JP2001502906A - Ｄｓ―ｃａｍタンパク質をコードする核酸およびそれに関連する産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明によると、新規なダウン症-細胞接着分子（DS-CAM）タンパク質が提供される。前記タンパク質をコードする核酸配列およびそれを用いるアッセイも開示される。本発明のDS-CAMタンパク質は、種々の面で、例えば、それに対する抗DS-CAM抗体の産生、前記タンパク質および／または抗体を用いる治療用組成物ならびに方法において使用することができる。また、DS-CAMタンパク質はアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのバイオアッセイにも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＳ−ＣＡＭタンパク質をコードする核酸およびそれに関連する産物 本出願は、1996年10月25日に出願された米国仮出願第60/029,322号の利益に基 づく非仮出願であり、その利益を主張するものである。この米国仮出願第60/029 ,322号の内容は引用によりその全文が本明細書に含まれるものとする。 謝辞 本発明は、国立保健研究所から授与された補助金No.HL50025およびNo．HD1744 9ならびにエネルギー省から授与されたDE-FGO3-92ER61402に基づく政府の支援に よってなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有するものであ る。 発明の分野 本発明は、核酸および該核酸によってコードされるタンパク質に関する。本発 明の核酸は、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーの新規Ｎ−ＣＡＭ メンバーをコードするものである。また、本発明は、かかる核酸およびタンパク 質の製造および使用方法にも関する。 発明の背景 過去10年間にわたる研究によって、体内における細胞−細胞相互作用に伴う分 子事象、特に、免疫系における細胞の活動および活性化に関与する分子事象がお おいに解明されてきた。一般的には、Springerら，Nature 346:425-434，1990を 参照されたい。それに対応して、細胞表面タンパク質、および特にいわゆる細胞 接着分子（Cellular Adhesion Molecule）（「ＣＡＭ」）は、炎症部位への白血 球溢出および別のターゲット組織への白血球移動のプロセスを仲介することをそ の目的として有する医薬品の研究および開発の主題であった。また、細胞接着分 子の単離および特性付け、かかる分子をコードするＤＮＡ配列のクローニングお よび発現、ならびに炎症プロセス、ウイルス感染および癌転移に関連した治療剤 および診断剤の開発も、多数の来国特許（Letters Patent）およびその外国出願 の主題であった。Edward，Current Opinion in Therapeutic Patents 1(11):161 7-1630，1991、特にそこに引用された刊行物「特許文献参照(patent literature references)」を参照されたい。 現在まで多数のＣＡＭが特性付けられている。例えば、PCT WO 90/13300に記 載されたような血管接着分子（ＶＣＡＭ−１）；Newmanら，Science 247:1219-1 222，1990に記載された血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）；ならびにP CT WO 91/10683；および米国特許第5,525,487号；5,235,049号；5,272,263号；5 ,489,233号；5,264,554号；5,318,890号；5,389,520号；5,519,008号などを参照 されたい。 Ｎ−ＣＡＭおよびその関連物は神経発達において重要な役割を果たすという実 質的な証拠がある（EdelmanおよびCrossin，“CELL ADHESION MOLECULES:Implic ations for a Molecular Histology”，Ann ．Rev．Biochem．60:155-190，1991; ならびにWalshおよびDoherty，Curr ．Opinion in Cell Biol．5:791-796，1993 ）。例えば、Ｎ−ＣＡＭに対して特異的な抗体は神経プロセスの正常な成長パタ ーンを妨害した。Ｎ−ＣＡＭ（遺伝子座11q23.1）は発達中の神経管の細胞中に 大量に発現されるが、神経堤細胞が神経管から解離し拡散すると、それら神経堤 細胞は再凝集して神経節を形成する際にＮ−ＣＡＭを後で再発現するためだけに Ｎ−ＣＡＭを消費する。さらに、Rosenthalら（Nature Genet．2:107-112，1992 ）は、ＣＡＭ−Ｌ１（遺伝子座Xq28）における突然変異がＸ染色体性(X-linked) 水頭症を引き起こすことを報告しており、Jouetら（Nature Genet．7:402-407， 1994）は、ＣＡＭ Ｌ１遺伝子における突然変異が１型Ｘ染色体性痙性対麻痺お よび脳梁の非形成を示すＭＡＳＡ症候群の原因であることを示した。よって、当 技術分野では、免疫グロブリンスーパーファミリーの新規Ｎ−ＣＡＭメンバーを 、神経発達および神経細胞伝達におけるそれらの役割を決定することができるよ うに、同定し、単離することが必要とされている。 したがって、当技術分野ではヒト細胞−細胞相互作用に関係するさらなるタン パク質の発見が必要とされ続けており、特に、それらのアミノ酸配列の面でかか るタンパク質を明確に同定し特性付けるのに役立つ情報が必要とされ続けている 。さらに、かかる分子が治療剤および診断剤の開発の基礎を形成し得る程度まで に、それらをコードするＤＮＡが解明されることが必須である。本発明はこの要 求を満たすものであり、さらに関連する利点も提供するものである。 発明の簡単な説明 本発明によれば、本明細書においてはダウン症候群−細胞接着分子（ＤＳ−Ｃ ＡＭ）と呼ばれる、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーの新規哺乳 動物Ｎ−ＣＡＭ（神経細胞接着分子）メンバーをコードする単離された核酸が提 供される。さらに、本発明の核酸を含むベクター、それにハイブリダイズするプ ローブ、それを用いて形質転換された宿主細胞、それに対するアンチセンスオリ ゴヌクレオチドおよび関連組成物が提供される。本明細書に記載する核酸分子は 、単離されたＤＳ−ＣＡＭタンパク質を容易に産生するということが当業者に知 られている種々の組換え発現系に組み込むことができる。さらに、本発明の核酸 分子は、所与の試料中のＤＳ−ＣＡＭ遺伝子またはｍＲＮＡ転写産物の存在およ び／または量をアッセイするためのプローブとして有用である。また、本明細書 に記載する核酸分子、およびそのオリゴヌクレオチド断片は、ＤＳ−ＣＡＭタン パク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマーおよ び／または鋳型としても有用である。 本発明によれば、単離された哺乳動物ＤＳ−ＣＡＭタンパク質も提供される。 これらのタンパク質は、例えば、損傷した、または重症の末梢神経を修復（再生 ）する管挿入(entubulation)法に用いられる神経補てつ装置において有用である （例えば、米国特許第4,955,892号を参照されたい。これは引用により本明細書 に含まれるものとする。）。さらに、これらのタンパク質、またはその断片は、 抗ＤＳ−ＣＡＭ抗体を産生させるための免疫原として有用であり、かかるタンパ ク質および／または抗体を含む治療組成物において有用である。本発明のＤＳ− ＣＡＭタンパク質は、それに対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定する ためのバイオアッセイにおいても有用である。また、本発明のタンパク質を発現 するトランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供される。 本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質と免疫反応性のある抗体も提供される。これ らの抗体は、所与の試料、例えば、組織試料、ウェスタンブロットなどに存在す るＤＳ−ＣＡＭタンパク質のレベルを測定するための診断アッセイにおいて有用 である。また、この抗体は、粗細胞抽出物などからのＤＳ−ＣＡＭタンパク質の 精製にも使用することができる。さらに、これらの抗体は、in vivoでＤＳ−Ｃ ＡＭの生物学的作用を中和し、または補うのために治療上有用であると考えられ る。 種々の組織試料中のＤＳ−ＣＡＭタンパク質のレベルを測定するための方法お よび診断システムも提供される。これらの診断方法は、治療のために投与された ＤＳ−ＣＡＭタンパク質またはその断片のレベルを監視して治療上有効な量の維 持を容易にするのに用いることができる。また、これらの診断方法は、ＤＳ−Ｃ ＡＭタンパク質の異常レベルまたは異常構造から生じる生理学的障害を診断する ことにも用いることができる。 図面の簡単な説明 図１は、染色体21上のD21S345とD21S347の間の領域へのＤＳ−ＣＡＭ遺伝子の 局在の物理的地図を示すものである。ＢＡＣクローン（数から始まる）およびＰ ＡＣクローン（「Ｐ」から始まる）の位置を、水平のバーで示す。矢じりはＢＡ ＣおよびＰＡＣコンティーグにおけるギャップを示すものである。ＤＳ−ＣＡＭ 遺伝子の位置を細い矢印で示す。 図２は、配列番号２に対応するヒトＤＳ−ＣＡＭ１タンパク質の推定アミノ酸 配列および概略構造を示すものである。ＩＧ：免疫グロブリンＣ２型ドメイン。 ＦｂＮ：フィブロネクチンIII型ドメイン。アミノ酸配列中の太字のＣは、Ｉｇ 様Ｃ２型ドメインにおけるジスルフィド結合を形成するシステイン残基を示す。 アミノ酸配列中の太字のＮＸＳおよびＮＸＴは、Ｎ−グリコシル化される可能性 のある部位に対応する。 図３は、ＤＳ−ＣＡＭ１の部分的ゲノム構造およびＤＳ−ＣＡＭ２ ｃＤＮＡ クローン（クローンｐＤＳ−ＣＡＭ−１８およびｐＤＳ−ＣＡＭ−５２）に含ま れる欠失を示すものである。欠失境界配列（ＧＣ−ＡＧ）は、異常な選択的スプ ライシングを示唆するものである。水平のバーは、ＤＳ−ＣＡＭ−４２のエキソ ンを含むゲノム配列を示す。エキソンは、白四角によって示される。エキソン− イントロン境界は、ｐＤＳ−ＣＡＭ−４２のｃＤＮＡ配列と、ＢＡＣクローンか ら決定されたゲノム配列の比較によって決定される。 図４は、神経細胞Ｉｇスーパーファミリーメンバーを図示的に比較したもので ある。Ｉｇ様Ｃ−２型ドメイン、フィブロネクチンIII型ドメイン、および膜貫 通ドメインが示されている。ＭＡＧ：ミエリン関連糖タンパク質、Ｎ−ＣＡＭ： 神経細胞接着分子、ＢＩＧ−１：脳誘導免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミ リー分子−１、ＤＣＣ：結腸直腸癌において欠失されるもの。 発明の詳細な説明 本発明によれば、タンパク質のＤＳ−ＣＡＭファミリーの新規哺乳動物メンバ ーおよびその断片をコードする、単離された核酸が提供される。「ＤＳ−ＣＡＭ 」という語句は、実質的に純粋な天然ＤＳ−ＣＡＭタンパク質、または組換え的 に産生されたタンパク質を意味し、例えば、本明細書に開示されているＤＳ−Ｃ ＡＭ１（配列番号２）およびＤＳ−ＣＡＭ２（配列番号１１）のような一次転写 産物の選択的スプライシングによって産生されたｍＲＮＡによってコードされる その天然対立遺伝子変異体などを含み、さらには免疫原性のような少なくとも１ 種の天然生物学的活性を維持するその断片などを含む。一つの態様においては、 ＤＳ−ＣＡＭ１のような本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、膜の平面において 可動な細胞表面糖タンパク質である。本発明のＤＳ−ＣＡＭ１タンパク質は、細 胞の外側から細胞質および核に情報を伝達する細胞外および細胞内ドメインを含 んでおり、それによって細胞機能が決定される。別の態様においては、ＤＳ−Ｃ ＡＭ２のような本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、非膜結合性可溶性タンパク 質である。 本発明の一つの態様においては、ＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、さらに、免疫グ ロブリンスーパーファミリーに相同な少なくとも７個の免疫グロブリン様（Ｉｇ 様）ドメインおよび６個のIII型フィブロネクチンリピート(repeats)を含むこと によって特性付けられる（例えば、EdelmanおよびCrossin，“CELL ADHESION MO LECULES:Implications for a Molecular Histology”，Ann ．Rey．Biochem.，60 :155-190，1991;ならびにWalshおよびDoherty，Curr ．Opinion in Cell Biol.， 5:791-796，1993を参照されたい。これらはそれぞれ引用によりその全文が本明 細書に含まれるものとする。）。本発明の別の態様においては、ＤＳ−ＣＡＭタ ンパク質は、少なくとも８個、好ましくは少なくとも９個、特に好ましくは少な くとも10個のＩｇ様ドメインを含むタンパク質である。 本明細書で用いられる場合、「Ｉｇ様ドメイン」、またはその文法的に変化し たものは、細胞接着分子（ＣＡＭ）に共通の周知のリピートを意味する（例えば 、EdelmanおよびCrossin，前掲，1991のp.158の図１Ａ；ならびにWalshおよびDo herty，前掲，1993を参照されたい。これらは引用によりそれらの全文が本明細 書に含まれるものとする）。 「III型フィブロネクチンリピート」、「フィブロネクチンリピート」という 語句、またはそれらの文法的に変化したものは、細胞接着分子（ＣＡＭ）に共通 の周知のリピートを意昧する（例えば、EdelmanおよびCrossin，前掲，1991のp. 158の図１Ａ；ならびにWalshおよびDoherty，前掲，1993を参照されたい。これ らは引用によりそれらの全文が本明細書に含まれるものとする）。 本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、ＢＩＧ−１（Yoshiharaら，Neuron 13:4 15-426，1994）、ＣＡＭ−Ｌ１（Mossら，Nature 334:701-703，1988）、ＤＣＣ （Fearonら，Science 247:49-56，1990）、ネオゲニン（Laneら，Genomics 35:4 56-465，1996）、コンタクチン（Ranscht，J ．Cell Bio．107:1561-1573，1988 ）などの神経細胞接着分子に対して最も高い相同性を有するＩｇ（免疫グロブリ ン）スーパーファミリーの新規サブクラスを規定するものである(図４)。本発明 のＤＳ−ＣＡＭタンパク質の構造は神経免疫グロブリンスーパーファミリー内で は独特であり、Ｉｇ様Ｃ２型およびフィブロネクチンIIIドメインの数（それぞ れ10および６）に、ならびに10番目のＣ２ドメインによる４番目と５番目のフィ ブロネクチンドメインの分断に特徴があることがわかっており、その機能的意義 が興味の対象であり得る。ＤＳ−ＣＡＭの新規な構造および分化中の神経系全体 におけるその発現は、神経の発達および機能における神経ＣＡＭに対する興味深 い役割を示唆するものである。ＤＳ神経認識表現型に重要な領域におけるＤＳ −ＣＡＭの位置は、認識機能に対するこれらの役割の意義を試験するためのヒト モデルを提供するものである。 神経Ｉｇスーパーファミリーメンバーは、神経の発達および機能において重要 な役割を果たしており、細胞の移動および選別、軸索誘導および束形成、神経連 結の形成、ならびにシナプス形成性に密接に関係している（EdelmanおよびCross in，前掲，1991;WalshおよびDoherty，前掲，1993;Tessier-Lavigneら，Science 274:1123-1133 ，1996;Shusterら， Neuron 17:641-654 ，1996;Shusterら，Neuro n 17:655-657，1996）。これらの活性は、Ｉｇ−スーパーファミリーメンバーの 同種親和性または異種親和性結合タンパク質（Mauroら，J ．Cell Bio．119:191- 202，1992およびMilevら，J．Biol．Chem．271:15716-15723，1996）、細胞外マ トリックスタンパク質へのＩｇ−スーパーファミリータンパク質の結合（Grumet ら，Cell Adhesion Comm ．1:177-190，1993;Tairaら，Neuron 12:861-872，1994 ;およびZischら，J ．Cell Bio．119:203-213，1992）、ならびに小型の拡散性化 学忌避薬または化学誘引薬、例えばＤＣＣおよびネトリンへの結合（Keino-Masu ら，Cell 87:175-185，1996）によって媒介される。 中枢神経系に対するＤＳ−ＣＡＭ発現の特異性、ならびに中枢および抹消神経 系の両方における軸索生長期間に対するその発現の時機は、初期の発達および分 化におけるＤＳ−ＣＡＭの役割を示すものである（実施例４および５）。神経堤 前駆細胞を除き、発達の初期には、神経管の上衣層および脳の脳室区域のような 分裂中の感党上皮前駆細胞を含む領域では明らかに発現が無い（AltmanおよびBa yer，Atlas of Prenatal Rat Brain Development，CRC Press，Ann Arbor，MI， 1995）。胚においては、分化した神経細胞は、軸索が生長している間に、感覚上 皮内の適正な位置への移動が終了したら、ＤＳ−ＣＡＭを発現する。 神経堤細胞は、移動しながらＤＳ−ＣＡＭを発現し得る。pc15.5および16.5日 目に、神経堤誘導組織の大部分はある程度の発現を有しているが、全てが移動を 終了したとは限らない。dpc15.5〜16.5日後の筋層間神経叢におけるＤＳ−ＣＡ Ｍの連続発現は、分裂を停止した神経堤細胞によるものであるが、その他のもの は細胞周期にある。腸管筋神経節神経細胞(myenteric ganglia nuerons)の約50 ％は誕生後に生じ、ＤＳ−ＣＡＭは、後で、このサブセットにおいて発現され得 る。後の段階においては、データは、ＤＳ−ＣＡＭが、腸管筋神経節および膵臓 の神経節のような神経堤誘導体中でダウンレギュレートされることを示唆してい る。神経堤から誘導された組織におけるＤＳ−ＣＡＭ発現は、臍帯において高レ ベルで検出されるという点についてより興味深い。臍動脈および静脈の周囲の組 織は神経堤から誘導され、生まれた時に生じる心臓血管変化の協調(coordinatin g)において機能する。胎児肝臓および鰓弓において検出される発現も、静脈管、 そして最終的にそれぞれ動脈管および心流出路に関連した神経堤から誘導される ＤＳ−ＣＡＭ発現は、生後、隔壁および下丘のような新生児の脳の分化中の領 域、ならびに成人における嗅球および海馬のような形成性に関連した領域におい て続く。シナプス強度の決定におけるＩｇスーパーファミリーの関与についての 証拠(Mayfordら，Science 256:638-644，1992)と組み合わせた場合、連続した発 現は、再造形、学習および記憶におけるＤＳ−ＣＡＭの役割をサポートするもの である。細胞体維持における樹状結合の発現パターンおよび役割は、ＤＳ脳にお けるＤＳ−ＣＡＭ発現の増大が、一部、ＤＳ固体において生後４ヶ月に観察され る樹枝状構造の異常および腱画の減少の原因であることを示すものである。 ＣＡＭの選択的スプライス改変体は、ＮＣＡＭなどの密接に関連したＩｇ−ス ーパーファミリーメンバーについて示されたように、脳の異なる部分において別 個の役割を有する（Cunninghamら，Science 236:799-806，1987およびFigarella -Brangerら，J ．Neuroathol．Exp．Neurol．51:12-23，1992）。ＤＳ−ＣＡＭ１ （配列番号２）およびＤＳ−ＣＡＭ２（配列番号１１）をコードする選択的スプ ライスＤＳ−ＣＡＭ転写産物の分化発現がヒト成人脳の種々の部分において同様 に観察されている。例えば、ＤＳ−ＣＡＭ２をコードするＤＳ−ＣＡＭクローン は、ＤＳ−ＣＡＭ１と比べて小さい欠失を含むことがわかった。この欠失は膜貫 通ドメインを含むものであり（実施例３および図３）、下流に停止コドン36bpを 生じさせるものである。ＲＴ−ＰＣＲの結果（実施例５）から、種々のヒト組織 由来の試験したＲＮＡはすべてＤＳ−ＣＡＭ１およびＤＳ−ＣＡＭ２転写産物の 両方を発現すること、およびＰＣＲ産物は適切な形に対して予測される配列およ びサイズをもたらすことが示された。欠失の近位境界および遠位境界は隣接エ キソン内に位置しており、Ｕ１スプライソソームＲＮＡに対するさらなる周囲相 同性を有する変異体コンセンサススプライス部位配列（Jackson，Nuc．Acid Res ．19:3795-3798，1991）を明らかにする。 ノーザン分析（実施例４）から、最小限の３つの別個の転写産物が膜貫通ドメ インについてのプローブによって認識される。ｃＤＮＡ配列分析（実施例５）か ら、ＤＳ−ＣＡＭタンパク質の２つの形態が推定され、一つは膜貫通接着分子を 生じさせるものであり、第２のものは膜貫通ドメインが欠失しており、よって細 胞外マトリックスへ輸送される分子を生じさせるものである。ＣＡＭの細胞外体 および膜結合体を生じさせるこの様式は、大部分のＣＡＭによって用いられてい るＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）結合とは驚くほど異なって おり、より広い幅の細胞と細胞外マトリックスとの同種親和性相互作用（これは 細胞移動に対して重要であり得る）を発生させる様式をもたらすものである。 ＤＳ−ＣＡＭ遺伝子は、Ｄ２１Ｓ５５とＭＸ１との間の領域をカバーする21q2 2.2〜q22.3上のＢＡＣコンティーグ（Hubertら，Genomics 41:218-226，1997） を用いることによって単離される（下記の実施例に記載されたとおりである）。 この遺伝子は、オーバーラップしておらず、かつＤＳ−ＣＡＭ遺伝子によってカ バーされているＢＡＣとＰＡＣのサイズを合計することによって概算したところ 、最低限900kbに及ぶ(図１)。ＤＳ−ＣＡＭ遺伝子はこの領域の全ての物理的地 図におけるギャップをカバーする。210kbをカバーするＢＡＣ ２７７Ｇ１０に対 する完全ｃＤＮＡのシグナルを示さないハイブリダイゼーション実験から、5'側 イントロンはＤＣＣ遺伝子の第１のイントロンと同様に少なくともこのサイズで ある（Choら，Genomics 19:525-531，1994）。一方、その他の別の(alternative )転写産物は、このＢＡＣに位置するエキソンを含み得る。この遺伝子は、バン ド21q22.2およびq22.3、それぞれギムザの暗いバンドおよびギムザの明るいバン ドの境界に広がる。PEP19についての遺伝子、すなわち同バンド21q22.2内に大型 イントロンを有する小型の634bp遺伝子（Cabinら，Somat ．Cell Mol．Genet．22 :167-175，1996）の位置は、大型イントロンを有するＧ−バンドにおける遺伝子 の一般構造を示唆するものである。 本明細書に記載された核酸分子は、かかる核酸が当業者に公知の種々のタンパ ク 質発現系に組み込まれた場合、本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質を産生するのに 有用である。さらに、かかる核酸分子またはその断片は、容易に検出できる置換 基で標識することができ、所与の試料中のＤＳ−ＣＡＭ遺伝子またはｍＲＮＡ転 写物の存在および／または量をアッセイするためのハイブリダイゼーションプロ ーブとして使用することができる。また、本明細書に記載された核酸分子および その断片は、本明細書に記載された本発明のタンパク質をコードする遺伝子を増 幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマーおよび／または鋳型としても有用で ある。 「核酸」（ポリヌクレオチドともいう）という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）ま たはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプラ イマーを包含するものである。ＤＮＡは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノ ムＤＮＡ、例えばＤＳ−ＣＡＭタンパク質をコードする遺伝子、のいずれかであ り得る。ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードする核酸を単離する一つの手段は、 当技術分野で周知の方法を用いて、天然または人為的に設計したＤＮＡプローブ により哺乳動物ゲノムライブラリーを調べることである。ＤＳ−ＣＡＭ遺伝子か ら誘導されたＤＮＡプローブはこの目的に特に有用である。ＤＳ−ＣＡＭポリペ プチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を用いることによって哺乳動物（ 例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタなど）またはその他の動物起源か ら相補的ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを取得することができ、あるいは 以下により詳細に記載した方法によってｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをス クリーニングすることによって関連ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するこ とができる。核酸としては、例えば、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードするＲ ＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離されたゲノムＤＮＡが挙げられる。かかる核酸とし ては、限定するものではないが、配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番 号９、配列番号１０、または配列番号１の少なくともヌクレオチド453〜6185若 しくは配列番号１０のヌクレオチド453〜5168に示したものと実質的に同一のヌ クレオチド配列を有する核酸が挙げられ得る。 本明細書および請求の範囲における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタ ンパク質の修飾語としての「単離された」および／または「精製された」という 用語の使用は、そのように指定されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタン パク質が人間の手によってそのような状態で産生されており、したがって、それ らの天然のin vivo細胞環境から分離されているということを意味するものであ る。この人間の介入の結果、本明細書に記載された点で、天然に産生されるよう なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、またはタンパク質ではない本発明の組換えＤ ＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタンパク質は有用である。 本明細書で用いられる場合、「哺乳動物」は、本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク 質が誘導される様々な種、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、サル、ヒヒ 、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなどを意味するものである。本発明において 好ましいＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、ヒトＤＳ−ＣＡＭである。 本発明の一つの実施態様においては、本明細書に開示された本発明のＤＳ−Ｃ ＡＭタンパク質をコードするｃＤＮＡは、配列番号１、配列番号７、配列番号８ 、配列番号９または配列番号１０に示したものと実質的に同一のヌクレオチド配 列を含む。本発明のタンパク質をコードする好ましいｃＤＮＡ分子は、配列番号 １のヌクレオチド453〜6185、または配列番号１０のヌクレオチド453〜5168と同 一のヌクレオチド配列を含む。 本明細書で用いられる場合、「実質的に同一のヌクレオチド配列」という用語 は、中度にストリンジエントな(moderately stringent)ハイブリダイゼーション 条件下で参照ヌクレオチドとハイブリダイズするような参照ポリヌクレオチドに 対して十分な同一性を有するＤＮＡを意味するものである。一つの実施態様にお いては、参照ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するＤＮ Ａは、配列番号２もしくは配列番号１１に示したアミノ酸配列、配列番号７、配 列番号８もしくは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域、配列番号２もしくは配 列番号１１を含むより大きなアミノ酸配列、または配列番号７、配列番号８もし くは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域と実質的に同一のアミノ酸配列をコー ドする。別の実施態様においては、参照ヌクレオチド配列と「実質的に同一のヌ クレオチド配列」を有するＤＮＡは、その参照ヌクレオチド配列と少なくとも60 ％の同一性を有する。参照ヌクレオチド配列と少なくとも70％、より好ましくは 少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％の同一性を有するＤＮＡ が好ましい。 また、本発明は、配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配 列番号１０に示された核酸とは異なるが、同一の表現型を有する核酸も包含する 。また、表現型が類似した核酸は、「機能的に等価な核酸」ともいう。本明細書 で用いられる場合、「機能的に等価な核酸」という語句は、実質的に同一の様式 で機能することによって本明細書に開示された核酸と同一のタンパク質産物を産 生するであろう、軽微な、重要でない配列変化によって特徴付けられる核酸を包 含する。特に、機能的に等価な核酸は、本明細書で開示されたものと同一である か、または保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードし、または配列番 号２もしくは配列番号１１、または配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９ のＤＳ−ＣＡＭコード領域を含むより大きなポリペプチドをコードする。例えば 、保存的変化としては、非極性残基の別の非極性残基による置換、または荷電し た残基の同様に荷電した残基による置換が挙げられる。これらの変化は、タンパ ク質の三次構造を実質的に変更しないものと当業者が認識するものを含む。 さらに、遺伝コードの縮重のために特定のハイブリダイゼーション条件下で本 発明の核酸と必ずしもハイブリダイズしないＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコード する核酸が提供される。本発明のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、配 列番号２もしくは配列番号１１に示されたアミノ酸配列、または配列番号７、配 列番号８もしくは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域と実質的に同一のアミノ 酸配列をコードするヌクレオチドから構成される。 したがって、本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質をコードする具体的な核酸は： （ａ）配列番号２もしくは配列番号１１に示したアミノ酸配列、または配列 番号７、配列番号８もしくは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域をコードする ＤＮＡ、 （ｂ）中度にストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズ するＤＮＡであって、生物学的に活性なＤＳ−ＣＡＭをコードするもの、または （ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）のいずれかに対する縮重ＤＮＡであって、 生物学的に活性なＤＳ−ＣＡＭをコードするもの から選択され得る。 ハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡ中に天然に生ずる結合と同様の、水 素結合による核酸の相補鎖同士の結合（すなわち、センス：アンチセンス鎖また はプローブ：標的ＤＮＡ）を意味するものである。当業者は、所与のプローブを 標的ＤＮＡとハイブリダイズさせるのに用いられるストリンジェントレベルを容 易に変更することができる。 「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、本明細書で用 いられる場合、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味するものである。 当業者には公知のように、ハイブリッドの安定性は該ハイブリッドの融点（Ｔ_m ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温 度との関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、低度にストリ ンジェントな条件下で行われ、次いで様々な、より高度にストリンジェントな条 件下で洗浄する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとの関係はそのよ うな洗浄条件に関係する。 本明細書で用いられる場合、「中度にストリンジェントなハイブリダイゼーシ ョン」という語句は、標的ＤＮＡに、その標的ＤＮＡに対して約60％の同一性、 好ましくは約75％の同一性、より好ましくは約85％の同一性を有する相補的核酸 を結合させる条件を意味するものであり、標的ＤＮＡに対して約90％以上の同一 性を有するものが特に好ましい。好ましくは、中度にストリンジェントな条件は 、50％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、42 ℃でのハイブリダイゼーション、その後の0.2×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、65℃ での洗浄と等価な条件である。 「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、0.018 Ｍ NaCl中、65℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみをハイブリダイ ズさせる条件を意昧するものである（すなわち、本明細書では、ハイブリッドが 0.018Ｍ NaCl中、65℃で安定でない場合、ハイブリッドは高度にストリンジェン トな条件下で安定ではない）。高度にストリンジェントな条件は、例えば、50％ ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、42℃での ハイブリダイゼーション、その後の0.1×ＳＳＰＥ、および0.1％ＳＤＳ中、65℃ での洗浄によって得られ得る。 「低度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、10％ホ ルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、42℃でのハ イブリダイゼーション、その後の１×ＳＳＰＥ、0.2％ＳＤＳ中、50℃での洗浄 と等価な条件を意味するものである。デンハルト溶液およびＳＳＰＥ（例えば、 Sambrookら，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor L aboratory Press，1989を参照されたい）は、その他の適当なハイブリダイゼー ションの緩衝液であるので、当業者には周知である。 本明細書で用いられる場合、「縮重」という用語は、参照核酸、例えば、配列 番号１と少なくとも１つのヌクレオチドが異なるが、該参照核酸と同じアミノ酸 をコードするコドンを意昧するものである。例えば、トリプレット「ＵＣＵ」、 「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」で示されるコドンは、これらの４つの コドンはすべてアミノ酸のセリンをコードするので、互いに縮重である。 本発明のボリペプチドをコードする好ましい核酸は、中度にストリンジェント な条件、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号 ７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０に示された核酸配列の実質的に 全ての配列、または特定の実施態様においては実質的な部分（すなわち、典型的 には少なくとも15〜30ヌクレオチド）にハイブリダイズする。 本発明の核酸は、当技術分野で周知の種々の方法、例えば、本明細書に記載さ れた方法によって、配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配 列番号１０の種々の領域由来のオリゴヌクレオチドプライマーなどを用いるＰＣ Ｒ増幅を使用する等して、産生することができる。 本発明のさらなる実施態様によれば、任意に標識したＤＳ−ＣＡＭ−コードｃ ＤＮＡまたはその断片を用いることによって、新規哺乳動物ＤＳ−ＣＡＭタンパ ク質をコードするさらなる核酸についてライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノ ムなど）を調査することができる。実施例３に記載したように、哺乳動物ｃＤＮ Ａライブラリー、好ましくはヒト第21番三染色体性胎児脳ｃＤＮＡライブラリー の構築は当技術分野においては周知である。そのようなｃＤＮＡライブラリーの スクリーニングは、最初、低度にストリンジェントな条件下（約42℃未満の温度 、約50％未満のホルムアミド濃度、および中〜低塩濃度からなる）で行われる。 現在のところ好ましいプローブに基づくスクリーニング条件は、約37℃の温度 、約20％のホルムアミド濃度、および約５×標準生理的食塩水クエン酸塩（stan dard saline citrate、ＳＳＣ；３Ｍの塩化ナトリウム、0.3Ｍのクエン酸ナトリ ウムを含む20×ＳＳＣ、pH7.0）の塩濃度からなる。このような条件によって、 完全な相同性を要求することなくプローブ配列と実質的な程度の類似性を有する 配列の同定が可能になるであろう。「実質的類似性」という語句は、少なくとも 50％相同性を共有する配列を意味するものである。好ましくは、プローブと少な くとも70％相同性を有する配列を同定することが可能である一方、該プローブと の相同性の程度がより低い配列と区別して扱うことが可能なハイブリダイゼーシ ョン条件が選択される。その結果、配列番号１に示したヌクレオチド453〜6185 、または配列番号１０、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９に示したヌ クレオチド453〜5168と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する核酸が得られ る。 本明細書で用いられる場合、核酸「プローブ」は、配列番号１、配列番号７、 配列番号８、配列番号９または配列番号１０のいずれかに示した連続塩基と同一 である（あるいは相補的である）少なくとも14、少なくとも20、少なくとも50、 少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、または少なく とも500個の連続塩基を含むヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡもしくは ＲＮＡ、またはその類似体である。プローブを構築するのに好ましい領域は、配 列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の5'および ／または3'コード領域を含む。さらに、本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質の全ｃ ＤＮＡコード領域、または配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９ま たは配列番号１０に対応する全配列をプローブとして使用し得る。プローブは、 以下に記載されていうように、当技術分野で公知の方法によって標識され得るも のであり、種々の診断キットにおいて用いられ得る。 本明細書で用いられる場合、その種々の文法的語形における「標識」および「 表示手段」という用語は、検出可能なシグナルの産生に直接的または間接的に関 与する単独の原子および分子を意味するものである。標識または表示手段は、本 発明の核酸プローブ、発現されたタンパク質、ポリペプチド断片、または抗体分 子に連結することができる。これらの原子または分子は、単独で、またはさらな る試薬と組み合わせて用いることができる。そのような標識は、それ自体、臨床 診断化学において周知である。 標識手段は、変性することなく抗体または抗原に化学的に結合して有用な免疫 蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であり得る。免疫 蛍光分析法の説明は、DeLuca，"Immunofluorescence Analysis"，in Antibody A s a Tool，編集Marchalonisら，John Wiley & Sons，Ltd.，pp.189-231(1982)に 記載されており、これは参照により本明細書に含まれるものである。 一つの実施態様においては、表示基は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ ）、グルコースオキシダーゼなどの酵素である。別の実施態様においては、放射 性エレメントが標識剤に用いられる。基質への標識の連結、すなわち核酸、プロ ーブ、抗体、ポリペプチド、およびタンパク質の標識法は、当技術分野において 周知である。例えば、本発明の抗体は、培養培地中で得られる放射性標識アミノ 酸の代謝組込みによって標識することができる。例えば、Galfreら，Meth．Enzy mol.，73:3-46(1981)を参照されたい。活性化官能基によるタンパク質結合また はカップリングの通常の方法が特に適用可能である。例えば、Aurameasら，Scan d．J．Immunol.，8(7):7-23(1978)，Rodwellら，Biotech.，3:889-894(1984)お よび米国特許第4,493,795号を参照されたい。 本発明の別の実施態様によれば、本発明の核酸によってコードされる単離され た哺乳動物ＤＳ−ＣＡＭタンパク質（好ましくはヒト）、ポリペプチドおよびそ の断片が提供される。好ましくは、本明細書において、ＤＳ−ＣＡＭタンパク質 は、配列番号２もしくは配列番号１１に示された配列、または配列番号７、配列 番号８もしくは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域を含むＤＳ−ＣＡＭタンパ ク質も特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるそれらのポリペプチド である。本発明の単離されたＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、通常、天然のin vivo 環境に伴う細胞成分および／または汚染物質を含まない。 本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、さらに、主として胎児脳で発現し、胎児 肺又は胎児肝臓で発現しないことによって特徴付けられる。例えば、ヒト胎児組 織を用いたノーザン分析の結果（実施例４に記載）で示したように、8.5kbおよ び7.6kbの転写物は、胎児脳でのみ発現し、胎児肺、胎児肝臓および胎児腎臓で は発現しない。成人組織のノーザンブロット分析によって、脳の異なる基礎組織 における9.7bp、8.5bpおよび7.6bpの３つのいずれかの転写物の示差的発現が明 らかとなった。9.7kbの転写物は、黒質で高度に発現し、扁桃および海馬で中度 に発現するが、脳全体ではほどんど発現しない。同様のパターンが、ＤＳ−ＣＡ Ｍ−１８およびＤＳ−ＣＡＭ−５２において見られる191bpにわたる欠失をもつ ＰＣＲ産物を用いることにより観察された。胎盤は、かすかなバンドを示し、そ のバンドのサイズは脳のものよりも小さい。骨格筋では、かすかなバンド（6.5b p）が検出される。 ＲＴ−ＰＣＲ（実施例５）の結果によって、胎児および成人脳、胎児腎臓、並 びに乳癌細胞系ｍＲＮＡにおけるヒトＤＳ−ＣＡＭｍＲＮＡの発現が示された。 従って、ＤＳ−ＣＡＭファミリータンパク質をコードするｃＤＮＡ転写物のスプ ライス変異体が本発明によって意図されているのは明らかである。 ＤＳ−ＣＡＭ由来の染色体遺伝子座21p22.2領域は、全前脳症Ｉ型（ＨＰＥ１ ）の候補領域の一部である。さらに、この領域がヘミ接合的に欠失したある忠者 は、脳梁および脳裂の異常をしめす。従って、ＤＳ−ＣＡＭは、欠損、欠失また は重複して存在する場合に全前脳症、脳梁および／または脳の構造欠陥の無発育 の原因となる遺伝子として意図される。さらに、ＤＳ−ＣＡＭは、精神薄弱およ びさらに具体的にはダウン症候群において観察される異常な樹状構造を含むダウ ン症候群のいくつかの表現型の原因ともなる。ＤＳ−ＣＡＭのさらなる役割は、 BLAST X/NおよびTIGRデータベース分析を用いたデータベースホモロジー検索に よってさらに評価された。これらの検索の結果によって、ＤＳ−ＣＡＭがＮ−Ｃ ＡＭ−１に対して（Cunninghamら.,Science，236：799-806，1987）およびＤＣ Ｃに対して（Fearonら.,Science，247：49-56，1990）中程度のホモロジーを示 すことが明らかとなっている。 現在のところ好ましい本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、配列番号２もしく は配列番号１１に示されたタンパク質配列、または配列番号７、配列番号８もし くは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域と実質的に同一であるアミノ酸配列な らびにそれらの生物学的に活性な修飾体を含む。当業者は、上記の配列の多数の 残基をその他の化学的、立体的および／または電子的に類似した残基で得られる 受容体種の生物学的活性を実質的に変更することなく置換することができるとい うことを認識するであろう。さらに、配列番号２もしくは配列番号１１、または 配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域と実質的 に同一の配列を含むより大きな、またはより小さなポリペプチド配列（例えば、 スプライス変異体）もそれに含まれる。 本明細書で用いられる場合、「実質的に同一のアミノ酸配列」という用語は、 参照アミノ酸配列に対して少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、さ らに好ましくは少なくとも約70％の同一性を有し、参照アミノ酸配列によって定 義されるタンパク質に特徴的な同等の機能および生物学的活性を維持するアミノ 酸配列を意昧するものである。本発明の別の実施態様において、好ましくは、「 実質的に同一のアミノ酸配列」を有するタンパク質は、参照アミノ酸配列に対し て少なくとも約80％、より好ましくは90％のアミノ酸同一性を有し、約95％以上 のアミノ酸配列同一性を有することが特に好ましい。しかしながら、スプライス 変異体として生じる記載されたレベルよりも低い配列同一性を含むか、保存的ア ミノ酸置換もしくは縮重コドンの置換によって修飾されたポリペプチド（または 上記では核酸）も本発明の範囲に含まれるものである。 「生物学的に活性な」または「機能的な」という用語が、本明細書で本発明の ＤＳ−ＣＡＭタンパク質またはそのポリペプチド断片の修飾語として用いられる 場合、ＤＳ−ＣＡＭと同様の機能的特性を示すポリペプチドを意味するものであ る。例えば、ＤＳ−ＣＡＭの一つの生物学的活性は、ＤＳ−ＣＡＭに特異的に結 合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生のための免疫原として作 用する能力である。したがって、本発明のＤＳ−ＣＡＭをコードする核酸は、配 列番号２もしくは配列番号１１に示された配列、または配列番号７、配列番号８ もしくは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域を含むＤＳ−ＣＡＭタンパク質も 特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドをコードする。 そのような活性は、当業者に公知のあらゆる方法によってアッセイされ得る。例 えば、ＤＳ−ＣＡＭｃＤＮＡによってコードされる試験ポリペプチドを用いるこ とによって、抗体を産生させることができ、次いで、それらの抗体が、配列番号 ２もしくは配列番号１１に示された配列、または配列番号７、配列番号８もしく は配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコード領域を含むタンパク質と結合する能力につい てアッセイする。抗体が、試験ポリペプチド、および配列番号２もしくは配列番 号１１に示された配列または配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のＤＳ −ＣＡＭコード領域を含むタンパク質と実質的に同一の親和性で結合する場合、 そのポリペプチドは必須の生物学的活性を保有するものである。 本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質は、当技術分野で周知の種々の方法、例えば 、本明細書に記載された方法、本明細書に記載された組換え発現系、沈降、ゲル 濾過、イオン交換、逆相およびアフィニティクロマトグラフィーなどによって単 離することができる。その他の周知の方法は、Deutscherら，Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology Vol．182，(Academic Press，(1990))に 記載されており、これは参照により本明細書に含まれるものである。また、本発 明の単離されたポリペプチドは、例えば、Sambrookら（上記のとおり、1989）に 記載されたような周知の組換え法を用いることにより取得することができる 。 本発明のポリペプチドを調製するための手段としては、例えば、当技術分野で 周知の方法を用いて細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（すなわち、卵母細胞）、 または哺乳動物細胞のような適当な宿主細胞中でＤＳ−ＣＡＭをコードする核酸 を発現させて、再度周知の方法を用いて発現されたポリペプチドを回収すること が挙げられる。本発明のポリペプチドは、下記のような発現ベクターで形質転換 された細胞から直接単離することができる。本発明のポリペプチド、生物学的に 活性な断片、およびその機能的等価物も化学合成によって製造することができる 。例えば、合成ポリペプチドは、Applied Biosystems社のモデル430Aまたは431A 自動ペプチド合成装置（Foster City、カリフォルニア州）を用いて、製造業者 から提供された化学現象を使用することにより製造することができる。 本発明はまた、許容しうる担体と、単離精製ＤＳ−ＣＡＭポリペプチド、その 活性断片、または精製成熟タンパク質およびその活性断片のいずれかを単独で、 あるいは互いに組み合わせて含有する組成物を提供する。これらのポリペプチド またはタンパク質は、組換えによっても誘導可能であるし、化学的に合成するこ とも可能であるし、あるいは天然の供給源から精製することもできる。本明細書 で用いられる場合、「許容しうる担体」とは、リン酸緩衝食塩水、水および油／ 水、または水／油エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに種々のタイプの湿 潤剤などの標準的な医薬担体のいずれをも包含する。 また、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードするｍＲＮＡのいずれかの部分と特 異的に結合して、ｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる配列を有するアンチセン スオリゴヌクレオチドも提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＳ −ＣＡＭポリペプチドをコードするｃＤＮＡの配列のいずれかの部分と特異的に 結合できる配列を有していてもよい。本明細書で用いる場合、「特異的に結合す る」とは、核酸配列が相補的核酸配列を認識して、その相補的塩基対間の水素結 合の形成を介して、それとともに二重らせんセグメントを形成する能力を包含す る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、ヌクレオチドの化学的類似 体を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。 本明細書ではまた、細胞膜を通過し、次いで、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコ ードするｍＲＮＡと特異的に結合して、翻訳を妨げることにより、ＤＳ−ＣＡＭ ポリペプチドの発現を低下させるのに有効な量の前記アンチセンスオリゴヌクレ オチドと、細胞膜を通過することができる、許容しうる疎水性担体とを含んでな る組成物も提供される。適切な疎水性担体は、例えば、米国特許第5,334,761号 ；第4,889,953号；第4,897,355号などに記載されている。細胞膜を通過できる許 容しうる疎水性担体は、また、選択された細胞種に特異的な受容体と結合し、そ れにより選択された細胞種の細胞により取り込まれる構造を含んでいてもよい。 この構造は、細胞種特異的受容体に結合することが知られているタンパク質の一 部であってもよい。 アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、本発明のポリペプチドをコードす るｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有用である。合成オリゴヌクレオチド、または 他のアンチセンス化学構造は、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードするｍＲＮＡ に結合して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計され、組織サンプルにおいて 、または患者においてＤＳ−ＣＡＭに関与する遺伝子の発現を阻害する組成物と して有用である。 本発明のもう１つの実施態様によれば、第21染色体の遺伝子座q22.2における 突然変異、重複、欠失、再配列および異数性を検出するキットは、本発明のプロ ーブまたはアンチセンスヌクレオチドの少なくとも１つを含んでなる。 本発明は、これらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する合成 アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物（以下、ＳＡＯＣ）を使用することによ り、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの発現レベルを調節する手段を提供する。ｍＲＮ Ａを認識して選択的に結合するよう設計された合成オリゴヌクレオチドまたは他 のアンチセンス化学構造は、配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９ または配列番号１０で示されているＤＳ−ＣＡＭコーディング鎖またはヌクレオ チド配列の一部に相補するように構築される。ＳＡＯＣは、注射による患者への 投与のために血流中で安定なように、あるいは実験室での細胞培養条件下で安定 なように設計される。ＳＡＯＣは、例えば小さな疎水性ＳＡＯＣ化学構造を設計 することによって、細胞膜を通過できるようにするＳＡＯＣの物理的、化学的特 性に基づき、あるいはＳＡＯＣを認識して細胞内に輸送する細胞の特異的輸送系 に基づき、細胞の原形質に入るために、細胞膜を通過できるように設計される。 さらに、ＳＡＯＣは、選択細胞集団内だけにＳＡＯＣを結合させ、取り込ませる 特異的な細胞取り込みのメカニズムによって認識されるようにＳＡＯＣを標的化 することにより、特定の選択細胞集団のみに投与するように設計することも可能 である。 例えば、前記のように、特定の細胞種にのみ見られる受容体と結合するよう、 ＳＡＯＣを設計してもよい。また、ＳＡＯＣは、配列番号１、配列番号７、配列 番号８、配列番号９または配列番号１０に示されている配列内に含まれる配列に 相当し得る、標的ｍＲＮＡ配列を認識して選択的に結合するよう設計される。Ｓ ＡＯＣは、標的ｍＲＮＡ配列と結合して、例えば、リボヌクレアーゼＩ分解によ るｍＲＮＡの分解を誘導するか、あるいは、翻訳調節因子、またはリボソームの 結合を妨げたり、リボザイム配列、あるいは標的ｍＲＮＡを分解するか、または 化学的に修飾する反応性化学基などの他の化学構造を包含させたりすることによ って標的ｍＲＮＡ配列の翻訳を阻害するかのいずれかの方法により、標的ｍＲＮ Ａ配列を不活性化するよう設計される。ＳＡＯＣは、ｍＲＮＡ標的に向けられる 場合、かかる特性を持ち得ることが示されている（Cohenら、TIBS，10:435(1989 )およびWeintraub，Sci．American，January(1990)，40頁を参照;双方とも出典 明示して本明細書の一部とみなす）。 本発明のさらにもう１つの実施態様によれば、適切な宿主細胞中で前記核酸配 列を発現させることによる、本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質の組換え体の生産 方法が提供される。本明細書に記載のＤＳ−ＣＡＭタンパク質を生産するのに適 した組換えＤＮＡ発現系は、当該技術分野で十分に公知である。例えば、前記ヌ クレオチド配列を、さらなる操作のためにベクターに組み込むことができる。本 明細書で用いる場合、ベクター（またはプラスミド）とは、それらの発現または 複製のいずれかのため、異種ＤＮＡを細胞に導入するために用いる別個のエレメ ントをいう。 適切な発現ベクターは当該技術分野で十分に公知であり、ＤＮＡの発現を調節 することができるプロモーター領域などの調節配列に作動可能なように連結され たかかるＤＮＡを発現できるベクターを含む。このように、発現ベクターとは、 適当な宿主細胞に導入した際に挿入したＤＮＡが発現するようになる、プラスミ ド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲ ＮＡ構築体をいう。適当な発現ベクターは当業者には十分に公知であり、真核細 胞および／または原核細胞内で複製可能なもの、およびエピソームであるもの、 または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを含む。 本明細書で用いる場合、プロモーター領域とは、それが作動可能なように連結 されているＤＮＡの転写を制御するＤＮＡセグメントをいう。このプロモーター 領域には、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写の開始に十分な特異的 配列が含まれる。さらに、プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼのこの認 識、結合および転写開始活性を調節する配列が含まれる。これらの配列はシス作 用性であってもよいし、またトランス作用性因子に応答するものであってもよい 。プロモーターは調節の性質により、構成的であっても調節的であってもい。本 発明の実施で使用されるプロモーターの例としては、SV40初期プロモーター、サ イトメガロウイルス(CMV)プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)ステロイド 誘導性プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルス(MMLV)プロモーターなど が挙げられる。 本発明で用いる場合、「作動可能なように連結される」とは、プロモーター、 エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列など、調節お よびエフェクターヌクレオチド配列とＤＮＡとの機能的な関係をいう。例えば、 プロモーターへのＤＮＡの作動的連結とは、ＤＮＡとプロモーターの間の物理的 かつ機能的関係であって、かかるＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識し 、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーターから開始されるも のをいう。 本明細書で用いる場合、発現とは、ポリ核酸がｍＲＮＡへと転写され、次いで ペプチドまたはタンパク質へと翻訳され、その後、必要に応じて翻訳後修飾され るといった当業者に公知のプロセスをいう。本発明の核酸がゲノムＤＮＡに由来 する場合、適当な真核宿主細胞または生物を選択すれば、発現はｍＲＮＡのスプ ライシングを含む。 原核細胞形質転換ベクターは当該技術分野で十分に公知であり、pBlueskript およびファージλZAPベクター(Stratagene，San Diego，CA)などを含む。他の適 切なベクターおよびプロモーターは、1989年１月17日公表の米国特許第4,798,88 5号に詳細に記載され、この開示は出典明示してそのまま本発明の一部とみなす 。 大腸菌細胞の形質転換のための他の適切なベクターとしては、pET発現ベクタ ー(Novagen、米国特許第4,952,496号参照のこと）、例えば、T7プロモーター、T 7ターミネーター、誘導性大腸菌lacオペレーターおよびlacレプレッサー遺伝子 を含むpETlla；およびT7プロモーター、T7ターミネーターおよび大腸菌ompT分泌 シグナルを含むpET12a-cが挙げられる。もう１つの適切なベクターとしては、lp pプロモーター、lacUV5プロモーターオペレーター、ompA分泌シグナルおよびlac レプレッサー遺伝子を含むpIN-IIIompA2(Duffaudら，Meth ．InEnzmology，153:4 92-507，1987を参照のこと)がある。 典型的な真核細胞形質転換ベクターには、クローン化ウシパピローマウイルス ゲノム、マウスレトロウイルスのクローン化ゲノム、pSV-2gpt系[Mulliganおよ びBerg，Nature第277巻:108-114(1979)に記載]およびOkayama-Bergクロ ーニング系[Mol．Cell Biol．第2巻:161-170(1982)]などの真核細胞カセット、 ならびにGenetics Instituteにより記載された発現クローニングベクター[Scien ce第228巻:810-815(1985)]が含まれ、形質転換された真核細胞系において目的の タンパク質が少なくともある程度発現するという実質的な保証のあるものが入手 可能である。 本発明のＤＳ−ＣＡＭをコードする、哺乳類細胞のトランスフェクションのた めのＤＮＡと連結できる調節要素を含む特に好ましい基本ベクターは、、pcＤＮ Ａ1(Invitrogen，San Diego，CA)のようなサイトメガロウイルス(CMV)プロモー ターを基本とするベクター、pMAMNeo(Clontech，Palo Alto，CA)およびpMSG(Pha rmacia，Piscataway，NJ)のようなMMTVプロモーターを基本とするベクター、な らびにpSVβ(Clontech，Palo Alto，CA)のようなSV40プロモーターを基本とする ベクターである。 本発明のもう１つの実施態様によれば、本発明の核酸分子（すなわち、ＤＮＡ またはｍＲＮＡ）を含む「組換え細胞」が提供される。適切な宿主細胞、好まし くは細菌細胞、さらに好ましくは大腸菌細胞の形質転換法、ならびに異種タンパ ク質をコードする遺伝子を含む当該細胞の培養に適切な方法は、当該技術分野に おいて一般に知られている。例えば、Sambrookら．，前出（1989）を参照のこと 。 典型的な形質転換法には、例えば、プラスミド、ウイルスまたはバクテリオフ ァージベクターを使用する形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレー ション、リポフェクションなどが含まれる。異種ＤＮＡは場合により、その染色 体外での維持を可能とした配列を含んでもよいし、または（宿主中での安定な維 持を確実にするための別の手段として）当該異種ＤＮＡを宿主のゲノム中に組み 込ませるようにすることもできる。 本発明の実施での使用を意図した宿主生物には、異種タンパク質の組換え生産 を行ってきた生物が含まれる。ＤＮＡを導入する細胞の例としては、哺乳動物起 源の細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞、および当 業者に公知のその他の細胞）、両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル卵母細 胞）、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevis iae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ハンセヌラ・ポリモ ルファ（Hansenula polymorpha）およびP.パストリス（P.pastoris）；例えば、 米国特許第4,882,279号、4,837,148号、4,929,555号および4,855,231号を参照の こと）、細菌（例えば、大腸菌）などが挙げられる。 １つの実施態様では、当該技術分野で十分に公知の適切なウイルスベクターを 用いてin vivoまたはin vitroのいずれかで、本発明のＤＳ−ＣＡＭタンパク質 をコードする核酸を哺乳類細胞中に入れることができる。特にin vivo「遺伝子 治療」法のために設計された適切なレトロウイルスベクターは、例えば国際公開 WO 9205266号およびWO 9214829号に記載されており、それらはin vivoにおいて 核酸をヒト細胞中に効率よく導入する方法を記載している。さらに、本発明のＤ Ｓ−ＣＡＭのin vivoでの発現を制限または減じることを望む場合、本発明の核 酸のアンチセンス鎖の導入が考えられる。 本発明のさらなるもう１つの実施態様によれば、本発明のＤＳ−ＣＡＭポリペ プチドと特異的な反応性を有する抗ＤＳ−ＣＡＭ抗体が提供される。抗体の活性 断片は、「抗体」の定義の範囲内に含められる。抗原として本発明ポリペプチド 、タンパク質またはそれらの一部を用い、当該技術分野で公知の方法によって、 本発明抗体を製造することができる。例えば、ポリクローナルおよびモノクロー ナル抗体は、例えば、出典明示して本明細書の一部とみなすHarlowおよびLane， Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory(1988))に記 載されているような、当該技術分野で十分公知の方法によって製造することがで きる。本発明のポリペプチドは、かかる抗体を生成させる際の免疫原として用い ることができる。別法として、合成ペプチドを（市販の合成装置を用いて）製造 し、免疫原として用いることができる。当該技術分野で十分公知の方法によって アミノ酸配列を解析して、それらが、対応するポリペプチドの疎水性または親水 性ドメインをコードするかどうかを決定することができる。キメラ抗体、ヒト化 抗体、CDRグラフト化抗体、または二機能性抗体などの改変抗体もまた、当該技 術分野で十分公知の方法によって製造できる。かかる抗体はまた、例えばSambro okら，前出（1988）、ならびにHarlowおよびLane,前出（1988） に記載されたハイブリドーマ、化学合成または組換え方法によっても製造できる 。抗ペプチドおよび抗融合タンパク質抗体の双方を用いることができる。(例え ば、Bahouthら，Trends Pharmacol．Sci．12:338(1991);Ausubelら，Current Pr otocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons，NY(1989)）を参照のこ と。これらは出典明示して本明細書の一部とみなす)。 このように製造した抗体は、とりわけ、哺乳類、好ましくはヒトの、組織また は血管内流体などの身体サンプル中に存在するＤＳ−ＣＡＭタンパク質のレベル を検出する診断方法および系に用いることができる。かかる抗体はまた、本発明 のＤＳ−ＣＡＭタンパク質のイムノアフィニティーまたはアフィニティークロマ トグラフィー精製に用いることができる。さらに、本明細書では、細胞の表面上 のＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの存在を検出するための方法であって、細胞を、抗 体がポリペプチドに結合できる条件下で、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドと特異的に 結合する抗体と接触させ、該細胞に結合した抗体の存在を検出し、次いでそれに より、該細胞の表面上の本発明ポリペプチドの存在を検出することを含む方法が 考えられる。かかるポリペプチドの検出に関して、抗体をin vitroでの診断また はin vivoでの画像化法に用いることができる。 サンプル中の標的ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドのin vitroでの検出に有用な免疫 学的方法には、検出可能な抗体を使用するイムノアッセイが含まれる。かかるイ ムノアッセイには、例えば、当該技術分野で十分公知のELISA、Pandexマイクロ フルオリメトリックアッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断 アッセイおよび免疫組織化学染色方法が含まれる。抗体は、当該技術分野で十分 公知の種々の方法によって検出可能なものにすることができる。例えば、検出可 能なマーカーを、直接的にまたは間接的に該抗体に結合することができる。有用 なマーカーには、例えば、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光体、色素原および化 学発光標識が含まれる。 生きている動物、ヒト、またはそれらから単離した生物学的組織もしくは流体 中のＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの活性を調節するために本発明において用いる本 発明の抗ＤＳ−ＣＡＭ抗体が意図される。従って、本発明では、担体、および自 然に生じるリガンドまたは他のCHD結合タンパク質が本発明のＤＳ−ＣＡＭポリ ペプチドに結合するのを阻止するために有効な量の、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチド に対する特異性を有する抗体を含んでなる組成物が意図される。例えば、細胞の 表面上に存在し、配列番号２もしくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、ま たは配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のＤＳ−ＣＡＭコーディング領 域を含むＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有するＤＳ−ＣＡＭポリペプチド分子のエピトープに 対するモノクローナル抗体が、この目的のためには有用であり得る。 本発明はさらに、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードする外来の核酸を発現す ることができる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。本明細書で用い る場合、「外来の核酸」とは、宿主には本来存在しない、または自然環境以外で （例えば、遺伝的に操作されたＤＮＡ構築体の一部として）宿主に存在する核酸 配列をいう。 また、正常な活性がなくなるように変異させた、すなわち天然のＤＳ−ＣＡＭ を発現しない、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードする核酸を発現することがで きる非ヒトトランスジェニック哺乳動物が提供される。本発明はまた、ＤＳ−Ｃ ＡＭポリペプチドをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより、その 翻訳を減少させる、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードするｍＲＮＡと相補的な アンチセンスｍＲＮＡに転写されるように組み込まれた、ＤＳ−ＣＡＭポリペプ チドをコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸を含んでなるゲノムを有する 非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。該核酸はさらに誘導可能なプロ モーターおよび／または組織特異的調節因子を含んでもよく、この結果、発現が 誘導されるか、または特異的な細胞種に限定され得る。核酸の例としては、配列 番号１で示されるコーディング配列と実質的に同一のコーディング配列を有する ＤＮＡまたはｃＤＮＡがある。非ヒトトランスジェニック哺乳動物の例としては 、トランスジェニックマウスがある。組織特異性を決定する因子の例としては、 メタロチオネインプロモーターおよびL7プロモーターがある。 ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの生理学的および挙動的役割を解明する動物モデル 系もまた提供され、それらは、種々の技術を用いてＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの 発現が改変されているトランスジェニック動物を作出することにより作られる。 かかる技術の例としては、トランスジェニック動物を作出するための、マイクロ インジェクション、レトロウイルス感染または当業者に十分公知の他の手段によ るＤＳ−ＣＡＭポリペプチドをコードする正常または変異型核酸の、適切な受精 胚への挿入が挙げられる(例えば、Hoganら，Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，(1986)参照)。 また本発明では、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの発現または構造の調節を改変す るための、トランスジェニック動物における天然の遺伝子座と変異または正常型 のCHD遺伝子の相同組換えの利用が意図される(Capecchiら，Science 244：1288( 1989)；Zimmerら，Nature 338：150(1989)；これらは出典明示して本明細書の一 部とみなす)。相同組換え技術は当該技術分野において十分公知である。相同組 換えにより、天然(内因性)遺伝子と組換えまたは変異遺伝子が置換され、天然( 内因性)タンパク質は発現できないが、例えば変異したタンパク質を発現するこ とができ、結果としてＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの発現が改変された動物が作出 される。 相同組換えと対照的に、マイクロインジェクション法では、宿主の遺伝子を除 去することなく遺伝子を宿主ゲノムに付加する。マイクロインジェクション法に より、内因性および外来性ＤＳ−ＣＡＭタンパク質の双方を発現することのでき るトランスジェニック動物を作出することが可能である。導入遺伝子（transgen e）の発現調節のための手段を提供ため、誘導プロモーターを核酸のコーディン グ領域に連結することが可能である。導入遺伝子の組織特異的発現を可能にする 組織特異的調節因子をコーディング領域に連結することができる。トランスジェ ニック動物モデル系は、タンパク質応答を活性化または阻害する特異的リガンド 、すなわちアゴニストおよびアンタゴニストの同定のための、化合物のin vivo スクリーニングに役立つ。 本発明の核酸、オリゴヌクレオチド(アンチセンスを含む)、これを含むベクタ ー、形質転換宿主細胞、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせ、ならびに本発 明の抗体は、化合物が、本発明のポリペプチドに対する潜在的なアゴニストまた はアンタゴニストとして機能するかどうかを決定するためのin vitroにおける化 合物のスクリーニングに使用することができる。これらのin vitroスクリー ニングアッセイは、本発明のポリペプチドの機能および活性に関する情報を提供 し、これは１種以上のポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質との特異的な相 互作用が可能な化合物の同定および設計につながる。 本発明のさらなるもう１つの実施態様によれば、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドに 結合する化合物の同定方法が提供される。本発明のタンパク質は、競合結合アッ セイに使用してよい。かかるアッセイは、もしあるとすれば、どの化合物がＤＳ −ＣＡＭタンパク質に結合することが可能かを決定するための、多数の化合物の 迅速なスクリーニングを提供することができる。続いて、結合が認められたそれ らの化合物を用いてより詳細なアッセイを行い、さらにかかる化合物が本発明の タンパク質のモジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニストとして働くかど うか決定することができる。 本発明の結合アッセイの他の用途としては、ＤＳ−ＣＡＭの有無に関する試験 サンプル（例えば、生物学的溶液）のアッセイがある。すなわち、例えば、ＤＳ −ＣＡＭの過剰なまたは不十分な産生に関係すると考えられる症状を示す患者に 由来する血清をアッセイして、観察された症状が実際にＤＳ−ＣＡＭの過剰なま たは不十分な産生により引き起こされているかどうかを決定することができる。 本発明のもう１つの実施態様では、本発明のＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの活性 を調節する化合物の同定のためのバイオアッセイが提供される。この方法によれ ば、本発明のポリペプチドを「未知の」または試験物質と(アンタゴニスト活性 が試験されている場合には、レポーター遺伝子構築体の存在下で)接触させ、「 未知の」または試験物質との接触に引き続いてポリペプチドの活性をモニターし 、レポーター遺伝子構築体を発現させるそれらの物質をＤＳ−ＣＡＭポリペプチ ドの機能的リガンドとして同定する。 本発明のもう１つの実施態様では、組換えにより本発明のポリペプチドを発現 する形質転換宿主細胞を試験化合物と接触させることができ、次いで試験化合物 の存在下または不存在下での、ＤＳ−ＣＡＭ介在応答(例えば、レポーター遺伝 子発現を介して)の比較、または試験細胞または対照細胞(すなわち、ＤＳ−ＣＡ Ｍポリペプチドを発現しない細胞)の、化合物の存在に対する応答の比較により 、それらの調節作用を評価することができる。 本明細書で用いる場合、本発明のポリペプチドの「活性を調節する」化合物ま たはシグナルとは、ＤＳ−ＣＡＭポリペプチドの活性を変える化合物またはシグ ナルであって、その結果、化合物またはシグナル存在下と不存在下では本発明の ポリペプチドの活性が異なるものをいう。特に、かかる化合物またはシグナルは アゴニストおよびアンタゴニストを含む。アゴニストは、ＤＳ−ＣＡＭタンパク 質の発現を活性化する化合物またはシグナルを包含する。また、アンタゴニスト はＤＳ−ＣＡＭタンパク質の発現を妨害する化合物またはシグナルを包含する。 典型的には、アンタゴニストの効果は、アゴニストにより誘導されたタンパク質 の活性化のブロッキングとして観察される。アンタゴニストは競合的および非競 合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト(または競合的ブロッカー)は アゴニスト結合に特異的な部位またはその近傍と相互作用する。非競合的アンタ ゴニストまたはブロッカーはアゴニスト相互作用部位以外の部位と相互作用する ことによりポリペプチドの機能を不活性化する。 当業者に理解されているように、ＤＳ−ＣＡＭ活性を調節する化合物の同定の ためのアッセイ方法は、一般に対照との比較が必要である。「対照」の１つのタ イプとしては、化合物に曝露される試験細胞または試験培養物と実質的に同じ処 理をされる細胞または培養物であり、「対照」細胞または培養物は化合物に曝さ れないという違いを有する。例えば、電位固定（clamp）電気生理学的手段を用 いる方法においては、ただ細胞を懸濁する外部溶液を変えるだけで、化合物の存 在下または不存在下で同じ細胞を用いて試験することができる。もう１つのタイ プの「対照」細胞または培養物は、「対照」細胞または培養物は天然タンパク質 を発現しないこと以外は、トランスフェクトされた細胞と同じ細胞または培養物 であってよい。従って、化合物に対するトランスフェクトされた細胞の応答は、 「対照」細胞または培養物の、同反応条件下での同じ化合物に対する応答(また はその欠如)と比較される。 CAMが細胞外リガンドと相互作用することは周知であるので、本発明のDS-CAM タンパク質は細胞外リガンドと相互作用すると考えられる。本発明の別の実施形 態においては、本発明のDS-CAMタンパク質が他のCAMと協力してまたは競合して 特異的に作用することが意図される。したがって、本発明は、本発明のDS-CAMタ ンパク質のリガンドを同定するための種々のバイオアッセイを包含する。さらに 、本発明は、結果的に生じる表現型を評価するための、正常なまたは欠陥のある 本発明DS-CAMを当技術分野で公知の他のCAMと共に発生中に同時発現させること の効果を測定するアッセイを包含する。 本発明の一実施形態では、被験化合物がアゴニストとして作用することができ るか否かを評価するためのバイオアッセイが提供され、前記アッセイは、 (a)１以上のDS-CAMタンパク質またはその機能性改変体を発現するＤＮＡ、お よびDS-CAM応答性の転写エレメントに機能しうる形で連結されたリポータータン パク質をコードするＤＮＡを含有する細胞を培養し、 その際、前記培養を行うにあたって、DS-CAMタンパク質のシグナル伝達活性を 誘導する能力を測定しようとする少なくとも１つの化合物を存在させ、その後 (b)前記リポータータンパク質の発現について前記細胞をモニターする、 ことを含んでなる。 本発明の別の実施形態では、被験化合物が本発明のDS-CAMタンパク質またはDS -CAMタンパク質の機能性改変体のアンタゴニストとして作用することができるか 否かを評価するためのバイオアッセイが提供され、前記アッセイは、 (a)１以上のDS-CAMタンパク質またはその機能性改変体を発現するＤＮＡ、お よびDS-CAM応答性の転写エレメントに機能しうる形で連結されたリポータータン パク質をコードするＤＮＡを含有する細胞を培養し、 その際、前記培養を行うにあたって、DS-CAMタンパク質のシグナル伝達活性を 抑制する能力を測定しようとする少なくとも１つの化合物を次第に濃度を増加さ せて存在させ、かつDS-CAMタンパク質またはその機能性改変体の少なくとも１つ のアゴニストを一定の濃度で存在させ、その後 (b)前記細胞において、前記化合物の濃度の関数として前記リポータータンパ ク質の発現レベルをモニターし、それによりシグナル伝達活性を抑制する前記化 合物の能力が示される、 ことを含んでなる。 アンタゴニストについての上記バイオアッセイのステップ(a)においては、前 記培養を行うにあたって、DS-CAMタンパク質のシグナル伝達活性を抑制する能力 を測定しようとする少なくとも１つの化合物を一定の濃度で存在させ、そしてDS -CAMタンパク質またはその機能性改変体の少なくとも１つのアゴニストを次第に 濃度を増加させて存在させてもよい。 本発明のさらに別の実施形態では、本発明のDS-CAMタンパク質はアデニル酸シ クラーゼのモジュレーションを介してシグナル伝達を媒介することが意図される 。例えば、DS-CAMリガンドがDS-CAMに結合すると、アデニル酸シクラーゼが細胞 内cAMPのレベルを上昇させる。したがって、本発明の一実施形態においては、被 験化合物がアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができるか否か を評価するバイオアッセイは、 (a)１以上のDS-CAMタンパク質またはその機能性改変体を発現するＤＮＡを含 有する細胞を培養し、 その際、前記培養を行うにあたって、DS-CAMタンパク質のシグナル伝達活性を モジュレートする能力を測定しようとする少なくとも１つの化合物を存在させ、 その後 (b)細胞内cAMPのレベルの上昇または低下について前記細胞をモニターする、 ことを含んでなる。 ここに記載する結合アッセイにおいて、細胞内cAMPのレベルを測定するかまた はシクラーゼ活性を測定する当技術分野で公知の方法を用いて、DS-CAMのアゴニ ストまたはアンタゴニストを同定することができる。例えば、いくつかのCAMの 活性化はcAMPの低下または増加をもたらすので、細胞内cAMPレベルを測定するア ッセイを用いて、哺乳動物宿主細胞において発現された組換え体DS-CAMを評価す ることができる。 本明細書中で用いる「DS-CAMタンパク質のシグナル伝達活性をモジュレートす る能力」とは、DS-CAMタンパク質のシグナル伝達活性を誘導する（アゴニスト） または抑制する（アンタゴニスト）いずれかの能力を有する化合物をさす。 本発明のバイオアッセイ（例えば、ここに記載するアッセイや同等のアッセイ ）のそれぞれは、本発明のDS-CAMと共に、当技術分野で知られたCAM免疫グロブ リンスーパーファミリーの１以上のメンバーを同時発現させることにより競合ア ッセイとして実施することができる。さらに、当技術分野で知られたCAM免疫グ ロブリンスーパーファミリーの１以上のメンバー（例えば、N-CAM）を本発明のD S-CAMと共に同時発現させて、本発明のDS-CAMと協力して作用する非DS-CAMメン バーのシグナル伝達に対するアゴニストまたはアンタゴニスト効果を評価するこ とができる。 本発明のさらに別の実施形態においては、DS-CAMポリペプチドを上記のバイオ アッセイで同定された少なくとも１つの化合物の有効量と接触させることで、前 記ポリペプチドの活性化をモジュレートすることができる。 免疫グロブリンのN-CAMスーパーファミリーのメンバーは疾病に関与している 。例えば、N-CAMレベルのさまざまな変化が成人病、発生欠損および中毒症状に おいて見られる。多発性硬化症患者の脳脊髄液中のN-CAMレベルの増加は臨床的 改善と一致することが観察されている(Massaroら，Ital．J．Neurol．Sci．Supp l．6:85-88，1987)。神経管欠損の胎児をみごもっている母親の羊水中のN-CAMの レベルは上昇することが報告されている(Ibsenら，J．Neurochem．41:363-366， 1983)。多くのこうした欠損は遺伝的欠損というよりもメカニカルな異常のため であると思われるので、これらの結果を確認することで出生前検査の新しい診断 成分が提供されるだろう。別の刺激的な知見は、鉛によるゴルジ体シアリルトラ ンスフェラーゼの刺激についての観察に関するものである(Breen and Regan，De velopment 104:147-154，1988;およびCookmanら，J．Neurochem．49:399-403，1 987)。塩化鉛にさらすと、生後16日から30日までシアリルトランスフェラーゼが 著しく刺激された。この時期はN-CAMが通常あまりシアリル化されない時期と一 致している。したがって、重大な発生時期に鉛に暴露されると、より高度にシア リル化された、接着性のより低いN-CAMが生じるだろう。E-A変換のこの阻止は神 経の発達に重大な影響を及ぼすだろう。E-A変換それ自体は、突然変異旋回病(st aggerer)マウス(Edelman and Chuong，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79:7036-7 042，1982)では該突然変異と関連した結合性の変化と結びついて、遅れる ことが見出された。 ダウン症(DS)表現型におけるDS-CAMの位置および発現は、部分的21トリソミー 患者の研究により支持される。典型的な容貌と精神遅滞を含めて、DSの特徴のサ ブセットはバンド21q22のみの重複により出現した(Niebuhr，Humangenetik 21:9 9-101，1974)。他の研究は、これらの特徴および先天性心疾患を領域21q22.2-q2 2.3に、そしてDS-CAMを含む約4Mbの領域であるD21S267とMX1/MX2の間(Korenberg ら，Am．J．Hum．Genet．50:294-302，1992およびKorenbergら，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，91:4997-5001，1994)にマップした。DSのTs65DnマウスモデルはD S-CAMを含むMMU16の領域(Pgk1-ps1からMX1/2)を含有し、DSの神経行動的特徴の 一部を明らかにした(Reevesら，Nature Genet．11:177-183，1995およびHoltzma nら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，93:13333-13338，1996)。 DS個体の6%近くがヒルシュスプルング病(Hirschsprung's disease:HSCR)を有 し(Garverら，Clin．Genet．28:503-508，1985)、全HSCRの10%以上がDSと関連し ている(Passarge，New Eng．J．Med.，276:138-143，1967)。染色体21q22上のHS CRの改変遺伝子領域(D21S259-D21S156)が非DS HSCRにおいて報告された(Puffenb ergerら，Hum．Mol．Genet．3:1217-1225，1994)。DS-CAM遺伝子はこの小さな領 域内にマップされる。ガットの神経冠由来腸神経叢におけるDS-CAMの発現がin s ituハイブリダイゼーションによりマウス組織で検出された（実施例７）。神経 細胞接着分子としてのDS-CAMタンパク質の機能および第21染色体のこの領域とHS CRとの関連は、DS-CAMがこの領域に集まっている頭蓋の神経冠の移動においてあ る役割を果たしていることを示す。したがって、DS-CAMの過剰発現は、非DS HSC Rにおいては第21染色体対合に、そしてDSにおいてはHSCRに関与している。 N-CAMよりもDS-CAMに類似している分子である（図４）、CAM-L1の突然変異は ヒト疾患において確立された役割を有している。これはＸ連鎖性水頭症(Rosenth alら，Nature Genet．2:107-112，1992)、１型Ｘ連鎖性痙性対麻痺およびMASA症 候群（精神遅滞、失語症、足を引きずる歩行、内転した母指、および脳梁の非形 成を伴う）(Jouetら，Nature Genet．7:402-407，1994)をもたらす。CAM-L1の異 数体発現による発生の混乱は、発生および神経異常の原因としての DS-CAMの異数体発現の役割を支持する。 本発明の別の実施形態によれば、DS-CAM関連疾患（例えば、精神遅滞、全前脳 症、脳梁の非形成、または脳裂）の診断方法が提供され、前記方法は、前記被験 者において、配列番号１もしくは配列番号10、またはその断片を含むゲノムまた は転写ｍＲＮＡを検出する、ことを含んでなる。 好ましくは、本発明の診断方法により検出されるDS-CAM核酸は、ある形の突然 変異（例えば、点突然変異、欠失など）を起こしているか、あるいは健康な個体 におけるDS-CAMの発現レベルと比べて過剰に発現されている。 本発明の別の実施形態によれば、適当なパッケージ材料中に少なくとも１つの 本発明核酸を含んでなる、好ましくはキットの形をした、診断系が提供される。 診断用の核酸は本明細書に記載するDS-CAMコード核酸から誘導される。一実施形 態において、例えば、診断用の核酸は配列番号１、配列番号７、配列番号８、配 列番号９または配列番号10に由来するものである。本発明の診断系はゲノムＤＮ ＡまたはDS-CAMをコードする転写された核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）中 のDS-CAMコード核酸の有無をアッセイするのに有用である。 適当な診断系は、少なくとも１回のアッセイに十分な量の少なくとも１種の本 発明核酸、好ましくは２種以上の本発明核酸を、別個にパッケージされた化学的 試薬として含む。典型的にはパッケージされた試薬の使用説明書も添付される。 当業者であれば、本発明の核酸プローブおよび／またはプライマーを、ここに記 載した本発明の方法を実施するのに適したバッファーおよび溶液と組み合わせて キットに組み入れることは容易であろう。 本明細書で用いる「パッケージ材料」とは、本発明の核酸プローブまたはプラ イマーなどのキットの内容物を収容するために使用される１以上の物理的構造体 をいう。パッケージ材料は公知の方法で作製され、無菌で混入物のない環境を提 供することが好ましい。パッケージ材料にはラベルを貼って、配列番号１、配列 番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号10に示したヌクレオチド配列を 含むDS-CAMをコードする特定の配列を検出して、全前脳症、脳梁の非形成、また はダウン症のいくつかの表現型（精神遅滞などの）の存在または素因を診断する ために本発明の核酸を使用できることを表示する。さらに、パッケージ材料は、 特定の配列を検出して、全前脳症、脳梁の非形成、またはダウン症のいくつかの 表現型（精神遅滞などの）の存在または素因を診断するためにキット内の物質を どのように使用するかを示す説明書を含む。 診断系に関係して用いられるパッケージ材料は、核酸をベースとした診断系に おいて常用されているものである。本明細書中で用いる「パッケージ」とは、本 発明の単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはプライマーを一定の範囲内に 保持することができるガラス、プラスチック、紙、フォイルなどの固体マトリッ クスまたは材料をさす。したがって、パッケージはミリグラム量の意図した核酸 、オリゴヌクレオチドまたはプライマーを入れるために用いるガラスバイアルで あってもよいし、ミリグラム量の意図した核酸プローブを機能しうるように付着 させたマイクロタイタープレートであってもよい。 「使用説明書」は典型的には、試薬の濃度または少なくとも１つのアッセイ法 パラメーター、例えば混合すべき試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合 物の保持時間、温度、バッファー条件などを記載する明確な表現を含む。 本明細書中に記載した米国特許および刊行物はすべて、参照することでその全 体をここに組み入れる。以下の非限定的実施例を参照することにより本発明をよ り詳細に説明することにする。材料および方法 特に断らない限り、本発明は、例えば、Maniatisら，Molecular Cloning:A La boratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，New York，USA(1982);Sambrookら、前掲(1989);Devisら、Basic Methods in M olecular Biology ，Elsevier Science Publishlng，Inc.，New York，USA(1986) ;またはMethods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques第152 巻，Ｓ．Ｌ．BergerおよびＡ．Ｒ．Kimmerl編，Academic Press Inc.，San Dieg o，USA(1987)に記載の標準法を用いて行われる。 ライブラリー。 細菌性人工染色体（BAC）ライブラリの構築：トータルヒトゲノムDNAのBACラ イブラリの構築は、ShizuyaらのProc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:8794-8797，(1 992)、およびHubertらのGenomics 41:218-226(1997)に記載されたように行った 。酵母人工染色体(YAC)クローンは、CEPH mega-YACライブラリーから得、標準条 件の下で増殖させた(Cohenら，Nature 366:689-701(1993))。 P1人工染色体(PAC)ライブラリーの構築：RPCI-1と称する3XヒトPACライブラリ ー(Ioannouら，Hum ．Genet．219-220(1994))を記載のように(Ioannouら，Nat ．G enet ．6:84-89(1994))構築した。ライブラリーは384ウェルディッシュに並べた 。次いで、ベクタープライマーを用いてクローンの配列を決定することにより形 成されたSTSを、PACライブラリーのグリッド化(gridded)コロニーフィルターに 対するハイブリダイゼーションプローブとして用いた。 YACDNAの調製：YACクローンは選択培地で増殖させ、ペレットとし、3mlの0.9 Ｍソルビトール、0.1Ｍ EDTA ｐＨ7.5に再懸濁させ、次いで、100Ｕのリトカー ゼ(Sigma、ミズーリ州セントルイス)とともに37℃にて１時間インキュベートし た。5,000rpmにて５分間の遠心分離の後、ペレットを3mlの50ｍＭトリスｐＨ7.4 5，20ｍＭ EDTAに再懸濁させ、0.3mlの10％SDSを加え、混合物を65℃にて30分間 インキュベートした。１mlの5Ｍ酢酸カリウムを加え、チューブを１時間氷上に 放置し、次いで、10,OO0rpmにて10分間遠心分離した。上清を２倍容量のエタノ ール中に沈殿させ、6,00Orpmにて15分間でペレットとした。ペ レットをＴＥに再懸濁させ、ＲＮアーゼで処理し、次いで、フェノール-クロロ ホルムで再抽出した。 蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)による分析：PACまたはBACクロー ンを、BioNick Labeling Kit(Gibco-BRL)を用いて、ビオチン-14-dATPの存在下 でのニックトランスレーションによりビオチン化した。FISHは、本質的には記載 の方法と同様にして行った(Korenbergら，Cytogenet Cell Genet．69:196-200(1 995))。簡単に述べると、プローブ中の反復性のヒト配列ならびに酵母配列から 生じる可能性があるバックグラウンドを抑えるために、400ngのプローブＤＮＡ と8ngのヒトCot1 ＤＮＡ(Glbco-BRL)および2μｇの超音波処理したサケ精子ＤＮ Ａとを混合した。このプローブを75℃で変性させ、37℃にて１時間、予備アニー リングし、正常な雄リンパ球から調製した変性染色体スライドにアプライした(K orenbergら，前掲(1995))。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、40℃で2X SSC/ 50％ホルムアミド中にて行い、次いで、50℃で1X SSC中で行った。ハイブリダイ ズしたＤＮＡは、アビジン結合蛍光イソチオシアネート(Vector Laboratories) を用いて検出した。ビオチン化した抗アビジンを用いることにより、増幅を１回 行った。染色体のサブバンドを正確に識別するために、リバースバンディング法 (reverse banding technique)を用いたが、これはクロモマイシンA3およびジス タマイシンＡの二重染色によって達成された(Korenbergら，前掲（1995）)。Pho tometrics Cooled-CCDカメラとBDS画像解析ソフトウェア(Oncor Imaging，Inc.) を用いることにより、カラー画像を取り込んだ。 サザンブロット分析：ＤＮＡのゲル電気泳動は、1X TBE中の0.8％アガロース ゲルで行った。核酸のNybond Ｎ+ナイロン膜(Amersham)への転移は、製造業者の 説明書に従い行った。プローブはRadPrim Labeling System(BRL)を用いて標識し た。50％ホルムアミド、5X SSPE、5X Denhardt's 0.1％ SDS、100mg/mlの変性サ ケ精子ＤＮＡ中で、42℃にて16時間で、ハイブリダイゼーションを行った。この フィルターを1X SSC、0.1％ SDS中、室温で20分間１回洗浄し、0.1X SSC、0.1％ SDS中、65℃にて20分間ずつ２回洗浄した。このブロットをＸ線フィルム(Kodak ，X-OMAT-AR)に露光した。 PACおよびBACエンドクローンの配列決定：PACクローンは、500mlのLB/ カナマイシン中へ接種して一晩増殖させ、BACクローンは、500mlのLB/クロラム フェニコール中へ接種して一晩増殖させた。ＤＮＡは、QIAGENカラムを用いてフ ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの１回抽出、次いで、クロロホ ルム／イソアミルアルコールの１回抽出を用いる販売業者のプロトコールに従い 、単離した。標準T7およびSP6プライマーを用いるGibco-BRLサイクルシーケンシ ングキットを用い、クローンを配列決定した。 実施例１ BAC コンティグの構築 遺伝子単離およびD21S55からMX1領域における配列決定イニシアチブのための 安定したクローンを得るため、細菌性人工染色体(BAC)およびP1人工染色体(PAC) を用いてコンティグを構築した。全ヒトゲノムＤＮＡのBACライブラリーの構築 は、Shizuyaらの前掲(1992)；KimらのGenomics 34:213-218(1996)に記載のよう にして行った。BACライブラリーは、その領域にかかるいくつかのYACを用いてス クリーニングし；PACライブラリー（Iannouら、Nature Genet ．6:84-89(1994)） は、放射性標識STS PCR産物およびギャップ・フィリング・イニシアチブにおけ る全BACを用いてスクリーニングした。 これらBACおよびPACクローンの位置は、蛍光in situハイブリダイゼーション( FISH)により確認した。35の既存のSTSとともに（BACおよびPAC末端の直接配列決 定から生じた）24の新しいSTSを用いるクローン間のサザン分析を用いると、BAC およびPAC間の重複が示された。BACおよびPACにおいてカバーされる間隔にわた るSTS密度は、60kbごとにSTS１個であり、クローンの79％が2個以上のSTSを有し ていた。およそ3.5Mbの4-5Mb D21S55からMX1までの間隔は、85個のBACおよび25 個のPACにおいてカバーされ、これはコンティグ内の4倍のカバー範囲に相当する （Hubertら、Genomics 41:218-226，1997）。 非重複クローンのみを計数することにより求めた最小のコンティグサイズは：１ 100kb、900kb、510kb、380kbおよび270kbである。BACクローンの挿入物のサイズ は、ＤＮＡをNotIで消化した後、パルスフィールドゲル電気泳動を行うことによ り測定した。 実施例２ 直接的ｃＤＮＡ選択 21トリソミーヒト胎児脳由来ｃＤＮＡを用いて改変した直接ｃＤＮＡ選択技術 （Yamakawaら、Hum ．Mol．Genet．4:709-716，1995;Yamakawaら、Cytogenet ．Ce ll Genet． 74:140-145，1996）をBAC−423A5、BAC−430F1、BAC−628H2、BAC−3 71H8およびPAC-31P10（図1）に適用し、つぎに選択した断片をプラスミドベクタ ーにサブクローン化した。 全ＲＮＡはTRI領域（商標）（Molecular Research Center Inc.）を用いて、1 4週齢21トリソミー胎児脳から単離した。ポリ(A)⁺ＲＮＡはポリ(A)Quick（登録 商標）ｍＲＮＡ単離キット(STRATAGENE)を用いて単離した。二本鎖ｃＤＮＡはSu perScript(商標）選択システム(GIBCO BRL)を用いて、1μｇのオリゴ(dT)₁₅また は0.1μｇのランダムヘキサマーを用いる5μｇの21トリソミー胎児脳ポリ(A)⁺Ｒ ＮＡから合成した。全合成反応物はGene Clean（登録商標）IIキット(BIO101,In c.)により精製し、次いでキナーゼを作用させた。Sau3AIリンカーを、その後Sau 3AIで消化されるｃＤＮＡに結合させた。この反応物をGene Cleanを用いて精製 した。MboIリンカーはｃＤＮＡに結合させ、この反応物をGene Clean(Morganら 、前掲(1992))により精製した。この合成産物を、プライマーとして一本鎖のMbo Iリンカー(5'CCTGATGCTCGAGTGAATTC3')（配列番号4）を用い、PCRにより増幅さ せた。PCRサイクル条件は100μｌの1xPCR緩衝液(Promega)、3ｍＭ MgCl₂、5.0単 位のTaqポリメラーゼ(Promega)、2μＭプライマーおよび0.2ｍＭ dNTP中におい て、94℃／15秒、60℃／23秒、72℃／2分の40サイクルであった。 領域ETS2およびMX1間の19のBAC ＤＮＡ（総量2.5μｇ）および２のPAC ＤＮＡ は、QIAGENプラスミドキットを用いて調製し、ニックトランスレーションキット およびビオチン-16-dUTP(Boehringer Manneheim)を用いて、ビオチン化した。3 μｇの熱変性させたPCR増幅ｃＤＮＡは、100μｌハイブリダイゼーション緩衝液 (750ｍＭ NaCl、50ｍＭ NaPO₄(pH7.2)、5ｍＭ EDTA、5x Denhardt's、0.05％ SD Sおよび50％ホルムアミド)中、42℃にて2時間3μｇの熱変性Ｃ OT1 ＤＮＡ(BRL)とアニーリングした。プレハイブリダイゼーション後、1.2μｇ の熱変性ビオチン化BAC ＤＮＡを添加し、16時間42℃にてインキュベートした。 ｃＤＮＡ-BAC ＤＮＡハイブリッドをEtOHで沈殿させ、60μｌの10ｍＭトリス塩 酸(ｐＨ8.0)、１ｍＭ EDTA中に溶解した。40μｌの5M NaClの添加後、ＤＮＡを 磁気ビーズ(Dynabeads M-280、Dynal)とともに1時間25℃にて緩やかに回転させ ながらインキュベートし、ＤＮＡを磁気ビーズへ付着させた。次いでこのビーズ を400μｌの2x SSC中でピペッティングし、30秒間磁気ホルダー(MPC-E（商標） 、Dynal)に保持し、上清を除去することにより2回洗浄した。さらに0.2x SSC中 で10分間68℃にて4回洗浄し、洗浄のたびにそのビーズを新しいチューブへ移し た。ｃＤＮＡは時々攪拌しながら10分間80℃にて100μｌの蒸留水に溶出させた 。溶出したｃＤＮＡは前記のようにPCRにより増幅させた。磁気ビーズを用いる 選択手順を2回繰り返した後、増幅させたｃＤＮＡをEcoRＩで消化し、さらにpBl ueScriptKS+（STRATAGENE）へとサブクローニングした。このサブクローンから 挿入DNAを単離し、サザンハイブリダイゼーションおよびDNA配列決定によりこれ を分析した。 ETS2およびMX1間の19のBACおよび2のPACを用いた直接ｃＤＮＡ選択法により、 合計145のユニークｃＤＮＡ断片が生じた。FASTAを用いたGenbankおよびTIGR相 同性検索により、ETS2、HMG14、PEP19、Na K ATPアーゼ、Titan EST、MX1領域ES T、および未知の機能を持つ14のESTとの一致が明らかになった。妊娠14週におけ る21トリソミー胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーは、「ES1」（配列番号：３ ）とラベルしたこれらのユニークｃＤＮＡ断片の１つを用いてスクリーニングし た。 実施例３ ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを用いたヒトDS-CAM ｃＤＮＡの単離 21トリソミーヒト胎児脳（14週齢）ｃＤＮＡライブラリーは一方向性ｃＤＮＡ ライブラリーをもたらすZAP-c ＤＮＡ（登録商標）合成キット(STRATAGENE)を用 いて構築された。簡単に述べると、5-メチルdCTPを有するハイブリッドオリゴ(d T)-XhoＩリンカープライマーを用いて、５μｇの21トリソミー胎児脳ポ リ(A)⁺ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。EcoRＩリンカーをｃＤＮＡと結合 させ、続いてEcoRＩおよびXhoＩで消化し、その後UNI-ZAP XRベクター（STRATAG ENE）にクローン化した。このライブラリーはGigapack（登録商標）IIGoldパッ ケージング抽出物を用いてパッケージングした。原ライブラリーの力価は1.1×1 0⁶p.f.u.／パッケージであった。このライブラリーを1回増幅させた。ブルー・ ホワイトカラーアッセイは99％のクローンが挿入断片を有することを示した。 上記の通り調製し「E51」（配列番号３）と表示した145個のユニークｃＤＮＡ 断片の１個を使って、21トリソミー胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン グを実施した。ファージを175cm²プレート当たり１×10⁵の平均密度でまいた。 ２通りのナイロン膜（Hybond-N+;Amersham）を使い、20プレートのプラークリフ ト（２×10⁶ファージ）を行った。ハイブリダイズした膜を0.2X SSC、0.IX SDS の最終ストリンジェンシーまで65℃で洗浄した。フィルターを一夜、Ｘ線フィル ムに感光した。 元のライブラリー中の２×10⁶クローンから62クローンを同定した。これらの 陽性ファージクローンのうち18個をプラスミドに変換し、それらのＤＮＡを単離 した。これらのｃＤＮＡは、別々のDS-CAM（ダウン症細胞接着分子；Down Syndr ome Cell Adhesion Molecle）クローンとして独立に番号を付した。これらクロ ーンのインサートの長さは、2.4kb〜6.6kbの範囲にあった。BACおよびPACコンテ ィグ中のｃＤＮＡを単離するために、エキソントラッピング（Bucklerら，Proc ．Natl．Acad．Sci． USA 88:4005-4009，1991;Churchら，Nature Genet．6:98-1 05，1994）も使った。この手法で、BAC-539E7から同定した3つのエキソンとBAC- 430F1からの一つは、ｃＤＮＡ選別により単離したものと同じ配列を同定するこ とが見出された。 DS-CAM-42と表示したクローンの1つの配列分析は、大きいORF（5687bp）並び に3'-UTR配列（423bp）を有する6110bpのＤＮＡ配列を示したが、5'-UTRおよび 開始コドンはクローンDS-CAM-42中に見付からなかった。5'末端を特性決定する ために、更に2つのクローン、6.5kbのDS-CAM-18および6.6kbのDS-CAM-52を特性 決定した。これらのクローンの5'末端に近接した配列分析は、DS-CAM-42の5'末 端配列とオーバーラップした。しかし、DS-CAM-42より、DS-CAM-18は5'側で416k bさらに伸長し、DS-CAM-52は5'側で494bpさらに伸長している。余分の494bp配列 はORFを5'末端で43bpだけ伸長し、また開始コドンを含有した。2つの停止コドン が開始コドンの330bpおよび427bp上流に存在する。DS-CAM-52に存在する494bpの 追加5'配列とDS-CAM-42の結合（6604bp）により、DS-CAM1と表示した本発明タン パク質のアイソフォームの1つをコードするコンセンサスｃＤＮＡが生じる。DS- CAM1 ｃＤＮＡは、452kbの5'-UTRと422bpの3'-UTRにより挟まれた、1910アミノ 酸タンパク質（配列番号２；およそ211キロダルトン）をコードする5730bp（配 列番号１）のオープンリーディングフレームを含有する。該5'-UTRは、高度にGC 含有量が高く（452bp中、GC81%）、13個のMsp1部位並びに72個のCGおよび93個の GCジヌクレオチド対を含有する。 DS-CAM1タンパク質はＮ末端に細胞外成分を含有し、該細胞外成分は、9個のタ ンデムに反復したIg様C2型ドメイン、および６個の反復フィブロネクチンIII型 ドメインのアレイの4番および5番ドメイン間に位置する第10のIg様C2ドメインか らなる（図２）。それぞれのIg様C2ドメインは、49〜56個の残基により分離され た保存システイン対を有する約100個のアミノ酸からなる。22個のアミノ酸から なる単一膜貫通ドメインはTMBASEプログラム（Hoffmann and Stoffel，Biol ．Ch em ．Hoppe-Seyler 374:166,1993）を使って規定した。細胞質ドメインに対応す るＣ末端の残りの294アミノ酸は、マウスM期インデューサーホスファターゼ2（K akizukaら，Genes Dev ．6:578-590，1992）と2領域において部分相同性を有し、 第1領域は46bpにわたって34%の同一性と52%の類似性を、また第2領域は21bpにわ たって38%の同一性と52%の類似性を有する。ショウジョウバエガラス遺伝子の相 同体（Drosophila glass gene）（O'Neillら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 92: 6557-6561，1995）は42bpにわたって30%の同一性と52%の類似性を有し、またマ ウスδオピオイド受容体（Evansら，Science 258:1952-1955，1992）は30bpにわ たって43%の同一性と60%の類似性を有する。推定タンパク質は16個の潜在的Ｎグ リコシル化部位を含有する。 DS-CAM1（配列番号１）の5730bpオープンリーディングフレームの推定アミノ 酸配列の、ジーンバンクおよびEMBLデータベースに登録された遺伝子に対する相 同性探索を、BLAST-Pプログラム（Altschulら，J ．Mol．Biol．215:403-410，19 90）を使って実施した。推定アミノ酸配列は、CAM-L1（Moosら，Nature 334:701 -703，1988）、BIG-1（脳由来免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリー分子-1 ）（Yoshiharaら，Neuron 13:415-426，1994）、DCC（大腸癌では欠失）（Fearo nら，Science 247:49-56，1990）を含む多数のタンパク質に対して相同性を示し （図４）、DS-CAMは新規クラスの免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーを規 定することを明らかにした。最も高度に関係したIgスーパーファミリーメンバ ー（CAM-L1、DCC、およびアキソニン-1）のIgC2型ドメインおよびフィブロネク チンIII型ドメインの配列との相同性探索をFASTAプログラム（Pearson and Lipm an，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 85:2444-2448，1988）を使って実施した。 更に、本明細書ではDS-CAM2と呼ぶDS-CAM1の非膜結合アイソフォームをコード するスプライス変異体ｃＤＮＡ配列が本発明で提供される。2つのヒトDS-CAM ｃ ＤＮＡクローン（DS-CAM-18およびDS-CAM-52）は、隣接エキソンに存在し、DS-C AM1をコードする配列番号1のｃＤＮＡ配列のbp5133〜5323を欠失する191kbの同 一の欠失を含有することが見出された（図３）。DS-CAM2（配列番号10）をコー ドする生じたスプライス変異体転写産物は、これらエキソンのより3'側によりコ ードされる膜貫通ドメイン全体を欠失している。更に、この欠失はリーディング フレームを変化させ、欠失の36bp下流に停止コドンを作製して、1571個のアミノ 酸（配列番号11）からなる可溶性細胞外タンパク質をもたらす。生じる欠失の遠 位ボーダーはＲＮＡスプライシングコンセンサス受容体部位の規定AGを含有する 。近位ボーダーは供与スプライス部位コンセンサス配列の変異体（Jackson,Nucl ．Acids Res． 19:3795-3798，1991）を含有する。 DS-CAM ｃＤＮＡがダウン症領域のBACおよびPACに由来することを確証し、か つDS-CAMのゲノムサイズを決定するために、最長のDS-CAM ｃＤＮＡクローン（D S-CAM-42；6.1kb、DS-CAM-18；6.5kb、DS-CAM-52；6.6kb）をBACおよびPACクロ ーンコンティグを含有するサザンブロットにハイブリダイズさせた（図１）。DS -CAM-42、18および52は、BAC 423A5、430F1、628H2、539E7、371H8、825E1、593 D1、261F12、30E4、385B7、388F4、およびPAC 31P10、58D10にハイブリダイズし た。BAC 816F6、116E8、720G4、619H8はDS-CAM-18およびDS-CAM-52に対してのみ ポジティブであったが、DS-CAM-42に対してはネガティブであった。図１の他の 全てのBACはネガティブであった。これらの結果は、DS-CAM遺伝子が900kb〜1200 kbのゲノムＤＮＡにわたり、矢印で示したこのBACおよびPACコンティグ並びに利 用可能なYACコンティグのギャップをカバーすることを示す（Korenbergら，Geno me Res ． 5:427-443，1995；Gardinerら，Somat ．Cell Mol．Genet．2:399-414， 1995）。ｃＤＮＡ配列特異的プライマーを用いてテンプレートとしてのBACおよ びPACを直接配列決定することにより、DS-CAM ｃＤＮＡ配列はこれらのBACお よびPACに由来することが確証された。 染色体21q22.2〜22.3上のDS-CAMのマップ位置は、クローンDS-CAM-42を蛍光in situハイブリダイゼーションのプローブとして用いて確証された。2つの独立し た実験を実施し、100個以上の分裂中期細胞を評価した。85%の細胞の少なくとも １つの染色体の２つの染色分体上にシグナルが明確に示された。1%より多い細胞 においては他の２重シグナル部位は見られなかった。 実施例４ ヒトDS-CAM発現のノーザンブロット分析 DS-CAM ｃＤＮＡを含有するインサートを基本ベクターからXho1およびEcoRIで 消化して切除した。ランダムプライミング法（RadPrime Labeling System;GIBCO BRL)を使って標識付けし、続いてG-50 Sephadexカラム（Quick SpinColumn;Boe hringer Mannheim）を使って精製した後、該断片をMultiple Tissue Northern B lot（Clontech）を使用するノーザンハイブリダイゼーションのプローブに使っ た。DS-CAM ｃＤＮＡをプローブとして使い、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格 筋、腎臓および膵臓を含む様々な胎児および成人組織で、ノーザンブロットアッ セイを実施した。ノーザンハイブリダイゼーションは、製造業者の説明書に従っ て実施した。ハイブリダイズした膜を0.1X SSC、0.1X SDSの最終ストリンジェン シーまで50℃で洗浄した。フィルターを-70℃で1〜5日間、Ｘ線フィルム（Kodak X-OMAT AR）に感光した。 ヒト胎児組織を使うノーザン分析の結果は、8.5kbおよび7.6kbの転写産物が胎 児脳にのみ発現され、胎児肺、胎児肝および胎児腎では発現されないことを示し た。成人組織では、9.7kb、8.5kbおよび7.6kbの３種類の転写産物が脳に存在し た。胎盤は弱いバンドを示し、サイズは脳のそれと同様であった。骨格筋では弱 い小さいバンド（6.5kb）が検出された。成人脳の複数の部分において、9.7kb、 8.5kbおよび7.6kbの転写産物は異なって発現された。9.7kbの転写産物は黒質（s ubstantia nigra）で高度に発現され、扁桃体（amygdala）および海馬（hippoca mpus）で中度に発現され、全脳ではあまり発現されない。同様なパターンが、ク ローンDS-CAM2に対応するスプライス変異体配列をコードするクローンDS-CAM-18 およびDS-CAM-52に見出された191kb欠失にかかるPCR産物を使って得られた。か くして、DS-CAMファミリーのタンパク質をコードするスプライス変異体ｃＤＮＡ 転写産物は本発明により明らかに意図される。 実施例５ ヒトDS-CAM発現のRT-PCRアッセイ 様々のヒト組織のｃＤＮＡライブラリーに対する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 （RT-PCR）アッセイを、B9-131F（配列番号５）およびB9-131R（配列番号６）の 番号を付したプライマーを使って実施した。結果は、胎児および成人の脳および 胎児腎におけるヒトDS-CAM ｍＲＮＡの発現を実証した。更に、乳癌細胞系はヒ トDS-CAMｍＲＮＡの発現を示した。 独立した13例のヒト胎児および成人由来のｃＤＮＡを、配列番号１に示された DS-CAM1 ｃＤＮＡのヌクレオチド5133〜5323の191塩基対欠失を生じる選択的ス プライス領域の両側に位置するプライマー対を使って、PCRにより分析した。プ ライマーは、2つの選択的スプライス転写産物（すなわち、非欠失DS-CAM1転写産 物に対応する536bp、および欠失DS-CAM2転写産物に対応する345kb）のそれぞれ について異なるサイズの産物を生成するように設計された。分析は、扁桃体（24 歳）、骨格筋（36歳）および３つの独立したリンパ芽球様細胞系からの成人サン プルを含んでいた。胎児サンプルは、21トリソミー胎児の全脳（14週）１例、全 脳（4.5〜13週）から４例、側頭葉（28週）から１例および心臓（4.5および13週 ）から２例を含んでいた。結果は、全ての胎児および成人サンプルが予測された サイズのPCR産物に対応する2つのバンドを生成することを示し、これは2つの選 択的スプライス転写産物の発現を示した。 実施例６ マウスDS-CAM ｃＤＮＡクローンの単離 マウス脳ｃＤＮＡライブラリーを、19週齢の雌C57 Black/6マウスからUni-ZAP XRベクター（STRATAGENE）中に調製した。該ｃＤＮＡをオリゴ-dTプライミング し、一方向的にベクターのEcoRIおよびXhoI部位にクローニングした。平均イン サートサイズは1.0kbである。このライブラリーをヒトDS-CAM ｃＤＮＡクローン をプローブとして使ってスクリーニングした。2つの部分マウスDS-CAM ｃＤＮＡ クローンを単離し、配列決定した。これらクローンの結合したヌクレオチド配列 を配列番号７、配列番号８および配列番号９に示したが、それぞれマウスDS-CAM をコードするｃＤＮＡの5'部、中間部および3'部に相当することが見い出された 。 実施例７ マウス組織中のDS-CAM ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション分析 BALB/cおよびC57BL/6×DBA/2胚、胎児および出生後の脳を、Lyonsら（J ．Neur osci． 15:5727-5738，1995）が詳細に記載した通り、固定して包埋した。胚は、 4%パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝溶液（PBS）中に一夜固定し、脱水し 、パラフィンを浸潤させた。5〜7μｍの一連の切片をゼラチン化スライド上に載 せた。スライド1枚当たり2個の切片を載せ、キシレンで脱パラフィンし、再水和 し、後固定した。切片をプロテイナーゼＫで消化し、後固定し、トリエタノール アミン／無水酢酸で処理し、洗浄し、脱水した。ｃＲＮＡプローブをDS-CAM-M-1 4から調製した。該プラスミドをXbaIで線状化し、T7ポリメラーゼを使ってアン チセンスｃＲＮＡを作製した。該プラスミドをKpnIで線状化し、T3ポリメラーゼ を使ってセンス対照ｃＲＮＡを作製した。ｃＲＮＡ転写産物を製造業者（STRATA GENE）の条件によって合成し、³⁵S-UTP（>1000Ci/mmol；Amersham）で標識した 。100ヌクレオチドより大きいｃＲＮＡ転写産物は、効率的なハイブリダイゼー ションのためにアルカリ加水分解処理して70塩基の平均サイズとした。 切片を、一夜、52℃で、50%脱イオン化ホルムアミド、0.3M NaCl、20mM Tri s-HCl pH7.4、5mM EDTA、10mM NaPO4、10%デキストラン硫酸、1X Denhardt's、5 0μｇ/ml全酵母ＲＮＡ、および50〜75,000cpm/μｌの³⁵Ｓ標識ｃＲＮＡプローブ 中で、ハイブリダイズさせた。該組織を、65℃、50%ホルムアミド、2X SSC、10m M DTT中でストリンジェント洗浄にかけ、PBS中で洗浄し、その後20μｇ/mlのRNa seAで37℃、30分間処理した。2X SSCおよび0.1X SSC中で10分間、37℃で洗浄し 、その後、スライドを脱水し、Kodak NTB-2核トラックエマルジョン（nuclear t rack emulsion）中に浸し、乾燥剤を入れた明るい密閉箱中で４℃で２〜３週間 感 光した。写真現像はKodak D-19で行った。スライドをトルイジンブルーで軽く対 比染色し、Zeiss Axiophot顕微鏡の明視野および暗視野オプチクスの両方を使っ て分析した。センス対照ｃＲＮＡプローブ（ｍＲＮＡと同一）は常にバックグラ ウンドレベルのハイブリダイゼーションシグナルを与えた。胚構造物を次の地図 によって同定した：Ruch（The Mouse;Its Reproduction and Development．Oxfo rd Univ．Press，Oxford，UK，1990）、Kaufman（The Atlas of Mouse Develomp ent ．Acad．Press，New York，NY，1992）、およびAltman and Bayer（前掲，19 95）。 マウスｃＤＮＡをプローブとして使い、交配後（pc）8.5〜17.5日の正常マウ ス胚、並びに新生マウス、２週齢および成熟脳の切片について、組織in situハ イブリダイゼーション分析を上述の通り実施した。結果は、pc8.5日のDS-CAMの 検出可能な発現は見られないことを示す。pc9.5日に、神経上皮に発現が検出さ れた。低レベルの発現が鰓弓（branchial arches）内に検出され、移動性の神経 冠細胞を示唆した。pc10.5日に、三叉神経節（神経冠由来）がこの転写産物の発 現を開始し、鰓弓内の発現は更に明確となった。 pc11.5日の発現は、脳全体に行きわたった。この転写産物は発生中の最も初期 に分化する神経系領域内に見出された（Altman and Bayer，前掲，1995）。脳に おいて、これは視床（thalamus）や髄質（medulla）のごとき最も腹側（ventral ）の領域を含む。若干の発現が嗅上皮（olfactory epithelium）内に検出された 。神経管内の発現が２領域で始まる：腹外側（ventrolateral）（運動ニューロ ンが分化する領域に対応する）および外側灰色柱（lateral gray column） （後に交連ニューロン（commissural neurons）を形成する）（Leberら，J ．Neu rosci． 15:1236-1248，1990）。後根神経節（dorsal root ganglia）（神経冠由 来）はpc11.5日にこの転写産物を発現した。三叉神経節はpc11.5日には、10.5日 に示したより高いレベルを示した。移動性神経冠が上顎骨（maxilla）、下顎骨 弓（mandibular arch）内、および発生中の腸（gut）で観察することができた。 シグナルは臍静脈および動脈を囲む間葉（mesenchyme）内に観察された。 pc12.5日には、pc11.5日より更に広範に発現した。中脳の大部分、橋域（pont ine area）、脳幹神経節（basal ganglia）および皮質（cortex）の最外層を含 む更に多くの神経系が該転写産物の発現を示す。この層のニューロンは、皮質の 脳質上皮下層（subependymal layer）中で有糸分裂し、大脳皮質の外套層に分化 細胞として移動した（Smartら，J ．Comp．Neurol．116:325-347，1961）。 pc13.5日に、発現は脳の殆ど全体に見られた。腸の最外層もこの段階で発現中 であるのがみられる；これらの細胞は神経冠に由来し、腸管筋神経節（myenteri c ganglia）を形成する。pc15.5および16.5日には、神経冠由来の神経構造の殆 どは何らかの発現を有する。例えば、感覚毛（vibrissae）、膵神経節、心神経 節、腸神経系,および交感神経幹の基部で感覚構造へと発生する突起（snout）領 域は全て該転写産物を発現する。 この段階で臍内での発現はない。2つの非ニューロン構造、すなわち生殖腺お よび椎間板の織維環がこの遺伝子を発現する。嗅球（olfactory bulb）は、顆粒 細胞中および房飾僧帽細胞（tufted mitral cell）内の両方でシグナルを示す。 新生脳内では、この転写産物は、中隔野（septal area）、嗅球、下丘（inferio r colliculus）および海馬のごとき分化性領域内に最も広範に発現された。成熟 脳では、該遺伝子は、扁桃体、皮質、海馬および視床を含む多くの領域で発現さ れた。成熟小脳（cerebellum）では、該転写産物はプルキニェ（Purkinje）細胞 層中に、および深小脳核（deep cerebellar nuclei）中に検出された。 本発明は特定の好ましい実施様態を参照して詳細に記載されたが、本明細書に 記載され請求された発明の精神と範囲内での修飾および変更があることは理解さ れるであろう。 配列の概要 配列番号１は、本発明の新規ヒトDS-CAM1タンパク質をコードするｃＤＮＡの 核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。 配列番号２は、本発明のヒトDS-CAM1タンパク質の推定アミノ酸配列である。 配列番号３は、ヒトDS-CAMをコードするｃＤＮＡを単離するために使うｃＤＮ Ａプローブ（「E51」と表示）である。 配列番号４は、Mbo1リンカー配列である。 配列番号５は、実施例５に記載されたRT-PCRアッセイに使われるB9-131Fと表 示されたプライマーである。 配列番号６は、実施例５に記載されたRT-PCRアッセイに使われるB9-131Rと表 示されたプライマーである。 配列番号７は、本発明DS-CAMタンパク質をコードする部分マウス由来ｃＤＮＡ クローンの5'領域である。 配列番号８は、本発明DS-CAMタンパク質をコードする部分マウス由来ｃＤＮＡ クローンの中間領域である。 配列番号９は、本発明DS-CAMタンパク質をコードする部分マウス由来ｃＤＮＡ クローンの3'領域である。 配列番号10は、本発明の新規ヒトDS-CAM2タンパク質をコードするｃＤＮＡの 核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。 配列番号11は、DS-CAM1（配列番号２）のスプライス変異体である本発明の新 規ヒトDS-CAM2タンパク質の推定アミノ酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．タンパク質の免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの哺乳動物DS-CAMメン バーをコードする単離された核酸、またはその断片であって、前記DS-CAMが少 なくとも７つのIg様ドメインを含むものである、上記核酸。 2．前記核酸またはその断片が、 (a)配列番号２もしくは配列番号11に示したアミノ酸配列、または配列番号 ７、配列番号８もしくは配列番号９のDS-CAMコード領域をコードするＤＮＡ、 (b)中程度のストリンジェント条件下で(a)のＤＮＡとハイブリダイズするＤ ＮＡであって、生物学的に活性なDS-CAMをコードするもの、または (c)前記の(a)または(b)に対する縮重ＤＮＡであって、生物学的に活性なDS- CAMをコードするもの、 から選択される、請求項１に記載の単離された核酸。 3．前記核酸が、高度のストリンジェント条件下で、配列番号１、配列番号７、 配列番号８、配列番号９または配列番号10のヌクレオチドのDS-CAMコード部分 とハイブリダイズする、請求項２に記載の核酸。 4．前記核酸のヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列 番号９または配列番号10に示したものと実質的に同一である、請求項２に記載 の核酸。 5．前記核酸のヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列 番号９または配列番号10に示したものと同一である、請求項２に記載の核酸。 6．前記核酸がｃＤＮＡである、請求項２に記載の核酸。 7．請求項２に記載の核酸を含有するベクター。 8．請求項２に記載の核酸を含有する組換え細胞。 9．配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号10に示し たヌクレオチド配列の核酸の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能な 少なくとも15ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。 10．前記オリゴヌクレオチドが検出可能なマーカーで標識されている、請求項９ に記載のオリゴヌクレオチド。 11．請求項２に記載の前記核酸によってコードされるｍＲＮＡと特異的に結合す ることが可能なアンチセンス・オリゴヌクレオチド。 12．請求項10に記載の少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む、DS-CAMのc ＤＮＡ配列の存在を検出するためのキット。 13．少なくとも７つのIg様ドメインを含む、単離されたDS-CAMタンパク質。 14．肺、肝臓または腎臓よりも脳において有意に高い量で発現されることをさら に特徴とする、請求項13に記載のDS-CAMタンパク質。 15．前記タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２もしくは配列番号11に示した タンパク質配列、または配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のDS-CAM コード領域と実質的に同一のものを含む、請求項13に記載のDS-CAMタンパク質 。 16．配列番号２もしくは配列番号11に示したタンパク質配列、または配列番号７ 、配列番号８もしくは配列番号９のDS-CAMコード領域と同一のアミノ酸配列を 含む、請求項15に記載のDS-CAMタンパク質。 17．前記タンパク質が配列番号１、配列番号７、配列番号８、配列番号９または 配列番号10に示したヌクレオチド配列と実質的に同一のものを含むヌクレオチ ド配列によってコードされる、請求項13に記載のDS-CAMタンパク質。 18．前記タンパク質が配列番号１または配列番号10を含むヌクレオチド配列によ ってコードされる、請求項17に記載のDS-CAMタンパク質。 19．前記タンパク質が配列番号１に示したヌクレオチド453〜6185、配列番号10 に示したヌクレオチド453〜5168、配列番号７、配列番号８または配列番号９ と実質的に同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードさ れる、請求項13に記載のDS-CAMタンパク質。 20．DS-CAM関連タンパク質の発現方法であって、請求項８に記載の細胞を、前記 DS-CAMタンパク質の発現に適した条件下で培養することを含んでなる、上記方 法。 21．請求項13に記載のDS-CAMタンパク質との特異的な反応性を有する、単離され た抗DS-CAM抗体。 22．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項21に記載の抗体。 23．前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項21に記載の抗体。 24．DS-CAMタンパク質の発現を抑制するのに有効な量の請求項11に記載のアンチ センス・オリゴヌクレオチドおよび細胞膜を通過することが可能な許容できる 疎水性担体を含有する組成物。 25．DS-CAMタンパク質をコードする外因性核酸を発現するトランスジェニック非 ヒト哺乳動物。 26．前記DS-CAMタンパク質をコードする前記核酸が突然変異を起こしており、そ のため発現されたDS-CAMタンパク質が天然のDS-CAMではない、請求項25に記載 のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 27．トランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項25に記載のトラ ンスジェニック非ヒト哺乳動物。 28．哺乳動物DS-CAMタンパク質をコードする核酸の同定方法であって、核酸含有 サンプルを請求項９に記載のオリゴヌクレオチドと高度ストリンジェントハイ ブリダイゼーション条件下で接触させ、そしてそれにハイブリダイズする化合 物を同定することを含んでなる、上記方法。 29．サンプル中の哺乳動物DS-CAMタンパク質の存在を検出する方法であって、被 験サンプルを請求項21に記載の抗体と接触させ、抗体−DS-CAM複合体の存在を 検出し、それによって前記被験サンプル中の哺乳動物DS-CAMの存在を検出する ことを含んでなる、上記方法。 30．配列番号１、配列番号10、配列番号７、配列番号８または配列番号９に示し た核酸配列に由来する核酸配列を含む、DS-CAM核酸増幅用の一本鎖ＤＮＡプラ イマー。