEM medium, exp ⁇ m the proteins p33a and p33b, but Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl) does not.
  • Figure 2b shows the results of a Northern blot analysis using RNAs from these two strains which had previously been cultured either in YPD medium or in ⁇ -MEM medium. Also included were RNAs from the virulent strain Canl6 ( ⁇ cphl) and the strain Can33 ( ⁇ efgl), which shows no hyphae formation and has a greatly reduced virulence, both strains having been cultured in ⁇ -MEM medium before RNA extraction. Hybridization signals were obtained when hybridizing with capl ⁇ -, cap-19 and cap33-specific probes with the RNAs isolated from strains Sc5314 and Canl6 cultured in ⁇ -MEM medium. However, the RNA isolated from the strain Sc5314 cultivated in YPD medium showed no hybridization signals.
  • RNA from the avirulent strain Can34 (cultured either in YPD or in ⁇ -MEM medium) also showed no hybridization signals. The same result was obtained with the RNA isolated from the Can33 strain cultured in ⁇ -MEM medium.
  • An actin-specific probe (ACT1) was used as a control.
  • FIG. 3 shows the results of 2D gel electrophoresis of protein extracts from the strains Sc5315 and Can34 cultivated in ⁇ -MEM medium
  • the proteins were isolated from the clinical isolate Sc5314 by differential 2D gel electrophoresis as follows: To isolate the proteins, the virulent Candida albicans strain Sc5314 and the avirulent Candida albicans strain Can34 (HLC69) (Lo et al., 1997, Cell, 90, 939-949) were simultaneously mixed in full medium (YPD: 20 g / l Bacto- Peptone; 10g / l yeast extract; 0.15g / l L-tryptophan) grown overnight, inoculated in ⁇ -MEM medium (# 22571 Life Technologies / Gibco) with 2% glucose (1: 100) and for 24 h Incubated at 37 ° C on a round debris.
  • full medium YPD: 20 g / l Bacto- Peptone; 10g / l yeast extract; 0.15g / l L-tryptophan
  • the cells obtained in this way were pelleted and in a non-detergent-containing saline buffer (PGSK buffer: 0.52 g / l NaH 2 PO 4 » H 2 0; 8.8 g / l Na 2 HP0 4 « 2H 2 0; 2, 8g / l NaCl; 0.372g / l KC1; llg / 1 glucose) digested with glass beads.
  • PGSK buffer 0.52 g / l NaH 2 PO 4 » H 2 0; 8.8 g / l Na 2 HP0 4 « 2H 2 0; 2, 8g / l NaCl; 0.372g / l KC1; llg / 1 glucose
  • the protein extract isolated therefrom was separated using isoelectical focusing and then using SDS-PAGE.
  • the gels were stained with silver (see FIG. 2a) or Coomassie (see FIG. 2b).
  • the protein spots which were only visible in one of the two gels
  • DNA sequences and the flanking regions were amplified and cloned by PCR from genomic DNA from Sc5314. Furthermore, the corresponding DNA sequence from genomic libraries (Liu et al., 1995, Science, 266, 1723- 1726) by hybridization of the radioactively labeled fragments obtained by PCR.
  • the coding sequences for each of the seven identified proteins were removed from the cloned PCR fragments by means of PCR and replaced by selection markers (URA3) (Fonzi and Irwin, 1993, Genetics, 134, 717-728). These constructs are used to delete the coding sequence in C. albicans. Furthermore, the open reading frames for all seven proteins and the termination sequences were isolated by means of PCR and in vectors with regulatable PCK1 and MET3 promoters (Leuker et al., Gene, 1997, 19, 192 (2), 235-40; Care et al., Mol Microbiol., 1999, 34 (4), 792-8.) for expression in C.
  • the regulation of the hyphen-specific expressed proteins takes place at the transcription level, since the mRNA for all seven proteins can only be detected in Sc5314 cultures grown in ⁇ -MEM, but not in Sc5314, which was cultivated in full medium, or in the avirulent strain Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl), which was cultured in complete medium or ⁇ -MEM medium.
  • FIG. 2b shows as an example a Northern analysis of RNA from the strains Sc5314 and Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl) cultivated in full medium (YPD or ⁇ -MEM).
  • RNA of the strains Canl6 ( ⁇ cphl) and Can33 ( ⁇ efgl) (Lo et al., 1997, Cell, 90, 939-949) cultivated in ⁇ -MEM medium was also applied.
  • Canl6 ( ⁇ cphl) has been described as a strain that has virulence comparable to Sc5314 and shows hyphae formation.
  • Can33 ( ⁇ efgl) shows no hyphae formation and its virulence is greatly reduced (Lo et al., 1997, Cell, 90, 939-949).
  • the corresponding mRNAs can be detected with Cap33, Capl ⁇ and Capl9-specific probes.
  • no corresponding mRNAs can be detected in Sc5314, which was cultivated in YPD medium, using the probes mentioned above.
  • the corresponding mRNAs can also be detected using the probes.
  • the avirulent strain Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl), cultivated either in YPD medium or in ⁇ -MEM medium, contains no corresponding mRNAs.
  • the Can33 strain cultured in ⁇ -MEM medium also contains no corresponding mRNAs.
  • Protein extracts from the strains Sc5314 and Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl), which had been cultivated in ⁇ -MEM medium, were subjected to 2D gel electrophoresis according to customary methods.
  • the hyphen-specifically expressed proteins pl5, pl ⁇ , pl9, p20, p33a, p33b and p40 can only be detected in the hyphal growing strain Sc5314, but not in the avirulent strain Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl).
  • FIG. 2a also shows that the strain Sc5314 cultivated in ⁇ -MEM medium produces the proteins Cap33a and Cap33b, but the strain Can34 does not.
  • nucleotide chip Detection of nucleotide sequences encoding hyphen-specific proteins by means of a nucleotide chip
  • Nucleotide sequences which code for the hyphen-specific proteins CAP33, CAP19 and CAP16 were fixed on a poly-L-lysine-coated carrier surface.
  • the nucleotide chip thus obtained was hybridized under the usual hybridization conditions with cDNAs which had been produced from mRNA of the hyphal growing Candida albicans strain Sc5315 and the avirulent, yeast-like growing Candida strain Can34 ( ⁇ cphl ⁇ efgl). The results of this hybridization are shown in FIG. 1.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Biochips, insbesondere Nucleotid-Chips, die hyphenspezifische Proteine codierende Nucleotidsequenzen enthalten, Protein-Chips, die hyphenspezifische Proteine enthalten, und Antikörper-Chips, die gegen diese hyphenspezifischen Proteine gerichtete Antikörper enthalten, diagnostische Zusammensetzungen, die diese Nucleotid-, Protein- oder Antikörper-Chips enthalten, Verfahren zum Auffinden und Identifizieren von Substanzen, die gegen durch Candida-Arten verursachte Krankheiten therapeutisch wirksam sind, und Verfahren zum Diagnostizieren einer durch Candida verursachten Krankheit.

Description

Hyphenspezifische Faktoren aus Candida albicans
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Biochips, insbesondere Nucleotid-Chips, die hyphenspezifische Proteine codierende Nucleotidsequenzen enthalten, Protein-Chips, die hyphenspezifische Proteine enthalten, und Antikörper-Chips, die gegen diese hyphenspezifischen Proteine gerichtete Antikörper enthalten, diagnostische Zusammensetzungen, die diese Nucleotid-, Protein- oder Antikörper-Chips enthalten, Verfahren zum Auffinden und Identifizieren von Substanzen, die gegen durch Candida-Arten verursachten Krankheiten therapeutisch wirksam sind, und Verfahren zum Diagnostizieren einer durch Candida verursachten Krankheit.
Zu den Sprosspilzen oder Hefen zählen neben den schon seit langem zum Beispiel in der Lebensmittelindustrie kommerziell genutzten Hefen der Familie Saccharomycetaceae, auch asporogene Hefen wie beispielsweise Hefen der Gattung Candida. Einige Angehörige der Gattung Candida sind in der Lage, Mycel- verbände zu bilden, andere vermehren sich lediglich durch Sprossung. Candida albicans ist der am häufigsten isolierte humanpathogene Pilz. Candida albicans verursacht häufig opportunistische Infektionen, also Infektionen durch normalerweise relativ unproblematische Keime bei immunsupprimierten Patienten. Derartige Infektionen nehmen bei diesen Patienten einen schweren Verlauf und verkürzen die Überlebenszeit zum Beispiel HlV-Infizierter oder mittels Chemo- oder Radiotherapie behandelter Krebspatienten entscheidend. Gegenwärtig wird die Behandlung von systemischen Infektionen mit Candida albicans hauptsächlich mittels Azolen oder Polyenen durchgeführt. Die Behandlung mittels dieser beiden Substanzklassen weist jedoch Nachteile auf. Polyene führen zu starken Nebenwirkungen, gegen die Azole entwickeln sich zunehmend Resistenzen (DiDomenico, 1999, Curr Opin Microbiol 2, 509 bis 515, Georgopa- padakou, 1998, Curr Opin Microbiol 1,547 bis 557).
Da die klinischen Befunde bei Pilzinfektionen überwiegend uncharakteristisch sind, gestaltet sich die exakte Diagnose pilzlicher Infektionen, insbesondere von Candida-Infektionen, äußerst schwierig. Bei Verdacht auf Candida-Befall der Haut oder der Schleimhäute müssen beispielsweise Oberflächenabstriche abgenommen und mikroskopisch untersucht werden. Bei Befall innerer Organe ist es erforderlich, Organbiopsien histologisch zu untersuchen, um invasives Wachstum nachweisen zu können. Zur Diagnostik einer generalisierten Candida-Infektion ist die Spiegelung des Augenhintergrundes indiziert. Ferner müssen mehrere Blutkulturen untersucht werden, die an aufeinanderfolgenden Tagen venös abzunehmen sind. Bei einer Nierenbeteiligung ist zusätzlich der Urin zu untersuchen. Derartige mikroskopische Nativpräparate erlauben jedoch nur den Nachweis von polymorphen Pilzzellen (Hyphen, Pseu- dohyphen und Blastosporen) und Sporen, ohne dass jedoch die genaue Spezies ermittelt werden kann und geeignete therapeutische Maßnahmen eingeleitet werden können. Neben dem mikroskopischen Nachweis ist es daher un- erlasslich, Kulturen zur exakten Speziesbestimmung anzulegen. E ne weitere diagnostische Möglichkeit, die jedoch bislang nicht den erhofften Aussagewert hat, ist der Nachweis von Candida-Antigen im Serum des Patienten. Ein hoher Titer spricht zwar für eine systemische Candida-Infektion, ist aber nicht beweisend, wahrend ein negativer Befund eine systemische Infektion nicht ausschließen kann.
Die Entwicklung weiterer verbesserter Diagnostika zur zweifelfreien Zuordnung einer gesundheitlichen Störung zu den durch Vertreter der Familie Candida hervorgerufene Infektionen und von Antimycotica zur Behandlung von durch Vertreter der Familie Candida hervorgerufene Infektionen ist daher dringend erforderlich.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht also darin, Mittel und Verfahren zur Diagnose von durch Candida albicans hervorgerufenen Infektionen und zur Entwicklung von Substanzen, die gegen Candida-verursachte Erkrankungen therapeutisch wirksam sind, zur Verfugung zu stellen.
Die Erfindung lost das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung von Biochips, insbesondere eines Nucleotid-Chips, umfassend einen festen Trager und mindestens eine daran fixierte Nucleotidsequenz, welche für die Identifizierung und Transkription eines Gens codierend für ein hyphenspezifisches Protein aus Candida, insbesondere Candida albicans, geeignet ist, wobei diese Nuc- leotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einer Nucleotidsequenz, definiert in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 12, 13, 15 oder 17, oder eines komplementären Strangs oder Teils davon,
(b) einer Nucleotidsequenz, codierend eine Ammosauresequenz, definiert in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18, oder eines komplementären Strangs oder Teils davon und
(c) einer Nucleotidsequenz, die mit einer der (a) oder (b) genannten Nuc- leotidsequenzen hybridisiert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Biochip eine Vorrichtung verstanden, die eine Vielzahl biologischer Substanzen, beispielsweise Nucleotidsequenzen, Proteine oder Anti- korper, m immobilisierter oder fixierter Form um- fasst und mit deren Hilfe mittels Hybridisierungs- und/oder Bindungsverfahren eine kleine Menge eines Liganden, der unter geeigneten Bedingungen an die biologische Substanz binden kann, in einer kleinen Probe nachgewiesen werden kann. Unter einem Nucleo- tid-Chip wird eine Vorrichtung verstanden, die eine Vielzahl verschiedener Nucleinsauren oder Nucleotidsequenzen wie DNA oder RNA in immobilisierter Form enthalt und mit deren Hilfe mittels Nuclein- saure-Hybridisierung eine kleine Menge einer komplementären Nuclemsaure m einer kleinen Proben- flussigkeit oder mittels DNA/Protein- Bindungsuntersuchungen eine kleine Menge eines an Nucleinsauren bindenden Proteins nachgewiesen wer¬ den kann.
Die erfindungsgemaßen Nucleotid-Chips enthalten an einem festen Trager fixierte Nucleotidsequenzen, die ausschließlich m der hyphal wachsenden Form von Candida albicans exprimierte Proteine codieren beziehungsweise die ausschließlich die Expression hyphenspezifischer Proteine regulieren. Das heisst, die auf den erfindungsgemaßen Nucleotid-Chips enthaltenen Nucleotidsequenzen werden wahrend des he- feartigen Wachstums von Candida nicht exprimiert . Die erfindungsgemaß beschriebenen Nucleotidsequenzen und die davon codierten Proteine weisen keine signifikanten Homologien, beispielsweise mit Proteinen von Saccharomyces cerevisiae, einem verwandten, nicht-pathogenen, nicht hyphal wachsenden Pilz auf. Es ist bekannt, dass das filamentose Wachstum, also die Bildung von Hyphen, eine wichtige Voraussetzung für die Ausprägung der Virulenzeigenschaf- ten von Candida ist (Mitchell, 1998, Curr. Opin. Microbiol., 1, 687-692). So sind Candida albicans- Formen, die keine Hyphen ausbilden, im Modellsystem (Mus musculus) avirulent (Lo et al., 1997, Cell 90, 939 bis 949) . Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird daher unter einem hyphenspezifischen Protein ein Protein und/oder Peptid verstanden, das ausschließlich in Arten der Gattung Candida exprimiert wird und vorzugsweise für die Virulenz von Candida, insbesondere Candida albicans Bedeutung hat. Die erfindungsgemaß verwendeten, spezifisch m der pathogenen Form von Candida albicans vorkommenden Nucleotidsequenzen und die von diesen codierten Proteine stellen daher ausgezeichnete diagnostische Hilfsmittel für das Erkennen lokaler oder systemischer Candidosen dar, insbesondere zum Erkennen lokaler oder systemischer Candida albicans- Infektionen. Darüber hinaus bieten sie die Möglichkeit, im Falle einer Candida-Infektion hyphal wachsende, also virulente Candida albicans-Formen von hefeartig wachsenden, also nicht-virulenten Candida albicans-Formen zu unterscheiden.
Überdies erweisen sich die erfindungsgemaß verwendeten Nucleotidsequenzen und Proteine als besonders wertvoll für die Entwicklung von Medikamenten zur Bekämpfung von Candidosen. Die erfindungsgemaßen Nucleotidsequenzen und Proteine können als Targets für die Identifikation spezifisch auf diese wirkender Substanzen eingesetzt werden. So können etwa Substanzbibliotheken auf die Interaktion der m ihnen vorhandenen Substanzen mit erfindungsgemaßen Proteinen oder erfindungsgemaßen Nucleotidsequenzen hin untersucht werden.
Die Erfindung betrifft daher in bevorzugter Ausfuhrungsform einen vorgenannten Nucleotid-Chip, der eine Nucleotidsequenz u fasst, die eine proteincodierende Nucleotidsequenz ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleotidsequenzen der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 13, 15 und 17. Diese Nucleotidsequenzen codieren die in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 und 18 dargestellten Ammosauresequenzen. Diese Sequenzen sind besonders hilfreich bei der Diagnose von Erkrankungen, die von Candida-Arten verursacht werden, indem sie den gezielten Nachweis der Gegenwart von Candida in Oberflächenabstrichen oder Organbiopsien ermöglichen. Beispielsweise können die auf einem solchen Nucleotid-Chip enthaltenen erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen mit markierten DNA-Proben, die aus Quellen wie Hautabstrichen, Biosieproben oder eigens angelegten Pilzkulturen isoliert oder mittels PCR-Verfahren amplifi- ziert wurden, unter stringenten Bedingungen hybridisiert werden. Da die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen keine signifikanten Homologien mit Nucleotidsequenzen von verwandten Pilzen aufweisen, erlaubt der Nachweis einer Hybridisierung daher den Nachweis von Candida in einer mit Pilzen infizierten Probe. Die erfindungsgemäß verwendeten Nucleotidsequenzen ermöglichen jedoch nicht nur den einfachen Nachweis von Candida, sondern auch den Nachweis, dass Candida in hyphaler Form wächst und dementsprechend virulente Eigenschaften aufweist. Beispielsweise kann aus Hautabstrichen oder Bi- ospieproben gezielt mRNA isoliert und/oder mittels PCR-Verfahren amplifiziert werden. Nach Markierung mit geeigneten Markierungsmitteln wird die so erhaltene mRNA mit dem die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen enthaltenden Nucleotid-Chip hybridisiert. Da die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen ausschließlich während des hyphalen Wachstums von Candida transkribiert und exprimiert werden, nicht jedoch während des hefeartigen Wachstums, erlaubt der Nachweis einer Hybridisierung unter Verwendung von isolierter mRNA den Nachweis, dass sich Candida den Übergang in der hyphalen und damit virulenten Wachstumsphase befindet. Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform den vorgenannten Nucleotid- Chip, der Nucleotidsequenzen enthalt, die regulato¬ rische Elemente von hyphenspezifische Candida- Proteine codierenden Genen darstellen, also Elemen¬ te, die insbesondere die Transkription der mit diesen regulatorischen Elementen funktionell verbundenen proteincodierenden Bereiche ermöglichen, beispielsweise Promotoren, Transkπptionstermmations- signale, Silencer, Enhancer usw.. Diese besonders bevorzugten Nucleotidsequenzen können insbesondere Promotoren sein, besonders bevorzugt der m SEQ ID Nr. 12 dargestellte Promotor. Die erfindungsgemaßen regulatorischen Elemente, insbesondere Promotoren, besonders bevorzugt der in SEQ ID Nr. 12 dargestellte Promoter, erweisen sich insofern als besonders vorteilhaft, als sie d e für die Induktion von hyphenspezifisch exprimierten Proteinen notwendigen Regulationssequenzen umfassen und dementsprechend verwendet werden können, um weitere spezifische Candida-Proteme zu identifizieren, die in vivo durch Bindung an diese regulatorischen Elemente die Transkription von hyphenspezifischen Proteinen, insbesondere der Proteine mit den in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 und 18 dargestellten Ammosaurese- quenzen, induzieren oder hemmen können. Nach Identifizierung solcher Proteine können Nucleotid- Chips, die regulatorische Elemente von hyphenspezi- fisch exprimierten proteincodierenden Nucleotidsequenzen enthalten, verwendet werden, um Substanzen jedweder Art zu identif zieren, die die Wechselwirkung zwischen den regulatorischen Elementen und den daran bindenden Proteinen inhibieren. Unter Verwendung derartiger Nucleotid-Chips ist es also mog- lich, Substanzen zu identifizieren, die die Expression hyphenspezifischer Proteine hemmen und daher potentiell als spezifisch wirkende Medikamente ge¬ gen Candida-Infektionen eingesetzt werden können.
Die Erfindung betrifft in einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform den vorgenannten Nucle- otid-Chip, der als Nucleotidsequenz DNA-, RNA- oder PNA-Sequenzen aufweist. Bei PNA (Peptide Nucleic Acid oder Polyamide Nucleic Acid) -Sequenzen handelt es sich um Moleküle, die nicht negativ geladen sind und in gleicher Weise wie DNA wirken (Nielsen et al., 1991, Science, 254, 1497-1500; Nielsen et al., 1997, Biochemistry, 36, 5072-5077; Weiler et al . , 1997, Nuc. Acids Res., 25, 2792-2799). PNA- Sequenzen umfassen ein Polyamid-Grundgerust aus N- (2-Ammoethyl) -glycm-Emheiten und besitzen keine Glucose-Einheiten und keine Phosphat-Gruppen.
Die erfindungsgemaßen Nuclemsauremolekule, die an einem Trager fixiert werden können, können aus naturlichen Quellen, vorzugsweise aus Candida albicans, isoliert werden. Beispielsweise können die Nuclemsauremolekule mittels PCR-Verfahren isoliert und amplifiziert werden, wobei doppelstrangige Moleküle erhalten werden. Die erfindungsgemaßen Nuc- leinsauremolekule können aber auch nach bekannten Verfahren in vitro synthetisiert werden, wobei em- zelstrangige Oligonucleotide oder Peptid- Oligonucleotide erhalten werden. Durch die Wahl geeigneter Primer können gewünschte Bereiche der er- findungsgemaßen Nucleinsauren, das heißt sowohl einzelne Bereiche als auch der gesamte Leseraster des Gens, amplifiziert und isoliert werden. Mittels gangiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich, verschiedenartige Mutationen m die erfin- dungsgemaßen Nuclemsauremolekule einzufügen. Dadurch können beispielsweise Sequenzvarianten er- fasst werden, die in unterschiedlichen kimischen Candida-Isolaten vorkommen. Derartige von der Erfindung erfasste Mutationen können Insertionen, De- letionen, Duplikationen, Inversionen, Additionen, Austausche oder ähnliches sein, auch von ungewöhnlichen Nucleotiden. Auf diese Weise können aber auch modifizierte Oligonucleotide mit funktioneilen Gruppen hergestellt werden, die eine kovalente Bindung des Oligonucleotids an das Tragermaterial zur Herstellung des erfindungsgemaßen Nucleotid-Chips ermöglichen. So können beispielsweise Oligonucleotide mit Ammo-Modifikationen oder Biotm-Gruppen hergestellt werden, die an auf der Oberflache des Tragermateπals enthaltenen chemisch reaktiven Gruppen (Epoxide) oder Streptavidm-Gruppen oder Derivate davon kovalent binden können. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass Nuclemsauren mit photolabile Schutzgruppen enthaltenden Nucleosid-Derivaten versehen werden.
Erfindungsgemaß können für den Nucleotid-Chip auch Nucleotidsequenzen verwendet werden, die durch Fusion der erfindungsgemaßen Nucleotidsequenzen mit Genen oder Bestandteilen von Genen aus anderen Quellen erzeugt werden. Erfindungsgemaß können auch verk rzte Nucleotidsequenzen der vorgenannten Art verwendet werden, sofern diese die genannte Hyphenspezifitat aufweisen. Erfindungsgemaß ist vorgesehen, dass verkürzte Nucleotidsequenzen eine Lange von mindestens 15 Basenpaaren aufweisen.
In einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Nucleotid-Chip auch Nucleotidsequenzen der vorgenannten Art umfasst, die m t den vorgenannten erfindungsgemaßen Nucleotidsequenzen hybridisieren. Hybridisierung bedeutet im Zusammenhang mit diesem Aspekt der Erfindung eine Hybridi- sierung unter konventionellen Hybπdisierungsbed - gungen, wie sie in Sambrook et al. (Molecular clon- mg. A laboratory manual. Cold spring harbor labo- ratory press, 2. Ausgabe 1989) beschrieben sind, vorzugsweise unter strmgenten Bedingungen. Gemäß vorliegender Erfindung spricht man von einer Hybri- disierung, wenn nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62 °C und besonders bevorzugt bei 68 °C insbesondere für eine Stunde 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Erfindungsgemaß kann e ne unter derartigen Waschbedingungen mit einer der den Sequenzprotokollen angegebenen Nucleotidsequenzen hybridisierende Nucleotidsequenz durch Immobilisierung an den festen Trager für den erfindungsgemaßen Nucleotid-Chip verwendet werden.
Die Identifizierung und Isolierung hybridisierender Nucleotidsequenzen kann beispielsweise unter Verwendung eines erfindungsgemaßen Nucleotid-Chips, der die vorstehend genannten Nucleotidsequenzen o- der Teile dieser Moleküle beziehungsweise des komplementären Stranges enthalt, erfolgen. Der zur I- dentifizierung und Isolierung hybridisierender Nuc¬ leotidsequenzen eingesetzte Nucleotid-Chip kann beispielsweise Nucleotidsequenzen enthalten, die exakt die oder im wesentlichen die unter SEQ ID Nr. 1 bis 4, 12, 13, 15 oder 17 dargestellte Nucleotidsequenzen oder Teile dieser Sequenzen oder komplementäre Stränge aufweisen. Der Nucleotid-Chip kann aber auch synthetische Fragmente enthalten, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt werden und deren Sequenz im wesentlichen mit der einer erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz übereinstimmt. Auf diese Weise können Nucleotidsequenzen aus klinischen Candida-Isolaten isoliert und für den erfindungsgemäßen Nucleotid-Chip verfügbar gemacht werden, die gegenüber den in SEQ ID Nr. 1 bis 4, 9 bis 13, 15 oder 17 dargestellten Nucleotidsequenzen Abweichungen oder Mutationen enthalten.
Die mit den erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und/oder alleli- sche Varianten der vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren oder dessen hyphenspezifische Expression gewährleisten. Unter „Fragmenten" werden dabei Teile der Nucleotidsequenzen verstanden, die lang genug sind, um das hyphenspezifisch exprimierte Protein zu codieren oder die Hyphenspezifität zu gewährleisten. Der Ausdruck „Derivat", „funktionelles Ä- quivalent" oder „mutante Abwandlung" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle von den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen auf der Nucleotidebene aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentitat von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80%, und besonders bevorzugt, über 90%, 95%, 97% oder 99% auf Nucleinsau- reebene .
Die erfindungsgemaßen Nucleotid-Chips umfassen an einem festen Trager fixierte oder immobilisierte Nucleotidsequenzen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „fester Trager" eine unlösliche Matrix. In bevorzugter Ausfuhrungsform besteht der feste Trager aus einem hydrophoben oder schwach hydrophilen Material, wie transparentem Glas, Siliciumdioxid, Metalloxiden, Polymeren und Copolymeren von Dextranen oder Ami- den, beispielsweise Acrylamid-Derivaten, Cellulose, Nylon, oder polymeren Materialien, wie Polyethylen- terephthalat , Celluloseacetat , Polystyrol oder Po- lymethylmethacrylat oder einem Polycarbonat von Bisphenol A. Das Tragermaterial wird vorzugsweise vor Fixierung der Nucleotidsequenzen mit einem 0- berflachen-aktivierenden Mittel wie Poly-L-Lysm, Polyethylenimm oder Polyalkylamm vorbehandelt, um die Fixierung der Nucleotidsequenzen am Tragermaterial zu verbessern. In einer anderen Ausfuhrungsform wird als Trager verwendetes Glas mit einem Si- lan-Kupplungsmittel, das eine Ammo-Gruppe, eine Aldehyd-Gruppe oder eine Epoxy-Gruppe aufweist, vorbehandelt. Für den erfindungsgemaßen Nucleotid- Chip können jedoch auch die im Handel erhältlichen, bereits beschichteten Tragertypen wie Poly-L-Lysm (Sigma Diagnostics) , Super-Aldehyde (Teleche ) , Su- per-Amme (Telechem), Silane Prep (Sigma) , CMT GAPS (Corning) , Type I (Clontech) , Type II (Clontech) , Arrayl k (GeneScan Europe) , Type I (Eppendorf) , Type II (Eppendorf) , Epoxysilan (Quantifoil) und Cast/FastSlides (Schleicher & Schull) verwendet werden. Weitere geeignete Trager sind solche, die f r photolithographisch hergestellte Nucleotid- Chips verwendet werden, beispielsweise die in Lipshutz et al. beschriebenen (Lipshutz, Fodor, Gingeras und Lockhart, 1999, Nat . Genet., 21, 20- 24). In besonders bevorzugter Ausfuhrungsform werden für den erfindungsgemaßen Nucleotid-Chip Trager mit Beschichtungen aus Poly-L-Lysm, wie DeRisi et al. beschrieben (DeRisi, J. L., Iyer, V. R. und Brown, P. 0., 1997, Science, 278, 680-686), beispielsweise Poly-Prep Slides (Sigma Diagnostics) , oder Ammosilanen, wie Silane-Prep Slides (Sigma) , CMT GAPS Slides (Coming) und Super Amme (Telechem) , oder Membranen, wie CAST Slides oder FAST Slides (Schleicher & Schull) verwendet. Zur Immobilisierung ammo-modifizierter Oligonucleotide sind epoxy-modiflzierte Oberflachen, wie ArrayLmk Bio- chip (GeneScan Europe) oder Epoxysilane Slides (Quantifoil) besonders bevorzugt.
Die Nucleotidsequenzen können über chemische oder photochemische Reaktionen oder durch elektrostatische Wechselwirkungen an das Tragersubstrat gebunden und fixiert werden. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Immobilisierung oder Fixierung der Nucle sauren an den verwendeten Trageroberflachen über eine elektrostatische Bindung oder eine kovalente Bindung erfolgt. Wenn die Nuclemsauren beispielsweise syn- thetisch hergestellt wurden und eine funktionelle Gruppe aufweisen, können die Nuclemsauren an geeignete funktionelle Gruppen auf der Oberflache des Tragermaterials kovalent gebunden und fixiert werden (Lamture et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, 2121-2125; Guo et al., 1994, Nucl. Acids Res., 22, 5456-5465) . Erfindungsgemaß können die Nuclemsauren auch über Spacer oder ein Vernetzungsmittel, beispielsweise ein bifunktionelles Vernetzungsmittel, auf den Oberflachen-aktiv erten Trager kovalent gebunden werden. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Bindung der Nucleotidsequenzen an den Trager im Falle von Polylys -, Aminosilan- und Membranbeschichteten Nucleotid-Chips mittels UV- Quervernetzung und im Falle von epoxy-modiflzierten Chips mittels chemischer Reaktion erfolgt. Die Bindung der Nuclemsauren an den Trager kann selbstverständlich auch über photochemische Reaktionen erfolgen. Im Falle solcher photolithographisch hergestellten Nucleotid-Chips erfolgt im Anschluss an die Immobilisierung eine gezielte Abspaltung der photolabilen Schutzgruppen mittels Photolyse.
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher Verfahren zur Herstellung von Nucleotid-Chips gemäß Anspruch 1, umfassend die Isolierung und/oder Amplifikation von mindestens einer Nucleotidsequenz, die ein hyphenspezifisch exprimiertes Protein von Candida codiert und/oder Regulationselemente dieser Nucleotidsequenz umfasst, oder die chemische Synthese dieser Nucleotidsequenz, die Modifikation der Nucleotidsequenz wahrend oder nach der Synthese oder Amplifikation durch den Einbau funktioneller Grup¬ pen oder Spacer-E heiten, das Auftragen einer wassπgen Losung der isolierten oder synthetisier¬ ten Nucleotidsequenz auf em festes Tragermaterial und die Immobilisierung der Nucleotidsequenz an dem Trager mittels chemischer oder photochemischer Reaktion oder elektrostatischer Wechselwirkung.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft Protein-Chips, umfassend einen festen Trager und mindestens em daran fixiertes hyphenspezifisches Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einem Protein mit einer Ammosaure- sequenz, definiert m SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18, oder einem Fragment davon, und
(b) einem Protein mit einer Ammosaure- sequenz, die zu einer der SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 definierten Ammosauresequenz eine Se- quenzidentitat von mindestens 80% aufweist, oder einem Fragment davon.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protem-Chip eine Vorrichtung verstanden, die eine Vielzahl verschiedener Proteine oder Peptide in immobilisierter Form enthalt und mit deren Hilfe eine kleine Menge eines Liganden, beispielsweise eines Proteins oder eines Antikörpers, das/der an mindestens em auf dem Trager fixiertes Protein oder Peptid kovalent oder nicht-kovalent binden kann, m einer kleinen Probenflussigkeit nachgewiesen werden kann.
Die erfindungsgemaßen Protem-Chips enthalten an einem festen Trager fixierte Proteine, die ausschließlich in der hyphal wachsenden Form von Candida albicans exprimiert werden, oder Teile davon. Die erfindungsgemaßen Protem-Chips können daher beispielsweise zum Nachweis von Antikörpern verwendet werden, die im Korper eines Organismus, insbesondere eines Saugers, als Folge einer Immunisierung durch Antigen-Determmanten von hyphal wachsenden Candida-Formen, insbesondere hyphenspezif1- schen Candida-Protemen, gebildet wurden. Die Bindung von mindestens einem Antikörper aus Blut, Lymphe, Korpersekreten oder anderen Korperflussigkei- ten eines Organismus an den erfindungsgemaßen Pro- tem-Chip ermöglicht also den Nachweis einer systemischen Candida-Infektion in diesem Organismus, die zur Bildung des gebundenen Antikörpers gefuhrt hat. Darüber hinaus können die erfindungsgemaßen Protem-Chips auch verwendet werden, um beispielsweise solche Proteine aus Candida- flzierten Materialien zu identifizieren und zu isolieren, die in vivo mit den auf dem Protem-Chip enthaltenen Proteinen in Wechselwirkung treten. Nach Identifizierung und I- solierung derartiger mteragierender Proteine können die erfindungsgemaßen Protem-Chips auch verwendet werden, um Substanzen jedweder Art zu identifizieren, die die Wechselwirkung zwischen den er- findungsgemaßen Proteinen und damit mteragierenden Proteinen hemmen oder fordern können. Unter Verwendung der erfindungsgemaßen Protem-Chips lassen sich also Substanzen detektieren, die potentiell als Medikamente zur Bekämpfung von Candida- Infektionen, insbesondere zur Hemmung des Übergangs vom hefeartigen Wachstum zum hyphalen Wachstum von Candida, geeignet sind.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist daher vorgesehen, dass der erfm- dungsgemaße Protem-Chip neben den hyphenspezif1- schen Proteinen mit den m SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 und 18 dargestellten Ammosauresequenzen auch Derivate, funktionelle Äquivalente oder Varianten dieser Proteine umfassen kann. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Derivaten, funktionellen Äquivalenten und Varianten" insbesondere solche Abkömmlinge der Proteine mit den m SEQ ID Nr. 5 bis 8, 14, 16 und 18 angegebenen Ammosauresequenzen verstanden, die unter Beibehaltung der Grundstruktur dieser Proteine durch Substitution von Atomen oder Molekulgruppen erhalten werden und deren Ammosauresequenzen sich von den m SEQ ID Nr. 5 bis 8, 14, 16 und 18 angegebenen Ammosauresequenzen an mindestens einer Position unterscheiden und die im wesentlichen einen hohen Grad an Homologie auf Ammosaureebene aufweisen. Der dem Fachmann bekannte Begriff "Homologie" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei Polypeptiden, der durch das Ausmaß der Übereinstimmung zwischen diesen Polypeptiden bestimmt wird. Dabei kann eine Übereinstimmung sowohl eine identische Übereinstimmung, also Sequenzidentitat , als auch einen konservativen Ammosaureaustausch bedeuten. Vorzugsweise besitzen erfindungsgemaß verwendete Derivate, Varianten oder funktionelle Äquivalente eme Sequenzidentitat zu jeweils einer m SEQ ID Nr. 5 bis 8, 14, 16 und 18 angegebenen Ammosauresequenzen von mindestens 80%, vorzugsweise 85% und besonders bevorzugt von über 90%, 95%, 97% und 99% auf Ammosaureebene. Die Abweichungen zu den m SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 dargestellten Ammosauresequenzen können beispielsweise durch mit technischen Mitteln erzeugte Dele- tionen, Substitutionen, Insertionen, Additionen, Austausche oder Rekombinationen der die Ammosauresequenzen codierenden Nucleotidsequenzen entstanden sein. Es kann sich dabei aber auch um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispiels¬ weise um auf naturliche Weise entstandende Ammo- sauresequenz-Anderungen. Derivate oder Varianten der erfindungsgemaßen hyphenspezifischen Proteine können beispielsweise aus klinischen Isolaten von Candida stammen.
Solche Derivate, funktionelle Äquivalente oder Varianten können sich von den Proteinen mit den m SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 und 18 dargestellten Ammosauresequenzen beispielsweise durch eine veränderte Stabilität, Spezifitat, em modifiziertes Temperatur-, pH-Wert- und/oder Konzentrationspro- fil, eine veränderte Aktivität und/oder em verändertes Effektorenmuster unterscheiden. Derivate, funktionelle Äquivalente oder Varianten können auch in anderen Konformationen vorkommen oder andere Untereinheiten beziehungsweise pra- und/oder posttranslationelle Modifikationen aufweisen. Trotz der möglicherweise vorhandenen Unterschiede besitzen die hyphenspezifischen Proteine mit den m SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 und 18 dargestellten Ami- nosauresequenzen und Derivate, Varianten oder funk- tionellen Äquivalente davon jedoch bestimmte gemeinsame Charakteristika, wie Aktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation und/oder physikalische Eigenschaften, wie das Laufverhalten in Gelelektrophorese und deren Loslich- keit und andere.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der erfmdungsgemaße Protem-Chip Fragmente der Proteine mit den in SEQ ID Nr. 5 bis 8, 14, 16 und 18 angegebenen Ammosauresequenzen oder der Proteine, deren Ammosauresequenz eine Sequenzidentitat von mindestens 80% zu einer der in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 definierten Ammosauresequenz aufweist, umfasst. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Fragmenten" insbesondere diejenigen isolierten Bereiche eines Proteins verstanden, die weniger Aminosäuren als das na- tive Protein aufweisen, deren Lange jedoch ausreicht, dass das isolierte Fragment zumindest eine der für das native Protein charakteristischen Funktionen, wie Bmdungsvermogen an em zweites Protein, eine spezifische katalytische Aktivität etc. ausüben kann. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung umfasst das Fragment eines Proteins einen Protein-Bereich, der eine Anti- gen-Determinante oder em Epitop darstellt und daher m besonderem Maße zur Bindung eines Antikörpers geeignet ist.
Die erfindungsgemaßen hyphenspezifischen Proteine, insbesondere die Proteine mit den in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 und 18 dargestellten Ammosaurese- quenzen, die auf dem erfindungsgemaßen Protem-Chip immobilisiert sind, können aus natürlichen Quellen, beispielsweise aus Candida-mfizierten Geweben oder eigens angelegten Candida-Kulturen unter Verwendung üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren isoliert und aufgereinigt worden sein. Die verwendeten Proteine oder Fragmente können auch synthetischen Ursprungs sein. Beispielsweise lassen sich mit Hilfe des Verfahrens von Merπfield (1985, An- gew. Chem., 97, 801) Peptide, also Fragmente der erfindungsgemaßen Proteine synthetisch herstellen. In besonders bevorzugter Ausfuhrungsform der Erfindung können die hyphenspezifischen Proteine oder Peptide mittels üblicher DNA-Rekombmations- techniken hergestellt werden. Beispielsweise können die erfindungsgemaßen proteincodierenden Nucleotidsequenzen, wie die m SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 13, 15 und 17 dargestellten Sequenzen oder damit hybridisierende Sequenzen, unter Verwendung üblicher mole- kularbiologischer und gentechnischer Verfahren geeigneten Vektoren msertiert und cloniert werden. Vorzugsweise erfolgt die Insertion der erfmdungs- gemaßen proteincodierenden Nucleotidsequenzen so, dass sie unter der Kontrolle regulatorischer Elemente stehen, das heißt mit diesen operativ verbunden sind. Diese regulatorischen Elemente gewahrleisten die Transkription und Synthese translatier- barer Nuclemsauremolekule m pro- und/oder eukary- otischen Zellen. Bei regulatorischen Elementen kann es sich um Promotoren, Enhancer, Operatoren, Silen- cer und/oder Transkπptionstermmationssignale usw. handeln. Nach Transformation in geeignete Wirtszellen, beispielsweise prokaryotische oder eukaryoti- sche Zellen, wie Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, In- sekten- oder Saugerzellen, können diese Wirtszellen n einem geeigneten Kulturmedium unter solchen Be¬ dingungen kultiviert werden, die d e Bildung des von der proteincodierenden Nucleotidsequenz codierten hyphenspezifischen Proteins oder eines Fragments davon erlauben. Anschließend kann das Protein oder Fragment davon unter Verwendung geeigneter Verfahren aus der Wirtszelle oder dem Medium, m dem die Wirtszelle kultiviert wurde, isoliert und aufgereinigt werden. Zur Herstellung der hyphenspe- zifischen Proteine oder Fragmente können aber auch geeignete m vιtro-Transkrιptιons-/Translatιons- systeme eingesetzt werden. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung erfolgt die Herstellung der hyphenspezifischen Proteine oder Fragmente davon in bakteriellen Expressionssyste- men, wobei die Proteine vorzugsweise als GST- Fusionsprote e, HIS-Tag-Fusionsproteme, pMAL- Fusionsproteme usw. erhalten werden.
Als fester Trager für die erfindungsgemaßen Protem-Chips können die gleichen Materialien verwendet werden, wie vorstehend für die erfindungsgemaßen Nucleotid-Chips beschrieben, beispielsweise Glas, Siliciumdioxid, andere Silica-Mateπalien, polymere Materialien, wie Fluorpolymere, oder Metalloxide. Vorzugsweise werden diese Tragermaterialien vor der Immobilisierung der Proteine vorbehandelt, beispielsweise mit Silan-Kupplungsmitteln. In einer bevorzugten Ausfuhrungsfor der Erfindung werden die von Joos et al. beschriebenen Epoxy- modifizierte Tr ger oder Membranen (Joos et al., 2000, Electrophoresis, 21, 2641-2650) verwendet. Erfindungsgemaß ist vorgesehen, dass die Bindung und Immobilisierung der hyphenspezifischen Proteine oder Fragmente am Tragermaterial mittels chemischer oder photochemischer Reaktion oder elektrostatischer Wechselwirkung erfolgt. Die erfindungsgemaßen hyphenspezifischen Proteine und Fragmente davon können beispielsweise durch eine Vielzahl üblicherweise verwendeter funktioneller Gruppen und/oder Spacer oder chemischer Vernetzungsmittel, wie bi- funktioneller Vernetzungsmittel, am Tragermaterial gebunden und immobilisiert werden. Eine Übersicht über geeignete funktionelle Gruppen, die eine Bindung von Proteinen an silanisierte Oberflachen ermöglichen, findet sich beispielsweise in Weetall, 1996, Advances in Molecular and Cell Biology, Bd. 15A, 161-192, JAI Press Inc. Falls das zu immobilisierende Protein als GST-Fusionsprotem vorliegt, kann die Bindung des Proteins an den Trager über auf der Trageroberflache vorhandene GSH-E heiten erfolgen. Die Immobilisierung eines pMAL- Fusionsprote s kann über MBP-E heiten auf der 0- berflache des Tragermaterials erfolgen. Liegt das zu immobilisierende Protein als HIS-Tag- Fusionsprotein, kann die Immobilisierung über Nι2+- Nitπlotπacetic Acid-Oberflachen (Ni-NTA) erfolgen (Adachi et al . , Proc. Nat . Acad. Sei. USA, 97, 7243-7247) .
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher Verfahren zur Herstellung von Protem-Chips, umfassend die Isolierung von mindestens einem hyphenspezifisch exprimierten Candida-Protem aus einer geeigneten Quelle oder die chemische Synthese oder rekombmante Her- stellung dieses Proteins oder eines Fragments da¬ von, die Modifikation des Proteins oder Fragments wahrend oder nach der Isolierung, Synthese oder Herstellung durch den Einbau funktioneller Gruppen oder Spacer-E he ten, das Auftragen einer wassπ- gen Losung des isolierten oder synthetisierten Proteins auf em festes Tragermaterial und die Immobilisierung des Proteins an dem Trager mittels chemischer oder photochemischer Reaktion oder elektrostatischer Wechselwirkung.
Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikorper-Chip, umfassend einen festen Trager und mindestens einen daran fixierten Antikörper, der spezifisch gegen em Protein mit der in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 dargestellten Ammosauresequenz oder em Fragment davon oder em Derivat davon gerichtet
Da die auf dem erfindungsgemaßen Antikorper-Chip fixierten Antikörper spezifisch gegen hyphenspezifische Candida-Proteme gerichtet sind, kann unter Verwendung eines derartigen Chips die Gegenwart von hyphal wachsenden Candida-Zellen m pilzmfizierten Haut- oder Schleimhautabstrichen, Organbiopsien o- der Korperflussigkeiten nachgewiesen werden. Beispielsweise können aus den vorstehend genannten Proben Proteine extrahiert und nach Markierung mit dem erfindungsgemaßen Antikorper-Chip mkubiert werden. Die Bindung mindestens eines markierten Proteins an den erfindungsgemaßen Antikorper-Chip zeigt daher an, dass in der untersuchten Probe hyphal wachsende Candida-Formen vorliegen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Antikörper" em Polypeptid verstanden, das durch em oder mehrere Immunglobulm-Gene co¬ diert wird und spezifische Strukturen auf einem An- tigen, insbesondere eine Antigen-Determmante oder em Epitop, erkennt und spezifisch daran binden kann. Der Begriff „Antikörper" umfasst nicht nur em vollständiges Immunglobulm, sondern auch eine Reihe von Fragmenten, die mittels Spaltung mit verschiedenen Peptidasen erhältlich sind. Der Begriff „Antikörper" umfasst auch modifizierte Antikörper, wie oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper. „Antikörper" umfasst auch Antikörper- Fragmente, die sowohl durch Modifikation intakter Antikörper als auch unter Verwendung von DNA- Rekombmationstechmken erzeugt wurden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst „Antikörper" insbesondere auch solche Fragmente wie Fab, F(ab')2 oder Fvm, die an eine Antigen- Determmante binden können. Das Fab-Fragment kann durch Spaltung des intakten Antikörpers mit dem Enzym Papam erzeugt werden, wobei eine intakte leichte Kette mit einem Teil einer schweren Kette erhalten wird. F(ab')2 kann durch Behandlung des intakten Antikörpers mit Pepsin ohne anschließende Reduktion erzeugt werden. Bei F(ab')2 handelt es sich um em aus zwei Fab' -Fragmenten bestehendes Dimer. Bei Fv handelt es sich um em gentechnisch hergestelltes Antikörper-Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette umfasst. Verfahren zur Herstellung solcher Fragmente sind beispielsweise von Harlow und Lane m „Antibodies: A Laboratory Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, beschrieben.
Der Ausdruck „Antikörper, der spezifisch gegen em Protein gerichtet ist" oder „Antikörper, der spezi¬ fisch an em Protein bindet" bedeutet, dass em Antikörper unter definierten Immuntest-Bedmgungen eine Antigen-Determmante oder em Epitop eines Proteins erkennen und mittels seines Paratops daran binden kann. Antigen-Determ anten bestehen meist aus chemisch aktiven Molekül-Gruppen, wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, auf der Oberflache eines Antigens, beispielsweise eines Proteins, und besitzen eine charakteristische dreidimensionale Struktur. Unter definierten Bedingungen bindet em Antikörper daher vorzugsweise nur an em bestimmtes Protein, wahrend an andere Proteine in der gleichen Probe keine nennenswerte Bindung erfolgt.
Em erfindungsgemaß auf einem Antikorper-Chip immobilisierter Antikörper kann daher an e Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Proteoglycan und/oder einen Lipidkomplex binden, das/der mit den erfindungsgemaß verwendeten hyphenspezifischen Protein m spezifischer Beziehung steht. E erfindungsgemaß verwendeter Antikörper kann auch gegen Strukturen gerichtet sein, die als posttranslationelle Modifikation der hyphenspezifischen Proteine anzusehen sind.
Erfindungsgemaß ist vorgesehen, dass der Antikor- per-Chip sowohl monoclonale als auch polyclonale Antikörper enthalt, die m der Lage sind, spezifisch eine Struktur eines erfindungsgemaßen hyphenspezifischen Proteins zu identifizieren und gegebenenfalls zu binden.
Die auf dem erfindungsgemaßen Antikorper-Chip enthaltenen monoclonalen und polyclonalen Antikörper können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt und isoliert werden. Die Verfahren zur Herstellung monoclonaler Antikörper unter Verwendung der Hybπdom- Technologie sind beispielsweise in Schreyer et al . , „Hybridoma Techniques" (1980) oder in den US- Patenten Nr. 4,341,761, Nr. 4,399,121, Nr. 4,472,500 beschrieben.
Als Tragermaterial zur Immobilisierung der Antikörper können die vorstehend für Protem-Chips genannten Materialien, wie Glas, Siliciumdioxid, Nylon, Acrylamid-Deπvate, Silica-Mateπalien, polymere Materialien, wie Fluorpolymere, Metalloxide, usw. verwendet werden. Diese Tragermaterialien werden vorzugsweise vor Immobilisierung der Antikörper vorbehandelt, beispielsweise mit Silan- Kupplungsmitteln . In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden für die Antikorper-Chips die von Joos et al. beschriebenen Epoxy- modifizierte Trager oder Membranen (Joos et al., 2000, Electrophoresis, 21, 2641-2650) verwendet.
Erfindungsgemaß ist vorgesehen, dass die Bindung der gegen hyphenspezif sche Proteine gerichteten Antikörper an den Trager über eine chemische oder photochemische Reaktion oder über elektrostatische Wechselwirkungen erfolgt. Wie vorstehend für die Protem-Chips beschrieben, können die erfindungsge- maß verwendeten Antikörper beispielsweise mit Hilfe einer Vielzahl üblicherweise verwendeter funktio¬ neller Gruppen und/oder Spacer oder chemischer Ver¬ netzungsmittel, wie bifunktioneller Vernetzungsmittel, am Tragermaterial gebunden und immobilisiert werden.
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher Verfahren zur Herstellung von Antikorper-Chips, umfassend die gentechnische Herstellung, Isolierung oder Synthese mindestens eines gegen em hyphenspezifisches Candida-Protem gerichteten Antikörpers oder Fragments davon, die Modifikation des Antikörpers oder Fragments wahrend oder nach der Isolierung, Synthese oder Herstellung durch den Einbau funktioneller Gruppen oder Spacer-Emheiten, das Auftragen einer wassπgen Losung des isolierten oder synthetisierten Antikörpers auf em festes Tragermaterial und die Immobilisierung des Antikörpers an dem Trager mittels chemischer oder photochemischer Reaktion oder elektrostatischer Wechselwirkung.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft einen Antikorper-Chip, umfassend einen festen Tr ger und mindestens einen daran fixierten Antikörper, der spezifisch gegen einen Antikörper gegen em Protein mit der in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 dargestellten A- mmosauresequenz gerichtet ist. Em derartiger An- tikorper-Chip umfasst also Antikörper, die gegen die vorgenannten Antikörper gerichtet sind und diese spezifisch erkennen und binden können. Die Verwendung eines derartigen Antikörpers ermöglicht al- so den Nachweis von Antikörpern gegen hyphenspezi¬ fische Proteine von Candida im Blut, der Lymphe, m Korpersekreten oder anderen Korperflussigkeiten eines Organismus und somit den Nachweis einer systemischen Candida-Infektion m diesem Organismus, die zur Bildung der in den Proben enthaltenen Antikörper gefuhrt hat.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine diagnostische Zusammensetzung, umfassend mindestens einen erfindungsgemaßen Nucleotid-Chip, einen er- findungsgemaßen Protem-Chip und/oder einen erf - dungsgemaßen Antikorper-Chip. Die Erfindung umfasst daher auch Diagnostikkits, die die erfindungsgemaßen Biochips, das heißt Nucleotid-Chips, Protem- Chips und Antikorper-Chips, geeignete Puffersysteme und geeignete Markierungssysteme enthalten.
Die Erfindung betrifft m einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform Verfahren zur Diagnose von durch Candida-Arten verursachten Krankheiten, insbesondere durch Candida albicans verursachte Krankheiten, wobei eine zu testende Probe in einem geeigneten Medium mit einem erfindungsgemaßen Nucleo- tid-Chip, einem erfindungsgemaßen Protem-Chip und/oder einem erfindungsgemaßen Antikorper-Chip in Kontakt gebracht wird und eine Interaktion zwischen der zu testenden Probe und mindestens einem der genannten Bio-Chips nachgewiesen wird. Die erfm- dungsgemaßen Verfahren zur Diagnose von Candida- Erkrankungen basieren auf dem Nachweis der Anwesenheit von Nucleotidsequenzen, Proteinen, Antikörpern oder Fragmenten davon, die im Zusammenhang mit den erfindungsgemaßen hyphenspezifischen Proteinen ste- hen, in Proben, wie Haut- oder Schleimhautabstri- chen, Organbiopsien, Korpersekreten, Blut, Lymphe oder anderen Korperflussigkeiten etc., die pilzli- chen Befall zeigen oder im Verdacht stehen, infi¬ ziert zu sein.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „durch Candida-Arten verursachten Krankheiten, Krankheitszustanden oder Infektionen" solche Erkrankungen verstanden, die ausschließlich von Candida-Arten, insbesondere jedoch von Candida albicans verursacht werden. Der Begriff umfasst daher auch alle Erkrankungen, die von Candida-Arten wie C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis und C. guilliermondn, oder Torulopsis (Candida) glabrata verursacht werden. Erfindungsgemaß werden unter diesem Begriff auch Krankheiten oder Krankheitszu- stande verstanden, die primär andere Ursachen haben und bei denen die Candida-Arten am Gesamtkrank- heitsbild nur beteiligt sind beziehungsweise zusätzliche Symptome hinzufügen, zum Beispiel opportunistische Infektionen. Der Begriff „durch Candida-Arten verursachten Krankheiten, Krankheitszustanden oder Infektionen" umfasst insbesondere solche Erkrankungen wie Candida-Mykosen oder Candidosen, die sich im wesentlichen m drei Hauptformen unterteilen lassen. Die erste Hauptform von Candidosen ist durch eine saprophytare Besiedlung der Haut und Schleimhäute, insbesondere in den äußeren Genitalien, im Mund, Nase-Rachenraum und im Verdauungstrakt gekennzeichnet. Die zweite Candidosen- Hauptform umfasst Infektionen von Haut und Schleimhäuten und wird in erheblichem Maße durch Faktoren wie Schwangerschaft, Diabetes mellitus, schwere Er- krankungen oder Traumen, Cytostatika- und Antibio¬ tikatherapie sowie Alkoholkrankheit begünstigt. Die dritte Hauptform umfasst tiefe Organmykosen bei lm- munsuppπmierten Patienten mit zellularer Immun¬ schwache, insbesondere im Bereich der Atemwege, seltener als Candida-Endocarditis, Candida- Menmgitis, Candida-Nephπtis und Candida- Endophthalmitis .
Aufgrund der Hyphenspezifitat und der damit verbundenen Korrelation zu einem Candida-verursachten Krankheitsbild weist die Anwesenheit von Nucleotidsequenzen, Proteinen, Antikörpern oder Fragmenten davon, die im Zusammenhang mit den erfindungsgemaßen hyphenspezifischen Proteinen stehen, auf eine Candida-verursachte Krankheit hm. Der Nachweis der vorgenannten Substanzen erfolgt durch Bindung und/oder Hybridisierung an mindestens einen der er- findungsgemaßen Biochips, die die nachzuweisenden Substanzen spezifisch erkennen.
Sollen im Zusammenhang mit den hyphenspezifischen Proteinen stehende Nucleotidsequenzen in einer Probe nachgewiesen werden, erfolgt deren Nachweis durch Hybridisierung mit dem erfindungsgemaßen Nuc- leotid-Chip. Dazu werden Nuclemsauren, beispielsweise DNA oder mRNA, aus einer Probe oder aus einer eigens angelegten Kultur isoliert und/oder amplifiziert, beispielsweise mittels PCR-Verfahren . Die extrahierten Nuclemsauren werden anschließend markiert, zum Beispiel mit Fluoreszenzfarbstoffen, Enzymen oder radioaktiven Gruppen. Hybridisiert die extrahierte und markierte DNA mit dem Nucleotid- Chip, so zeigt dies die Anwesenheit von Candida in der untersuchten Probe. Hybridisiert die extrahier¬ te mRNA mit dem erfindungsgemaßen Nucleotid-Chip, so weist dies darauf hm, dass die Probe hyphal wachsende Candida-Formen enthalt.
Sollen hyphenspezifische Candida-Proteme m einer Untersuchungsprobe nachgewiesen werden, werden Proteine aus der Probe extrahiert und markiert und anschließend mit dem erfindungsgemaßen Antikorper- Chip, der Antikörper gegen hyphenspezifische Proteine enthalt, mkubiert. Die Bindung mindestens eines markierten Proteins am erfindungsgemaßen Anti- korper-Chip weist auf die Anwesenheit hyphal wachsender Candida-Zellen hm. Der Nachweis von Anti- korpern gegen Candida-Proteme in Korperflussigkei- ten kann sowohl unter Verwendung des erfmdungsge- maßen Protem-Chips als auch unter Verwendung des erfindungsgemaßen Antikorper-Chips, der Antikörper enthalt, die gegen die Antikörper gegen hyphenspezifische Proteine gerichtet sind, erfolgen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Auffinden und identifizieren von Substanzen, die gegen Candida-verursachte Krankheiten therapeutisch wirksam sind, wobei eine zu testende Substanz m einem geeigneten Medium mit einem erfindungsgemaßen Nucleotid-Chip, einem erfindungsgemaßen Protem-Chip oder einem erfindungsgemaßen Antikorper- Chip in Kontakt gebracht und eine Wechselwirkung zwischen der zu testenden Substanz und mindestens einem der genannten Chips nachgewiesen wird. So können die erfindungsgemaßen Nucleotid- und Protem-Chips, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden, um Substanzen, beispielsweise Proteine, zu ldentiflzieren, die m vivo an Nucleotidsequenzen, die hyphenspezifisch exprimierte Proteine codieren beziehungsweise die Expression dieser Proteine regulieren, oder an die hyphenspezifischen Proteine selbst binden. Solche bindenden Substanzen, insbesondere Proteine, können potentiell als Medikamente gegen Candida-verursachte Krankheiten geeignet sein, wenn sie beispielsweise in der Lage sind, durch Bindung an regulatorische Nucleotidsequenzen die Transkription hyphenspezifischer Proteine zu hemmen oder zu unterbinden oder wenn sie durch Bindung an die hyphenspezifischen Proteine deren Aktivität hemmen oder unterbinden können. Wenn solche Substanzen, die an erfmdungsgemaße Nucleotid- oder Proteinchips binden, die Transkription der hyphenspezifischen Proteine induzieren oder fordern oder die Aktivität hyphenspezifischer Proteine derartiger Proteine begünstigen, können die erfin- dungsgemaßen Biochips verwendet werden, um weitere Substanzen zu identifizieren, die die Interaktion zwischen einem hyphenspezifischen Protein beziehungsweise der dieses codierenden Nucleotidsequenz und der daran bindenden Substanz, insbesondere eines bindenden Proteins, beeinflussen oder hemmen können. Auch solche Substanzen sind potentiell als Medikamente zur Behandlung Candida-verursachter Krankheiten geeignet.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Sequenzprotokoll und die folgenden Figuren und Beispiele erläutert.
Das Sequenzprotokoll ist Teil dieser Beschreibung und enthalt die Sequenzprotokolle SEQ ID Nr. 1 bis 18. Jede der nachstehend aufgeführten Ammosauresequenzen wurde aus der entsprechenden DNA-Sequenz abgeleitet und dann teilweise durch Sequenzierung der isolierten Proteine verifiziert.
SEQ ID Nr. 1 stellt die codierende Cap33a DNA-Sequenz aus Contιg4-2149 dar.
SEQ ID Nr. 2 stellt die codierende Cap33b DNA-Sequenz aus Contιg4-2501 dar.
SEQ ID Nr. 3 stellt die codierende Caplδp DNA-Sequenz aus Contιg4-2069 dar.
SEQ ID Nr. 4 stellt die codierende Capl9p DNA-Sequenz aus Contιg4-2069 dar.
SEQ ID Nr. 5 stellt die Ammosauresequenz von Cap33a dar.
SEQ ID Nr. 6 stellt die Ammosauresequenz von Cap33b dar.
SEQ ID Nr. 7 stellt die Ammosauresequenz von Caplδp dar.
SEQ ID Nr. 8 stellt die Ammosauresequenz von Capl9p dar.
SEQ ID Nr. 9 stellt die gesamte DNA-Sequenz von Contιg4-2149 dar.
SEQ ID Nr. 10 stellt die gesamte DNA-Sequenz von Contιg4-2501 dar. SEQ ID Nr. 11 stellt die gesamte DNA-Sequenz von Contιg4-2069 dar.
SEQ ID Nr. 12 stellt den Promoter-Bereich von Caplδp und Capl9p dar.
SEQ ID Nr. 13 stellt die Capl5p codierende DNA-Sequenz aus Contιg5-3226 dar.
SEQ ID Nr. 14 stellt die Ammosauresequenz von Capl5p dar. Bei Capl5p handelt es sich wahrscheinlich um eine Nucleosid-Diphosphat-Kmase .
SEQ ID Nr. 15 stellt die Cap20p codierende DNA-Se¬ quenz aus Contιg4-2178 dar.
SEQ ID Nr. 16 stellt die Ammosauresequenz von Cap20p dar. Bei Cap20p handelt es sich wahrscheinlich um eine Glutathionperoxidase .
SEQ ID Nr. 17 stellt die Cap40p codierende DNA-Sequenz aus Contιg5-2806 dar.
SEQ ID Nr. 18 stellt die Ammosauresequenz von Cap40p dar. Bei Cap40p handelt es sich wahrscheinlich um eine Fructose-Biphosphat-Aldolase .
Figur 1 zeigt im linken Teil mikroskopische Aufnahmen des virulenten, hyphal wachsenden Candida albi- cans-Stammes Sc5315 und des avirulenten, hefeartig wachsenden Candida-Stammes Can34 (ΔcphlΔefgl ) . Aus beiden Stammen wurde RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die markierte cDNA wurde mit einem er- findungsgemaßen Nucleotid-Chip, auf dem CAP33, CAP19 und CAP18 codierende Nucleotidsequenzen fi- xiert waren, hybridisiert. Die Ergebnisse dieser Hybridisierung sind im rechten Teil von Figur 1 zu sehen. Wahrend die cDNA aus dem avirulenten Stamm mit keiner der auf dem Nucleotid-Chip enthaltenen Nucleotidsequenzen hybridisierte, zeigte die cDNA des virulenten Stammes mit allen drei immobilisierten Nucleotidsequenzen starke Hybridisierungssigna- le. Wird der C. albicans-Stamm Sc5315 jedoch unter Bedingungen kultiviert, unter denen keine Hyphen entstehen, wird dasselbe Ergebnis wie für den avirulenten Stamm Can34 (ΔcphlΔefgl) erhalten.
Figur 2a zeigt mikroskopische Aufnahmen des virulenten, hyphal wachsenden Candida albicans-Stammes Sc5315 und des avirulenten, hefeartig wachsenden Candida-Stammes Can34 (ΔcphlΔefgl) . Darunter sind Abbildungen differentieller Proteom-Analysen der beiden Stamme nach Kultivierung m α-MEM-Medium gezeigt. Aus diesen Abbildungen geht hervor, dass Sc5314 bei Kultivierung in α-MEM-Medium die Proteine p33a und p33b expπmiert, Can34 (ΔcphlΔefgl) jedoch nicht.
Figur 2b zeigt die Ergebnisse einer Northern-Blot- Analyse unter Verwendung von RNAs aus diesen beiden Stammen, die zuvor entweder in YPD-Medium oder in α-MEM-Medium kultiviert worden waren. Ebenfalls einbezogen wurden RNAs aus dem virulenten Stamm Canl6 (Δcphl) und dem Stamm Can33 (Δefgl), der keine Hyphenbildung zeigt und eine stark verminderte Virulenz besitzt, wobei beide Stamme vor RNA- Extraktion in α-MEM-Medium kultiviert worden waren. Bei Hybridisierung mit caplδ-, cap-19 und cap33- spezifischen Sonden wurden Hybridisierungssignale mit den aus in α-MEM-Medium kultivierten Stammen Sc5314 und Canl6 isolierten RNAs gefunden. Die aus dem in YPD-Medium kultivierten Stamm Sc5314 isolierte RNA zeigte hingegen keine Hybridisierungs- signale. Die RNA aus dem avirulenten Stamm Can34 (kultiviert entweder m YPD- oder in α-MEM-Medium) zeigte ebenfalls keine Hybridisierungssignale . Das gleiche Ergebnis wurde auch bei der RNA erhalten, die aus dem in α-MEM-Medium kultivierten Stamm Can33 isoliert worden war. Als Kontrolle wurde eine Aktin-spezifische Sonde (ACT1) eingesetzt.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse von 2D- Gelelektrophoresen von Proteinextrakten aus den in α-MEM-Medium kultivierten Stammen Sc5315 und Can34
(ΔcphlΔefgl). Wahrend Sc5315 die hyphenspezifischen Proteine p33a, p33b, p40, pl5, pl8, pl9 und p20 exprimiert, werden diese Proteine in Can34
(ΔcphlΔefgl) nicht exprimiert.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteranspruchen beschrieben.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels naher beschrieben.
Beispiel 1 :
Die Isolierung der Proteine
Die Proteine wurden aus dem klinischen Isolat Sc5314 durch differenzielle 2D-Gelelektrophorese wie folgt isoliert: Zur Isolierung der Proteine wurden der virulente Candida albicans-Sta m Sc5314 und der avirulente Candida albicans Stamm Can34 (HLC69) (Lo et al., 1997, Cell, 90, 939-949) gleichzeitig m Vollmedium (YPD: 20g/l Bacto-Pepton; 10g/l Hefe-Extrakt; 0,15g/l L-Tryptophan) über Nacht angezogen, in α- MEM Medium (#22571 Life Technologies/Gibco) mit 2 % Glucose inocculiert (1:100) und für 24 h bei 37°C auf einem Rundschuttier mkubiert. Die so gewonnenen Zellen wurden pelletiert und in einem nicht de- tergenzhaltigen salmen Puffer ( PGSK-Puffer : 0,52g/l NaH2P04 »H20; 8,8g/l Na2HP04 «2H20; 2,8g/l NaCl; 0,372g/l KC1; llg/1 Glucose) mit Glasperlen aufgeschlossen. Der daraus isolierte Proteinextrakt wurde mittels isoelektischer Fokusierung und danach mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden mit Silber (vgl. Figur 2a) oder Coomassie (vgl. Figur 2b) angefärbt. Die Proteinspots, die nur in einem der beiden Gele sichtbar waren, wurden aus den coo- massiegefarbten Gelen ausgestochen und deren Sequenz bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die identifizierten Proteine ausschließlich in Sc5314 in α-MEM gebildet werden (Figuren 2a und 3) .
Aufgrund der Ammosaure-Sequenz, die durch Edmann- Abbau von tryptischen Fragmenten des Proteins eindeutig zu bestimmen war, konnte die zugehörige DNA- Sequenz über Datenbankvergleiche identifiziert werden. Die DNA-Sequenzen sowie die flankierenden Bereiche wurden durch PCR aus genomischer DNA von Sc5314 amplifiziert und cloniert . Weiterhin wurde die entsprechende DNA-Sequenz aus genomischen Bibliotheken (Liu et al., 1995, Science, 266, 1723- 1726) mittels Hybridisierung der durch PCR gewonnenen radioaktiv markierter Fragmente isoliert.
Die codierenden Sequenzen zu jedem der sieben identifizierten Proteine wurden aus den clonierten PCR- Fragmenten -mittels PCR- entfernt und durch Selek- tionsmarker (URA3) ersetzt (Fonzi and Irwin, 1993, Genetics, 134, 717-728). Diese Konstrukte werden zur Deletion der codierenden Sequenz in C. albicans verwendet. Weiterhin wurden die offenen Leserahmen zu allen sieben Proteinen sowie die Terminationsse- quenzen mittels PCR isoliert und in Vektoren mit regulierbaren PCK1- und MET3-Promotoren (Leuker et al., Gene, 1997, 19, 192(2), 235-40; Care et al . , Mol Microbiol., 1999, 34(4), 792-8.) zur Expression in C. albicans beziehungsweise mit regulierbaren GAL1-10- und MET25-Promotoren (Mumberg et al . , Nucleic Acids Res. 1994, 25, 22 (25), 5767-8.) zur Expression in S. cerevisiae und in geeignete Vektoren (pMAL, PGEx etc.) zur Expression der Proteine in Bakterien cloniert.
Beispiel 2 :
Nachweis der h_yphenspezi fischen Expression der erfindungsgemäßen Proteine
Die Regulation der hyphenspezifisch exprimierten Proteine findet auf Transkriptionsebene statt, da die mRNA zu allen sieben Proteinen ausschließlich in α-MEM gewachsenen Sc5314-Kulturen nachweisbar ist, nicht jedoch in Sc5314, der in Vollmedium kultiviert wurde, oder im avirulenten Stamm Can34 (ΔcphlΔefgl) , der in Vollmedium oder α-MEM-Medium kultiviert wurde.
Figur 2b zeigt als Beispiel eine Northern-Analyse von RNA aus den in Vollmedium (YPD oder α-MEM) kultivierten Stämmen Sc5314 und Can34 (ΔcphlΔefgl) . Bei dieser Northern-Analyse wurde zudem RNA der in α-MEM-Medium kultivierten Stämme Canl6 (Δcphl) und Can33 (Δefgl) (Lo et al., 1997, Cell, 90, 939-949) aufgetragen. Canl6 (Δcphl) wurde als Stamm beschrieben, der eine mit Sc5314 vergleichbare Virulenz aufweist und Hyphenbildung zeigt. Can33 (Δefgl) zeigt hingegen keine Hyphenbildung und seine Virulenz ist stark reduziert (Lo et al., 1997, Cell, 90, 939-949) .
Im virulenten Stamm Sc5314, der in α-MEM-Medium kultiviert wurde, können mit Cap33-, Caplδ- und Capl9-spezifischen Sonden die entsprechenden mRNAs nachgewiesen werden. Hingegen lassen sich in Sc5314, der in YPD-Medium kultiviert wurde, mit den vorstehend genannten Sonden keine entsprechenden mRNAs nachweisen. Im virulenten Stamm Canlδ, kultiviert in α-MEM-Medium, können unter Verwendung der Sonden die entsprechenden mRNAs ebenfalls nachgewiesen werden. Der avirulente Stamm Can34 (ΔcphlΔefgl) , kultiviert entweder in YPD-Medium o- der in α-MEM-Medium, enthält keine entsprechende mRNAs. Auch der in α-MEM-Medium kultivierte Stamm Can33 enthält keine entsprechenden mRNAs.
Die Ergebnisse dieser Northern-Blot-Analyse zeigen einerseits die hyphenspezifische Expression der Proteine mit SEQ ID Nr. 5, 5, 7, 8, 14, 16 und 18 in den virulenten Stämmen Sc5314 und Canl6. Andererseits zeigen diese Ergebnisse, dass die hyphenspezifische Expression dieser Proteine hauptsächlich auf der Transkriptionsebene reguliert wird. Dies ist für die Verwendung als diagnostisches Mittel bedeutsam, da die Anwesenheit von mRNA, die im Zusammenhang mit einem der vorstehend genannten hyphenspezifischen Proteinen steht, in einer zu testenden Probe ein Hinweis auf das Vorkommen hyphal wachsender virulenter Candida-Formen in dieser Probe ist.
Proteinextrakte aus den Stämmen Sc5314 und Can34 (ΔcphlΔefgl) , die in α-MEM-Medium kultiviert worden waren, wurden entsprechend üblichen Verfahren einer 2D-Gelektrophorese unterworfen. Wie in Figur 3 zu sehen, sind die hyphenspezifisch exprimierten Proteine pl5, plδ, pl9, p20, p33a, p33b und p40 ausschließlich im hyphal wachsenden Stamm Sc5314 nachweisbar, nicht jedoch im avirulenten Stamm Can34 (ΔcphlΔefgl) . In Figur 2a ist darüber hinaus dargestellt, dass der in α-MEM-Medium kultivierte Stamm Sc5314 die Proteine Cap33a und Cap33b produziert, der Stamm Can34 jedoch nicht.
Beispiel 3 :
Nachweis von hyphenspezifische Proteine codierenden Nucleotidsequenzen mi t tels eines Nucleotid-Chips
Auf einer Poly-L-Lysin-beschichteten Trägeroberfläche wurden Nucleotidsequenzen, die die hyphenspezi- fischen Proteine CAP33, CAP19 und CAP16 codieren, fixiert. Der so erhaltene Nucleotid-Chip wurde un- ter üblichen Hybridisierungsbedingungen mit cDNAs hybridisiert, die aus mRNA des hyphal wachsenden Candida albicans-Stammes Sc5315 und des avirulenten, hefeartig wachsenden Candida-Stammes Can34 (ΔcphlΔefgl) hergestellt worden waren. Die Ergebnisse dieser Hybridisierung sind in Figur 1 dargestellt. Während die cDNA aus dem avirulenten Stamm mit keiner der auf dem Nucleotid-Chip enthaltenen Nucleotidsequenzen hybridisierte, zeigte die cDNA des virulenten Stammes mit allen drei immobilisierten Nucleotidsequenzen starke Hybridisierungssigna- le. Dieser Versuch zeigt, dass unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Nucleotid-Chips spezifische Nucleinsäuren nachgewiesen werden können und dass damit hyphal wachsende virulente C. albicans-Stämme von nicht-hyphal wachsenden, avirulenten C. albi- cans-Stämmen unterschieden werden können.

Claims

Ansprüche
1. Nucleotid-Chip, umfassend einen festen Träger und mindestens eine daran fixierte Nucleotidsequenz, welche für die Identifizierung und Transkription eines ein hyphenspezifisches Protein codierenden Gens geeignet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einer Nucleotidsequenz, definiert in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 12, 13, 15 oder 17, oder eines komplementären Strangs oder Teils davon,
(b) einer Nucleotidsequenz, codierend die Aminosäuresequenz, definiert in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18, oder eines komplementären Strangs oder Teils davon und
(c) einer Nucleotidsequenz, die mit einer der (a) oder (b) genannten Nucleotidsequenzen hybridisiert.
2. Nucleotid-Chip nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz eine DNA-, RNA- oder PNA-Sequenz ist.
3. Protein-Chip, umfassend einen festen Träger und mindestens ein daran fixiertes hyphenspezifisches Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz, definiert in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18, oder einem Fragment davon, und
(b) einem Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zu einer der in SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 definierten Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität von mindestens 80% aufweist, oder einem Fragment davon.
4. Protein-Chip nach Anspruch 3, wobei das Fragment des Proteins ein eine Antigen-Determinante umfassender Protein-Bereich ist.
5. Antikörper-Chip, umfassend einen festen Träger und mindestens einen daran fixierten Antikörper, der spezifisch gegen ein Protein mit der SEQ ID Nr.
5. 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 gerichtet ist.
6. Antikörper-Chip nach Anspruch 5, wobei der Antikörper ein monoclonaler, polyclonaler und/oder modifizierter Antikörper ist.
7. Antikörper-Chip, umfassend einen festen Träger und mindestens einen daran fixierten Antikörper, der spezifisch gegen einen Antikörper gegen ein Protein mit der SEQ ID Nr. 5, 6, 7, 8, 14, 16 oder 18 gerichtet ist.
8. Diagnostische Zusammensetzung, enthaltend einen Nucleotid-Chip nach Anspruch 1 oder 2, einen Protein-Chip nach Anspruch 3 oder 4 oder einen Antikörper-Chip nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
9. Verfahren zum Diagnostizieren einer durch Arten der Gattung Candida verursachten Krankheit, wobei eine zu testende Probe in einem geeigneten Medium mit einem Nucleotid-Chip nach Anspruch 1 oder 2, einen Protein-Chip nach Anspruch 3 oder 4 oder einen Antikörper-Chip nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in Kontakt gebracht wird und eine Interaktion zwischen der zu testenden Probe und mindestens einem der genannten Chips nachgewiesen wird.
10. Verfahren zum Auffinden und Identifizieren therapeutisch gegen durch Arten der Gattung Candida verursachten Krankheiten wirksamer Substanzen, wobei eine zu testende Substanz in einem geeigneten Medium mit einem Nucleotid-Chip nach Anspruch 1 o- der 2, einen Protein-Chip nach Anspruch 3 oder 4 oder einen Antikörper-Chip nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in Kontakt gebracht wird und eine Interaktion zwischen der zu testenden Substanz und mindestens einem der genannten Chips nachgewiesen wird.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060228813A1 (en) * 2003-04-10 2006-10-12 Ying Wu Method for immobilizing biomolecules on metal oxide substrates
CN1948335B (zh) * 2005-10-14 2010-05-12 中国科学院上海生命科学研究院 白念珠菌菌丝调控因子基因及其用途
US7745158B2 (en) 2005-12-14 2010-06-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection of secreted aspartyl proteases from Candida species
EP2887068B8 (de) 2013-12-20 2018-10-24 Bio-Rad Innovations Verfahren zur Verbesserung der Diagnose von invasiven Candida-Infektionen durch FBA1-Proteinerkennung

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700636A (en) 1990-10-19 1997-12-23 Becton Dickinson And Company Methods for selectively detecting microorganisms associated with vaginal infections in complex biological samples
EP2332957B1 (de) 1996-02-09 2015-04-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detektion von Unterschieden in der Sequenz von Nukleinsäuren mittels der Ligasedetektionsreaktion und adressierbaren Arrays
AU4858597A (en) * 1996-10-30 1998-05-22 National Research Council Of Canada (candida albicans) proteins associated with virulence and hyphal formation and uses thereof
CA2319828A1 (en) 1998-01-29 1999-08-05 Miller, Samuel High density arrays for proteome analysis and methods and compositions therefor
CA2318175A1 (en) * 1998-02-04 1999-08-12 Invitrogen Corporation Microarrays and uses therefor
US6747137B1 (en) * 1998-02-13 2004-06-08 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid sequences relating to Candida albicans for diagnostics and therapeutics
DE60000836T2 (de) 1999-02-08 2003-09-04 Fuji Photo Film Co., Ltd. Verfahren zur herstellung eines dns chip
US6713255B1 (en) 1999-06-07 2004-03-30 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip, PNA chip, and their preparation methods
JP2001186881A (ja) 1999-10-22 2001-07-10 Ngk Insulators Ltd Ｄｎａチップの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
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