JP2001501465A

JP2001501465A - 先天性心臓疾患タンパク質をコードする核酸およびそれに関連する産物確認（Ａｃｋｎｏｗｌｅｄｇｍｅｎｔ）

Info

Publication number: JP2001501465A
Application number: JP10514740A
Authority: JP
Inventors: コレンバーグ，ジュリー，アール．
Original assignee: セダース―シナイメディカルセンター
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2001-02-06
Also published as: EP0963436A1; WO1998012323A1; US6040429A; US5945305A

Abstract

(57)【要約】本発明によれば、新規の先天性心臓疾患（ＣＨＤ）タンパク質が提供される。かかるタンパク質をコードする核酸配列およびそれを用いるアッセイも開示される。本発明のＣＨＤタンパク質は、種々の面で、例えば、それに対する抗ＣＨＤ抗体の産生、治療用組成物、かかるタンパク質および／または抗体を用いる方法において使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】先天性心臓疾患タンパク質をコードする核酸およびそれに関連する産物確認(Acknowledgment) 本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金No.HL50025およびHD17449に基づく政府の援助によってなされたものである。政府は、本発明に一定の権利を有する。発明の分野本発明は、核酸および該核酸にコードされる受容体タンパク質に関する。本発明の核酸は、新規の先天性心臓疾患関連タンパク質をコードする。さらに、本発明はそのような核酸およびタンパク質を製造し、使用するための方法に関する。発明の背景通常、第21番染色体三染色体性によって引き起こされるダウン症候群（ＤＳ）は、合衆国単独で200,000人以上が罹患している精神遅滞ならびに先天性心臓疾患（ＣＨＤ）および腸疾患の主な原因である。ＤＳ−ＣＨＤに特徴的な心臓の異常としては、房室管欠損および心室中隔欠損が挙げられる。ＤＳのその他の特徴としては、一連の特徴的な顔貌、胸腺異常、白血病の高い危険度およびアルツハイマー様痴呆の早期発病が挙げられる。ＤＳならびに部分的な第21番染色体重複および一染色体性を有する希少患者の分子分析によって、一定の染色体領域と特定のＤＳ表現型が関連していることが導き出された（Korenbergら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA M91:4997-5001(1994);Delebarら，Eur．J．Human．Genet．1: 114-124(1993);Antonarakisら，Progress in Clinical and Biological Reserch 311:29-43(1989)）。したがって、第21番染色体はヒト染色体異数性の研究についてのモデルであり、その物理的地図の構築は特に関心の的である。ヒト第21番染色体は、その長さの大部分に及ぶ、十分に特性付けされたオーバーラップＹＡＣの連続するセットを有するほぼ完全な物理的地図を有する（Chum akovら，Nature 359:380-387(1992);Shimizuら，Cytogenet．Cell Genet．70:14 7-182(1995);Korenbergら，Genome Research 5:427-443(1995)）。遺伝子単離作業のための配列準備コンティグ(sequence ready contigs)およびクローンに対する要求によってコスミド内（Patilら，Hum．Molec．Genet．3:1811-1817(199 5)）およびより最近ではＰＡＣ内（Osoegawaら，Genomics 32:375-387(1996)）において多数の高度に解明されたコンティグの構築が促された。かなりのマッピング作業は、ＣＢＲからＤ２１Ｓ５５までの領域に存在する。というのは、精神遅滞などのＤＳのいくつかの表現型的特徴を有する部分的三染色体性個体においてはこの領域が重複しているからである。しかしながら、速位の隣接する４−５ＭｂＤ２１Ｓ５５〜ＭＸ１領域も、ダウン症候群先天性心臓疾患（ＤＳ−ＣＨＤ）およびＤＳのその他の特徴と関連しているので関心の的である（Korenberg ら，Am．J．Hum．Genet．50:294-302(1992);Korenbergら(1994)）。非キメラＹＡＣはこの区間にまたがるが、全Ｄ２１Ｓ５５〜ＭＸ１領域について利用可能なより高度に解明された物理的地図は未だ存在しない。したがって、全Ｄ２１Ｓ５５〜ＭＸ１領域についてより高度に解明された物理的地図が望まれている。さらに、当技術分野では先天性心臓疾患（ＣＨＤ）と関連する単離された核酸および該核酸によってコードされる単離されたタンパク質が必要とされている。発明の簡単な説明本発明によれば、哺乳動物ＣＨＤ（先天性心臓疾患）タンパク質をコードする単離された核酸が提供される。さらに、本発明の核酸を含むベクター、該ベクターにハイブリダイズするプローブ、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該ベクターに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび関連組成物が提供される。本明細書に記載された核酸分子は、当業者に公知の種々の発現系に組み込むことができる。さらに、本発明の核酸分子は、所与の試料中のＣＨＤ遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の存在および／または量をアッセイするためのプローブとして有用である。また、本明細書に記載された核酸分子および該分子のオリゴヌクレオチド断片もＣＨＤタンパク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマーおよび／または鋳型として有用である。また、本発明によれば、単離された哺乳動物ＣＨＤタンパク質も提供される。さらに、これらのタンパク質またはその断片は、抗ＣＨＤ抗体を産生させるための免疫原としてバイオアッセイにおいて、またはそのようなタンパク質および／または抗体を含む治療用組成物において有用である。さらに、本発明のタンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供される。本発明のＣＨＤタンパク質と免疫反応性のある抗体も提供される。これらの抗体は、所与の試料、例えば組織試料に存在するＣＨＤタンパク質のレベルを決定するための診断アッセイ、ウェスタンブロットなどにおいて有用である。また、抗体を用いることによって粗細胞抽出物などからＣＨＤタンパク質を精製することもできる。さらに、これらの抗体は、in vivoでのＣＨＤの生物学的作用の抑制または補助に対して治療上有用であると考えられる。種々の組織試料中のＣＨＤタンパク質のレベルを測定するための方法および診断システムも提供される。これらの診断方法を治療上投与されたＣＨＤタンパク質またはその断片のレベルの監視に使用することによって、その治療上有効な量の維持を容易にすることができる。また、これらの診断方法を使用することによって、異常レベルのＣＨＤタンパク質から生じる生理学的障害を診断することもできる。図面の簡単な説明図１は、第21番染色体上のD21S3とD21S220との間の190kbの領域に対応するＣＨＤ遺伝子の位置決定(localization)について物理的地図を示すものである。ＹＡＣ 767B3および14A12を参考のために示す。発明の詳細な説明本発明によれば、新規の哺乳動物ＣＨＤ（先天性心臓疾患）タンパク質をコードする単離された核酸、およびその断片が提供される。かかる核酸は、ヒト第21 番染色体、特にq22.2〜22.3遺伝子座（これはダウン症候群先天性心臓疾患（ＤＳ−ＣＨＤ）を引き起こす染色体重複部位である）から取得することができる。本明細書で用いられる場合、ＣＨＤタンパク質は、配列番号２に示した配列を含む哺乳動物ＣＨＤタンパク質（好ましくはヒト）も特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドをコードするものである。本明細書に記載された核酸分子は、かかる核酸が当業者に公知の種々のタンパク質発現系に組み込まれた場合、本発明のタンパク質を産生するのに有用である。さらに、かかる核酸分子またはその断片は、容易に検出できる置換基で標識することができ、所与の試料中のＣＨＤ遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の存在および／または量をアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。また、本明細書に記載された核酸分子およびその断片は、本明細書に記載された本発明のタンパク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマーおよび／または鋳型としても有用である。「核酸」（ポリヌクレオチドともいう）という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーを包含するものである。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡ、例えばＣＨＤタンパク質をコードする遺伝子、のいずれかであり得る。ＣＨＤポリペプチドをコードする核酸を単離する一つの手段は、当技術分野で周知の方法を用いて、天然または人為的に設計したＤＮＡプローブにより哺乳動物ゲノムライブラリーを調べることである。ＣＨＤ遺伝子から誘導されたＤＮＡプローブはこの目的に特に有用である。ＣＨＤポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を用いることによって哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタなど）またはその他の動物起源から相補的ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを取得することができ、あるいは以下により詳細に記載した方法によってｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって関連ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離することができる。核酸としては、例えば、ＣＨＤポリペプチドをコードするＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離されたゲノムＤＮＡが挙げられる。かかる核酸としては、限定するものではないが、配列番号１、配列番号７、配列番号８、または配列番号１の少なくともヌクレオチド39〜902に示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を有する核酸が挙げられ得る。本明細書および請求の範囲における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾語としての「単離された」および／または「精製された」という用語の使用は、そのように指定されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が人間の手によってそのような状態で産生されており、したがって、それらの天然のin vivo細胞環境から分離されているということを意味するものである。この人間の介入の結果、本明細書に記載された点で、天然に産生されるようなＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質ではない本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタンパク質は有用である。本明細書で用いられる場合、「哺乳動物」は、本発明のＣＨＤタンパク質が誘導される様々な種、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、サル、ヒヒ、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなどを意味するものである。本発明において好ましいＣＨＤタンパク質は、ヒトＣＨＤである。本発明の一つの実施態様においては、本明細書に開示された本発明のＣＨＤタンパク質をコードするｃＤＮＡは、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。本発明のタンパク質をコードする好ましいｃＤＮＡ分子は、配列番号１のヌクレオチド39〜902と同一のヌクレオチド配列を含む。本明細書で用いられる場合、「実質的に同一のヌクレオチド配列」という用語は、中度にストリンジェントな(moderately stringent)ハイブリダイゼーション条件下で参照ヌクレオチドとハイブリダイズするような参照ポリヌクレオチドに対して十分な同一性を有するＤＮＡを意味するものである。一つの実施態様においては、参照ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、配列番号２に示したアミノ酸配列、もしくは配列番号２を含むより大きなアミノ酸配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。別の実施態様においては、参照ヌクレオチド配列と「実質的に同一のヌクレオチド配列」を有するＤＮＡは、その参照ヌクレオチド配列と少なくとも60％の同一性を有する。参照ヌクレオチド配列と少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％の同一性を有するＤＮＡが好ましい。また、本発明は、配列番号１、配列番号７および配列番号８に示された核酸とは異なるが、同一の表現型を有する核酸も包含する。また、表現型が類似した核酸は、「機能的に等価な核酸」ともいう。本明細書で用いられる場合、「機能的に等価な核酸」という語句は、実質的に同一の様式で機能することによって本明細書に開示された核酸と同一のタンパク質産物を産生するであろう、軽微な、重要でない配列変化によって特徴付けられる核酸を包含する。特に、機能的に等価な核酸は、本明細書で開示されたものと同一であるか、または保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードし、または配列番号２、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分を含むより大きなポリペプチドをコードする。例えば、保存的変化としては、非極性残基の別の非極性残基による置換、または荷電した残基の同様に荷電した残基による置換が挙げられる。これらの変化は、タンパク質の三次構造を実質的に変更しないものと当業者が認識するものを含む。さらに、遺伝コードの縮重のために特定のハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸と必ずしもハイブリダイズしないＣＨＤポリペプチドをコードする核酸が提供される。本発明のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、配列番号２に示されたアミノ酸配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドから構成される。したがって、本発明のＣＨＤタンパク質をコードする具体的な核酸は：（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分をコードするＤＮＡ、（ｂ）中度にストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであって、生物学的に活性なＣＨＤをコードするもの、または（ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）のいずれかについて縮重したＤＮＡであって、生物学的に活性なＣＨＤをコードするものから選択され得る。ハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡ中に天然に生ずる結合と同様の、水素結合による核酸の相補鎖同士の結合（すなわち、センス：アンチセンス鎖またはプローブ：標的ＤＮＡ）を意味するものである。当業者は、所与のプローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるのに用いられるストリンジェントレベルを容易に変更することができる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、本明細書で用いられる場合、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味するものである。当業者には公知のように、ハイブリッドの安定性は該ハイブリッドの融点（Ｔ_m ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温度との関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、低度にストリンジェントな条件下で行われ、次いで様々な、より高度にストリンジェントな条件下で洗浄する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとの関係はそのような洗浄条件に関係する。本明細書で用いられる場合、「中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、標的ＤＮＡに、その標的ＤＮＡに対して約60％の同一性、好ましくは約75％の同一性、より好ましくは約85％の同一性を有する相補的核酸を結合させる条件を意味するものであり、標的ＤＮＡに対して約90％以上の同一性を有するものが特に好ましい。好ましくは、中度にストリンジェントな条件は、50％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、42 ℃でのハイブリダイゼーション、その後の0.2×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、65℃ での洗浄と等価な条件である。「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、0.018 Ｍ NaCl中、65℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみをハイブリダイズさせる条件を意味するものである（すなわち、本明細書では、ハイブリッドが 0.018Ｍ NaCl中、65℃で安定でない場合、ハイブリッドは高度にストリンジェントな条件下で安定ではない）。高度にストリンジェントな条件は、例えば、50％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、42℃でのハイブリダイゼーション、その後の0.1×ＳＳＰＥ、および0.1％ＳＤＳ中、65℃ での洗浄によって得られ得る。「低度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、10％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、42℃でのハイブリダイゼーション、その後の１×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、50℃での洗浄と等価な条件を意味するものである。デンハルト溶液およびＳＳＰＥ（例えば、 Sambrookら，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor L aboratory Press，1989を参照されたい）は、その他の適当なハイブリダイゼーションの緩衝液であるので、当業者には周知である。本明細書で用いられる場合、「縮重」という用語は、参照核酸、例えば、配列番号１、配列番号７または配列番号８と少なくとも１つのヌクレオチドが異なるが、該参照核酸と同じアミノ酸をコードするコドンを意味するものである。例えば、トリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」で示されるコドンは、これらの４つのコドンはすべてアミノ酸のセリンをコードするので、互いに縮重である。本発明のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、中度にストリンジェントな条件、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示された核酸配列の実質的に全ての配列または実質的な部分（すなわち、典型的には少なくとも15〜30ヌクレオチド）にハイブリダイズする。本発明の核酸は、当技術分野で周知の種々の方法、例えば、本明細書に記載された方法によって、配列番号１、配列番号７または配列番号８の種々の領域由来のオリゴヌクレオチドプライマーなどを用いるＰＣＲ増幅を使用する等して、産生することができる。本発明のさらなる実施態様によれば、任意に標識したＣＨＤ−コードｃＤＮＡまたはその断片を用いることによって、新規哺乳動物ＣＨＤタンパク質をコードするさらなる核酸についてライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムなど）を調査することができる。実施例３に記載したように、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリー、好ましくはヒト第21番三染色体性胎児脳ｃＤＮＡライブラリーの構築は当技術分野においては周知である。そのようなｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、最初、低度にストリンジェントな条件下（約42℃未満の温度、約50％未満のホルムアミド濃度、および中〜低塩濃度からなる）で行われる。現在のところ、好ましいプローブに基づくスクリーニング条件は、約37℃の温度、約20％のホルムアミド濃度、および約５×標準生理的食塩水クエン酸塩（st andard saline citrate、ＳＳＣ；３Ｍの塩化ナトリウム、0.3Ｍのクエン酸ナトリウムを含む20×ＳＳＣ、pH7.0）の塩濃度からなる。このような条件によって、完全な相同性を要求することなくプローブ配列と実質的な程度の類似性を有する配列の同定が可能になるであろう。「実質的類似性」という語句は、少なくとも50％相同性を共有する配列を意味するものである。好ましくは、プローブと少なくとも70％相同性を有する配列を同定することが可能である一方、該プローブとの相同性の程度がより低い配列と区別して扱うことが可能なハイブリダイゼーション条件が選択される。その結果、配列番号１のヌクレオチド39〜902と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する核酸が得られる。本明細書で用いられる場合、核酸「プローブ」は、配列番号１、配列番号７または配列番号８のいずれかに示した14個以上の連続塩基と同一である（あるいは相補的である）少なくとも14、好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも50個の連続塩基を含むヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその類似体である。プローブを構築するのに好ましい領域は、配列番号１、配列番号７または配列番号８の5'および／または3'コード領域を含む。さらに、本発明のＣＨＤタンパク質の全ｃＤＮＡコード領域、または配列番号１、配列番号７または配列番号８に対応する全配列をプローブとして使用し得る。プローブは、以下に記載されていうように、当技術分野で公知の方法によって標識され得るものであり、種々の診断キットにおいて用いられ得る。本明細書で用いられる場合、その種々の文法的語形における「標識」および「表示手段」という用語は、検出可能なシグナルの産生に直接的または間接的に関与する単独の原子および分子を意味するものである。標識または表示手段は、本発明の核酸プローブ、発現されたタンパク質、ポリペプチド断片、または抗体分子に連結することができる。これらの原子または分子は、単独で、またはさらなる試薬と組み合わせて用いることができる。そのような標識は、それ自体、臨床診断化学において周知である。標識手段は、変性することなく抗体または抗原に化学的に結合して有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であり得る。免疫蛍光分析法の説明は、DeLuca，"Immunofluoresce nceAnalysis"，in Antibody A s a Tool，編集Marchalonisら，John Wiley & Sons，Ltd.，pp.189-231(1982)に記載されており、これは参照により本明細書に含まれるものである。一つの実施態様においては、表示基は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどの酵素である。別の実施態様においては、放射性エレメントが標識剤に用いられる。基質への標識の連結、すなわち核酸、プローブ、抗体、ポリペプチド、およびタンパク質の標識法は、当技術分野において周知である。例えば、本発明の抗体は、培養培地中で得られる放射性標識アミノ酸の代謝組込みによって標識することができる。例えば、Galfreら，Meth．Enzy mol.，73:3-46(1981)を参照されたい。活性化官能基によるタンパク質結合またはカップリングの通常の方法が特に適用可能である。例えば、Aurameasら，Sc and．J．Immunol.，Vol．8，Suppl．7:7-23(1978)，Rodwellら，Biotech.，3:88 9-894(1984)および米国特許第4,493,795号を参照されたい。本発明の別の実施態様によれば、本発明の核酸によってコードされる単離された哺乳動物ＣＨＤタンパク質（好ましくはヒト）、ポリペプチドおよびその断片が提供される。「ＣＨＤ」という用語は、実質的に純粋な天然ＣＨＤタンパク質、または一次転写物の選択的スプライシングによって生じたｍＲＮＡによってコードされるそれらの天然の対立遺伝子変異体など、さらに免疫原生のような少なくとも１種の固有の生物学的活性を維持するそれらの断片などの組換え的に産生されたタンパク質を意味するものである。好ましくは、本明細書において、ＣＨＤタンパク質は、配列番号２に示された配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分を含むＣＨＤタンパク質（好ましくはヒト）も特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるそれらのポリペプチドである。本発明の単離されたＣＨＤタンパク質は、通常、天然のin vivo環境に伴う細胞成分および／または汚染物質を含まない。本発明のタンパク質は、さらに、主として成人心臓において発現し、骨格筋において低レベルの偏在発現(ubiquitous expression)であることによって特徴付けられる（実施例４に記載）。骨格筋細胞と比べて示差的に高レベルのＣＨＤ発現が成人心臓細胞において観察される。心臓組織における主な転写物は2.4kbの大きさであり、一方、筋肉における主な転写物は1.2kbである（ノーザンブロットアッセイにより観察した）。また、心臓組織は約1.2kbのマイナー転写物も有しており、骨格筋は2.6kbのマイナー転写物を有している。したがって、ＣＨＤファミリーのタンパク質をコードするスプライス変異体ｃＤＮＡ転写物は、明らかに本発明により予想されるものである。本明細書で用いられる場合、「示差的に発現した」という語句は、本発明のタンパク質をコードする天然ＲＮＡが骨格筋組織に比べて成人心臓において実質的に高レベルで検出され得ることを意味するものである。ＣＨＤは、欠損しているかまたは重複として存在する場合、ダウン症候群先天性心臓疾患の原因となる遺伝子と予想される。ＣＨＤの追加的な役割を、さらに、 BLAST X/NおよびTIGRデータベース分析を用いてデータベース相同性検索によって評価した。これらの検索の結果から、ＣＨＤは、骨髄分化一次応答遺伝子に対して中度の相同性を示し、胚分化における役割の可能性を示唆する転写因子に対する低レベルの相同性を示すということがわかる。さらに、ＣＨＤはラットポリマー免疫グロブリン受容体、ミオシンＨ鎖平滑筋イソ型、およびアミノレブリン酸シンターゼといくらかの相同性を共有する。本明細書に記載されているように、第21番染色体上の公知のＤＳ−ＣＨＤ領域に対するＣＨＤの位置、心臓および骨格筋における発現パターン、発達の53日目および55日目における転写物の存在、および配列相同性は、心臓の発達において先天性心臓疾患の原因としてＣＨＤタンパク質に影響を与えるものである。現在のところ本発明の好ましいＣＨＤタンパク質は、配列番号２に示されたタンパク質配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分と実質的に同一であるアミノ酸配列ならびにそれらの生物学的に活性な修飾体を含む。当業者は、上記の配列の多数の残基をその他の化学的、立体的および／または電子的に類似した残基で得られる受容体種の生物学的活性を実質的に変更することなく置換することができるということを認識するであろう。さらに、配列番号２、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分と実質的に同一の配列を含むより大きなポリペプチド配列（例えば、スプライス変異体および融合タンパク質）もそれに含まれる。本明細書で用いられる場合、「実質的に同一のアミノ酸配列」という用語は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約70％の同一性を有し、参照アミノ酸配列によって定義されるタンパク質に特徴的な同等の機能および生物学的活性を維持するアミノ酸配列を意味するものである。好ましくは、「実質的に同一のアミノ酸配列」を有するタンパク質は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約80％、より好ましくは90％のアミノ酸同一性を有し、約95％以上のアミノ酸配列同一性を有することが特に好ましい。しかしながら、スプライス変異体として生じる記載されたレベルよりも低い配列同一性を含むか、保存的アミノ酸置換もしくは縮重コドンの置換によって修飾されたポリペプチド（または上記では核酸）も本発明の範囲に含まれるものである。「生物学的に活性な」または「機能的な」という用語が、本明細書で本発明のＣＨＤタンパク質またはそのポリペプチド断片の修飾語として用いられる場合、ＣＨＤと同様の機能的特性を示すポリペプチドを意味するものである。例えば、ＣＨＤの一つの生物学的活性は、ＣＨＤに特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生のための免疫原として作用する能力である。したがって、本発明のＣＨＤをコードする核酸は、配列番号２に示された配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分を含むＣＨＤタンパク質（好ましくはヒト）も特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドをコードする。そのような活性は、当業者に公知のあらゆる方法によってアッセイされ得る。例えば、ＣＨＤｃＤＮＡによってコードされる試験ポリペプチドを用いることによって、抗体を産生させることができ、次いで、それらの抗体が、配列番号２に示された配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分を含むタンパク質と結合する能力についてアッセイする。抗体が、試験ポリペプチドおよび配列番号２に示された配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分を含むタンパク質と実質的に同一の親和性で結合する場合、そのポリペプチドは必須の生物学的活性を保有するものである。本発明のＣＨＤタンパク質は、当技術分野で周知の種々の方法、例えば、実施例３に記載された方法、本明細書に記載された組換え発現系、沈降、ゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニティクロマトグラフィーなどによって単離することができる。その他の周知の方法は、Deutscherら，Guide to Protein Purifi cation:Methods in Enzymology Vol．182，(Academic Press，(1990))に記載されており、これは参照により本明細書に含まれるものである。また、本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、Sambrookら（上記のとおり、1989）に記載されたような周知の組換え法を用いることにより取得することができる。本発明のポリペプチドを調製するための手段としては、例えば、当技術分野で周知の方法を用いて細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（すなわち、卵母細胞）、または哺乳動物細胞のような適当な宿主細胞中でＣＨＤをコードする核酸を発現させて、再度周知の方法を用いて発現されたポリペプチドを回収することが挙げられる。本発明のポリペプチドは、下記のような発現ベクターで形質転換された細胞から直接単離することができる。本発明のポリペプチド、生物学的に活性な断片、およびその機能的等価物も化学合成によって製造することができる。例えば、合成ポリペプチドは、Applied Biosystems社のモデル430Aまたは431A自動ペプチド合成装置（Foster City、カリフォルニア州）を用いて、製造業者から提供された化学現象を使用することにより製造することができる。本発明はまた、許容しうる担体と、単離精製CHDポリペプチド、その活性断片、または精製成熟タンパク質およびその活性断片のいずれかを単独で、あるいは互いに組み合わせて含有する組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換えによっても誘導可能であるし、化学的に合成することも可能であるし、あるいは天然の供給源から精製することもできる。本明細書で用いられる場合、「許容しうる担体」とは、リン酸緩衝食塩水、水および油／水、または水／油エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに種々のタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれをも包含する。また、CHDポリペプチドをコードするｍＲＮＡのいずれかの部分と特異的に結合して、ｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、CHDポリペプチドをコードするｃＤＮＡの配列のいずれかの部分と特異的に結合できる配列を有していてもよい。本明細書で用いる場合、「特異的に結合する」とは、核酸配列が相補的核酸配列を認識して、その相補的塩基対間の水素結合の形成を介して、それとともに二重らせんセグメントを形成する能力を包含する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、ヌクレオチドの化学的類似体を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。本明細書ではまた、細胞膜を通過し、次いで、CHDポリペプチドをコードするｍＲＮＡと特異的に結合して、翻訳を妨げることにより、CHDポリペプチドの発現を低下させるのに有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過することができる、許容しうる疎水性担体とを含んでなる組成物も提供される。適切な疎水性担体は、例えば、米国特許第5,334,761号；第4,889,953号；第4,897,355号などに記載されている。細胞膜を通過できる許容しうる疎水性担体は、また、選択された細胞種に特異的な受容体と結合し、それにより選択された細胞種の細胞により取り込まれる構造を含んでいてもよい。この構造は、細胞種特異的受容体に結合することが知られているタンパク質の一部であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有用である。合成オリゴヌクレオチド、または他のアンチセンス化学構造は、CHDポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計され、組織サンプルにおいて、または患者においてCHDに関与する遺伝子の発現を阻害する組成物として有用である。本発明のもう１つの具体例によれば、第21染色体の遺伝子座q22.2-22.3における突然変異、重複、欠失、再配列および異数性を検出するキットは、本発明のプローブまたはアンチセンスヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる。本発明は、これらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物（以下、SAOC）を使用することにより、 CHDポリペプチドの発現レベルを調節する手段を提供する。ｍＲＮＡを認識して選択的に結合するよう設計された合成オリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス化学構造は、配列番号1、配列番号7または配列番号8で示されているCHDコーディング鎖またはヌクレオチド配列の一部に相補するように構築される。SAOCは、注射による患者への投与のために血流中で安定なように、あるいは実験室での細胞培養条件下で安定なように設計される。SAOCは、例えば小さな疎水性SAOC化学構造を設計することによって、細胞膜を通過できるようにするSAOCの物理的、化学的特性に基づき、あるいはSAOCを認識して細胞内に輸送する細胞の特異的輸送系に基づき、細胞の原形質に入るために、細胞膜を通過できるように設計される。さらに、SAOCは、選択細胞集団内だけにSAOCを結合させ、取り込ませる特異的な細胞取り込みのメカニズムによって認識されるようにSAOCを標的化することにより、特定の選択細胞集団のみに投与するように設計することも可能である。例えば、前記のように、特定の細胞種にのみ見られる受容体と結合するよう、 SAOCを設計してもよい。また、SAOCは、配列番号1、配列番号7または配列番号8 に示されている配列内に含まれる配列に相当し得る、標的ｍＲＮＡ配列を認識して選択的に結合するよう設計される。SAOCは、標的ｍＲＮＡ配列と結合して、例えば、リボヌクレアーゼI分解によるｍＲＮＡの分解を誘導するか、あるいは、翻訳調節因子、またはリボソームの結合を妨げたり、リボザイム配列、あるいは標的ｍＲＮＡを分解するか、または化学的に修飾する反応性化学基などの他の化学構造を包含させたりすることによって標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を阻害するかのいずれかの方法により、標的ｍＲＮＡ配列を不活性化するよう設計される。SAOC は、ｍＲＮＡ標的に向けられる場合、かかる特性を持ち得ることが示されている（Cohenら、TIPS，10:435(1989)およびWeintraub，Sci．American，January(199 0)，40頁を参照;双方とも出典明示して本明細書の一部とみなす）。本発明のさらにもう１つの具体例によれば、適切な宿主細胞中で前記核酸配列を発現させることによる、本発明のCHDタンパク質の組換え体の生産方法が提供される。本明細書に記載のCHDタンパク質を生産するのに適した組換えＤＮＡ発現系は、当該技術分野で十分に公知である。例えば、前記ヌクレオチド配列を、さらなる操作のためにベクターに組み込むことができる。本明細書で用いる場合、ベクター（またはプラスミド）とは、それらの発現または複製のいずれかのため、異種ＤＮＡを細胞に導入するために用いる別個のエレメントをいう。適切な発現ベクターは当該技術分野で十分に公知であり、ＤＮＡの発現を調節することができるプロモーター領域などの調節配列に作動可能なように連結されたかかるＤＮＡを発現できるベクターを含む。このように、発現ベクターとは、適当な宿主細胞に導入した際に挿入したＤＮＡが発現するようになる、プラスミド、ァアージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築体をいう。適当な発現ベクターは当業者には十分に公知であり、真核細胞および／または原核細胞内で複製可能なもの、およびエピソームであるもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを含む。本明細書で用いる場合、プロモーター領域とは、それが作動可能なように連結されているＤＮＡの転写を制御するＤＮＡセグメントをいう。このプロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写の開始に十分な特異的配列が含まれる。さらに、プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始活性を調節する配列が含まれる。これらの配列はシス作用性であってもよいし、またトランス作用性因子に応答するものであってもよい。プロモーターは調節の性質により、構成的であっても調節的であってもい。本発明の実施で使用されるプロモーターの例としては、SV40初期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)ステロイド誘導性プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルス(MMLV)プロモーターなどが挙げられる。本発明で用いる場合、「作動可能なように連結される」とは、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列など、調節およびエフェクターヌクレオチド配列とＤＮＡとの機能的な関係をいう。例えば、プロモーターへのＤＮＡの作動的連結とは、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的かつ機能的関係であって、かかるＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーターから開始されるものをいう。本明細書で用いる場合、発現とは、ポリ核酸がｍＲＮＡへと転写され、次いでペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳されるプロセスをいう。ポリ核酸ゲノムがＤＮＡに由来する場合、適当な真核宿主細胞または生物を選択すれば、発現はｍＲＮＡのスプライシングを含む。原核細胞形質転換ベクターは当該技術分野で十分に公知であり、pBlueskript およびファージλZAPベクター(Stratagene，La Jolla，CA)などを含む。他の適切なベクターおよびプロモーターは、1989年1月17日公表の米国特許第4,798,885 号に詳細に記載され、この開示は出典明示してそのまま本発明の一部とみなす。大腸菌細胞の形質転換のための他の適切なベクターとしては、pET発現ベクター（Novagen、米国特許第4,952,496号参照のこと）、例えば、T7プロモーター、 T7ターミネーター、誘導性大腸菌lacオペレーターおよびlacレプレッサー遺伝子を含むpET11a；およびT7プロモーター、T7ターミネーターおよび大腸菌ompT分泌シグナルを含むpET12a-cが挙げられる。もう１つの適切なベクターとしては、lp pプロモーター、lacUV5プロモーターオペレーター、ompA分泌シグナルおよびlac レプレッサー遺伝子を含むpIN-IIIompA2(Duffaudら，Meth ．In Enzymology，153 :492-507，1987を参照のこと)がある。典型的な真核細胞形質転換ベクターには、クローン化ウシパピローマウイルスゲノム、マウスレトロウイルスのクローン化ゲノム、pSV-2 gpt系[MulliganおよびBerg，Nature第277巻:108-114(1979)に記載]およびOkayama-Bergクローニング系[Mol．Cell Biol．第２巻:161−170(1982)]などの真核細胞カセット、ならびにGenetics Instituteにより記載された発現クローニングベクター[Science第22 8 巻:810-815(1985)]が含まれ、形質転換された真核細胞系において目的のタンパク質が少なくともある程度発現するという実質的な保証のあるものが入手可能である。本発明のCHDをコードする、哺乳類細胞のトランスフェクションのためのＤＮＡと連結できる調節要素を含む特に好ましい基本ベクターは、、pcＤＮＡl(Invi trogen，San Diego，CA)のようなサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを基本とするベクター、pMAMNeo(Clontech，Palo Alto，CA)およびpMSG(Pharmacia， Piscataway，NJ)のようなMMTVプロモーターを基本とするベクター、ならびにpSV β(Clontech，Palo Alto，CA)のようなSV40プロモーターを基本とするベクターである。本発明のもう１つの具体例によれば、本発明の核酸分子（すなわち、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む「組換え細胞」が提供される。適切な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、さらに好ましくは大腸菌細胞の形質転換法、ならびに異種タンパク質をコードする遺伝子を含む当該細胞の培養に適切な方法は、当該技術分野において一般に知られている。例えば、Sambrookら，Molecular Cloning：A Laborat ory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har bor，New York，USA(1989)を参照のこと。典型的な形質転換法には、例えば、プラスミド、ウイルスまたはバクテリオファージベクターを使用する形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどが含まれる。異種ＤＮＡは場合により、その染色体外での維持を可能とした配列を含んでもよいし、または（宿主中での安定な維持を確実にするための別の手段として）当該異種ＤＮＡを宿主のゲノム中に組み込ませるようにすることもできる。本発明の実施での使用を意図した宿主生物には、異種タンパク質の組換え生産を行ってきた生物が含まれる。かかる宿主生物の例としては、細菌（例えば大腸菌）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Han senula Polymorpha)およびP.パストリス(P．pastoris)：例えば、米国特許第4,8 82,279号、同第4,837,148号、同第4,929,555号および同第4,855,231号参照）、哺乳類細胞（例えば、HEK293、CHOおよびLtk^-細胞）、昆虫細胞などが含まれる。現在のところ、好ましい宿主生物は細菌である。最も好ましい細菌は大腸菌である。１つの具体例では、当該技術分野で十分に公知の適切なウイルスベクターを用いてin vivoまたはin vitroのいずれかで、本発明のCHDタンパク質をコードする核酸を哺乳類細胞中に入れることができる。特にin vivo「遺伝子治療」法のために設計された適切なレトロウイルスベクターは、例えば国際公開WO 9205266号およびWO 9214829号に記載されており、それらはin vivoにおいて核酸をヒト細胞中に効率よく導入する方法を記載している。さらに、本発明CHDのin vivoでの発現を制限または減じることを望む場合、本発明の核酸のアンチセンス鎖の導入が考えられる。本発明のさらなるもう１つの具体例によれば、本発明のCHDポリペプチドと特異的な反応性を有する抗CHD抗体が提供される。抗体の活性断片は、「抗体」の定義の範囲内に含められる。抗原として本発明ポリペプチド、タンパク質またはそれらの一部を用い、当該技術分野で公知の方法によって、本発明抗体を製造することができる。例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、例えば、出典明示して本明細書の一部とみなすHarlowおよびLane，Antibodies:A Labor atory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory(1988))に記載されているような、当該技術分野で十分公知の方法によって製造することができる。本発明のポリペプチドは、かかる抗体を生成させる際の免疫原として用いることができる。別法として、合成ペプチドを（市販の合成装置を用いて）製造し、免疫原として用いることができる。当該技術分野で十分公知の方法によってアミノ酸配列を解析して、それらが、対応するポリペプチドの疎水性または親水性ドメインをコードするかどうかを決定することができる。キメラ抗体、ヒト化抗体、CDRグラフト化抗体、または二機能性抗体などの改変抗体もまた、当該技術分野で十分公知の方法によって製造できる。かかる抗体はまた、例えばSambrookら，上記、ならびにHarlowおよびLane，上記に記載されたハイブリドーマ、化学合成または組換え方法によっても製造できる。抗ペプチドおよび抗融合タンパク質抗体の双方を用いることができる。(例えば、Bahouthら，Trends Pharmacol．Sci．12:33 8(1991);Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley an d Sons，NY(1989)）を参照のこと。これらは出典明示して本明細書の一部とみなす）。このように製造した抗体は、とりわけ、哺乳類、好ましくはヒトの、組織または血管内流体などの身体サンプル中に存在するCHDタンパク質のレベルを検出する診断方法および系に用いることができる。かかる抗体はまた、本発明CHDタンパク質のイムノアフィニティーまたはアフィニティークロマトグラフィー精製に用いることができる。さらに、本明細書では、細胞の表面上のCHDポリペプチドの存在を検出するための方法であって、細胞を、抗体がポリペプチドに結合できる条件下で、CHDポリペプチドと特異的に結合する抗体と接触させ、該細胞に結合した抗体の存在を検出し、次いでそれにより、該細胞の表面上の本発明ポリペプチドの存在を検出することを含む方法が考えられる。かかるポリペプチドの検出に関して、抗体をin vitroでの診断またはin vivoでの画像化法に用いることができる。サンプル中の標的CHDポリペプチドのin vitroでの検出に有用な免疫学的方法には、検出可能な抗体を使用するイムノアッセイが含まれる。かかるイムノアッセイには、例えば、当該技術分野で十分公知のELISA、Pandexマイクロフルオリメトリックアッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織化学染色方法が含まれる。抗体は、当該技術分野で十分公知の種々の方法によって検出可能なものにすることができる。例えば、検出可能なマーカーを、直接的にまたは間接的に該抗体に結合することができる。有用なマーカーには、例えば、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光体、色素原および化学発光標識が含まれる。生きている動物、ヒト、またはそれらから単離した生物学的組織もしくは流体中のCHDポリペプチドの活性を調節するために本発明において用いる本発明の抗C HD抗体が意図される。従って、本発明では、担体、および自然に生じるリガンドまたは他のCHD結合タンパク質が本発明のCHDポリペプチドに結合するのを阻止するために有効な量の、CHDポリペプチドに対する特異性を有する抗体を含んでなる組成物が意図される。例えば、細胞の表面上に存在するCHDポリペプチド分子のエピトープに対するモノクローナル抗体であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むCHDポリペプチド、または配列番号7もしくは配列番号8のCHDコーディング部分の細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体が、この目的のためには有用であり得る。本発明はさらに、CHDポリペプチドをコードする外来の核酸を発現することができる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。本明細書で用いる場合、「外来の核酸」とは、宿主には本来存在しない、または自然環境以外で（例えば、遺伝的に操作されたＤＮＡ構築体の一部として）宿主に存在する核酸配列をいう。また、正常な活性がなくなるように変異させた、すなわち天然のCHDを発現しない、CHDポリペプチドをコードする核酸を発現することができる非ヒトトランスジェニック哺乳動物が提供される。本発明はまた、CHDポリペプチドをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより、その翻訳を減少させる、CHDポリペプチドをコードするｍＲＮＡと相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるように組み込まれた、CHDポリペプチドをコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸を含んでなるゲノムを有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。該核酸はさらに誘導可能なプロモーターおよび／または組織特異的調節因子を含んでもよく、この結果、発現が誘導されるか、または特異的な細胞種に限定され得る。核酸の例としては、配列番号1、配列番号7または配列番号8で示されるコーディング配列と実質的に同一のコーディング配列を含んでなるＤＮＡまたはｃＤＮＡがある。非ヒトトランスジェニック哺乳動物の例としては、トランスジェニックマウスがある。組織特異性を決定する因子の例としては、メタロチオネインプロモーターおよびL7プロモーターがある。 CHDポリペプチドの生理学的および挙動的役割を解明する動物モデル系もまた提供され、それらは、種々の技術を用いてCHDポリペプチドの発現が改変されているトランスジェニック動物を作出することにより作られる。かかる技術の例としては、トランスジェニック動物を作出するための、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染または当業者に十分公知の他の手段によるCHDポリペプチドをコードする正常または変異型核酸の、適切な受精胚への挿入が挙げられる(例えば、Hoganら，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual(Cold S pring Harbor Laboratory，(1986)参照)。また本発明では、CHDポリペプチドの発現または構造の調節を改変するための、トランスジェニック動物における天然の遺伝子座と変異または正常型のCHD遺伝子の相同組換えの利用が意図される(Capecchiら，Science 244：1288(1989)； Zimmerら，Nature 338：150(1989)：これらは出典明示して本明細書の一部とみなす)。相同組換え技術は当該技術分野において十分公知である。相同組換えにより、天然(内因性)遺伝子と組換えまたは変異遺伝子が置換され、天然(内因性) タンパク質は発現できないが、例えば変異したタンパク質を発現することができ、結果としてCHDポリペプチドの発現が改変された動物が作出される。相同組換えと対照的に、マイクロインジェクション法では、宿主の遺伝子を除去することなく遺伝子を宿主ゲノムに付加する。マイクロインジェクション法により、内因性および外来性CHDタンパク質の双方を発現することのできるトランスジェニック動物を作出することが可能である。導入遺伝子（transgene）の発現調節のための手段を提供ため、誘導プロモーターを核酸のコーディング領域に連結することが可能である。導入遺伝子の組織特異的発現を可能にする組織特異的調節因子をコーディング領域に連結することができる。トランスジェニック動物モデル系は、タンパク質応答を活性化または阻害する特異的リガンド、すなわちアゴニストおよびアンタゴニストの同定のための、化合物のin vivoスクリーニングに役立つ。本発明の核酸、オリゴヌクレオチド(アンチセンスを含む)、これを含むベクター、形質転換宿主細胞、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせ、ならびに本発明の抗体は、化合物が、本発明のポリペプチドに対する潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するかどうかを決定するためのin vitroにおける化合物のスクリーニングに使用することができる。これらのin vitroスクリーニングアッセイは、本発明のポリペプチドの機能および活性に関する情報を提供し、これは1種以上のポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質との特異的な相互作用が可能な化合物の同定および設計につながる。本発明のさらなるもう１つの具体例によれば、CHDポリペプチドに結合する化合物の同定方法が提供される。本発明のタンパク質は、競合結合アッセイに使用してよい。かかるアッセイは、もしあるとすれば、どの化合物がCHDタンパク質に結合することが可能かを決定するための、多数の化合物の迅速なスクリーニングを提供することができる。続いて、結合が認められたそれらの化合物を用いてより詳細なアッセイを行い、さらにかかる化合物が本発明のタンパク質のモジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニストとして働くかどうか決定することができる。本発明のもう１つの具体例では、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物の同定のためのバイオアッセイが提供される。この方法によれば、本発明のポリペプチドを「未知の」または試験物質と(アンタゴニスト活性が試験されている場合には、レポーター遺伝子構築体の存在下で)接触させ、「未知の」または試験物質との接触に引き続いてポリペプチドの活性をモニターし、レポーター遺伝子構築体を発現させるそれらの物質をCHDポリペプチドの機能的リガンドとして同定する。本発明のもう１つの具体例では、組換えにより本発明のポリペプチドを発現する形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させることができ、次いで試験化合物の存在下または不存在下での、CHD介在応答(例えば、レポーター遺伝子発現を介して)の比較、または試験細胞または対照細胞(すなわち、CHDポリペプチドを発現しない細胞)の、化合物の存在に対する応答の比較により、それらの調節作用を評価することができる。本明細書で用いる場合、本発明のポリペプチドの「活性を調節する」化合物またはシグナルとは、CHDポリペプチドの活性を変える化合物またはシグナルであって、その結果、化合物またはシグナル存在下と不存在下では本発明のポリペプチドの活性が異なるものをいう。特に、かかる化合物またはシグナルはアゴニストおよびアンタゴニストを含む。アゴニストは、CHDタンパク質の発現を活性化する化合物またはシグナルを包含する。また、アンタゴニストはCHDタンパク質の発現を妨害する化合物またはシグナルを包含する。典型的には、アンタゴニストの効果は、アゴニストにより誘導されたタンパク質の活性化のブロッキングとして観察される。アンタゴニストは競合的および非競合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト(または競合的ブロッカー)はアゴニスト結合に特異的な部位またはその近傍と相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーはアゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用することによりポリペプチドの機能を不活性化する。当業者に理解されているように、CHD活性を調節する化合物の同定のためのアッセイ方法は、一般に対照との比較が必要である。「対照」の１つのタイプとしては、化合物に曝露される試験細胞または試験培養物と実質的に同じ処理をされる細胞または培養物であり、「対照」細胞または培養物は化合物に曝されないという違いを有する。例えば、電位固定（clamp）電気生理学的手段を用いる方法においては、ただ細胞を懸濁する外部溶液を変えるだけで、化合物の存在下または不存在下で同じ細胞を用いて試験することができる。もう１つのタイプの「対照」細胞または培養物は、「対照」細胞または培養物は天然タンパク質を発現しないこと以外は、トランスフェクトされた細胞と同じ細胞または培養物であってよい。従って、化合物に対するトランスフェクトされた細胞の応答は、「対照」細胞または培養物の、同反応条件下での同じ化合物に対する応答(またはその欠如)と比較される。本発明のさらにもう１つの具体例では、CHDポリペプチドの活性化を、有効量の、前記バイオアッセイにより同定された少なくとも１つの化合物とポリペプチドを接触させることにより調節することができる。本発明のもう１つの具体例では、ダウン症候群CHDの診断方法が提供され、該方法は：患者における、配列番号１，配列番号7または配列番号8を含むゲノムまたは転写ｍＲＮＡ配列の検出を含む。本発明のもう１つの具体例では、好ましくはキットの形態で、適切な封入体（ packaging material）中に少なくとも１種の本発明の核酸を含んでなる、診断系が提供される。診断用核酸は、本明細書に記載のCHDをコードする核酸に由来する。１つの具体例では、例えば、診断用核酸は配列番号１に由来する。本発明の診断系は、ゲノムＤＮＡ中またはCHDをコードする転写された核酸(ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡなど)中のいずれかにCHDをコードする核酸が存在しているか否かを分析するのに有用である。適切な診断系は少なくとも1種の、好ましくは2種以上の本発明の核酸の、少なくとも一回のアッセイに十分な量を別々に封入した化学試薬として含む。典型的には、封入試薬の使用上の指示書もまた含まれる。当業者は、本発明の核酸プローブおよび／またはプライマーを、本明細書に記載の本発明の方法を実施するために適当な緩衝液および溶液と組み合わせてキット形態に取り入れることが容易にできる。本明細書で用いる場合、「封入体」とは、本発明の核酸プローブまたはプライマーなどのキットの内容物を入れるために用いられる１以上の物理的構造体を表す。封入体は十分公知の方法で構築され、滅菌された、不純物を含まない環境にすることが好ましい。封入体は、本発明の核酸を、配列番号1、配列番号7、または配列番号8で示されるヌクレオチド配列をはじめとするCHDをコードする特定の配列を検出し、これによりダウン症候群先天性心臓疾患(DS-CHD)の存在または傾向を診断するために使用できることを表示するラベルを有する。さらに、封入体は特定の配列の検出およびダウン症候群先天性心臓疾患(DS-CHD)の存在または傾向の診断双方に用いられるキット中の材料の使用方法を示した指示書を含む。診断系に関連して、本発明において用いられる封入体は、核酸に基づく診断系において慣例的に利用されるものである。本明細書で用いる場合、「封入材（pa ckage）」とは、単離された本発明の核酸、オリゴヌクレオチド、またはプライマーを固定された範囲内に保持することができるガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの固形マトリックスまたは材料を表す。したがって、封入材は、例えば核酸、オリゴヌクレオチドまたはプライマーがミリグラム量で考慮される場合に用いられるガラスバイアルであってもよく、またはマイクログラム量で考慮される核酸プローブが操作的に被覆されたマイクロタイタープレートウエルであってもよい。「使用のための説明書」とは、典型的に、試薬濃度または、混合する試薬および試料の相対量、試薬／試料混合物の維持時間、温度、緩衝液条件などの少なくとも１つのアッセイ方法パラメーターを記載する明確な表現を含む。本明細書に記載されたすべての米国特許および出版物は、そのまま出典明示して本明細書の一部とみなされる。本発明を、以下の限定されない実施例を参照して、より詳細に記載する。以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、それらに限定するものではない。本明細書に記載されたすべての米国特許および刊行物は、そのまま出典明示して本明細書の一部とみなされる。特に断らない限り、本発明は、例えばManiatisら，Molecular Cloning ：A Lab oratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，New York，USA（1982）；Sambrookら，Molecular Cloning ：A Laboratory Man ual(2 ed.) ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA(1989)；Davisら，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(1986)；またはMethods in Enzvmolo gv:Guide to Molecular Cloning Techniques Vol．152，S．L．BergerおよびA． R．Kimmerl Eds.，Academic Press Inc.，San Diego，USA(1987)に記載された標準的な方法を用いて行われた。材料および方法特に断らない限り、本発明は、例えば、Maniatisら，Molecular Cloning:A La boratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，New York，USA(1982);Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual （第2版），Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA(1989);Davisら，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Sc ience Publishing，Inc.，New York，USA(1986);またはMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques第152巻，S．L．BergerおよびA．R．Ki mmerl編，Academic Press Inc.，San Diego，USA(1987)に記載の標準法を用いて行われる。ライブラリー。酵母人工染色体(YAC)クローンは、CEPH mega-YACライブラリーから得、標準条件の下で増殖させた(Cohenら，Nature 366:689-701(1993))。P1 人工染色体(PAC)ライブラリーの構築。RPCI-1と称する3XヒトPACライブラリー(I oannouら，Hum．Genet．219-220(1994b))を記載のように(Ioannouら，Nat．Gene t．6:84-89(1994a))構築した。ライブラリーは384ウェルディッシュに並べた。次いで、ベクタープライマーを用いてクローンの配列を決定することにより形成されたSTSを、PACライブラリーのグリッド化(gridded)コロニーフィルターに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いた。 YAC ＤＮＡの調製。YACクローンは選択培地で増殖させ、ペレットとし、3mlの 0.9Mソルビトール、0.1M EDTA pH7.5に再懸濁させ、次いで、100Uのリトカーゼ( Sigma)とともに37℃にて１時間インキュベートした。5,000rpmにて５分間の遠心分離の後、ペレットを3mlの50mMトリスpH7.45，20mM EDTAに再懸濁させ、3/10ml の10% SDSを加え、混合物を65℃にて30分間インキュベートした。1mlの5M酢酸カリウムを加え、チューブを1時間氷上に放置し、次いで、10,000rpmにて10分間遠心分離した。上清を2倍容量のエタノール中に沈殿させ、6,000rpmにて15分間でペレットとした。ペレットをTEに再懸濁させ、RNアーゼで処理し、次いで、フェノールークロロホルムで再抽出した。パルスフィールドゲル電気泳動による分析。全YAC ＤＮＡを含有する酵母細胞のアガロースプラグを調製し(LarinおよびLehrach．Genet．Rcs．56:203-208 (1990))、CHEF DRII Mapper(Bio-Rad)を用いて、0.5X TBE中の1%SeaKemアガロースゲルで、パルスフィールドゲル分離にかけた。PACおよびBACクローンは、No.t Iでの消化後にサイズ分画した。アルカリブロッティングを用いて、ゲルをMagna NTナイロン膜にブロットし、紫外線で架橋し、80℃で2時間焼き付けた。個々のクローンの大きさは、それらの相対的な位置を分子量標準と比較することにより決定した。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)による分析。PACまたはBACクローンを、BioNick Labeling Kit(Gibco-BRL)を用いて、ビオチン-14-dATPの存在下でのニックトランスレーションによりビオチン化した。FISHは、本質的には記載の方法と同様にして行った(Korenbergら，Cytogenet Cell Genet．69:196-200(1 995))。簡単に述べると、プローブ中の反復性のヒト配列ならびに酵母配列から生じる可能性があるバックグラウンドを抑えるために、400ngのプローブＤＮＡと8ngのヒトCot1 ＤＮＡ(Gibco-BRL)および2μｇの超音波処理したサケ精子ＤＮＡとを混合した。このプローブを75℃で変性させ、37℃にて1時間、予備アニーリングし、正常な雄リンパ球から調製した変性染色体スライドにアプライした(K orenbergら，1995，上記)。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、40℃で2X SSC/ 50%ホルムアミド中にて行い、次いで、50℃で1X SSC中で行った。ハイブリダイズしたＤＮＡは、アビジン結合蛍光イソチオシアネート(Vector Laboratories) を用いて検出した。ビオチン化した抗アビジンを用いることにより、増幅を1回行った。染色体のサブバンドを正確に識別するために、リバースバンディング法 (reverse banding technique)を用いたが、これはクロモマイシンA3およびジスタマイシンAの二重染色によって達成された(Korenbergら，1995，上記)。Photom etrics Cooled-CCDカメラとBDS画像解析ソフトウェア(Oncor Imaging，Inc．)を用いることにより、カラー画像を取り込んだ。 PACおよびBAC ＤＮＡの調製。選択したコロニーを、PACについては12.5μｇ/m lカナマイシン、BACについては12.5μｇ/mlクロラムフェニコールを含有するLB 培地で一晩増殖させた。ＤＮＡはアルカリ溶解法により調製した。BACおよびPAC ＤＮＡをNotIで消化し、次いで、パルスフィールド電気泳動にかけた。λコンカタマーと比較して大きさを決定した。サザンブロット分析。ＤＮＡのゲル電気泳動は、1X TBE中の0.8%アガロースゲルで行った。核酸のNybond N+ナイロン膜(Amersham)への転移は、製造業者の説明書に従い行った。プローブはRadPrim Labeling System(BRL)を用いて標識した。50%ホルムアミド、5X SSPE、5X Denhardt's 0.1% SDS、100mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ中で、42℃にて16時間で、ハイブリダイゼーションを行った。このフィルターを1X SSC、0.1% SDS中、室温で20分間1回洗浄し、0.1X SSC,，0.1% SDS中、65℃にて20分間ずつ２回洗浄した。このブロットをX線フィルム(Kodak，X-OMA T-AR)に露光した。 PACおよびBACエンドクローンの配列決定。PACクローンは、500mlのLB/カナマイシン中へ接種して一晩増殖させ、BACクローンは、500mlのLB/クロラムフェニコール中へ接種して一晩増殖させた。ＤＮＡは、QIAGENカラムを用いてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの１回抽出、次いで、クロロホルム／イソアミルアルコールの１回抽出を用いる販売業者のプロトコールに従い、単離した。標準T7およびSP6プライマーを用いるGibco-BRLサイクルシーケンシングキットを用い、クローンを配列決定した。実施例１ BAC コンティグの構築遺伝子単離およびD21S55からMX1領域における配列決定イニシアチブのための安定したクローンを得るため、本発明者らは細菌人工染色体(BAC)およびP1人工染色体(PAC)を用いてコンティグを構築した。全ヒトゲノムＤＮＡのBACライブラリーの構築は、Shizuyaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:8794-8797（1992）に記載のようにして行った。BACライブラリーは、その領域にかかるいくつかのY ACを用いてスクリーニングし；PACライブラリーは、放射性標識STS PCR産物およびギャップ・フィリング・イニシアチブにおける全BACを用いてスクリーニングした。これらBACおよびPACクローンの位置は、蛍光in situハイブリダイゼーション( FISH)により確認した。35の既存のSTSとともに（BACおよびPAC末端の直接配列決定から生じた）24の新しいSTSを用いるクローン間のサザン分析を用いると、BAC およびPAC間の重複が示された。BACおよびPACにおいてカバーされる間隔にわたるSTS密度は、60kbごとにSTS１個であり、クローンの75%が2個以上のSTSを有していた。およそ3.5Mbの4-5Mb D21S55からMX1までの間隔は、85個のBACおよび25 個のPACにおいてカバーされ、これはコンティグ内の4倍のカバー範囲に相当する。非重複クローンのみを計数することにより求めた最小のコンティグサイズは： 1100kb、900kb、510kb、380kbおよび270kbである。BACクローンの挿入物のサイズは、ＤＮＡをNotIで消化した後、パルスフィールド電気泳動を行うことにより測定した。実施例2 直接的ｃＤＮＡ選択直接的選択手法はいくつかの改良を伴うMorganらの、Nucleic Acid Res．20： 5173-5179(1992)に記載のものと同様であった。全ＲＮＡはTRI領域（商標）（Mo lecular Research Center Inc.）を用いて、14週齢21トノソミー胎児脳から単離した。ポリ(A)⁺ＲＮＡはポリ(A)Quick（登録商標）ｍＲＮＡ単離キット(STRATAG ENE)を用いて単離した。二本鎖cDNAはSuperScript（商標）選択システム(GIBCOB RL)を用いて、1μｇのオリゴ(dT)₁₅または0.1μｇのランダムヘキサマーを用いる5μｇの21トノソミー胎児脳ポリ(A)⁺ＲＮＡから合成した。全合成反応物はGen e Clean（登録商標)IIキット(BIO101,Inc.)により精製し、次いでキナーゼを作用させた。Sau3AIリンカーを、その後Sau3AIで消化されるcDNAに結合させた。この反応物をGene Cleanを用いて精製した。MboＩリンカーはｃDNAに結合させ、この反応物をGene Clean(Morganら、Nucleic Acid Res．20：5173-5179(1992))により精製した。この合成産物を、プライマーとして一本のMboＩリンカー(5'CCTG ATGCTCGAGTGAATTC3')(配列番号4)を用い、PCRにより増幅させた。PCRサイクル条件は100μｌの1xPCR緩衝液(Promega)、3mM MgCl₂、5.0単位のTaqポリメラーゼ(P romega)、2μＭプライマーおよび0.2mM dNTP中において、94℃／15秒、60℃／23 秒、72℃／2分の40サイクルであった。領域ETS2およびMX1間の19のBAC ＤＮＡ（総量2.5μｇ）および2のPAC ＤＮＡは、QIAGENプラスミドキットを用いて調製し、ニックトランスレーションキットおよびビオチン-16-dUTP(Boehringer Manneheim)を用いて、ビオチン化した。3 μｇの熱変性させたPCR増幅ｃＤＮＡは、100μｌハイブリダイゼーション緩衝液 (750mM NaCl、50mM NaPO₄(pH7.2)、5mM EDTA、5x Denhardt's、0.05% SDSおよび 50％ホルムアミド）中、42℃にて2時間3μｇの熱変性COT1 ＤＮＡ(BRL)とアニーリングした。プレハイブリダイゼーション後、1.2μｇの熱変性ビオチン化BAC ＤＮＡを添加し、16時間42℃にてインキュベートした。ｃＤＮＡ-BAC ＤＮＡハイブリッドをエタノールで沈殿させ、60μｌの10mMトリス塩酸(pH8.0)、1mM EDTA中に溶解した。40μｌの5M NaClの添加後、ＤＮＡを磁気ビーズ(Dynabeads M-280、Dyn al)とともに1時間25℃にて緩やかに回転させながらインキュベートし、ＤＮＡを磁気ビーズへ付着させた。次いでこのビーズを400μｌの2x SSC中でピペッティングし、30秒間磁気ホルダー(MPC-E（商標）、Dynal)に保持し、上清を除去することにより2回洗浄した。さらに0.2x SSC中で10分間68℃にて４回洗浄し、洗浄のたびにそのビーズを新しいチューブへ移した。ｃＤＮＡは時々攪拌しながら10 分間80℃にて100μｌの蒸留水に溶出させた。溶出したｃＤＮＡは前記のようにP CRにより増幅させた。磁気ビーズを用いる選択手順を２回繰り返した後、増幅させたｃＤＮＡをEcoRＩで消化し、さらにpBluescriptIIへとサブクローニングした。 ETS2およびMX1間の19のBACおよび2のPACを用いた直接ｃＤＮＡ選択法により、合計145のユニークｃＤＮＡ断片が生じた。FASTAを用いたGenbankおよびTIGR相同性検索により、ETS2、HMG14、PEP19、Na K ATPアーゼ、Titan EST、MX1領域ES T、および未知の機能を持つ14のESTとの一致が明らかになった。妊娠14週における21トノソミー胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーは、「A64」と称するこれらのユニークｃＤＮＡ断片の１つを用いてスクリーニングした。実施例3 ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを用いたヒトCHD ｃＤＮＡの単離 21トノソミー胎児脳cDNAライブラリーは一方向性cDNAライブラリーをもたらす ZAP-ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット(STRATAGENE)を用いて構築された。簡単に述べると、二本鎖ｃＤＮＡを5-メチルdCTPを有するハイブリッドオリゴ(dT)-Xho Ｉリンカープライマーを用いて、5μｇの21トノソミー胎児脳ポリ(A)⁺ＲＮＡから合成した。EcoRＩリンカーをcDNAと結合させ、続いてEcoRＩおよびXholで消化し、その後UNI-ZAP XRベクターにクローン化した。このライブラリーはGigapack （登録商標）IIGoldパッケージング抽出物を用いてパッケージングした。原ライブラリーの力価は1.1×10⁶p.f.ｕ./パッケージであった。このライブラリーを１回増幅させた。ブルー・ホワイトカラーアッセイは99％のクローンが挿入断片を有することを示した。この挿入断片の平均サイズは、14のクローンから算出して 1.9kbであった。 21トリソミー胎児脳cDNAライブラリーのスクリーニングは、上記のように調製した「A64」と称する145のユニークｃＤＮＡ断片（配列番号3）1つを用いて行った。ファージを175cm²のプレートにつき平均密度1×10⁵になるようにプレートした。20のプレート（2×10⁶ファージ）のプラークリフトを二重ナイロン膜（Hybo nd-N+；Amersham）を用いて行った。ハイブリダイズした膜を最終ストリンジェンシ−0.2x SSC、0.1x SDSまで65℃にて洗浄した。フィルターを一晩、Ｘ線フィルムに感光させた。さらなる分析のためにM13が介在する切除により、ファージをプラスミドベクターpBluescript II SK(-)にサブクローニングした。「CHD」と称する新規タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを単離した。CHDをコードするｃＤＮＡは、288アミノ酸配列（配列番号2）をコードする864塩基対のオープンリーディングフレーム（配列番号1）を少なくとも有する。実施例4 ヒトCHD発現のノーザンブロット分析 CHD cDNAを含む挿入断片はXhoIおよびEcoRIでの消化により、基本ベクターから切り出した。ランダムプライミング法を用いて標識した後、その断片はMultip le Tissue Northern Blot(Clontech)を用いたノーザンハイブリダイゼーション用のプローブとして使用した。ノーザンブロットアッセイは成人心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓をはじめとする種々の組織において、プローブとしてCHD ｃＤＮＡを用いて実施した。その結果は、主に成人心臓および骨格筋で発現し、より低レベルでは至る所で発現することを示す。脳、胎盤、肺、肝臓、腎臓および膵臓では、ごくわずかなCHDの発現を示す。心臓組織におけるノーザンブロットで見られた主要な転写産物は2.4kbの大きさであり、一方、筋肉における主要な転写産物は1.2kbである。心臓は約1.2kbにマイナーな転写産物を有し、骨格筋は2.6kbにマイナーな転写産物を有する。このように、タンパク質のCHDファミリーをコードするスプライシング変異体ｃＤＮＡ転写産物が、本発明により明確に考えられる。実施例5 ヒトCHD発現のRT-PCRアッセイ種々のヒト組織のcDNAライブラリーに対する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)アッセイを、CHD-31（配列番号5）およびCHD-52（配列番号6）と番号を付したプライマーを用いて行った。その結果は53日および55日齢のヒト胎児心臓および6-9週齢の心臓におけるヒトCHD ｍＲＮＡの発現を証明した。CHDの時間的および組織特異的発現パターンは、DS-CHDとCHDとの会合をさらに支持するものである。実施例6 マウスCHD ｃＤＮＡの単離 CHDのマウス相同体は、マウス脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして1053塩基対のヒトcDNAクローン（配列番号1）を用いて単離した。二本鎖ｃＤＮＡを、19週齢の雌C57 Black／6マウスから単離したマウス脳ポリ(A)⁺ＲＮＡ 5μｇから合成した。ｃＤＮＡは5-メチルdCTPを有するハイブリッドオリゴ(dT)-XhoIリンカープライマーを用いてオリゴ(dT)開始させた。Eco RIリンカーをｃＤＮＡに連結し、このｃＤＮＡはEcoRIおよびXhoIで消化し、Uni ZAP XRベクター(STRATAGENE：Catalog #937314)にクローン化した。ライブラリーの平均挿入断片サイズは1.0kbであった。ライブラリーのスクリーニングは、プローブとしてヒトCHD ｃＤＮＡ（配列番号1）を用いて、実施例3に記載するようにフィルターハイブリダイゼーションにより行った。ライブラリ一中の2×10⁶個のクローンをスクリーニングすることにより、40個の陽性クローンを同定した。CHD1-Mos-3と称する、このマウスクローンの１つの分析により、約1.0kbのｃＤＮＡが明らかになった。5'領域および3' 領域に対応するCHD-1-Mos-3クローンの部分的ｃＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号7 および配列番号8に示す。マウスｃＤＮＡの416塩基対の5'末端（配列番号7）のヒトCHDクローン（配列番号1）に対する同一性は81％であった。さらに、マウス CHD-1-Mos-3 ｃＤＮＡの配列解析により、マウスｃＤＮＡの3'末端における320 塩基対の重複配列（配列番号8）においてヒトCHDクローン（配列番号1）との77. 5％の同一性が明らかになった。実施例7 マウスCHD発現のin situ特性決定さらにマウスCHDの発現を調べるために、交尾後7.5〜17.5日の正常マウス胚、新生児マウス、2週齢マウスおよび成体マウスの脳の切片に対して、プローブとしてマウスCHD-1-Mos-3 ｃＤＮＡを用いて、組織in situハイブリダイゼーション分析を行った。 BALB/cおよびC57BL/6xDBA/2胚、胎児および出生後の脳を、リン酸緩衝溶液(P BS)中の4％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、脱水してパラフィンを浸潤させた。5〜7ミクロンの連続切片をゼラチン被膜スライドに載せた。1スライドにつき2切片を載置し、キシレン中で脱パラフィンし、再水和し、後固定した。この切片をプロテナーゼKで消化し、後固定し、トリエタノールアミン／無水酢酸で処理し、洗浄、脱水した。ｃＲＮＡプローブは、マウスCHD-1-Mos-3 ｃＤＮＡから作製した。プラスミドをKpnIで線状化し、T3ポリメラーゼを用いてセンス制御ｃＲＮＡを作製した。ｃＲＮＡ転写産物は、製造業者の条件(STRATAGENE)に従って合成し、³⁵S-UTP(>1000Ci/mmol；AMERSHAM)で標識した。100ヌクレオチドより大きいｃＲＮＡ転写産物をアルカリ加水分解にかけて、効率的なハイブリダイゼーションのための平均サイズ70塩基を得た。切片は一晩、52℃で50％脱イオン化ホルムアミド、0.3M塩化ナトリウム、20mMトリス塩酸、pH7.4、5mM EDTA、10m M NaPO₄、10％デキストラン硫酸、1x Denhardt's溶液、50μg/mlの全酵母ＲＮＡおよび50-75,000cpm/mlの³⁵S-標識ｃＲＮＡプローブ中にて、ハイブリダイズした。この組織を65℃で50％ホルムアミド、2x SSC、10mMジチオトレイトール中にてストリンジェント洗浄に付し、PBS中で洗浄した後、37℃で30分間、20μｇ/ml のRNアーゼAで処理した。2x SSC、および0.1x SSC中で37℃にて10分間洗浄した後、このスライドを脱水し、Kodak NTB-2ヌクレアートラックエマルジョン(nucl ear track emulsion)に浸し、4℃で2〜3週間乾燥剤を含むlight-tight box中で感光させた。Kodak D-19にて写真現像を行った。スライドはトルイジンブルーで明るく対比染色され、Zeiss Axiphot顕微鏡の明・暗視野オプチックスの双方を用いて分析した。センス制御ｃＲＮＡプローブは細胞のｍＲＮＡと同一であり、常にハイブリダイゼーションシグナルのバックグラウンドレベルを示す。胚構造はよく知られた図解書を用いて確認した。結果は、マウスCHD-1-Mos-3クローンが交尾後7.5〜9.5日からの全胚細胞において高度に発現されることを示している。10.5日においてマウスCHD-1-Mos-3の発現はいくつかの組織および器官において減少するが、他では依然として顕著であった。例えば、肺、肝臓および顎弓では、より高いレベルの発現が見られる。また発現は、より先端部の神経管および周辺の間葉に比べ、後部肢芽のような尾部領域においてより高度に現れる。11.5日では、マウスCHD-1-Mos-3発現は心臓、神経上皮、頭蓋神経節、骨格筋および消化管では低い。11.5日での発現は肝臓で最も高い。12.5日では、消化管でのシグナルは上皮ライニングに局在するようになる。顎弓に存在したシグナルは舌筋に主として局在するようになる。13.5日では、マウスCHD-1-Mos-3レベルは肝臓において最も高くまた腎臓においても検出される。14.5日および15.5日では、中枢神経系での発現が新皮質において最も高い。胸腺におけるin situハイブリダイゼーションシグナルは肝臓のものと同等またはより高い。17.5日マウスにおいてCHD-1-Mos-3発現レベルは褐色脂肪において最も高い。特定の好ましい具体例を参照して本発明を詳しく説明してきたが、特許請求された本発明の精神および範囲にはさまざまな修飾および変更が含まれることが理解されよう。配列の要約配列番号1は、本発明のヒトCHDタンパク質をコードするｃＤＮＡの核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。配列番号2は、本発明のヒトCHDタンパク質の推定アミノ酸配列である。配列番号3は、CHDをコードするｃＤＮＡの単離に用いられるｃＤＮＡプローブ（「A64」と表記する）である。配列番号4は、MboIリンカー配列である。配列番号5は、実施例5に記載のRT-PCRアッセイで用いられる、CHD-31と称するプライマーである。配列番号6は、実施例5に記載のRT-PCRアッセイで用いられる、CHD-52と称するプライマーである。配列番号7は、マウスCHDタンパク質をコードするマウスｃＤＮＡクローンCHD- 1-Mos-3の5'領域の部分配列である。推定開始コドンは配列番号7のヌクレオチド 281にある。配列番号8は、マウスCHDタンパク質をコードするマウスｃＤＮＡクローンCHD- 1-Mos-3の3'開始領域の部分配列である。推定停止コドンは配列番号8のヌクレオチド316にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物の先天性心臓疾患（ＣＨＤ）タンパク質をコードする単離された核酸、またはその断片。２．（ａ）配列番号２に示されたアミノ酸配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分をコードするＤＮＡ、（ｂ）中度ストリンジェント条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであって、生物学的に活性なＣＨＤをコードするもの、または（ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）に対する縮重ＤＮＡであって、生物学的に活性なＣＨＤをコードするものから選択される、哺乳動物の先天性心臓疾患（ＣＨＤ）タンパク質をコードする単離された核酸、またはその断片。３．前記核酸が、高度ストリンジェント条件下で、配列番号１、配列番号７または配列番号８のヌクレオチドのＣＨＤコード部分とハイブリダイズする、請求項２に記載の核酸。４．前記核酸のヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示されたものと実質的に同一のものを含む、請求項２に記載の核酸。５．前記核酸のヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示されたものと同一である、請求項２に記載の核酸。６．前記核酸がｃＤＮＡである、請求項２に記載の核酸。７．請求項２に記載の核酸を含むベクター。８．請求項２に記載の核酸を含む組換え細胞。９．配列番号１、配列番号７または配列番号８に示されたヌクレオチド配列の核酸の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な少なくとも15ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。１０．前記オリゴヌクレオチドが検出可能なマーカーで標識されている、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。１１．請求項２に記載の前記核酸によってコードされるｍＲＮＡと特異的に結合することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド。１２．請求項１０に記載の少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含むＣＨＤｃＤＮＡ配列の存在を検出するためのキット。１３．単離された哺乳動物先天性心臓疾患（ＣＨＤ）タンパク質。１４．さらに、骨格筋よりも心臓において有意に高い量で発現することによって特徴付けられる、請求項１３に記載のＣＨＤタンパク質。１５．前記タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されたタンパク質配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分と実質的に同一のものを含む、請求項１３に記載のＣＨＤタンパク質。１６．配列番号２に示されたタンパク質配列、または配列番号７もしくは配列番号８のＣＨＤコード部分と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のＣＨＤタンパク質。１７．前記タンパク質が、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示されたヌクレオチド配列と実質的に同一のものを含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１３に記載のＣＨＤタンパク質。１８．前記タンパク質が、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示されたヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１７に記載のＣＨＤタンパク質。１９．前記タンパク質が、配列番号１、配列番号７または配列番号８に示されたヌクレオチド39〜902と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１３に記載のＣＨＤタンパク質。２０．ＣＨＤ関連タンパク質の発現方法であって、請求項８に記載の細胞を、前記ＣＨＤタンパク質の発現に適した条件下で培養することを含む、前記方法。２１．請求項１３に記載のＣＨＤタンパク質との特異的な反応性を有する、単離された抗ＣＨＤ抗体。２２．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の抗体。２３．前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項２１に記載の抗体。２４．ヒトＣＨＤタンパク質の発現を抑制するのに有効な量の請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび細胞膜を通過することが可能な許容できる疎水性担体を含む組成物。２５．ＣＨＤタンパク質をコードする外因性核酸を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。２６．前記ＣＨＤタンパク質をコードする前記核酸が突然変異を起こしており、そのため発現したＣＨＤタンパク質が天然ＣＨＤではない、請求項２５に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。２７．トランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項２５に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。２８．哺乳動物ＣＨＤタンパク質をコードする核酸を同定する方法であって、核酸を含む試料を請求項９に記載のオリゴヌクレオチドと高度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で接触させ、そしてそれにハイブリダイズする化合物を同定することを含む、前記方法。２９．試料中のヒトＣＨＤタンパク質の存在を検出する方法であって、試験試料を請求項２１に記載の抗体と接触させ、抗体−ＣＨＤ複合体の存在を検出し、それによって前記試験試料中のヒトＣＨＤの存在を検出することを含む、前記方法。３０．配列番号１、配列番号７または配列番号８に示された核酸配列から誘導された核酸配列を含む、ＣＨＤ核酸増幅用の１本鎖ＤＮＡプライマー。