KR20020011140A - 신규 칼파인 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 칼파인 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 칼파인 및 그의 용도{Novel Calpains and Their Use}

본 발명은 신규 포유류 칼파인인 CAPN11, 그의 합성 및 그의 용도에 관한 것이다.

칼파인은 관련 단백질들의 거대족으로, 그 중 일부 단백질은 칼슘-의존성 시스테인 프로테아제로서 작용하는 것이 입증되었다. 8가지 상이한 칼파인이 포유동물에서 확인되었다.

칼파인은 세포내 칼슘-의존성 시스테인 프로테아제의 족을 형성한다. 포유류에서 확인된 칼파인 동족체의 수가 증가하고 있으며, 개개의 구성원들은 물리적 구조 및 예상되는 특성에 기초하여 4개의 클래스로 분류된다. 클래스 A는 "고전적 칼파인 (classical calpains)"으로 CAPN1, CAPN2, CAPN3 (p94), CAPN8 (nCL-2) 및 CAPN9 (nCL-4)가 있고, 이들 모두는 프로테아제 활성이 있으며 Ca²⁺에 의존적이다. 이들은 가변적인 크기의 서브유닛 (80kDa)과 불변의 작은 서브유닛 (30kDa)으로 이루어져 있다. 클래스 B 및 D의 칼파인인 CAPN5 (6, 15) 및 CAPN7 (8)은 프로테아제 활성은 있으나 거의 Ca²⁺에 독립적이다. 클래스 C의 칼파인인 CAPN6은 프로테아제 활성이 없는 것 같다. 또한, 칼파인은 그들의 발현 패턴에 따라 몇가지 카테고리로 분류되는데, CAPN3, CAPN6, CAPN8 및 CAPN9는 약간의 조직 특이성을 나타낸다. 비록 칼파인이 다수의 생리적 과정 및 병리적 증상과 관련된 것으로 밝혀졌지만 (참고문헌 17 참조), 이들의 기능은 알려져 있지 않다. 칼파인의 기능 및 진화적 역사를 밝혀내기 위해서는 칼파인 족 구성원들의 전체 범위를 확인해야 한다.

본 발명은 서열 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는 신규 폴리펩티드인 CAPN11에 관한 것이다.

신규 칼파인 단백질인 CAPN11은 잠재적 프로테아제 활성 및 칼슘-결합 도메인을 비롯한 칼파인의 전형적인 특성을 가진다. 이 단백질은 매우 제한된 조직 분포를 나타내며 주로 정소에서 발현된다. 방사선 하이브리드 매핑 (radiation hybrid mapping)의 도움으로, CAPN11의 유전자가 6번 염색체에서 p12로 할당된 영역에 위치하는 것으로 나타났다. 계통발생학적 분석 결과, 포유류의 CAPN11은 CAPN1 및 CAPN2와의 연관관계가 가장 높은 것으로 밝혀졌다.

그러나, 추정된 CAPN11 서열은 입수가능한 칼파인 서열 중에서 닭의 칼파인 μ/m과 가장 상동성이 높았다. 따라서, CAPN11은 μ/m 칼파인에 대한 인간 오르토로그일 것이다. 이 신규 칼파인에 대한 그러한 발견은, 그 구성원들이 프로테아제 억제, 칼슘 의존성 및 조직 발현에 기초하여 구별되는 칼파인 족이 매우 복잡함을 거듭 보여준다.

CAPN11 유전자의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 2338개의 뉴클레오티드를 함유한다 (서열 1). 이 cDNA 서열은 단일 mRNA 로부터 인접 프라이머에 의해 인간 정소 cDNA로부터의 온전한 추정 코딩 영역을 성공적으로 증폭시킴으로써 유도되었다. 몇개의 cDNA 클론을 완전히 서열분석하여 PCR 인공변이도 모두 배제하였다.

CAPN11에는 702개의 아미노산을 갖는 단백질 (분자량 80kDa)을 코딩하는 큰 오픈 리딩 프레임이 존재한다 (도 1). 이 아미노산 서열은 칼파인 족 구성원의 큰 서브유닛과 유사하다 (도 1). 이 단백질은 칼파인에 전형적인 4개의 도메인으로 나누어질 수 있다. 도메인 Ⅱ는 프로테아제 도메인의 특성을 나타내고, 추정 아미노산 서열에는 시스테인 프로테아제 활성 부위의 일부인 3가지 아미노산 잔기 (Cys102, His259 및 Asn283)가 있다 (2). CAPN2에 대해 기재된 Ca²⁺-결합 서열 5가지 모두의 아미노산 서열 (4, 12)은 어느정도 보존적이다 (도 1). 따라서, 이 단백질은 프로테아제 활성 및 칼슘-결합 특성을 가질 것이다. 추정 아미노산 서열을 다른 모든 칼파인 서열과 비교한 결과, 닭의 칼파인 μ/m에 대해 가장 높은 서열 상동성 (57.5％)이 나타났다. 포유류 칼파인에 있어서는 인간 CAPN1과 가장 유사성이 높았다 (54.3％의 상동성). 가장 유사성이 낮은 것은 CAPN6으로, 상동성이 단지 18.7％였다. 이 cDNA에 상응하는 유전자는 인간 유전자 명명 위원회 (Human Gene Nomenclature Committee)에서 CAPN11이라 명명하였다.

확인된 모든 인간 칼파인의 온전한 아미노산 서열에 대해 계통발생학적 분석을 수행하였다. 그 결과, 인간 칼파인을 진화학상의 4가지 주요 군으로 분류할 수 있었다 (도 2). 제1 군에는 CAPN5, CAPN6, CAPN7 및 CAPN8이 있고, 제2 군에는 CAPN1 및 CAPN2가 있으며, 제3 군에는 CAPN3 및 CAPN9가 있고, 제4 군에는 CAPN11이 포함된다. 따라서, 계통발생학적 분석은 CAPN11이 별도의 칼파인 하위 족 (subfamily)임을 시사한다.

인간 조직에서의 CAPN11의 발현은 노던-블롯 (Northern blot) 및 RNA 도트-블롯 (dot-blot) 분석에 의해 조사하였다. 조사된 50개 조직의 RNA 중에서, CAPN11의 mRNA는 주로 정소에서 강력하게 발현되었다 (도 3A). 이 신호의 특이성은 노던 블롯 분석에 의해 확인하였고, 그 크기가 약 3 kb의 mRNA에 상응하였다 (도 3D). 매우 약한 신호가 흉선 및 유선에서 검출되었다. 이 발견의 의미는 불분명한데, 이는 흉선 RNA를 노던 블롯 분석으로 추가 조사하였을 때 오랜 노출 시간에도 불구하고 신호가 나타나지 않았기 때문이다 (도 3D, 데이타 미기재). 이에 대해서는 관련 mRNA와의 교차-혼성화 (cross-hybridization)에 의해 약한 신호가 발생했다고 설명할 수 있다. 따라서, 본 발명자들이 조사하지 않은 다른 조직에서 CAPN11 유전자가 발현될 가능성을 배제할 수는 없지만, CAPN11이 주로 발현되는 부위는 정소이다.

본 발명자들은 어느 염색체에 인간 CAPN11 유전자가 위치하는지 조사하였다. 본 발명자들은 인간 CAPN11 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR과 인간/설치류의 체세포 하이브리드 매핑 패널 (somatic human/rodent cell hybrid mapping panel)에 의해 상기 유전자가 6번 염색체에 위치함을 알아냈다 (코렐 세포 저장소; Correll Cell Repositories). 중간 해상도의 스탠포드 G3 패널 (Research Genetics Inc.)를 이용한 방사선 하이브리드 매핑과 스탠포드 인간 게놈 센터의 데이타베이스 (shgc-www.stanford.edu)의 도움을 받아, 이 유전자가 상기 염색체상에서 SHGC-32834 마커로부터 5 센티레이만큼 떨어져 있음을 알아냈다 (LOD 점수 12.87). 이 마커는 마이크로새텔라이트 마커 (microsatellite marker)인D6S1616 (59.6 cM)과 D6S427 (73.9 cM) 사이에 위치하며 (7), 그 사이의 마커인 D6S269는 세포유전학적으로 6p12에 위치하는 것으로 밝혀졌다 (5). 따라서, CAPN11은 6번 염색체의 p12 부근에 위치한다. 이 염색체에는 다른 어떤 칼파인 유전자도 존재하지 않는다.

닭의 μ/m 칼파인은 클로닝된 칼파인 족의 제1 구성원이었다 (16). 이 칼파인은 처음에 m 칼파인이라 불리웠으나, 나중에 포유류의 μ 및 m 칼파인에 대한 오르토로그일 가능성이 높은 닭의 다른 칼파인이 확인된 후에 다시 분류되었다 (18). 그러나, 아직 포유류의 μ/m 칼파인은 결정되지 않았다. 그러나, CAPN11이 다른 포유류 칼파인보다 닭의 μ/m 칼파인에 높은 상동성을 나타내기 때문에, CAPN11은 그의 오르토로그일 것이다.

현재까지 특정한 정도의 조직 특이성을 나타내는 칼파인은 5가지이다: CAPN3 (골격근), CAPN6 (태반), CAPN8 (아마도 평활근), CAPN9 (위 및 소장) 및 CAPN11 (정소). 정소에서 무수한 프로테아제가 확인되었고, 이들이 조직 재구성 (20), 정자생성의 조절 (14), 정자에 의한 투명대의 투과 (10) 및 수정 (13)과 같은 과정에 관련되어 있는 것으로 가정하고 있다. 그러나, 이들 활성 중 다수는 분비 프로테아제에 의존적인데, CAPN11은 세포내에 위치할 가능성이 높다. 정소에서, CAPN11은 생식세포의 아팝토시스 (3) 또는 정소-특이적 전사 인자의 조절과 같이 다른 조직에서 칼파인이 관여하는 과정에 관여할 것이다.

본 발명의 다른 측면은 상기 폴리펩티드의 효소 활성을 억제할 수 있는 물질 (칼파인 억제제라 불리움), 특히 CAPN11에 선택적인 칼파인 억제제를 확인하는데있어서 CAPN11 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 선택적이라는 것은 그 칼파인 억제제가 상기 기재된 다른 칼파인의 활성보다 CAPN11의 활성을 더 억제, 특히 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 25배 이상 억제하는 것을 의미한다. CAPN11의 효소 활성은 Ca-의존적 프로테아제 활성이다.

본 발명의 다른 측면은 제1항에 청구된 폴리펩티드의 효소 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(a) 화합물 존재하의 CAPN11 효소 활성 정도를 화합물 부재하의 CAPN11 효소 활성 정도와 비교하는 단계, 및

(b) 상기 화합물 부재하의 CAPN11 효소 활성에 비해 CAPN11의 효소 활성 정도를 변화시키는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.

상기 기재된 방법에 의해 확인된 억제 화합물은 사람의 불임과 같이 비생리학적으로 증가된 CAPN11 활성과 관련되거나 이와 연계된 질환의 치료에 적합하다.

이들 억제제에 대한 투여량 및 치료 방법은 다른 프로테아제 억제제에 대해 공지된 통상의 방법에 의해 결정할 수 있다.

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도 1은 CAPN11의 추정 아미노산 서열을 다른 인간 칼파인과 그룹화한 것이다. 아미노산 서열 여러 개를 그룹화하는 것은 클러스탈 더블유 (CLUSTAL W)(19)를 이용하여 수행하였다. CAPN11에 대해 추정된 개시 메티오닌 (GGAatgG)은 번역 개시 부위에 대한 최소 컨센서스 서열 (RNNatgG, 여기서 R은 푸린임; 참고문헌 11)에 상응한다. CAPN11과 동일한 다른 단백질의 아미노산은 배경이 어둡게 나타나 있다. 대시 기호 (-)는 정렬을 최대화하기 위해 도입된 갭 (gap)을 나타낸다. 화살표 머리는 칼파인 활성 부위의 일부인 보존적 아미노산 3개를 가리킨다. CAPN8의 잠재적 EF-핸드 칼슘-결합 도메인에는 밑줄이 그어져 있으며, 일련 번호를 기입하였다. 칼파인 도메인을 임의로 표시하였다. 단지 쥐 및 생쥐에서만 확인된 CAPN4 및 CAPN7의 서열은 나타나 있지 않다. 공개된 CAPN6 서열은 부분 서열이기 때문에 포함시키지 않았다. 그룹화된 칼파인에 대한 다른 명칭 및 고유번호는 도 2의 설명 부분에 기재되어 있다.

도 2는 인간 칼파인의 큰 서브유닛 족에 대한 기원이 표시되지 않은 계통발생학적 계통수 (phylogenetic tree)이다. 분석은 포프 (PAUP) 프로그램으로 수행하였고, 계통수는 도이치 크렙스포르슝스첸트룸스 (Deutsche Krebsforschungszentrums, Heidelberg; www.dkfz-heidelberg.de)의 후사 (HUSAR)서버로부터 클러스트리 (CLUSTREE)를 이용하여 정렬하였다. 평행선의 길이는 유래된 계통발생학적 거리에 비례하며, 수직선은 아무 의미가 없다. 부트스트랩 입력을 1000회 반복 수행하여 측정값을 내부 노드에 나타냈다. CAPN7의 서열은 생쥐로부터 유도되었는데, 이는 입수가능한 인간 뉴클레오티드 및 단백질 서열이 거의 없었기 때문이다. 사실상 인간 오르토로그가 존재 (참고문헌 8 참조)하기 때문에, 비교를 위해 생쥐 서열을 이용하는 것은 정당하다. 인간 CAPN8의 부분 서열은 EST 클론 AA026030호 (Hillier et al., 1995, The WashU-Merck EST project, 비공개 결과임)에 대한 예상 번역물이다. 이 클론의 아미노산 번역물은 쥐의 CAPN8 서열과 매우 높은 유사성을 나타내었다. 이 서열은 다른 서열에 비해 훨씬 짧기 때문에, 부트스트랩으로 입력하지 않았다. 따라서, 부트스트랩 값을 전장 서열의 비교값과 인지가능하게 비교하는 것은 불가능했다. 인간 유전자 명명 위원회에 의해 지정된 명명법을 사용하였다. 다양한 칼파인에 대한 기존의 명칭은, CAPN1이 m 칼파인이고, CAPN2가 m 칼파인이며, CAPN3가 p94, nCL-1이고, CAPN8이 nCL-2이며, CAPN9가 nCL-4이다. 사용된 칼파인 서열에 대한 엠블 (EMBL) 고유번호는 CAPN1이 P17655, CAPN2가 P07384, CAPN3가 P20807, CAPN5가 Y10656, CAPN6가 Y12582, CAPN7이 AJ012475, CAPN9이 AF022799이다.

도 3은 CAPN11의 발현을 나타낸다. 800 염기쌍 단편으로 이루어진 인간 cDNA 코딩 서열의³²P-표지된 DNA 프로브를 마스터 블롯 (A), 50가지 상이한 인간 조직 RNA의 도트-블롯을 위한 나일론 필터, 또는 클론테크 (Clontech)의 다수 조직노던 블롯 (D)에 혼성화시켰다. 필터를 매우 엄격하게 (6x SSC, 65℃) 세척하였다. 도트-블롯 상의 다양한 RNA에 대한 정확한 위치를 모식적으로 나타내었다 (C). 노던 블롯 상의 RNA는 상응하는 레인 위에 표시하였다. 도트-블롯 및 노던 블롯을 인간 유비퀴틴 (B) 및 β-액틴에 대한 DNA 프로브로 다시 혼성화하여 로딩된 폴리(A+) RNA의 양을 측정하였다. 크기 마커 (kb 단위)의 위치는 노던 블롯에 대해 표시되어 있다. 노출 시간은 A가 72시간, B가 24시간, D가 48시간이었으며, PBL은 말초 혈액 백혈구를 의미한다.

Claims (6)

1. 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
2. 제1항에 청구된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
3. 서열 1의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열.
4. 제1항에 청구된 폴리펩티드의, 그 폴리펩티드의 효소 활성을 억제할 수 있는 물질을 확인함에 있어서의 용도.
5. (a) 화합물 존재하의 CAPN11 효소 활성 정도를 화합물 부재하의 CAPN11 효소 활성 정도와 비교하는 단계, 및

   (b) 상기 화합물 부재하의 CAPN11 효소 활성에 비해 CAPN11의 효소 활성 정도를 변화시키는 화합물을 선별하는 단계

   를 포함하는, 제1항에 청구된 폴리펩티드의 효소 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 방법.
6. 제5항에 청구된 방법에 의해 확인된 화합물의, 사람의 불임을 치료함에 있어서의 용도.