EP1224472A1 - Verfahren zur identifizierung von zellspezifischen proteinen - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von zellspezifischen proteinen

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EP1224472A1
EP1224472A1 EP01974224A EP01974224A EP1224472A1 EP 1224472 A1 EP1224472 A1 EP 1224472A1 EP 01974224 A EP01974224 A EP 01974224A EP 01974224 A EP01974224 A EP 01974224A EP 1224472 A1 EP1224472 A1 EP 1224472A1
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EP
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cell
cells
protein
specific
combination patterns
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EP01974224A
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Walter Schubert
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MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH
Original Assignee
MELTEC MULTI EPITOPE LIGAND TE
Meltec Multi-Epitope-Ligand-Technologies GmbH
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1072—Differential gene expression library synthesis, e.g. subtracted libraries, differential screening
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Definitions

  • the invention relates to a method for identifying cell-specific proteins.
  • lymphocytes express specific combinations of proteins, also called protein combination patterns or PKM for short, which are responsible for binding to endothelial cells of the blood vessels of the brain and muscle tissue.
  • protein combination patterns also called protein combination patterns or PKM for short, which are responsible for binding to endothelial cells of the blood vessels of the brain and muscle tissue.
  • PKM protein combination patterns
  • these specific combinations are constant on an individual basis and always have the same binding functions.
  • the specific protein combination patterns therefore appear to be an interindividual constant lymphocyte binding code of the cell surface for organ-specific endothelial cell surfaces, which represents a cell-specific target structure.
  • Cell-specific target structures can consequently have very specific protein combination patterns.
  • Invasive tumor cells also have specific protein combination patterns on their cell surfaces, which lead to targeted, ie organ-selective invasion behavior.
  • Such protein combination patterns therefore represent target structures for possible drugs.
  • Methods for identifying target structures are known from the prior art, which are based on the analysis of gene expression profiles of diseased tissues or cells in comparison to gene expression profiles of healthy tissues or cells, both protein expression profiles and expression profiles of messenger ribonucleic acid (mRNA ) To provide information about the appearance of new proteins, misregulated or abnormally modified proteins in diseased tissues or cells (e.g. in: F. Lottsspeich / H.Zorbas; Bioanalytik; Spektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, 1998).
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • cell homogenates which are usually based on thousands or millions of cells, since expression profiles of the type mentioned above can only be created with the aid of these cell sets.
  • the cells are in an open form so that the proteins or mRNA molecules can be extracted and separated using biochemical processes.
  • a disadvantage of these known methods is that they are not suitable for identifying protein combination patterns, since the individual protein components of such a protein combination pattern are completely separated by the generation of cell homogenates and by the subsequent extraction processes, and the essential information regarding their cell and tissue topological position get lost. By destroying the cell compartments, no information regarding the combinations of proteins within these cell compartments and their relative topological relationship can be obtained.
  • Another disadvantage of the known methods is that no analysis can be carried out at the single cell level, so that differences between the individual cells with regard to their protein combination patterns cannot be determined.
  • protein combination patterns of individual cells or cell membranes from different cell or tissue samples can be compared.
  • those marker molecules can be identified which, for example, bind to a specific protein combination pattern or to a specific region of such a protein combination pattern of a first object which originates from a first tissue or cell sample and which do not simultaneously bind to a second object, that of a second tissue or cell sample comes.
  • those molecular regions (molecules or molecular complexes) of the protein combination pattern can now be found or selected and subsequently characterized using a sample portion of the first tissue and / or cell sample, which are bound by the identified marker molecules. In this way it is possible to detect both the molecular composition of a protein combination pattern, the arrangement of the molecules within the protein combination pattern and the arrangement of the protein combination pattern within a tissue or a cell.
  • the object of the invention is therefore to further develop and provide a method of the type mentioned above, further processed by the identified and highly complex protein combination pattern and thus facilitating the development of highly selective pharmaceuticals.
  • a method for identifying cell-specific proteins which comprises the following steps: (a) Determination of cell-specific protein combination patterns of n cells; (b) comparison of the protein combination pattern of healthy and pathologically or physiologically modified cells of a cell type or comparison of the protein combination pattern of cells of different cell types with the same clinical picture; (d) subtracting the corresponding proportions of the protein combination patterns compared in process step (b) from healthy and pathologically or physiologically modified cells of a cell type and determining a resulting cell-specific protein; or (c2) subtraction of the non-matching portions of the protein combination patterns compared in method step (b) from rows of different cell types with the same clinical picture and determination of a resulting cell-specific protein; and (d) molecular and spatial identification of the resulting cell-specific protein.
  • the inhibiting substance can be an antibody.
  • the cell-specific protein combination patterns to be processed according to the invention are determined with the aid of the methods described in DE 197 09 348 02 and DE 100 01 685 A1 for determining, identifying and mapping cell-specific target structures.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Proteinen, folgende Schritte umfassend: a) Ermittelung zellspezifischer Proteinkombinationsmuster von n Zellen; b) Vergleich der Proteinkombinationsmuster von gesunden und pathologisch oder physiologisch veränderten Zellen eines Zelltyps oder Vergleich der Proteinkombinationsmuster von Zellen unterschiedlichen Zelltyps mit gleichem Krankheitsbild; c1) Subtraktion der übereinstimmenden Anteile der in Verfahrensschritt b) verglichenen Proteinkombinationsmuster von gesunden und pathologisch oder physiologisch veränderten Zellen eines Zelltyps und Ermittelung eines daraus resultierenden zellspezifischen Proteins; oder c2) Subtraktion der nicht-übereinstimmenden Anteile der in Verfahrensschritt b) verglichenen Proteinkombinationsmuster von Zellen unterschiedlichen Zelltyps mit gleichem Krankheitsbild und Ermittelung eines daraus resultierenden zellspezifischen Proteins; und d) molekulare und räumliche Identifizierung des resultierenden zellspezifischen Proteins.

Description

Verfahren zur Identifizierung von zeilspezifischen Proteinen
BESCHREIBUNG:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Proteinen.
Die Identifizierung zellspezifischer Proteinkombinationsmuster ist von zentraler Bedeutung bei der Aufklärung von Zell-Zell-interaktionen, die unzählige Wirkungen innerhalb eines Organismus nach sich ziehen können. Insbesondere die Kenntnis krankheitsspezifische Zielstrukturen ist eine entscheidende Voraussetzung für die Entwicklung wirksamer und gleichzeitig nebenwirkungsarmer Arzneimittel.
Es ist bekannt, daß Immunzellen (Lymphozyten) spezifische Kombinationen von Proteinen, auch Proteinkombinationsmuster bzw. kurz PKM genannt, exprimieren, die für eine Bindung an Endothelzellen der Blutgefäße von Gehirn und Muskelgewebe verantwortlich sind. Andere Kombinationen von Proteinen führen dagegen nicht zu einer Bindung an diese Endothelzellen. Überraschenderweise sind diese spezifischen Kombinationen interindividuell konstant und weisen immer dieselben Bindungsfunktionen auf. Es scheint sich folglich bei den spezifischen Proteinkombinationsmustern um einen interindividuellen konstanten Lymphozyten Binduhgs-Code der Zelioberfläche für organspezifische Endothelzelloberflächen zu handeln, der eine zellspezifische Zielstruktur darstellt. Zellspezifische Zielstrukturen können folglich ganz spezifische Proteinkombinationsmuster aufweisen. Auch invasive Tumorzellen verfügen über spezifische Proteinkombinationsmuster an ihren Zelloberflächen, die zu einem gezielten, d.h. organselektiven Invasionsverhalten führen. Solche Proteinkombinationsmuster stellen daher Zielstrukturen für mögliche Arzneimittel dar.
Unbedingte Voraussetzung für die Entwicklung solcher hoch-selektiver Arzneimittel ist jedoch die Kenntnis der molekularen Zusammensetzung dieser Zielstrukturen.
Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zur Identifizierung von Zielstrukturen bekannt, die auf der Analyse von Gen-Expressionsprofilen von kranken Geweben oder Zellen im Vergleich zu Gen-Expressionsprofilen von gesunden Geweben oder Zellen beruhen, wobei sowohl Proteinexpressionsprofile als auch Expressionsprofile der Messenger Ribonukleinsäure (mRNA) Aufschluss über das Auftreten neuer Proteine, fehlregulierter oder abnorm modifizierter Proteine in kranken Geweben oder Zellen geben sollen (z.B. in: F. Lottspeich/H.Zorbas; Bioanalytik; Spektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, 1998).
Diese Verfahren gehen jedoch alle von Zellhomogenaten aus, denen in der Regel Tausende oder Millionen von Zellen zugrunde liegen, da nur mit Hilfe dieser Zellmengen Expressionsprofile der oben genannten Art erstellt werden können. In den Zellhomogenaten liegen die Zellen in aufgeschlossener Form vor, damit die Proteine oder mRNA-Moleküle mit Hilfe biochemischer Verfahren extrahiert und getrennt werden können.
Nachteilig an diesen bekannten Verfahren ist jedoch, daß sie nicht dazu geeignet sind, Proteinkombinationsmuster zu identifizieren, da die einzelnen Proteinkomponenten eines solchen Proteinkombinationsmusters durch die Erzeugung von Zellhomogenaten und durch die darauffolgenden Extraktionsvorgänge vollständig getrennt werden und die wesentliche Information bezüglich ihrer zell- und gewebetopologischen Lage verloren geht. Durch die Zerstörung der Zellkompartimente können weiterhin keine Informationen bezüglich der Kombinationen von Proteinen innerhalb dieser Zellkompartimente und ihre relative topologische Beziehung zueinander gewonnen werden. Ein weiterer Nachteil der bekannten Verfahren ist außerdem, daß keine Analytik auf dem Einzelzellniveau durchführbar ist, so daß Unterschiede der einzelnen Zellen bezüglich ihrer Proteinkombinationsmuster nicht erfassbar sind. Diese Nachteile überwinden die in der DE 197 09 348 C2 und der DE 100 01 685 A1 beschriebenen Verfahren zur Bestimmung, Identifizierung und Kartierung zellspezifischer Zielstrukturen. Durch diese Verfahren können Proteinkombinationsmuster einzelner Zellen oder Zellmembranen von unterschiedlichen Zell- oder Gewebeproben vergleichend untersucht werden. Dabei können diejenigen Markiermoleküle identifiziert werden, die beispielsweise an ein bestimmtes Proteinkombinationsmuster oder an einen bestimmten Bereich eines solchen Proteinkombinationsmuster eines ersten Objektes binden, das einer ersten Gewebeoder Zellprobe entstammt, und die gleichzeitig nicht an ein zweites Objekt binden, das einer zweiten Gewebe- oder Zellprobe entstammt. Mit Hilfe dieser identifizierten Markiermoleküle können nun unter Verwendung eines Probenanteils der ersten Gewebe- und/oder Zellprobe diejenigen molekularen Bereiche (Moleküle oder Molekülkomplexe) des Proteinkombinationsmusters aufgefunden bzw. selektiert und anschließend charakterisiert werden, die durch die identifizierten Markiermoleküle gebunden werden. Auf diese Weise ist es möglich, sowohl die molekulare Zusammensetzung eines Proteinkombinationsmuster, die Anordnung der Moleküle innerhalb des Proteinkombinationsmusters und die Anordnung des Proteinkombinationsmusters innerhalb eines Gewebes oder eine Zelle zu erfassen.
Die so erhaltenen zellspezifischen Proteinkombinationsmuster sind jedoch noch immer hoch-komplex, was die Entwicklung hoch-selektiver Arzneimittel deutlich erschwert.
Aufgabe der Erfindung ist es daher ein Verfahren der oben genannten Art weiterzubilden und bereitzustellen, durch das identifizierte und hoch-komplexe Proteinkombinationsmuster weiter aufbereitet und so die Entwicklung hoch- selektiver Arzneimittel erleichtert.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Proteinen, das folgende Schritte umfasst: (a) Ermittelung zellspezifischer Proteinkombinationsmuster von n Zellen; (b) Vergleich der Proteinkombinationsmuster von gesunden und pathologisch oder physiologisch veränderten Zellen eines Zelltyps oder Vergleich der Proteinkombinationsmuster von Zellen unterschiedlichen Zelltyps mit gleichem Krankheitsbild; (d) Subtraktion der übereinstimmenden Anteile der in Verfahrensschritt (b) verglichenen Proteinkombinationsmuster von gesunden und pathologisch oder physiologisch veränderten Zellen eines Zelltyps und Ermittelung eines daraus resultierenden zellspezifischen Proteins; oder (c2) Subtraktion der nicht-übereinstimmenden Anteile der in Verfahrensschritt (b) verglichenen Proteinkombinationsmuster von Zeilen unterschiedlichen Zelltyps mit gleichem Krankheitsbild und Ermittelung eines daraus resultierenden zellspezifischen Proteins; und (d) molekulare und räumliche Identifizierung des resultierenden zellspezifischen Proteins.
Durch die Reduzierung der hoch-komplexen ermittelten Proteinkombinationsmuster auf ein einzelnes, hoch-selektives und zellspezifisches Protein ist es möglich, die Entwicklung von ebenfalls hoch-selektiven Arzneimittel deutlich zu erleichtern und den Zeitraum für diese Entwicklung signifikant zu verkürzen. So ist es bei der Entwicklung von Arzneimitteln nicht mehr notwendig die hoch-komplexen und ebenfalls zellcharakteristischen Proteinkombinationsmuster zu betrachten.
Erfindungsgemäß ist lediglich eine Selektion einer Substanz zur Hemmung der Aktivität des identifizierten zellspezifischen Proteins notwendig. Diese Hemmung führt zu einem Zusammenbrechen des zellspezifischen Proteinnetzwerks und damit zu einem Zusammenbrechen der Zellfunktionen. Beispielsweise führt das Ausschalten des zellspezifischen Proteins von Tumorzellen zu einer Hemmung der Migration dieser Zellen, da das hierbei identifizierte Protein das Migrationsverhalten der Tumorzelle steuert und regelt. Die hemmende Substanz kann dabei ein Antikörper sein.
Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich dann, wenn es sich bei pathologisch veränderten Zellen um invasive Zellen handelt.
Aufgrund der Kenntnis dieser z.B. krankheitsspezifischen Proteine innerhalb eines Proteinkombinationsmusters können zudem hoch-spezifische Arzneimittel entwickelt werden, die aufgrund eben dieser Spezifität nahezu nebenwirkungsfrei sind.
Die erfindungsgemäß aufzuarbeitenden zellspezifischen Proteinkombinationsmuster werden mit Hilfe der in der DE 197 09 348 02 und der DE 100 01 685 A1 beschriebenen Verfahren zur Bestimmung, Identifizierung und Kartierung zellspezifischer Zielstrukturen ermittelt.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen ProteinenANSPRUCHE:
1. Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Proteinen, folgende Schritte umfassend: a) Ermittelung zellspezifischer Proteinkombinationsmuster von n Zellen;
b) Vergleich der Proteinkombinationsmuster von gesunden und pathologisch oder physiologisch veränderten Zellen eines Zelltyps oder Vergleich der
Proteinkombinationsmuster von Zellen unterschiedlichen Zelltyps mit gleichem Krankheitsbild;
d) Subtraktion der übereinstimmenden Anteile der in Verfahrensschritt b) verglichenen Proteinkombinationsmuster von gesunden und pathologisch oder physiologisch veränderten Zellen eines Zelltyps und Ermittelung eines daraus resultierenden zellspezifischen Proteins; oder
c2) Subtraktion der nicht-übereinstimmenden Anteile der in Verfahrensschritt b) verglichenen Proteinkombinationsmuster von Zellen unterschiedlichen
Zelltyps mit gleichem Krankheitsbild und Ermittelung eines daraus resultierenden zellspezifischen Proteins; und
d) molekulare und räumliche Identifizierung des resultierenden zellspezifischen Proteins.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Selektion einer Substanz zur Hemmung der Aktivität des identifizierten zellspezifischen Proteins umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß die Substanz ein Antikörper ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei pathologisch veränderten Zellen um invasive Zellen handelt.
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