JP2002530110A - 哺乳動物のウロテンシンii及びその応用 - Google Patents

哺乳動物のウロテンシンii及びその応用

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Abstract

(57)【要約】 この発明は、ウロテンシン(UII)の構造を有する哺乳動物のペプチド、及び特に脊髄の神経変性疾患もしくは外傷の治療用組成物形態の医薬品としてのその使用に関する。このポリペプチドは、ウロテンシンIIファミリーに属し、かつヒトのプレプロ-ウロテンシンIIに相当するポリペプチド配列SEQ ID NO:1と少なくとも45%、好ましくは少なくとも70%の類似性を有することを特徴とする、次の配列: Cys-Phe,Trp-Lys-Tyr-Cys-Xaa (XaaはVal又はIleを示す)を有するヘプタペプチドをC-末端に含む。また、この発明は、ポリペプチドをコードする核酸配列、該配列に含まれるオリゴヌクレオチド、及びプライマー及びプローブとしての、ならびに哺乳動物のウロテンシンIIを発現させるためのその使用に関する。また、この発明は、高血圧活性のアンタゴニストを選択するための該ポリペプチドの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は、哺乳動物、特にヒト又はマウス由来の、ウロテンシンII (UII)型(
プレプロ-ウロテンシンII、プロ-ウロテンシンII及びウロテンシンII)の構造を
有するポリペプチド、及び特に脊髄に対する神経変性外傷疾患(片麻痺、対麻痺)
の治療用組成物の形態の医薬品として、及び抗高血圧医薬品のスクリーニング手
段としてのその応用にも関する。 また、この発明は、該ポリペプチドをエンコードする核酸配列、該配列中に含
まれるオリゴヌクレオチド、及びプライマーならびにプローブとしての、又は哺
乳動物のウロテンシンII、特にヒトもしくはマウスのウロテンシンIIを発現させ
るための該配列の使用に関する。
【0002】 ウロテンシンIIは、硬骨魚類のウロファイシス(urophysis)で最初に特徴付け
られた神経ペプチドである。これらの魚類で、ウロテンシンIIは、12アミノ酸か
らなる環状ペプチドである。幾つかの種類の硬骨魚類 におけるウロテンシンII
の特性付けは、C-末端環状ヘプタペプチドの構造は保存されるが、置換は分子の
N-末端部で認められることを示している。このヘプタペプチドは、以下の配列を
有する: Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val (SEQ ID NO:9) (1-3)。 何年もの間、このペプチドは、硬骨魚類のウロファイシス、脊髄の尾部末端に
位置する、神経下垂体との類似性を示す小さな神経血管器官で独占的に生産され
ると考えられていた(3)。しかし、この神経ペプチドは魚類の尾部神経分泌系に
制限されないことが、明らかになっている。それは、マス、ガンギエイ(4)又は
ヤツメウナギ(5)の脳の抽出物からも単離されている。さらに、魚類のウロテン
シンIIに類似したペプチドは、カエル(ラナ・リビブンダ(Rana ridibunda))の中
枢神経系(CNS)(6)で、また腹足類(アプリシア・カルフォルニカ(Aplysia califo
rnica))の脳神経節(7)で検出されている。
【0003】 このペプチドは、カエルでは13アミノ酸からなり、魚類ウロテンシンIIと構造
上の類似性、特に上記ヘプタペプチドを含む環状領域を示す。 この神経ペプチドは、ソマトスタチンとの類似性も示す(2,3)。しかし、魚類
ウロテンシンIIは、ラットやウサギのような哺乳動物にこのウロテンシンを投与
した際にも認められる心臓血管作用(8,9):動脈での収縮作用 (ラット(8)及びウ
サギ(10)で認められる作用)、平滑筋の収縮(両生類におけるある平滑筋(膀胱及
び回腸)でのスパスモーゲン作用(11))及び心拍(cardiac rhythm)に対する作用(
両生類で認められる(12))を本質的に有する。 また、魚類ウロテンシンIIは前駆体の形態で発現することが分かっており、そ
の一次構造は、コイ(シプリナス・カルピオ(Cyprinus carpio))の尾部神経分泌
系を用いて決定されている(13)。
【0004】 発明者らは、予期しなかったことに、ウロテンシンIIが哺乳動物、特にヒト及
びマウスで発現されること、及びそれがヒトにおいて運動ニューロンの生存及び
/又は再生ならびに動脈血圧(高血圧)に対して活性を有しうることを見出した。 この発明の対象は、C-末端に次の配列: Cys-Phe,Trp-Lys-Tyr-Cys-Xaa を有し
、ここでXaaがVal又はIleを示すヘプタペプチドからなり、ウロテンシンIIファ
ミリーに属し、かつヒトのプレプロ-ウロテンシンIIに相当するポリペプチド配
列SEQ ID NO:1と少なくとも45%、好ましくは少なくとも70%の類似性を示すこ
とを特徴とする、哺乳動物から単離されるポリペプチドである。 類似性は、特にインターネット(サイトhttp://www2.ebi.ac.uk/ clustalw/)で
入手可能なクラスタル(Clustal)(登録商標)プログラムを用いて定量する。
【0005】 この発明は、特に - ヒトのプレプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:1)、ヒトのプロ-ウロテンシンI
I (SEQ ID NO:2)及びヒトのウロテンシンII (SEQ ID NO:3)、 - ラットのプレプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:30)、ラットのプロ-ウロテン
シンII (SEQ ID NO:31)及びラットのウロテンシII (SEQ ID NO:32)、 - マウスのプレプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:33)、マウスのプロ-ウロテン
シンII (SEQ ID NO:34)及びマウスのウロテンシンII (SEQ ID NO:35) を包含する。 これらの哺乳動物のポリペプチド配列は、全体にわたって、魚類又はカエルの
配列とわずかな類似性を示す(図1及び図4): - コイのプレプロ-UII-α又はプレプロ-UII-γとヒトのプレプロ-IIとの16%の
類似性; - カエルのプレプロ-UIIとヒトのプレプロ-UIIとの25%の類似性。
【0006】 ヒトUIIのN-末端で、これらの配列は、前記の非哺乳動物のUII類と類似性を示
さない。 また、この発明は、この発明による哺乳動物のウロテンシンII及びその前駆体
から1以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換によって誘導されるポリペプチド又
はペプチドを包含する。例えば、それらは、特に右旋性のアミノ酸を左旋性のア
ミノ酸で置換することによって修飾が導入されているポリペプチド(偽ペプチド)
、又は分子モデリングによって得られ、ウロテンシンIIに対する神経筋連結部又
は他の生物学的標的でウロテンシンII活性を有するポリペプチドであってもよい
。 また、この発明の対象は、Gen Bank受託番号AA535545のESTを除いて、センス
又はアンチセンスの配列であってもよい、上記の哺乳動物のウロテンシンIIをエ
ンコードする配列、又はその相補配列の全てもしくは一部からなることを特徴と
する、精製された核酸フラグメントである。 この明細書で、この発明は、特にウロテンシンII及びその前駆体のcDNA類、mR
NA類及びゲノムDNA類を包含する。
【0007】 この発明は、以下の配列を包含する: * ヒトの配列: - 551bpからなる配列SEQ ID NO:4のヒトのプレプロ-ウロテンシンIIをエンコー
ドする配列、ここで . セグメント1-32は、非コード化配列であり、 . セグメント33-407は、ヒトのプレプロ-ウロテンシンII、シグナルペ
プチドをエンコードする配列に相当するセグメント33-92をエンコードし、かつ . セグメント408-551は、非コード化領域である(図2参照); - ヒトのウロテンシンII前駆体であるヒトのプロ-ウロテンシンIIをエンコード
し、SEQ ID NO:4のセグメント93-407に相当することを特徴とする、ヒトのプレ
プロ-ウロテンシンIIをエンコードする配列のフラグメント(配列SEQ ID NO:5);
- ヒトのウロテンシンII をエンコードし、配列SEQ ID NO:4のセグメント372-4
07に相当することを特徴とする、ヒトのプレプロ-ウロテンシンIIをエンコード
する配列のフラグメント(配列SEQ ID NO:6); - ジペプチド(Pro-Tyr)をエンコードし、ヒトのウロテンシンIIをエンコードす
る配列のちょうど上流に位置し、そのヒト配列に特異的な三塩基の切断部位の上
流にあるヒトのプレプロ-ウロテンシンIIをエンコードする配列のフラグメント(
図2参照);
【0008】 - SEQ ID NO:4の20-50ヌクレオチド、特に配列SEQ ID NO:7-8 及び 10-17から
なるプライマーとして使用できるフラグメント、より詳細には以下のプライマー
対: . それぞれ配列 SEQ ID NO:4のセグメント267-292及び535-511に相当す
る配列SEQ ID NO:7 及び NO:8; . それぞれ配列SEQ ID NO:4の位置198-216及び381-404に相当する配列SE
Q ID NO:10 及び 11; . それぞれ配列SEQ ID NO:4の位置46-65及び214-195に相当する配列SE
Q ID NO:12及び13; . 配列SEQ ID NO:14 (配列SEQ ID NO:4の位置9-28)及び SEQ ID NO:13
; . 配列SEQ ID NO:15 (配列SEQ ID NO:4の位置14-33)及びSEQ ID NO:13
; . 配列SEQ ID NO:12及びSEQ ID NO:16 (配列SEQ ID NO:4の位置150-13
1); . 配列SEQ ID NO:17 (配列SEQ ID NO:4の位置8-27)及びSEQ ID NO:13;
【0009】 - プローブとして使用できるフラグメント:配列SEQ ID NO:4及び配列 SEQ ID N
O:4の20-520ヌクレオチドからなるフラグメント。このプローブは、以下のハイ
ブリダイゼーション条件下で使用することが好ましい: . ハイブリダイゼーシ
ョン: 5X SSPE (0.9 M NaCl/0.05 M リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.7/0.005 M
EDTA)、0.1% SDS、10X デンハート(0.2% フィコール/0.2% ポリビニルピロリ
ドン/0.2% BSA)、 50μg/ml tRNA、50μg/ml 変性サケ精子DNA。37℃、一晩。 . 洗浄: 5X SSPE/0.1% SDS、4回5分、室温、3X SSPE/0.1% SDS、 2回
10分、30℃
【0010】 * ラットの配列: - 529bpからなる配列 SEQ ID NO:18のラットのプレプロ-ウロテンシンIIをエン
コードする配列、ここで: . セグメント1-36が非コード化配列であり、 . セグメント37-405が、ラットのプレプロ-ウロテンシンII、シグナル
ペプチドをエンコードする配列に相当するセグメント37-96をエンコードし、か
つ . セグメント406-529が、非コードである(図3参照); - ラットのウロテンシンII前駆体であるラットのプロ-ウロテンシンIIをエンコ
ードし、配列SEQ ID NO:18のセグメント96-405に相当することを特徴とするラッ
トのプレプロ-ウロテンシンIIをエンコードする配列のフラグメント(配列SEQ ID
NO:19); - ラットのウロテンシンIIをエンコードし、配列SEQ ID NO:18のセグメント364
-405 に相当することを特徴とする、ラットのプレプロ-ウロテンシンII をエン
コードする配列のフラグメント(配列SEQ ID NO:20);
【0011】 - SEQ ID NO:18の20-50ヌクレオチド、特に配列SEQ ID NO:36-42からなるプラ
イマーとして使用可能なフラグメント、より詳細には、以下のプライマー対: . それぞれ配列SEQ ID NO:18の位置295-314及び504-485に相当する配
列SEQ ID NO:36及びSEQ ID NO:37; . 配列SEQ ID NO:38 (配列SEQ ID NO:18の位置280-299)及び SEQ ID N
O:37; . 配列SEQ ID NO:39 (配列SEQ ID NO:18の位置131-150)及びSEQ ID NO
:40(SEQ ID NO:18の位置314-295); . 配列SEQ ID NO:41 (配列SEQ ID NO:18の位置322-341)及びSEQ ID NO
:37; . 配列SEQ ID NO:42 (SEQ ID NO:18の位置50-69)及びSEQ ID NO:40;
- プローブとして使用可能なフラグメント:配列SEQ ID NO:18及び配列SEQ ID N
O:18の20-50ヌクレオチドからなるフラグメント、特にSEQ ID NO:43 (配列SEQ I
D NO:18の位置192-221)。
【0012】 * マウスの配列 - 539bpからなる配列SEQ ID NO:27のマウスのプレプロ-ウロテンシンIIをエン
コードする配列、ここで: . セグメント1-36が非コード化配列であり . セグメント37-405が、マウスのプレプロ-ウロテンシンII、シグナル
ペプチドをエンコードする配列に相当するセグメント37-96をエンコードし、か
つ . セグメント406-539が非コードである(図4参照); - マウスのウロテンシン前駆体であるマウスのプロ-ウロテンシンIIをエンコー
ドし、SEQ ID NO:27のセグメント97-405 に相当することを特徴とするマウスの
プレプロ-ウロテンシンIIをエンコードする配列のフラグメント(SEQ ID NO:28);
- マウスのウロテンシンIIをエンコードし、配列SEQ ID NO:27のセグメント355
-405 に相当することを特徴とするマウスのプレプローウロテンシンIIをエンコ
ードする配列のフラグメント(配列SEQ ID NO:29);
【0013】 - SEQ ID NO:27の20-50ヌクレオチド、特に配列SEQ ID NO:21-26からなるプラ
イマーとして使用可能なフラグメント、より詳細は、以下のプライマー対: . 配列SEQ ID NO:27の位置295-314及び485-504それぞれに相当する配
列SEQ ID NO:21及びSEQ ID NO:22; - 配列SEQ ID NO:23 (配列SEQ ID NO:27の位置280-299)、及びSEQ ID NO:22; - 配列SEQ ID NO:24 (配列SEQ ID NO:27の位置131-150)、及びSEQ ID NO:22; - 配列SEQ ID NO:25 (配列SEQ ID NO:27の位置295-314)、及びSEQ ID NO:22; - 配列SEQ ID NO:24 及びSEQ ID NO:26 (配列SEQ ID NO:27の位置 322-341); - プローブとして使用可能なフラグメント: 配列SEQ ID NO:27及び配列 SEQ ID
NO:27の20-50ヌクレオチドからなるフラグメント、特に配列SEQ ID NO:44 (配列
SEQ ID NO:27の位置204-233)。
【0014】 マウスのプローブについてのハイブリダイゼーション条件は、ヒト配列につい
て上記した条件と類似している。 発明者らに利用可能なデータを考慮すれば、哺乳動物がウロテンシンIIを発現
し、ウロテンシンが心臓血管作用以外の効果を有効に発揮することは、明らかで
はなかった。 このポリペプチドは、宿主細胞中で上記の核酸配列を発現させることによって
、又は合成、特にメリフィールド技術に従った合成によって産生させることがで
きる。
【0015】 上記の核酸配列の最初の応用は、哺乳動物のウロテンシンII、特にヒトのウロ
テンシンIIをエンコードするmRNAの有無のいずれかを、特に神経変性病状もしく
は脊髄に対する外傷を有する個体における、生物学的試料(例えば生検)中で検出
するか、あるいはウロテンシンをエンコードする遺伝子又はmRNA配列における突
然変異を(この発明による核酸配列と比較して)検出することである。 上記の核酸配列の第二の応用は、特に目標とされる遺伝子治療に関連して、ヒ
トのウロテンシンII前駆体を発現し得るベクターの生産である。 これらの応用の関係で、核酸配列は、ヒトの配列SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:6
、ラットの配列SEQ ID NO:18 - SEQ ID NO:20及びマウスの配列 SEQ ID NO:27 -
SEQ ID NO:29からなる群から選択することが有利である。
【0016】 また、この発明の対象は、上記の核酸フラグメントの少なくとも一つで形質転
換された細胞である。 この発明の対象は、少なくとも一つの医薬的に許容される賦形剤と組合わさっ
た上記の少なくとも一つのポリペプチド又は該ポリペプチドの全てもしくは一部
をエンコードする少なくとも一つの核酸配列とからなることで特徴付けられる医
薬組成物でもある。 この発明の目的に対して、用語「医薬的に許容される賦形剤」は、従来の賦形
剤及び遺伝子治療の関連で用いられる賦形剤の双方を意味することを意図する。 好ましくは、組成物は鞘内に投与される。
【0017】 この発明による組成物によって、特に脊髄の神経変性疾患、特に神経筋終板の
疾患、より詳細には筋萎縮性側策硬化症のような筋萎縮性疾患、あるいは脊髄に
対する外傷、より詳細には対麻痺及び片麻痺を治療することができる。 この発明の有利な具体例では、組成物は、ポリペプチドがヒトのプレプロ-ウ
ロテンシンII (SEQ ID NO:1)、ヒトのプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:2)及び
ヒトのウロテンシンII (SEQ ID NO:3)、ラットのプレプロ-ウロテンシンII (SEQ
ID NO:30)、ラットのプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:31)及びラットのウロテ
ンシンII (SEQ ID NO:32)、ならびにマウスのプレプロ-ウロテンシンII (SEQ ID
NO:33)、マウスのプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:34) 及びマウスのウロテン
シンII (SEQ ID NO:35)からなる群から選択されることで特徴付けられる。
【0018】 この発明の別の有利な具体例では、組成物は、ポリヌクレオチドがヒト配列SE
Q ID NO:4 - SEQ ID NO:6、ラットの配列SEQ ID NO:18 - SEQ ID NO:20及びマウ
スの配列 SEQ ID NO:27 - SEQ ID NO:29からなる群から選択されることで特徴付
けられる。 また、この発明の対象は、脊髄の神経変性疾患又は脊髄に対する外傷の治療用
医薬品を製造するための、ウロテンシンIIファミリーに属するポリペプチド又は
該ポリペプチドをエンコードする核酸の使用である。 ウロテンシンIIファミリーに属するポリペプチドは、この発明にしたがって用
いることができ、無脊椎動物と脊椎動物、特に哺乳動物、好ましくはヒトのどち
らに由来していてもよい。
【0019】 この発明の有利な具体例では、上記の使用は、ポリペプチドがヒトのプレプロ
-ウロテンシンII (SEQ ID NO:1)、ヒトのプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:2)及
びヒトのウロテンシンII (SEQ ID NO:3)、ラットのプレプロ-ウロテンシンII (S
EQ ID NO:30)、ラットのプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:31)及びラットのウロ
テンシンII (SEQ ID NO:32)、ならびにマウスのプレプロ-ウロテンシンII (SEQ
ID NO:33)、マウスのプロ-ウロテンシンII (SEQ ID NO:34)及びマウスのウロテ
ンシンII (SEQ ID NO:35)からなる群から選択されることで特徴付けられる。 この発明の別の有利な具体例で、上記の使用は、ポリヌクレオチドがヒトの配
列SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:6、ラットの配列 SEQ ID NO:18 - SEQ ID NO:20及
びマウスの配列SEQ ID NO:27 - SEQ ID NO:29からなる群から選択されることで
特徴付けられる。
【0020】 また、この発明の対象は、哺乳動物のウロテンシンIIをエンコードし、修飾さ
れている可能性があるmRNAの存在を検出し得る、この発明で主張される配列の少
なくとも一つを生物学的試料中に含むことを特徴とする診断キットである。 この発明の対象は、高血圧活性のアンタゴニストを選択(この発明で主張され
るウロテンシンIIに対する活性を有する抗高血圧を選択)するための、該活性を
も有するポリペプチドの使用でもある。
【0021】 前記の組合わせに加えて、この発明は、この発明の対象である方法の実施例及
び添付図面に言及する以下の記載から明らかになるであろう他の組合わせも包含
する。 - 図1は、ヒト、カエル及びコイそれぞれの推定されるプレプロ-UIIのアミノ
酸配列のアラインメントを示す。この図で、シグナル配列は斜体で示し;保存さ
れているアミノ酸は黒字で示し; プロホルモンの切断部位は星で示し、保存され
ているアミノ酸配列は黒丸で示している。UII配列中にあるジスルフィド結合は
、ウロテンシンII配列の下に示している。アミノ酸は、図の右に番号付けした。
- 図2は、ヒトのプレプロ-UII、プロ-UII及びUIIの構造を示している。 - 図3は、ラットのプレプロ-UII、プロ-UII及びUIIの構造を示している。 - 図4は、マウスのプレプロ-UII、プロ-UII及びUIIの構造を示している。
【0022】 - 図5は、ヒトのプレプロ-UII mRNAの組織分布を示す。図5Aは、Clontechのマ
スターブロット(MasterBlot)を用いる、種々のヒト組織中のプレプロ-UII mRNA
発現(8個のハウスキーピング遺伝子のRNA発現レベルを用いて標準化した、50の
異なるヒト組織からのポリ(A) RNA (80-448ng/ポイント))のドットブロット解析
を示す。正の対照は、ヒトのゲノムDNAからなる。負の対照は、酵母又は大腸菌
由来のDNAもしくはRNA、またヒトの反復ゲノム配列を含む(H)。ブロットは、ヒ
トのプレプロ-UIIをエンコードするcDNAプローブとハイブリダイズさせ、2日間X
-Omatフィルムに曝す。図5Bは、ヒト脊髄でのプレプロ-UII mRNAの発現のノー
ザンブロット解析を示す。2μgの脊髄のポリ(A) mRNAをヒトのプレプロ-UII cDN
Aからなるプローブとハイブリダイズさせる。大きさは、RNAサイズマーカー(較
正された標準的なヌクレオチド鎖)を用いて測定する。図5CはX-線のオートラジ
オグラフに相当し、ヒト脊髄でのプレプロ-UII mRNAの分布を示している。正面
の切片(frontal section)をアンチセンス(1)又はセンス(2)のプレプロ-UIIリボ
プローブとハイブリダイズさせ、10日間 X-線感受性フィルムに曝す。
【0023】 - 図6は、種々の種類由来のウロテンシンIIに関する一次構造の比較である。
ダッシュは、配列が最適に配置される順序で挿入している。ドットは、ヒト配列
に対して種々の配列間で同一なアミノ酸残基を示している。 - 図7は、ラット及びマウスのプレプロ-UII mRNAの組織分布を示している。 しかしながら、これらの実施例がこの発明の対象の例示として示されているも
のに過ぎず、限定を少しも成すものでないことは、明らかに理解されるべきであ
る。
【0024】 実施例 - 材料及び方法* ヒトのプレプロ-UII cDNAの単離: カエルのウロテンシンIIとある同一性を有するペプチドをエンコードするEST
(発現された標識配列)配列は、no. AA535545で登録されている(Genbank)。この
配列は、結腸腫瘍から得られるcDNAクローンのEST解析に由来している。 EST配列から推定される2つのプライマー((5'-AACCCAAGAGGAAATTT GAGAAAGTT-
3' (SEQ ID NO:7) 及び5'-CCAGGTAACAATGAACAGGGTGTAG-3' (SEQ ID NO:8))によ
って、以下の条件でヒト結腸腫瘍試料からRT-PCRにより269bpのフラグメントを
合成することができる: 94℃、4分、1X; 94℃、1分; 55℃、1分; 72℃、1分、30X; 72℃、5分、1X。
【0025】 PCR生成物を、ランダムプライミングによって[32P] dCTPでラベルし、次いで
ポリ(A) RNAを含む種々のヒト組織で、また正の対照と負の対照でハイブリダイ
ズさせる(マスターブロット、Clontech, Palo Alto)。ハイブリダイゼーション
と洗浄は、以下の条件で行う: * プレハイブリダイゼーション: 50%ホルムアミド、5X SSC、5X デンハート
、50 mM NaH2PO4/Na2HPO4、200μg/ml サケ精子DNA、0.1% SDSからなる反応媒
体中で少なくとも5時間、42℃でインキュベーション * ハイブリダイゼーション: プレハイブリダイゼーションの媒体と同じ媒体に
、ラベルしたプローブを添加した * 洗浄: 室温で、2X SSC + 0.1% SDSで4回5分、次いで42℃で0.1% SDS + 0.
1% SDSで2回10分。 ブロットをX-OMATフィルム(Kodak)に曝し、ハイブリダイゼーションシグナル
をデンシラブ(Densylab)プログラム(Bioprobe Systems, フランス)を用いて定量
する。 もっとも強いハイブリダイゼーションシグナルは、脊髄で得られる。 これらの条件下で、ヒト脊髄からのポリ(A) RNA (Clontech)を用い、RACEキッ
ト(マラソンcDNA増幅キット、Clontech)を用いてヒトUII cDNAの5'末端を増幅す
る。
【0026】* ノーザンブロット解析(膜へのRNA転移): ヒト脊髄からの2μgのポリ(A) RNA (Clontech)を、アガロース-ホルムアミド
ゲルに載せる。移動し、ナイロン膜に転移した後、[32P] dCTPの導入でラベルし
たヒトUII cDNAに特異的なPCR生成物を用いてハイブリダイゼーションを行う。
* インサイトゥハイブリダイゼーション: センス及びアンチセンスのヒトのリボプローブを、特異的なプレプロ-UIIプラ
イマー 5'-CTGCCAGAGATGCTGGGTG-3' (SEQ ID NO:10) 及び5'-GACACAGTATTTCCAGA
AGCAATC-3' (SEQ ID NO:11)を用いて得られるPCR生成物のインビトロ転写により
調製し、相当するRNAポリメラーゼのSP6及びT7プロモーターで5'-末端に伸張し
た。転写は、上記と同じPCRの条件で、[35S]UTP (Amersham) 又はジゴキシゲニ
ン-11-UTP (Boehringer)、及びT3もしくはT7 RNA ポリメラーゼの存在下で行う
。 ヒトの頸部の脊髄部分は、70歳の男性から剖検で得た。 組織フラグメントを24時間4%のホルムアルデヒド中で固定し、Tissue-Tekに
埋め込み、液体窒素で凍結させた。
【0027】 低温槽を用いて正面の切片(厚み12μm)を切断し、-80℃で保存する。 切片をH. Tostivintら(14)に記載されるように予備処理し、プレハイブリダイ
ゼーション緩衝液(50%ホルムアミド、0.6 M NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、0
.02%フィコール、0.02% ポリビニルピロリドン、0.1% BSA、1 mM EDTA、pH 8
.0、550μg/mlの変性サケ精子DNA及び 50μg/mlの酵母tRNA)で塗布する。 ハイブリダイゼーションは、同じ緩衝液(但し、変性サケ精子DNAの濃度: 60μ
g/ml)中で55℃で一晩行い、ジチオトレイトール10 mM、10%硫酸デキストラン及
び熱変性リボプローブを補足した。 35S-ラベルしたプローブ及びジゴキシゲニン-ラベルしたプローブをハイブリ
ダイゼーション緩衝液で希釈し、それぞれの最終濃度を5x106 dmp/ml 及び1:100
(v/v)とする。 切片を60℃で2X SSC緩衝液で洗浄し、37℃で60分RNase A (50 μg/ml)で処理
する。
【0028】 ストリンジェントな条件下での洗浄を、0.1X SSC、14 mM β-メルカプトエタ
ノール、0.05%ピロリン酸ナトリウム緩衝液中で60℃で5回行う。 35S-ラベルしたリボプローブとハイブリダイズした切片を、酢酸ナトリウム0.
3 M濃度を増していくことからなるエタノール溶液中で脱水し、ハイパーフィル
ム-βmaxフィルム(Amersham)に2週間曝す。 ジゴキシゲニン-ラベルしたリボプローブとハイブリダイズした切片を、緩衝
液1 (100 mM Tris-HCl及び150 mM NaCl, pH 7.5)で洗浄し、ブロッキング緩衝液
中(緩衝液1中、ベーリンガー(Boehringer)ブロッキング剤2%)で30分インキュベ
ートし、1:500のアルカリホスフェート-接合-抗ジゴキシゲニン抗体(Boehringer
)、1%の正常なヒツジ血清及び0.1%のTriton X100を含む緩衝液1中で2時間イン
キュベートする。緩衝液1で10分、緩衝液2 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl及び
50 mM MgCl2, pH 9.5)で10分、切片を2回すすぎ、次いでFast Red TR/ナフトー
ル AS-MX 及び3 mMレバミソールからなる発色(chromagenic)溶液(Sigma)中で3時
間インキュベートする。 反応を、TE緩衝液に注いで止める(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)。
切片を、顕微鏡(Leitz Orthoplan)で調べる。
【0029】* シーケンシング 増幅産物をpGEM-Tベクター(Promega)にサブクローンし、アマーシャム(Amersh
am)シーケンシングキット(サーモ シーケナーゼ(Thermo Sequenase))を用いて
、SP6及びT7 プライマーでシークエンスする。 - 結 果* ヒトのプレプロ-UII cDNAの特徴づけ: ヒトのUII前駆体cDNAのオープンリーディングフレームは、124アミノ酸のタン
パク質をエンコードする(図1及び図2)。 ヒトUII前駆体の構成は、コイのUIIプロホルモン及びカエルのUII前駆体の構
成に似ている。これらの前駆体は、全てN-末端シグナル配列、次いでフランキン
グペプチド、タンパク質加水分解切断部位(Lys/Arg- Lys-Arg)及び各前駆体のC-
末端に位置するウロテンシンII配列からなる。
【0030】 コイ、カエル及びヒト前駆体のN-末端フランキングペプチドは、事実上は全く
類似性を示さない。 ヒトUIIはわずか11アミノ酸からなるが、カエルとコイのUIIは、それぞれ13ア
ミノ酸及び12アミノ酸を有する(図6)。 ウロテンシンIIのC-末端の環状ヘプタペプチドの配列は、カエルとヒトで保存
されている。他方、そのペプチドのN-末端領域は、非常に可変性である。 カエルでは、コイでのように、フランキングペプチドのC-末端領域は、保存さ
れているジペプチドGln-Phe を生じ得る二塩基性の潜在的な切断部位(Arg-Lys及
びArg-Arg)を含む。 しかし、ヒトでは、相当するジペプチドの配列は、完全に異なっている(Pro-T
yr) (図1及び図2)。
【0031】* ヒトのプレプロ-UII mRNAの分布を研究した: ヒトのプレプロ-UII mRNAの組織分布は、ドットブロット解析で研究した(図5A
)。 試験した50の異なる組織のうち、脊髄は、最も強いハイブリダイゼーションシ
グナルを示す。プレプロ-UII mRNAも延髄で認められるが、シグナルの強さは、
脊髄で認められる強さよりもかなり弱い。 末梢組織では、プレプロ-UII mRNAの存在が、腎臓、脾臓、小腸、胸腺、前立
腺、下垂体及び副腎腺(adrenal gland)で、そして少量で、胃、膵臓、卵巣及び
肝臓で検出されている(図5A)。 ノーザンブロットによる解析は、ヒトの脊髄において約700bpのプレプロ-UII
mRNAに相当する単一のバンドの存在を示している。 インサイトゥハイブリダイゼーションによるヒト脊髄の頸部切片のラベル化は
、プレプロ-UII mRNAが運動ニューロンに局在していることを示している(図5C)
【0032】* ラット及びマウスのプレプロ-UII cDNAの特徴づけ: ラット及びマウスのUII前駆体cDNAのオープンリーディングフレームは、123ア
ミノ酸のタンパク質をエンコードしている(図3及び4)。 図7は、RT-PCRを用いて、種々のラット及びマウス組織における分布結果を示
している。全てのRNAを抽出し、上記と類似した条件でRT-PCR反応に付す。 図7Aで、ラット(左)及びマウス(右)のPCR生成物は、ラット及びマウスに特異
的な内部オリゴヌクレオチドプローブ(それぞれ、配列SEQ ID NO:43及び44)を用
いるハイブリダイゼーションにより検出する。 図7Bは、等価なRNAレベルを反映するために対照として用いられる、アガロー
スゲルに載せたGADPH PCR生成物を示す。
【0033】 参考文献 1. H.A. Bernら, Rec. Prog. Horm. Res., 1985, 41, 533-552. 2. D. Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77, 5021-5024. 3. J.M. Conlon ら, Regul. Pept., 1997, 69, 95-103. 4. D. Waugh 及び J.M. Conlon, Gen. Comp. Endocrinol., 1993, 92, 419
-427. 5. D. Waughら, Gen. Comp. Endocrinol., 1995, 99, 323-332. 6. J.M. Conlonら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 188, 578-58
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0.
【0034】 上記から明らかであるように、この発明は、より明確に記載したにすぎない、
その実施方法、製造及び応用に少しも限定されない。逆に、発明は、この発明の
関連性又は範囲から逸脱しない限り、当業者により成し得る全ての変形を包含す
るものである。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成13年1月23日(2001.1.23)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0032
【補正方法】変更
【補正内容】
【0032】* ラット及びマウスのプレプロ-UII cDNAの特徴づけ: ラット及びマウスのUII前駆体cDNAのオープンリーディングフレームは、123ア
ミノ酸のタンパク質をエンコードしている(図3及び4)。 図7は、RT-PCRを用いて、種々のラット及びマウス組織における分布結果を示
している。全てのRNAを抽出し、上記と類似した条件でRT-PCR反応に付す。 図7の上部(UII)で、ラット(左)及びマウス(右)のPCR生成物は、ラット及びマ
ウスに特異的な内部オリゴヌクレオチドプローブ(それぞれ、配列SEQ ID NO:43
及び44)を用いるハイブリダイゼーションにより検出する。 図7の下部(GADPH)は、等価なRNAレベルを反映するために対照として用いられ
る、アガロースゲルに載せたGADPH PCR生成物を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 25/28 C12N 1/15 C07K 7/08 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12Q 1/68 A 1/21 G01N 33/53 M 5/10 33/566 C12Q 1/68 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/53 5/00 A // G01N 33/566 A61K 37/02 (71)出願人 101 rue de Tolbiac,F −75654 Paris Cedex 13, France (72)発明者 コーラーン,オレイヌ フランス、エフ−76000 ルーエン、アプ ト ベー106、アレ アロマンシュ 24 (72)発明者 ジュゴー,シルヴィエ フランス、エフ−76000 ルーエン、イン パッセ タブレ 4 (72)発明者 リアマン,イザベル フランス、エフ−27310 サン オウエン デュ トベルヴィエ、リュ デュ ラ ハイゼッテ 19 (72)発明者 ヴォドリー,ウベルト フランス、エフ−76133 マネグリーゼ、 ルート デプヴィーレ 36 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 EA04 GA11 HA12 4B063 QA17 QA19 QQ08 QQ42 QQ53 QR08 QR33 QR42 QR56 QS25 QS33 QS34 QX02 QX07 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA90Y AA91Y AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA02 BA08 BA18 BA24 CA53 CA56 DC40 NA14 ZA012 ZA422 4H045 AA10 BA17 CA41 EA21 EA50 FA71 FA74

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 C-末端に次の配列: Cys-Phe,Trp-Lys-Tyr-Cys-Xaa (XaaはV
    al又はIleを示す)を有するヘプタペプチドからなり、ウロテンシンIIファミリー
    に属し、かつヒトのプレプロ-ウロテンシンIIに相当するポリペプチド配列SEQ I
    D NO:1と少なくとも45%、好ましくは少なくとも70%の類似性を示すことを特徴
    とする、哺乳動物から単離されるポリペプチド。
  2. 【請求項2】 ヒトの配列SEQ ID NO:1-3、ラットの配列SEQ ID NO:30-32及
    びマウスの配列SEQ ID NO:33-35からなる群から選択されることを特徴とする請
    求項1に記載される哺乳動物のポリペプチド。
  3. 【請求項3】 Gen Bank受託番号AA535545のESTを除いて、センス又はアン
    チセンスの配列であってもよい、請求項1又は請求項2に記載されるポリペプチ
    ドをエンコードする配列、又はその相補配列の全てもしくは一部からなることを
    特徴とする、精製された核酸フラグメント。
  4. 【請求項4】 配列SEQ ID NO:4-6、配列SEQ ID NO:18-20及び配列SEQ ID N
    O:27-29からなる群から選択されることを特徴とする請求項3に記載される核酸
    フラグメント。
  5. 【請求項5】 請求項3又は請求項4に記載される核酸フラグメントを含む
    ことを特徴とする組換えベクター。
  6. 【請求項6】 請求項3又は請求項4に記載される核酸フラグメントの少な
    くとも一つで形質転換された細胞。
  7. 【請求項7】 配列SEQ ID NO:4、配列SEQ ID NO:18又は配列SEQ ID NO:27
    の20-50ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項3又は請求項4に記載さ
    れる核酸フラグメントを検出するための試薬。
  8. 【請求項8】 - ジペプチド(Pro-Tyr)をエンコードし、ヒトのウロテンシ
    ンIIをエンコードする配列のちょうど上流に位置し、そのヒト配列に特異的な三
    塩基の切断部位の上流にあるヒトのプレプロ-ウロテンシンIIをエンコードする
    配列のフラグメント; - プライマーとして使用できるフラグメント: SEQ ID NO:7 及び NO:8、SEQ ID
    NO:10-17; SEQ ID NO:21-26; SEQ ID NO:36-42、及び - プローブとして使用できるフラグメント: 配列 SEQ ID NO:4及び配列SEQ ID
    NO:4の20-50ヌクレオチドからなるフラグメント; 配列SEQ ID NO:18 及び配列SE
    Q ID NO:18の20-50ヌクレオチドからなるフラグメント、及び配列SEQ ID NO:27
    ならびに配列SEQ ID NO:27の20-50ヌクレオチドからなるフラグメント からなる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載の試薬。
  9. 【請求項9】 少なくとも一つの医薬的に許容される賦形剤と組合わさった
    、請求項1及び2のいずれかに記載される少なくとも一つのポリペプチド、又は
    該ポリペプチドの全てもしくは一部をエンコードする請求項3及び4のいずれか
    に記載される一つの核酸配列とからなることで特徴付けられる医薬組成物。
  10. 【請求項10】 脊髄の神経変性疾患又は脊髄に対する外傷の治療用医薬品
    を製造するための、ウロテンシンIIファミリーに属するポリペプチド又は該ポリ
    ペプチドをエンコードする核酸配列の使用。
  11. 【請求項11】 適切に処理した生物学的試料を請求項7又は請求項8に記
    載の少なくとも一つの試薬と接触させることによる、特に神経変性病状もしくは
    脊髄に対する外傷を有する個体で哺乳動物のウロテンシンIIをエンコードするmR
    NAの有無を検出する方法。
  12. 【請求項12】 ウロテンシンをエンコードするDNA又はmRNAを生物学的試
    料から抽出し、それを請求項3又は請求項4に記載される核酸配列と比較するこ
    とからなることで特徴付けられる、ウロテンシンをエンコードする遺伝子又はmR
    NAの配列中の突然変異を検出する方法。
  13. 【請求項13】 哺乳動物のウロテンシンIIをエンコードし、修飾されてい
    る可能性があるmRNAの存在を検出し得る、請求項3及び4のいずれかに記載され
    る配列の少なくとも一つを生物学的試料中に含むことを特徴とする診断キット。
  14. 【請求項14】 抗-高血圧を選択するための請求項1又は請求項2に記載
    されるポリペプチドの使用。
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