JP2003503023A - 新規カルパインおよびその使用 - Google Patents

新規カルパインおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 新規カルパインおよびその使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規の哺乳類カルパイン ＣＡＰＮ１１、その合成方法およびその
使用に関する。
【０００２】 カルパインは、関連するタンパク質のスーパーファミリーであり、これらのい
くつかはカルシウム依存性システインプロテアーゼとして作用することが証明さ
れている。８個の異なるカルパインが、哺乳類において同定されている。
【０００３】 カルパインは、細胞内カルシウム依存性システインプロテアーゼのファミリー
を形成する。哺乳類カルパインのホモログ数の増加が明らかにされ、かつ、それ
ぞれのメンバーは、物理的構造および予測される性質に基づいて、４個のクラス
に分類することができる。クラスＡの“古典的カルパイン”であるＣＡＰＮ１、
ＣＡＰＮ２、ＣＡＰＮ３（ｐ９４）；ＣＡＰＮ８（ｎＣＬ−２）およびＣＡＰＮ
９（ｎＣＬ−４）のすべては、プロテアーゼ活性を有し、かつＣａ２＋依存性で
あると考えられる。これらは、可変の大きさ（８０ｋＤａ）のサブユニットおよ
び不変の小サブユニット（３０ｋＤａ）から成る。クラスＢおよびＤのカルパイ
ン、ＣＡＰＮ５（６，１５）およびＣＡＰＮ７（８）は、プロテアーゼ活性を有
するが、しかしながら、おそらくはＣａ２＋−非依存性であると考えられ；クラ
スＣのカルパイン、ＣＡＰＮ６は、おそらくはプロテアーゼ活性ではないと考え
られている。また、カルパインは、これらの発現パターンに基づくカテゴリーに
分類することができ、その際、ＣＡＰＮ３、ＣＡＰＮ６、ＣＡＰＮ８およびＣＡ
ＰＮ９はいくつかの組織特異性を示す。多くの生理学的過程および病理学的状態
と関連しているが、カルパインの機能はよく知られていない（参考文献１７に記
載）。その機能および進化の歴史を明かにするために、カルパインファミリーの
それぞれの完全なスペクトルを明かにすることが必要である。
【０００４】 本発明は、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を有する新規ポリペプチドＣ
ＡＰＮ１１に関する。
【０００５】 新規カルパインタンパク質ＣＡＰＮ１１は、潜在的なプロテアーゼドメインお
よびカルシウム結合ドメインを含む典型的なカルパインの特性を有する。これは
、かなり制限された組織分布を示し、かつ、主に精巣で発現する。放射線ハイブ
リッドマッピング（radiation hydrid mapping）の方法によって、遺伝子は、ｐ
１２とされる領域中で第６染色体に配置付けされた。系統発生学的分析は、哺乳
類のＣＡＰＮ１１が、ＣＡＰＮ１とＣＡＰＮ２に対して最も密接に関連している
ことを示す。
【０００６】 しかしながら、予測されるＣＡＰＮ１１配列は、入手可能なカルパイン配列中
で、ニワトリカルパインμ／ｍと最も多くのホモログを有する。したがって、Ｃ
ＡＰＮ１１は、ヒトμ／ｍカルパインのオーソロガス遺伝子（ortholog）であっ
てもよい。この新規カルパインの発見は、プロテアーゼ活性、カルシウム依存性
および組織発現に基づいて識別することができる、カルパインファミリー構成の
複雑性を際だたせるものである。
【０００７】 ＣＡＰＮ１１遺伝子のｃＤＮＡヌクレオチド配列は、２３３８個のヌクレオチ
ドを有する（配列番号１）。ｃＤＮＡ配列は、フランキングプライマー（flanki
ng primers）法による、ヒト精巣ｃＤＮＡからの完全な予測されるコード領域の
良好な増幅によって一本鎖ｍＲＮＡから誘導される。いくつかのｃＤＮＡクロー
ンが、任意のＰＣＲ産物を排除するために、完全にシーケンスされる。
【０００８】 ７０２個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする大きいオープンリーディ
ングフレーム（Ｍｒ８０ｋＤａ）が存在する（図１）。アミノ酸配列は、カルパ
インファミリーの一員の大サブユニットと類似している（図１）。タンパク質は
、４個のカルパインの典型的なドメインに分けられてもよい。ドメインＩＩは、
プロテアーゼドメインの性質を示し、かつ、推定されるアミノ酸配列は、３個の
アミノ酸残基を有し（Cys102, His259およびAsn283）、この場合、これは、シス
テインプロテアーゼの活性部位の一部分である（２）。ＣＡＰＮ２に関して記載
された全部で５個のＣａ２＋−結合配列のアミノ酸配列（４，１２）は、一定の
範囲で保存される（図１）。したがって、このタンパク質は、おそらくはプロテ
アーゼおよびカルシウム結合の性質を有する。他のすべてのカルパインのアミノ
酸配列と、予測されるアミノ酸配列との比較は、ニワトリμ／ｍカルパインとの
最も多い配列ホモログ（５７．５％）を示した。哺乳類カルパインにおいて、最
も多い類似性は、ヒトＣＡＰＮ１とのものである（５４．３％のホモロジー）。
たったの１８．７％ホモロジーの、最も少ない類似性を有するヒトカルパインは
ＣＡＰＮ６であった。このｃＤＮＡに相当する遺伝子は、ヒューマンジーンノー
メンクレイターコミッティー（Human Gene Nomenclator Committe）によって、
ＣＡＰＮ１１と表された。
【０００９】 すべての同定されたヒトカルパインの完全なアミノ酸配列は、系統発生学的分
析をおこなった。結果から、ヒトカルパインを４個の主要な進化群に分類するこ
とができる（図２）。第１群は、ＣＡＰＮ５、ＣＡＰＮ６、ＣＡＰＮ７およびＣ
ＡＰＮ８であり、第２群は、ＣＡＰＮ１およびＣＡＰＮ２、第３群は、ＣＡＰＮ
３およびＣＡＰＮ９であり、かつ、第４群は、ＣＡＰＮ１１によって表される。
したがって、系統発生学的分析は、ＣＡＰＮ１１が別個のカルパインサブファミ
リーであることを示す。
【００１０】 ヒト組織中のＣＡＰＮ１１の発現は、ノーザンおよびＲＮＡドットブロット分
析によって試験された。５０個の組織ＤＮＡが試験され、ＣＡＰＮ１１ ｍＲＮ
Ａは精巣中で最も強く発現した（図３Ａ）。このシグナルの特異性は、ノーザン
ブロット分析によって確認され、かつ、ｍＲＮＡは約３ｋｂの大きさに相当した
（図３Ｄ）。弱いシグナルは、胸腺および乳腺中で検出された。しかしながら、
このシグナルの意味は不明確であり、それというのも、ノーザンブロット分析に
よる胸腺ＲＮＡの他の試験が、長い暴露時間にもかかわらず、シグナルを生じな
かったためである（図３Ｄ、データなし）。考えられうる説明は、この弱いシグ
ナルが、関連するｍＲＮＡでのクロスハイブリダイゼーションによるものであろ
うということである。したがって、試験されていない他の組織中に遺伝子が発現
するという可能性は排除することができないけれども、精巣は、ＣＡＰＮ１１の
主な発現部位である。
【００１１】 ヒトＣＡＰＮ１１遺伝子が配置されている染色体を測定した。我々は、ヒトＣ
ＡＰＮ１１ヌクレオチド配列に関して特異的なプライマーを有するＰＣＲの方法
によって、かつ、ヒト／齧歯類体細胞ハイブリッドマッピングパネルで、第６染
色体に対する遺伝子を示した。メディウム−リソリューション スタンフォード
Ｇ３パネル（medium-resolution Stanford G3 panel）（Research Genetics Inc
.）を用いての放射線ハイブリッドマッピング法（radiation hydrid mapping）
およびスタンフォードヒューマンゲノムセンター（Stanford Human Genome Cent
er）（shgc-www. stanford. edu）のデーターベースを用いて、遺伝子は、この
染色体（LOD score 12.87）上でマーカーＳＨＧＣ−３２８３４から５センチレ
イ（centiray）離れて配置された（LOD score 12.87）。このマーカーは、マイ
クロサテライトマーカー（microsatelite marker）Ｄ６Ｓ１６１６（５９．６ｃ
Ｍ）とＤ６Ｓ４２７（７３．９ｃＭ）との間に配置され（７）、かつ、この間隔
中のマーカー、Ｄ６Ｓ２６９は、６ｐ１２に細胞遺伝的に指定されている（５）
。したがって、ＣＡＰＮ１１は、ｐ１２のの付近で、第６染色体上に配置されて
いる。他のカルパイン遺伝子はこの染色体上には配置されていない。
【００１２】 ニワトリμ／ｍカルパインは、クローン化されるべきカルパインファミリーの
第１のカルパインである（１６）。本来はｍカルパインと呼称されていたが、し
かしながら、哺乳類μおよびｍカルパインのおおよそのオルソロガス遺伝子であ
る他のニワトリカルパインの同定の後に再度分類された（１８）。しかしながら
、哺乳類μ／ｍカルパインはいまだ決定されていない。それというのも、ＣＡＰ
Ｎ１１は、他の哺乳類カルパインよりも、ニワトリμ／ｍカルパインとの優れた
ホモロジーを示し、この場合、これは、これらのオルソロガス遺伝子であっても
よい。
【００１３】 今日までに、５個のカルパインは、組織特異性の一定の度合い−ＣＡＰＮ３（
骨格筋）、ＣＡＰＮ６（胎盤）、ＣＡＰＮ８（おそらくは平滑筋）、ＣＡＰＮ９
（胃および小腸）およびＣＡＰＮ１１（精巣）を示している。多くのプロテアー
ゼは、精巣中で認められ、かつ、たとえば、組織の再構成化（２０）、精子形成
の調整（１４）、精子による透明帯への侵入（１０）および受精のような過程中
に含まれるものと推測される。しかしながら、多くのこれらの活性は、分泌され
たプロテアーゼに依存し、かつ、ＣＡＰＮ１１はおそらくは細胞内局在を有する
。精巣中において、たとえば、生殖細胞アポトーシス（３）または精巣特異的転
写因子の調整のような他の組織中のカルパインが含まれる工程を含んでいてもよ
い。
【００１４】 本発明の他の態様は、カルパイン阻害剤と呼称される、本発明のポリペプチド
の酵素活性を阻害可能な物質、特にＣＡＰＮ１１選択的カルパイン阻害剤を同定
するための、このポリペプチドＣＡＰＮ１１の使用に関する。選択性は、このよ
うなカルパイン阻害剤が、前記に挙げられた他のカルパインの活性よりも多く、
とくに好ましくは少なくとも１０倍、およびより好ましくは２５倍以上、ＣＡＰ
Ｎ１１活性を抑制することを示す。ＣＡＰＮ１１の酵素活性は、カルシウム依存
型プロテアーゼ活性である。
【００１５】 本発明の他の態様は、請求項１に記載のポリペプチドの酵素活性を阻害する、
化合物を同定するための方法に関し、この場合、この方法は、以下の工程を含む
： （ａ）化合物の存在下でのＣＡＰＮ１１の酵素活性の程度と、化合物の不在下で
のＣＡＰＮ１１の酵素活性の程度とを比較し、かつ、 （ｂ）化合物の不在下でのＣＡＰＮ１１の酵素活性と比較して、ＣＡＰＮ１１の
酵素活性の程度を変化させた化合物を選択する。
【００１６】 前記に示された方法によって同定された阻害剤化合物は、非生理学的に上昇し
たＣＡＰＮ１１活性に付随するかまたは関連する疾患、たとえば、ヒトの生殖機
能障害の治療に適している。
【００１７】 前記阻害剤に関する投与量および治療計画は、他のプロテアーゼ阻害剤に関し
て公知の方法によって定められなければならない。
【００１８】 参考文献
【００１９】
【外１】
【００２０】
【外２】
【００２１】
【外３】
【００２２】 図面 図１は、他のヒトカルパインでのＣＡＰＮ１１の予測されるアミノ酸配列のグ
ループ分けを示す。アミノ酸配列の複合的なグループ分けは、ＣＬＵＳＴＡＬ
Ｗ（１９）を用いて実施した。ＣＡＰＮ１１のための予測される開始メチオニン
（ＧＧＡａｔｇＧ）は、翻訳開始部位に対する最少のコンセンサス配列に相当す
る（ＲＮＮａｔｇＧ、その際、Ｒはプリンである。参考文献１１）。ＣＡＰＮ１
１のアミノ酸と同一の他のタンパク質中のアミノ酸は暗色にされている。ダッシ
ュは、整合（alignment）を最大化するために導入されているギャップを示す。
矢じりは、カルパインの活性部位の一部分である３個の保存的アミノ酸を示す。
ＣＡＰＮ８の潜在的なＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメインは、下線が引かれ、
かつ、連続的に番号付けされた。カルパインの任意の領域が示された。それぞれ
ラットおよびマウス中でのみ同定されているＣＡＰＮ４およびＣＡＰＮ７に関す
る領域は示されていない。開示されているＣＡＰＮ６配列が含まれていないが、
それというのも、これが、単に部分的な配列であるからである。グループ化され
たカルパインの二者択一的な名前および受託番号は、図２に示されている。
【００２３】 図２は、ヒトカルパインの大きいサブユニットのファミリーの不安定な系統樹
を示す。この分析は、ＰＵＡＰプログラムによって実施され、かつ系統樹は、ド
イチュ クレプスフォルシュングツエントウルム、ハイデルベルグ（Deutsche k
rebsforschungszentrums, Heidelberg）（ｗｗｗ．ｄｋｆｚ−ｈｅｉｄｅｌｂｅ
ｒｇ．ｄｅ）のＨＵＳＡＲサーバーからのＣＬＵＳＴＲＥＥを用いて分類された
。横線の長さは誘導された系統発生的距離に比例し；縦線は意味をもたない。１
０００回のブートストラッピング反復（bootstrapping repetition）が実施され
、かつ、値は内部分岐（internal node）で示された。ＣＡＰＮ７配列はマウス
から誘導されたが、それというのも、少量のヒトヌクレオチド配列およびタンパ
ク質配列しか入手可能でなかったためである。ヒトオーソロガス遺伝子が、事実
上存在するために（参考文献８参照）、したがって、この比較のためのマウス配
列の使用は正当である。部分的ヒトＣＡＰＮ８配列は、ＥＳＴクローンＡＡ０２
６０３０の予測された翻訳である（Hillier et al., 1995, The WashU-Merck ES
T project, unpublished results）。このクローンのアミノ酸翻訳は、ラットＣ
ＡＰＮ８配列のものとかなりの類似性を示す。ブートストラッピングがこの配列
で実施されることはなく、それというのも、他の配列よりも短いためである。し
たがって、ブートストラッピング値と完全長の配列の比較からの値との厳密な比
較は不可能である。ヒューマンジーンノーメンクレイターコミッティー（Humen
Gene Nomenclature Comittee）によって特定化された命名法が使用される。種々
のカルパインに関する従来的な名前は：ＣＡＰＮ１はｍカルパインであり、ＣＡ
ＰＮ２はｍカルパインであり、ＣＡＰＮ３はｐ９４、ｎＣｌ−１であり、ＣＡＰ
Ｎ８はｎＣＬ−２であり、ＣＡＰＮ９はｎＣＬ−４である。使用されるカルパイ
ン配列に関するＥＭＢＬ受託番号は：ＣＡＰＮ１（ｐ１７６５５）、ＣＡＰＮ２
（ｐ０７３８４）、ＣＡＰＮ３（ｐ２０８０７）、ＣＡＰＮ５（Ｙ１０６５６）
、ＣＡＰＮ６（Ｙ１２５８２）、ＣＡＰＮ７（ＡＪ０１２４７５）およびＣＡＰ
Ｎ９（ＡＦ０２２７９９）である。
【００２４】 図３は、ＣＡＰＮ１１の発現を示す。ヒトＣＡＰＮ１１ ｃＤＮＡのコーディ
ング配列の８００塩基対のセグメントを有する３２Ｐ−標識化ＤＮＡプローブを
、マスターブロット（Ａ）、５０個の異なるヒト組織からのＲＮＡｓのドットブ
ロットを有するナイロンフィルターまたはクローンテック マルチプルティッシ
ュノーザンブロット（Clontech multiple tissue Northern blot）（Ｄ）上でハ
イブリダイズした。フィルターを、高ストリンジェンシー（６ｘＳＳＣ、６５℃
）で洗浄した。ドットブロットフィルター上の種々のＲＮＡｓの正確な位置が図
示されている（Ｃ）。ノーザンブロット上のＲＮＡｓは、対応するレーン上に示
される。ドットブロットおよびノーザンブロットは、ロードされたポリ（Ａ＋）
ＲＮＡの量を測定するために、ヒトユビキチン（Ｂ）およびβ−アクチンに関す
るＤＮＡプローブで再度ハイブリダイズされた。サイズマーカーの位置（キロベ
ーズ）は、ノーザンブロットのために示された。暴露時間は：Ａ、７２時間；Ｂ
、２４時間；Ｄ、４８時間、ＰＢＬ＝末梢血白血球
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 他のヒトカルパインでのＣＡＰＮ１１の予測されるアミノ酸配列のグループ分
けを示す図。
【図２】 ヒトカルパインの大サブユニットのファミリーの不安定な系統樹を示す図。
【図３】 ＣＡＰＮ１１の発現を示すブロット図。Ａはマスターブロット図、Ｂはヒトユ
ビキチンに関するプローブを用いてのブロット図、Ｃはドットブロットフィルタ
ー上の種々のＲＮＡｓの正確な位置を示す図、Ｄはクローンテック マルチプル
ティッシュノーザンブロット図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アーヒム メラー ドイツ連邦共和国 グリューンシュタット イム ツァウンリュッケン 10 Ｆターム(参考） 2G045 CB01 CB17 CB26 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 CA09 CA20 GA11 HA11 HA13 HA14 4B050 CC01 CC03 DD11 EE01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA05 QA18 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QQ95 QR16 4C084 AA16 NA14 ZA812

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
    ド配列。
  3. 【請求項３】 配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド配列。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のポリペプチドの酵素活性を阻害しうる物質
    を同定するための、請求項１に記載のポリペプチドの使用。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドの酵素活性を阻害する化合物
    を同定するための方法において、 （ａ）化合物の存在下でのＣＡＰＮ１１の酵素活性の程度と、化合物の不在下で
    のＣＡＰＮ１１の酵素活性の程度とを比較し、 （ｂ）化合物の不在下でのＣＡＰＮ１１の酵素活性と比較して、ＣＡＰＮ１１の
    酵素活性の程度を変化させる化合物を選択する、 ことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの酵素活性を阻害する化合物
    を同定するための方法。
  6. 【請求項６】 ヒトにおける生殖機能障害を治療するための、請求項５に記
    載の方法によって同定された化合物の使用。
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