SK18262001A3 - Kalpaíny a ich použitie - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nového cicavčieho kaplaínu CAPN11, jeho syntézy a jeho použitia.

Doterajší stav techniky

Kalpaíny sú nadrodinou príbuzných proteínov, z ktorých niektoré sa ukázali ako pôsobiace proti cysteínproteázam závislým od vápnika. U cicavcov bolo identifikovaných osem rôznych kalpaínov.

Kalpaíny tvoria rodinu vnútrobunkových cysteínproteáz závislých od vápnika. Je identifikovaný rastúci počet cicavčích kalpaínových homológov a jednotlivé členy možno rozdeliť do štyroch tried na základe fyzickej štruktúry a predpokladaných vlastností. Trieda A, „klasické kalpaíny“ CAPN1, CAPN2, CAPN3 (p94); CAPN8 (nCL-2) a CAPN9 (nCL-4) majú pravdepodobne všetky proteázovú aktivitu a sú závislé od Ca²⁺. Pozostávajú z podjednotky variabilnej veľkosti (80 kDa) a nevariantnej malej podjednotky (30 kDa). Kalpaíny triedy B a D, CAPN5 (6, 15) a CAPN7 (8), majú proteázovú aktivitu, ale veľmi pravdepodobne sú nezávislé od Ca²⁺; kalpaín triedy C, CAPN6, pravdepodobne nemá žiadnu proteázovú aktivitu. Kalpaíny možno rozdeliť aj do kategórií na báze ich vzorcov expresie, kde CAPN3, CAPN6, CAPN8 a CAPN9 vykazujú určitú tkanivovú špecifickosť. Funkcia kalpaínov je neznáma, hoci sú spojené s veľkým počtom fyziologických procesov a patologických stavov (prehľadný článok v odkaze 17). V záujme osvetlenia ich funkcie a evolučnej histórie je potrebné identifikovať celé spektrum členov kalpaínovej rodiny.

Vynález sa týka nového polypeptidu CAPN11 majúceho aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekvencia č. 2.

Nový kalpaínový proteín CAPN11 má vlastnosti typické pre kalpaíny vrátane potenciálnych proteázových a vápnik viažucich domén. Vykazuje veľmi obmedzenú tkanivovú distribúciu a exprimuje sa hlavne vtestes. Pomocou radiačného mapovania hybridov bol gén lokalizovaný na chromozóm 6 v regióne, ktorý je priradený do p12. Fylogenetická analýza odhaľuje, že CAPN11 u cicavcov je najpríbuznejší s CAPN1 a CAPN2.

Avšak predpovedaná sekvencia CAPN11 má spomedzi dostupných kalpaínových sekvencií najväčšiu homológiu s kuracím kalpaínom μ/m. CAPN11 môže byť teda ľudským ortológom kalpaínu μ/m. Objav tohto nového kalpaínu zdôrazňuje zložitosť rodiny kalpaínov, ktorej členy možno rozlišovať na základe proteázovej aktivity, závislosti od vápnika a tkanivovej expresie.

Nukleotidová sekvencia cDNA génu CAPN11 obsahuje 2338 nukleotidov (sekvencia č. 1). Sekvencia cDNA je odvodená z jedinej mRNA úspešnou amplifikáciou úplného predpokladaného kódovacieho regiónu z cDNA ľudských testes pomocou lemovacích primérov. Niekoľko klonov cDNA bolo úplne sekvencovaných, aby sa vylúčili akékoľvek artefakty PCR.

Nachádza sa tu veľký otvorený čítací rámec, ktorý kóduje proteín so 702 aminokyselinami (Mr 80 kDa) (obr. 1). Aminokyselinová sekvencia pripomína veľkú podjednotku členov kalpaínovej rodiny (obr. 1). Proteín možno rozdeliť na štyri domény typické pre kalpaín. Doména II vykazuje vlastnosti proteázovej domény a predpovedaná aminokyselinová sekvencia má tri aminokyselinové sekvencie (Cys102, His259 a Asn283), ktoré sú súčasťou aktívneho miesta cysteínproteáz (2). Aminokyselinová sekvencia všetkých piatich sekvencií viažucich Ca²⁺ opísaných pre CAPN2 (4, 12) je do istej miery konzervovaná (obr. 1). Tento proteín má teda proteázové vlastnosti a vlastnosti viazania vápnika. Porovnanie predpovedanej aminokyselinovej sekvencie so sekvenciami všetkých ostatných kalpaínov odhalilo najväčšou homológiu sekvencií (57,5 %) s kuracím kalpaínom μ/m. U cicavčích kalpaínov bola najväčšia podobnosť s ľudským CAPN1 (54,3 % homológia). Najmenej podobný ľudský kalpaín, s iba 18,7% homológiou, bol

CAPN6. Gén zodpovedajúci tejto cDNA bol označený Výborom pre nomenklatúru ľudských génov ako CAPN11.

Celá aminokyselinová sekvencia všetkých identifikovaných ľudských kalpaínov bola podrobená fylogenetickej analýze. Výsledky umožňujú klasifikovať ľudské kalpaíny do štyroch hlavných evolučných skupín (obr. 2). Prvú skupinu predstavuje CAPN5, CAPN6, CAPN7 a CAPN8, druhú skupinu CAPN1 a CAPN2, tretiu skupinu CAPN3 a CAPN9 a štvrtá skupina pozostáva zCAPNU. Fylogenetická analýza teda naznačuje, že CAPN11 predstavuje osobitnú kalpaínovú podrodinu.

Expresia CAPN11 v ľudských tkanivách bola skúmaná Northem a RNA dotblot analýzami. Z 50 skúmaných tkanivových RNA sa CAPN11 mRNA exprimovala najsilnejšie v testes (obr. 3A). Špecifickosť tohto signálu bola potvrdená Northern blot analýzou a zodpovedala mRNA veľkosti približne 3 kb (Fig. 3D). Oveľa slabšie signály boli zistené v týmuse a v prsnej žľaze. Význam tohto zistenia je však nejasný, pretože ďalšie skúmanie týmusovej RNA pomocou Northern blot analýzy nedalo žiadny signál napriek dlhým expozičným časom (obr. 3D a neuvedené dáta). Možným vysvetlením by mohlo byť, že tento slabý signál možno pripísať krížovej hybridizácii s príbuznými mRNA. Testes sú teda hlavným miestom expresie CAPN11, hoci nemôžeme vylúčiť možnosť, že gén sa exprimuje v iných tkanivách, ktoré neboli skúmané.

Určili sme, na ktorom chromozóme sa nachádza ľudský gén CAPN11. Pomocou PCR sme priradili, ktoré priméry sú špecifické pre nukleotidovú sekvenciu ľudského CAPN11 a pomocou somatického ľudsko-hlodavčieho bunkového hybridného mapovacieho panela, gén ku chromozómu 6 (Correll Celí Repositories). Pomocou radiačného hybridného mapovania pomocou panela Stanford G3 so stredným rozlíšením (Research Genetics Inc.) a databázy na Stanford Human Genome Center (shgc-www.stanford.edu) sa gén lokalizoval 5 centiray od markera SHGC-32834 na tomto chromozóme (LOD skóre 12,87). Tento marker sa nachádza v intervale medzi mikrosatelitnými markermi D6S1616 (59,6 cM) a D6S427 (73,9 cM) (7) a marker v tomto intervale, D6S269, bol cytogeneticky priradený k 6p12 (5). CAPN11 sa teda nachádza na chromozóme 6 v blízkosti p12. Na tomto chromozóme nebol lokalizovaný žiadny iný kalpaínový gén.

Kurací kalpaín μ/m bol prvým členom rodiny kalpaínov, ktorý bol klonovaný (16). Pôvodne sa označoval ako kalpaín m, ale bol reklasifikovaný po identifikovaní ďalších kuracích kalpaínov, ktoré sú veľmi pravdepodobne ortológne voči cicavčím kalpaínom μ a m (18). Žiadny cicavčí kalpaín μ/m však ešte nebol určený. Keďže však CAPN11 vykazuje vyššiu homológiu s kuracím kalpaínom μ/m ako sinými cicavčími kalpaínmi, môže ísť o jeho ortológ.

Doposiaľ je zistených 5 kalpaínov vykazujúcich určitý stupeň tkanivovej špecifickosti - CAPN3 (kostrové svalstvo), CAPN6 (placenta), CAPN8 (pravdepodobne hladká svalovina), CAPN9 (žalúdok a tenké črevo) a CAPN11 (testes). V testes bolo identifikovaných mnoho proteáz a predpokladá sa, že sú zapojené do procesov ako reorganizácia tkaniva (20), regulácia spermatogenézy (14), prenikanie spermií cez zónu pellucida (10) a plodnosť (13). Mnohé z týchto aktivít sú však závislé od vylučovaných proteáz aCAPN11 má pravdepodobne vnútrobunkovú lokalizáciu. V testes by mohol byť zapojený do procesov, na ktorých sa zúčastňujú aj kalpainy v iných tkanivách, napríklad apoptóza zárodočných buniek (3) alebo regulácia transkripčných faktorov špecifických pre testes.

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka použitia polypeptidu CAPN11 na identifikáciu látok, ktoré sú schopné inhibovať enzymatickú aktivitu tohto polypeptidu, nazývaných kalpaínové inhibítory, najmä tých kalpaínových inhibítorov, ktoré sú selektívne pre CAPN11. Selektivita znamená, že také kalpaínové inhibítory inhibujú aktivitu CAPN11 viac ako aktivitu iných vyššie uvedených kalpaínov, najmä s výhodou aspoň 10 krát a s väčšou výhodou 25 krát viac. Enzýmová aktivita CAPN11 je proteázovou aktivitou závislou od Ca.

Ďalší aspekt vynálezu sa týka spôsobu identifikácie zlúčenín, ktoré inhibujú enzýmovú aktivitu polypeptidu podľa nároku 1, zahŕňajúceho:

(a) porovnanie rozsahu enzýmovej aktivity CAPN11 za prítomnosti zlúčeniny s rozsahom enzýmovej aktivity CAPN11 bez prítomnosti zlúčeniny a (b) výber zlúčenín, ktoré menia rozsah enzýmovej aktivity CAPN11 v porovnaní s enzýmovou aktivitou CAPN11 za neprítomnosti zlúčeniny.

Inhibujúce zlúčeniny identifikované vyššie uvedeným spôsobom sú vhodné na liečbu porúch spojených alebo súvisiacich s nefyziologicky zvýšenou aktivitou CAPN11, napríklad neplodnosti u mužov.

Dávkovanie a liečebný režim pre tieto inhibítory sa musí určiť rutinnými metódami známymi pre iné proteázové inhibítory.

Použitá literatúra

1. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. a Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment sequencing tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

2. Berti, P. J a Storer, A. C. (1995). Alignment/Phylogeny of the papain superfamily of cysteine proteases. J. Mol. Biol. 246: 273-283.

3. Billig, H., Chun S. Y., Eisenhauer K. a Hsueh, A. J. (1996). Gonadal celí apoptosis. Hormone-regulated celí demise. Hum. Reprod. Update 2:103-117.

4. Blanchard, H., Grochulski, P., Li, Y., Arthur, J. S. C., Davies, P. L., Eice, J. S. a Cygler, M. (1997). Structure of a Ca²⁺-binding domain reveals a novel EFhand and Ca²⁺-induced conformational changes. Náture Structural Biology 4: 532-538.

5. Bray-Ward, P., Menninger, J., Lieman, T., Desai, T., Mokady, N., Banks, A. a Ward, D. C. (1996). Integration of the cytogenetic, geneticand physical maps of the human genome by FISH mapping of CEPH YAC dones. Genomics 32:

1-14.

6. Dear, N., Matena, K., Vingron, M. a Boehm, T. (1997). A new subfamily of vertebrate calpains lacking a calmodulin-like domain: Implications for calpain regulation and evolution. Genomics 45:175-184.

7. Deloukas, P. et al. (1998). A physical map of 30,000 human genes. Science 282: 744-746.

8. Franz, T., Vingron, N., Boehm, T. a Dear, T.N. (1999). Capn7: A highly divergent vertebrate calpain with a novel C-terminal domain. Mamm. Genome, 10:318-321.

9. Frohman, M. A., Dush, M. K. a Martin, G. R. (1988). Rapid production of fulllength cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002.

10. Kohno, N., Yamagata, K., Yamada, S., Kasiwabara, S., Sakai, Y. a Baba, T. (1998). Two novel testicular serine proteases, TESP1 and TESP2, are present in the mouse sperm. acrosome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245:658-665.

11. Kozák, M. (1996). Interpreting cDNA sequences: some insights from studies on translation. Mamm. Genome 7: 563-574.

12. Lin, G.-D., Chattopadhyay, D., Maki, M., Wang, K.K.W., Carson, M., Jin, L., Yuen, P.-W., Takano, E., Hatanaka, M., DeLucas, L. J. a Narayana, S. V. L. (1997). Crystal structure of calcium bound domain VI of calpain at 1.9 A, resolution and its role in enzýme assembly, regulation, and inhibitor binding. Náture Structural Biology 4: 539-547.

13. Mbikay, M., Tadros, H., Ishida, N., Lerner, C. P., De Lamirande, E., Chen, A., El-Aify, M., Clermont, Y., Seidah, N.G., Chretien, N., Gagnon, C. a Simpson, E.M. (1997). Impaired fertility in mice deficient for the testicular germ-cell protease PC4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6842-6846.

14. Monsees, T. K., Gornig, N., Schill, W. B. a Miska, W. (1998). Possible involvement of proteases in the regulation of spermatogenesis. Andrologia 30:185-191.

15. Mugita, N., Kimura, Y., Ogawa, M., Saya, H. a Nakao, M. (1997), Identification of a novel, tissue-specific calpain htra-3; a human homologue of the Caenorhabditis elegans sex determination gene. Biochem. Biophys. Res. Comm. 239:845-850.

16. Ohno, S., Emori, Y., Imajoh, S., Kawasaki, H., Kisaragi, M. a Suzuki, K. (1984). Evolutionary origin of a calcium-dependent protease by fusion of genes for a thiol protease and a calcium-binding protein? Náture 312: 566570.

17. Ono, Y., Sorimachi, H. a Suzuki, K. (1998). Structure and physiology of calpain, an enigmatic protease. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245:289294.

18. Sorimachi, H., Tsukahara, T., Okada-Ban, M., Sugita, H., Ishiura, S. a Suzuki,

K. (1995). Identification of a third ubiquitous calpain species - chicken muscle expresses four distinct calpains. Biochim. Biophys. Ada 1261: 381-393.

19. Thompson J. D., Higgins D. G. a Gibson T. J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res. 22:4673-4680.

20. Tohonen, V., Osterlund, C. a Nordqvist, K. (1998). Testatin: A cystatin-related gene expressed during early testis development. Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:14208-14213.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1. Zoskupenie predpokladanej aminokyselinovej sekvencie CAPN11 s inými ľudskými kalpaínmi. Viacnásobné zoskupenie aminokyselinových sekvencií sa uskutočnilo pomocou CLUSTAL W (19). Predpokladaný počiatočný metionín pre CAPN11 (GGAatgG) zodpovedá minimálnej konsenzuálnej sekvencii pre miesto začínajúce transláciu (RNNatgG, kde R je purín, lit. 11). Aminokyseliny v iných proteínoch, ktoré sú identické s aminokyselinami vCAPNU, sú vytieňované. Čiarky naznačujú medzery, ktoré boli zavedené v záujme maximalizácie zarovnania. Šípky ukazujú na tri konzervované aminokyseliny, ktoré sú súčasťou aktívneho miesta kalpaínov. Potenciálne EF-hand vápnik viažuce domény CAPN8 sú podčiarknuté a očíslované v poradí. Ľubovoľné domény kalpaínu sú vyznačené. Sekvencie pre CAPN4 a CAPN7, ktoré boli identifikované len u potkana, resp. myši, nie sú zobrazené. Publikovaná sekvencia CAPN6 nebola zahrnutá, pretože ide len o čiastočnú sekvenciu. Alternatívne názvy a prírastkové čísla pre zoskupené kalpaíny sú uvedené v legende pre obrázok 2.

Obrázok 2. Bezkorenný fylogenetický strom rodiny najväčšej podjednotky ľudských kalpaínov. Analýza sa uskutočnila pomocou programu PAUP a strom bol usporiadaný pomocou CLUSTREE zo servera HUSÁR organizácie Deutsche Krebsforschungszentrums, Heidelberg (www.dkfz-heidelberg.de). Dĺžky vodorovných čiar sú úmerné odvodeným fylogenetickým vzdialenostiam; zvislé čiary nemajú žiadny význam. Uskutočnilo sa 1000 bootstrapping opakovaní a hodnoty sú zobrazené pri interných uzloch. Sekvencia CAPN7 je odvodená z myši, pretože je k dispozícii len málo z ľudského nukleotidu a proteínovej sekvencie. Ľudský ortológ skutočne existuje (pozrite literatúru 8), takže použitie myšacej sekvencie pre toto porovnanie je odôvodnené. Čiastočná sekvencia ľudského CAPN8 je predpokladaná translácia klonu EST AA026030 (Hillier et al., 1995, projekt WashU-Merck EST, nepublikované výsledky). Aminokyselinová translácia tohto klonu vykazuje veľkú podobnosť so sekvenciou potkanieho CAPN8. Pri tejto sekvencii sa neuskutočnil žiadny bootstrapping, pretože je oveľa kratšia ako ostatné. Preto nie je možné žiadne rozumné porovnanie bootstrapping hodnoty s hodnotami z porovnaní sekvencii s plnou dĺžkou. Používa sa názvoslovie špecifikované Výborom pre nomenklatúru ľudských génov. Predchádzajúce názvy pre rôzne kalpaíny sú: CAPNI - m kalpaín, CAPN2 - m kalpaín, CAPN3 - p94, nCI1, CAPN8, nCL-2, CAPN9, nCL-4. Prírastkové čísla EMBL pre použité kalpaínové sekvencie sú: CAPNI (P17655), CAPN2 (P07384), CAPN3 (P20807), CAPN5 (Y10656), CAPN6 (Y12582), CAPN7 (AJ012475) a CAPN9 (AF022799).

Obrázok 3. Expresia CAPN11. DNA sonda označená pomocou ³²P s 800 bázovopárovým segmentom kódujúcej sekvencie cDNA ľudského CAPN11 sa hybridizovala na master blot (A), nylonovom filtri s bodovými škvrnami RNA z 50 rôznych ľudských tkanív alebo Clontech mnohotkanivovom Northern blot (D). Filtre sa premyli s vysokou stringentnosťou (6 x SSC, 65 °C). Presné miesto rôznych RNA na filtri s bodovými škvrnami je zobrazené ako diagram (C). RNA na Northern blot sú indikované na príslušných dráhach. Bodové škvrny a Northern blot sa rehybridizovali so sondami DNA pre ľudský ubikvitín (B) a P-aktín, aby sa určili množstvá zavedenej poly(A+) RNA. Miesta veľkostných markerov (v kilobázach) sú indikované pre Northern blot. Expozičné časy boli: A, 72 h; B, 24 h; D, 48 h, PBĽ = leukocyty periférnej krvi (peripheral blood leukocytes).

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou č. 2.
2. 2. Polynukleotidová sekvencia, ktorá kóduje polypeptid podľa nároku 1.
3. 3. Polynukleotidová sekvencia so sekvenciou č. 1.
4. 4. Použitie polypeptidu podľa nároku 1 na identifikáciu látok schopných inhibovať enzýmovú aktivitu tohto polypeptidu.
5. 5. Spôsob identifikácie zlúčenín, ktoré inhibujú enzýmovú aktivitu polypeptidu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

   (a) porovnanie rozsahu enzýmovej aktivity CAPN11 za prítomnosti zlúčeniny s rozsahom enzýmovej aktivity CAPN11 bez prítomnosti zlúčeniny a (b) výber zlúčenín, ktoré menia rozsah enzýmovej aktivity CAPN11 v porovnaní s enzýmovou aktivitou CAPN11 za neprítomnosti zlúčeniny.
6. 6. Použitie zlúčenín, ktoré boli identifikované spôsobom podľa nároku 5, na liečbu porúch plodnosti u mužov.