DE102018001512A1

DE102018001512A1 - Test zur Kontrolle primärer Wirkstoffwirkungen (Drug Primär Performance Monitoring Assay) zur gleichzeitigen Bestimmung eines Analyten und einer gegen den Analyten gerichteten Therapeutikums

Info

Publication number: DE102018001512A1
Application number: DE102018001512.3A
Authority: DE
Inventors: Pavel Strohner; Astrid Schäfer; Anja Talke; Uwe Ahnert; Jürgen Schliepe
Original assignee: BIOTEZ BERLIN-BUCH GmbH; Bio Tez Berlin Buch GmbH
Current assignee: BIOTEZ BERLIN-BUCH GmbH; Bio Tez Berlin Buch GmbH
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2019-08-29

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Test zur Kontrolle primärer Wirkstoffwirkungen (Drug Primär Performance Monitoring Assay), bei dem eine gleichzeitige quantitative Bestimmung eines Analyten und eines gegen den Analyten gerichteten Wirkstoffs erfolgt. Der Test beruht auf der Verwendung eines Fängerantikörpers, der den Analyten 1 (Target) bindet. Dieser Analyt 1 ist Ziel eines Wirkstoffs (Analyt 2), der die sogenannten „Small Molecules“ mit einer Molekülmasse von weniger als 800 µ·mol-1 umfasst, mit denen kein klassischer Sandwich-ELISA möglich ist, und der am Analyten 1 bindet. Wird das Therapeutikum markiert als Konjugat zugesetzt, erhält man einen Assay zur gleichzeitigen Konzentrationsbestimmung des freien Analyten 1, des freien Analyten 2 und das Neutralisierungspotential für den Analyten 1. Der Assay ermöglicht erstmalig die Bestimmung eines Targets und eines gegen dieses Target gerichteten Wirkstoffs mit kleiner Molekülmasse, bei denen ein klassischer Sandwich Immunoassay, d.h. die Bindung eines Analyten zwischen zwei Proteinen, etwa auf Grund der Molekülgröße nicht zuverlässig gelingt oder gar nicht möglich ist.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung eines Analyten 1 und eines gegen den Analyten 1 gerichteten Therapeutikums (Analyt 2) (Drug Primär Performance Monitoring Assay abgekürzt DPPMA). Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.
Hintergrund der Erfindung
Ein großer Trend in der Medizin ist der Ansatz hin zu einer individualisierten Medizin. Dies umfasst z. B. auch die individuelle Einstellung einer optimalen Medikamentendosierung, sowie die Überwachung der Wirksamkeit eines Therapeutikums. Dazu ist es notwendig den Grad einer Interaktion des Wirkstoffes mit seinem Targetmolekül zu bestimmen. Unter Interaktion ist dabei die primäre konzentrationsabhängige Bindung zwischen Molekülen in Lösungen zu verstehen. Ist ein Molekül gebunden, bedeutet dies, dass es inaktiv ist, d. h. es ist neutralisiert. Neutralisierungspotenzial bedeutet einen Prozentwert zwischen 0 und 100, der unter Berücksichtigung der Bindungsfunktion zwischen Targetmolekül und Wirkstoff beschreibt, mit welchem Prozentwert eine zusätzliche Einheit des Targetmoleküls gebunden wird.
Die primäre Wirkung eines Therapeutikums ist definiert als Bindung des Therapeutikums am Target Molekül, die nicht immer mit sekundären Wirkungen,
z. B. der Besserung klinischer Symptome korreliert. Es müssen also therapiebegleitende und therapielenkende Testsysteme entwickelt werden, die sowohl eine Quantifizierung des freien Targets als auch eine Quantifizierung des noch neutralisierungsfähigen Therapeutikums ermöglichen.
Ein Beispiel, in dem eine individuelle und personalisierte Einstellung der Medikation und Dosierung wichtig ist, ist die Therapie von Parkinson. Bei Parkinsonerkrankungen kommt es zu Dopaminmangel und zu einem Ungleichgewicht zwischen Acetylcholin und Dopamin. Medikamentöse Therapien bestehen aus der gleichzeitigen Gabe von Dopamin oder Vorstufen von Dopamin und Enzymen, um die vorzeitige Verstoffwechselung zu unterbinden. Zu den gegenwärtig wichtigsten Therapeutika zählen Hemmstoffe gegen die Enzyme, die das Dopamin ab- und umbauen wie die Catechol-O-Methyltransferase (COMT), die Monoaminooxidase B (MAO-B) und die Dopamin-Decarboxylase (DDC). Die mit Abstand häufigste Behandlung besteht aus Kombinationspräparaten, L-Dopa (Levodopamin), eine Vorstufe vom fehlenden Dopamin und den Hemmstoffen für die Enzyme COMT, MAO-B, DDC. Die Einstellung der richtigen Medikamentendosis geschieht oftmals durch Ausprobieren und bei Therapieversagern besteht Ratlosigkeit. Die zeitgleich verabreichten Enzymhemmstoffe verursachen enorme Nebenwirkungen, da sie eine sehr große Gruppe hochwirksamer körpereigener Substanzen unkontrolliert beeinflussen. Die Wechselwirkungen sind daher sehr komplex und für die Patienten häufig unangenehm. Eine ganzheitliche Diagnostik liefert dem Arzt Informationen über die Wirksamkeit seines Medikamentes und erlaubt Effekte, die von einer Dosisveränderung ausgehen, zu prognostizieren. Ausprobieren kann damit reduziert werden. Aus diesem Grund stellen die Analyse der freien Targetenzyme des Dopamin-Stoffwechsels (MAO-B, DDC und COMT), die Analyse der entsprechenden Hemmstoffe und die Analyse der Dosis-Wirkungsbeziehung einen notwendigen therapiebegleitenden Schritt dar. Dafür ist es wichtig, nicht nur die Konzentrationen an Enzym und Enzymhemmstoff im Serum zu bestimmen, sondern auch deren Interaktion, bzw. die primäre Wirksamkeit bezogen auf den individuellen Patienten.
Stand der Technik
Bisher sind im Stand der Technik Verfahren bekannt, die eine gleichzeitige Quantifizierung eines Analyten und eines gegen den Analyten gerichteten proteinbasierten Therapeutikums erlauben, die allerdings nur zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden können. So beschreibt EP 1957980 einen Recovery Immunoassay und ein dazugehöriges Verfahren zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers. Dieser Assay geht von einem gewöhnlichen Sandwich-Immunoassay aus. In einem richtig bestimmenden Sandwich-Immunoassay, bei dem der Therapieantikörper oder ein Antikörper, der am gleichen Bindungsepitop bindet, in markierter Form als Nachweisantikörper oder Fängerantikörper verwendet wird, bewirkt die Anwesenheit des Therapieantikörpers in Proben eine systematische Verringerung der Wiederfindung des zu bestimmenden Antigens, die mit der Konzentration des Therapieantikörpers korreliert. Diese Korrelation wird zur Bestimmung der unbekannten Konzentration des Therapieantikörpers und zur Bestimmung der freien und totalen Antigenkonzentration genutzt.
Ein weiterentwickelter Assay wird in WO 2012/059083 beschrieben, bei dem ebenso modifizierten Antikörper (bi-; trispezifische Antikörper, Antikörperwirkstoffkonjugate etc.) und -Analoga wie z. B. Fusionsproteine, Aptamere und Non-Antibody Scaffold Proteine eingesetzt werden können.
Beide Verfahren beschreiben Sandwich-Immunoassays im klassischen Sinn. Diese haben den Nachteil, dass lediglich Therapeutika in Form von Antikörpern nachgewiesen werden können, die eine Protein-Protein-Bindung mit dem Analyten (Target) eingehen. Therapeutika, die keine Antikörper darstellen und demzufolge keine Protein-Protein-Bindung, sondern eine chemische Bindung mit dem Target eingehen, können dagegen nicht zusammen mit dem Target quantifiziert werden. So ist beispielsweise mit sog. „Small Molecules“, einer Klasse von Wirkstoffen, deren Molekülmasse 800 µ·mol^-1 nicht übersteigt, ein wie im Stand der Technik beschriebener Sandwich-Immunoassay nicht möglich. Derartige Small Molecules spielen wie zuvor erwähnt u. a. bei der Parkinson-Therapie eine Rolle, deren Überwachung wie ebenfalls bereits erwähnt wurde, von großer Bedeutung ist. Die bisher bekannten Tests können in diesem Fall nicht eingesetzt werden.
Ziel und Aufgabe der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, die Interaktion zwischen einem Targetmolekül und einem am Targetmolekül bindenden Wirkstoff, der die sogenannten „Small Molecules“ umfasst so zu charakterisieren, dass die Konzentration des freien Targetmoleküls, die Konzentration des noch vorhandenen freien Wirkstoffs und das Neutralisierungspotenzial des Wirkstoffs in einem Immunoassay bestimmt werden kann. Insbesondere besteht das Ziel darin, einen therapiebegleitenden und therapielenkenden Test für die Einstellung und Medikation z.B. bei Parkinsonerkrankungen zu entwickeln, mit dem es möglich ist die optimale Medikamentendosis zu finden und einzustellen.
Daraus leitet sich die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ab, ein Testsystem zu entwickeln, mit dem es möglich ist sowohl das freie Zielprotein als auch den daran gebundenen Wirkstoff mit dem ein Sandwich-ELISA nicht möglich ist, separat aber in einem Messansatz zu quantifizieren.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere mögliche Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Beispielen.
Wesen der Erfindung
Das vorliegende Verfahren betrifft einen Drug Primär Performance Monitoring Assay (nachfolgend als DPPMA abgekürzt) zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung eines Analyten 1 (Target), eines gegen den Analyten 1 gerichteten Therapeutikums / Wirkstoffs (Analyt 2) und daraus berechnet, des Grads der Abbindung des Analyt 1.
Dabei basiert das vorliegende Verfahren auf der Erkenntnis, dass das aus EP 1957980 oder WO 2012/059083 bekannte Recovery-Immunoassay-Prinzip bei einer Abwandlung auch zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung von Targets und von gegen diese Targets gerichteten „Small Molecules“ als Therapeutika, bei denen kein Sandwich-Immunoassay möglich ist, unter bestimmten Bedingungen angewendet werden kann.
Das vorliegende Verfahren beruht auf der Verwendung eines Fängerantikörpers, der den Analyten 1 (Target) bindet. Dieser Analyt 1 ist Ziel von einem Wirkstoff (Analyt 2), der die sogenannten „Small Molecules“ mit einer Molekülmasse von weniger als 800 µ·mol^-1 umfasst, mit denen kein wie im Stand der Technik beschriebener Sandwich-ELISA möglich ist, und der am Analyten 1 bindet. Wird dieses Therapeutikum markiert (nachfolgend als Konjugat bezeichnet), erhält man einen Assay zur gleichzeitigen Konzentrationsbestimmung des freien Analyten 1, des freien Analyten 2 und das Neutralisierungspotential für den Analyten 1. In Analogie zum Recovery Immunoassay können nun die in Proben vorhandenen Konzentrationen eines freien Target Moleküls, z. B. MAO-B sowie die frei vorhandene unbekannte Konzentration eines dagegen gerichteten Wirkstoffs z. B. Rasagilin durch systematische Wiederfindung eines spezifischen Konjugates bestimmt werden. Anders als beim Recovery Immunoassay liegt diesmal keine Protein-Protein-Bindung vor, sondern eine chemische Bindung eines Medikamenten-Konjugates. Die Korrelation wird zur Bestimmung der unbekannten Konzentration des freien Therapeutikums (Analyt 2) und zur Bestimmung der freien und totalen Target Konzentration (Analyt 1) in Proben genutzt.
Der erfindungsgemäße Assay-Aufbau umfasst die nachstehenden Komponenten:

- ein an einer Festphase (1) (z. B. Mikrotiterplatte, Chip, Membran, Beads etc.) im Verlauf des Assays gebundenes direkt oder indirekt immobilisiertes Fängermolekül (z. B. Antikörper, Peptide, Aptamere oder sonstige spezifisch bindenden Substanzen mit und ohne Markierung), vorzugsweise ein Fängerantikörper (2), welcher Analyt 1 immobilisiert und dabei nicht die gleiche Bindungsdomäne wie Analyt 2 (Therapeutikum) und Konjugat (markiertes Therapeutikum) aufweist.
- Die zu untersuchende Probe (z. B. Patientenserum) mit unbekannter Menge an Analyt 1 (Target) und Analyt 2 (Therapeutikum); dabei ist Analyt 1 (3) ein Zielmolekül, z. B. ein Protein, ein Kohlenhydrat, Lipid, Nukleinsäure, Isoprenoid, Alkaloid, Polyketid etc., welches vom Fängermolekül (2) gebunden werden kann und Analyt 2 (4) eine Substanz, z. B. eine chemische Substanz, ein Wirkstoff, ein Peptid, Aptamer etc, die am Analyten 1 reversibel oder irreversibel bindet und die die Klasse der „Small Molecules“ umfasst, deren Molekülmasse vorzugsweise 800 µ·mol-1 nicht übersteigt und mit denen aufgrund der geringen Größe ein Sandwich zwischen zwei Antikörpern nicht möglich ist.
- Ein Konjugat (5) in bekannter Konzentration bestehend aus dem Analyt 2 oder eines ihm im Bindungsverhalten zum Analyt 1 ähnlichen Moleküls, das eine Markierung zum Nachweis trägt. Die Markierung kann eine radioaktiven Markierung, Fluoreszenz-, Lumineszenz Markierung, Enzym, welches ein Farbsubstrat umsetzt, oder ein spezifisches Tag sein, das von einem markierten Protein spezifisch gebunden wird. Das Konjugat bindet an der gleichen Bindungsdomäne am Analyten 1 wie der Analyt 2.
- eine Lösung des unmarkierten Analyten 2 (Therapeutikum) in bekannter Konzentration für die Standardisierung/Kalibrierung.
- eine Lösung des Analyten 1 in bekannter Konzentration - wobei es sich auch um ein rekombinant hergestelltes Analogon zum Analyten 1 handeln darf, das das gleiche Bindungsverhalten wie der Analyt 1 aufweist - für die Standardisierung/Kalibrierung und zum Aufstocken der Proben.

Nachfolgend wird das Verfahren zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung eines Analyten 1 (Target), eines gegen den Analyten 1 gerichteten Therapeutikums / Wirkstoffs (Analyt 2) näher erläutert (1). Beispielhaft wird dabei das Verfahren unter Verwendung einer Mikrotiterplatte beschrieben.
Die zu untersuchende Patientenprobe mit unbekannter Menge an Analyt 1 (Target) und Analyt 2 (Therapeutikum) wird in mehreren Aliquots in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgeteilt, wobei an der Festphase der einzelnen Vertiefungen (1) zuvor ein Fängermolekül, bevorzugt ein Fängerantikörper (2), immobilisiert wurde. Besagtes immobilisiertes Fängermolekül (2) bindet dabei den Analyten 1 (Target), der wiederum an einer anderen Bindungsdomäne Analyt 2 (4) (Therapeutikum) gebunden hat. Anschließend werden den Vertiefungen der Mikrotiterplatte jeweils eine gleiche Menge an Konjugat (markiertes Therapeutikum) mit bekannter Konzentration zugegeben und mit bekannten, ansteigenden Konzentrationen an Analyt 1aufgestockt. Die Aufstockung ist Assay-abhängig und richtet sich nach dem gewünschten Arbeitsbereich des Assays, d. h. nach der Bandbreite an Konzentrationen, die gemessen werden sollen. Die Aufstockung startet dabei aber stets mit einer Zugabe von 0 µg Analyt 1; in 1 ist dies als Aufstockung Stufe 0 bezeichnet. Die Signalstärke nimmt systematisch zu und erlaubt die mathematische Bestimmung der Ausgangskonzentrationen an freiem Analyt 1 (Target) und von an den Analyten 1 gebundenen Analyt 2 (Therapeutikum).
2 zeigt beispielhaft die Anordnung der Kalibrierkurven auf einer Mikrotiterplatte und die Aufstockung der unbekannten Patientenproben.
Dabei ist darauf zu achten, dass

- das Fängermolekül und demzufolge die verfügbaren Bindungsstellen an der festen Phase der Vertiefungen im Verhältnis zum Komplex aus Analyt 1 und Analyt 2 in der zu untersuchenden Patentienprobe sowie dem zugesetzten Analyt 1 mit bekannter Konzentration und dem zugesetzten Konjugat mit bekannter Konzentration im Unterschuss sind
- der Analyt 1 (3) auch nach dessen Aufstockung im Verhältnis zum Analyt 2 (4) und zum Konjugat (5) im Unterschuss ist, d. h. in der Praxis liegt Analyt 2 häufig im 500-1000fachen Überschuss vor und
- der Analyt 2 darf bei Anwesenheit in der Probe nicht durch das Konjugat von der Bindungsstelle am Analyten 1 verdrängt werden.

Das Bindungsverhalten von Fängermolekül, Analyt 1, Analyt 2 und Konjugat unterliegt systematischen Bindungsgesetzmäßigkeiten, die mathematisch durch Funktionen (Bindungsfunktionen) hinreichend genau beschrieben werden können und damit prognostizierbar sind und die Rückrechnung von empirisch vermessenen Proben und dadurch erhaltene Daten erlaubt. Das sind zum Beispiel nachfolgende Funktionen für die Bildung des Komplexes aus Analyt 1 und Analyt 2 bzw. Analyt 1 und dem Konjugat in Lösung sowie der Bindung des Analyten 1 bzw. des mit dem Analyten 1 gebildeten Komplexes an der festen Phase (immobiliserter Fängerantikörper).
Ausgangspunkt ist das Massenwirkungsgesetz mit Antikörperüberschuss in der Lösung und Produktüberschuss an der Festphase, was in der Regel zutrifft. Entsprechend diesem Ansatz ergeben sich folgende Formulierungen: $k_{1} = \frac{B_{1}}{q_{1} \cdot (p_{1} - B_{1})}$
Antikörperüberschuss in der Lösung bedeutet, dass die Ausgangskonzentration an Antikörper (q1) durch die Bindung an das Antigen p1 nur geringfügig (vernachlässigbar) reduziert wird. Für den in der Lösung gebildeten Komplex B1 aus Antikörper und Antigen ergibt sich aus der oben angeführten Formel: $\begin{matrix} ^{B_{1} = \frac{q_{1}}{\frac{1}{k_{1}} + q_{1}} \cdot p_{1}} = b \cdot p1 & b =^{\frac{q_{1}}{\frac{1}{k_{1}} + q_{1}} \cdot} \end{matrix}$
Bei konstanter Antikörperkonzentration ist der Komplex B1 linear korreliert mit der Antigenkonzentration. Eine Ausnahme ist gegeben, wenn der Antikörper nicht im Überschuss vorliegt, wie im vorliegenden Fall, dann gilt : $k_{1} = \frac{B_{1}}{(q - B_{1}) \cdot (p_{1} - B_{1})}$
$B 1 = 0,5 \cdot (m - \sqrt{m^{2}} - 4 \cdot q \cdot p_{1})$
$m = \frac{1}{k} + q + p_{1}$

: Kehrwert der Affinitätskonstante; q: Bindungskapazität des Antigens
p1:: Antigenkonzentration
m:: Abkürzung für den beschriebenen Term

Der Komplex aus Antikörper und Antigen bindet an die Festphase. Dafür gilt nachstehende Formel: $k_{2} = \frac{B_{2}}{(q_{2} - B_{2}) \cdot B_{1}}$
Wobei k₂ die Bindungskonstante des Antigens an den Fängerantikörper der Oberfläche, B₁ das in der Lösung gebildete Reaktionsprodukt (Komplex), q₂ die Bindungskapazität des Fängerantikörpers und B₂ der an der Oberfläche gebundene Komplex (Reaktionsprodukt) ist. Letztendlich ergibt sich daraus folgende Formel: $B_{2} = {\frac{q_{2} \cdot B_{1}}{\frac{1}{k_{2}} + B_{1}}}_{=} \frac{q_{2}_{\cdot} b \cdot p_{1}}{\frac{1}{k_{2}} + b \cdot p_{1}}$
Die Extinktion (E) ist linear und korreliert mit dem an der Oberfläche gebundenen Reaktionsprodukt. $E = f*B2$
wobei f die spezifische Extinktion des Konjugates ist.
Mit diesem Drug Primär Performance Monitoring Assay werden gleichzeitig die unbekannten Konzentrationen eines Analyten 1, eines gegen den Analyten 1 gerichteten Therapeutikums / Wirkstoffs (Analyt 2) und daraus berechnet, der Grad der Abbindung des Analyten 1 bestimmt. Dies erlaubt bei einer therapiebegleitenden Analyse die genaue Bestimmung der „Absättigung“ des Targets (Analyt 1) mit Wirkstoff (Analyt 2). Damit kann erreicht werden, dass der Patient genau so viel Wirkstoff einsetzt, wie für ihn notwendig ist, um seine Zielwerte zu erreichen und Nebenwirkungen ließen sich dadurch so gering wie möglich halten.
Der besondere Vorteil der Erfindung ist, dass das Prinzip auch zur Bestimmung von Wirkstoffen mit kleiner Molekülmasse von weniger als 800 µ·mol-1 geeignet ist, bei denen ein sogenannter Sandwich Immunoassay, d.h. die Bindung eines Analyten zwischen zwei Proteinen, etwa auf Grund der Molekülgröße nicht zuverlässig gelingt oder gar nicht möglich ist.
Figurenliste

1: Drug Primär Performance Monitoring Assay. Im Test wird die Probe bei konstanter Menge an Konjugat mit bekannten, ansteigenden Mengen an Analyt 1 aufgestockt. Die Signalintensität nimmt systematisch zu und erlaubt die Bestimmung der Ausgangskonzentrationen von freiem Target und nicht gebundenen Wirkstoff in der Ausgangsprobe
2: Darstellung der Anordnung der Kalibrierkurven auf einer Mikrotiterplatte und die Aufstockung der unbekannten Patientenproben

Bezugszeichenliste

(1): Well einer Mikrotiterplatte, bzw. Reaktionskavität, Vertiefung
(2): Fängerantikörper, Bindungsprotein an der festen Phase
(3): Analyt 1, Antigen
(4): Analyt 2, Wirkstoff gegen Analyt 1
(5): Konjugat

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 1957980 [0005, 0012]
WO 2012/059083 [0006, 0012]

Claims

Verfahren zur gleichzeitigen Konzentrationsbestimmung eines freien Analyten (Analyt 1) und eines gegen den Analyten gerichteten freien Wirkstoffs (Analyt 2) in Patientenproben wie Seren mittels eines immunologischen Nachweisverfahrens, mit folgenden Komponenten: - Die zu untersuchende Probe mit unbekannter Menge an Analyt 1 und Analyt 2, wobei Analyt 2 einen Wirkstoff darstellt, der reversibel oder irreversibel an Analyt 1 bindet, - ein an einer Festphase im Verlauf des Assays gebundenes direkt oder indirekt immobilisiertes Fängermolekül, das den Analyten 1 bindet, wobei die Bindungsdomäne zwischen Fängermolekül und Analyt 1 eine andere ist als die zwischen Analyt 1 und Analyt 2, - Ein Konjugat in bekannter Konzentration bestehend aus Analyt 2 oder eines ihm im Bindungsverhalten zum Analyt 1 ähnlichen Moleküls, das eine Markierung zum Nachweis trägt und an der gleichen Bindungsdomäne am Analyten 1 wie der Analyt 2 bindet, den Analyt 2 aber nicht von der Bindungsstelle am Analyt 1 verdrängt - für die Standardisierung/Kalibrierung eine Lösung des unmarkierten Analyten 2 in bekannter Konzentration und - für die Standardisierung/Kalibrierung und zum Aufstocken der Proben eine Lösung von Analyt 1 oder eines rekombinant hergestellten Analogon zum Analyten 1, dass das gleiche Bindungsverhalten wie Analyt 1 aufweist, in bekannter Konzentration dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Patientenprobe in mindestens 2 Aliquots bevorzugt 4 Aliquots aufgeteilt wird, jeder der Aliquots mit an der Festphase immobilisierten Fängermolekül in Kontakt gebracht wird, ungebundenes Material entfernt wird, anschließend die mindestens 2, bevorzugt 4 Ansätze jeweils mit einer gleichen Konzentration von Konjugat und dem Analyt 1 in bekannter Konzentration in einer ansteigenden Konzentration beginnend bei 0 versetzt werden und im Anschluss die zunehmende Signalstärke gemessen wird, die eine mathematische Bestimmung der Ausgangskonzentrationen an freiem Analyt 1 und von an den Analyten 1 bindungsfähigen Analyt 2 ermöglicht und mit der ein Prozentwert zwischen 0 und 100 bestimmt wird, mit dem eine zusätzliche Einheit des Analyten 1 durch den in der Probe vorhandenen freien Analyt 2 gebunden wird
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass Analyt 2 ein Wirkstoff ist, der die Klasse der „Small Molecules“ umfasst, deren Molekülmasse vorzugsweise 800 µ·mol^-1 nicht übersteigt und mit denen ein Sandwich-ELISA nicht möglich ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass Analyt 1 ein Protein, ein Kohlenhydrat, Lipid, Nukleinsäure, Isoprenoid, Alkaloid, Polyketid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung des Konjugats eine radioaktiven Markierung, eine Fluoreszenz-, eine Lumineszenz-Markierung, ein Enzym, welches ein Farbsubstrat umsetzt, oder ein spezifisches Tag ist, das von einem markierten Protein spezifisch gebunden, wobei die Markierung des Konjugat vorzugsweise Poly-POD ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass als Fängermoleküle Antikörper, Peptide, Aptamere oder sonstige spezifisch bindende Substanzen mit und ohne Markierung, vorzugsweise ein Fängerantikörper eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass als Festphase eine Mikrotiterplatte, ein Chip, Membranen oder Beads verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass das an der Festphase immobilisierte Fängermolekül im Verhältnis zum Komplex aus Analyt 1 und Analyt 2 in der zu untersuchenden Patentienprobe sowie dem zugesetzten Analyt 1 mit bekannter Konzentration und dem zugesetzten Konjugat mit bekannter Konzentration im Unterschuss ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass Analyt 1 auch nach dessen Aufstockung im Verhältnis zum Analyt 2 und zum Konjugat im Unterschuss ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass das zugesetzte Konjugat derart gestaltet ist, dass es Analyt 2 nicht von seiner Bindungsstelle am Analyten 1 verdrängt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Probe Serum, Blut, Blut mit Zusätzen, wie beispielsweise Heparin, abgereichertes Blut, Lysate, Kulturmedien oder sonstige Lösung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Probe unverdünnt oder niedrig verdünnt eingesetzt wird und gleichzeitig in einem Assay vorzugsweise einer Mikrotiterplatte Proben mit unterschiedlicher Verdünnung bestimmt werden.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-10 zur Bestimmung der primären und sekundären Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen Analyt 1 und dem dagegen wirkenden Analyt 2.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-10 zur Bestimmung der primären und sekundären Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen MAO-B (Analyt 1) und dem Wirkstoff Rasagilin (Analyt 2)