C-ALPAINAS NOVEDOSAS Y SU USO La invención se relaciona a una calpaina CAPN11 de mamífero novedosa, a su síntesis y a su uso. Las calpainas son una superfamilia de las proteinas relacionadas, algunas de las cuales han demostrado actuar como cisteina proteasas dependientes de calcio. Ocho calpainas diferentes se han identificado en mamíferos. Las calpainas forman una familia de cisteina proteasas dependientes de calcio intracelular. Un número incrementado de homólogos calpaina de mamífero se han identificado, y los miembros individuales pueden dividirse en cuatro clases con base en la estructura fisica y las propiedades previstas. La clase A, las "calpainas clásicas" CAPN1, CAPN2, CAPN3 (p94); CAPN8 (nCL-2) y CAPN9 (nCL-4) probablemente tienen mucha actividad de proteasa y son Ca +- dependientes . Consisten de una subunidad de tamaño variable (80 Da) y una subunidad pequeña invariable (30 kDa) . La clase B y D de calpainas, CAPN5 (6, 15) y CAPN7 (8) tienen actividad proteasa pero son muy probablemente Ca2+- independientes; las calpainas clase C, CAPNß, probablemente no tiene actividad proteasa. Las calpainas también pueden dividirse en categorías sobre la base de sus patrones de expresión, con CAPN3, CAPNß, CAPN8 y CAPN9 que muestran algún tejido de especificidad. La función de las calpainas se desconocen aunque se han conectado con un gran número de
ÍAA _-»-..-._-- -_ i _ __». procesos fisiológicos y estados patológicos (revisar en referencia 17). Para clarificar su función e historia evolucionarla es necesario identificar el espectro completo de los miembros de la familia calpaina. 5 La invención se relaciona con el polipéptido CAPNll novedoso que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEC. DE IDENT. No. 2. La proteina CAPNll calpaina novedosa tiene las propiedades típicas de las calpainas que incluyen proteasa
10 potencial y dominios de unión al calcio. Se muestra una distribución de tejido restringida ampliamente y se expresa principalmente en los testículos. Con la ayuda del mapeo de hibridación por radiación, el gen se ha localizado en el cromosoma 6 en una región que se asigna a pl2. El análisis
15 filogenético revela que CAPNll en los mamíferos está más estrechamente relacionado a CAPN1 y CAPN2. Sin embargo, la secuencia CAPNll prevista tiene la homología extensa con la calpaina de pollo µ/m entre las secuencias de calpaina disponibles. De esta manera, CAPNll
20 puede ser la ortología humana de la calpaina µ/m. La descripción de esta calpaina novedosa enfatiza la complejidad de la familia de la calpaina, los miembros de la cual pueden distinguirse sobre la base de la actividad proteasa, dependencia de calcio y expresión de tejido. 25 La secuencia de nucleótido ADNc del gen CAPNll
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contiene 2338 nucleótidos (SEC. DE IDENT. No. 1). La secuencia de ADNc se deriva de un ARNm sencillo mediante amplificación exitosa de la región de codificación presunta completa del ADNc del testículo humano por medio de cebadores de flanqueo. Diversos clones de ADNc han sido completamente secuenciado en el orden para excluir cualesquier artefactos PCR. Existe una estructura de lectura abierta larga que codifica una proteina que tiene 702 aminoácidos (Mr 80 kDa) (Figura 1). La secuencia de aminoácido parece la subunidad larga de los miembros de la familia de la calpaina (Figura 1) . La proteina puede dividirse en los cuatro dominios típicos de calpaina. El dominio II muestra las propiedades del dominio proteasa, y la secuencia de aminoácido prevista tiene los tres residuos de aminoácido (Cysl02, His259 y Asn283) que son parte del sitio activo de la cisteina proteasa (2) . La secuencia de aminoácido de todas las cinco secuencias de Ca -de enlace descritas para CAPN2 (4, 12) se conservan en una cierta extensión (Figura 1). Esta proteina de esta manera probablemente tiene propiedades proteasa y de unión al calcio. La comparación de la secuencia de aminoácido prevista con aquellas de todas las otras calpainas revela la homología de secuencia extensa (57.5%) con una calpaina de pollo µ/m. En las calpainas de mamífero, la similaridad extensa fue con la CAPN1 humana (homología al 54.3%) . La calpaina humana similar menor, con únicamente homología al 18.7%, fue CAPNß. El gen que corresponde a este ADNc ha sido CAPNll designado por el Comité de Nomenclatura de Gen Humano. La secuencia de aminoácido completa de todas las calpainas humanas identificadas tienen análisis filogenético. Los resultados lo hacen posible para clasificar calpainas humanas en cuatro grupos evolucionarlos principales (Figura 2) . El primer grupo está representado por CAPN5, CAPNß, CAPN7 y CAPN8, el segundo por CAPN1 y CAPN2, el tercer grupo por CAPN3 y CAPN9, y el cuarto grupo comprende CAPNll. El análisis filogenético de esta manera sugiere que CAPNll representa una subfamilia de calpaina separada. La expresión de CAPNll en el tejido humano se investigó por Northern y análisis de punto de tinción ARN. De los ARNs de 50 tejidos investigados, el ARNm CAPNll se expresó más fuertemente en los testículos (Figura 3A) . La especificidad de esta señal se confirmó por el análisis de tinción Northern y corresponde a un ARNm aproximadamente 3 kb en dimensión (Figura 3D) . Muchas señales débiles se detectaron en el timo y en la glándula mamaria. La significancia de este hallazgo, sin embargo, no es claro debido a una investigación adicional del ARN de timo por el análisis de tinción Northern de señal no producida, a pesar de la larga exposición de veces (Figura 3D y datos no mostrados) . Debe ser una explicación posible que esta señal débil sea atribuible a hibridización cruzada con ARNms relacionados. El testículo es de esta manera el sitio de expresión principal de CAPNll, aunque seamos incapaces de imposibilitar la posibilidad que el gen se exprese en otros tejidos que no fueron investigados. Se ha determinado en cual de los cromosomas del gen se ubica el CAPNll humano. Se ha asignado por medio de PCR con cebadores que son específicos para la secuencia de nucleótido CAPNll humano, y con el panel de mapeo híbrido de célula de humano/roedor somática, el gen para el cromosoma ß
(Repositorio de Células Correll) . Con la ayuda del mapeo híbrido de radiación que utiliza el panel Stanford G3 de resolución media (Research Genetics Inc.) y la base de datos en el Centro Genoma Humano Stanford (shgc-www.stanford.edu), el gen se ubicó 5 centirayos fuera del marcador SHGC-32834 en este cromosoma (LOD marcador 12.87) . Este marcador se ubicó en el intervalo entre los marcadores DßSlßlß de microsatélite (59. ß cM) y D6S427 (73.9 cM) (7), y un marcador en este intervalo, D6S269, ha sido citogenéticamente asignado a 6pl2 (5) . De esta manera, CAPNll se ubica en 6 cromosomas en la vecindad de pl2. Ningún otro gen de calpaina se ubicó en este cromosoma . La calpaina de pollo µ/m fue el primer miembro de la familia de la calpaina a ser clonado (16) . Originalmente se refirió como calpaina ra, pero se reclasificó después de la
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identificación de otras calpainas de pollo que son muy probablemente ortólogas en las calpainas µ y m de mamífero (18) . Sin embargo, ninguna calpaina µ/m de mamífero ha sido aún determinada. Ya que, sin embargo, CAPNll muestra mayor homología con la calpaina µ/m de pollo que con otras calpainas de mamífero, puede ser el ortólogo del mismo. Existen a la fecha 5 calpainas que muestran un cierto grado de especificidad de tejidos - CAPN3 (músculo de esqueleto) , CAPNß (placenta) , CAPN8 (músculo suave posiblemente) , CAPN9 (estómago e intestino delgado) y CAPNll (testículos). Numerosas proteasas han sido identificadas en el testículo, y se asume que se involucran en procesos tales como la reorganización de tejido (20), la regulación de espermatogénesis (14), penetración de la zona pelúcida por esperma (10) y fertilidad (13) . Sin embargo, muchas de estas actividades son dependientes en las proteasas secretadas, y CAPNll probablemente tienen una ubicación intracelular. En el testículo, esto puede involucrarse en procesos en los cuales las calpainas en otros tejidos se involucran, tales como apóptosis de célula de germen (3) o regulación de factores de transcripción específicos de testículo. Un aspecto adicional de esta invención se relaciona al uso de CAPNll polipéptido para identificar sustancias que son capaces de inhibir la actividad enzimática de este polipéptido, llamada inhibidores calpaina, en particular
.
aquellos inhibidores calpaina que son selectivos para CAPNll.
La selectividad significa que tales inhibidores calpaina inhiben la actividad de CAPNll más que la actividad de otras calpainas mencionadas en lo anterior, en particular preferiblemente por lo menos 10 veces y más preferiblemente
25 veces, más. La actividad enzimática de CAPNll es una actividad proteasa Ca-dependiente . Un aspecto adicional de la invención se relaciona a un método para identificar compuestos que inhiben la actividad enzimática de un polipéptido como se reclamó en la reivindicación 1, que comprende: (a) comparar la magnitud de la actividad enzimática de CAPNll en presencia del compuesto con la magnitud de la actividad enzimática de CAPNll en la ausencia del compuesto y (b) seleccionar los compuestos que alteran la magnitud de la actividad enzimática de CAPNll comparada con la actividad enzimática de CAPNll en la ausencia del compuesto . Los compuestos de inhibición identificados por el método mencionado en lo anterior son adecuados para el tratamiento de trastornos asociados con la unión a una actividad CAPNll no fisiológicamente elevada, tal como la infertilidad en el hombre. La dosificación y el régimen de tratamiento para estos inhibidores debe determinarse por métodos de rutina conocidos por otros inhibidores proteasa . FIGURAS
FIGURA 1. El agrupamiento de la secuencia de aminoácido prevista de CAPNll con otras calpainas humanas. El agrupamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos se llevan a cabo utilizando CLUSTAL W (19). La metionina inicial supuesta para CAPNll (GGAatgG) corresponde a la secuencia de consenso minimo para la traducción de sitio inicial (RNNatgG, dónde R es una purina, Ref. 11) . Los aminoácidos en otras proteinas que son idénticas a aquéllas de CAPNll se matizan. Las rayas indican espacios que se han introducido para maximizar el alineamiento. Las cabezas de flecha señalan a los tres aminoácidos conservados que son parte del sitio activo de la calpaina. Los dominios de enlace de calcio manuales EF potenciales de CAPN8 se subrayan y se numeran consecutivamente. Los dominios arbitrarios de la calpaina se indican. Las secuencias para. CAPN4 y CAPN7 que se han identificado únicamente en ratas y ratones, respectivamente, no se muestran. La secuencia CAPNß publicada no se ha incluido debido a su única secuencia parcial. Los nombres alternativos y los números de acceso para las calpainas agrupadas se indican en la leyenda para la Figura 2. FIGURA 2. El árbol filogenético sin raices de la familia de subunidad larga de calpaina humana. El análisis se llevó a cabo con el programa PAUP, y el árbol se dispuso
--_-_-_-_ -__-- ..._.__• utilizando CLUSTREE del servidor HÚSAR del Deutsche Krebsforschungszentrums, Heidelberg (www.dkfz-heidelberg.de). Las longitudes de las lineas horizontales son proporcionales a las distancias filogenéticas derivadas; las lineas verticales no tienen significancia. 1000 repeticiones tiradas se llevaron a cabo, y los valores se mostraron en los nodos internos. La secuencia CAPN7 se derivó del ratón debido a que únicamente un poco del nucleótido humano y la secuencia de proteina está disponible. El ortólogo humano de hecho existe (véase Ref. 8) de manera que el uso de la secuencia de ratón para esta comparación se justificó. La secuencia CAPN8 humana parcial es la traducción vista del clon AA026030 EST (Hillier et al., 1995, The ashU-Merck EST project, unpublished results) . Una traducción del aminoácido de este clon mostró amplia similaridad con la secuencia CAPN8 de rata. Ningún tiro se llevó a cabo con esta secuencia debido a que es mucho más corta que las otras. De esta manera ninguna comparación sensible del valor girado con los valores de comparación de las secuencias de longitud completa son posibles. La nomenclatura especificada por el Comité de Nomenclatura del Gen Humano se utiliza. Los nombres previos para las diversas calpainas son: CAPN1 - calpaina m, CAPN2 - calpaina m, CAPN3 - p94, nCl-1, CAPN8, nCL-2, CAPN9, nCL-4,. Los números de acceso EMBL para la secuencia calpaina utilizados son: CAPN1 (P17655), CAPN2 (P07384), CAPN3 (P20807), CAPN5 (Y10656), CAPNß (Y12582), CAPN7 (AJ012475) y CAPN9 (AF022799). FIG. 3. La expresión de CAPNll. Una sonda de ADN 32P etiquetada con un segmento de 800 pares de base de la secuencia de codificación de ADNc de CAPNll humano fue hibridizado en una tinción maestra (A) , un filtro de nylon con tinciones de punto de las ARNs a partir de 50 tejidos humanos diferentes o una tinción (D) Northern de tejido múltiple Clontech. Los filtros se lavaron alta severidad ( 6x SSC, 65°C) . El sitio exacto de los diversos ARNs en el filtro con tinciones de punto se muestran esquemáticamente (C) . Los ARNs en la tinción Northern se indican sobre las vias correspondientes. La tinción Northern y la tinción de punto se rehibridizan con sondas de ADN para ubiquitina humana (B) y ß-actina para determinar las cantidades de poli(A+) ARN cargada. Les sitios de los marcadores de tamaño (en kilobases) se indican para la tinción Northern. Los tiempos de exposición son: A, 72 h; B, 24 h; D, 48 h, PBL = leucocitos de sangre periférica.
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LISTA DE SECUENCIA
<110> BASF A tiengesellsc aft
<120> Hoden-spezifisches Calpain <120> Testis specific calpain <130> OZ0050/ <140> <141> <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2338 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5 'UTR <222> (1)..(103) <220> <221> CDS <222> (104)..(2212) <220> <221> 3 'UTR <222> (2213)..(2338) <400> 1 ctccccaggg ccgagtcttc cggagtcagc agagagcctg gatggatcac aggaggataa 60 gcctcggggc tcatgtgcgg agcccacttt tactgatacg gga atg gtg gct cac 115 Met Val Ala His 1 ata aac aac age cgg etc aag gcc aag ggc gtg ggc cag cac gac aac 163 lie Asn Asn Ser Arg Leu Lys Ala Lys Gly Val Gly Gln His Asp Asn 5 10 15 20 gcc cag aac ttt ggt aac cag age ttt gag gag ctg cga gca gcc tgt 211 Ala Gln Asn Phe Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Leu Arg Ala Ala Cys 25 30 35 cta aga aag ggg gag etc ttc gag gac ccc tta ttc cct gct gaa ccc 259 Leu Arg Lys Gly Glu Leu Phe Glu Asp Pro Leu Phe Pro Ala Glu Pro 40 45 50 age tea ctg ggc ttc aag gac ctg ggc ccc aac tcc aaa aat gtg cag 307 Ser Ser Leu Gly Phe Lys Asp Leu Gly Pro Asn Ser Lys Asn Val Gln 55 60 65 aac ate tcc tgg cag cgg ccc aag gat ate ata aac aac cct cta ttc 355 Asn lie Ser Trp Gln Arg Pro Lys Asp lie lie Asn Asn Pro Leu Phe
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Leu Gln Thr He Gly Phe Val Leu Tyr Ala Val 425 430 435 cea aaa gag ttt cag aac att cag gat gtc cac ttg aag aag gaa ttc 1459 Pro Lys Glu Phe Gln Asn He Gln Asp Val His Leu Lys Lys Glu Phe 440 445 450 ttc acg aag tat cag gac cac ggc ttc tea gag ate ttc acc aac tea 1507 Phe Thr Lys Tyr Gln Asp His Gly Phe Ser Glu He Phe Thr Asn Ser 455 460 465 cgg gag gtg age age caa etc cgg ctg cct ccg ggg gaa tat ate att 1555 Arg Glu Val Ser Ser Gln Leu Arg Leu Pro Pro Gly Glu Tyr He He 470 475 480 att ccc tcc ace ttt gag cea cac aga gat gct gac ttc ctg ctt cgg 1603 He Pro Ser Thr Phe Glu Pro His Arg Asp Ala Asp Phe Leu Leu Arg 485 490 495 500 gtc ttc acc gag aag cac age gag tea tgg gaa ttg gat gaa gtc aac 1651 Val Phe Thr Glu Lys His Ser Glu Ser Trp Glu Leu Asp Glu Val Asn 505 510 515 tat gct gag caa etc caa gag gaa aag gtc tet gag gat gac atg gac 1699 Tyr Ala Glu Gln Leu Gln Glu Glu Lys Val Ser Glu Asp Asp Met Asp 520 525 530 cag gac ttc cta cat ttg ttt aag ata gtg gca gga gag ggc aag gag 1747 Gln Asp 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<210> 2 <211> 702 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Ala His He Asn Asn Ser Arg Leu Lys Ala Lys Gly Val Gly 1 5 10 15 Gln His Asp Asn Ala Gln Asn Phe Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Leu 20 25 30 Arg Ala Ala Cys Leu Arg Lys Gly Glu Leu Phe Glu Asp Pro Leu Phe 35 40 45 Pro Ala Glu Pro Ser Ser Leu Gly Phe Lys Asp Leu Gly Pro Asn Ser 50 55 60
-____,__ -ni-* ».._J._ __-_.-._._-__. __ _J_--t_E__-. .... . _________*a Lys Asn Val Gln Asn He Ser Trp Gln Arg Pro Lys Asp He He Asn 65 70 75 80
Asn Pro Leu Phc_ He Met Asp Gly He Ser Pro Thr Asp He Cys Gln 85 90 95
Gly He Leu Gl? Asp Cys Trp Leu Leu Ala Ala He Gly Ser Leu Thr 100 105 110 Thr Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Arg Val Val Pro Arg Gly Gln Ser Phe 115 120 125 Lys Lys Asn Tyr Ala Gly He Phe His Phe Gln He Trp Gln Phe Gly 130 135 140 Gln Trp Val Asn Val Val Val Asp Asp Arg Leu Pro Thr Lys Asn Asp 145 150 155 160
Lys Leu Val Phe Val His Ser Thr Glu Arg Ser Glu Phe Trp Ser Ala 165 170 175
Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Ser Gly Ser Tyr Glu Ala Leu 180 185 190 Ser Gly Gly Ser Thr Met Glu Gly Leu Glu Asp Phe Thr Gly Gly Val 195 200 205 Ala Gln Ser Phe Gln Leu Gln Arg Pro Pro Gln Asn Leu Leu Arg Leu 210 215 220 Leu Arg Lys Ala Val Glu Arg Ser Ser Leu Met Gly Cys Ser He Glu 225 230 235 240
Val Thr Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Met Thr Asp Lys Met Leu Val 245 250 255
Arg Gly Hxs Ala Tyr Ser Val Thr Gly Leu Gln Asp Val His Tyr Arg 260 265 270 Gly Lys Met Glu Thr Leu He Arg Val Arg Asn Pro Trp Gly Arg He 275 280 285 Glu Trp Asn Gly Ala Trp Ser Asp Ser Ala Arg Glu Trp Glu Glu Val 290 295 300 Ala Ser Asp He Gln Met G n Leu Leu His Lys Thr Glu Asp Gly Glu 305 310 315 320
Phe Trp Met Ser Tyr Gln Asp Phe Leu Asn Asn Phe Thr Leu Leu Glu 325 330 335
He Cys Asn Leu Thr Pro Asp Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Lys Ser Tyr 340 345 350 Trp His Thr Thr Phe Tyr Glu Gly Ser Trp Arg Arg Gly Ser Ser Ala 355 360 365 Gly Gly Cys Arg Asn His Pro Gly Thr Phe Trp Thr Asn Pro Gln Phe 370 375 380
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Lys He Ser Leu Pro Glu Gly Asp Asp Pro Glu Asp Asp Ala Glu Gly 385 390 395 400
Asn Val Val Val Cys Thr Cys Leu Val Ala Leu Met Gln Lys Asn Trp 405 410 415
Arg His Ala Arg Gln Gln Gly Ala Gln Leu Gln Thr He Gly Phe Val 420 425 430 Leu Tyr Ala Val Pro Lys Glu Phe Gln Asn He Gln Asp Val His Leu 435 440 445 Lys Lys Glu Phe Phe Thr Lys Tyr Gln Asp His Gly Phe Ser Glu He 450 455 460 Phe Thr Asn Ser Arg Glu Val Ser Ser Gln Leu Arg Leu Pro Pro Gly 465 470 475 480
Glu Tyr He He He Pro Ser Thr Phe Glu Pro His Arg Asp Ala Asp 485 490 495
Phe Leu Leu Arg Val Phe Thr Glu Lys His Ser Glu Ser Trp Glu Leu 500 505 510 Asp Glu Val Asn Tyr Ala Glu Gln Leu Gln Glu Glu Lys Val Ser Glu 515 520 525 Asp Asp Met Asp Gln Asp Phe Leu His Leu Phe Lys He Val Ala Gly 530 535 540 Glu Gly Lys Glu He Gly Val Tyr Glu Leu Gln Arg Leu Leu Asn Arg 545 550 555 560
Met Ala He Lys Phe Lys Ser Phe Lys Thr Lys Gly Phe Gly Leu Asp 565 570 575
Ala Cys Arg Cys Met He Asn Leu Met Asp Lys Asp Gly Ser Gly Lys 580 585 590 Leu Gly Leu Leu Glu Phe Lys He Leu Trp Lys Lys Leu Lys Lys Trp 595 600 605 Met Asp He Phe Arg Glu Cys Asp Gln Asp His Ser Gly Thr Leu Asn 610 615 620 Ser Tyr Glu Met Arg Leu Val He Glu Lys Ala Gly He Lys Leu Asn 625 630 635 640
Asn Lys Val Met G n Val Leu Val Ala Arg Tyr Ala Asp Asp Asp Leu 645 650 655
He He Asp Phe Asp Ser Phe He Ser Cys Phe Leu Arg Leu Lys Thr 660 665 670 Met Phe Thr Phe Phe Leu Thr Met Asp Pro Lys Asn Thr Gly His He 675 680 685 Cys Leu Ser Leu Glu Gln Trp Leu Gln Met Thr Met Trp Gly 690 695 700