CA2352606A1 - Urotensines ii de mammiferes et leurs applications - Google Patents
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Abstract
Peptides de mammifères présentant une structure de type urotensine II (UII), ainsi que leurs applications en tant que médicament, notamment sous la forme d'une composition destinée au traitement des maladies neurodégénératives ou des traumatismes de la moelle épinière. Lesdits polypeptides comprennent à leur extrémité C-terminale un heptapeptide présentant la séquence suivante: Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Xaa dans laquelle Xaa représente Val ou Ile, en ce qu'ils appartiennent à la famille des urotensines II et en ce qu'ils présentent au moins 45 %, et de préférence au moins 70 % de similarité avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO:1, correspondant à la prépro-urotensine II humaine. Séquences d'acides nucléiques codant pour lesdits polypeptides, oligonucléotides compris dans lesdites séquences, et utilisation desdites séquences comme amorces et comme sondes et pour l'expression des urotensines II de mammifères. Utilisation desdits polypeptides pour la sélection d'anti- hypertenseurs.
Description
UROTENSINES II DE IVIAVIyIIFERES ET LEURS APPLICATIONS ' La présente invention est relative à des polypeptides de mammiferes, notamment d'origine humaine ou mucine, présentant une structure de type urotensine II (UII) (prépro-urotensine II, pro-urotensine II et urotensine II), ainsi qu'à leurs appli-cations en tant que médicament, notamment sous la forme d'une composition destinée au traitement des maladies neurodégénératives ou des traumatismes de la moelle épinière (hémiplégie, paraplégie) et en tant qu'outil de criblage de médicaments anti-hypertenseurs.
lo La présente invention est également relative à des séquences d'acides nucléiques codant pour lesdits polypeptides, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, et à l'utilisation desdites séquences comme amorces et comme sondes ou pour l'expression des urotensines II de mammiferes et notamment de l'urotensine II humaine ou mucine.
L' urotensine II est un neuropeptide qui a d' abord été caractérisé
dans l'urophyse des poissons téléostéens. Chez ces poissons, l'urotensine II
est un peptide cyclique comprenant 12 acides aminés. La caractérisation de l'urotensine II
chez plusieurs espèces de poissons téléostéens a montré que la structure de l'heptapeptide cyclique C-terminal est conservée, tandis que l'on observe des 2o substitutions dans Ia partie N-terminale de la molécule. Cet heptapeptide présente la séquence suivante : Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val (SEQ ID N0:9) (1-3).
On a longtemps pensé que ce peptide était produit exclusivement dans l'urophyse des poissons téléostéens (3), un petit organé neurohémal présentant des similitudes avec la neurohypophyse, localisé à l'extrémité caudale de la moelle épinière ; toutefois, il est apparu que ce neuropeptide n'est pas confiné au système neurosecrétoire caudal du poisson. II a également été isolé à partir d'extraits de cerveaux de truite, de raie (4) ou de lamproie (5). En outre, un peptide similaire à
l'urotensine II de poisson a été détecté dans le système nerveux central (SNC) de la grenouille (Rana ridibunda) (6) et chez un gastéropode (Aplysia californica), au 3o niveau du ganglion cérébral (7).
Ce peptide, qui comprend chez la grenouille, 13 acides aminés, présente des similarités de structure avec les urotensines II de poisson, et notamment la région cyclique contenant l'heptapeptide précité.
Ce neuropeptide, présente également des similarités avec la soma tostatine (2,3) ; toutefois, l'urotensine II de poisson présente essentiellement des effets cardiovasculaires, que l'on peut également observer lorsque cette urotensine est admi nistrée à un mammiiere, tel que le rat ou le lapin (8,9) : effet contractile sur les artères
lo La présente invention est également relative à des séquences d'acides nucléiques codant pour lesdits polypeptides, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, et à l'utilisation desdites séquences comme amorces et comme sondes ou pour l'expression des urotensines II de mammiferes et notamment de l'urotensine II humaine ou mucine.
L' urotensine II est un neuropeptide qui a d' abord été caractérisé
dans l'urophyse des poissons téléostéens. Chez ces poissons, l'urotensine II
est un peptide cyclique comprenant 12 acides aminés. La caractérisation de l'urotensine II
chez plusieurs espèces de poissons téléostéens a montré que la structure de l'heptapeptide cyclique C-terminal est conservée, tandis que l'on observe des 2o substitutions dans Ia partie N-terminale de la molécule. Cet heptapeptide présente la séquence suivante : Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val (SEQ ID N0:9) (1-3).
On a longtemps pensé que ce peptide était produit exclusivement dans l'urophyse des poissons téléostéens (3), un petit organé neurohémal présentant des similitudes avec la neurohypophyse, localisé à l'extrémité caudale de la moelle épinière ; toutefois, il est apparu que ce neuropeptide n'est pas confiné au système neurosecrétoire caudal du poisson. II a également été isolé à partir d'extraits de cerveaux de truite, de raie (4) ou de lamproie (5). En outre, un peptide similaire à
l'urotensine II de poisson a été détecté dans le système nerveux central (SNC) de la grenouille (Rana ridibunda) (6) et chez un gastéropode (Aplysia californica), au 3o niveau du ganglion cérébral (7).
Ce peptide, qui comprend chez la grenouille, 13 acides aminés, présente des similarités de structure avec les urotensines II de poisson, et notamment la région cyclique contenant l'heptapeptide précité.
Ce neuropeptide, présente également des similarités avec la soma tostatine (2,3) ; toutefois, l'urotensine II de poisson présente essentiellement des effets cardiovasculaires, que l'on peut également observer lorsque cette urotensine est admi nistrée à un mammiiere, tel que le rat ou le lapin (8,9) : effet contractile sur les artères
2 (action observée chez le rat (8) et le lapin (10)), contraction des muscles lisses (effet spasmogène sur certains muscles lisses (vessie et iléum), chez les amphibiens (11)), effets sur le rythme cardiaque (obsewés chez les amphibiens (12)).
Il a également été montré que l'urotensine II de poisson est exprimée sous la forme de précurseurs, dont les structures primaires ont été
déterminées à partir du système neurosécrétoire caudal de la carpe (Cyprinus carpio) (13).
Les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, qu'une urotensine II était exprimée chez les mammifères. notamment chez l'homme et chez les murins et qu'elle pouvait présenter, chez l'homme une activité sur la survie et/ou la régénération 1 o des motoneurones et sur la pression artérielle (hypertension).
La présente invention a pour objet des polypeptides, isolés de mammiferes, caractérisés en ce qu'ils comprennent à leur extrémité C-terminale un heptapeptide présentant la séquence suivante : Cys-Phe-Trp-Lys-Tvr-Cys-Xaa dans laquelle Xaa représente Val ou Ile, en ce qu'ils appartiennent à Ia famille des urotensines II et en ce qu'ils présentent au moins 45 %, et de préférence au moins 70 % de similarité avec le polypeptide de séquence SEQ ID N0:1, correspondant à la prépro-urotensine II humaine.
La similarité est quantifiée à l'aide du logiciel Clustal~, notamment accessible sur l'Intemet (site http://ww2.ebi.ac.uk/clustalw/).
2o La présente invention englobe en particulier - la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID N0:1), la pro-urotensine II humaine (SEQ ID N0:2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID N0:3), - la prépro-urotensine II de rat (SEQ ID N0:30), la pro-urotensine II
de rat (SEQ ID N0:31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID N0:32), - la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:33), la pro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID
N0:35).
Ces séquences polypeptidiques de mammifères présentent globale-ment une faible similarité avec les séquences de poisson ou de grenouille (figure 1 et figure 4) - 16 % de similarité entre la prépro-UII-a ou la prépro-UII-y de carpe et la prépro-UII humaine ;
- 25 % de similarité entre la prépro-UII de grenouille et la prépro-UII humaine.
Au niveau N-terminal de l'UII humaine, ces séquences ne présentent aucune similarité avec les UII de non-mammifères antérieurement décrites.
L'invention englobe également des polypeptides ou des peptides dérivés des urotensines II de mammifère et de leurs précurseurs, selon l'invention, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés ; il peut s'agir par ' exemple de polypeptides dans lesquels des modifications ont été apportées, notam-ment par substitution des acides aminés dextrojyres par des acides aminés levogyres (pseudopeptides) ou de polypeptides obtenus par modélisation moléculaire et présen tant une activité d'urotensine II au niveau de la jonction neuromusculaire ou des autres cibles biologiques de l'urotensine II.
La présente invention a également pour objet un fragment d'acide nucléique purifié, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence codant pour une urotensine II de mammifère telle que définie ci-dessus ou de sa to séquence complémentaire, sens ou anti-sens, à l'exception de l'EST ayant pour numéro d'accession Gen Bank, le n° AA535545.
Dans ce cadre, la présente invention englobe en particulier les ADNc, les ARNm et les ADN génomiques des urotensines II et de leurs précurseurs.
Elle englobe en particulier les séquences suivantes * séquences humaines - la séquence codant pour la prépro-urotensine II humaine, de séquence SEQ ID NO:4, qui comprend 551 pb et dans laquelle . le segment I-32 est une séquence non-codante, . le segment 33-407 code pour la prépro-urotensine II humaine, le 2o segment 33-92 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 408-5~ 1 est non-codant (voir figure 2), - un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
humaine (séquence SEQ ID NO:S), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II humaine, le précurseur de l'urotensine II humaine et correspond au segment de la SEQ ID N0:4;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
humaine (séquence SEQ ID N0:6), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II
humaine et correspond au segment 372-407 de la séquence SEQ ID N0:4 ;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
3o humaine, codant pour un dipeptide (Pro-Tyr), en amont du site de clivage tribasique, lui-même situé juste en amont de la séquence codant pour l'urotensine II
humaine et spécifique de ladite séquence humaine (voir figure 2) ;
- des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à 50 nucléotides de SEQ ID N0:4 et notamment les séquences SEQ ID N0:7-8 et 10-17 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes . les séquences SEQ ID N0:7 et N0:8, correspondant respective-ment aux segments 267-292 et ~3~-~ 11 de la séquence SEQ ID N0:4 ;
. les séquences SEQ ID NO:10 et 11 correspondant respectivement -aux positions 198-216 et 381-404 de la séquence ID N0:4 ;
. les séquences SEQ ID N0:12 et SEQ ID N0:13, correspondant respectivement aux positions 46-6~ et 214-19~ de la séquence SEQ ID N0:4 ;
. Ies séquences SEQ ID N0:14 (positions 9-28 de la séquence SEQIDN0:4)etSEQIDN0:13;
. les séquences SEQ ID NO: l S (positions 14-33 de la séquence SEQIDN0:4)etSEQIDN0:l3;
. tes séquences SEQ ID N0:12 et SEQ ID NO:I6 (positions150-131 to de la séquence SEQ ID N0:4) ;
. les séquences SEQ ID N0:17 (positions 8-27 de la séquence SEQ ID N0:4) et SEQ ID N0:13.
- des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID N0:4 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID N0:4.
Lesdites sondes sont de préférence utilisées dans les conditions d'hybridation suivantes . hybridation : SX SSPE (0,9 M NaCI/0,05 M tampon sodium phosphate, pH 7,7/0,005 M EDTA), 0,1 % SDS, lOX Denhardt's (0,2 % Ficoll/0,2 polyvinylpyrrolidone/0,2 % BSA), 50 p.g/ml ARNt, SO ug/ml ADN de sperme de saumon dénaturé. 37°C, une nuit.
, lavages : SX SSPE/0,1 % SDS, 4 fois 5 minutes, température ambiante, 3X SSPE/0,1 % SDS, 2 fois 10 minutes, 30°C.
* séquences de rat - la séquence codant pour la prépro-urotensine II de rat, de séquence SEQ ID N0:18, qui comprend 529 pb et dans laquelle . le segment 1-36 est une séquence non-codante, . le segment 37-405 code pour la prépro-urotensine II de rat, le segment 37-96 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 406-X29 est non-codant (voir figure 3), - un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de 3o rat (séquence SEQ ID N0:19), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II de rat, le précurseur de l'urotensine II de rat et correspond au segment 96-405 de la SEQ ID N0:18 ;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de rat (séquence SEQ ID N0:20), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II
de rat et correspond au segment 364-405 de la séquence SEQ ID N0:18 ;
- des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à SO -nucléotides de SEQ ID N0:18 et notamment les séquences SED ID N0:36-42 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes . les séquences SEQ ID N0:36 et SEQ ID N0:37, correspondant 5 respectivement aux positions 29~-314 et X04-485 de la séquence SEQ ID N0:18 ;
. les séquences SEQ ID N0:38 (positions 280-299 de la séquence SEQIDN0:18)etSEQIDN0:37;
. les séquences SEQ ID N0:39 (positions 131-150 de la séquence SEQ ID N0:18) et SEQ ID N0:40 (positions 314-295 de la SEQ ID N0:18) ;
to . les séquences SEQ ID N0:41, (positions 322-341 de la séquence SEQ ID N0:18) et SEQ ID N0:37 ;
les séquences SEQ ID N0:42 (positions SO-G9 de la SEQ ID N0:18) et SEQ ID N0:40.
- des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID N0:18 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID
N0:18, notamment la SEQ ID N0:43 (positions 192-221 de Ia séquence SEQ ID N0:18).
* séquences de souris - la séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris, de séquence SEQ ID N0:27, qui comprend 539 pb et dans laquelle . le segment 1-36 est une séquence non-codante, . le segment 37-405 code pour la prépro-urotensine II de souris, le segment 37-96 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 406-X39 est non-codant (voir figure 4), - un fragment de Ia séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris (séquence SEQ ID N0:28), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II de souris, le précurseur de l'urotensine de souris et correspond au segment de la SEQ ID N0:27 ;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris (séquence SEQ ID N0:29), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II de 3o souris et correspond au segment 3~5-405 de la séquence SEQ ID N0:27 ;
- des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à 50 nucléotides de SEQ ID N0:27 et notamment les séquences SEQ ID N0:21-26 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes . les séquences SEQ ID N0:21 et SEQ ID N0:22, correspondant respectivement aux positions 29~-314 et 485-504 de la séquence SEQ ID N0:27 ;
. les séquences SEQ ID N0:23 (positions 280-299 de la séquence SEQ ID N0:27) et SEQ ID NO:?2 ;
. les séquences SEQ ID N0:24 (positions 131-150 de la séquence -SEQ ID N0:27) et SEQ ID N0:22 ;
. les séquences SEQ ID N0:2S (positions 29S-314 de la séquence SEQ ID N0:27) et SEQ ID N0:22 ;
. les séquences SEQ ID N0:24 et SEQ ID N0:26 (positions 322-341 de la séquence SEQ ID N0:27).
- des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID N0:27 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID N0:27 et notamment la séquence SEQ ID N0:44 (positions 204-233 de la séquence lo SEQ ID N0:27).
Les conditions d'hybridation des sondes murines sont similaires à
celles exposées ci-dessus, pour les séquences humaines.
Compte tenu des données à la disposition des Inventeurs, il n'était pas évident que les mammifères puissent exprimer une urotensine II et que cette t5 dernière exerçât effectivement d'autres effets que des effets cardiovasculaires.
Lesdits polypeptides peuvent être produits, soit en exprimant les séquences d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus dans des cellules hôtes, soit par synthèse, et notamment par synthèse selon la technique de Mernfield.
Les séquences nucléiques ci-dessus définies ont comme première 2o application de détecter soit la présence ou l'absence de l'ARNm codant pour une uro tensine II de mammifère et notamment pour l'urotensine II humaine dans des échan tillons biologiques (biopsies, par exemple), notamment chez des sujets présentant une pathologie neurodégénérative ou un traumatisme de la moelle épinière, soit de détecter une mutation dans la séquence du gène ou de l'ARNm codant pour l'urotensine 25 (comparaison avec les séquences d'acides nucléiques selon l'invention).
Les séquences nucléiques ci-dessus définies ont comme deuxième application, la production de vecteurs aptes à exprimer les précurseurs de l'urotensine II humaine, notamment dans le cadre d'une thérapie génique ciblée.
Dans le cadre de ces applications, les séquences nucléiques sont 3o avantageusement, sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID N0:4 à SEQ ID N0:6, les séquences de rat, SEQ ID N0:18 à
SEQ ID N0:20 et les séquences de souris, SEQ ID N0:27 à SEQ ID N0:29.
La présente invention a également pour objet une cellule transformée par au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
35 La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un polypeptide tel que défini ci-dessus ou au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour tout ou partie desdits polypeptides, associé à au moins un véhicule ' pharmaceutiquement acceptable.
Au sens de la présente invention, on entend par véhicule pharmaceutiquement acceptable, aussi bien les véhicules usuels que ceux utilisés dans le cadre d'une thérapie génique.
De manière préférée, lesdites compositions sont administrées par voie intrathécale.
Les compositions selon la présente invention, permettent notamment de traiter les maladies neurodégénératives de la moelle épinière, en particulier les to maladies de la plaque neuromusculaire et plus particulièrement les maladies amyotrophiques, telles que la sclérose latérale amyotrophique ou les traumatismes de la moelle épinière, plus particulièrement les paraplégies et les hémiplégies.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites compositions sont caractérisées en ce que le polypeptide est choisi dans le groupe constitué par la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID N0:1 ), la pro-urotensine II
humaine (SEQ ID N0:2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID N0:3), la prépro urotensine II de rat (SEQ ID N0:30), la pro-urotensine II de rat (SEQ ID
N0:31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID N0:32), la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:33), la pro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID N0:35).
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites compositions sont caractérisées en ce que les séquences nucléiques sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID N0:4 à
SEQ ID N0:6, les séquences de rat, SEQ ID N0:18 à SEQ ID N0:20 et les séquences de souris, SEQ ID N0:27 à SEQ ID N0:29.
La présente invention a en outre pour objet, l'utilisation de polypeptides appartenant à la famille de l'urotensine II ou de séquences nucléiques codant pour lesdits polypeptides, pour la préparation d'un médicament destiné
à traiter les maladies neurodégénératives de la moelle épinière ou les traumatismes de Ia moelle épinière.
Les polypeptides appartenant à la famille de l'urotensine II aptes à
être utilisés conformément à l'invention peuvent avoir pour origine, aussi bien les invertébrés que les vertébrés, notamment les mammifères, et de préférence les mammifères humains.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite utilisation est caractérisée en ce que le polypeptide est choisi dans le groupe constitué
par la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID NO: I ), la pro-urotensine II
humaine (SEQ ID N0:2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID N0:3), la prépro-urotensine II de rat (SEQ ID N0:30), la pro-urotensine II de rat (SEQ ID N0:31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID N0:32), la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:33), la pro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID
N0:35).
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite utilisation est caractérisée en ce que les polvnucléotides sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID N0:4 à SEQ ID N0:6, les séquences de rat, SEQ ID NO:I8 à SEQ ID N0:20 et les séquences de souris, SEQ ID N0:27 à SEQ ID N0:29.
1o La présente invention a, également, pour objet un kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence selon l'invention, apte à
détecter la présence d'un ARNm, éventuellement modifié, codant pour une urotensine II de mammifere dans un échantillon biologique.
La présente invention a, en outre, pour objet l'utilisation desdits polypeptides, qui présentent également une activité hypertensive, pour la sélection d'antagonistes de cette activité (sélection d'ami-hypertenseurs présentant une activité
à l'encontre des urotensines II selon l'invention).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfere à
2o des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 illustre l'alignement des séquences en acides aminés déduites respectivement des prépro-LTII humaine, de grenouille et de carpe.
Dans cette figure, la séquence signal est indiquée en italique ; les acides aminés conservés sont indiqués en noir ; les sites de clivage de fa prohormone sont indiqués par des étoiles et les résidus acides conservés sont indiqués par un cercle noir. Le pont disulfure présent dans la séquence de l'UII est indiqué sous Ia séquence de I'urotensine II. Les acides aminés sont numérotés sur la droite de la figure ;
- la figure 2 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII
3o humaines ;
- la figure 3 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII de rat ;
- la figure 4 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII de souris ;
- la figure 5 illustre la distribution tissulaire de 1'ARNm de la prépro-UII humaine. La figure ~A illustre l'analyse en dot blot de l'expression de l'ARNm de la prépro-UII dans différents tissus humains, en utilisant le Masterblot de Clontech (ARN poly(A) de 50 tissus humains différents (80-448 ng/point, standardisé
en utilisant le taux d'expression en ARN de 8 gènes domestiques). Les contrôles posi-tifs consistent en ADN génomique humain ; les contrôles négatifs incluent de l'ADN
ou de TARN de levure ou d'E. coli ainsi que des séquences génomiques répétées humaines (H). Le blot est hybridé avec la sonde d'ADNc codant pour la prépro-UII
humaine et exposé pendant 2 jours à un film X-Omat. La figure SB illustre l'analyse en Northern Blot de l'expression de l'ARNm de prépro-UII dans la moelle épinière humaine ; 2 pg d'ARNm poly(A) de moelle épinière sont hybridés avec Ia sonde constituée par l'ADNc de Ia prépro-UII humaine. La taille est déterminée en utilisant lo des marqueurs de taille des ARN (chaînes de nucléotides standards calibrés). La figure SC correspond à des autoradiographies aux rayons X et montre la distribution de l'ARNm de la prépro-UII dans la moelle épinière humaine. Les sections frontales sont hybridées avec une ribosonde prépro-UII anti-sens ( 1 ) ou sens (2} et exposées pendant jours à des films sensibles aux rayons X ;
- la figure 6 est une comparaison des structures primaires de l'urotensine II de différentes espèces. Des tirets ont été introduits pour que les séquences présentent un alignement optimal. Les points illustrent les identités de rési-dus d'acides aminés entre les différentes séquences, par rapport à la séquence humaine.
- la figure 7 illustre la distribution tissulaire de l'ARNm de la prépro-UII de rat et de souris.
II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE
- Matériel et Méthodes * Isolement de l'ADNc de la prépro-UII humaine Une séquence EST (expressed sequence tag) codant pour un peptide ayant une certaine identité avec l'urotensine II de grenouille est enregistrée sous le 3o n° AA535545 (Genbank). Cette séquence dérive d'une analyse EST de clones d'ADNc obtenus à partir de tumeurs du colon.
Deux amorces (5'-AACCCAAGAGGAAATTTGAGAAAGTT-3' (SEQ ID N0:7) et 5'-CCAGGTAACAATGAACAGGGTGTAG-3' (SEQ ID N0:8)) déduites de la séquence EST permettent de synthétiser un fragment de 269 pb par RT-PCR à partir d'un échantillon de tumeur du colon humain, dans les conditions suivantes 94°C, 4 min, 1 X ; 94°C, I min ; 55°C, 1 min ;
72°C, 1 min, 30X ;
72°C, 5 min, IX.
Le produit de la PCR est marqué avec des (3zP] dCTP par amorçage aléatoire, puis hybridé avec différents tissus humains contenant des ARN
poly(A) ainsi qu'avec des contrôles positifs et négatifs (MasterBlot, Clontech, Palo Alto).
5 L'hybridation et les lavages sont réalisés dans Ies conditions suivantes * préhybridation : incubation à 42°C, au moins 5 heures dans un milieu réactionnel comprenant 50 % formamide, SX SSC, SX Denhardt's, 50 mM
NaH2P04/Na2HP04, 200 p,g/ml ADN de sperme de saumon , 0,1 % SDS.
lo * hybridation : même milieu que le milieu de préhybridation avec la sonde marquée en plus.
* lavages : 4 fois 5 minutes à température ambiante, 2X SSC +
0,1 % SDS, puis 2 fois 10 minutes à 42°C, 0,1 % SDS + 0,1 % SDS.
Le blot est exposé à un film X-OMAT (Kodak) et les signaux d'hybridation sont quantifiés à l'aide du logiciel Densylab (Bioprobe Systems, France).
Le signal d'hybridation le plus important est obtenu dans la moelle épinière.
Dans ces conditions, l'ARN poly(A) de moelle épinière humaine (Clontech) est utilisé pour l'amplification de l'extrémité 5' de l'ADNc d'UII
humaine avec un kit RACE (kit d'amplification Marathon cDNA, Clontech).
* Analyse en Northern blot (transfert d'ARN sur membrane) 2 p,g d'ARN poly(A) de moelle épinière humaine (Clantech) sont déposés sur gel d'agarose-formaldéhyde ; après migration, on procède à un transfert sur membrane de nylon et à une hybridation avec le produit de la PCR
spécifique de I'ADNc de I'UII humaine marqué par incorporation de [32P] dCTP.
* Hybridation in situ Des ribosondes sens et anti-sens humaines sont préparées par trans cription in vitro des produits de la PCR obtenus avec des amorces prépro-UII
spéci 3o figues 5'-CTGCCAGAGATGCTGGGTG-3' (SEQ ID NO:IO) et 5' GACACAGTATTTCCAGAAGCAATC-3' (SEQ ID NO:11) étendues à leur extré-mité 5'-terminale avec Ies promoteurs SP6 et T7 des ARN polymérases correspon-dantes ; la transcription est réalisée en présence de (3'S]UTP (Amersham) ou de digoxigénine-I 1-UTP (Boerhinger), et de T3 ou T7 ARN polymérase, dans les mêmes conditions de PCR que celles exposées ci-dessus.
Une portion de moelle épinière cervicale humaine a été obtenue par autopsie d'un sujet de sexe masculin âgé de 70 ans.
Le fragment de tissu est fixé dans du formaldéhyde 4 % pendant 24 ' heures, inclus dans du Tissue-Tek et congelé dans de l'azote liquide.
Des sections frontales (12 ym d'épaisseur) sont coupées à I'aide d'un cryostat et conservées à -80°C.
Les sections sont prétraitées comme décrit dans H. Tostivint et al.
( I4) et recouvertes d'un tampon de préhybridation (50 % formamide, 0,6 M
NaCI, mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,02 % Ficoll, 0,02 % polyvinylpyrrolidine, 0,1 % BSA, 1 mM EDTA , pH 8,0 , 550 pg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé, SO p.g/mI
d'ARNt de levure).
1o L'hybridation est réalisée à 55°C pendant une nuit dans le même tampon (à l'exception de la concentration en ADN de sperme de saumon dénaturé
60 pg/ml), complémenté avec 10 mM de dithiothréitol, du sulfate de dextran à
10 % et des ribosondes dénaturées par la chaleur.
Les sondes marquées au 35S et les sonder marrntPPC à ta digoxigénine sont diluées dans le tampon d'hybridation pour obtenir une concentration finale de 5.106 dpm/ml et 1:100 (v/v), respectivement.
Les coupes sont lavées dans du tampon 2X SSC à 60°C et traitées avec de la RNase A (50 p.g/ml) pendant 60 min à 37°C.
Cinq lavages dans des conditions stringentes sont effectués dans un 2o tampon O,1X SSC, 14 mM de (3-mercaptoéthanol, 0,05 % de pyrophosphate de sodium à 60°C.
Les sections hybridées avec les ribosondes marquées au 35S sont déshydratées dans des solutions d'éthanol comprenant des concentrations croissantes d'acétate de sodium 0,3 M et exposées sur un film Hyperfilm-(3max (Amersham) pendant 2 semaines.
Les sections hybridées avec les ribosondes marquées à la digoxi-génine sont lavées dans un tampon 1 (100 mM Tris-HCI et I50 mM NaCI, pH 7,5), incubées pendant 30 min dans un tampon de blocage (2 % d'agent bloquant Boehringer dans du tampon 1 ) et incubées pendant 2 heures dans le tampon 1 conte-3o nant 1:500 d'anticorps anti-digoxigénine conjugués à la phosphatase alcaline (Boehringer), I % de sérum de mouton normal et 0,1 % de Triton X100. Les sections sont rincées deux fois pendant 10 min dans le tampon 1 et 10 min dans le tampon 2 (100 mM Tris-HCI, 100 mM NaCI et 50 mM MgCl2, pH 9,5), puis incubées pendant 3 heures dans une solution chromagène consistant en Fast Red TR/Naphtol AS-MX et
Il a également été montré que l'urotensine II de poisson est exprimée sous la forme de précurseurs, dont les structures primaires ont été
déterminées à partir du système neurosécrétoire caudal de la carpe (Cyprinus carpio) (13).
Les Inventeurs ont trouvé, de manière inattendue, qu'une urotensine II était exprimée chez les mammifères. notamment chez l'homme et chez les murins et qu'elle pouvait présenter, chez l'homme une activité sur la survie et/ou la régénération 1 o des motoneurones et sur la pression artérielle (hypertension).
La présente invention a pour objet des polypeptides, isolés de mammiferes, caractérisés en ce qu'ils comprennent à leur extrémité C-terminale un heptapeptide présentant la séquence suivante : Cys-Phe-Trp-Lys-Tvr-Cys-Xaa dans laquelle Xaa représente Val ou Ile, en ce qu'ils appartiennent à Ia famille des urotensines II et en ce qu'ils présentent au moins 45 %, et de préférence au moins 70 % de similarité avec le polypeptide de séquence SEQ ID N0:1, correspondant à la prépro-urotensine II humaine.
La similarité est quantifiée à l'aide du logiciel Clustal~, notamment accessible sur l'Intemet (site http://ww2.ebi.ac.uk/clustalw/).
2o La présente invention englobe en particulier - la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID N0:1), la pro-urotensine II humaine (SEQ ID N0:2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID N0:3), - la prépro-urotensine II de rat (SEQ ID N0:30), la pro-urotensine II
de rat (SEQ ID N0:31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID N0:32), - la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:33), la pro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID
N0:35).
Ces séquences polypeptidiques de mammifères présentent globale-ment une faible similarité avec les séquences de poisson ou de grenouille (figure 1 et figure 4) - 16 % de similarité entre la prépro-UII-a ou la prépro-UII-y de carpe et la prépro-UII humaine ;
- 25 % de similarité entre la prépro-UII de grenouille et la prépro-UII humaine.
Au niveau N-terminal de l'UII humaine, ces séquences ne présentent aucune similarité avec les UII de non-mammifères antérieurement décrites.
L'invention englobe également des polypeptides ou des peptides dérivés des urotensines II de mammifère et de leurs précurseurs, selon l'invention, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés ; il peut s'agir par ' exemple de polypeptides dans lesquels des modifications ont été apportées, notam-ment par substitution des acides aminés dextrojyres par des acides aminés levogyres (pseudopeptides) ou de polypeptides obtenus par modélisation moléculaire et présen tant une activité d'urotensine II au niveau de la jonction neuromusculaire ou des autres cibles biologiques de l'urotensine II.
La présente invention a également pour objet un fragment d'acide nucléique purifié, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence codant pour une urotensine II de mammifère telle que définie ci-dessus ou de sa to séquence complémentaire, sens ou anti-sens, à l'exception de l'EST ayant pour numéro d'accession Gen Bank, le n° AA535545.
Dans ce cadre, la présente invention englobe en particulier les ADNc, les ARNm et les ADN génomiques des urotensines II et de leurs précurseurs.
Elle englobe en particulier les séquences suivantes * séquences humaines - la séquence codant pour la prépro-urotensine II humaine, de séquence SEQ ID NO:4, qui comprend 551 pb et dans laquelle . le segment I-32 est une séquence non-codante, . le segment 33-407 code pour la prépro-urotensine II humaine, le 2o segment 33-92 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 408-5~ 1 est non-codant (voir figure 2), - un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
humaine (séquence SEQ ID NO:S), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II humaine, le précurseur de l'urotensine II humaine et correspond au segment de la SEQ ID N0:4;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
humaine (séquence SEQ ID N0:6), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II
humaine et correspond au segment 372-407 de la séquence SEQ ID N0:4 ;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
3o humaine, codant pour un dipeptide (Pro-Tyr), en amont du site de clivage tribasique, lui-même situé juste en amont de la séquence codant pour l'urotensine II
humaine et spécifique de ladite séquence humaine (voir figure 2) ;
- des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à 50 nucléotides de SEQ ID N0:4 et notamment les séquences SEQ ID N0:7-8 et 10-17 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes . les séquences SEQ ID N0:7 et N0:8, correspondant respective-ment aux segments 267-292 et ~3~-~ 11 de la séquence SEQ ID N0:4 ;
. les séquences SEQ ID NO:10 et 11 correspondant respectivement -aux positions 198-216 et 381-404 de la séquence ID N0:4 ;
. les séquences SEQ ID N0:12 et SEQ ID N0:13, correspondant respectivement aux positions 46-6~ et 214-19~ de la séquence SEQ ID N0:4 ;
. Ies séquences SEQ ID N0:14 (positions 9-28 de la séquence SEQIDN0:4)etSEQIDN0:13;
. les séquences SEQ ID NO: l S (positions 14-33 de la séquence SEQIDN0:4)etSEQIDN0:l3;
. tes séquences SEQ ID N0:12 et SEQ ID NO:I6 (positions150-131 to de la séquence SEQ ID N0:4) ;
. les séquences SEQ ID N0:17 (positions 8-27 de la séquence SEQ ID N0:4) et SEQ ID N0:13.
- des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID N0:4 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID N0:4.
Lesdites sondes sont de préférence utilisées dans les conditions d'hybridation suivantes . hybridation : SX SSPE (0,9 M NaCI/0,05 M tampon sodium phosphate, pH 7,7/0,005 M EDTA), 0,1 % SDS, lOX Denhardt's (0,2 % Ficoll/0,2 polyvinylpyrrolidone/0,2 % BSA), 50 p.g/ml ARNt, SO ug/ml ADN de sperme de saumon dénaturé. 37°C, une nuit.
, lavages : SX SSPE/0,1 % SDS, 4 fois 5 minutes, température ambiante, 3X SSPE/0,1 % SDS, 2 fois 10 minutes, 30°C.
* séquences de rat - la séquence codant pour la prépro-urotensine II de rat, de séquence SEQ ID N0:18, qui comprend 529 pb et dans laquelle . le segment 1-36 est une séquence non-codante, . le segment 37-405 code pour la prépro-urotensine II de rat, le segment 37-96 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 406-X29 est non-codant (voir figure 3), - un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de 3o rat (séquence SEQ ID N0:19), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II de rat, le précurseur de l'urotensine II de rat et correspond au segment 96-405 de la SEQ ID N0:18 ;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de rat (séquence SEQ ID N0:20), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II
de rat et correspond au segment 364-405 de la séquence SEQ ID N0:18 ;
- des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à SO -nucléotides de SEQ ID N0:18 et notamment les séquences SED ID N0:36-42 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes . les séquences SEQ ID N0:36 et SEQ ID N0:37, correspondant 5 respectivement aux positions 29~-314 et X04-485 de la séquence SEQ ID N0:18 ;
. les séquences SEQ ID N0:38 (positions 280-299 de la séquence SEQIDN0:18)etSEQIDN0:37;
. les séquences SEQ ID N0:39 (positions 131-150 de la séquence SEQ ID N0:18) et SEQ ID N0:40 (positions 314-295 de la SEQ ID N0:18) ;
to . les séquences SEQ ID N0:41, (positions 322-341 de la séquence SEQ ID N0:18) et SEQ ID N0:37 ;
les séquences SEQ ID N0:42 (positions SO-G9 de la SEQ ID N0:18) et SEQ ID N0:40.
- des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID N0:18 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID
N0:18, notamment la SEQ ID N0:43 (positions 192-221 de Ia séquence SEQ ID N0:18).
* séquences de souris - la séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris, de séquence SEQ ID N0:27, qui comprend 539 pb et dans laquelle . le segment 1-36 est une séquence non-codante, . le segment 37-405 code pour la prépro-urotensine II de souris, le segment 37-96 correspondant à la séquence codant pour le peptide signal et . le segment 406-X39 est non-codant (voir figure 4), - un fragment de Ia séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris (séquence SEQ ID N0:28), caractérisé en ce qu'il code pour la pro-urotensine II de souris, le précurseur de l'urotensine de souris et correspond au segment de la SEQ ID N0:27 ;
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II de souris (séquence SEQ ID N0:29), caractérisé en ce qu'il code pour l'urotensine II de 3o souris et correspond au segment 3~5-405 de la séquence SEQ ID N0:27 ;
- des fragments, aptes à servir d'amorces constitués de 20 à 50 nucléotides de SEQ ID N0:27 et notamment les séquences SEQ ID N0:21-26 et plus particulièrement les paires d'amorces suivantes . les séquences SEQ ID N0:21 et SEQ ID N0:22, correspondant respectivement aux positions 29~-314 et 485-504 de la séquence SEQ ID N0:27 ;
. les séquences SEQ ID N0:23 (positions 280-299 de la séquence SEQ ID N0:27) et SEQ ID NO:?2 ;
. les séquences SEQ ID N0:24 (positions 131-150 de la séquence -SEQ ID N0:27) et SEQ ID N0:22 ;
. les séquences SEQ ID N0:2S (positions 29S-314 de la séquence SEQ ID N0:27) et SEQ ID N0:22 ;
. les séquences SEQ ID N0:24 et SEQ ID N0:26 (positions 322-341 de la séquence SEQ ID N0:27).
- des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID N0:27 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de la séquence SEQ ID N0:27 et notamment la séquence SEQ ID N0:44 (positions 204-233 de la séquence lo SEQ ID N0:27).
Les conditions d'hybridation des sondes murines sont similaires à
celles exposées ci-dessus, pour les séquences humaines.
Compte tenu des données à la disposition des Inventeurs, il n'était pas évident que les mammifères puissent exprimer une urotensine II et que cette t5 dernière exerçât effectivement d'autres effets que des effets cardiovasculaires.
Lesdits polypeptides peuvent être produits, soit en exprimant les séquences d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus dans des cellules hôtes, soit par synthèse, et notamment par synthèse selon la technique de Mernfield.
Les séquences nucléiques ci-dessus définies ont comme première 2o application de détecter soit la présence ou l'absence de l'ARNm codant pour une uro tensine II de mammifère et notamment pour l'urotensine II humaine dans des échan tillons biologiques (biopsies, par exemple), notamment chez des sujets présentant une pathologie neurodégénérative ou un traumatisme de la moelle épinière, soit de détecter une mutation dans la séquence du gène ou de l'ARNm codant pour l'urotensine 25 (comparaison avec les séquences d'acides nucléiques selon l'invention).
Les séquences nucléiques ci-dessus définies ont comme deuxième application, la production de vecteurs aptes à exprimer les précurseurs de l'urotensine II humaine, notamment dans le cadre d'une thérapie génique ciblée.
Dans le cadre de ces applications, les séquences nucléiques sont 3o avantageusement, sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID N0:4 à SEQ ID N0:6, les séquences de rat, SEQ ID N0:18 à
SEQ ID N0:20 et les séquences de souris, SEQ ID N0:27 à SEQ ID N0:29.
La présente invention a également pour objet une cellule transformée par au moins un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
35 La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un polypeptide tel que défini ci-dessus ou au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour tout ou partie desdits polypeptides, associé à au moins un véhicule ' pharmaceutiquement acceptable.
Au sens de la présente invention, on entend par véhicule pharmaceutiquement acceptable, aussi bien les véhicules usuels que ceux utilisés dans le cadre d'une thérapie génique.
De manière préférée, lesdites compositions sont administrées par voie intrathécale.
Les compositions selon la présente invention, permettent notamment de traiter les maladies neurodégénératives de la moelle épinière, en particulier les to maladies de la plaque neuromusculaire et plus particulièrement les maladies amyotrophiques, telles que la sclérose latérale amyotrophique ou les traumatismes de la moelle épinière, plus particulièrement les paraplégies et les hémiplégies.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites compositions sont caractérisées en ce que le polypeptide est choisi dans le groupe constitué par la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID N0:1 ), la pro-urotensine II
humaine (SEQ ID N0:2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID N0:3), la prépro urotensine II de rat (SEQ ID N0:30), la pro-urotensine II de rat (SEQ ID
N0:31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID N0:32), la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:33), la pro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID N0:35).
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites compositions sont caractérisées en ce que les séquences nucléiques sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID N0:4 à
SEQ ID N0:6, les séquences de rat, SEQ ID N0:18 à SEQ ID N0:20 et les séquences de souris, SEQ ID N0:27 à SEQ ID N0:29.
La présente invention a en outre pour objet, l'utilisation de polypeptides appartenant à la famille de l'urotensine II ou de séquences nucléiques codant pour lesdits polypeptides, pour la préparation d'un médicament destiné
à traiter les maladies neurodégénératives de la moelle épinière ou les traumatismes de Ia moelle épinière.
Les polypeptides appartenant à la famille de l'urotensine II aptes à
être utilisés conformément à l'invention peuvent avoir pour origine, aussi bien les invertébrés que les vertébrés, notamment les mammifères, et de préférence les mammifères humains.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite utilisation est caractérisée en ce que le polypeptide est choisi dans le groupe constitué
par la prépro-urotensine II humaine (SEQ ID NO: I ), la pro-urotensine II
humaine (SEQ ID N0:2) et l'urotensine II humaine (SEQ ID N0:3), la prépro-urotensine II de rat (SEQ ID N0:30), la pro-urotensine II de rat (SEQ ID N0:31) et l'urotensine II de rat (SEQ ID N0:32), la prépro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:33), la pro-urotensine II de souris (SEQ ID N0:34) et l'urotensine II de souris (SEQ ID
N0:35).
Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite utilisation est caractérisée en ce que les polvnucléotides sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences humaines, SEQ ID N0:4 à SEQ ID N0:6, les séquences de rat, SEQ ID NO:I8 à SEQ ID N0:20 et les séquences de souris, SEQ ID N0:27 à SEQ ID N0:29.
1o La présente invention a, également, pour objet un kit de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence selon l'invention, apte à
détecter la présence d'un ARNm, éventuellement modifié, codant pour une urotensine II de mammifere dans un échantillon biologique.
La présente invention a, en outre, pour objet l'utilisation desdits polypeptides, qui présentent également une activité hypertensive, pour la sélection d'antagonistes de cette activité (sélection d'ami-hypertenseurs présentant une activité
à l'encontre des urotensines II selon l'invention).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfere à
2o des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 illustre l'alignement des séquences en acides aminés déduites respectivement des prépro-LTII humaine, de grenouille et de carpe.
Dans cette figure, la séquence signal est indiquée en italique ; les acides aminés conservés sont indiqués en noir ; les sites de clivage de fa prohormone sont indiqués par des étoiles et les résidus acides conservés sont indiqués par un cercle noir. Le pont disulfure présent dans la séquence de l'UII est indiqué sous Ia séquence de I'urotensine II. Les acides aminés sont numérotés sur la droite de la figure ;
- la figure 2 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII
3o humaines ;
- la figure 3 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII de rat ;
- la figure 4 illustre la structure des prépro-UII, pro-UII et UII de souris ;
- la figure 5 illustre la distribution tissulaire de 1'ARNm de la prépro-UII humaine. La figure ~A illustre l'analyse en dot blot de l'expression de l'ARNm de la prépro-UII dans différents tissus humains, en utilisant le Masterblot de Clontech (ARN poly(A) de 50 tissus humains différents (80-448 ng/point, standardisé
en utilisant le taux d'expression en ARN de 8 gènes domestiques). Les contrôles posi-tifs consistent en ADN génomique humain ; les contrôles négatifs incluent de l'ADN
ou de TARN de levure ou d'E. coli ainsi que des séquences génomiques répétées humaines (H). Le blot est hybridé avec la sonde d'ADNc codant pour la prépro-UII
humaine et exposé pendant 2 jours à un film X-Omat. La figure SB illustre l'analyse en Northern Blot de l'expression de l'ARNm de prépro-UII dans la moelle épinière humaine ; 2 pg d'ARNm poly(A) de moelle épinière sont hybridés avec Ia sonde constituée par l'ADNc de Ia prépro-UII humaine. La taille est déterminée en utilisant lo des marqueurs de taille des ARN (chaînes de nucléotides standards calibrés). La figure SC correspond à des autoradiographies aux rayons X et montre la distribution de l'ARNm de la prépro-UII dans la moelle épinière humaine. Les sections frontales sont hybridées avec une ribosonde prépro-UII anti-sens ( 1 ) ou sens (2} et exposées pendant jours à des films sensibles aux rayons X ;
- la figure 6 est une comparaison des structures primaires de l'urotensine II de différentes espèces. Des tirets ont été introduits pour que les séquences présentent un alignement optimal. Les points illustrent les identités de rési-dus d'acides aminés entre les différentes séquences, par rapport à la séquence humaine.
- la figure 7 illustre la distribution tissulaire de l'ARNm de la prépro-UII de rat et de souris.
II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE
- Matériel et Méthodes * Isolement de l'ADNc de la prépro-UII humaine Une séquence EST (expressed sequence tag) codant pour un peptide ayant une certaine identité avec l'urotensine II de grenouille est enregistrée sous le 3o n° AA535545 (Genbank). Cette séquence dérive d'une analyse EST de clones d'ADNc obtenus à partir de tumeurs du colon.
Deux amorces (5'-AACCCAAGAGGAAATTTGAGAAAGTT-3' (SEQ ID N0:7) et 5'-CCAGGTAACAATGAACAGGGTGTAG-3' (SEQ ID N0:8)) déduites de la séquence EST permettent de synthétiser un fragment de 269 pb par RT-PCR à partir d'un échantillon de tumeur du colon humain, dans les conditions suivantes 94°C, 4 min, 1 X ; 94°C, I min ; 55°C, 1 min ;
72°C, 1 min, 30X ;
72°C, 5 min, IX.
Le produit de la PCR est marqué avec des (3zP] dCTP par amorçage aléatoire, puis hybridé avec différents tissus humains contenant des ARN
poly(A) ainsi qu'avec des contrôles positifs et négatifs (MasterBlot, Clontech, Palo Alto).
5 L'hybridation et les lavages sont réalisés dans Ies conditions suivantes * préhybridation : incubation à 42°C, au moins 5 heures dans un milieu réactionnel comprenant 50 % formamide, SX SSC, SX Denhardt's, 50 mM
NaH2P04/Na2HP04, 200 p,g/ml ADN de sperme de saumon , 0,1 % SDS.
lo * hybridation : même milieu que le milieu de préhybridation avec la sonde marquée en plus.
* lavages : 4 fois 5 minutes à température ambiante, 2X SSC +
0,1 % SDS, puis 2 fois 10 minutes à 42°C, 0,1 % SDS + 0,1 % SDS.
Le blot est exposé à un film X-OMAT (Kodak) et les signaux d'hybridation sont quantifiés à l'aide du logiciel Densylab (Bioprobe Systems, France).
Le signal d'hybridation le plus important est obtenu dans la moelle épinière.
Dans ces conditions, l'ARN poly(A) de moelle épinière humaine (Clontech) est utilisé pour l'amplification de l'extrémité 5' de l'ADNc d'UII
humaine avec un kit RACE (kit d'amplification Marathon cDNA, Clontech).
* Analyse en Northern blot (transfert d'ARN sur membrane) 2 p,g d'ARN poly(A) de moelle épinière humaine (Clantech) sont déposés sur gel d'agarose-formaldéhyde ; après migration, on procède à un transfert sur membrane de nylon et à une hybridation avec le produit de la PCR
spécifique de I'ADNc de I'UII humaine marqué par incorporation de [32P] dCTP.
* Hybridation in situ Des ribosondes sens et anti-sens humaines sont préparées par trans cription in vitro des produits de la PCR obtenus avec des amorces prépro-UII
spéci 3o figues 5'-CTGCCAGAGATGCTGGGTG-3' (SEQ ID NO:IO) et 5' GACACAGTATTTCCAGAAGCAATC-3' (SEQ ID NO:11) étendues à leur extré-mité 5'-terminale avec Ies promoteurs SP6 et T7 des ARN polymérases correspon-dantes ; la transcription est réalisée en présence de (3'S]UTP (Amersham) ou de digoxigénine-I 1-UTP (Boerhinger), et de T3 ou T7 ARN polymérase, dans les mêmes conditions de PCR que celles exposées ci-dessus.
Une portion de moelle épinière cervicale humaine a été obtenue par autopsie d'un sujet de sexe masculin âgé de 70 ans.
Le fragment de tissu est fixé dans du formaldéhyde 4 % pendant 24 ' heures, inclus dans du Tissue-Tek et congelé dans de l'azote liquide.
Des sections frontales (12 ym d'épaisseur) sont coupées à I'aide d'un cryostat et conservées à -80°C.
Les sections sont prétraitées comme décrit dans H. Tostivint et al.
( I4) et recouvertes d'un tampon de préhybridation (50 % formamide, 0,6 M
NaCI, mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,02 % Ficoll, 0,02 % polyvinylpyrrolidine, 0,1 % BSA, 1 mM EDTA , pH 8,0 , 550 pg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé, SO p.g/mI
d'ARNt de levure).
1o L'hybridation est réalisée à 55°C pendant une nuit dans le même tampon (à l'exception de la concentration en ADN de sperme de saumon dénaturé
60 pg/ml), complémenté avec 10 mM de dithiothréitol, du sulfate de dextran à
10 % et des ribosondes dénaturées par la chaleur.
Les sondes marquées au 35S et les sonder marrntPPC à ta digoxigénine sont diluées dans le tampon d'hybridation pour obtenir une concentration finale de 5.106 dpm/ml et 1:100 (v/v), respectivement.
Les coupes sont lavées dans du tampon 2X SSC à 60°C et traitées avec de la RNase A (50 p.g/ml) pendant 60 min à 37°C.
Cinq lavages dans des conditions stringentes sont effectués dans un 2o tampon O,1X SSC, 14 mM de (3-mercaptoéthanol, 0,05 % de pyrophosphate de sodium à 60°C.
Les sections hybridées avec les ribosondes marquées au 35S sont déshydratées dans des solutions d'éthanol comprenant des concentrations croissantes d'acétate de sodium 0,3 M et exposées sur un film Hyperfilm-(3max (Amersham) pendant 2 semaines.
Les sections hybridées avec les ribosondes marquées à la digoxi-génine sont lavées dans un tampon 1 (100 mM Tris-HCI et I50 mM NaCI, pH 7,5), incubées pendant 30 min dans un tampon de blocage (2 % d'agent bloquant Boehringer dans du tampon 1 ) et incubées pendant 2 heures dans le tampon 1 conte-3o nant 1:500 d'anticorps anti-digoxigénine conjugués à la phosphatase alcaline (Boehringer), I % de sérum de mouton normal et 0,1 % de Triton X100. Les sections sont rincées deux fois pendant 10 min dans le tampon 1 et 10 min dans le tampon 2 (100 mM Tris-HCI, 100 mM NaCI et 50 mM MgCl2, pH 9,5), puis incubées pendant 3 heures dans une solution chromagène consistant en Fast Red TR/Naphtol AS-MX et
3 mM Levamisole (Sigma).
La réaction est arrêtée par rinçage dans un tampon TE ( I O mM Tris-HC1, I mM EDTA, pH 8,0).
Les sections sont examinées avec un microscope (Leitz Orthoplan). ' * Séquencaoe Le produit de l'amplification est sous-cloné dans un vecteur pGEM
T (Promega) et séquencé avec les amorces SP6 et T7 en utilisant le kit de séquençage Amersham (Thermo Sequenase).
- Résultats * Caractérisation de l'ADNc de prépro-UII humaine Le cadre de lecture ouvert des ADNc du précurseur de l'UII
humaine code pour une protéine de 124 acides aminés (figure 1 et figure 2).
lo L'organisation des précurseurs UII humains est similaire à celle de la prohormone UII de carpe et à celle du précurseur UII de la grenouille. Tous ces précurseurs comprennent une séquence signal en N-terminai puis un peptide flanquant, un site de clivage protéolytique (Lys/Arg-Lys-Arg) et Ia séquence de l'urotensine II, localisée à l'extrémité C-terminale de chaque précurseur.
Les peptides flanquants N-terminaux des précurseurs de carpe, de grenouille et humain ne présentent quasiment pas de similarité.
L'UII humaine ne comprend que 11 acides aminés alors que l'UII de grenouille et de carpe en possèdent respectivement 13 et 12 (figure 6).
La séquence de l'heptapeptide cyclique C-terminal de l'urotensine II
2o est conservée chez la grenouille et chez l'homme. Au contraire, la région N-terminale du peptide est très variable.
Chez la grenouille, comme chez la carpe, Ia région C-terminale du peptide flanquant contient un site de cuvage potentiel dibasique (Arg-Lys et Arg-Arg) qui pourrâit générer le dipeptide conservé GIn-Phe.
Cependant, chez l'homme, la séquence du dipeptide correspondant est totalement différente (Pro-Tyr) (figure 1 et figure 2).
* Distribution de l'ARNm de la prépro-UII humaine a été étudiée La distribution tissulaire de l'ARNm de la prépro-UII humain a été
étudiée par analyse dot blot (figure 5A).
3o Sur les 50 tissus différents testés, la moelle épinière présente le signal d'hybridation le plus important. L'ARNm de la prépro-UII est également observé dans la medulla oblongaaa mais l'intensité du signal est bien plus faible que celle obtenue dans la moelle épinière.
Dans les tissus périphériques, la présence d'ARNm de la prépro-UII
est détectée dans le rein, la rate, l'intestin grêle, le thymus, la prostate, l'hypophyse, la glande surrénale et en moindres quantités, dans l'estomac, le pancréas, les ovaires et le foie (figure 5A).
...,..."......." ...,. ~o- ~ - ~ 02352606 2001-05-25 V 1 4fi Es:~ f 4 47-. +4s 8s FR 009902941 . .a i L'analyse par Northern bloc révèle la pré~nce d'une seule bande correspondant à un AILNm de la prépro-UD d'environ 70a pli, dans la rnodlc épiniérc humaine. , Lc marquage da sections de Is portion ecrvi~ale do la moelle épiniére humaine par hybridation in situ montre que l'ARNm de la pr~pro-Ull est localisé dans les rnotoneurones (figure SC).
'" Caract~on de l'ADNc dcnrénrn-L11T de rat et dc sOL~S
Le cadre de lecture ouvort des ADNc du précurseur de I''IJI! dc rat et da souris code pour une protéine dc 12.3 acides aminés (figures 3 et 4).
I O La figure 7 illustre ies résultats de la distribution dans divers tissus de rat et de souris par RT-PCR. Les ARN totaux sont extraits et soumis à une réaction de RT-pCR, dans des conditions similaires à celles exposées ci-dessus.
Dans la partit supérieure de la figure ? (Ull), les produits PCR de rat (gauche) et d.e souris (droite) sont détectés par hybridation avec une sonde oligo nueléotidiquc interne et spécifique dc rat ct de souris (re,~pc~ctüetnent !es séquences SEQ ID N0:43 et 44).
La partie inférieure de la figure 7 (GADPFi~ illustre le dépôt sur gel d'agarosc des produits PCR. GAPIZIa utilisée comme contrc"m~e pour refléter des taux équivalents ù'ARN.
RÉFÉRENCES
t . H.A. Hern et al., Itec.. Prog. Ho~rn. Res., 1985, 41, 533-552.
2. D. Pearson et al., Froc. Natl. Acad. Sci. US~i, 1980, 77, 50?J1-5024, 3. J.M. Conlon et al., ReguL Pept., 1997, 69, 95-1U3.
La réaction est arrêtée par rinçage dans un tampon TE ( I O mM Tris-HC1, I mM EDTA, pH 8,0).
Les sections sont examinées avec un microscope (Leitz Orthoplan). ' * Séquencaoe Le produit de l'amplification est sous-cloné dans un vecteur pGEM
T (Promega) et séquencé avec les amorces SP6 et T7 en utilisant le kit de séquençage Amersham (Thermo Sequenase).
- Résultats * Caractérisation de l'ADNc de prépro-UII humaine Le cadre de lecture ouvert des ADNc du précurseur de l'UII
humaine code pour une protéine de 124 acides aminés (figure 1 et figure 2).
lo L'organisation des précurseurs UII humains est similaire à celle de la prohormone UII de carpe et à celle du précurseur UII de la grenouille. Tous ces précurseurs comprennent une séquence signal en N-terminai puis un peptide flanquant, un site de clivage protéolytique (Lys/Arg-Lys-Arg) et Ia séquence de l'urotensine II, localisée à l'extrémité C-terminale de chaque précurseur.
Les peptides flanquants N-terminaux des précurseurs de carpe, de grenouille et humain ne présentent quasiment pas de similarité.
L'UII humaine ne comprend que 11 acides aminés alors que l'UII de grenouille et de carpe en possèdent respectivement 13 et 12 (figure 6).
La séquence de l'heptapeptide cyclique C-terminal de l'urotensine II
2o est conservée chez la grenouille et chez l'homme. Au contraire, la région N-terminale du peptide est très variable.
Chez la grenouille, comme chez la carpe, Ia région C-terminale du peptide flanquant contient un site de cuvage potentiel dibasique (Arg-Lys et Arg-Arg) qui pourrâit générer le dipeptide conservé GIn-Phe.
Cependant, chez l'homme, la séquence du dipeptide correspondant est totalement différente (Pro-Tyr) (figure 1 et figure 2).
* Distribution de l'ARNm de la prépro-UII humaine a été étudiée La distribution tissulaire de l'ARNm de la prépro-UII humain a été
étudiée par analyse dot blot (figure 5A).
3o Sur les 50 tissus différents testés, la moelle épinière présente le signal d'hybridation le plus important. L'ARNm de la prépro-UII est également observé dans la medulla oblongaaa mais l'intensité du signal est bien plus faible que celle obtenue dans la moelle épinière.
Dans les tissus périphériques, la présence d'ARNm de la prépro-UII
est détectée dans le rein, la rate, l'intestin grêle, le thymus, la prostate, l'hypophyse, la glande surrénale et en moindres quantités, dans l'estomac, le pancréas, les ovaires et le foie (figure 5A).
...,..."......." ...,. ~o- ~ - ~ 02352606 2001-05-25 V 1 4fi Es:~ f 4 47-. +4s 8s FR 009902941 . .a i L'analyse par Northern bloc révèle la pré~nce d'une seule bande correspondant à un AILNm de la prépro-UD d'environ 70a pli, dans la rnodlc épiniérc humaine. , Lc marquage da sections de Is portion ecrvi~ale do la moelle épiniére humaine par hybridation in situ montre que l'ARNm de la pr~pro-Ull est localisé dans les rnotoneurones (figure SC).
'" Caract~on de l'ADNc dcnrénrn-L11T de rat et dc sOL~S
Le cadre de lecture ouvort des ADNc du précurseur de I''IJI! dc rat et da souris code pour une protéine dc 12.3 acides aminés (figures 3 et 4).
I O La figure 7 illustre ies résultats de la distribution dans divers tissus de rat et de souris par RT-PCR. Les ARN totaux sont extraits et soumis à une réaction de RT-pCR, dans des conditions similaires à celles exposées ci-dessus.
Dans la partit supérieure de la figure ? (Ull), les produits PCR de rat (gauche) et d.e souris (droite) sont détectés par hybridation avec une sonde oligo nueléotidiquc interne et spécifique dc rat ct de souris (re,~pc~ctüetnent !es séquences SEQ ID N0:43 et 44).
La partie inférieure de la figure 7 (GADPFi~ illustre le dépôt sur gel d'agarosc des produits PCR. GAPIZIa utilisée comme contrc"m~e pour refléter des taux équivalents ù'ARN.
RÉFÉRENCES
t . H.A. Hern et al., Itec.. Prog. Ho~rn. Res., 1985, 41, 533-552.
2. D. Pearson et al., Froc. Natl. Acad. Sci. US~i, 1980, 77, 50?J1-5024, 3. J.M. Conlon et al., ReguL Pept., 1997, 69, 95-1U3.
4. D. Waugh et J.M. Conlon, Gen. Cvmp, Endocri.cul., 1993, 92, 419-427.
5. D. Waugh et al., Gen. Comp. EnrlucrinoL, 1995, 99, 323-332.
h. J.M. Conlon et al.; Biochem. Bivp&ys. li'es. Commun., 1992; 188, 578-589.
7. G.C. Gonzalea et al., peptides, 1992,13, fi95-7ü3.
8. H. Itob et al., Eur. J. Pharmacvl., 1988,149, 61-fib.
9. A. Gibson et al., Cen. Comp. Endvcrinol., 1986, 64, 435-439.
1 O.I. Muramatsu ct al., Gunma Symp. Endncrinvl., 1.979,16, 39-47.
11.K. Yano et al., Gcn. Comp. Endacrinol., 1994, 96, 412-419, 12.IC. Yang cc al., (3en. Comp. F.ndocrinol., 1996, 97, 103-110 13.5. Ohsako et al., J. Neurosci., 198&, 6, 2730-2?35.
14.H. Tostivint et al., Proc. NQr1 Acaa'. Sci. tISA, 1996, 93,1?~605-12fi10.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en aeuvre, de rcalisajtion et d'application qui . vienriant d'être décrits de façon plus explicite ; elle en ombras~ac au contraire toutes las variantes qui peuvent venir ~ l'esprit du technicien en la mature, sans s'écarter du cadre ni de la portée de Ia présente invention.
FEUILLE MODIFI E
LISTE DE SE~UENCES
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECIERCHE :~.EDICALE
BEAUVILLAIN, Jean-Claude COULOUARN, Yolaine JEGOU, Sylvie LIHRMANN, Isabelle VAUDRY, Hubert <120> UROTENSINES II DE MAMMIFERES E_ LEURS APPLICATIONS
<130> s598PCT25 <140>
<141>
<150> FR9814914 <151> 1998-11-26 <160> 94 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <21I> 124 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 1 Met Tyr Lys Leu Ala Ser Cys Cys Leu Leu Phe Ile Gly Phe Leu Asn Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu Leu Asp Ser Arg Glu Ile Ser Phe Gln Leu Ser Ala Pro His Glu Asp Ala Arg Leu Thr Pro Glu Glu Leu Glu Arg Ala Ser Leu Leu Gln Ile Leu Pro Glu Met Leu Gly Ala Glu Ara_ Gly Asp Ile Leu Arg Lys Ala Asp Ser Ser Thr Asn Ile Phe Asn Pro Arg Gly Asn Leu Arg Lys Phe Gln Asp Phe Ser Gly Gln Asp Pro Asn Ile Leu Leu Ser His Leu Leu Ala Arg Ile Trp Lys Pro Tyr Lys Lys Arg Glu Thr Pro Asp Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Val 115 12~
<210> 2 <211> 104 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2 Leu LeuLeuAsp SerArgGlu IleSerPhe GlnLeuSer AlaPro Pro His AspAlaArg LeuThrPro GluGluLeu GluArgAla SerLeu Glu Leu IleLeuPro GluMetLeu GlyAlaGlu ArgGlyAsp IleLeu Gln Arg AlaAspSer SerThrAsn IlePheAsn ProArgGly AsnLeu Lys Arg PheGlnAsp PheSerGly GlnAspPro AsnIleLeu LeuSer Lys 65 70 75 g0 His LeuAlaArg IleTrpLys ProTyrLys LysArgGlu ThrPro Leu Asp PheTrpLys TyrCysVal ' Cys <210>
<211>
<212>
PRT
<213> apiens Homo s <400> 3 Glu Thr Pro Asp Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Val <210> 9 <211> 551 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 4 ccaagaagga agccgtctat cttgtggcga tcatgtataa gctggcctcc tgctgtttgc 60 ttttcatagg attcttaaat cctctcttat ctcttcctct ccttgactcc agggaaatat 120 cctttcaact ctcagcacct catgaagacg cgcgcttaac tccggaggac gtagaaagag I80 cttcccttct acagatactg ccagagatç~ tgggtgcaga aagaggggat attctcagga 240 aagcagactc aagtaccaac atttttaacc caataggaaa tttgagaaag tttcaggatt 300 tctctggaca agatcctaac attttactga gtcatctttt ggccagaatc tggaaaccat 360 acaagaaacg tgagactcct gattgcttct ggaaatactg tgtctgaagt gaaataagca 420 tctgttagtc agctcagaaa cacccatctt agaatatgaa aaataacaca atgcttgatt 480 tgaaaacagt gtggagaaaa actaggcaaa ctacaccctg ttcattgtta cctggaaaat 540 aaatcctcta t 551 <210> 5 <211> 315 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 5 cttcctctcc ttgactccag ggaaatatcc tttcaactct cagcacctca tgaagacgcg 60 cgcttaactc cggaggagct agaaagagct tcccttctac agatactgcc agagatgctg 120 ggtgcagaaa gaggggatat tctcaggaaa gcagactcaa gtaccaacat ttttaaccca 180 _ 3 PCT/FR99/02941 agaggaaatt tgagaaagtt tcaggatttc tctggacaag atcctaacat tttactgagt 240 catcttttgg ccagaatctg gaaaccatac aagaaacgtg agactcctga ttgcttctgg 300 aaatactgtg tctga 315 <210> 6 <211> 36 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 6 gagactcctg attgcttctg gaaatactgt gtctga <210> 7 <211> 26 <212> ADN
<213> Homo sapiens <900> 7 aacccaagag gaaatttgag aaagtt 26 <210> 8 <211> 25 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 8 ccaggtaaca atgaacaggg tgtag 25 <210> 9 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 9 Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Val <210> 10 <211> I9 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 10 ctgccagaga tgctgggtg I9 <210> 11 <211> 24 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 11 gacacagtat ttccagaagc aatc 24 <210> 12 -<211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 12 cctcctgctg tttgcttttc 20 <210> 13 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 13 cccagcatct ctggcagtat 20 <210> 14 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 14 gaagccgtct atcttgtggc 20 <210> 15 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 15 cgtctatctt gtggcgatca 20 <210> 16 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 16 cgtcttcatg aggtgctgag 20 <210> 17 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 17 ggaagccgtc tatcttgtgg 20 <210> 18 <211> 529 <212> ADN
<213> Battus sp.
<400> 18 cggagcagac acccagccag acttcttccc gtcgtcatgg acagggtgcc cttctgctgc 60 ctgctcttcg taggactcct gaatccact~ ctgtcttttc ccgtcacgga cactggtgaa 120 atgtctcttc agcttccagt gcttgaggaa aatgctcttc gggctctgga ggagctggag 180 aggactgccc tcctgcagac gctgcgccaç accgtgggca cagaagcaga gggaagcctt 240 _ ggccaggcag atcccagtgc cgagactccc actccaaggg gaagcttgag gaaggctctc 300 actgggcaag attctaacac tgtactgagc cgtcttttgg cgagaaccag gaaacaacgt 360 aagcaacacg ggactgcccc agaatgctt= ~ggaagtact gcatttgaag agagacgtct 420 cctcagaacc atcacttcag gaaactaaaç agcagatgct tgaagaaaaa tcgtgccaac 980 aacgccccgt tctccactat gagaaataa~ ccctctatgt ttctcaact 529 <210> 19 <211> 312 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 19 tttcccgtca cggacactgg tgaaatgtc_ cttcagcttc cagtgcttga ggaaaatgct 60 cttcgggctc tggaggagct ggagaggac= gccctcctgc agacgctgcg ccagaccgtg I20 ggcacagaag cagagggaag ccttggcca~ gcagatccca gtgccgagac tcccactcca 180 aggggaagct tgaggaaggc tctcactggç caagattcta acactgtact gagccgtctt 240 ttggcgagaa ccaggaaaca acgtaagcaa cacgggactg ccccagaatg cttctggaag 300 tactgcattt ga 312 <210> 20 <211> 92 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 20 caacacggga ctgccccaga atgcttctgï aagtactgca tt 42 <210> 21 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <400> 21 agcttccagt gcttgaggaa <210> 22 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 22 gttagaattt tgcccagcga 20 <210> 23 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 23 gcttccagtg cttgaggaag 20 <210> 29 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <400> 29 tctgctgcct gctcttcata 20 <210> 25 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 25 acggacactg gtgagaggac 20 <220> 26 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 26 gagcgtcttc ctcaagcact 20 <210> 27 <211> 539 <212> ADN
<213> Mus <400> 27 cgagagcaga cgcccagacg gacttctcgc cgcatcatgg acagggtgcc cttctgctgc 60 ctgctcttca taggacttct gaatccactg ctgtcccttc ccgtcacgga cactggtgag 120 aggactcttc agcttccagt gcttgaggaa gacgctcttc gggctctgga ggagctggag 180 aggatggccc tcctgcagac cctgcgtcag accatgggca cggaagcagg ggagagccct 290 ggagaagcag gtcccagcac tgagactccc actccacggg gaagcatgag gaaggctttc 300 gctgggcaaa attctaacac tgtactgagt cgtctcttgg caagaaccag gaaacaacat 360 aagcaacacg gggctgcccc agagtgcttc tggaaatact gcatttgagg agacacaagc 420 gcccgttggt ctctcagaac cattacattc aggaaacggg cagagcagat gcttgaagca 480 aaatcacgct aacgacgcct tgttcttcat tatgagaaat aaatcctcta tgtttctca 539 <210> 28 <211> 493 <212> ADN
<213> Mus <400> 28 cttcccgtca cggacactgg tgagaggact cttcagcttc cagtgcttga ggaagacgct 60 cttcgggctc tggaggagct ggagaggatg gccctcctgc agaccctgcg tcagaccatg 120 ggcacggaag caggggagag ccctggagaa gcaggtccca gcactgagac tcccactcca 180 cggggaagca tgaggaaggc tttcgctggg caaaattcta acactgtact gagtcgtctc 290 ttggcaagaa ccaggaaaca acataagcaa cacggggctg ccccagagtg cttctggaaa 300 tactgcattt gaggagacac aagcgcccgt tggtctctca gaaccattac attcaggaaa 360 cgggcagagc agatgcttga agcaaaatca cgctaacgac gccttgttct tcattatgag 420 aaataaatcc tctatgtttc tca 443 <210> 29 <211> 309 <212> ADN
<213> Mus <400> 29 cttcccgtca cggacactgg tgagaggact ctLcagcttc cagtgcttga ggaagacgct 60 cttcgggctc tggaggagct ggagaggatg gccctcctgc agaccctgcg tcagaccatg 120 ggcacggaag caggggagag ccctggagaa gcaggtccca gcactgagac tcccactcca 180 cggggaagca tgaggaaggc tttcgctggg caaaattcta acactgtact gagtcgtctc 240 ttggcaagaa ccaggaaaca acataagcaa cacggggctg ccccagagtg cttctggaaa 300 tactgcatt 309 <210> 30 <211> 123 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<900> 30 Met Asp Arg Val Pro Phe Cys Cys Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Asn Pro Leu Leu Ser Phe Pro Val Thr Asp ''_'hr Gly Glu Met Ser Leu Gln Leu Pro Val Leu G1u Glu Asn Ala Leu Arg Ala Leu Glu Glu Leu Glu Arg Thr Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Val Gly Thr Glu Ala Glu Gly Ser Leu Gly Gln Ala Asp Pro Ser Ala Glu Thr Pro Thr Pro Arg Gly Ser Leu Arg Lys Ala Leu Thr Gly Gln Asp Ser Asn Thr Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln Arg Lys Gln His Gly Thr Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 31 <211> 103 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 31 Phe Pro Val Thr Asp Thr Gly Glu Met Ser Leu Gln Leu Pro Val Leu Glu Glu Asn Ala Leu Arg Ala Leu Glu Glu Leu Glu Arg Thr Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Val Gly Thr Glu Ala Glu Gly Ser Leu Gly Gln Ala Asp Pro Ser Ala Glu Thr Pro Thr Pro Arg Gly Ser Leu Arg Lys Ala Leu Thr Gly Gln Asp Se. .'-.s~ Thr Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln Arg Lys C_n His Gly Thr Ala Pro Glu 85 :0 95 Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 32 <211> 14 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 32 Gln His Gly Thr Ala Pro Glu Cys Pàe '"=p Lys Tyr'Cys Ile <210> 33 <211> 123 <212> PRT
<213> Mus <400> 33 Met Asp Arg Val Pro Phe Cys Cys Leu Leu Phe Ile Gly Leu Leu Asn Pro Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Asp Thr Gly Glu Arg Thr Leu Gln Leu Pro Val Leu Glu Glu Asp Ala Leu ?_~g Ala Leu Glu Glu Leu Glu Arg Met Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Met Gly Thr Glu Ala Gly Glu Ser Pro Gly Glu Ala Gly Pro Ser Thr Glu Thr Pro Thr Pro 65 70 75 8p Arg Gly Ser Met Arg Lys Ala Phe Ala Gly Gln Asn Ser Asn Thr Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln His Lys Gln His Gly Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 34 <211> 103 <212> PRT
<213> Mus <400> 39 Leu Pro Val Thr Asp Thr Gly Glu Arg 'T'r,r Leu Gln Leu Pro Val Leu 1 5 ~0 15 Glu Glu Asp Ala Leu Arg Ala Leu Giu Glu Leu Glu Arg Met Ala Les ' Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Met Gly Thr Glu Aîa Gly Glu Ser Pro Gly Glu Ala Gly Pro Ser Thr Glu Thr Pro Thr Pro Arg Gly Ser Met Arg Lys Ala Phe Ala Gly Gln Asn Ser Asn T'.~.r Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln His Lys Gln His Giy Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 35 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus <400> 35 Gln His Lys Gln His Gly Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 36 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 36 gctctcactg ggcaagattc 20 <210> 37 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 37 tctcatagtg gagaacgggg 20 <210> 38 <211> 20 <2.12> ADN
<213> Rattus exulans <400> 38 1~
ggaagcttga ggaaggctct 20 <210> 39 ' <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 39 agcttccagt gcttgaggaa 20 <210> 40 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 90 gaatcttgcc cagtgagagc ~ 20 <210> 41 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 91 gtactgagcc gtcttttggc 20 <210> 42 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 92 tgcctgctct tcgtaggact 20 <210> 43 <211> 30 <212> ADN
<2I3> Rattus sp.
<400> 43 gtgcccacgg tctggcgcag cgtctgcagg 30 <210> 44 <211> 30 <212> ADN
<213> Mus <400> 44 tcccctgctt ccgtgcccat ggtctgacgc 30 Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys T
h. J.M. Conlon et al.; Biochem. Bivp&ys. li'es. Commun., 1992; 188, 578-589.
7. G.C. Gonzalea et al., peptides, 1992,13, fi95-7ü3.
8. H. Itob et al., Eur. J. Pharmacvl., 1988,149, 61-fib.
9. A. Gibson et al., Cen. Comp. Endvcrinol., 1986, 64, 435-439.
1 O.I. Muramatsu ct al., Gunma Symp. Endncrinvl., 1.979,16, 39-47.
11.K. Yano et al., Gcn. Comp. Endacrinol., 1994, 96, 412-419, 12.IC. Yang cc al., (3en. Comp. F.ndocrinol., 1996, 97, 103-110 13.5. Ohsako et al., J. Neurosci., 198&, 6, 2730-2?35.
14.H. Tostivint et al., Proc. NQr1 Acaa'. Sci. tISA, 1996, 93,1?~605-12fi10.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en aeuvre, de rcalisajtion et d'application qui . vienriant d'être décrits de façon plus explicite ; elle en ombras~ac au contraire toutes las variantes qui peuvent venir ~ l'esprit du technicien en la mature, sans s'écarter du cadre ni de la portée de Ia présente invention.
FEUILLE MODIFI E
LISTE DE SE~UENCES
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECIERCHE :~.EDICALE
BEAUVILLAIN, Jean-Claude COULOUARN, Yolaine JEGOU, Sylvie LIHRMANN, Isabelle VAUDRY, Hubert <120> UROTENSINES II DE MAMMIFERES E_ LEURS APPLICATIONS
<130> s598PCT25 <140>
<141>
<150> FR9814914 <151> 1998-11-26 <160> 94 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <21I> 124 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 1 Met Tyr Lys Leu Ala Ser Cys Cys Leu Leu Phe Ile Gly Phe Leu Asn Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu Leu Asp Ser Arg Glu Ile Ser Phe Gln Leu Ser Ala Pro His Glu Asp Ala Arg Leu Thr Pro Glu Glu Leu Glu Arg Ala Ser Leu Leu Gln Ile Leu Pro Glu Met Leu Gly Ala Glu Ara_ Gly Asp Ile Leu Arg Lys Ala Asp Ser Ser Thr Asn Ile Phe Asn Pro Arg Gly Asn Leu Arg Lys Phe Gln Asp Phe Ser Gly Gln Asp Pro Asn Ile Leu Leu Ser His Leu Leu Ala Arg Ile Trp Lys Pro Tyr Lys Lys Arg Glu Thr Pro Asp Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Val 115 12~
<210> 2 <211> 104 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2 Leu LeuLeuAsp SerArgGlu IleSerPhe GlnLeuSer AlaPro Pro His AspAlaArg LeuThrPro GluGluLeu GluArgAla SerLeu Glu Leu IleLeuPro GluMetLeu GlyAlaGlu ArgGlyAsp IleLeu Gln Arg AlaAspSer SerThrAsn IlePheAsn ProArgGly AsnLeu Lys Arg PheGlnAsp PheSerGly GlnAspPro AsnIleLeu LeuSer Lys 65 70 75 g0 His LeuAlaArg IleTrpLys ProTyrLys LysArgGlu ThrPro Leu Asp PheTrpLys TyrCysVal ' Cys <210>
<211>
<212>
PRT
<213> apiens Homo s <400> 3 Glu Thr Pro Asp Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Val <210> 9 <211> 551 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 4 ccaagaagga agccgtctat cttgtggcga tcatgtataa gctggcctcc tgctgtttgc 60 ttttcatagg attcttaaat cctctcttat ctcttcctct ccttgactcc agggaaatat 120 cctttcaact ctcagcacct catgaagacg cgcgcttaac tccggaggac gtagaaagag I80 cttcccttct acagatactg ccagagatç~ tgggtgcaga aagaggggat attctcagga 240 aagcagactc aagtaccaac atttttaacc caataggaaa tttgagaaag tttcaggatt 300 tctctggaca agatcctaac attttactga gtcatctttt ggccagaatc tggaaaccat 360 acaagaaacg tgagactcct gattgcttct ggaaatactg tgtctgaagt gaaataagca 420 tctgttagtc agctcagaaa cacccatctt agaatatgaa aaataacaca atgcttgatt 480 tgaaaacagt gtggagaaaa actaggcaaa ctacaccctg ttcattgtta cctggaaaat 540 aaatcctcta t 551 <210> 5 <211> 315 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 5 cttcctctcc ttgactccag ggaaatatcc tttcaactct cagcacctca tgaagacgcg 60 cgcttaactc cggaggagct agaaagagct tcccttctac agatactgcc agagatgctg 120 ggtgcagaaa gaggggatat tctcaggaaa gcagactcaa gtaccaacat ttttaaccca 180 _ 3 PCT/FR99/02941 agaggaaatt tgagaaagtt tcaggatttc tctggacaag atcctaacat tttactgagt 240 catcttttgg ccagaatctg gaaaccatac aagaaacgtg agactcctga ttgcttctgg 300 aaatactgtg tctga 315 <210> 6 <211> 36 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 6 gagactcctg attgcttctg gaaatactgt gtctga <210> 7 <211> 26 <212> ADN
<213> Homo sapiens <900> 7 aacccaagag gaaatttgag aaagtt 26 <210> 8 <211> 25 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 8 ccaggtaaca atgaacaggg tgtag 25 <210> 9 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 9 Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Val <210> 10 <211> I9 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 10 ctgccagaga tgctgggtg I9 <210> 11 <211> 24 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 11 gacacagtat ttccagaagc aatc 24 <210> 12 -<211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 12 cctcctgctg tttgcttttc 20 <210> 13 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 13 cccagcatct ctggcagtat 20 <210> 14 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 14 gaagccgtct atcttgtggc 20 <210> 15 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 15 cgtctatctt gtggcgatca 20 <210> 16 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 16 cgtcttcatg aggtgctgag 20 <210> 17 <211> 20 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 17 ggaagccgtc tatcttgtgg 20 <210> 18 <211> 529 <212> ADN
<213> Battus sp.
<400> 18 cggagcagac acccagccag acttcttccc gtcgtcatgg acagggtgcc cttctgctgc 60 ctgctcttcg taggactcct gaatccact~ ctgtcttttc ccgtcacgga cactggtgaa 120 atgtctcttc agcttccagt gcttgaggaa aatgctcttc gggctctgga ggagctggag 180 aggactgccc tcctgcagac gctgcgccaç accgtgggca cagaagcaga gggaagcctt 240 _ ggccaggcag atcccagtgc cgagactccc actccaaggg gaagcttgag gaaggctctc 300 actgggcaag attctaacac tgtactgagc cgtcttttgg cgagaaccag gaaacaacgt 360 aagcaacacg ggactgcccc agaatgctt= ~ggaagtact gcatttgaag agagacgtct 420 cctcagaacc atcacttcag gaaactaaaç agcagatgct tgaagaaaaa tcgtgccaac 980 aacgccccgt tctccactat gagaaataa~ ccctctatgt ttctcaact 529 <210> 19 <211> 312 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 19 tttcccgtca cggacactgg tgaaatgtc_ cttcagcttc cagtgcttga ggaaaatgct 60 cttcgggctc tggaggagct ggagaggac= gccctcctgc agacgctgcg ccagaccgtg I20 ggcacagaag cagagggaag ccttggcca~ gcagatccca gtgccgagac tcccactcca 180 aggggaagct tgaggaaggc tctcactggç caagattcta acactgtact gagccgtctt 240 ttggcgagaa ccaggaaaca acgtaagcaa cacgggactg ccccagaatg cttctggaag 300 tactgcattt ga 312 <210> 20 <211> 92 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 20 caacacggga ctgccccaga atgcttctgï aagtactgca tt 42 <210> 21 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <400> 21 agcttccagt gcttgaggaa <210> 22 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 22 gttagaattt tgcccagcga 20 <210> 23 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 23 gcttccagtg cttgaggaag 20 <210> 29 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <400> 29 tctgctgcct gctcttcata 20 <210> 25 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 25 acggacactg gtgagaggac 20 <220> 26 <211> 20 <212> ADN
<213> Mus <900> 26 gagcgtcttc ctcaagcact 20 <210> 27 <211> 539 <212> ADN
<213> Mus <400> 27 cgagagcaga cgcccagacg gacttctcgc cgcatcatgg acagggtgcc cttctgctgc 60 ctgctcttca taggacttct gaatccactg ctgtcccttc ccgtcacgga cactggtgag 120 aggactcttc agcttccagt gcttgaggaa gacgctcttc gggctctgga ggagctggag 180 aggatggccc tcctgcagac cctgcgtcag accatgggca cggaagcagg ggagagccct 290 ggagaagcag gtcccagcac tgagactccc actccacggg gaagcatgag gaaggctttc 300 gctgggcaaa attctaacac tgtactgagt cgtctcttgg caagaaccag gaaacaacat 360 aagcaacacg gggctgcccc agagtgcttc tggaaatact gcatttgagg agacacaagc 420 gcccgttggt ctctcagaac cattacattc aggaaacggg cagagcagat gcttgaagca 480 aaatcacgct aacgacgcct tgttcttcat tatgagaaat aaatcctcta tgtttctca 539 <210> 28 <211> 493 <212> ADN
<213> Mus <400> 28 cttcccgtca cggacactgg tgagaggact cttcagcttc cagtgcttga ggaagacgct 60 cttcgggctc tggaggagct ggagaggatg gccctcctgc agaccctgcg tcagaccatg 120 ggcacggaag caggggagag ccctggagaa gcaggtccca gcactgagac tcccactcca 180 cggggaagca tgaggaaggc tttcgctggg caaaattcta acactgtact gagtcgtctc 290 ttggcaagaa ccaggaaaca acataagcaa cacggggctg ccccagagtg cttctggaaa 300 tactgcattt gaggagacac aagcgcccgt tggtctctca gaaccattac attcaggaaa 360 cgggcagagc agatgcttga agcaaaatca cgctaacgac gccttgttct tcattatgag 420 aaataaatcc tctatgtttc tca 443 <210> 29 <211> 309 <212> ADN
<213> Mus <400> 29 cttcccgtca cggacactgg tgagaggact ctLcagcttc cagtgcttga ggaagacgct 60 cttcgggctc tggaggagct ggagaggatg gccctcctgc agaccctgcg tcagaccatg 120 ggcacggaag caggggagag ccctggagaa gcaggtccca gcactgagac tcccactcca 180 cggggaagca tgaggaaggc tttcgctggg caaaattcta acactgtact gagtcgtctc 240 ttggcaagaa ccaggaaaca acataagcaa cacggggctg ccccagagtg cttctggaaa 300 tactgcatt 309 <210> 30 <211> 123 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<900> 30 Met Asp Arg Val Pro Phe Cys Cys Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Asn Pro Leu Leu Ser Phe Pro Val Thr Asp ''_'hr Gly Glu Met Ser Leu Gln Leu Pro Val Leu G1u Glu Asn Ala Leu Arg Ala Leu Glu Glu Leu Glu Arg Thr Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Val Gly Thr Glu Ala Glu Gly Ser Leu Gly Gln Ala Asp Pro Ser Ala Glu Thr Pro Thr Pro Arg Gly Ser Leu Arg Lys Ala Leu Thr Gly Gln Asp Ser Asn Thr Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln Arg Lys Gln His Gly Thr Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 31 <211> 103 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 31 Phe Pro Val Thr Asp Thr Gly Glu Met Ser Leu Gln Leu Pro Val Leu Glu Glu Asn Ala Leu Arg Ala Leu Glu Glu Leu Glu Arg Thr Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Val Gly Thr Glu Ala Glu Gly Ser Leu Gly Gln Ala Asp Pro Ser Ala Glu Thr Pro Thr Pro Arg Gly Ser Leu Arg Lys Ala Leu Thr Gly Gln Asp Se. .'-.s~ Thr Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln Arg Lys C_n His Gly Thr Ala Pro Glu 85 :0 95 Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 32 <211> 14 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 32 Gln His Gly Thr Ala Pro Glu Cys Pàe '"=p Lys Tyr'Cys Ile <210> 33 <211> 123 <212> PRT
<213> Mus <400> 33 Met Asp Arg Val Pro Phe Cys Cys Leu Leu Phe Ile Gly Leu Leu Asn Pro Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Asp Thr Gly Glu Arg Thr Leu Gln Leu Pro Val Leu Glu Glu Asp Ala Leu ?_~g Ala Leu Glu Glu Leu Glu Arg Met Ala Leu Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Met Gly Thr Glu Ala Gly Glu Ser Pro Gly Glu Ala Gly Pro Ser Thr Glu Thr Pro Thr Pro 65 70 75 8p Arg Gly Ser Met Arg Lys Ala Phe Ala Gly Gln Asn Ser Asn Thr Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln His Lys Gln His Gly Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 34 <211> 103 <212> PRT
<213> Mus <400> 39 Leu Pro Val Thr Asp Thr Gly Glu Arg 'T'r,r Leu Gln Leu Pro Val Leu 1 5 ~0 15 Glu Glu Asp Ala Leu Arg Ala Leu Giu Glu Leu Glu Arg Met Ala Les ' Leu Gln Thr Leu Arg Gln Thr Met Gly Thr Glu Aîa Gly Glu Ser Pro Gly Glu Ala Gly Pro Ser Thr Glu Thr Pro Thr Pro Arg Gly Ser Met Arg Lys Ala Phe Ala Gly Gln Asn Ser Asn T'.~.r Val Leu Ser Arg Leu Leu Ala Arg Thr Arg Lys Gln His Lys Gln His Giy Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 35 <211> 17 <212> PRT
<213> Mus <400> 35 Gln His Lys Gln His Gly Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys Tyr Cys Ile <210> 36 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 36 gctctcactg ggcaagattc 20 <210> 37 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 37 tctcatagtg gagaacgggg 20 <210> 38 <211> 20 <2.12> ADN
<213> Rattus exulans <400> 38 1~
ggaagcttga ggaaggctct 20 <210> 39 ' <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 39 agcttccagt gcttgaggaa 20 <210> 40 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 90 gaatcttgcc cagtgagagc ~ 20 <210> 41 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 91 gtactgagcc gtcttttggc 20 <210> 42 <211> 20 <212> ADN
<213> Rattus sp.
<400> 92 tgcctgctct tcgtaggact 20 <210> 43 <211> 30 <212> ADN
<2I3> Rattus sp.
<400> 43 gtgcccacgg tctggcgcag cgtctgcagg 30 <210> 44 <211> 30 <212> ADN
<213> Mus <400> 44 tcccctgctt ccgtgcccat ggtctgacgc 30 Ala Ala Pro Glu Cys Phe Trp Lys T
Claims (14)
1°) Polypeptides, isolés de mammifères, caractérisés en ce qu'ils comprennent à leur extrémité C-terminale un heptapeptide présentant la séquence suivante : Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Xaa dans laquelle Xaa représente Val ou Ile, en ce qu'ils appartiennent à la famille des urotensines II et en ce qu'ils présentent au moins 45 %, et de préférence au moins 70 % de similarité avec le polypeptide de séquence SEQ ID NO:1, correspondant à la prépro-urotensine II humaine.
2°) Polypeptides de mammifères selon la revendication 1, caractéri-sés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitués par les séquences humaines SEQ ID NO: 1-3, par les séquence de rat SEQ ID:30-32 et par les séquences de souris SEQ ID NO:33-35.
3°) Fragments d'acides nucléique purifiés, caractérisé en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par:
a) les fragments comprenant au moins une séquence codant pour un polypeptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, b) les fragments constitués par une séquence codant pour un poly-peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, c) les oligonucléotides issus des séquences telles que définies en b), constituant des sondes ou des amorces, et d) les séquences complémentaires des séquences précédentes, sens ou antisens, à l'exception de l'EST ayant pour numéro d'accession Gen Bank, le n°AA535545.
a) les fragments comprenant au moins une séquence codant pour un polypeptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, b) les fragments constitués par une séquence codant pour un poly-peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, c) les oligonucléotides issus des séquences telles que définies en b), constituant des sondes ou des amorces, et d) les séquences complémentaires des séquences précédentes, sens ou antisens, à l'exception de l'EST ayant pour numéro d'accession Gen Bank, le n°AA535545.
4°) Fragments d'acides nucléiques selon la revendication 3, caractéri-sés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID
NO:4-6, les séquences SEQ ID NO:18-20 et les séquences SEQ ID NO:27-24.
NO:4-6, les séquences SEQ ID NO:18-20 et les séquences SEQ ID NO:27-24.
5°) Vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils contiennent un fragment d'acide nucléique selon la revendication 3 ou la revendication 4.
6°) Cellules transformées par au moins un fragment d'acide nucléique selon la revendication 3 ou la revendication 4.
7°) Réactif de détection d'un fragment d'acide nucléique selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend entre 20 et 50 nucléotides de la séquence SEQ ID NO:4, de la séquence SEQ ID NO:18 ou de la séquence SEQ ID NO:27.
8°) Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il est sélec-tionné dans le groupe constitué par:
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
humaine, codant pour un dipeptide (Pro-Tyr), en amont du site de clivage tribasique, lui-même situé juste en amont de la séquence codant pour l'urotensine II
humaine et spécifique de ladite séquence humaine;
- des fragments, aptes à servir d'amorces : SEQ ID NO:7 et NO:8, SEQ ID NO:10-17 ; SEQ ID NO:21-26 ; SEQ ID NO:36-42, et - des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID NO:4 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de ladite séquence SEQ ID
NO:4;
séquence SEQ ID NO:18 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de ladite séquence SEQ ID NO:18 et séquence SEQ ID NO:27 et les fragments constitués de à 54 nucléotides de ladite séquence SEQ ID NO:27.
- un fragment de la séquence codant pour la prépro-urotensine II
humaine, codant pour un dipeptide (Pro-Tyr), en amont du site de clivage tribasique, lui-même situé juste en amont de la séquence codant pour l'urotensine II
humaine et spécifique de ladite séquence humaine;
- des fragments, aptes à servir d'amorces : SEQ ID NO:7 et NO:8, SEQ ID NO:10-17 ; SEQ ID NO:21-26 ; SEQ ID NO:36-42, et - des fragments, aptes à servir de sondes : séquence SEQ ID NO:4 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de ladite séquence SEQ ID
NO:4;
séquence SEQ ID NO:18 et les fragments constitués de 20 à 50 nucléotides de ladite séquence SEQ ID NO:18 et séquence SEQ ID NO:27 et les fragments constitués de à 54 nucléotides de ladite séquence SEQ ID NO:27.
9°) Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 ou une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 et 4 codant pour tout ou partit desdits polypeptides, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
10°) Utilisation do polypeptides appartenant à la famille de l'urotensine 11 ou de séquences nucléiques codant pour lesdits polypeptides, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les maladies neurodégénératives de la moelle épinière ou les traumatismes de la moelle épinière.
11°) Procédé de détection de la présence ou de l'absence d'un ARNm codant pour une urotensine II de mammifère, notamment chez des sujets présentant une pathologie neurodégénérative ou un traumatisme de la moelle épinière par mise en contact d'un échantillon biologique avec au moins un réactif selon la revendication 7 ou la revendication 8.
12°) Procédé de détection d'une mutation dans la séquence du gène ou de l'ARNm codant pour l'urotensine, caractérisé en ce qu'il comprend l'extraction dudit ADN ou dudit ARNm à partir d'un échantillon biologique et sa comparaison avec les séquences d'acides nucléiques selon la revendication 3 ou la revendication 4.
13°) Kit de diagnostic destiné à la détection d'un ARNm codant pour une urotensine II de mammifère dans un échantillon biologique, ledit ARNm étant éventuellement muté, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4.
14°) Utilisation des polypeptides selon la revendication 1 ou la revendication 2, pour la sélection d'anti-hypertenseurs.
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