EP1185673A2 - Neue calpaine und deren verwendung - Google Patents

Neue calpaine und deren verwendung

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EP1185673A2
EP1185673A2 EP00945716A EP00945716A EP1185673A2 EP 1185673 A2 EP1185673 A2 EP 1185673A2 EP 00945716 A EP00945716 A EP 00945716A EP 00945716 A EP00945716 A EP 00945716A EP 1185673 A2 EP1185673 A2 EP 1185673A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
capnii
calpain
calpains
human
enzymatic activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00945716A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Neil T. Dear
Thomas Böhm
Achim Möller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott GmbH and Co KG
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1185673A2 publication Critical patent/EP1185673A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis

Definitions

  • the invention relates to a new mammalian calpain CAPN11, its synthesis and its use.
  • Calpains are a superfamily of related proteins, some of which have been shown to act as calcim dependent cysteine proteases. Eight different calpains have been identified in mammals.
  • An increasing number of mammalian cal-pain homologs have been identified and the individual members can be divided into four classes based on the physical structure and the predicted properties.
  • Class A the "classic Calpaine” CAPNl, CAPN2, CAPN3 (p94); CAPN8 (nCL-2) and CAPN9 (nCL-4) are probably all protease-active and Ca 2+ dependent. They consist of a variable large (80 kDa) and an invariant small subunit (30 kDa).
  • Class B and D calpains CAPN5 (6.15) and CAPN7 (8) are protease-active, but most likely Ca 2+ -independent, the class C calpain, CAPN6, is unlikely to have any protease activity.
  • the calpains can also be divided into categories based on their expression pattern, with CAPN3, CAPN6, CAPN8 and CAPN9 having some tissue specificity.
  • the function of calpains is not known, although they have been associated with a large number of physiological processes and pathological conditions (overview in reference 17). To elucidate their function and evolutionary history, the identification of the entire spectrum of the Calpain family members is necessary.
  • the invention relates to the new polypeptide CAPN11 with the SEQ. - ID. -No. 2 disclosed amino acid sequence.
  • the new calpain protein CAPN11 has the characteristics typical of calpains, including potential protease and calcium binding domains. It has a very restricted tissue distribution and is mainly expressed in the testis. Radiation hybrid mapping was used to locate the gene on chromosome 6 in a region that is assigned to pl2. Phylogenetic analysis shows that CAPN11 is most closely related to CAPN1 and CAPN2 in mammals.
  • CAPN11 can be the human orthologon of the ⁇ / m calpain his.
  • the discovery of this new calpain emphasizes the complexity of the calpain family, whose members can be distinguished on the basis of protease activity, calcium dependency and tissue expression.
  • the cDNA nucleotide sequence of the CAPNII gene contains 2338 nucleotides (SEQ. ID. No. 1).
  • the cDNA sequence comes from a single mRNA by successfully amplifying the entire putative coding region from human testicular cDNA using flanking primers. Several cDNA clones were fully sequenced to rule out any PCR artifacts.
  • Calpaine gave the largest sequence homology (57.5%) for the chick cal pain ⁇ / m.
  • the mammalian calpaines were most similar to the human CAPNl (54.3% homology).
  • the least similar human calpain with only 18.7% homology was CAPN6.
  • the gene corresponding to this cDNA was designated CAPN11 by the Human Gene Nomenclature Committee.
  • the complete amino acid sequence of all identified human calpains was analyzed phylogenetically.
  • the results enable the human calpains to be classified into four main evolution groups (FIG. 2).
  • the first group is represented by CAPN5, CAPN6, CAPN7 and CAPN8, the second by CAPN1 and CAPN2, the third group by CAPN3 and CAPN9, and the fourth group comprises CAPN11.
  • the phylogenetic analysis thus suggests that CAPNII is a separate calpain subfamily.
  • CAPN11 in human tissues was examined by Northern and RNA dot blot analysis. Of the 50 tissue RAs examined, the CAPNII mRNA was most strongly expressed in the testis (FIG. 3A). The specificity of this signal was confirmed by Northern blot analysis and corresponded to an approximately 3 kb mRNA (FIG. 3D). In the thymus and in the mammary gland much weaker signals detected. However, the significance of this finding is unclear, since a further examination of Thymus RNA with Northern blot analysis did not produce any signal despite long exposure times (FIG. 3D and data not shown). A possible explanation would be that this weak signal is due to cross hybridization with related mRNAs. Thus, the testis is the major expression site of CAPNII, although we cannot rule out the possibility that the gene may be expressed in other, unexamined tissues.
  • This marker is located in the space between the microsatellite markers D6S1616 (59.6 cM) and D6S427 (73.9 cM) (7), and a marker in this space, D6S269, has been cytogenetically assigned to 6pl2 (5).
  • D6S1616 59.6 cM
  • D6S427 73.9 cM
  • D6S269 a marker in this space
  • the chick ⁇ / m calpain was the first member of the calpain family to be cloned (16). It was originally called m-calpain, but was reclassified after identifying other chick calpains that are most likely orthologous to the ⁇ - and m-calpaines from mammals (18). A mammalian ⁇ / m calpain has yet to be determined. However, since CAPN11 has a greater homology to the chick ⁇ / m calpain than to other mammalian calpains, this may be its orthologue.
  • CAPN3 skeletal muscle
  • CAPN6 placenta
  • CAPN8 possibly smooth muscles
  • CAPN9 stomach and small intestine
  • CAPN11 testes
  • Numerous proteases in the testis have been identified and are believed to be involved in processes such as tissue reorganization (20), regulation of spermatogenesis (14), sperm penetration of the zona pellucida (10) and fertility (13).
  • tissue reorganization (20), regulation of spermatogenesis (14), sperm penetration of the zona pellucida (10) and fertility (13).
  • CAPN11 is likely to be located intracellularly.
  • Another aspect of this invention relates to the use of the polypeptide CAPNII for the identification of substances which can inhibit the enzymatic activity of this polypeptide, so-called calpain inhibitors, in particular those calpain inhibitors which are selective for CAPNII.
  • Selectivity means that such calpain inhibitors inhibit the activity of CAPNII more than the activity of the other calpains mentioned above, preferably at least 10 times, more preferably 25 times more.
  • the enzyme activity of CAPNII is a Ca-dependent protease activity.
  • Another aspect of the invention relates to a method for identifying compounds which inhibit the enzyme activity of a polypeptide according to claim 1, comprising:
  • inhibitory compounds identified by the above-mentioned method are suitable for the treatment of diseases which are associated with or associated with an unphysiologically increased CAPNII activity, such as infertility in men.
  • Capn7 A highly divergent vertebrate calpain with a novel
  • TESPl Two novel testicular serine proteases, TESPl and TESP2, are present in the mouse sperm. acro- some. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 658-665.
  • FIG. 1 Grouping the predicted amino acid sequence of CAPNII with other human calpains. The multiple grouping of the amino acid sequences was carried out using CLUSTAL W (19).
  • the putative start methionine for CAPNII (GGAatgG) corresponds to the minimal consensus sequence for the translation start site (RNNatgG, where R is a purine, ref. 11).
  • Amino acids that are identical to those of CAPNII 5 in the other proteins are shaded. Dashes indicate gaps that have been added to maximize alignment. Arrowheads indicate the three conserved amino acids that are part of the active center of the Calpaine.
  • the potential EF hand calcium binding domains of CAPN8 are underlined and numbered consecutively. The arbitrary domains of Calpain are specified.
  • FIG. 2 Rootless phylogenetic family tree of the family of the large subunit of human calpaine. The analysis was carried out with the PAUP program and the family tree with CLUSTREE from the HUSAR server of the German Cancer Research Center, Heidelberg (www.dkfz-heidelberg.de) was arranged. The lengths of the horizontal lines are proportional to the derived phylogenetic distances; the vertical lines have no meaning.
  • the CAPN7 sequence is from the mouse because there is little human nucleotide and protein sequence available. However, the human orthologue exists (see ref. 8), so the use of the mouse sequence for this comparison is justified.
  • the partial human CAPN8 sequence is the predicted translation of the EST clone AA026030 (Hillier et al., 1995, The WashU-Merck EST project, unpublished results). An amino acid translation of this clone shows high similarity to the rat CAPN8 sequence. No bootstrapping was done with this sequence because it is much shorter than the others. The bootstrapping value can therefore not be meaningfully compared with the values from comparisons of full-length sequences.
  • CAPNl The nomenclature specified by the Human Gene Nomenclature Committee is used. Previous names for the different calpains are: CAPNl - m-Calpain, CAPN2 - m-Calpain, CAPN3 - p94, nCl-1, CAPN8, nCL-2, CAPN9, nCL-4.
  • the EMBL accession numbers for the calpain sequences used are: CAPNl (P17655), CAPN2 (P07384), CAPN3 (P20807), CAPN5 (Y10656), CAPN6 (Y12582), CAPN7 (AJ012475) and CAPN9 (AF022799).
  • FIG. 3 Expression of CAPNII.
  • a 32 P-labeled DNA probe with an 800 base pair segment of the coding sequence of the human CAPNII cDNA was attached to a master blot (A), a nylon filter with dot blots of RNAs from 50 different human tissues or a Clontech Multi-tissue Northern blot (D) hybridizes.
  • the filters were washed with high stringency (6x SSC, 65 ° C). The exact location of the different RNAs on the dot blot filter is shown schematically (C). The RNAs on the Northern blot are indicated above the corresponding lanes.
  • Dot blot and Northern blot were re-hybridized with human ubiquitin (B) and b-actin DNA probes to determine the amounts of poly (A +) RNA applied.
  • the positions of the size markers (in kilobases) are given for the Northern blot.
  • the exposure times were: A, 72 hours; B, 24 hours; D, 48 hrs.
  • PBL peripheral blood leukocytes.

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Abstract

Neue Calpaine und deren Verwendung.

Description

Neue Calpaine und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft ein neues Säugetier-Calpain CAPN11, seine Synthese sowie seine Verwendung.
Calpaine sind eine Superfamilie verwandter Proteine, von denen einige nachgewiesenermaßen als calci mabhängige Cysteinproteasen wirken. In Säugetieren sind acht verschiedene Calpaine identifi- ziert worden.
Calpaine bilden eine Familie intrazellulärer calciumabhängiger Cystein-Proteasen. Man hat eine steigende Zahl von Säugetier-Cal- pain-Homologa identifiziert, und die einzelnen Mitglieder lassen sich auf der Basis der physikalischen Struktur und der vorhergesagten Eigenschaften in vier Klassen einteilen. Die Klasse A, die "klassischen Calpaine" CAPNl, CAPN2 , CAPN3 (p94) ; CAPN8 (nCL-2) und CAPN9 (nCL-4) sind wahrscheinlich alle proteaseaktiv und Ca2+-abhängig. Sie bestehen aus einer variablen großen (80 kDa) und einer invarianten kleinen Untereinheit (30 kDa) . Die Calpaine der Klasse B und D, CAPN5 (6,15) und CAPN7 (8) sind proteaseaktiv, jedoch höchstwahrscheinlich Ca2+-unabhängig, das Calpain der Klasse C, CAPN6, besitzt wahrscheinlich keine Proteaseaktivität . Die Calpaine lassen sich auch auf der Basis ihrer Expressionsmu- ster in Kategorien einteilen, wobei CAPN3 , CAPN6 , CAPN8 und CAPN9 etwas Gewebespezifität aufweisen. Die Funktion der Calpaine ist nicht bekannt, obwohl sie mit sehr vielen physiologischen Prozessen und pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht wurden (Überblick in Literaturstelle 17). Zur Aufklärung ihrer Funktion und Evolutionsgeschichte ist die Identifizierung des gesamten Spektrums der Calpain-Familien itglieder notwendig.
Die Erfindung betrifft das neue Polypetid CAPN11 mit der in SEQ . - ID. -Nr. 2 offenbarten Aminosäuresequenz.
Das neue Calpain-Protein CAPN11 besitzt die für Calpaine typischen Eigenschaften, einschließlich potentieller Protease- und Calciumbindungs-Domänen. Es weist eine stark eingeschränkte Gewebeverteilung auf und wird hauptsächlich im Hoden exprimiert. Mit Hilfe der Strahlungs-Hybrid-Kartierung wurde das Gen auf Chromosom 6 in einer Region lokalisiert, die pl2 zugeordnet wird. Aus phylogenetischer Analyse geht hervor, daß CAPN11 in Säugetieren am engsten mit CAPNl und CAPN2 verwandt ist .
Die vorhergesagte CAPNll-Sequenz weist jedoch von den verfügbaren Calpainsequenzen die größte Homologie zum Küken-Calpain μ/m auf. Somit kann CAPNll das menschliche Orthologon des μ/m-Calpains sein. Die Entdeckung dieses neuen Calpains betont die Komplexität der Calpain-Familie, deren Mitglieder sich auf der Basis der Pro- teaseaktivität , Calciumabhängigkeit und Gewebeexpression unterscheiden lassen.
Die cDNA-Nukleotidsequenz des CAPNll-Gens enthält 2338 Nukleotide (SEQ. -ID. -Nr. 1). Die cDNA-Sequenz stammt von einer einzigen mRNA durch erfolgreiche Amplifizierung der gesamten mutmaßlichen codierenden Region aus menschlicher Hoden-cDNA mittels flankieren- der Primer. Mehrere cDNA-Klone wurden vollständig sequenziert, um jedwede PCR-Artefakte auszuschließen.
Es gibt ein großes offenes Leseraster, das ein Protein mit 702 Aminosäuren codiert (Mr 80 kDa) (Fig. 1) . Die Aminosäuresequenz ähnelt der großen Untereinheit von Mitgliedern der Calpain-Familie (Fig. 1) . Das Protein läßt sich in die vier für Calpain typischen Domänen unterteilen. Die Domäne II weist die Eigenschaften einer Protease-Domäne auf, und die vorhergesagte Aminosäuresequenz besitzt die drei Aminosäurereste (Cysl02, His259 und Asn283), die Teil des aktiven Zentrums von Cysteinproteasen sind (2) . Die Aminosäuresequenz sämtlicher fünf, für CAPN2 beschriebenen Ca2+-bindenden Sequenzen (4, 12) sind in gewissem Ausmaß konserviert (Fig. 1) . Dieses Protein besitzt somit wahrscheinlich Protease- und Calciumbindungs-Eigenschaften. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz mit denen sämtlicher anderer
Calpaine ergab die größte Sequenzhomologie (57,5%) zum Küken-Cal- pain μ/m. Bei den Säugetier-Calpainen bestand die größte Ähnlichkeit zum menschlichen CAPNl (54,3% Homologie). Das am wenigsten ähnliche menschliche Calpain mit nur 18,7% Homologie war CAPN6. Das dieser cDNA entsprechende Gen wurde vom Human Gene Nomencla- ture Committee als CAPN11 bezeichnet.
Die vollständige Aminosäuresequenz sämtlicher identifizierter menschlicher Calpaine wurde phylogenetisch analysiert . Die Ergeb- nisse ermöglichen die Klassifizierung der menschlichen Calpaine in vier Haupt-Evolutionsgruppen (Fig. 2). Die erste Gruppe wird durch CAPN5, CAPN6 , CAPN7 und CAPN8 vertreten, die zweite durch CAPNl und CAPN2 , die dritte Gruppe durch CAPN3 und CAPN9 , und die vierte umfaßt CAPNll . Die phylogenetische Analyse legt somit nahe, daß CAPNll eine eigene Calpain-Subfamilie darstellt.
Die Expression von CAPNll in menschlichen Geweben wurde durch Northern- und RNA-Dot-Blot-Analyse untersucht. Von den 50 untersuchten Gewebe-RAs wurde die CAPNll-mRNA am stärksten im Hoden exprimiert (Fig. 3A) . Die Spezifität dieses Signals wurde durch Northern-Blot-Analyse bestätigt und entsprach einer etwa 3 kb großen mRNA (Fig. 3D) . Im Thymus und in der Brustdrüse wurden viel schwächere Signale nachgewiesen. Die Signifikanz dieses Befundes ist jedoch unklar, da eine weitere Untersuchung von Thy- mus-RNA mit Northern-Blot-Analyse trotz langer Expositionszeiten kein Signal ergab (Fig. 3D und Daten nicht gezeigt) . Eine mögli- ehe Erklärung wäre, daß dieses schwache Signal auf eine Kreuzhy- bridisierung mit verwandten mRNAs zurückzuführen ist. Somit ist der Hoden die Haupt-Expressionsstelle von CAPNll, obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, daß das Gen in anderen, nicht untersuchten Geweben exprimiert wird.
Wir haben bestimmt, auf welchem Chromosom das menschliche CAPNll-Gen lokalisiert ist. Mittels PCR mit Primern, die spezifisch für die menschliche CAPNll-Nukleotidsequenz sind, haben wir mit einem somatischen Mensch/Nagetier-Zellhybrid-Kartierungspanel das Gen dem Chromosom 6 zugeordnet (Correll Cell Repositories) . Mit Hilfe der Strahlungs-Hybridkartierung mit dem Stanford-G3-Panel mittlerer Auflösung (Research Genetics Inc.) und der Datenbank am Stanford Human Genome Center (shgc-www.stanford.edu) wurde das Gen 5 Centiray vom Marker SHGC-32834 entfernt auf die- sem Chromosom lokalisiert (LOD-Score 12,87). Dieser Marker befindet sich im Zwischenraum zwischen den Mikrosatelliten-Markern D6S1616 (59,6 cM) und D6S427 (73,9 cM) (7), und ein Marker in diesem Zwischenraum, D6S269, ist cytogenetisch 6pl2 zugeordnet worden (5). Somit befindet sich CAPNll auf Chromosom 6 in der Nähe von pl2. Auf diesem Chromosom ist kein anderes Calpain-Gen lokalisiert worden.
Das Küken-μ/m-Calpain war das erste Mitglied der zu klonierenden Calpain-Familie (16) . Es wurde ursprünglich als m-Calpain be- zeichnet, jedoch umklassifiziert, nachdem andere Küken-Calpaine identifiziert wurden, die sehr wahrscheinlich zu den μ- und m- Calpainen aus Säugetier ortholog sind (18) . Ein Säugetier-μ/m- Calpain muß jedoch noch bestimmt werden. Da aber CAPNll eine größere Homologie zum Küken-μ/m-Calpain aufweist als zu anderen Säu- getier-Calpainen, kann es sich dabei um dessen Orthologon handeln.
Es gibt bisher 5 Calpaine, die einen gewissen Grad von Gewebespe- zifität aufweisen - CAPN3 (Skelettmuskel) , CAPN6 (Plazenta) , CAPN8 (möglicherweise glatte Muskeln) , CAPN9 (Magen und Dünndarm) und CAPNll (Hoden) . Man hat zahlreiche Proteasen im Hoden identifiziert, und es wird angenommen, daß sie an Prozessen beteiligt sind, wie Gewebereorganisation (20) , Regulation der Spermatoge- nese (14) , Durchdringung der Zona pellucida durch Sperma (10) und Fruchtbarkeit (13). Viele dieser Aktivitäten sind jedoch von se- zernierten Proteasen abhängig, und CAPNll ist wahrscheinlich intrazellulär lokalisiert. Im Hoden könnte es an Prozessen betei- ligt sein, an denen Calpaine in anderen Geweben beteiligt sind, wie Keimzellen-Apoptose (3) oder Regulation von hodenspezifischen
Transkriptionsfaktoren.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft die Verwendung des Polypeptides CAPNll zur Identifizierung von Substanzen, die die enzymatische Aktivität dieses Polypeptides hemmen können, sogenannte Calpain-Inhibitoren, insbesondere solche Calpain-Inhibitoren, die für CAPNll selektiv sind. Selektivität bedeutet, daß solche Calpain-Inhibitoren die Aktivität von CAPNll stärker hemmen als die Aktivität der anderen vorstehend genannten Calpaine, und zwar vorzugsweise mindestens lOmal, stärker bevorzugt 25mal stärker. Die Enzymaktivität von CAPNll ist eine Ca-abhängige Pro- teaseaktivität .
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Enzymaktivität eines Polypeptides nach Anspruch 1 hemmen, umfassend:
(a) das Vergleichen des Ausmaßes der enzymatischen Aktivität von CAPNll in Gegenwart der Verbindung mit dem Ausmaß der enzymatischen Aktivität von CAPNll in Abwesenheit der Verbindung und
(b) das Auswählen von Verbindungen, die das Ausmaß der enzymatischen Aktivität von CAPNll gegenüber der enzymatischen Aktivität von CAPNll in Abwesenheit der Verbindung ändern.
Die durch das vorstehend erwähnte Verfahren identifizierten hem- menden Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer unphysiologisch erhöhten CAPNll-Aktivität einhergehen oder damit verknüpft sind, wie Unfruchtbarkeit bei Männern.
Die Dosierung und das Behandlungsschema dieser Inhibitoren müssen durch Routineverfahren bestimmt werden, die von anderen Protease- inhibitoren bekannt sind.
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FIGUREN
FIG. 1. Gruppierung der vorhergesagten Aminosäuresequenz von CAPNll mit anderen menschlichen Calpainen. Die Mehrfach-Gruppie- 0 rung der Aminosäuresequenzen wurde mittels CLUSTAL W (19) durchgeführt. Das mutmaßliche Start-Methionin für CAPNll (GGAatgG) entspricht der minimalen Konsensussequenz für die Translationsstartstelle (RNNatgG, wobei R ein Purin ist, Lit. 11). Aminosäuren, die in den anderen Proteinen mit denen von CAPNll identisch 5 sind, sind schattiert. Striche bedeuten Lücken, die zur Maximie- rung des Alignments eingefügt worden sind. Pfeilspitzen deuten auf die drei konservierten Aminosäuren hin, die Teil des aktiven Zentrums der Calpaine sind. Die potentiellen EF-Hand-Calcium-Bin- dungsdomänen von CAPN8 sind unterstrichen und nacheinander durch- 0 nummeriert. Es sind die willkürlichen Domänen von Calpain angegeben. Die Sequenzen für CAPN4 und CAPN7 , die nur in Ratte bzw. Maus identifiziert worden sind, sind nicht gezeigt. Die veröffentlichte CAPN6-Sequenz wurde nicht mit aufgenommen, da sie nur eine Teilsequenz ist. Die Alternativnamen und Zugangsnummern 5 für die gruppierten Calpaine sind in der Legende von Fig. 2 angegeben . FIG. 2. Wurzelloser phylogenetischer Stammbaum der Familie der großen Untereinheit menschlicher Calpaine. Die Analyse wurde mit dem PAUP-Programm durchgeführt, und der Stammbaum mit CLUSTREE vom HUSAR-Server des Deutschen KrebsforschungsZentrums, Heidel- berg (www.dkfz-heidelberg.de) angeordnet. Die Längen der horizontalen Linien sind proportional zu den abgeleiteten phylogeneti- schen Entfernungen; die vertikalen Linien haben keine Bedeutung. Es wurden 1000 Bootstrapping-Wiederholungen durchgeführt, und die Werte sind an den inneren Knoten gezeigt. Die CAPN7-Sequenz stammt von der Maus, da nur wenig menschliche Nukleotid- und Proteinsequenz verfügbar ist. Allerdings existiert das menschliche Orthologon (siehe Lit. 8) , so daß die Verwendung der Maussequenz für diesen Vergleich gerechtfertigt ist. Die partielle menschliche CAPN8-Sequenz ist die vorhergesagte Translation des EST-Klo- nes AA026030 (Hillier et al . , 1995, The WashU-Merck EST-Projekt, unveröffentlichte Ergebnisse) . Eine Aminosäuretranslation dieses Klons zeigt hohe Ähnlichkeit zur Ratten-CAPN8-Sequenz . Mit dieser Sequenz wurde kein Bootstrapping durchgeführt, da sie viel kürzer als die anderen ist . Somit kann der Bootstrapping-Wert nicht sinnvoll mit den Werten aus Vergleichen von Vollängen-Sequenzen verglichen werden. Es wird die vom Human Gene Nomenclature Committee spezifizierte Nomenklatur verwendet. Vorherige Namen für die verschiedenen Calpaine sind: CAPNl - m-Calpain, CAPN2 - m-Calpain, CAPN3 - p94, nCl-1, CAPN8, nCL-2 , CAPN9 , nCL-4. Die EMBL-Zugangsnummern für die verwendeten Calpain-Sequenzen sind: CAPNl (P17655), CAPN2 (P07384) , CAPN3 (P20807), CAPN5 (Y10656), CAPN6 (Y12582), CAPN7 (AJ012475) und CAPN9 (AF022799).
Fig. 3. Expression von CAPNll. Eine 32P-markierte DNA-Sonde mit einem 800-Basenpaar-Segment der codierenden Sequenz der menschlichen CAPNll-cDNA wurde an einen Master-Blot (A) , einen Nylonfilter mit Dot-Blots von RNAs von 50 verschiedenen menschlichen Geweben oder einen Clontech-Mehrgewebe-Northern-Blot (D) hybridisiert. Die Filter wurden hochstringent (6x SSC, 65°C) gewaschen. Die genaue Stelle der verschiedenen RNAs auf dem Dot-Blot-Filter ist schematisch gezeigt (C) . Die RNAs auf dem Northern-Blot sind über den entsprechenden Spuren angegeben. Dot-Blot- und Northern- Blot wurden mit DNA-Sonden für menschliches Ubiquitin (B) und b-Aktin rehybridisiert, um die Mengen der aufgetragenen Poly(A+)-RNA zu bestimmen. Für den Northern-Blot sind die Stellen der Größenmarker (in Kilobasen) angegeben. Die Expositionszeiten waren: A, 72 Std. ; B, 24 Std. ; D, 48 Std. PBL = Periphere Blut- Leukocyten.

Claims

Patentansprüche
1. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ. -ID. -Nr. 2.
2. Polynukleotidsequenz , die ein Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
3. Polynukleotidsequenz mit der Sequenz SEQ. -ID. -Nr. 1.
4. Verwendung eines Polypeptides nach Anspruch 1 zur Identifizierung von Substanzen, die die enzymatische Aktivität dieses Polypeptides hemmen können.
5. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die enzymatische Aktivität eines Polypeptides nach Anspruch 1 hemmen, umfassend:
(a) das Vergleichen des Ausmaßes der enzymatischen Aktivität von CAPNll in Gegenwart der Verbindung mit dem Ausmaß der enzymatischen Aktivität von CAPNll in Abwesenheit der Verbindung und
(b) das Auswählen von Verbindungen, die das Ausmaß der enzy- atischen Aktivität von CAPNll gegenüber der enzymatischen Aktivität von CAPNll in Abwesenheit der Verbindung ändern.
6. Verwendung von Verbindungen, die durch das Verfahren nach Anspruch 5 identifiziert worden sind, zur Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen bei Männern.
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