JPH04311386A - アミド化酵素遺伝子 - Google Patents
アミド化酵素遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ブタ心房由来のペプチ
ドのＣ−末端をアミド化する酵素をコードする遺伝子，
当該遺伝子を含有するベクター，このベクターより形質
転換された宿主細胞及び当該宿主細胞を用いる前記酵素
の製造方法並びに当該酵素を用いるＣ−末端α−アミド
化酵素ペプチド又はタンパクの製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ペプチドの中には、そのカルボキシル基
末端（Ｃ−末端）のグリシン残基がアミド化されている
ことにより、その生理活性を示すものが多く存在してい
る。これらペプチドやタンパクのＣ−末端をアミド化す
る酵素は、真核細胞特有の修飾（モディフィケイション
）酵素の１つとして知られ、主にペプチドやタンパクが
、メッセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）から翻訳された
後の修飾に関与している。ペプチドのＣ−末端がアミド
化される場合は、そのペプチドのＣ−末端にグリシン残
基の付加した前駆体が真核細胞中に存在するアミド化酵
素によって修飾を受け、Ｃ −末端グリシン残基の１つ
前のアミノ酸がアミド化されると考えられている。 【０００３】本アミド化酵素の存在を最初に発表したの
はＢｒａｄｂｕｒｙらである（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．
Ｆ． 等；Ｎａｔｕｒｅ，２８９，６８６−６８８，１
９８２ ）。その後、アミド化酵素がいくつかの動物臓
器より単離され、その遺伝子クローニングが成されてい
るものもある。Ｍｉｚｕｎｏらは、アフリカツメガエル
の体皮より精製したアミド化酵素ＡＥ−Ｉの前駆体ｃＤ
ＮＡのクローニングを行ない（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ等；Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．
，１４８，５４６−５５２，１９８７ ）、Ｅｉｐｐｅ
ｒらは、ウシ脳下垂体のアミド化酵素遺伝子のクローニ
ングを行ない（Ｅｉｐｐｅｒ，Ｂ．Ａ． 等；Ｍｏｌ．
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１，７７７−７９０，１９８７
）、同じくＥｉｐｐｅｒらは、ラット心房のアミド化
酵素の遺伝子クローニングを行ない（Ｅｉｐｐｅｒ，Ｂ
．Ａ． 等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８６，７３５−７３９，１９８９）、Ｇｌａｕ
ｄｅｒ らは、ヒト甲状線腫瘍細胞よりアミド化酵素遺
伝子をクローニングしている（Ｇｌａｕｄｅｒ，Ｊ．等
；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．，１６９，５５１−５５８，１９９０）。ブタ心
房由来のアミド化酵素としては、Ｋｏｊｉｍａらが、膜
画分由来の分子量９２ｋｄのタンパクを精製している（
Ｋｏｊｉｍａ，Ｍ． 等；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０
５，４４０−４４３，１９８９ ）。また、本発明者ら
も、同じブタ心房の水溶性画分より分子量３６ｋｄ（ゲ
ルろ過より測定）のアミド化酵素を精製している（特願
平１−１４０７６０）。 【０００４】しかし、ブタ心房由来の可溶型３６ｋｄ及
び膜結合型９２ｋｄのアミド化酵素に相当する遺伝子の
クローニングはまだ成功されていない。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】上記のアミド化酵素の
中で可溶性の酵素は比較的少なく、またブタ心房由来の
アミド化酵素に相当する遺伝子のクローニング、本酵素
の動物細胞中での発現、その応用法についての報告はま
だ成されていない。本発明は、ブタ心房由来のアミド化
酵素前駆体の遺伝子クローニングを行ない、活性を有す
る遺伝子領域を特定化するために、完全長ｃＤＮＡ及び
特異的プロテア−ゼによる限定的切断によって生じると
考えられる二つの可溶性型アミド化酵素に相当する、部
分ｃＤＮＡを組み込んだ３種類の発現ベクタ−を構築し
、それらを動物細胞中において発現させ、更に本アミド
化酵素を用いて、Ｃ−末端アミド化ペプチドの製造方法
を提供することを目的とするものである。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ブタ心房
由来のアミド化酵素をコードする遺伝子を取得し、３種
類の大きさの酵素に相当する遺伝子を発現ベクターに組
み込み、それらを動物細胞中で発現させ、その培養上清
がペプチドのＣ−末端をアミド化することを見出し、本
発明を完成した。すなわち本発明は、ブタ心房アミド化
酵素をコードする遺伝子、配列番号５に記載の塩基配列
で特定される請求項１記載の遺伝子、配列番号５に記載
のアミノ酸番号１から９５４までの９５４ アミノ酸残
基で特定される請求項１記載のアミド化酵素、ブタ心房
アミド化酵素をコードする塩基配列を組み込んだ発現ベ
クター、当該発現ベクターを導入した細胞及び当該細胞
を培養し、培養物からアミド化酵素を採取することを特
徴とするアミド化酵素の製造法に関する。 【０００７】ペプチドのＣ−末端をアミド化する酵素の
遺伝子を取得するに当たり、既にそのアミノ酸配列が公
知となっている、アフリカツメガエル皮膚及びブタ脳下
垂体のアミド化酵素の両者に共通して保存されているア
ミノ酸配列部位を捜し出し、その部分に相当する２０塩
基のＤＮＡ をプライマーにして、ブタ心房のｃＤＮＡ
を鋳型として、ＰＣＲ （Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ）反応（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．
Ｋ．等；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１
９８８）を行なって目的の遺伝子の一部分である、５３
９ 塩基対のＤＮＡ フラグメントを取得し、次にこれ
をプローブとして、ブタ心房のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングして、目的の遺伝子の全鎖長約３．７Ｋ
塩基対を含むクローンＰ ・ＰＡＭ−８ を取得した。 【０００８】次に、全遺伝子の塩基配列を決定するため
に、３６種のデリーションクローンを作製し、それぞれ
をダイデオキシシーケンシング法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．
等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７４，５４６３−５４６７，１９７７）によって全塩
基配列を決定した。次いで、Ｎ末端から３７８ 、４３
２ 及び９５４ アミノ酸残基のタンパクに相当する遺
伝子をＰＣＲ 法により収得し、動物細胞発現系で発現
させるために、各遺伝子をベクターｐｃＤＬ−ＳＲ α
２９６ （Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ． 等；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．，８，４６６−４７２，１９８８ ）に挿
入し、宿主細胞ＣＯＳ１株（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．；Ｃ
ｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）にトランス
フェクションして目的の遺伝子を発現させた。 【０００９】このアミド化酵素の活性測定方法としては
、Ｂｒａｄｂｕｒｙによる［１２５Ｉ］−Ｄ−Ｔｙｒ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙをアミド化酵素の基質とし、［１２５Ｉ
］−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ・ＮＨ２ が生成されることを
ＨＰＬＣを用いて追跡する方法（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ
．Ｆ． 等；Ｎａｔｕｒｅ，２９８，６８６−６８８，
１９８２ ）及びＭｉｚｕｎｏらによる［１２５Ｉ］−
Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを基質とし、生成さ
れる［１２５Ｉ］−Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ ・ＮＨ
２ を酢酸エチルで抽出して追跡する方法（Ｍｉｚｕｎ
ｏ，Ｋ． 等；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３７，９８４−９９１，１９８
６）が知られているが、本発明者らが新たに見出したラ
ジオアイソトープ化合物を使用しないでアミド化酵素活
性を測定する新しい方法を採用すると、極めて容易な操
作にて２０種類全てのアミド化されるアミノ酸に対して
、正確にアミド化活性を測定することができる。この方
法は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）検出器
としてＥＣＤ （エレクトロケミカルディテクター）を
付設したＥＣＤ−ＨＰＬＣアッセイ系を用いる方法であ
る。例えば、本酵素活性のスクリーニング用基質として
、Ｄ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （Ｘ は２０種類のアミノ
酸）を合成し、この基質を使用してアミド化酵素がＤ−
Ｔｙｒ−Ｘ ・ＮＨ２ に変換させる状態をアミド化反
応終了後にこの基質と生成物が分離する溶媒系を設定し
てあるＨＰＬＣにかけ、検出器としてＥＣＤ を使用し
た系で検出する。ＥＣＤ 上を通過した基質は、電気化
学的酸化を受けて、チロシンがキノン型に変換される。 その時に流れる電流を検知して、基質及び生成物に相当
するピークとして表現する。通常１ミリボルトの電圧を
かけると、約５〜１０マイクロアンペアの電流が流れる
。この時の基質と生成物とのピーク面積比によりアミド
化反応の進行を追跡した。本アッセイ系を使用すること
により、３ 種類の酵素遺伝子を発現させたＣＯＳ１培
養上清中のアミド化酵素活性を測定した結果、トリペプ
チド基質がジペプチドアミド体に変換されていることを
ＥＣＤ−ＨＰＬＣ上で検知し、本発明を完成するに至っ
た。 【００１０】 【実施例】次に、実施例により本発明を詳しく説明する
。 実施例１ ブタ心房よりポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの調製（１）全ＲＮ
Ａの調製 新鮮なブタ心房６ｇにつき４０ｍｌのグアニジンチオシ
アネート溶液（５．５Ｍグアニジンチオシアネート，０
．１Ｍ酢酸ナトリウム，５ｍＭ ＥＤＴＡ ＰＨ５．０
）を加え、氷冷しながらポリトロンを用いて細胞を破壊
した。次に、３Ｋｒｐｍ で１０分間遠心を行なった後
、その上清を１８Ｇ の注射針で粘性がなくなるまで出
し入れし、６ｍｌ のＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ ＣｓＣ
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０ ）の入った遠心
管に等量の上清を重層し、３５Ｋｒｐｍ、１８時間、２
０℃で遠心を行なった。遠心後、上清を除去し、ＲＮＡ
沈澱物をＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ７．５，１０ｍＭ ＥＤＴＡ ）に溶解し、１／１０
量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０ ）、２．５ 倍
量のエタノール（−２０℃）を加え、−８０℃で３０分
間エタノール沈澱を行なった。真空乾燥後、適量の滅菌
蒸留水を加え、エタノール沈澱物を溶解した。 この方法によりブタ心房６ｇから６８０ μｇ の全Ｒ
ＮＡ を調製した。 【００１１】（２）ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの調製オリゴ
（ｄＴ）セルロース０．５ｇをカラムにつめ、１０ｍｌ
の１×結合緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７
．６，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１
ＳＤＳ）で平衡化した。全ＲＮＡ を濃度３ｍｇ／ｍ
ｌに調整したもの１６７ μｌ を６５℃、５ 分間処
理し、直ちに水中に入れ、室温に戻した。これに１６７
μｌ の２×結合緩衝液を加えた。これをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムにかけ、８ｍｌ の１×結合緩衝
液で洗い、４ｍｌ の溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ７．５， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０
５ ＳＤＳ ）でポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ を溶出した。 溶出画分に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５
倍量のエタノール（−２０℃）を加えてエタノール沈
澱を行ないポリ（Ａ）＋ を調製した。５００ μｇ
の全ＲＮＡ より５０μｇ のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ
が得られた。 【００１２】実施例２ ｃ ＤＮＡライブラリーの作製 （１）ｃ ＤＮＡの作製 ｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャム社）を用い
、製品に添付されているプロトコールに従って実施した
。即ち、逆転写酵素によりｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ
を合成した後、リボヌクレアーゼＨで、ＲＮＡ 鎖にニ
ックとギャップを入れ、これを大腸菌ＤＮＡ ポリメラ
ーゼＩを用いて修復合成することにより、ＲＮＡ 鎖を
ＤＮＡ 鎖に置換した。最後に、Ｔ４ＤＮＡ ポリメラ
ーゼを用いてＤＮＡ 鎖の両末端を平衡化した。ブタ心
房のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ ２μｇ より７００ｎｇの
二本鎖ｃＤＮＡを合成した。システムの最終反応物５０
０ μｌに等量のフェノール／クロロホルム（１：１，
ｖ／ｖ ）を加えて撹拌後、１０Ｋｒｐｍにて１分間遠
心を行なった。次いで、上清の水層を取り、再度フェノ
ール／クロロホルム抽出を行なった後、等量のクロロホ
ルムを水層に加え、撹拌後、１０Ｋｒｐｍにて１分間遠
心を行なった。取り込まれなかったデオキシヌクレオチ
ド三リン酸を除去するために、水層（上清）に等量の４
Ｍ酢酸アンモニウム溶液と２倍量のエタノール（−２０
℃）を加え、ドライアイス上で１５分間放置した。静か
に混ぜながら室温に戻し、１０Ｋｒｐｍで１０分間遠心
し上清を除いた。沈澱に５０μｌ の２Ｍ酢酸アンモニ
ウム、次いで１００ μｌ エタノール（−２０ ℃）
を加え、室温で靜かに混和後、１０Ｋｒｐｍで１０分間
遠心して上清を除去した。沈澱を２００ μｌエタノー
ル（−２０℃）でリンスし、遠心したのち上清を除去し
、真空乾燥後、適量のＴＥ溶液に溶解した。 【００１３】（２）ｃ ＤＮＡライブラリーの作製ｃＤ
ＮＡライブラリーの作製は、ｃＤＮＡクローニングシス
テムλｇｔ１０・アダプター法（アマシャム社）を用い
、添付されているプロトコールに従って行なった。まず
、二本鎖ｃＤＮＡの両端にＥｃｏ ＲＩアダプターを付
加した後、未反応のアダプター分子と５００ 塩基対以
下のｃＤＮＡを除くため、カラム分画を行なった。Ｅｃ
ｏ ＲＩアダプターが結合したｃＤＮＡの５ ’末端を
リン酸化し、λｇｔ１０のＥｃｏ ＲＩア−ムに連結し
た後、インビトロパッケージングを行ない、宿主大腸菌
（ＮＭ５１４ 株）を感染させることによりｃＤＮＡラ
イブラリーとした。この方法により０．５ μｇ のｃ
ＤＮＡから２．５ ×１０７ 個のファージプラークを
得た。 【００１４】実施例３ＰＣＲ法を用いたＤＮＡプローブ
の作製ｃＤＮＡライブラリーよりアミド化酵素ｃＤＮＡ
を単離するために、既知のアミド化酵素遺伝子のホモロ
ジーに基づき、ＰＣＲ 法を利用することによって、Ｄ
ＮＡ プローブを作製した。 【００１５】既に報告されているアフリカツメガエル皮
膚アミド化酵素ＡＥ−Ｉ とウシ脳下垂体アミド化酵素
Ｂ・ＰＡＭ −１ のＮ末端側のアミノ酸配列の比較（
第１図）から、非常に高度に保存されている領域を見出
し（第１図）、その領域のＤＮＡ 配列をＰＣＲ 法の
プライマーとして利用するために、混合オリゴヌクレオ
チドを合成した。 即ち、７個のアミノ酸が連続して完全に一致している領
域２箇所を選び、センスプライマーとして２０塩基対、
８通りのコドン縮重があるミックスプライマー（Ｐｒｉ
ｍｅｒ−Ａ）と、アンチセンスプライマーとして２０塩
基対、２通りのコドン縮重があるミックスプライマー（
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂ）を合成した（第２図）。この合成し
たＰＣＲ 用ミックスプライマーを用い、ブタ心房ｃＤ
ＮＡを鋳型として、ＰＣＲ 法によりプローブとなる、
ブタ心房アミド化酵素をコードする遺伝子の部分ＤＮＡ
（５３９ 塩基対）の増幅を以下の条件で行なった。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３
１０
ｍＭ ＫＣｌ
５０ ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２
１．５ ｍＭ
ゼラチン
０．０１ ％
ｄＮＴＰｓ
０
．２ ｍＭ Ｔａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌ．
２．５ Ｕ
Ｐｒｉｍｅｒ−Ａ
２．５ μｇ
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂ
２．５
μｇ ブタ心房ｃＤＮＡ
１
０ ｎｇ ９４℃，２ｍｉｎ →
５５℃，２ｍｉｎ →７２℃，２ｍｉｎ を１サイクル
として３５回繰り返した。 【００１６】ＰＣＲ 反応の最終生成物はフェノール／
クロロホルム（１：１ ，ｖ／ｖ ）で抽出後、セファ
デックスＧ−５０カラムで精製し、その一部は、２％ア
ガロース電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫
外線（３００ｎｍ ）照射して増幅したＤＮＡ バンド
を確認した（第３図）。その結果、理論的に予想される
５３９ 塩基対に相当する特異的ＤＮＡ バンドが認め
られた。従って、既知のアミド化酵素遺伝子のホモロジ
ーに基づき、ＰＣＲ 法を利用することによって、クロ
ーニングのためのプローブとなるブタ心房アミド化酵素
をコードする遺伝子の部分ＤＮＡ （５３９ 塩基対）
を増幅し、得ることができた。 【００１７】実施例４ ブタ心房アミド化酵素 ｃＤＮＡの単離（１）ＤＮＡプ
ローブの標識 ＰＣＲ 法によって増幅した５３９ 塩基対のＤＮＡ
プローブ（ＰＣＲ−５３９ ）は、マルチプライムＤＮ
Ａ 標識システム（アマシャム社）を用いてアイソトー
プ標識した。即ち、ＰＣＲ −５３９ を熱変性し、こ
れにプライマーと未標識のｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ，最後に［α−３２Ｐ ］ｄＣＴＰを加え、Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素による伸長反応で核酸全体を標識した。標識し
たプローブ、［３２Ｐ ］ＰＣＲ −５３９ は、セフ
ァデックスＧ −５０カラム分画によって未反応の［α
−３２Ｐ ］ｄＣＴＰを除去し、精製した。その結果、
７ ×１０８ｃｐｍ／μｇ の比活性を持ったプローブ
［３２Ｐ ］ＰＣＲ −５３９ が調製できた。 【００１８】（２）プラークハイブリダイゼーション作
製したｃＤＮＡライブラリーを普通栄養寒天培地に宿主
菌（ＮＭ５１４）と共に拡げ（３．５ ×１０４／プレ
ート）、３７℃、６．５ 時間後、形成したプラークの
上にナイロンフィルター（アマシャム社）を置き、２分
間放置した。このナイロンフィルターをアルカリ変性溶
液（０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌ ）上に
５ 分間置き、次に中和溶液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７，１．５Ｍ ＮａＣｌ ）上に５分間置い
た。その後、２×ＳＳＣ （２０×ＳＳＣ ：ＮａＣｌ
１７５．３ｇ 、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇ
、全量１リットル）で洗浄、風乾後、紫外線（３００ｎ
ｍ ）で５分間照射して、ＤＮＡ をフィルター上に固
定した。こうしたナイロンフィルター１０枚をビニール
袋にパックしてＲａｐｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎｂｕｆｆｅｒ（アマシャム社）５０ｍｌを加え、６５
℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行なった。 次に、一枚のナイロンフィルター当り、標識したＤＮＡ
プローブ［３２Ｐ ］ＰＣＲ −５３９ を７×１０
６ｃｐｍ入れて、６５℃、２時間以上ハイブリダイゼー
ションを行なった。 【００１９】次に、６×ＳＳＣ 、０．１ ％ＳＤＳ
で６５℃、３０分間洗浄し、２×ＳＳＣ 、０．１ ％
ＳＤＳ で６５℃、３０分間洗浄後、更に０．２ ×Ｓ
ＳＣ 、０．１ ％ＳＤＳ で６５℃、３０分間洗浄を
行い、最後に２×ＳＳＣ、２０℃でフィルターをリンス
した。風乾後、オートラジオグラフィーを−８０℃で１
昼夜行なった。この様にして約３５万個のブタ心房ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングして、プローブとハ
イブリダイズする１０個の陽性シグナルが得られた。 【００２０】この一次スクリーニングで得た陽性シグナ
ルに対応するプラーク領域を回収し、同様の方法で二次
、三次スクリーニングを順次行ない最終的に１０個の陽
性ファージクローンを得た。 （３） ｃＤＮＡクローンの制限酵素地図の作製取得し
た１０個のクローンについて、それぞれのインサートｃ
ＤＮＡの制限酵素地図を作製した。ファージＤＮＡ を
調製し、これをＥｃｏ ＲＩで切断することにより、イ
ンサートＤＮＡ を切り出し、Ｍ１３ｍｐ１８ のＥｃ
ｏ ＲＩ部位にサブクローニングした。これらプラスミ
ドを導入した大腸菌（ＪＭ１０９ 株）を培養し、プラ
スミドＤＮＡ を調製した。 【００２１】プラスミドＤＮＡ は、種々の制限酵素で
切断し、切断したＤＮＡ 断片をアガロース電気泳動で
分析した。種々の制限酵素により切断したＤＮＡ 断片
の鎖長を比較することにより、第４図に示す制限酵素地
図を得た。 その結果、アミド化酵素ｃＤＮＡを含む組換え体ファ−
ジクロ−ン（Ｐ ・ＰＡＭ−１ 〜１０）のうち、Ｐ
・ＰＡＭ−８ が最も長いｃＤＮＡインサ−トを含んで
いた。 【００２２】実施例５ ブタ心房アミド化酵素のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸配
列の決定得られた Ｐ・ＰＡＭ−８ のｃＤＮＡインサ
ートの全塩基配列を、Ｍ１３ｍｐ１８ ファージベクタ
ーに正逆両方向にサブクローニングした。キロシークエ
ンス用デリーションキット（宝酒造）を用いて、プロト
コールのデリーション法に従い、インサートｃＤＮＡが
ベクターの塩基配列決定用プライマーアニーリング部位
側から順次欠失した一連のデリーションクローンを作製
した。これらデリーションクローンのＤＮＡ 塩基配列
は、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼと蛍光ラベルプライ
マーを用いたダイデオキシ法により決定した（配列番号
５）。 【００２３】クロ−ン Ｐ・ＰＡＭ−８ は、ポリ（Ａ
）＋ テイルを含む３７３１塩基対をインサートｃＤＮ
Ａとして含み、翻訳開始コドンＡＴＧ から翻訳終止コ
ドンＴＧＡ までの２８６２塩基対、即ち９５４ アミ
ノ酸残基をコードする連続したオープンリーディングフ
レームが存在した。この最長の読み枠に相当する塩基配
列をアミノ酸に変換した結果も配列番号５示す。 【００２４】以上の結果を、ＤＮＡ 塩基配列及びそれ
から予想されるアミノ酸配列が既知であるカエル皮膚，
ウシ脳下垂体，ラット心房及びヒト甲状腺のアミド化酵
素の配列と比較した結果、非常によく類以していること
が見出された。 【００２５】これらの結果から判断して、配列番号５に
示すＤＮＡ 塩基配列及びアミノ酸配列はアミド化酵素
のものであることが明らかになった。 【００２６】実施例６ ＣＯＳ細胞におけるブタ心房アミド化酵素遺伝子の発現
（１）ｃＤＮＡ発現ベクターの構築 以前、我々がブタ心房から精製した約３６Ｋｄの可溶性
のアミド化酵素は、配列番号５の塩基番号１９６ 〜１
９８ のＡＴＧ から塩基番号３０５８〜３０６０のＴ
ＧＡ で終わる２８６２塩基対、即ち９５４ アミノ酸
残基の前駆体が配列番号５の塩基番号１３２４〜１３３
０のＬｙｓ−Ａｒｇ あるいは塩基番号１４８４〜１４
９０のＬｙｓ−Ｌｙｓ の塩基性アミノ酸対部分で特異
的プロテアーゼの作用によって、限定的切断を受けて産
生したと考えられる。これらのことから、精製した約３
６Ｋｄのアミド化酵素に相当するＣ末端側を欠失したＮ
末端側の部分ｃＤＮＡを動物細胞発現用ベクタ−に挿入
した組換え体を作製した。 【００２７】配列番号５に示すｃＤＮＡの塩基番号１９
６ 〜１３２９までの１１３４塩基対（３７８ アミノ
酸残基）に相当する部分（ｃＤＮＡ１１３４）、塩基番
号１９６ 〜１４９１までの１２９６塩基対（４３２
アミノ酸残基）に相当する部分（ｃＤＮＡ１２９６）及
び完全長のｃＤＮＡに対応する塩基番号１９６ 〜３０
５７までの２８６２塩基対（９５４ アミノ酸残基）に
相当する部分（ｃＤＮＡ２８６２）をＰＣＲ 法によっ
て得るために、第５図に示すＰＣＲ 用プライマー４本
、センスプライマー（ＰＣＲ−１９６ ）とアンチセン
スプライマー（ＰＣＲ−１３２９，ＰＣＲ−１４９１，
ＰＣＲ−３０５７）を合成した。 【００２８】ＰＣＲ 法による反応は、ブタ心房ｃＤＮ
Ａを鋳型として実施例３に示した条件に従って（ＰＣＲ
−１９６ ）：（ＰＣＲ−１３２９）、（ＰＣＲ−１９
６ ）：（ＰＣＲ−１４９１）、（ＰＣＲ−１９６ ）
：（ＰＣＲ−３０５７）の組合せで行なった。増幅した
ｃＤＮＡ１１３４、ｃＤＮＡ１２９６、ｃＤＮＡ２８６
２１ はフェノール／クロロホルム（１：１，ｖ／ｖ
）抽出後、セファデックスＧ−５０カラムで精製し、サ
ル腎由来のＣＯＳ１細胞株にトランスフェクトされたと
き、そのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ 部位に挿入されたｃＤＮ
Ａが高率に発現するように設計されている動物細胞発現
ベクターｐｃＤＬ−ＳＲ α２９６ のＰｓｔＩ−Ｋｐ
ｎＩ 部位に連結し、アミド化酵素が正しく発現する順
方向の組換え体ｐｃＤＬ−ＳＲ α１１３４、ｐｃＤＬ
−ＳＲα１２９６及びｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２を構
築した（第６図） 。 【００２９】（２）ＣＯＳ１細胞株の形質転換アミド化
酵素ｃＤＮＡ断片を持った組換え体、ｐｃＤＬ−ＳＲ
α１１３４、ｐｃＤＬ−ＳＲ α１２９６、ｐｃＤＬ−
ＳＲ α２８６２で形質転換した大腸菌（ＤＨ５株）か
らプラスミドＤＮＡ を抽出・精製し、ＣＯＳ１細胞に
トランスフェクトした。トランスフェクションは、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン・クロロキン法（Ｌｏｐａｔｏ，Ｍ
．Ａ． 等；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１
２，５７０７−５７１７，１９８４ ）を用いて行なっ
た。即ち、前日１０ｃｍプレート当り１０６ 個の細胞
を播き、１０％血清ＤＭＥＭ培地を加え、翌日まで培養
する。トランスフェクションを始める前に、４ｍｌ の
無血清ＤＭＥＭ、８０μｌＤＥＡＥ−デキストラン（２
０ｍｇ／ｍｌ ）及び１０μｇ のプラスミドＤＮＡ
を加えよく混合しておき、培養上清を吸引除去し無血清
ＤＭＥＭで洗浄したプレートに加える。３７℃で約４時
間培養後、ＰＢＳ 緩衝液で２回洗浄し、１００ μＭ
のクロロキンを含む４％血清ＤＭＥＭ培地（１０ｍｌ／
プレート）を加え、３７℃、３時間培養後、クロロキ
ンを含む培養液を吸引除去し、ＰＢＳ 緩衝液で洗浄す
る。４％血清ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを加え、３７℃で３
〜４日培養後、上清を回収した。 【００３０】（３）アミド化酵素活性の発現実施例６ 上記（２）で作製した三種の組換え体をトランスフェク
トした、それぞれのＣＯＳ１細胞培養上清中に含まれる
アミド化酵素活性を測定した。活性測定の方法は、本発
明者らが新たに開発したＥＣＤ−ＨＰＬＣアッセイ系を
用いた。即ち、合成した基質トリペプチドＤ−Ｔｙｒ−
Ｘ−Ｇｌｙ （Ｘ は２０種類のアミノ酸）の中で２０
μＭ のＤ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ を０．５ｍＭ
アスコルビン酸，１００ μｇ／ｍｌカタラーゼ，５０
μＭ ＣｕＳＯ４ 及びプロテアーゼ阻害剤 ＤＦＰ（
ジイソプロピルフルオロホスフェイト），ペプスタチン
，ＮＥＭ （Ｎ−エチルマレイミド）の存在下、１０倍
に濃縮した遺伝子導入ＣＯＳ１細胞培養上清１００ μ
ｌ と共に３７℃で４時間反応させた後、生成したジペ
プチドアミド体Ｄ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ ・ＮＨ２ と基質
とが分離できるＥＣＤ を付設したＨＰＬＣで反応液を
分析し、溶出した基質とそのジペプチドアミドのＤ−チ
ロシンをＥＣＤ 上で電気的に酸化した際に流れる電流
を検地することによって生成比率を表わした。 【００３１】第７図に各培養上清のアミド化酵素活性の
測定結果を示した。ｐｃＤＬ−ＳＲ α１１３４、ｐｃ
ＤＬ−ＳＲ α１２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２
のいずれの組換え体プラスミドＤＮＡ をＣＯＳ１細胞
に導入した場合も、ｃＤＮＡを挿入していないベクター
ｐｃＤＬ−ＳＲ２９６だけを導入したコントロールには
ほとんど見られなかったアミド化酵素活性が見出された
。 【００３２】また、第８図には、各培養上清をゲルロ過
カラムを用いて溶出分画し、そのアミド化酵素活性の測
定結果を示した。ｐｃＤＬ−ＳＲ α１１３４、ｐｃＤ
Ｌ−ＳＲ α１２９６及びｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２
のいずれのプラスミドＤＮＡ をＣＯＳ１細胞に導入し
た場合も、約３６ｋｄの位置にアミド化酵素活性が検出
された。 【００３３】以上の結果は、以前我々が報告したブタ心
房の可溶性画分より精製した約３６ｋｄのアミド化酵素
は、約３．７ｋｂ のアミド化酵素ｍＲＮＡから約９６
ｋｄの前駆体タンパクとして発現し、その後塩基性アミ
ノ酸対Ｌｙｓ−Ａｒｇ 部位（配列番号５ 、塩基番号
１３２４〜１３３０）で限定切断を受け、約３６ｋｄの
可溶性アミド化酵素として細胞外に分泌されることを示
す。 【００３４】 【発明の効果】以上に述べたように、本発明ではブタ心
房アミド化酵素をコードする遺伝子を単離し、その構造
を明らかにすると共に、以前報告した約３６ｋｄの可溶
性アミド化酵素において必要な遺伝子領域を特定し、動
物細胞において発現させることに成功した。この酵素を
用いてペプチドまたはタンパク質の生理活性に重要であ
るＣ−末端α− カルボキシル基のアミド化に用いれば
、生理活性物質を効率的に製造することを容易にする極
めて有用な発明である。 【００３５】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ 末端フラグメント起源 生物名：ウシ 組織の種類：脳下垂体 直接の起源 クローン：ＢＯＶ．ＰＡＭ−１ 配列 Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ １
５
１０
１５ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐ
ｈｅ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
２０
２５ ３
０ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐ
ｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ
３５ ４
０ ４５ Ｖ
ａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｒｏ ５０
５５
６０ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈ
ｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｒｇ ６５
７０ ７５
８０ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐ
ｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ
８５
９０ ９５
Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈ
ｉｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｃｙ
ｓ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｐｒｏ
１００ １０
５ １１０ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｒ
ｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ １１
５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ
Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ａｒｇ １３０
１３５
１４０ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
１４５ １５
０ １５５
１６０ Ｔｙｒ Ｐｈ
ｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ａｓｐ
１６５ １７０
１７５ Ａｓｎ
Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒ
ｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ １８０
１８５
１９０ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ １９５
２００
２０５ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ
２１０ ２１５
２２０ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ ２２５
２３０
２３５ ２４０
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ
２４５【００３６】配列
番号：２ 配列の長さ：２４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：アフリカツメガエル 組織の種類：皮膚 直接の起源 クローン名：ＡＥ−Ｉ 配列 Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ １
５
１０
１５ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｙ
ｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｙｒ
２０
２５
３０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａ
ｒｇ ３５
４０
４５ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔ
ｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｍｅ
ｔ ５０
５５
６０ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐ
ｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
６５ ７０
７５
８０ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ｈｉｓ
８５ ９
０ ９５
Ａｌａ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｉｌｅ
１００
１０５ １１０
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａ
ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ
１１５
１２０ １２５
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｍｅ
ｔ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
１３０ １３５
１４０
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｙ
ｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ １４５
１５０
１５５
１６０ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
１６５
１７０
１７５ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ １８
０ １８５
１９０ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉ
ｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ １９５
２００
２０５ Ｖａｌ Ｉ
ｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌ
ａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｌｅｕ ２１０
２１５
２２０ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ ２２５
２３０ ２３
５ ２４０
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ
２４５ 【
００３７】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＴＡＴＴＣＧＣＡ ＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴ ２０
Ｃ Ａ Ａ 【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＧＡＴＧＴＣＴＣ ＡＡＧＴＧＴＧＡＧＡ ２０
Ｇ 【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：３７３１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：ブタ 組織の種類：心房 直接の起源 クローン：Ｐ ・ＰＡＭ−８ 配列 ＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴ ＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡ ＣＡＣ
ＣＴＣＧＧＣＣ ＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣ ＧＣＧＧＣＴ
ＣＴＣＣ ＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧ ６０ＴＧＴＧＴ
ＧＧＣＣＧ ＣＣＧＣＴＧＧＡＣＧ ＣＣＣＧＣＣＧＣ
ＧＣ ＣＣＣＧＧＣＣＡＴＧ ＡＡＧＴＡＧＣＧＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣ １２０ＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣ
ＴＡＣＣＧＣＣＧＧＣ ＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧ ＣＧ
ＣＣＡＡＧＣＴＧ ＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣ ＣＣＧＧＣ
ＧＧＧＧＣ １８０ＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧ ＴＧＧＡ
Ｃ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＧＣ
ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＴＴ
２３１ Ｍｅｔ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ
１
５ １０
ＴＴＴ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＴ ＴＴＧ
ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＴＴ
ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＴＴ ＡＡＧ ２７９Ｐｈｅ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ １５
２０
２５ ＡＧＧ ＴＴＴ ＡＡＡ
ＧＡＡ ＡＣＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＴＴ Ｔ
ＣＴ ＡＡＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧＴ ＡＣ
Ｃ ３２７Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
３０ ３５
４０ ＡＣＣ Ａ
ＧＡ ＣＣＡ ＧＴＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＡＴＴ ＧＡ
Ｔ ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＣＡ ＴＴＧ
ＧＡＴ ＡＴＴ ３７５ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｒ
ｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｉｌｅ ４５
５０ ５５
６０ ＣＧＣ Ａ
ＴＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＴＴ ＡＣＡ ＣＣＴ ＡＡ
Ａ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴ ＡＣＡ ＴＡＣ ＴＴＣ
ＴＧＣ ＡＴＧ ４２３ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ
Ｍｅｔ ６５
７０
７５ ＴＣＡ ＡＴＧ Ｃ
ＧＴ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＧＡ
Ａ ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ
ＡＡＡ ４７１ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
８０
８５
９０ ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＣＣ Ａ
ＧＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＣＴ ＧＴＣ ＣＡＴ ＣＡ
Ｃ ＡＴＧ ＴＴＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＴＧＣ
５１９ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｍｅ
ｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
９５ １
００ １０５ ＡＡ
Ｔ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＧＧＡ
ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＧＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＣＣ ５６７Ａｓｎ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｙ Ｔｈｒ １１０
１１５
１２０ ＴＧＣ ＡＣＡ ＧＡＴ ＡＡＡ ＧＣＣ
ＡＡＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ Ｇ
ＣＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ６１５
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉ
ｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒ
ｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ １２５
１３０
１３５ １
４０ ＣＣＴ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＡＡ
Ａ ＧＧＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＴＴ
ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＡＧ ＡＣＴ ６６３Ｐｒ
ｏ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
１４５ １５
０ １５５ ＧＧＡ
ＡＧＴ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＣＴＴ
ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ Ａ
ＴＴ ＡＧＴ ＧＣＴ ７１１Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖ
ａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ １６０
１６５
１７０ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＡＴ Ａ
ＡＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＴＧＴ ＴＣＴ ＧＧ
Ｔ ＧＴＧ ＴＣＣ ＴＴＡ ＣＡＣ ＣＴＣ ＡＣＡ
７５９Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｈｉ
ｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
１７５ １
８０ １８５ ＣＧ
Ｃ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＴＡ ＡＴＴ
ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＡＣ ＣＴＴ ＡＴＧ
ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ８０７Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ １９０
１９５
２００ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＣＣ
Ａ ＧＣＡ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ
ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＴＴ ＴＣＡ ８
５５Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ ２０５
２１０
２１５
２２０ ＴＧＣ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＡＡ ＡＡＧ
ＴＡＴ ＣＣＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＴＴ Ｇ
ＣＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＣＡＣ ９０３
Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐ
ｒｏ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙ
ｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ
２２５
２３０ ２３５
ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＧＧＴ ＡＡＧ
ＧＴＡ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＡ Ｇ
ＴＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ９５１Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒ
ｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ ２４０
２４５
２５０ ＣＡＧ ＴＧＧ
ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＧＡ ＣＧＣ ＣＡＧ
ＡＧＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ Ｇ
ＣＴ ＴＴＣ ９９９Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｈ
ｅ ２５５
２６０
２６５ ＴＡＣ ＣＣＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＡＣ Ｃ
ＣＡ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＧＴ ＴＴＴ ＧＧ
Ｔ ＧＡＣ ＡＴＡ ＣＴＧ ＧＣＡ １０４７Ｔ
ｙｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ ２７０
２７５
２８０ ＧＣＡ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴ
Ａ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＧＧ
ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＴＴ
１０９５Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ ２８５
２９０
２９５
３００ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＣＴ
ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＡＡＣ Ｔ
ＴＡ ＴＡＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ
１１４３Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
３０５
３１０ ３
１５ ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＡＴ ＧＣ
Ａ ＧＴＴ ＴＣＴ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＴＧＴ
ＡＣＡ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＴＡ １１９１Ｍｅ
ｔ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ
Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ ３
２０ ３２５
３３０ ＧＣＴ ＣＣＧ
ＧＡＴ ＡＴＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＣＣ ＡＴＡ
ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＴＴ Ｃ
ＣＡ ＡＴＴ １２３９Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｉｌ
ｅ ３３５
３４０
３４５ ＣＣＴ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴ Ａ
ＴＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡ
Ｔ ＣＡＣ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＣＡ １２８７Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｖａ
ｌ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｈｉｓ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ３５０
３５５
３６０ ＧＡＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＡ
Ｔ ＡＡＧ ＡＣＴ ＴＣＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＣＡＧ
ＣＡＡ ＣＣＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ
１３３５Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ３６５
３７０
３７５
３８０ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＴＴＡ
ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＡＴ Ｔ
ＣＡ ＣＴＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ
１３８３Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
３８５
３９０ ３
９５ ＣＴＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＡ
Ｔ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＧＴＧ ＣＡＴ ＡＡＡ
ＴＡＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＣＡ １４３１Ｌｅ
ｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ４
００ ４０５
４１０ ＧＡＡ ＡＡＧ
ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＡＣ
ＣＴＧ ＧＴＡ ＧＣＣ ＧＡＧ ＡＴＴ ＧＣＡ Ａ
ＡＴ ＧＴＡ １４７９Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａ
ｌ ４１５
４２０
４２５ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＴ Ｃ
ＴＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＣＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧ
Ａ ＧＡＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＧＡＡ １５２７Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ ４３０
４３５
４４０ ＣＡＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＧＡ
Ｃ ＡＡＴ ＡＣＴ ＡＴＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＧＡ
ＧＡＣ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＴＴＣ
１５７５Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ４４５
４５０
４５５
４６０ ＣＡＣ ＡＧＡ ＣＴＡ ＧＴＡ
ＴＣＴ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＣＡ Ｇ
ＡＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＴＧ ＴＣＡ
１６２３Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
４６５
４７０ ４
７５ ＴＴＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＴＡ ＣＣ
Ｔ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＧＡＡ
ＴＣＡ ＧＡＡ ＣＡＣ ＡＣＡ １６７１Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ ４
８０ ４８５
４９０ ＧＧＡ ＧＡＴ
ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＣＡ
ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＴＡ Ｔ
ＡＣ ＴＴＧ １７１９Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅ
ｕ ４９５
５００
５０５ ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＴＴ Ｔ
ＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＣ
Ｔ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＴＧ １７６７Ｌ
ｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ ５１０
５１５
５２０ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＣＡ
Ｃ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＧ
ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＡＣ ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＡＣ
１８１５Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ ５２５
５３０
５３５
５４０ ＡＧＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＧＴＴ
ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＴＣ Ｇ
ＧＧ ＣＣＡ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＡＧ
１８６３Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒ
ｏ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ
５４５
５５０ ５
５５ ＡＣＴ ＡＴＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＴＡ ＧＡ
Ｔ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＴＧ
ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＣＣ ＡＧＴ １９１１Ｔｈ
ｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ５
６０ ５６５
５７０ ＧＧＧ ＡＡＡ
ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＴＧ ＣＣＡ
ＣＡＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＧＴ ＡＴＡ ＧＡＴ Ａ
ＡＡ ＧＡＴ １９５９Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ ５７５
５８０
５８５ ＧＧＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ Ａ
ＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＡ
Ｇ ＧＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＴＡ ２００７Ｇ
ｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ５９０
５９５
６００ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＧ
Ｔ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＡ
ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＴＧ
２０５５Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｍｅｔ ６０５
６１０
６１５
６２０ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＧＴ
ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＣＡＣ ＴＴＣ ＴＧＴ Ｃ
ＡＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＴＧ ＧＣＴ
２１０３Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇ
ｌｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｐｈｃ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒ
ｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ
６２５
６３０ ６
３５ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＧ
Ａ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＧＣ ＡＡＴ ２１５１Ｖａ
ｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ ６
４０ ６４５
６５０ ＡＧＴ ＣＧＧ
ＡＴＴ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＣＡ ＣＣＡ
ＡＧＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＣＡ Ｃ
ＡＧ ＴＧＧ ２１９９Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｒ
ｐ ６５５
６６０
６６５ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＣＴ Ｇ
ＧＧ ＧＡＣ ＡＧＣ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＣＡ Ｇ
ＧＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＴＴ ２２４７Ｇ
ｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ ６７０
６７５
６８０ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＴＴ
Ｇ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＴＧ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＴＧ
ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＴＡ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＣＡ
２２９５Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ ６８５
６９０
６９５
７００ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＡＣ
ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＴＧＴ ＴＴＴ Ａ
ＡＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＡＡ
２３４３Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
７０５
７１０ ７
１５ ＴＴＴ ＧＴＧ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＴＴ ＡＡ
Ｇ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＧＧＡ ＡＧＡ
ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＧＣＡ ２３９１Ｐｈ
ｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｈｉｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ ７
２０ ７２５
７３０ ＡＴＴ ＴＣＡ
ＴＡＴ ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＧＴ ＴＴＧ ＣＴＣ
ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＡＣ ＧＧＡ ＡＡＧ Ｃ
ＣＴ ＴＡＣ ２４３９Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａ
ｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｙ
ｒ ７３５
７４０
７４５ ＴＴＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＣＡＡ ＧＡＡ Ｃ
ＣＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＴＴ ＧＴＧ ＡＴ
Ｇ ＡＡＣ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＡＴ ２４８７Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｓｎ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ ７５０
７５５
７６０ ＧＧＧ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＴ
Ａ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＴＡ
ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＡＴＧ
２５３５Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ ７６５
７７０
７７５
７８０ ＣＣＴ ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＴＣ
ＡＣＴ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＧ Ａ
ＣＣ ＧＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ
２５８３Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａ
ｌ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ
７８５
７９０ ７
９５ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＧＴ
Ｇ ＴＧＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＧ ＡＣＴ
ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＡ ２６３１Ａｌ
ａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ８
００ ８０５
８１０ ＣＡＴ ＣＧＡ
ＴＣＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＧＣ
ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＴＣ Ａ
ＡＡ ＧＡＡ ２６７９Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ ８１５
８２０
８２５ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＴＴ ＧＴＴ Ｇ
ＡＡ ＡＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＡ
Ａ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ２７２７Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ８３０
８３５
８４０ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＡＧ ＡＡ
Ｇ ＡＴＧ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＡＡ
ＣＴＧ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＣ
２７７５Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ８４５
８５０
８５５
８６０ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＣＣ
ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＣＣ Ｃ
ＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＴＧ
２８２３Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ
８６５
８７０ ８
７５ ＧＴＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＴ
Ｔ ＧＣＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＣＧＧ ＴＧＧ
ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ２８７１Ｖａ
ｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｌｙｓ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ ８
８０ ８８５
８９０ ＧＣＣ ＴＴＴ
ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＧＧＧ ＡＧＣ ＧＧＡ
ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ Ｔ
ＴＣ ＴＴＣ ２９１９Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌ
ｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈ
ｅ ８９５
９００
９０５ ＧＣＡ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＧＧＣ Ｔ
ＡＴ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＧＧＧ ＴＴＴ ＧＡ
Ｃ ＣＧＣ ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ２９６７Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ９１０
９１５
９２０ ＧＡＧ ＧＧＡ ＡＧＣ
ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＡＧ Ｇ
ＡＴ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＣＣ ＧＡ
Ａ ３０１５Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓ
ｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ ９２５
９３０
９３５
９４０ ＧＣＧ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＣ
Ｃ ＧＣＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＣＣ
ＧＣＡ ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＧＡＧＡＴＣＡ
ＡＧ ３０６７ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ９４５
９５０ ＧＣＴＴ
ＴＧＡＣＴＴ ＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡ ＧＡＴＴＴＡＣ
ＣＡＡ ＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡ ＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣ
ＴＴＴＡＧＣＡＣＧＴ ３１２７ ＴＴＡＧＡＧＴ
ＴＴＴ ＧＴＧＴＡＴＴＴＡＡ ＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧ
ＴＡＣＴＡＧＴＣＴＧ ＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧ ＴＡ
ＣＡＣＡＴＴＴＴ ３１８７ ＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴ
ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＧ ＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴ ＣＴ
ＡＧＴＴＧＡＧＧ ＡＧＴＴＴＣＣＴＡＡ ＡＡＧＴＴ
ＣＡＧＡＡ ３２４７ ＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴ ＧＴ
ＣＴＴＴＡＴＡＧ ＧＡＡＣＡＴＡＧＧＡ ＴＡＧＡＧ
ＡＡＧＣＡ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＴ ＴＣＣＡＴＣＡＣ
ＡＣ ３３０７ ＴＡＧＴＡＡＧＴＴＡ ＡＴＧＡＴ
ＧＧＡＡＧ ＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴ ＣＴＧＣＡＴＴＴ
ＴＴ ＧＡＧＡＣＴＴＴＴＣ ＴＧＴＡＧＴＴＴＧＴ
３３６７ ＡＡＡＴＡＡＣＣＣＣ ＡＴＴＣＴＣＴＧ
ＣＴ ＴＧＡＡＣＡＣＡＧＴ ＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡ
ＣＡＧＣＡＣＴＴＣＣ ＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧ ３４
２７ ＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧ ＧＴＧＣＣＴＴＴＣＣ
ＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴ ＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧ ＴＧＧ
ＣＡＧＴＡＡＡ ＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴ ３４８７
ＧＴＧＣＴＡＣＡＴＧ ＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ ＴＧＣ
ＴＡＡＡＴＣＴ ＣＣＴＴＣＴＡＴＴＴ ＴＴＴＴＡＡ
ＡＡＴＣ ＡＣＴＡＡＣＡＴＴＡ ３５４７ ＴＡＴ
ＴＧＣＡＡＴＧ ＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡ ＡＡＡＧＡＡ
ＡＧＴＣ ＴＣＴＡＴＴＴＡＡＡ ＴＴＧＴＴＴＴＴＴ
Ｔ ＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴ ３６０７ ＣＴＴＣＴＴ
ＣＡＧＴ ＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴ ＴＧＧＧＧＡＴＧＴ
Ｃ ＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧ ＡＴＧＧＴＴＡＣＡＣ Ｔ
ＧＴＴＡＧＡＴＣＡ ３６６７ ＣＴＡＴＴＴＴＣＡ
Ｇ ＡＡＴＣＴＧＡＡＴＧ ＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴ Ａ
ＡＴＡＡＡＧＴＧＴ ＴＴＴＣＡＧＡＧＣＡ ＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ ３７２７ ＡＡＡＡ
３７３１ 【００４０】配列番号：６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧ ＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣ ＴＧＧ
ＣＴＴＴ ２７【００４１】配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＧＡＣＣＴＣＡＴ ＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ ＧＣＴ
ＧＴＡＧ ２７【００４２】配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＴＡＡＴＴＣＡＣ ＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡ ＣＴＡ
ＣＡＴＴ ２７【００４３】配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＡＣＣＴＴＧＧＴ ＴＧＡＴＣＴＣＡＧＧ ＡＧＧ
ＡＡＧＧ ２７【００４４】
ドのＣ−末端をアミド化する酵素をコードする遺伝子，
当該遺伝子を含有するベクター，このベクターより形質
転換された宿主細胞及び当該宿主細胞を用いる前記酵素
の製造方法並びに当該酵素を用いるＣ−末端α−アミド
化酵素ペプチド又はタンパクの製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ペプチドの中には、そのカルボキシル基
末端（Ｃ−末端）のグリシン残基がアミド化されている
ことにより、その生理活性を示すものが多く存在してい
る。これらペプチドやタンパクのＣ−末端をアミド化す
る酵素は、真核細胞特有の修飾（モディフィケイション
）酵素の１つとして知られ、主にペプチドやタンパクが
、メッセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）から翻訳された
後の修飾に関与している。ペプチドのＣ−末端がアミド
化される場合は、そのペプチドのＣ−末端にグリシン残
基の付加した前駆体が真核細胞中に存在するアミド化酵
素によって修飾を受け、Ｃ −末端グリシン残基の１つ
前のアミノ酸がアミド化されると考えられている。 【０００３】本アミド化酵素の存在を最初に発表したの
はＢｒａｄｂｕｒｙらである（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．
Ｆ． 等；Ｎａｔｕｒｅ，２８９，６８６−６８８，１
９８２ ）。その後、アミド化酵素がいくつかの動物臓
器より単離され、その遺伝子クローニングが成されてい
るものもある。Ｍｉｚｕｎｏらは、アフリカツメガエル
の体皮より精製したアミド化酵素ＡＥ−Ｉの前駆体ｃＤ
ＮＡのクローニングを行ない（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ等；Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．
，１４８，５４６−５５２，１９８７ ）、Ｅｉｐｐｅ
ｒらは、ウシ脳下垂体のアミド化酵素遺伝子のクローニ
ングを行ない（Ｅｉｐｐｅｒ，Ｂ．Ａ． 等；Ｍｏｌ．
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１，７７７−７９０，１９８７
）、同じくＥｉｐｐｅｒらは、ラット心房のアミド化
酵素の遺伝子クローニングを行ない（Ｅｉｐｐｅｒ，Ｂ
．Ａ． 等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８６，７３５−７３９，１９８９）、Ｇｌａｕ
ｄｅｒ らは、ヒト甲状線腫瘍細胞よりアミド化酵素遺
伝子をクローニングしている（Ｇｌａｕｄｅｒ，Ｊ．等
；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．，１６９，５５１−５５８，１９９０）。ブタ心
房由来のアミド化酵素としては、Ｋｏｊｉｍａらが、膜
画分由来の分子量９２ｋｄのタンパクを精製している（
Ｋｏｊｉｍａ，Ｍ． 等；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０
５，４４０−４４３，１９８９ ）。また、本発明者ら
も、同じブタ心房の水溶性画分より分子量３６ｋｄ（ゲ
ルろ過より測定）のアミド化酵素を精製している（特願
平１−１４０７６０）。 【０００４】しかし、ブタ心房由来の可溶型３６ｋｄ及
び膜結合型９２ｋｄのアミド化酵素に相当する遺伝子の
クローニングはまだ成功されていない。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】上記のアミド化酵素の
中で可溶性の酵素は比較的少なく、またブタ心房由来の
アミド化酵素に相当する遺伝子のクローニング、本酵素
の動物細胞中での発現、その応用法についての報告はま
だ成されていない。本発明は、ブタ心房由来のアミド化
酵素前駆体の遺伝子クローニングを行ない、活性を有す
る遺伝子領域を特定化するために、完全長ｃＤＮＡ及び
特異的プロテア−ゼによる限定的切断によって生じると
考えられる二つの可溶性型アミド化酵素に相当する、部
分ｃＤＮＡを組み込んだ３種類の発現ベクタ−を構築し
、それらを動物細胞中において発現させ、更に本アミド
化酵素を用いて、Ｃ−末端アミド化ペプチドの製造方法
を提供することを目的とするものである。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ブタ心房
由来のアミド化酵素をコードする遺伝子を取得し、３種
類の大きさの酵素に相当する遺伝子を発現ベクターに組
み込み、それらを動物細胞中で発現させ、その培養上清
がペプチドのＣ−末端をアミド化することを見出し、本
発明を完成した。すなわち本発明は、ブタ心房アミド化
酵素をコードする遺伝子、配列番号５に記載の塩基配列
で特定される請求項１記載の遺伝子、配列番号５に記載
のアミノ酸番号１から９５４までの９５４ アミノ酸残
基で特定される請求項１記載のアミド化酵素、ブタ心房
アミド化酵素をコードする塩基配列を組み込んだ発現ベ
クター、当該発現ベクターを導入した細胞及び当該細胞
を培養し、培養物からアミド化酵素を採取することを特
徴とするアミド化酵素の製造法に関する。 【０００７】ペプチドのＣ−末端をアミド化する酵素の
遺伝子を取得するに当たり、既にそのアミノ酸配列が公
知となっている、アフリカツメガエル皮膚及びブタ脳下
垂体のアミド化酵素の両者に共通して保存されているア
ミノ酸配列部位を捜し出し、その部分に相当する２０塩
基のＤＮＡ をプライマーにして、ブタ心房のｃＤＮＡ
を鋳型として、ＰＣＲ （Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ）反応（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．
Ｋ．等；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１
９８８）を行なって目的の遺伝子の一部分である、５３
９ 塩基対のＤＮＡ フラグメントを取得し、次にこれ
をプローブとして、ブタ心房のｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングして、目的の遺伝子の全鎖長約３．７Ｋ
塩基対を含むクローンＰ ・ＰＡＭ−８ を取得した。 【０００８】次に、全遺伝子の塩基配列を決定するため
に、３６種のデリーションクローンを作製し、それぞれ
をダイデオキシシーケンシング法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．
等；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，７４，５４６３−５４６７，１９７７）によって全塩
基配列を決定した。次いで、Ｎ末端から３７８ 、４３
２ 及び９５４ アミノ酸残基のタンパクに相当する遺
伝子をＰＣＲ 法により収得し、動物細胞発現系で発現
させるために、各遺伝子をベクターｐｃＤＬ−ＳＲ α
２９６ （Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ． 等；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．，８，４６６−４７２，１９８８ ）に挿
入し、宿主細胞ＣＯＳ１株（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．；Ｃ
ｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）にトランス
フェクションして目的の遺伝子を発現させた。 【０００９】このアミド化酵素の活性測定方法としては
、Ｂｒａｄｂｕｒｙによる［１２５Ｉ］−Ｄ−Ｔｙｒ−
Ｖａｌ−Ｇｌｙをアミド化酵素の基質とし、［１２５Ｉ
］−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ・ＮＨ２ が生成されることを
ＨＰＬＣを用いて追跡する方法（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ
．Ｆ． 等；Ｎａｔｕｒｅ，２９８，６８６−６８８，
１９８２ ）及びＭｉｚｕｎｏらによる［１２５Ｉ］−
Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙを基質とし、生成さ
れる［１２５Ｉ］−Ａｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ ・ＮＨ
２ を酢酸エチルで抽出して追跡する方法（Ｍｉｚｕｎ
ｏ，Ｋ． 等；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３７，９８４−９９１，１９８
６）が知られているが、本発明者らが新たに見出したラ
ジオアイソトープ化合物を使用しないでアミド化酵素活
性を測定する新しい方法を採用すると、極めて容易な操
作にて２０種類全てのアミド化されるアミノ酸に対して
、正確にアミド化活性を測定することができる。この方
法は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）検出器
としてＥＣＤ （エレクトロケミカルディテクター）を
付設したＥＣＤ−ＨＰＬＣアッセイ系を用いる方法であ
る。例えば、本酵素活性のスクリーニング用基質として
、Ｄ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ （Ｘ は２０種類のアミノ
酸）を合成し、この基質を使用してアミド化酵素がＤ−
Ｔｙｒ−Ｘ ・ＮＨ２ に変換させる状態をアミド化反
応終了後にこの基質と生成物が分離する溶媒系を設定し
てあるＨＰＬＣにかけ、検出器としてＥＣＤ を使用し
た系で検出する。ＥＣＤ 上を通過した基質は、電気化
学的酸化を受けて、チロシンがキノン型に変換される。 その時に流れる電流を検知して、基質及び生成物に相当
するピークとして表現する。通常１ミリボルトの電圧を
かけると、約５〜１０マイクロアンペアの電流が流れる
。この時の基質と生成物とのピーク面積比によりアミド
化反応の進行を追跡した。本アッセイ系を使用すること
により、３ 種類の酵素遺伝子を発現させたＣＯＳ１培
養上清中のアミド化酵素活性を測定した結果、トリペプ
チド基質がジペプチドアミド体に変換されていることを
ＥＣＤ−ＨＰＬＣ上で検知し、本発明を完成するに至っ
た。 【００１０】 【実施例】次に、実施例により本発明を詳しく説明する
。 実施例１ ブタ心房よりポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの調製（１）全ＲＮ
Ａの調製 新鮮なブタ心房６ｇにつき４０ｍｌのグアニジンチオシ
アネート溶液（５．５Ｍグアニジンチオシアネート，０
．１Ｍ酢酸ナトリウム，５ｍＭ ＥＤＴＡ ＰＨ５．０
）を加え、氷冷しながらポリトロンを用いて細胞を破壊
した。次に、３Ｋｒｐｍ で１０分間遠心を行なった後
、その上清を１８Ｇ の注射針で粘性がなくなるまで出
し入れし、６ｍｌ のＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ ＣｓＣ
ｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０ ）の入った遠心
管に等量の上清を重層し、３５Ｋｒｐｍ、１８時間、２
０℃で遠心を行なった。遠心後、上清を除去し、ＲＮＡ
沈澱物をＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ７．５，１０ｍＭ ＥＤＴＡ ）に溶解し、１／１０
量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０ ）、２．５ 倍
量のエタノール（−２０℃）を加え、−８０℃で３０分
間エタノール沈澱を行なった。真空乾燥後、適量の滅菌
蒸留水を加え、エタノール沈澱物を溶解した。 この方法によりブタ心房６ｇから６８０ μｇ の全Ｒ
ＮＡ を調製した。 【００１１】（２）ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの調製オリゴ
（ｄＴ）セルロース０．５ｇをカラムにつめ、１０ｍｌ
の１×結合緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７
．６，０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１
ＳＤＳ）で平衡化した。全ＲＮＡ を濃度３ｍｇ／ｍ
ｌに調整したもの１６７ μｌ を６５℃、５ 分間処
理し、直ちに水中に入れ、室温に戻した。これに１６７
μｌ の２×結合緩衝液を加えた。これをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムにかけ、８ｍｌ の１×結合緩衝
液で洗い、４ｍｌ の溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ７．５， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０
５ ＳＤＳ ）でポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ を溶出した。 溶出画分に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５
倍量のエタノール（−２０℃）を加えてエタノール沈
澱を行ないポリ（Ａ）＋ を調製した。５００ μｇ
の全ＲＮＡ より５０μｇ のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ
が得られた。 【００１２】実施例２ ｃ ＤＮＡライブラリーの作製 （１）ｃ ＤＮＡの作製 ｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャム社）を用い
、製品に添付されているプロトコールに従って実施した
。即ち、逆転写酵素によりｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ
を合成した後、リボヌクレアーゼＨで、ＲＮＡ 鎖にニ
ックとギャップを入れ、これを大腸菌ＤＮＡ ポリメラ
ーゼＩを用いて修復合成することにより、ＲＮＡ 鎖を
ＤＮＡ 鎖に置換した。最後に、Ｔ４ＤＮＡ ポリメラ
ーゼを用いてＤＮＡ 鎖の両末端を平衡化した。ブタ心
房のポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ ２μｇ より７００ｎｇの
二本鎖ｃＤＮＡを合成した。システムの最終反応物５０
０ μｌに等量のフェノール／クロロホルム（１：１，
ｖ／ｖ ）を加えて撹拌後、１０Ｋｒｐｍにて１分間遠
心を行なった。次いで、上清の水層を取り、再度フェノ
ール／クロロホルム抽出を行なった後、等量のクロロホ
ルムを水層に加え、撹拌後、１０Ｋｒｐｍにて１分間遠
心を行なった。取り込まれなかったデオキシヌクレオチ
ド三リン酸を除去するために、水層（上清）に等量の４
Ｍ酢酸アンモニウム溶液と２倍量のエタノール（−２０
℃）を加え、ドライアイス上で１５分間放置した。静か
に混ぜながら室温に戻し、１０Ｋｒｐｍで１０分間遠心
し上清を除いた。沈澱に５０μｌ の２Ｍ酢酸アンモニ
ウム、次いで１００ μｌ エタノール（−２０ ℃）
を加え、室温で靜かに混和後、１０Ｋｒｐｍで１０分間
遠心して上清を除去した。沈澱を２００ μｌエタノー
ル（−２０℃）でリンスし、遠心したのち上清を除去し
、真空乾燥後、適量のＴＥ溶液に溶解した。 【００１３】（２）ｃ ＤＮＡライブラリーの作製ｃＤ
ＮＡライブラリーの作製は、ｃＤＮＡクローニングシス
テムλｇｔ１０・アダプター法（アマシャム社）を用い
、添付されているプロトコールに従って行なった。まず
、二本鎖ｃＤＮＡの両端にＥｃｏ ＲＩアダプターを付
加した後、未反応のアダプター分子と５００ 塩基対以
下のｃＤＮＡを除くため、カラム分画を行なった。Ｅｃ
ｏ ＲＩアダプターが結合したｃＤＮＡの５ ’末端を
リン酸化し、λｇｔ１０のＥｃｏ ＲＩア−ムに連結し
た後、インビトロパッケージングを行ない、宿主大腸菌
（ＮＭ５１４ 株）を感染させることによりｃＤＮＡラ
イブラリーとした。この方法により０．５ μｇ のｃ
ＤＮＡから２．５ ×１０７ 個のファージプラークを
得た。 【００１４】実施例３ＰＣＲ法を用いたＤＮＡプローブ
の作製ｃＤＮＡライブラリーよりアミド化酵素ｃＤＮＡ
を単離するために、既知のアミド化酵素遺伝子のホモロ
ジーに基づき、ＰＣＲ 法を利用することによって、Ｄ
ＮＡ プローブを作製した。 【００１５】既に報告されているアフリカツメガエル皮
膚アミド化酵素ＡＥ−Ｉ とウシ脳下垂体アミド化酵素
Ｂ・ＰＡＭ −１ のＮ末端側のアミノ酸配列の比較（
第１図）から、非常に高度に保存されている領域を見出
し（第１図）、その領域のＤＮＡ 配列をＰＣＲ 法の
プライマーとして利用するために、混合オリゴヌクレオ
チドを合成した。 即ち、７個のアミノ酸が連続して完全に一致している領
域２箇所を選び、センスプライマーとして２０塩基対、
８通りのコドン縮重があるミックスプライマー（Ｐｒｉ
ｍｅｒ−Ａ）と、アンチセンスプライマーとして２０塩
基対、２通りのコドン縮重があるミックスプライマー（
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂ）を合成した（第２図）。この合成し
たＰＣＲ 用ミックスプライマーを用い、ブタ心房ｃＤ
ＮＡを鋳型として、ＰＣＲ 法によりプローブとなる、
ブタ心房アミド化酵素をコードする遺伝子の部分ＤＮＡ
（５３９ 塩基対）の増幅を以下の条件で行なった。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３
１０
ｍＭ ＫＣｌ
５０ ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２
１．５ ｍＭ
ゼラチン
０．０１ ％
ｄＮＴＰｓ
０
．２ ｍＭ Ｔａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌ．
２．５ Ｕ
Ｐｒｉｍｅｒ−Ａ
２．５ μｇ
Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂ
２．５
μｇ ブタ心房ｃＤＮＡ
１
０ ｎｇ ９４℃，２ｍｉｎ →
５５℃，２ｍｉｎ →７２℃，２ｍｉｎ を１サイクル
として３５回繰り返した。 【００１６】ＰＣＲ 反応の最終生成物はフェノール／
クロロホルム（１：１ ，ｖ／ｖ ）で抽出後、セファ
デックスＧ−５０カラムで精製し、その一部は、２％ア
ガロース電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫
外線（３００ｎｍ ）照射して増幅したＤＮＡ バンド
を確認した（第３図）。その結果、理論的に予想される
５３９ 塩基対に相当する特異的ＤＮＡ バンドが認め
られた。従って、既知のアミド化酵素遺伝子のホモロジ
ーに基づき、ＰＣＲ 法を利用することによって、クロ
ーニングのためのプローブとなるブタ心房アミド化酵素
をコードする遺伝子の部分ＤＮＡ （５３９ 塩基対）
を増幅し、得ることができた。 【００１７】実施例４ ブタ心房アミド化酵素 ｃＤＮＡの単離（１）ＤＮＡプ
ローブの標識 ＰＣＲ 法によって増幅した５３９ 塩基対のＤＮＡ
プローブ（ＰＣＲ−５３９ ）は、マルチプライムＤＮ
Ａ 標識システム（アマシャム社）を用いてアイソトー
プ標識した。即ち、ＰＣＲ −５３９ を熱変性し、こ
れにプライマーと未標識のｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ，最後に［α−３２Ｐ ］ｄＣＴＰを加え、Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素による伸長反応で核酸全体を標識した。標識し
たプローブ、［３２Ｐ ］ＰＣＲ −５３９ は、セフ
ァデックスＧ −５０カラム分画によって未反応の［α
−３２Ｐ ］ｄＣＴＰを除去し、精製した。その結果、
７ ×１０８ｃｐｍ／μｇ の比活性を持ったプローブ
［３２Ｐ ］ＰＣＲ −５３９ が調製できた。 【００１８】（２）プラークハイブリダイゼーション作
製したｃＤＮＡライブラリーを普通栄養寒天培地に宿主
菌（ＮＭ５１４）と共に拡げ（３．５ ×１０４／プレ
ート）、３７℃、６．５ 時間後、形成したプラークの
上にナイロンフィルター（アマシャム社）を置き、２分
間放置した。このナイロンフィルターをアルカリ変性溶
液（０．５Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌ ）上に
５ 分間置き、次に中和溶液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７，１．５Ｍ ＮａＣｌ ）上に５分間置い
た。その後、２×ＳＳＣ （２０×ＳＳＣ ：ＮａＣｌ
１７５．３ｇ 、クエン酸三ナトリウム８８．２ｇ
、全量１リットル）で洗浄、風乾後、紫外線（３００ｎ
ｍ ）で５分間照射して、ＤＮＡ をフィルター上に固
定した。こうしたナイロンフィルター１０枚をビニール
袋にパックしてＲａｐｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎｂｕｆｆｅｒ（アマシャム社）５０ｍｌを加え、６５
℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行なった。 次に、一枚のナイロンフィルター当り、標識したＤＮＡ
プローブ［３２Ｐ ］ＰＣＲ −５３９ を７×１０
６ｃｐｍ入れて、６５℃、２時間以上ハイブリダイゼー
ションを行なった。 【００１９】次に、６×ＳＳＣ 、０．１ ％ＳＤＳ
で６５℃、３０分間洗浄し、２×ＳＳＣ 、０．１ ％
ＳＤＳ で６５℃、３０分間洗浄後、更に０．２ ×Ｓ
ＳＣ 、０．１ ％ＳＤＳ で６５℃、３０分間洗浄を
行い、最後に２×ＳＳＣ、２０℃でフィルターをリンス
した。風乾後、オートラジオグラフィーを−８０℃で１
昼夜行なった。この様にして約３５万個のブタ心房ｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングして、プローブとハ
イブリダイズする１０個の陽性シグナルが得られた。 【００２０】この一次スクリーニングで得た陽性シグナ
ルに対応するプラーク領域を回収し、同様の方法で二次
、三次スクリーニングを順次行ない最終的に１０個の陽
性ファージクローンを得た。 （３） ｃＤＮＡクローンの制限酵素地図の作製取得し
た１０個のクローンについて、それぞれのインサートｃ
ＤＮＡの制限酵素地図を作製した。ファージＤＮＡ を
調製し、これをＥｃｏ ＲＩで切断することにより、イ
ンサートＤＮＡ を切り出し、Ｍ１３ｍｐ１８ のＥｃ
ｏ ＲＩ部位にサブクローニングした。これらプラスミ
ドを導入した大腸菌（ＪＭ１０９ 株）を培養し、プラ
スミドＤＮＡ を調製した。 【００２１】プラスミドＤＮＡ は、種々の制限酵素で
切断し、切断したＤＮＡ 断片をアガロース電気泳動で
分析した。種々の制限酵素により切断したＤＮＡ 断片
の鎖長を比較することにより、第４図に示す制限酵素地
図を得た。 その結果、アミド化酵素ｃＤＮＡを含む組換え体ファ−
ジクロ−ン（Ｐ ・ＰＡＭ−１ 〜１０）のうち、Ｐ
・ＰＡＭ−８ が最も長いｃＤＮＡインサ−トを含んで
いた。 【００２２】実施例５ ブタ心房アミド化酵素のＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸配
列の決定得られた Ｐ・ＰＡＭ−８ のｃＤＮＡインサ
ートの全塩基配列を、Ｍ１３ｍｐ１８ ファージベクタ
ーに正逆両方向にサブクローニングした。キロシークエ
ンス用デリーションキット（宝酒造）を用いて、プロト
コールのデリーション法に従い、インサートｃＤＮＡが
ベクターの塩基配列決定用プライマーアニーリング部位
側から順次欠失した一連のデリーションクローンを作製
した。これらデリーションクローンのＤＮＡ 塩基配列
は、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼと蛍光ラベルプライ
マーを用いたダイデオキシ法により決定した（配列番号
５）。 【００２３】クロ−ン Ｐ・ＰＡＭ−８ は、ポリ（Ａ
）＋ テイルを含む３７３１塩基対をインサートｃＤＮ
Ａとして含み、翻訳開始コドンＡＴＧ から翻訳終止コ
ドンＴＧＡ までの２８６２塩基対、即ち９５４ アミ
ノ酸残基をコードする連続したオープンリーディングフ
レームが存在した。この最長の読み枠に相当する塩基配
列をアミノ酸に変換した結果も配列番号５示す。 【００２４】以上の結果を、ＤＮＡ 塩基配列及びそれ
から予想されるアミノ酸配列が既知であるカエル皮膚，
ウシ脳下垂体，ラット心房及びヒト甲状腺のアミド化酵
素の配列と比較した結果、非常によく類以していること
が見出された。 【００２５】これらの結果から判断して、配列番号５に
示すＤＮＡ 塩基配列及びアミノ酸配列はアミド化酵素
のものであることが明らかになった。 【００２６】実施例６ ＣＯＳ細胞におけるブタ心房アミド化酵素遺伝子の発現
（１）ｃＤＮＡ発現ベクターの構築 以前、我々がブタ心房から精製した約３６Ｋｄの可溶性
のアミド化酵素は、配列番号５の塩基番号１９６ 〜１
９８ のＡＴＧ から塩基番号３０５８〜３０６０のＴ
ＧＡ で終わる２８６２塩基対、即ち９５４ アミノ酸
残基の前駆体が配列番号５の塩基番号１３２４〜１３３
０のＬｙｓ−Ａｒｇ あるいは塩基番号１４８４〜１４
９０のＬｙｓ−Ｌｙｓ の塩基性アミノ酸対部分で特異
的プロテアーゼの作用によって、限定的切断を受けて産
生したと考えられる。これらのことから、精製した約３
６Ｋｄのアミド化酵素に相当するＣ末端側を欠失したＮ
末端側の部分ｃＤＮＡを動物細胞発現用ベクタ−に挿入
した組換え体を作製した。 【００２７】配列番号５に示すｃＤＮＡの塩基番号１９
６ 〜１３２９までの１１３４塩基対（３７８ アミノ
酸残基）に相当する部分（ｃＤＮＡ１１３４）、塩基番
号１９６ 〜１４９１までの１２９６塩基対（４３２
アミノ酸残基）に相当する部分（ｃＤＮＡ１２９６）及
び完全長のｃＤＮＡに対応する塩基番号１９６ 〜３０
５７までの２８６２塩基対（９５４ アミノ酸残基）に
相当する部分（ｃＤＮＡ２８６２）をＰＣＲ 法によっ
て得るために、第５図に示すＰＣＲ 用プライマー４本
、センスプライマー（ＰＣＲ−１９６ ）とアンチセン
スプライマー（ＰＣＲ−１３２９，ＰＣＲ−１４９１，
ＰＣＲ−３０５７）を合成した。 【００２８】ＰＣＲ 法による反応は、ブタ心房ｃＤＮ
Ａを鋳型として実施例３に示した条件に従って（ＰＣＲ
−１９６ ）：（ＰＣＲ−１３２９）、（ＰＣＲ−１９
６ ）：（ＰＣＲ−１４９１）、（ＰＣＲ−１９６ ）
：（ＰＣＲ−３０５７）の組合せで行なった。増幅した
ｃＤＮＡ１１３４、ｃＤＮＡ１２９６、ｃＤＮＡ２８６
２１ はフェノール／クロロホルム（１：１，ｖ／ｖ
）抽出後、セファデックスＧ−５０カラムで精製し、サ
ル腎由来のＣＯＳ１細胞株にトランスフェクトされたと
き、そのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ 部位に挿入されたｃＤＮ
Ａが高率に発現するように設計されている動物細胞発現
ベクターｐｃＤＬ−ＳＲ α２９６ のＰｓｔＩ−Ｋｐ
ｎＩ 部位に連結し、アミド化酵素が正しく発現する順
方向の組換え体ｐｃＤＬ−ＳＲ α１１３４、ｐｃＤＬ
−ＳＲα１２９６及びｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２を構
築した（第６図） 。 【００２９】（２）ＣＯＳ１細胞株の形質転換アミド化
酵素ｃＤＮＡ断片を持った組換え体、ｐｃＤＬ−ＳＲ
α１１３４、ｐｃＤＬ−ＳＲ α１２９６、ｐｃＤＬ−
ＳＲ α２８６２で形質転換した大腸菌（ＤＨ５株）か
らプラスミドＤＮＡ を抽出・精製し、ＣＯＳ１細胞に
トランスフェクトした。トランスフェクションは、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン・クロロキン法（Ｌｏｐａｔｏ，Ｍ
．Ａ． 等；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１
２，５７０７−５７１７，１９８４ ）を用いて行なっ
た。即ち、前日１０ｃｍプレート当り１０６ 個の細胞
を播き、１０％血清ＤＭＥＭ培地を加え、翌日まで培養
する。トランスフェクションを始める前に、４ｍｌ の
無血清ＤＭＥＭ、８０μｌＤＥＡＥ−デキストラン（２
０ｍｇ／ｍｌ ）及び１０μｇ のプラスミドＤＮＡ
を加えよく混合しておき、培養上清を吸引除去し無血清
ＤＭＥＭで洗浄したプレートに加える。３７℃で約４時
間培養後、ＰＢＳ 緩衝液で２回洗浄し、１００ μＭ
のクロロキンを含む４％血清ＤＭＥＭ培地（１０ｍｌ／
プレート）を加え、３７℃、３時間培養後、クロロキ
ンを含む培養液を吸引除去し、ＰＢＳ 緩衝液で洗浄す
る。４％血清ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを加え、３７℃で３
〜４日培養後、上清を回収した。 【００３０】（３）アミド化酵素活性の発現実施例６ 上記（２）で作製した三種の組換え体をトランスフェク
トした、それぞれのＣＯＳ１細胞培養上清中に含まれる
アミド化酵素活性を測定した。活性測定の方法は、本発
明者らが新たに開発したＥＣＤ−ＨＰＬＣアッセイ系を
用いた。即ち、合成した基質トリペプチドＤ−Ｔｙｒ−
Ｘ−Ｇｌｙ （Ｘ は２０種類のアミノ酸）の中で２０
μＭ のＤ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ を０．５ｍＭ
アスコルビン酸，１００ μｇ／ｍｌカタラーゼ，５０
μＭ ＣｕＳＯ４ 及びプロテアーゼ阻害剤 ＤＦＰ（
ジイソプロピルフルオロホスフェイト），ペプスタチン
，ＮＥＭ （Ｎ−エチルマレイミド）の存在下、１０倍
に濃縮した遺伝子導入ＣＯＳ１細胞培養上清１００ μ
ｌ と共に３７℃で４時間反応させた後、生成したジペ
プチドアミド体Ｄ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ ・ＮＨ２ と基質
とが分離できるＥＣＤ を付設したＨＰＬＣで反応液を
分析し、溶出した基質とそのジペプチドアミドのＤ−チ
ロシンをＥＣＤ 上で電気的に酸化した際に流れる電流
を検地することによって生成比率を表わした。 【００３１】第７図に各培養上清のアミド化酵素活性の
測定結果を示した。ｐｃＤＬ−ＳＲ α１１３４、ｐｃ
ＤＬ−ＳＲ α１２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２
のいずれの組換え体プラスミドＤＮＡ をＣＯＳ１細胞
に導入した場合も、ｃＤＮＡを挿入していないベクター
ｐｃＤＬ−ＳＲ２９６だけを導入したコントロールには
ほとんど見られなかったアミド化酵素活性が見出された
。 【００３２】また、第８図には、各培養上清をゲルロ過
カラムを用いて溶出分画し、そのアミド化酵素活性の測
定結果を示した。ｐｃＤＬ−ＳＲ α１１３４、ｐｃＤ
Ｌ−ＳＲ α１２９６及びｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２
のいずれのプラスミドＤＮＡ をＣＯＳ１細胞に導入し
た場合も、約３６ｋｄの位置にアミド化酵素活性が検出
された。 【００３３】以上の結果は、以前我々が報告したブタ心
房の可溶性画分より精製した約３６ｋｄのアミド化酵素
は、約３．７ｋｂ のアミド化酵素ｍＲＮＡから約９６
ｋｄの前駆体タンパクとして発現し、その後塩基性アミ
ノ酸対Ｌｙｓ−Ａｒｇ 部位（配列番号５ 、塩基番号
１３２４〜１３３０）で限定切断を受け、約３６ｋｄの
可溶性アミド化酵素として細胞外に分泌されることを示
す。 【００３４】 【発明の効果】以上に述べたように、本発明ではブタ心
房アミド化酵素をコードする遺伝子を単離し、その構造
を明らかにすると共に、以前報告した約３６ｋｄの可溶
性アミド化酵素において必要な遺伝子領域を特定し、動
物細胞において発現させることに成功した。この酵素を
用いてペプチドまたはタンパク質の生理活性に重要であ
るＣ−末端α− カルボキシル基のアミド化に用いれば
、生理活性物質を効率的に製造することを容易にする極
めて有用な発明である。 【００３５】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ 末端フラグメント起源 生物名：ウシ 組織の種類：脳下垂体 直接の起源 クローン：ＢＯＶ．ＰＡＭ−１ 配列 Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ １
５
１０
１５ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐ
ｈｅ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
２０
２５ ３
０ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐ
ｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ
３５ ４
０ ４５ Ｖ
ａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｒｏ ５０
５５
６０ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈ
ｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｒｇ ６５
７０ ７５
８０ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐ
ｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ
８５
９０ ９５
Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈ
ｉｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｃｙ
ｓ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｐｒｏ
１００ １０
５ １１０ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｒ
ｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ １１
５ １２０
１２５ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ
Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ａｒｇ １３０
１３５
１４０ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
１４５ １５
０ １５５
１６０ Ｔｙｒ Ｐｈ
ｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ａｓｐ
１６５ １７０
１７５ Ａｓｎ
Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒ
ｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ １８０
１８５
１９０ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ １９５
２００
２０５ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ
２１０ ２１５
２２０ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ ２２５
２３０
２３５ ２４０
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ
２４５【００３６】配列
番号：２ 配列の長さ：２４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：アフリカツメガエル 組織の種類：皮膚 直接の起源 クローン名：ＡＥ−Ｉ 配列 Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ １
５
１０
１５ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｔｙ
ｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｙｒ
２０
２５
３０ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａ
ｒｇ ３５
４０
４５ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｍｅｔ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔ
ｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｍｅ
ｔ ５０
５５
６０ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐ
ｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙ
ｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
６５ ７０
７５
８０ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ｈｉｓ
８５ ９
０ ９５
Ａｌａ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｉｌｅ
１００
１０５ １１０
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａ
ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ
１１５
１２０ １２５
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｍｅ
ｔ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
１３０ １３５
１４０
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｙ
ｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ １４５
１５０
１５５
１６０ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
１６５
１７０
１７５ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｕ １８
０ １８５
１９０ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉ
ｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ １９５
２００
２０５ Ｖａｌ Ｉ
ｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌ
ａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｌｅｕ ２１０
２１５
２２０ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｒ
ｇ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ ２２５
２３０ ２３
５ ２４０
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ
２４５ 【
００３７】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＴＡＴＴＣＧＣＡ ＴＧＣＣＴＧＧＧＧＴ ２０
Ｃ Ａ Ａ 【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＧＡＴＧＴＣＴＣ ＡＡＧＴＧＴＧＡＧＡ ２０
Ｇ 【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：３７３１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 生物名：ブタ 組織の種類：心房 直接の起源 クローン：Ｐ ・ＰＡＭ−８ 配列 ＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴ ＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡ ＣＡＣ
ＣＴＣＧＧＣＣ ＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣ ＧＣＧＧＣＴ
ＣＴＣＣ ＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧ ６０ＴＧＴＧＴ
ＧＧＣＣＧ ＣＣＧＣＴＧＧＡＣＧ ＣＣＣＧＣＣＧＣ
ＧＣ ＣＣＣＧＧＣＣＡＴＧ ＡＡＧＴＡＧＣＧＧＣ
ＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣ １２０ＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣ
ＴＡＣＣＧＣＣＧＧＣ ＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧ ＣＧ
ＣＣＡＡＧＣＴＧ ＣＣＧＧＧＴＣＣＴＣ ＣＣＧＧＣ
ＧＧＧＧＣ １８０ＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧ ＴＧＧＡ
Ｃ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＧＣ
ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＴＴ
２３１ Ｍｅｔ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ
１
５ １０
ＴＴＴ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＴ ＴＴＧ
ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＧＣ ＣＣＡ ＣＴＴ
ＴＣＴ ＧＴＣ ＴＴＴ ＡＡＧ ２７９Ｐｈｅ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ １５
２０
２５ ＡＧＧ ＴＴＴ ＡＡＡ
ＧＡＡ ＡＣＴ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＴＴ Ｔ
ＣＴ ＡＡＴ ＧＡＡ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧＴ ＡＣ
Ｃ ３２７Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
３０ ３５
４０ ＡＣＣ Ａ
ＧＡ ＣＣＡ ＧＴＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＡＴＴ ＧＡ
Ｔ ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＣＡ ＴＴＧ
ＧＡＴ ＡＴＴ ３７５ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｒ
ｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｉｌｅ ４５
５０ ５５
６０ ＣＧＣ Ａ
ＴＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＴＴ ＡＣＡ ＣＣＴ ＡＡ
Ａ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴ ＡＣＡ ＴＡＣ ＴＴＣ
ＴＧＣ ＡＴＧ ４２３ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ
Ｍｅｔ ６５
７０
７５ ＴＣＡ ＡＴＧ Ｃ
ＧＴ ＴＴＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＧＡ
Ａ ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ
ＡＡＡ ４７１ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
８０
８５
９０ ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＣＣ Ａ
ＧＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＣＴ ＧＴＣ ＣＡＴ ＣＡ
Ｃ ＡＴＧ ＴＴＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＴＧＣ
５１９ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｍｅ
ｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
９５ １
００ １０５ ＡＡ
Ｔ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＣＴ ＧＧＡ
ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＧＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＣＣ ５６７Ａｓｎ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｙ Ｔｈｒ １１０
１１５
１２０ ＴＧＣ ＡＣＡ ＧＡＴ ＡＡＡ ＧＣＣ
ＡＡＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ Ｇ
ＣＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＣＡ ６１５
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉ
ｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒ
ｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ １２５
１３０
１３５ １
４０ ＣＣＴ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＣＣ ＡＡ
Ａ ＧＧＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＴＴ
ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＡＧ ＡＣＴ ６６３Ｐｒ
ｏ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
１４５ １５
０ １５５ ＧＧＡ
ＡＧＴ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＣＴＴ
ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ Ａ
ＴＴ ＡＧＴ ＧＣＴ ７１１Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｖ
ａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ １６０
１６５
１７０ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＡＴ Ａ
ＡＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＴＧＴ ＴＣＴ ＧＧ
Ｔ ＧＴＧ ＴＣＣ ＴＴＡ ＣＡＣ ＣＴＣ ＡＣＡ
７５９Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｈｉ
ｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
１７５ １
８０ １８５ ＣＧ
Ｃ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＴＡ ＡＴＴ
ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＡＣ ＣＴＴ ＡＴＧ
ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ８０７Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ １９０
１９５
２００ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＣＣ
Ａ ＧＣＡ ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ
ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＴＴ ＴＣＡ ８
５５Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ ２０５
２１０
２１５
２２０ ＴＧＣ ＣＡＴ ＴＡＴ ＡＡＡ ＡＡＧ
ＴＡＴ ＣＣＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＴＴ Ｇ
ＣＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＣＡＣ ９０３
Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐ
ｒｏ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙ
ｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ
２２５
２３０ ２３５
ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＴＡ ＧＧＴ ＡＡＧ
ＧＴＡ ＧＴＡ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧＡ Ｇ
ＴＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ９５１Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒ
ｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ ２４０
２４５
２５０ ＣＡＧ ＴＧＧ
ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＧＡ ＣＧＣ ＣＡＧ
ＡＧＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ Ｇ
ＣＴ ＴＴＣ ９９９Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｈ
ｅ ２５５
２６０
２６５ ＴＡＣ ＣＣＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＣＡＣ Ｃ
ＣＡ ＧＴＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＧＴ ＴＴＴ ＧＧ
Ｔ ＧＡＣ ＡＴＡ ＣＴＧ ＧＣＡ １０４７Ｔ
ｙｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ ２７０
２７５
２８０ ＧＣＡ ＡＧＡ ＴＧＴ ＧＴ
Ａ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＧＧ
ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＴＴ
１０９５Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ ２８５
２９０
２９５
３００ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＣＴ
ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＧＣ ＡＡＣ Ｔ
ＴＡ ＴＡＣ ＡＴＴ ＡＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ
１１４３Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
３０５
３１０ ３
１５ ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＡＴ ＧＣ
Ａ ＧＴＴ ＴＣＴ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＴＧＴ
ＡＣＡ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＴＡ １１９１Ｍｅ
ｔ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ
Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ ３
２０ ３２５
３３０ ＧＣＴ ＣＣＧ
ＧＡＴ ＡＴＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＣＣ ＡＴＡ
ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＴＴ Ｃ
ＣＡ ＡＴＴ １２３９Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｉｌ
ｅ ３３５
３４０
３４５ ＣＣＴ ＧＴＴ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＴ Ａ
ＴＧ ＧＴＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡ
Ｔ ＣＡＣ ＡＡＡ ＧＡＡ ＡＣＡ １２８７Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｖａ
ｌ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｈｉｓ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ３５０
３５５
３６０ ＧＡＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＡ
Ｔ ＡＡＧ ＡＣＴ ＴＣＴ ＡＴＴ ＣＴＡ ＣＡＧ
ＣＡＡ ＣＣＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ
１３３５Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ３６５
３７０
３７５
３８０ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＴＴＡ
ＧＡＡ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＡＴ Ｔ
ＣＡ ＣＴＡ ＣＴＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ
１３８３Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
３８５
３９０ ３
９５ ＣＴＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＡ
Ｔ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＧＴＧ ＣＡＴ ＡＡＡ
ＴＡＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＡＣＡ １４３１Ｌｅ
ｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ４
００ ４０５
４１０ ＧＡＡ ＡＡＧ
ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＴＣＡ ＧＡＣ
ＣＴＧ ＧＴＡ ＧＣＣ ＧＡＧ ＡＴＴ ＧＣＡ Ａ
ＡＴ ＧＴＡ １４７９Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａ
ｌ ４１５
４２０
４２５ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＴ Ｃ
ＴＣ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＣＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧ
Ａ ＧＡＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＧＡＡ １５２７Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ ４３０
４３５
４４０ ＣＡＴ ＧＡＧ ＡＧＧ ＧＡ
Ｃ ＡＡＴ ＡＣＴ ＡＴＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＧＡ
ＧＡＣ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＴＴＣ
１５７５Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ４４５
４５０
４５５
４６０ ＣＡＣ ＡＧＡ ＣＴＡ ＧＴＡ
ＴＣＴ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＣＡ Ｇ
ＡＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＴＧ ＴＣＡ
１６２３Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
４６５
４７０ ４
７５ ＴＴＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＴＡ ＣＣ
Ｔ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ＧＡＡ
ＴＣＡ ＧＡＡ ＣＡＣ ＡＣＡ １６７１Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ ４
８０ ４８５
４９０ ＧＧＡ ＧＡＴ
ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＣＡ
ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＴＡ Ｔ
ＡＣ ＴＴＧ １７１９Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａ
ｓｐ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅ
ｕ ４９５
５００
５０５ ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＴＴ Ｔ
ＣＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＣ
Ｔ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＡＣ ＣＴＧ １７６７Ｌ
ｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ ５１０
５１５
５２０ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＣＡ
Ｃ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＧ
ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＡＣ ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＡＣ
１８１５Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ ５２５
５３０
５３５
５４０ ＡＧＣ ＡＡＧ ＴＴＴ ＧＴＴ
ＴＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＴＣ Ｇ
ＧＧ ＣＣＡ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＡＧ
１８６３Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒ
ｏ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ
５４５
５５０ ５
５５ ＡＣＴ ＡＴＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＡＴＡ ＧＡ
Ｔ ＣＣＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＴＧ
ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＣＣ ＡＧＴ １９１１Ｔｈ
ｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ５
６０ ５６５
５７０ ＧＧＧ ＡＡＡ
ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＴＧ ＣＣＡ
ＣＡＴ ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＧＴ ＡＴＡ ＧＡＴ Ａ
ＡＡ ＧＡＴ １９５９Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ ５７５
５８０
５８５ ＧＧＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ Ａ
ＣＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＡ
Ｇ ＧＴＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＴＡ ２００７Ｇ
ｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ５９０
５９５
６００ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＧ
Ｔ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＴＡ
ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＴＧ
２０５５Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｍｅｔ ６０５
６１０
６１５
６２０ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＧＴ
ＧＡＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＣＡＣ ＴＴＣ ＴＧＴ Ｃ
ＡＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＴＧ ＧＣＴ
２１０３Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇ
ｌｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｐｈｃ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒ
ｏ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ
６２５
６３０ ６
３５ ＧＴＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＧ
Ａ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＧＣ ＡＡＴ ２１５１Ｖａ
ｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ ６
４０ ６４５
６５０ ＡＧＴ ＣＧＧ
ＡＴＴ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＣＡ ＣＣＡ
ＡＧＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＣＡ Ｃ
ＡＧ ＴＧＧ ２１９９Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｒ
ｐ ６５５
６６０
６６５ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＣＴ Ｇ
ＧＧ ＧＡＣ ＡＧＣ ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＣＡ Ｇ
ＧＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＴＴ ２２４７Ｇ
ｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ ６７０
６７５
６８０ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＴＴ
Ｇ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＴＧ ＣＣＴ ＣＡＴ ＴＴＧ
ＧＧＣ ＣＡＡ ＴＴＡ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＣＡ
２２９５Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ ６８５
６９０
６９５
７００ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡＡ ＡＡＣ
ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＴＧＴ ＴＴＴ Ａ
ＡＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＡＡ
２３４３Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
７０５
７１０ ７
１５ ＴＴＴ ＧＴＧ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＴＴ ＡＡ
Ｇ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＴＣ ＧＧＡ ＡＧＡ
ＡＡＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＧＣＡ ２３９１Ｐｈ
ｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｈｉｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ ７
２０ ７２５
７３０ ＡＴＴ ＴＣＡ
ＴＡＴ ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＧＴ ＴＴＧ ＣＴＣ
ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＡＣ ＧＧＡ ＡＡＧ Ｃ
ＣＴ ＴＡＣ ２４３９Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａ
ｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｔｙ
ｒ ７３５
７４０
７４５ ＴＴＴ ＧＡＧ ＧＡＣ ＣＡＡ ＧＡＡ Ｃ
ＣＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＴＴ ＧＴＧ ＡＴ
Ｇ ＡＡＣ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＡＴ ２４８７Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｓｎ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ ７５０
７５５
７６０ ＧＧＧ ＧＡＡ ＡＴＴ ＡＴ
Ａ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＴＡ
ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＡＴＧ
２５３５Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｍｅｔ ７６５
７７０
７７５
７８０ ＣＣＴ ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＴＣ
ＡＣＴ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＧ Ａ
ＣＣ ＧＴＧ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ
２５８３Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｖａ
ｌ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ
７８５
７９０ ７
９５ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＧＴ
Ｇ ＴＧＧ ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＧ ＡＣＴ
ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＡ ２６３１Ａｌ
ａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ８
００ ８０５
８１０ ＣＡＴ ＣＧＡ
ＴＣＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＧＣ
ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＴＣ Ａ
ＡＡ ＧＡＡ ２６７９Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ ８１５
８２０
８２５ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＴＴ ＧＴＴ Ｇ
ＡＡ ＡＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＡ
Ａ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ２７２７Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ８３０
８３５
８４０ ＧＡＡ ＴＴＧ ＣＡＧ ＡＡ
Ｇ ＡＴＧ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＡＡ
ＣＴＧ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＣ
２７７５Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ８４５
８５０
８５５
８６０ ＴＣＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＣＣ
ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＣＣ Ｃ
ＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＴＧ
２８２３Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ
８６５
８７０ ８
７５ ＧＴＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＴ
Ｔ ＧＣＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＣＧＧ ＴＧＧ
ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ２８７１Ｖａ
ｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｌｙｓ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ ８
８０ ８８５
８９０ ＧＣＣ ＴＴＴ
ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＧＧＧ ＡＧＣ ＧＧＡ
ＧＧＣ ＴＴＧ ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＧＣ ＡＡＴ Ｔ
ＴＣ ＴＴＣ ２９１９Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌ
ｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈ
ｅ ８９５
９００
９０５ ＧＣＡ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＧＧＣ Ｔ
ＡＴ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＧＧＧ ＴＴＴ ＧＡ
Ｃ ＣＧＣ ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ２９６７Ａ
ｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ９１０
９１５
９２０ ＧＡＧ ＧＧＡ ＡＧＣ
ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＡＧ Ｇ
ＡＴ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＣＣ ＧＡ
Ａ ３０１５Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇ
ｌｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓ
ｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ ９２５
９３０
９３５
９４０ ＧＣＧ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＣ
Ｃ ＧＣＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＣＣＣ ＡＣＡ ＣＣＣ
ＧＣＡ ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＧＡＧＡＴＣＡ
ＡＧ ３０６７ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌ
ａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ９４５
９５０ ＧＣＴＴ
ＴＧＡＣＴＴ ＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡ ＧＡＴＴＴＡＣ
ＣＡＡ ＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡ ＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣ
ＴＴＴＡＧＣＡＣＧＴ ３１２７ ＴＴＡＧＡＧＴ
ＴＴＴ ＧＴＧＴＡＴＴＴＡＡ ＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧ
ＴＡＣＴＡＧＴＣＴＧ ＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧ ＴＡ
ＣＡＣＡＴＴＴＴ ３１８７ ＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴ
ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＧ ＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴ ＣＴ
ＡＧＴＴＧＡＧＧ ＡＧＴＴＴＣＣＴＡＡ ＡＡＧＴＴ
ＣＡＧＡＡ ３２４７ ＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴ ＧＴ
ＣＴＴＴＡＴＡＧ ＧＡＡＣＡＴＡＧＧＡ ＴＡＧＡＧ
ＡＡＧＣＡ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＴ ＴＣＣＡＴＣＡＣ
ＡＣ ３３０７ ＴＡＧＴＡＡＧＴＴＡ ＡＴＧＡＴ
ＧＧＡＡＧ ＧＴＴＴＧＣＴＣＡＴ ＣＴＧＣＡＴＴＴ
ＴＴ ＧＡＧＡＣＴＴＴＴＣ ＴＧＴＡＧＴＴＴＧＴ
３３６７ ＡＡＡＴＡＡＣＣＣＣ ＡＴＴＣＴＣＴＧ
ＣＴ ＴＧＡＡＣＡＣＡＧＴ ＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡ
ＣＡＧＣＡＣＴＴＣＣ ＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧ ３４
２７ ＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧ ＧＴＧＣＣＴＴＴＣＣ
ＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴ ＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧ ＴＧＧ
ＣＡＧＴＡＡＡ ＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴ ３４８７
ＧＴＧＣＴＡＣＡＴＧ ＡＣＧＡＣＡＡＡＧＣ ＴＧＣ
ＴＡＡＡＴＣＴ ＣＣＴＴＣＴＡＴＴＴ ＴＴＴＴＡＡ
ＡＡＴＣ ＡＣＴＡＡＣＡＴＴＡ ３５４７ ＴＡＴ
ＴＧＣＡＡＴＧ ＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡ ＡＡＡＧＡＡ
ＡＧＴＣ ＴＣＴＡＴＴＴＡＡＡ ＴＴＧＴＴＴＴＴＴ
Ｔ ＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴ ３６０７ ＣＴＴＣＴＴ
ＣＡＧＴ ＴＧＡＴＧＴＧＴＴＴ ＴＧＧＧＧＡＴＧＴ
Ｃ ＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧ ＡＴＧＧＴＴＡＣＡＣ Ｔ
ＧＴＴＡＧＡＴＣＡ ３６６７ ＣＴＡＴＴＴＴＣＡ
Ｇ ＡＡＴＣＴＧＡＡＴＧ ＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴ Ａ
ＡＴＡＡＡＧＴＧＴ ＴＴＴＣＡＧＡＧＣＡ ＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡ ３７２７ ＡＡＡＡ
３７３１ 【００４０】配列番号：６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧ ＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣ ＴＧＧ
ＣＴＴＴ ２７【００４１】配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＧＡＣＣＴＣＡＴ ＣＧＴＴＴＴＧＧＴＴ ＧＣＴ
ＧＴＡＧ ２７【００４２】配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＴＡＡＴＴＣＡＣ ＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡ ＣＴＡ
ＣＡＴＴ ２７【００４３】配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＡＣＣＴＴＧＧＴ ＴＧＡＴＣＴＣＡＧＧ ＡＧＧ
ＡＡＧＧ ２７【００４４】
【図１】 ＡＥ−ＩとＢ ・ＰＡＭ−１ のＮ 末端
側のアミノ酸配列の比較とＰＣＲ 用ミックスプライマ
ーの作製領域を示す。
側のアミノ酸配列の比較とＰＣＲ 用ミックスプライマ
ーの作製領域を示す。
【図２】 合成したＰＣＲ 用ミックスプライマー、
Ｐｒｉｍｅｒ−ＡとＰｒｉｍｅｒ−Ｂの塩基配列を示す
。
Ｐｒｉｍｅｒ−ＡとＰｒｉｍｅｒ−Ｂの塩基配列を示す
。
【図３】 ＰＣＲ 反応産物のアガロース電気泳動写
真を示す。
真を示す。
【図４】 ブタ心房アミド化酵素をコードするｃＤＮ
Ａクローンの制限酵素地図を示す。
Ａクローンの制限酵素地図を示す。
【図５】 動物細胞発現ベクターに組み込むｃＤＮＡ
断片をＰＣＲ 法で作製するためのプライマーのデザイ
ンである。
断片をＰＣＲ 法で作製するためのプライマーのデザイ
ンである。
【図６】 発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲ α１１３４
、ｐｃＤＬ−ＳＲ α１２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２
８６２の作製を示す。
、ｐｃＤＬ−ＳＲ α１２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２
８６２の作製を示す。
【図７】 アミド化酵素ｃＤＮＡを含有する発現ベク
ターｐｃＤＬ−ＳＲα１２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２
８６２で形質転換したＣＯＳ１細胞が発現するアミド化
酵素活性を示す。
ターｐｃＤＬ−ＳＲα１２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２
８６２で形質転換したＣＯＳ１細胞が発現するアミド化
酵素活性を示す。
【図８】 アミド化酵素ｃＤＮＡを含有する発現ベク
ターｐｃＤＬ−ＳＲα１１３４、ｐｃＤＬ−ＳＲ α１
２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２で形質転換した各
ＣＯＳ１細胞培養上清のゲルろ過カラム分画におけるア
ミド化酵素活性を示す。
ターｐｃＤＬ−ＳＲα１１３４、ｐｃＤＬ−ＳＲ α１
２９６、ｐｃＤＬ−ＳＲ α２８６２で形質転換した各
ＣＯＳ１細胞培養上清のゲルろ過カラム分画におけるア
ミド化酵素活性を示す。
Claims (11)
- 【請求項１】 ブタ心房アミド化酵素をコードする遺
伝子。 - 【請求項２】 配列番号５に記載の塩基配列で特定さ
れる請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 配列番号５に記載の塩基番号１９６
から３０５７までの２８６２塩基対で特定される請求項
１記載の遺伝子。 - 【請求項４】 配列番号５に記載の塩基番号１９６
から１４９１までの１２９６塩基対で特定される請求項
１記載の遺伝子。 - 【請求項５】 配列番号５に記載の塩基番号１９６
から１３２９までの１１３４塩基対で特定される請求項
１記載の遺伝子。 - 【請求項６】 配列番号５に記載のアミノ酸番号１か
ら９５４ までの９５４ アミノ酸残基で特定される請
求項１記載のアミド化酵素。 - 【請求項７】 配列番号５に記載のアミノ酸番号１か
ら４３２ までの４３２ アミノ酸残基で特定される請
求項１記載のアミド化酵素。 - 【請求項８】 配列番号５に記載のアミノ酸番号１か
ら３７８ までの３７８ アミノ酸残基で特定される請
求項１記載のアミド化酵素。 - 【請求項９】 ブタ心房アミド化酵素をコードする塩
基配列を組み込んだ発現ベクター。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の発現ベクターを導
入した細胞。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の細胞を培養し、
培養物からアミド化酵素を採取することを特徴とするア
ミド化酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3099837A JPH04311386A (ja) | 1991-04-05 | 1991-04-05 | アミド化酵素遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3099837A JPH04311386A (ja) | 1991-04-05 | 1991-04-05 | アミド化酵素遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04311386A true JPH04311386A (ja) | 1992-11-04 |
Family
ID=14257923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3099837A Pending JPH04311386A (ja) | 1991-04-05 | 1991-04-05 | アミド化酵素遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04311386A (ja) |
-
1991
- 1991-04-05 JP JP3099837A patent/JPH04311386A/ja active Pending
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN 150=1988 * |
| BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN 169=1990 * |
| BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN 172-1=1990 * |
| J BIOCHEM 105=1989 * |
| MOL ENDOCRINOL 1=1987 * |
| PROC NARL ACAD SCI USA 86=1989 * |
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