KR20040055733A - 골관절염에 관련된 조성물 및 방법 - Google Patents

골관절염에 관련된 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20040055733A
KR20040055733A KR10-2003-7011506A KR20037011506A KR20040055733A KR 20040055733 A KR20040055733 A KR 20040055733A KR 20037011506 A KR20037011506 A KR 20037011506A KR 20040055733 A KR20040055733 A KR 20040055733A
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홍웨이 장
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콘드로진 인코포레이티드
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Abstract

발명은 하기 발생 및 질병 단계로부터 연골세포에 발현되는 한개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공한다: 태아, 정상, 마일드, 골관절염, 온건한 골관절염, 현저한 골관절염. 발명은 또한 이러한 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 임의의 조합을 포함하는 배열 및 조성물에 관한 것이다. 발명은 또한 골관절염을 진단하기 위해 발명의 배열을 사용하는 방법을 제공한다. 발명은 또한 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현 레벨을 변경하거나 또는 콘드로라이트의 동화작용 레벨을 변경하는 치료제를 확인하는 방법을 제공한다.

Description

골관절염에 관련된 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO OSTEOARTHRITIS}
태아 형성중, 관절 연골은 초기에 중배엽성 응축의 중간 구역으로부터 유도된다. 중배엽성 세포는 함께 떨기를 형성하고, 메트릭스 단백질을 합성한다. 메트릭스의 축적이, 모양이 구형이고 그리고 이제 연골세포로 명명되는 세포를 분할할 때, 이 조직은 연골로서 인식된다. 연골 형성과 성장중, 연골세포는 급격하게 증식하고, 그리고 큰 부피의 메트릭스를 형성한다. 골격 성숙전, 연골세포는 대사 활성의 최고 수준에 있게된다. 골격 성숙에 도달함에 따라, 연골세포 대사 활성의 속도와 세포분열의 속도는 감소한다. 골격 성숙 종료 후, 대부분의 연골 세포는 분할하지 않지만, 그러나 콜라겐, 프로토글리칸 및 다른 비콜라겐 단백질과 같은 메트릭스 단백질의 합성을 계속한다(1,2).
모든 살아 있는 조직과 같이, 관절 연골은, "늙은" 세포와 메트릭스 성분이 제거되고(이화작용 활성), 그리고 "새로운" 세포와 분자들이 생산되는(동화작용 활성) 재생과정을 계속적으로 거친다. 대부분의 조직과 비교하여, 관절 연골에서 이화/동화 턴오버(turnover)의 속도는 낮다. 성숙한 연골의 구조적 완전성의 장기간 유지는 메트릭스 합성과 퇴화의 적절한 밸런스에 의존한다. 연골 세포는 그들의 환경으로부터의 화학 및 기계적 자극에 대한 대응에 의해서 메트릭스 평형을 유지한다. 이들 자극에 대한 적절하고 효과적인 연골세포 반응은 연골 항상성에 필수적이다. 부적절한 이화작용 활성 또는 과도한 동화작용 활성을 통한 항상성의 파괴는 연골 퇴화와 골관절염에 이르게 된다(3). 손상되거나 이화작용 활성을 증가시키는 대부분의 조직은 조직 치료를 가능하게 하는 증가된 동화 활성 응답을 탑재할 수 있다. 불행하게도, 연골세포는 연골 메트릭스의 손실 또는 손상에 대한 응답에서 타입 II 콜라겐 및 프로토글리칸의 합성을 증가시키고, 그리고 이들의 동화작용 활성을 상승-조절하는 매우 제한적인 능력을 가진다. 이러한 연골세포의 기본적인 한계는 골관절염을 고치고 예방할 수 있는 치료법의 개발을 배제하는 핵심 문제점이다. 또한, 초기 골관절염을 검출하는 최종 진단 테스트와, 환자의 치료법에 대한 반응을 효과적으로 모니터링에 하는 예측 테스트에 대한 요구가 있다.
관절 통증은 초기 골관절염의 가장 통상적인 증상이다. 통증은 수일에서 수주까지 발작적으로 지속되고, 동시에 간헐적이다. 관절의 발적(redness)과 부종이 통상적이지는 않더라고, 관절은 골관절염의 발진 중 부드러워지는 경향이 있다.
"마일드" 또는 "초기 상태 골관절염"은 진단하기가 어렵다. 의사들은 마일드한 골관절염을 진단하기 위해서 초기에 환자의 병력과 물리적 시험에 의존한다. X-레이는 관절 연골에서 근원적이 초기 변화를 보여주기 못한다. 초기 상태의 골관절염의 진단을 확정하는데 사용되는 인식된 생화학적 마커가 없다.
X-레이 변화는 중간정도의 골관절염을 진단한다. 통상적인 관절의 X-레이는 잘 보존된 대칭적인 관절 공간을 보여준다. 골관절염을 가진 환자의 X-레이에서 보여지는 변화는 새로운 뼈의 형성(골의 외방증식), 좁은 관절 공간, 및 경화증(뼈 농밀화)을 포함한다. 현단계에서, "중간정도 골관절염"의 진단을 확인하기 위해 사용되는 인식된 생화학적 마커는 없다.
심각한 골관절염을 가진 관절의 병리학적 시험은 무름, 관절 변형, 및 운동성의 손실을 보여준다. 시험 중 수동적인 관절 움직임은 관절 움직임에 따라서 뼈와 뼈의 연삭 또는 염발음을 유도해낸다. 새로운 뼈 형성(골의 외방증식)은 명백하다. 다시, " 심각한 골관절염"의 진단을 확인해줄 인식된 생화학적 마커가 없다.
"골관절염" 은 가장 흔한 만성 관절 질병이다. 이것은 진행성 퇴화와 연골의 최종적인 손실로 특징지어진다. 현재, 골관절염의 코스를 변형시킬 효과적인 치료법에 대한 필요성이 있다. 더구나, 적어도 부분적으로 골관절염 질병 과정을 예방, 변형 또는 치료함에 있어서의 발전여부는 연골에서의 근본적인 이화 및 동화 공정의 분자 메카니즘의 이해에 달려있다. 세포성 기능이 실질적으로 세포를 발현하는 염색체에 의해서 결정되기 때문에, 상이한 발달 및 질병단계에서 관절 연골에서 발현된 유전자를 규명하는 것은 결과적으로 연골 형성, 손상, 질병 및 치료에 관련된 메카니즘과 분자에 있어서 새로운 통찰을 제공할 것이다.
추정적으로 보통 및 심각한 골관절염 인간 연골조직으로부터의 cDNA 라이브러리가 구축되었다(Kumar et al., 46th Annual Meeting, Orthopaedic Res. Soc.,Abstract, p. 1031). 그러나, 이 작업은 골관절염 인간 연골(마일드, 중간, 현저 및 심각한)의 상이한 심각성으로부터의 연골세포 유전자 발현의 상이성을 적절하게 발표하지 못했다. 또한, "보통 연골" 시료는 사망후 24 시간이상 경과된 사망한 공급원으로부터 얻어졌다. 그래서, 이 cDNA 라이브러리는 통상의 연골세포 유전자 발현을 진실되게 반영하지 못하는데, 이는 채취된 관절에 대해 관류의 중단후 RNA 의 급격한 분해가 발생하기 때문인데, 이는 하기에서 나타난것과 같이 개코원숭이 연구에서 보여졌다.
발명의 요약
본 발명은 인간 태아 관절 연골에 대한 하나이상의 유전자 발현의 프로파일에 관한 것이며, 그리고 정상, 마일드, 중간, 현저 및 심각한 골관절염 개체의 연골에 관한 것이며, 그리고 연골 손상, 치료 및 질병 진행에서 중요한 역할을하는 유전자를 밝히는 방법에 관한 것이다. 성인 연골세포에서의 태생적으로 낮은 이화작용 활성이 주어지기 때문에, 성인이 아닌 태아 연골세포에 의해서 발현되는 중요한 복제 및/또는 이화작용 유전자의 규명은 성인 연골 손상 및 골관절염에 대한 신규한 질병 변형 치료법을 개발하는데 중요한 의미를 가진다.
본 발명은 한편으로, 풍부한 연골세포 또는 연골세포-특이적 폴리뉴클레오티드 서열을 분리하는 것이다.
한 실시예에서, 도 6 에 규정된 유전자 1 - 5807에 상응하는 도 6A에 규명된 서열과 도 13 에서 확인된 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열이 분리되었다.
다른 실시예에서, 도 6 의 유전자 1 - 5807 에 상응하는 도 6A 에서 확인된 서열과 도 13 에서 확인된 서열로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 구축된다.
다른 실시예에서, 상기 벡터를 포함하는 숙주세포가 구축된다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나이상의 풍부한 연골세포 또는 연골세포-특이적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나이상의 (a) 태아, (b)정상, (c)마일드 골관절염, (d)중간정도의 골관절염, (e) 현저한 골관절염, 또는(f)심각한 골관절염 연골 시료로부터 분리된 풍부한 연골 세포 또는 연골 세포-특이적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 실시예는, 여기서 기술된 것과 같이 태아 cDNA 라이브러리로부터 분리된 도 6 B 에서 확인된 서열의 그룹으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예는, 여기서 기술된 것과 같이 태아 cDNA 라이브러리로부터 분리된 도 6 C 에서 확인된 서열의 그룹으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예는, 여기서 기술된 것과 같이 태아 cDNA 라이브러리로부터 분리된 도 6 D 에서 확인된 서열의 그룹으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예는, 여기서 기술된 것과 같이 태아 cDNA 라이브러리로부터 분리된 도 6 E 에서 확인된 서열의 그룹으로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예는, 도 6B, 6C, 6D, 및 6E 에서 확인된 서열의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 정상인 개체로부터의 연골과 관련하여 마일드 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리된다.
본 발명의 다른 실시예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 정상인 개체로부터의 연골과 관련하여 심각한 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리된다.
본 발명의 다른 실시예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 정상인 개체로부터의 연골과 관련하여 중간정도 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리된다.
본 발명의 다른 실시예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열중 적어도 하나는 정상인 개체로부터의 연골과 관련하여 현저한 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리된다.
본 발명의 다른 실시예는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 (a)태아, 또는 (b) 마일드한 골관절염을 가진 환자, (c) 중간정도의 골관절염을 가지는 환자, (d) 현저한 골관절염을 가진 환자, (e) 심각한 골관절염을 가지는 환자, 또는 (f) 정상인 개인으로부터 얻어진 연골 조직으로부터 분리된 연골의 상기 두개 이상의 출처로부터 분리된 연골에서 상이하게 발현된다.
발명의 다른 실시예는, 도 9 에서 확인된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 도 9 에서 개시된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
발명의 다른 실시예는, 도 11 에서 확인된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 도 11 에서 개시된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
발명의 다른 실시예는, 도 15 및 도 16 에서 개시된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
발명의 다른 실시예는, 도 6 에서 개시된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예는 도 13 에서 확인된 서열로부터 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 복수의 풍부한 연골세포 또는 연골세포-특이적 핵산군 서열을 포함하는 핵산 배열에 관한 것이다.
한 실시예에서, 발명은 복수의 핵산멤버들을 포함하는 배열을 제공하는데, 여기서 적어도 하나의 멤버는 정상 개체 및 고체 기질로부터의 연골과 비교시, 마일드 골관절염을 가지는 것으로 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 각 핵산 멤버는 배열에서 독특한 위치를 가지며, 고체 기질과 안정하게 결합된다.
한 실시예에서, 발명은 복수의 핵산멤버들을 포함하는 배열을 제공하는데, 여기서 적어도 하나의 멤버는 정상 개체 및 고체 기질로부터의 연골과 비교시, 심각한 골관절염을 가지는 것으로 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 각 핵산 멤버는 배열에서 독특한 위치를 가지며, 고체 기질과 안정하게 결합된다.
한 실시예에서, 발명은 복수의 핵산멤버들을 포함하는 배열을 제공하는데, 여기서 적어도 하나의 멤버는 정상 개체 및 고체 기질로부터의 연골과 비교시, 중간정도 관절염을 가지는 것으로 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 각 핵산 멤버는 배열에서 독특한 위치를 가지며, 고체 기질과 안정하게 결합된다.
한 실시예에서, 발명은 복수의 핵산멤버들을 포함하는 배열을 제공하는데,여기서 적어도 하나의 멤버는 정상 개체 및 고체 기질로부터의 연골과 비교시, 현저한 골관절염을 가지는 것으로 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 각 핵산 멤버는 배열에서 독특한 위치를 가지며, 고체 기질과 안정하게 결합된다.
한 실시예에서, 발명은 복수의 핵산멤버들을 포함하는 배열을 제공하는데, 여기서 적어도 하나의 멤버는 정상 개체 및 고체 기질로부터의 연골과 비교시, 태아로부터의 연골에서 상이하게 발현되며, 여기서 각 핵산 멤버는 배열에서 독특한 위치를 가지며, 고체 기질과 안정하게 결합된다.
바람직한 실시예에서, 연골은 살아있는 정상 개체로부터 분리된다.
다른 실시예에서, 연골은 사후 14 시간 이내의 정상 개체로부터 분리된다.
다른 실시예에서, 발명은 복수의 핵산 멤버들과 고체 기질을 포함하는 배열을 제공하며, 여기서 적어도 하나의 멤버는 하기 2 이상의 출저; (a)태아, (b) 마일드 골관절염을 가진 환자, (c) 중간정도의 골관절염을 가지는 환자, (d) 현저한 골관절염을 가진 환자, (e) 심각한 골관절염을 가지는 환자, 또는 (f) 정상인 개인으로부터 얻어진 연골 조직;으로부터 분리된 연골에서 상이하게 발현되고, 그리고 여기서 각 핵산 멤버는 배열에서 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질과 안정하게 결합되어 있다.
한 실시예에서, 본 발명에 따른 배열상에서 각 핵산 멤버는 적어도 50 뉴클레오티드를 가진다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 배열은 10 에서 20,000 위치를 포함한다.
다른 실시예에서, 발명에 따른 배열은 음 및 양 제어서열 및 RNA 질 제어서열을 포함한다. 제어서열은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 cDNA, 플렌트 염색체 서열(및/또는 이들의 cDNA 서열), 박테리아 서열, PCR 생성물, 벡터 서열, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
다른 측면에서, 발명은 골관절염을 진단하는 신규한 방법에 관한 것이다.
실시예에서, 환자에서 마일드한 골관절염 진단 방법은 RNA(예를 들면, RNA 또는 cDNA 또는 증폭된 RNA 또는 cDNA 의 생성물)에 상응하는 핵산 시료를 고체 기질 및 복수의 핵산 멤버들을 포함하는 배열에 혼성화하는 것을 포함하며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골과 비교시, 적어도 하나의 멤버는 마일드한 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되고, 그리고 여기서 각 핵산 멤버는 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질과 안정하게 결합되어 있다. 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 연골 조직으로부터 분리된다. 핵산 시료의 하나이상의 핵산 멤버에 대한 혼성화는 마일드한 골관절염을 지시한다.
실시예에서, 환자에서 중간정도 골관절염 진단 방법은 RNA에 상응하는 핵산 시료를 고체 기질 및 복수의 핵산 멤버들을 포함하는 배열에 혼성화하는 것을 포함하며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골과 비교시, 적어도 하나의 멤버는 중간정도 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되고, 그리고 여기서 각 핵산 멤버는 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질과 안정하게 결합되어 있다. 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 연골 조직으로부터 분리된다. 핵산 시료의 하나이상의 핵산 멤버에 대한 혼성화는 중간정도 골관절염을 지시한다.
다른 실시예에서, 환자에서 현저한 골관절염 진단 방법은 RNA에 상응하는 핵산 시료를 고체 기질 및 복수의 핵산 멤버들을 포함하는 배열에 혼성화하는 것을 포함하며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골과 비교시, 적어도 하나의 멤버는 현저한 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되고, 그리고 여기서 각 핵산 멤버는 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질과 안정하게 결합되어 있다. 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 연골 조직으로부터 분리된다. 핵산 시료의 하나이상의 핵산 멤버에 대한 혼성화는 현저한 골관절염을 지시한다.
다른 실시예에서, 환자에서 심각한 골관절염 진단 방법은 RNA에 상응하는 핵산 시료를 고체 기질 및 복수의 핵산 멤버들을 포함하는 배열에 혼성화하는 것을 포함하며, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골과 비교시, 적어도 하나의 멤버는 심각한 골관절염을 가진다고 진단된 환자로부터의 연골에서 상이하게 발현되고, 그리고 여기서 각 핵산 멤버는 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질과 안정하게 결합되어 있다. 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내에서 연골 조직으로부터 분리된다. 핵산 시료의 하나이상의 핵산 멤버에 대한 혼성화는 심각한 골관절염을 지시한다.
바람직한 실시예에서, 진단 방법은 연골 시료를 골관절염의 특정 단계(예를들면, 마일드, 중간정도, 현저, 또는 심각)에 있는 환자로부터 분리하는 것을 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 진단 방법은 연골시료로부터 RNA 시료를 제조하는 단계를 더 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 진단 방법은 혈액으로부터 RNA 시료를 제조하는 단계를 더 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 진단 방법은 활액(synovial) 유체로부터 RNA 시료를 제조하는 단계를 더 포함한다.
다른 관점에서, 발명은 태아 또는 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 골관절염 질병을 가진 환자로부터 유래한 연골세포에서 상이하게 발현되는 하나이상의 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현을 증가 또는 감소시키는 제제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 후보 제제와 함께 사후 14 시간 이내의 정상개체로부터 얻어진 연골 시료로부터 분리된 연골 세포를 배양하는 것을 포함한다. RNA 는 연골 세포로부터 분리되고, 프로브는 2 이상의 태아, 정상, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 및 심각한 골관절염의 발병 또는 질병 단계로부터의 연골세포에서 상이하게 발현되는 폴리뉴클레오티드 시퀀스에 상응하는 RNA 에 혼성화된다. 프로브의 어떤 하나이상의 태아(들), 마일드 골관절염을 가진 환자(들), 중간정도 골관절염을 가진 환자(들), 현저한 골관절염을 가진 환자(들), 심각한 골관절염을 가진 환자(들)로부터의 RNA 에 대한 프로브의 혼성화에 관련하여 정상 개체로부터의 RNA 에 대한 디퍼렌셜한 혼성화는 (differential hybridization) 디퍼렌셜하게발현된 연골세포-특이적 폴리뉴클레오티드 시퀀스로서 프로브에 특이적으로 혼성화된 RNA와 연골세포-특이적 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현을 증가 또는 감소시키는 것으로 하나로서 후보제제를 규명한다.
방법은 또한 연골세포로부터 얻어진 RNA 에 상응하는 cDNA를 평가하는 것에 의해 수행된다.
방법은 또한 혈액으로부터 얻어진 RNA 에 상응하는 cDNA를 평가하는 것에 의해 수행된다.
방법은 또한 시노비얼 유체로부터 얻어진 RNA 에 상응하는 cDNA를 평가하는 것에 의해 수행된다.
발명은 또한 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 것이다.
실시예에서, 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 a) 정상 개체로부터의 연골시료로부터 연골세포를 분리하는 것을 포함하며, 여기서 연골시료는 사후 14 시간 이내에서 얻어지며, b) 연골세포로부터 총 RNA 를 분리하는 것을 포함하고, c) 총 RNA 에서 mRNA 로부터 cDNA 를 합성하는 것을 포함하고, 및 d) cDNA 를 벡터에 결찰하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 a) 정상 개체로부터의 연골시료로부터 연골세포를 분리하는 것을 포함하며, 여기서 정상개체는 살아있으며, b) 연골세포로부터 총 RNA 를 분리하는 것을 포함하고, c) 총 RNA 에서 mRNA 로부터 cDNA 를 합성하는 것을 포함하고, 및 d) cDNA 를 벡터에 결찰하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 a) 태아로부터 연골시료를 분리하는 것을 포함하며, b) 연골세포로부터 총 RNA 를 분리하는 것을 포함하고, c) 총 RNA 에서 mRNA 로부터 cDNA 를 합성하는 것을 포함하고, 및 d) cDNA 를 벡터에 결찰하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법은 a) 마일드, 중간정도, 현저 또는 심각한 골관절염을 가졌다고 진단된 환자로부터의 연골시료로부터 연골세포를 분리하는 것을 포함하며, b) 연골세포로부터 총 RNA 를 분리하는 것을 포함하고, c) 총 RNA 에서 mRNA 로부터 cDNA 를 합성하는 것을 포함하고, 및 d) cDNA 를 벡터에 결찰하는 것을 포함한다.
본 발명은 복수의 선-선택(pre-selected)된 일정한 영역을 가지는 표면을 포함하는 고체지지체 상에서 도 14 의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열을 만드는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 각 핵산 멤버를 일정한 선-선택된 영역에 개별적으로 스팟(spotting)하는 단계, 및 각 핵산 멤버를 고체 지지체와 선-선택된 영역에서 안정하게 결합시키는 단계를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 핵산 멤버는, 정상 개체로부터 분리된 연골과 비교하여 마일드, 중간정도, 현저, 또는 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게(differentially) 발현되고, 여기서 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내의 연골 조직으로부터 분리된다.
바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 핵산 멤버는, 태아로부터 분리된 연골과 비교하여 마일드, 중간정도, 현저, 또는 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게(differentially) 발현된다.
바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 핵산 멤버는, 정상 개체로부터 분리된 연골과 비교하여 태아로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게(differentially) 발현되고, 여기서 정상개체는 사후 14 시간 이내의 연골조직으로부터 분리된다.
다른 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 핵산 멤버는 하기 출처의 어떤 두개로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되며, (a) 태아, (b) 정상개체, 여기서 정상개체로부터 분리된 연골조직이 사후 14 시간 이내의 연골조직으로부터 분리되며, 그리고 (c) 마일드 골관절염으로 진단된 환자, (d) 중간정도 골관절염으로 진단된 환자, (e) 현저한 골관절염으로 진단된 환자, 또는 (f) 심각한 골관절염으로 진단된 환자이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 조성물을 포함하는 키트 및/또는 상기의 배열 및 이들의 팩킹 수단을 제공한다.
본 발명의 특징과 목적이 하기 상세한 설명과 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
본 발명은 cDNA 라이브러리와 마이크로배열의 구축 및 이용을 통해 특이적 인간 조직형에서 디퍼렌셜(differential)한 유전자 발현의 윤곽을 그리는 것에 관한 것이다.
도 1 은 태아, 정상, 마일드한 골관절염, 및 심각한 골관절염 연골 cDNA 라이브러리 중에서 선택된 세포외 메트릭스(ECM) 단백질의 상대적 EST 빈도 수준을 보여주는 발명의 한 실시예에 따른 그래프이다. 퍼센트는 어떤 타입의 ECM 단백질에 매칭된 EST 의 수를 라이브러리당 ECM EST 의 총수로 나누어서 계산되었다.Legand: COL = 콜라겐, PGL = 프로테오글리칸, CMP = 연골 매트릭스 단백질, OSN = 오스네오닉틴, FN = 피브로넥틴, CRTL 1 = 연골 링크 단백질.
도 2 는 태아, 정상, 마일드한 골관절염, 및 심각한 골관절염 연골 cDNA 라이브러리 중에서 콜라겐의 상대적 EST 빈도 수준을 보여주는 발명의 한 실시예에 따른 그래프이다. 퍼센트는 특정한 라이브러리에서 콜라겐 EST 의 총수를 4 연골 라이브러리로부터의 콜라겐 EST의 총수로 나누어서 계산되었다.
도 3 는 태아, 정상, 마일드한 골관절염, 및 심각한 골관절염 연골 cDNA 라이브러리 중에서 특이적 콜라겐 타입의 상대적 EST 빈도 수준을 보여주는 발명의 한 실시예에 따른 그래프이다. 퍼센트는 특정한 라이브러리에서 각 타입의 콜라겐에 대한 EST 의 총수를 각 라이브러리로부터의 콜라겐 EST의 총수로 나누어서 계산되었다.
도 4 는 태아, 정상, 마일드한 골관절염, 및 심각한 골관절염 연골 cDNA 라이브러리 중에서 선택된 연골세포의 상대적 EST 빈도 수준을 보여주는 발명의 한 실시예에 따른 그래프이다. 퍼센트는 각 유전자에 대한 EST 의 총수를 각 라이브러리에서 독특한 염색체의 총수로 나누어서 계산되었다. Legend: DCN = 데코린/콘드로이틴 더마탄 설페이트 프로테오클리칸(PG40), HSP90 = 히트쇼크 프로틴 90/알파 염색체 시퀀스, MSF= 메가카요사이트 자극인자/ 프로테오글리칸 4/ 수퍼피셜 존 프로틴(superficial zone protein), B2M = 베타 2 마이크로글로블린, MGP = 매트릭스 Gla 단백질, LUM = 루미칸(lumican), TB4 = 티모신 베타 4, OSF-2 = 조골세포 특이성 인자 2 에 대한 mRNA, CHI = 키티나제, Vim = 비멘틴.
도 5 는 각 라이브러리에서 신규한 서열(즉, 어떤 유의한 매칭을 가지지 않는 ESTs)의 수 포함하는, EST 가 나타내는 것의 브레이크다운(breakdown)과 각 4 개 cDNA 라이브러리에서 EST 의 총수와 를 보여주는 발명의 한 실시예에 따른 표이다.
도 6 은 4 개의 cDNA 라이브러리에서 확인된 독특한 알려진 유전자(5,807)를 데이타에 리스트화한 발명의 실시예에 따른 한 표이다.
도 6A 는 도 6 에서 확인된 각각의 독특한 알려진 유전자를 나타내는 4 개의 cDNA 라이브러리에서 확인된 EST 서열의 이름을 리스트화한 발명의 한 실시예에 따른 표이다.
도 6B 는 태아 연골 조직으로부터 구축된 cDNA 라이브러리로부터 확인된 모든 EST 서열의 이름을 리스트화한 발명의 한 실시예에 따른 표이다.
도 6C 는 사후 14 시간 이내에서 얻어지는 정상 연골 조직으로부터 구축된 cDNA 라이브러리로부터 확인된 모든 EST 서열의 이름을 리스트화한 발명의 한 실시예에 따른 표이다.
도 6D 는 마일드한 골관절염을 가지는 환자의 연골 조직으로부터 구축된 cDNA 라이브러리로부터 확인된 모든 EST 서열의 이름을 리스트화한 발명의 한 실시예에 따른 표이다.
도 6E 는 심각한 골관절염을 가지는 환자의 연골 조직으로부터 구축된 cDNA 라이브러리로부터 확인된 모든 EST 서열의 이름을 리스트화한 발명의 한 실시예에 따른 표이다.
도 7는 ESTs 에 의해 대표되는 독특한 알려진 유전자의 기능별 분류에 기초한 4 개의 cDNA 라이브러리(57,422)로부터 EST 총숫자의 특징을 보여주는 발명의 한 실시예에 따른 표이다.
도 8 는 발명의 한 실시예에 따른 마이크로배열을 포함하는 마일드 및 심각한 cDNA 라이브러리로부터의 공지 또는 신규한 EST 의 리스트이다.
도 9 는 발명의 한 실시예에 따른 마이크로배열 분석에 기초한 마이드한 골관절염 cDNA 라이브러리에서 검출된 후보 상향규제(upregulated) 유전자를 보여주는 표이다.
도 10은 발명의 한 실시예에 따른 마이크로배열 분석에 기초한 마이드한 골관절염 cDNA 라이브러리에서 검출된 후보 하향규제된(downregulated) 유전자를 보여주는 표이다.
도 11 은 발명의 한 실시예에 따른 마이크로배열 분석에 기초한 심각한 골관절염 cDNA 라이브러리에서 검출된 후보 상향규제된(upregulated) 유전자를 보여주는 표이다.
도 12 는 발명의 한 실시예에 따른 마이크로배열 분석에 기초한 심각한 골관절염 cDNA 라이브러리에서 검출된 후보 하향규제된(downregulated) 유전자를 보여주는 표이다.
도 13 은 발명의 한 실시예에 따른 각각의 4 개 cDNA 라이브러리에서 확인된 신규한 서열을 나타내는 EST 서열 이름을 리스트화한 표이다.
도 14 는 발명의 한 실시예에 따른 4 개 인간 연골 cDNA 라이브러리로부터확인된 모든 EST 서열을 함유하는, 여기서 부착된 CD ROM 이다. CD-ROM 의 모든 EST 서열의 이름은 도 6B, 6C, 6D 및 6E 에 리스트화되어 있다.
도 15 는 발명의 한 실시예에 따른, 태아 및 정상 cDNA 라이브러리 사이에서 디퍼렌셜하게 발현되는 EST 빈도 분석을 통해 확인된 유전자의 리스트를 함유한다.
도 16 는 발명의 한 실시예에 따른, 마일드 및 심각한 골관절염 cDNA 라이브러리 사이에서 디퍼렌셜하게 발현되는 EST 빈도 분석을 통해 확인된 유전자의 리스트를 함유한다.
도 17 는 발명의 실시예에 따른 정상 개체와 상이한 단계의 골관절염을 가진 환자로부터의 활액 유체에서 베타-2-마이크로글로블린 (B2M)의 수준을 보여주는 막대 그래프이다. Legend: nor = 정상개체, mioa = 마일드한 골관절염 환자, mooa = 중간정도의 골관절염 환자, maoa = 현저한 골관절염 환자, seoa = 심각한 골관절염 환자.
도 18 은 발명의 한 실시예에 따른 배양 중 변화하는 시간 구간에서 심각한 골관절염을 가진 환자로부터의 연골로부터 배양된 배지에서 베타 2 마이크로글로블린 (B2M) 의 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 19 는 2 색상 형광 스켄의 블랙 및 화이트 표현이며, 발명의 한 실시예에 따른 것으로서, 비-B2M-처리된 연골세포(녹색점으로 나타날 것임)에서 바람직하게 발현된 유전자와 B2M-처리된 연골세포(붉은색 점으로 나타날 것임)에서 바람직하게 발현된 유전자을 보여준다. 대략 동일 수준으로 발현된 유전자는 노란색점으로 나타난다. B2M = 베타 2 마이크로글로블린.
본 발명은 상이한 발달 및 질병 상태의 연골에서 디퍼렌셜한 유전자 발현을 확인하기 위한 인간 연골세포에서 발현되는 유전자 서열을 프로파일화하는 방법에 관한 것이다. 디퍼렌셜하게 발현된 유전자와 그들의 생성물(예를들면, mRNAs 및 단백질)이 골관절염의 진단, 예측, 심사, 치료에 사용될 수 있다.
정의
하기 기술된 상세한 설명에서 사용되는 특정 용어에 대해서 다음의 정의가 제공된다.
여기서 사용되는, "골관절염"은 시간에 따라 차츰, 관절의 아티귤레이팅 표면을 형성하는 뼈의 말단에 있는 관절연골이 퇴화하는 만성 질병을 언급한다. 연골 퇴화는 밸런스가 맞지 않는 이화작용 활성("늙은"세포 및 매트릭스 성분의 제거)과 동화작용 활성("새로운"세포 및 분자의 생산)에 의해서 야기될 수 있다(Westacott et al., 1996,Semin Arthritis Rheum, 25: 254 - 72).
여기서 사용되는 "연골" 또는 "관절 연골" 은 인간 및 다른 종을 포함하는 포유류에서 탄성, 반투명의 연결성 조직이다. 연골은 주로 연골 세포, 타입 II 콜라겐, 소량의 다른 콜라겐 단백질, 다른 비콜라겐성 단백질, 프로테오글리칸 및 물로 이루어져 있으며, 타입 I 및 타입 II 콜라겐과 다른 프로테오글리칸의 매트릭스에서 섬유아세포로 만들어진 페리콘드리움(perichondrium)에 의해서 둘러쌓여 있다. 대부분의 연골이 성숙시 뼈가 될지라도, 일부 연골은 코, 귀, 무릎 및 다른 관절과 같은 위치에서 원래 형태로 남아있다. 연골은 혈액이나 신경 공급이 없고,연골세포는 이 조직에서 유일한 타입의 세포이다.
여기서 사용되는, "연골세포" 는 연골 세포를 언급한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "활액 유체"는 각 관절을 둘러쌓는 "활액낭(sinovial sac)"으로부터 분비되는 유체를 언급한다. 활액 유체는 관절을 보호하고, 관절을 윤활시키며, 그리고 관절연골에 영양을 공급한다. 본 발명에 따른 유용한 활액 유체는 여기서 기술된 종래 공지된 방법에 따라서 분리될 수 있는 RNA 로부터의 세포를 함유한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "골관절염(OA) 상태화" 또는 "골관절염 (OA) 등급화"는 연골에서 질병의 발병과 진행 정도를 측정하는 것을 언급한다. 연골을 상이한 질병상태로 구별하기 위해서, 당해 분야에서 공지된 방법에 따라서 점수화하는 시스템(scoring system)이 사용된다. 바람직하게 Marshall(Marshall W., 1996, The Journal of Rheumathology, 23: 582-584, 참고문헌에 의해 도입)에 기술된 스코어화 시스템이 사용된다. 이 방법에 따라서, 각각의 6개 관절 표면(파텔라, 페모랄 트로켈라, 메디얼 페로랄 콘딜레, 메디얼 티비알 플레튜, 레터럴 페모랄 콘틸레, 및 레터널 티비알 플레튜)이 그 특이적 표면에 존재하는 가장 나쁜 병소에 기초한 연골 등급에 배당된다. 다음 각 관절 표면이 그 표면에 대한 관절 심각성 등급을 반영하는 OA 심각성 숫자 수치를 수용하는 스코어링 시스템이 적용된다. 예를 들어, 만일 미디얼 페모랄 콘딜레가 그 가장 심각한 연골 손상과 같은 등급 I 병소를 가진다면, 수치 1 이 배당된다. 다음 환자에 대한 총 스코어는 6 관절 표면상 스코어의 합으로부터 유도된다. 이 총 스코어에 기초하여, 각 환자는 4 OA 그룹으로 편제된다: 마일드(초기)(1-6), 중간정도(7 -12), 현저(13 - 18), 및 심각(＞18).
여기에서 사용된 것과 같이, "진단"은 개인이 질병 또는 질환로 고통을 받는지를 결정하는 공정을 언급한다. "OA 의 진단" 또는 "OA 진단"은 본 발명의 방법에 따라서, 개인이 OA 로 고통받는지를 결정하는 것을 의미하며, 또는 일단 환자가 진단되면, OA 상태 또는 등급을 여기서 사용되는 것과 같이 환자의 병력이나 물리적 시험을 기초로 당해 분야 종래의 방법(즉 관절 X 레이)을 이용하여 측정하는 것을 의미한다. 바람직하게, OA 상태는 상기 Marshall 에 의해 기술된 스코어화 시스템을 이용하여 측정된다. "OA 의 예측"은 환자에게서 OA 의 가능한 발발 및/또는 진행의 예측을 의미하며, 또는 OA로부터의 회복 경향, 또는 OA 증상 감소 경향, 또는 OA 효과의 역전 경향의 예측을 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "환자"는 마일드, 중간정도, 현저 또는 심각한 형태의 OA를 가진것으로 진단된 포유류를 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "정상"은 어떤 OA 증상을 보이지 않으며, 연골 손상 또는 OA로 진단되지 않은 개체를 의미한다. 발명에 따라서, "정상"은 또한 사후 14 시간 이내내에서 정상 개체로부터 채취된 시료를 언급한다. 예를 들어 정상 연골 조직 시료는 OA로 진단되지 않은 개체 및 그 사체가 조직 제거 시점에서 어떤 OA증상을 보이지 않은 개체로부터 사후 14 시간 이내의 연골 조직으로부터 분리된 연골의 전부 또는 일부를 의미한다. 다른 실시예에서, "정상" 연골 조직 시료는 사후 14 시간 이내의 연골 조직으로부터 분리된 연골 조직, 예를 들어 13 시간 이내,12 시간, 11 시간, 10 시간, 9 시간, 8 시간, 7 시간, 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간, 2 시간, 또는 1 시간 사후이다. 발명의 한 실시예에서, "정상" 연골 시료는 사후 14 시간에서 분리되며, 추출된 mRNA 의 일관성(integrity)이 확인된다.
여기서 사용된 것과 같이, "mRNA 일관성"은 연골 시료로부터 추출된 mRNA 의 질을 언급한다. 양호한 일관성을 가진 mRNA 추출물은 종래 공지된 방법, 예를 들면, RNA 아가로스 겔 전기영동(예를 들어,Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology) 에 의해서 시험될 때 변성되지 않는 경향이 있다. 바람직하게, mRNA 시료가 이들이 추출된 연골시료의 유전자 발현 수준을 진짜로 나타내기 위해서, 좋은 일관성(예를 들면, 10 % 미만, 바람직하게 5 % 미만, 보다 바람직하게 1 % 미만의 mRNA 가 변성된다)을 가진다.
여기서 사용된 것과 같이, "태아" 연골 시료는 태아로부터 취해진 시료를 언급한다. 태아의 연골세포는, 어떤 상태의 OA(마일드, 중간정도, 현저 및 심각)로 진단된 성인으로부터 또는 정상 성인으로부터 유래된 연골로부터의 연골세포에 비교하여, 고수준의 대사활성과 세포분열 속도를 가진다.
여기서 사용된 것과 같이, "폴리뉴클레오티드"는 "핵산", "핵산서열", "서열" 및 "발현된 서열 태그"(EST(s))를 포함하는데, 일반적으로 변형된 RNA 또는 DNA 또는 비변형된 RNA 또는 DNA 일 수 있는 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리-데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다. "폴리뉴클레오티드"는 제한이 없이 단일- 및 두-가닥 핵산을 포함한다. 여기서 사용되는 것과 같이, 용어"폴리뉴클레오티드"는 또한 상기 기술된 것과 같이 DNA 또는 RNA 를 포함하며, 하나이상의 변형된 염기를함유한다. 그래서, 안정성이나 다른 이유때문에 변형된 백본을 가지는 DNA 또는 RNA 가 "폴리뉴클레오티드"이다. 여기서 사용되는 것과 같이, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 그러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드와 일예로 간단 및 복잡한 세포를 포함하는 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학형태를 포용한다.
여기서 사용된 것과 같이, 핵산에 관해서 사용될 때 "분리된" 또는 "정제된" 은 자연적으로 발생하는 서열이 그 정상 세포성(예를 들면, 염색체)환경으로부터 제거되거나, 또는 비-자연적 환경(예를 들면, 인공적 합성)에서 합성되는 것을 의미한다. 그래서, "분리된" 또는 "정제된" 서열은 세포-없는 용액에 있을 수 있으며, 또는 상이한 세포성 환경에 있을 수 있다. 용어"정제된"은 단지 뉴클레오티드 서열만이 존재한다는 것을 의미하지 않지만, 그러나 (약 90 - 95 % 순수하게) 그것과 자연적으로 관련된 비-뉴클레오티드 물질은 필수적으로 없으며, 그래서 분리된 염색체로부터 구별된다는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, 용어"프로브"는, 타겟 영역에서 서열을 가진 프로브에서 적어도 하나의 서열의 상보성 때문에, 타겟 핵산에서 서열과 이중 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 언급한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "핵산 서열"은 20개 상이한 핵산/㎠ 의 밀도를 초과하는 고체 지지체의 표면에 부착된 복수의 독특한 핵산(또는 "핵산 멤버")를 언급하며, 여기서 각 핵산 멤버는 비-동일한 선-선택된 영역내 고체 지지체의 표면에 부착된다. 한 실시예에서, 고체 지지체의 표면에 부착된 핵산 멤버는 DNA이다.바람직한 실시예에서, 고체 지지체의 표면에 부착된 핵산 멤버는 cDNA 이다. 다른 바람직한 실시예에서, 고체 지지체의 표면에 부착된 핵산 멤버는 중합 사슬반응 (PCR)에 의해서 합성된 cDNA 이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 배열의 핵산 멤버는 적어도 50 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게, 배열의 핵산 멤버는 6000 뉴클레오티드 길이 미만이다. 보다 바람직하게, 배열의 핵산 멤버는 길이로 500 뉴클레오티드 미만의 배열을 포함한다. 한 실시예에서, 배열은 고체 지지체의 표면에 부착된 500 상이한 핵산 멤버를 포함한다. 다른 실시예에서, 배열은 고체 지지체의 한 표면에 부착된 적어도 10 상이한 핵산 멤버를 포함한다. 다른 실시예에서, 배열은 고체 지지체의 한 표면에 부착된 적어도 10,000 상이한 핵산 멤버를 포함한다. 다른 실시예에서, 배열은 고체 지지체의 한 표면에 부착된 적어도 15,000 상이한 핵산 멤버를 포함한다. 용어 "핵산"은 여기서 사용되는 것과 같이, "폴리뉴클레오티드"와 치환가능하다.
여기서 사용되는 것과 같이, "복수의" 또는 "세트의"는 둘 이상을 의미하며, 예를 들어, 3 또는 이상, 100 또는 이상, 또는 10,000 또는 이상이다.
여기서 사용되는 것과 같이, "부착" 또는 "스팟팅"은 핵산배열을 형성하도록 핵산을 고체 기질상에 침착시켜, 핵산이 비가역적으로 공유결합, 수소결합 또는 이온 상호작용을 통해 고체 기질에 부착하도록 하는 공정을 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "안정하게 결합"은 공유 결합, 수소결합, 또는 이온 상호작용을 통해 배열을 형성하도록 고체 기질에 비가역적으로 고정되어, 핵산이, 배열에 안정하게 결합된 모든 다른 핵산, 배열이 전형적으로 분석되는 환경(즉, 혼성화, 세척, 및/또는 스케닝, 등등의 하나 이상의 단계 중)하에서 고체 기질상의 선-선택된 영역에 관련하여 독특한 선-선택된 위치에 남아있게 되는 핵산을 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "고체 기질" 또는 "고체 지지체"는 단단하거나 또는 반-단단한 표면을 가지는 물질을 언급한다. 용어"기질" 및 "지지체"는 여기서 용어"고체 기질" 및 "고체 지지체"와 교환가능하게 사용된다. 고체지지체는 생물학적, 비생물학적, 유기, 무기, 또는 이들의 조합일수 있으며, 입자, 가닥, 침전물, 겔, 시트, 튜브, 구, 비드, 용기, 캐필러리, 패트, 슬라이스, 필름, 판, 슬라이드, 칩 등등으로 존재한다. 자주, 기질은 실리콘 또는 유리 표면, (폴리)테트라플로로에틸렌, (폴리)비닐리덴디플로라이드, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 대전된 멤브레인, 일예로 나일론 66 또는 니트로셀룰로스, 또는 이들의 조합이다. 바람직한 실시예에서, 고체 지지체는 유리이다. 바람직하게, 기질의 적어도 하나의 표면은 실질적으로 평면이다. 바람직하게, 고체 지지체의 표면은 반응성 그룹을 함유하며, 제한적이지는 않지만, 카르복실, 아미노, 하이드록실, 시올, 등등을 포함한다. 한 실시예에서, 표면은 광학적으로 투명하다.
여기서 사용된 것과 같이, "선-선택된 영역", "선결정된 영역" 또는 " 독특한 위치"는 핵산의 침착을 위해서 사용되거나, 되었거나 또는 하기로 의도된 기질상의 국소 영역을 의미하며, 여기서는 다르게 "선택된 영역" 또는 단순히 "영역"으로서 선택사항으로서 언급된다. 선-선택된 영역은 어떤 편의적 형태, 예를 들면, 원, 사각형, 타원, 쐐기형 등등을 가질 수 있다. 어떤 실시예에서, 선-선택된 영역은 1 cm2보다 바람직하게는 1 mm2, 보다더 바람직하게는 0.5 mm2, 보다 작으며, 어떤 실시예에서는 0.1 mm2보다 작다. "선-선택된 영역", "선결정된 영역" 또는"독특한 영역"에서 핵산 멤버는 그 동일성(예를 들면 서열)이 영역 또는 독특한 위치에서 그 위치의 특성에 의해서 결정되는 것이다.
여기서 사용되는 것과 같이, "핵산 타겟" 또는 "타겟 핵산"은 상보성 서열의 핵산 멤버에 하나 이상 형태의 화학적 결합을 통해서, 통상적으로 상보성 염기쌍을 통해서, 즉 수소 결합 형성을 통해서 결합할 수 있는 핵산으로 정의된다. 여기서 사용되는 것과 같이,핵산 타겟은 천연(즉 A, G, C, 또는 T) 또는 변형된 염기(7-데아자구아노신, 이노신 등등)을 포함할 수 있다. 추가로, 핵산 프로브내 염기는, 이것이 혼성화와 간섭하지 않는한(즉, 프로브가 여전히 특이적으로, 표준의 엄격한 또는 선택적 혼성화 조건하에서 그 상보성 서열에 결합한다) 포스포디에스터 결합 이외의 연결에 의해서 결합될 수 있다. 그래서, 핵산 타겟은 구성염기가 포스포디에스터 연결보다는 펩티드결합에 의해서 결합되는 펩티드 핵산일 수 있다. 바람직하게, 핵산 타겟은 인간 연골, 혈액, 또는 활액 유체 추출물로부터 유래할 수 있다. 보다 바람직하게, 핵산 타겟은, 인간 연골, 혈액 또는 활액 유체 RNA 추출물 및 바람직하게는 mRNA 추출물로부터의, 단일- 또는 두가닥 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 혼성화일수 있다.
여기서 사용되는 것과 같이, "연골 핵산 시료"는 연골로부터 유래된 핵산을 언급한다. 바람직하게, 연골 핵산 시료는 RNA 또는 RNA 에 상응하는 핵산, 예를들면 cDNA 이다.
여기서 사용되는 것과 같이, 용어"대한 혼성화" 또는 "혼성화"는 상보성 핵산에 수소결합을 의미하며, 예를 들어 배열에서 타겟 핵산 서열과 핵산 멤버 사이의 상호작용이다.
여기서 사용되는 것과 같이, "특이적 혼성화" 또는 "선택적 혼성화"는 두 핵산 서열이 실질적으로 상보성(적어도 14 에서 25 뉴클레오티드의 스트레치에 걸쳐서 적어도 65 % 상보성, 바람직하게는 적어도 약 75 %, 보다 바람직하게는 적어도 약 90 % 상보성)일 때 발생하는 혼성화를 의미한다. Kanehisa, M., 1984, Nucleic acids Res., 12 :203 을 참조하는데, 여기서 참고문헌으로 도입되었다. 결과적으로 어떤 정도의 미스매치가 용인된다는 것이 기대된다. 그러한 미스매치는 작을 수 있으며, 일예로 모노-, 디-, 또는 트리-뉴클레오티드이다. 선택적으로, 미스매치의 영역은 루프를 둘러쌓을 수 있으며, 이것은 4 개 이상의 뉴클레오티드의 비단절적 시리즈에서 미스매치가 존재하는 영역으로서 정의된다. 다양한 인자가 두 핵산의 혼성화 효율성 및 선택성에 영향을 미치는데, 예를들면, 배열상 핵산 멤버의 타겟 핵산 서열이다. 이들 인자는 핵산 멤버 길이, 뉴클레오티드 서열, 및/또는 조성물, 혼성화 온도, 버퍼 조성물 및 핵산 멤버가 혼성화하기 위해서 요구되는 영역에서의 입체 장애에 대한 포텐셜이다. 핵산 멤버 길이와 핵산 멤버가 타겟 서열에 풀리는 정확성 및 효율성사이에 양의(positive) 상관관계가 존재한다. 특히, 긴 서열일 수록 더 짧은 서열에 비해 높은 융점(TM)을 가지며, 그리고 주어진 타겟 서열내에서 반복되는 경향이 적고, 이에 의해 무차별적인 혼성화가 최소화된다. 혼성화온도는 핵산 멤버 어닐링 효율에 역으로 변하는데, 혼성화 혼합물에 포함되는 유기 용매, 예를 들면 포름알데히드와 같으며, 반면 결합을 촉진시키는 염 농도에서는 증가한다. 엄격한 어닐링 조건하에서, 보다 긴 핵산일수록 짧은 것에 비해 보다 효과적으로 혼성화되며, 이것은 더 허용된 조건하에서 충분하다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어"디퍼렌셜 혼성화"는 2 이상의 시료로부터 상이한 수준에서 얻어지는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 언급한다. "디퍼렌셜 혼성화"는 다른 시료로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 프로브의 혼성화 수준의 비가 1.0 과 동일하지 않다는 것을 의미한다. 예를 들면, 다른 시료로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 서열과 비교시, 한 시료로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 프로브의 혼성화 수준의 비가 1,0 보다 크거나 또는 적으며, 그리고 1.5 보다 크고 0.7 보다 작거나, 그리고 2 보다 크거고 0.5 보다 작다. 디퍼렌셜 혼성화는, 또한 혼성화가 한 시료에서는 검출가능하나 그러나 다른시료에서는 그러하지 않는다면, 존재한다.
여기서 사용된 것과 같이, 용어"표준의 엄격한 조건"은 서열사이의 동일성이 적어도 95 %, 그리고 바람직하게 적어도 97 % 인 경우에만 발생한다는 것을 의미하며, 여기서 동일한 영역은 적어도 10 뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시예에서, 서열은 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 42 ℃ 에서 밤새 서열의 배양이 이어지고, 엄격한 세척(65 ℃ 에서 0.2 X SSC)이 이어진다. 몇몇 인자들이 혼성화의 엄격성에 영향을 미치기 때문에, 인자의 조합은 단일 인자의 절대적 측정보다 더 중요하다.
여기서 사용되는 것과 같이, 용어"발현 수준"은 주어진 핵산의 측정가능한 발현 수준을 언급한다. 핵산의 발현수준은 종래 공지된 방법에 의해서 결정된다. 용어"디페렌셜하게 발현" 또는 "발현의 수준에서 변화"는 주어진 핵산의 측정가능한 발현 수준에서의 증가 또는 감소를 언급한다. 여기서 사용된 것과 같이, "디퍼렌셜하게 발현"은 마이크로배열 분석을 언급할 때, 한 시료에서 주어진 폴리뉴클레오티드의 발현 수준과 다른 시료에서 주어진 폴리뉴클레오티드의 발현수준의 비가 1.0 이 아니라는 것이다. "디퍼렌셜하게 발현된"은 발명에 따른 마이크로배열의 분석을 언급할 때, 또한 한 시료에서 주어진 폴리뉴클레오티드의 발현 수준이 다른 시료에서 주어진 폴리뉴클레오티드의 발현수준의 비를 의미하며, 여기서 비는 1.0 보다 크거나 또는 작으며, 그리고 1.5 보다 크고 0.7 보다 작은 것, 바람직하게는 2.0 보다 크거 0.5 보다 작은 것을 포함한다. 핵산은 또한, 두시료중 하나가 어떤 핵산의 검출가능한 발현을 포함하지 않는다면, 두 시료에서 디퍼렌셜하게 발현된다고 말할 수 있다. 핵산 발현수준의 절대량은 하나이상의 핵산종의 알려진 농도를 포함하는것, 제어 핵산의 양에 기초한 표준 곡선을 만드는 것, 그리고 표준 곡선에 대해서 미지물의 혼성화 강도로부터 "미지" 핵산종의 발현 수준을 외삽하는 것에 의해서 성취될 수 있다. 발현 곡선은 종래 잘 알려진 방법에 따른 표지된 타겟 핵산을 이용한 혼성화 분석에 의해서 측정될 수 있다. 타겟 핵산상의 표지는 발광성 표지, 효소 표지, 방사성 표지, 화학표지 또는 물리적 표지일 수 있다. 바람직하게, 타겟 핵산은 형광 분자로 표지된다. 바람직하게 형광표지는 제한되지는 않지만, 플루오레세인(fluorescein), 아미노 쿠마린 아세트산, 테트라메틸로드아민 이소시오시아네이트(TRITC), Texax Red, Cy3 및 Cy5 이다.
여기서 사용되는 것과 같이,"디퍼렌션하게 발현된"은 EST 분석에 대해서 언급할때, 다른 cDNA 라이브러리로부터 유도된 동일한 유전자를 나타내는 EST 의 빈도와 비교시 cDNA 라이브러리로부터 유도된 유전자를 나타내는 EST 의 빈도를 기초로한 유전자의 상대적 발현 수준을 의미한다. 여기서 사용되는 것과 같이, EST 의 "상대적 EST 빈도"는 각 특이적 유전자를 나타내는 EST 의 수를 분석된 EST 의 총수로 나눈것에 의해서 계산된다. "상대적 EST 빈도"에서의 차이는 디퍼렌셜 유전자 발현을 가르키기 위해 사용될 수 있다.
여기서 사용되는 것과 같이, 용어"유의한 매치"는 핵산 서열을 언급할 때, 두 핵산 서열이 적어도 65 % 의 동일성, 적어도 70 % 의 동일성, 적어도 75 % 의 동일성, 적어도 80 %, 적어도 85% 그리고 바람직하게는 적어도 90 % 의 동일성을 종래 공지된 비교법을 이용할 때 나타내는 것을 의미한다(즉, Altschul, S. F. et al., 1997, Nucl. Acid Res., 25:3389 - 3402; Schaffer, A. A. et al., 1999, Bioinformatics 15:1000 - 1011). 여기서 사용된 것과 같이, "유의한 매치"는, 서열이 적어도 65 %, 및 바람직하게는 적어도 70 %, 적어도 75%, 적어도 80 %, 적어도 85%, 그리고 바람직하게 적어도 90 % 동일성을 종래의 통상적 정열 방법을 이용해 최대한으로 정렬될때 나타내는한, 비연속적 또는 분산된 동일한 뉴클레오티드를 포함한다.
여기서 사용된, "신규한 서열" 또는 "신규한 발현된 서열 태그(EST)"는, 각 신규 서열이 비교될 때 NCBI 를 통해서 이용가능한 "nt", "nr", "est", "gss" 및"htg"에서 존재하는 어떤 서열에 대해 유의한 서열을 가지지 않는 핵산 서열을 의미한다. "유의한 매치가 없는"은 바람직하게 데이타 베이스에서 다른 서열에 대한 조사되는 신규한 서열 사이에 65 % 미만의 매치를 언급하며, 종래 통상적 방법을 이용하여 최대한 정렬한 후, 바람직하게는 50 % 미만, 40 % 매치 미만, 또는 30 % 매치 미만이다.
여기서 사용된 것과 같이, "공지 서열"은 NCIB 를 통해서 이용가능한 "nt", "nr", "est", "gss", 및 "htg" 데이타 베이스에서 존재하는 적어도 하나의 서열에 대해 유의한 매치를 가지는 핵산 서열을 언급한다. "기능을 가진 공지서열"은 공지 기능을 가진 폴리펩티드를 엔코드하는 존재하는 서열에 대해 유의한 매치를 가지는 핵산을 언급한다. "기능이 없는 공지 서열"은 미지 기능의 폴리펩티드를 엔코드하는 존재하는 서열에 대해 유의한 매치를 나타내는 핵산을 의미한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "연골세포-특이적 핵산"은 연골세포에서 검출가능한 수준에서 발현되고 다른 세포타입으로부터의 서열을 포함하는 어떤 이용가능한 데이타베이스에서의 어떤 서열에 대해 유의한 매치를 가지는 않는 것으로 가르켜지는 다른 세포타입에서는 검출가능하게 발현되지 않는 핵산서열이다.
여기서 사용되는 것과 같이, "연골세포 풍부한 핵산" 또는 "연골세포 풍부한 서열"은 비-연골세포에 대해 비교시 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현된 서열을 언급한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "질병의 표시"는 발현 패턴이 질병을 가지지 않는 환자에서보다 질병을 가진 환자에서 보다 자주 유의하게 발견되어 질병을 진단하는 발현 형태를 언급한다(약 95 % 신뢰수준에서 고정된 통상의 통계적 방법을 이용하여 결정되는). 바람직하게, 질병을 표시하는 발현 패턴은 적어도 70 % 의 질병을 가진 환자에게서 발견되고, 10 % 미만의 질병을 가지지 않은 환자에게서 발견된다. 보다 바람직하게, 질병을 표시하는 발현 패턴은 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 이상의 질병을 가진 환자에서 발견되고, 10 % 미만, 8 % 미만, 5 % 미만, 2.5 % 미만, 또는 1 % 미만의 질병을 가지지 않은 환자에게서 발견된다.
여기서 사용되는 것과 같이, "유전자 발현 패턴" 또는 "유전자 발현 프로파일"은 하나이상의 멤버들의 세트가 디퍼렌셜하게 발현되는 하나이상의 세트의 핵산 서열의 발현 패턴을 포함한다.
여기서 사용되는 것과 같이, "핵산 배열 발현 프로파일"은 발명에 따른 배열을 포함하는 하나 이상의 핵산 멤버에 대한 시료로부터 유래된 핵산의 혼성화로부터 생성된다.
여기서 사용되는 것과 같이, "치료제" 또는 "제제"는 ,여기서 정의된 것과 같이, (a)태아, (b)마일드, (c)중간정도, (d)현저 및 (e)심각 또는 정상개체로부터의 연골세포의 골관절염 발병 또는 질병단계의 2 이상으로부터 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증가 또는 감소시키는 화합물을 나타낸다. 발명에 따른 치료제는 또한 연골세포의 동화작용 활성을 증가또는 감소시키는 화합물을 언급한다. 발명은 1) 골관절염의 시작을 예방하고; 2) 감염된 관절에서 통증, 붓기, 기능의 약화 또는 손실과 같은 골관절염 증상을 감소, 지연 또는 제거시키며; 3) 연골 퇴화를 감소, 지연 또는 제거 및/또는 연골세포 대사 활성 및 세포 분할 속도를 향상시키며;및/또는 4)환자에 투여시 정상개체와 보다 유사한 프로파일에 대한 환자의 하나이상의 질병-표시 핵산의 하나이상의 발현 프로파일을 재생시키는 "치료제"를 제공한다.
연골세포 풍부 및 연골세포-특이적 폴리뉴클레오티드 서열의 규명
cDNA 라이브러리는 인간 태아, 정상, 마일드 골관절염 및 심각한 골관절염 연골 시료로부터 구축되었다. 이들 라이브러리로부터 유리된 공지 및 신규한 클론은 마일드(초기상태) 골관절염의 검출용 진단기구로서 유용한 디퍼렌셀 유전자 발현 프로파일을 발생시키는 인간 연골세포-특이성 마이크로배열을 구축하기 위해서 사용되었다. 발명의 배열은 골관절염 진단용 금 표준 및, 새로운 시약 타겟의 치료적 효능을 확인하고 모니터하기 위한 용도로서 유용하다.
주어진 조직에서 유전자 발현 패턴을 특정하는 효과적이고 신속한 방법은 발현된 서열 태그(ESTs)를 발생시키기 위해 그러한 조직으로부터 유래된 cDNA 라이브러리의 대-스케일 부분 서열화이다. 이러한 접근은 다양한 조직 및 세포(4-7)에서 유전자 발현에 있어서 양적 및 질적인 정보를 제공한다. cDNA 라이브러리가 라이브러리를 구축하기 위해 사용되는 조직의 세포에서 유전자 전사를 나타내기 때문에, 무작위 샘플링과 서열화에 의해서 발생된 유전자 발현 프로파일은 시험된 조직의 발달, 정상 및 병리학적 상태사이의 자세한 유전적-수준의 비교에 이용된다.
많은 인간 유전자가 상이한 발달(태아 vs 성체) 또는 질병 상태의 연골에서 다른 수준에서 발현된다. 일부에서, 유전자는 일부 발달 또는 질병 상태에서 전혀발현되지 않으며, 다른 것에서는 고수준이다(도 6 , 15 및 16 을 예로 참조). 발명에 따라서, EST-계 접근을 이용한 상이한 질병 단계및 연골 발달 단계 중에서 연골세포 유전자 발현의 디퍼렌셜 분석이 골관절염 병리학 및 연골 수선에서 중요한 역할을 하는 유전자를 확인시킨다. 이 방법의 잇점은 이것이 다른 방법보다 큰 스케일로 유전자 발현 정보를 제공한다는 것이다. 이러한 접근에 의해서 생성된 cDNA 클론은 또한 어떤 유전자의 기능적 연구에도 유용하다. 이러한 타입의 게놈계 접근은 골관절염 질병 과정의 이해에 있어 중요하고 신규한 고찰을 제공하며, 신규한 진단, 예측, 및 치료적 접근을 제공한다.
시료
연골
일면으로, 연골은 종래 공지된 방법을 이용하여 태아로부터 얻어진다. 태아연골의 연골세포는, 정상인 성인 또는 어떤 골관절염(마일드, 중간정도, 현저 및 심각)으로 진단된 개체로부터의 연골로부터의 연골세포와 비교하여, 고수준의 대사적 활성과 세포분해속도를 가진다.
다른 측면에서, 연골은 살아있는 정상개체로부터 얻어지며, 하기 기술된 종래 알려진 방법에 따라서 사후 14 시간이내 연골 조직으로부터 얻어진다. 성인 인간으로부터의 통상의 관절 연골은 공지의 방법을 이용하여 얻어진다. 그러나, 진짜의 정상 연골은 살아있는 공급자로부터 일반적으로 얻어질 수 없는데, 이는 윤리적 문제 때문이다. 바람직하게, 통상의 연골 시료는 죽은 공급원으로부터 얻어지며, 창 너머 관측되는 RNA 의 변성을 최소화하기 위해서, 채취된 관절의 관류의 중단후 14 시간 사후 창 내에서 얻어진다. 다른 실시예에서, "정상"조직은 사후 14 시간 이내에서 얻어지며, 일예로 13, 12, 11, 10, 9, 8, 6, 4, 2 또는 1 시간 사후이다. 원숭이 시험이 이러한 접근을 확증하기 위해서 실시되고, 여기서 실시예 11 에서 기술된다. 바람직하게 정상 연골은 사후 14 시간 이내에서 얻어진다. 보다 바람직하게, 통상의 연골은 사후 12 시간 미만에서 얻어진다.
바람직하게, 연골은 또한 마일드, 현저, 중간정도, 및 심각한 골관절염의 질병상태에서 얻어진다. 골관절염 개체로부터 인간 연골 시료는 공지방법을 이용해서 얻어진다. 바람직하게, 관절경술 또는 전체적인 무릎대체 수술을 받은 개체로부터 얻어지며, 시료들은 필요할 때까지 액체 질소에서 보관된다. 바람직한 실시예에서, 최소 0.05 g 의 연골 시료가 cDNA 라이브러리의 구축을 위해서 2 ㎍ 의 총 RNA 추출을 얻기 위해서 분리된다. 다른 바람직한 실시예에서, 최소 0.025 g 연골시료가 마이크로배열용 타겟 시료로 사용하기 위한 1 ㎍ 총 RNA 추출물을 얻기 위해서 분리된다. 본 발명에 따라 유용한 연골 시료는 본 발명에 따른 하나이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 검출에 충분한 양으로 있다.
혈액 및 활액 유체
발명에 따른 유용한 시료들은 또한 혈액과 활액시료를 포함한다.
일측면에서, 혈액은 정상 환자 또는 종래 알려진 사혈법에 따라서 골관절염을 가지고 있다고 의심되거나 또는 진단된 개체로부터 얻어진다. 유용한 혈액시료는 약 1 ㎕ 에서 100 ml사이의 범위에 존재하고, 바람직하게는 10 ㎕ 에서 50 ml, 보다 바람직하게는 10 ㎕ 에서 25 ml 및 가장 바람직하게는 10 ㎕ 에서 1 ml에서존재한다. 본 발명에 따른 유용한 혈액 시료는 발명에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 검출에 충분한 양으로 존재한다. 한 실시예에서, 혈액에 함유된 폴리뉴클레오티드가 증폭되고, 예를 들어, 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 또는 RT-PCR이다. 종래 알려진 다른 증폭 방법은 또한 발명의 영역에 포함된다(예를 들어, 리가아제 사슬 반응, NASBA, 3SR, 및 등등).
활액 유체는 종래 공지된 방법에 따라서 골관절염을 가지고 있다고 의심되거나 또는 진단된 개체로부터 얻어진다. 바람직하게, 활액 유체는 관절경술에서 뽑아냄으로 인간 무릎 관절로부터 모집된다. 발명에 따른 유용한 활액 유체는 0.1 ml에서 20 ml 범위내 양으로 존재하며, 바람직하게는 0.5 ml 에서 10 ml 이다. 발명에 따라 유용한 활액 유체는 발명에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 검출에 충분한 양으로 존재한다.
관절 연골의 발달 및 질병 상태
연골세포는 하기 발달 및 질병 상태중 하나로부터 얻어진다: 태아, 정상, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 또는 심각한 골관절염.
인간 태아로부터 분리된 연골(태아발달 중)은 상기 특정되고, 태아 연골 세포의 분석에 대해서 발명에 따라서 유용하다.
"정상"개체로부터 분리된 연골은, 여기서 정의되고, 또한 발명에 따라서 "정상" 연골세포의 분리 및 분석에 유용하다.
마일드, 중간정도, 현저, 심각한 골관절염 중의 하나로 진단된 환자로부터 분리된 연골은 본 발명에 유용하다.
질병상테에 따라서 연골을 분류하기 위해서, 스코어링 시스템이 사용되고, 이에 의해서 관절경사에 의한 수술적 결정이 최소화된다. 여기서 기술된 질병상태를 정의하는 스코어링 시스템은 상기 Marshall 이며, 여기서 참고 문헌으로 도입되었다. 이 방법에 따라서, 각 6 개의 관절 표면(파텔라, 페모랄 트로켈라, 메디얼 페로랄 콘딜레, 메디얼 티비알 플레튜, 레터럴 페모랄 콘틸레, 및 레터널 티비알 플레튜)이 그 특이적 표면에 존재하는 가장 나쁜 병소에 기초한 연골 등급에 배당된다. 다음 각 관절 표면이 그 표면에 대한 관절 심각성 등급을 반영하는 골관절염 심각성 숫자 수치를 수용하는 스코어링 시스템이 표 1 에서 기술된 것과 같이 적용된다.
예를 들어, 그 가장 심각한 연골 손상으로서 메디얼 페로랄 콘딜레가 등급 1 병소를 가지면, 수치 1 인 배당된다. 다음 환자에 대한 총 스코어는 6 관절 표면상 스코어의 합으로부터 유도된다. 이 총 스코어에 기초하여, 각 환자는 4 골관절염 그룹으로 편제된다: 마일드(초기)(1-6), 중간정도(7 -12), 현저(13 - 18), 및 심각(＞18).
RNA 제조
한 면으로, RNA 가 여기서 기술된 바와 같이, 다양한 질병 또는 발달 상태로부터 연골 시료로부터 분리된다. 시료들은 단일 환자로부터 또는 복수 환자로부터 일수 있다.
다른 측면에서, RNA 는 여기서 기술된 바와 같이, 골관절염의 다양한 질병 상태 또는 발달 상태를 가진 환자의 혈액 시료로부터 직접적으로 분리된다. 시료들은 단일 환자, 또는 복수환자로부터 모아질 수 있다.
총 RNA 가 종래 알려진 방법에 의해서 연골시료로부터 추출된다. 실시예에서, RNA 는 하기 방법에 따라서 연골 조직으로부터 정제된다. 개체 또는 환자로부터 관심있는 조직의 제거 후, 조직은 액체 질소에서 급속 동결되어, RNA 의 변성을 막는다. 일정 부피의 조직 구아니디늄 용액 투입시, 조직시료는 2 -3 개의 10-초 폭발로 티슈미저(tissuemizer)에서 갈린다. 조직 구아니디늄 용액(1 L)590.8 g 를 제조하기 위해, 구아니디늄 이소티오시아네이트가 대략 400 ml DEPC-처리된 H2O에 용해된다. 25 ml 의 2M 트리스 Cl, pH 7.5(0.05 M 최종) 및 20 ml Na2EDTA(0.01 M 최종)이 투입되고, 용액이 밤새 교반되고, 950 ml에 부피가 조절되고 그리고 50 ml 2ME 가 투입된다.
혼성화된 조직 시료는 10 분동안 12,000 x g 으로 12 ℃ 에서 원심분리를 거친다. 결과적인 상청액(supernatant)이 2 분동안 65 ℃ 에서 20 % Sarkosyl 의 0.1 부피 존재하에서 배양되고, 9 ml 의 5.7 M CsCl용액(0.1 g CsCl/ml)상에 층을 이루고, 그리고 22 ℃ 에서 113,000 x g 으로 밤새 원심분리에 의해서 분리된다. 상청액의 조심스런 제거후, 튜브를 뒤집어 배출한다. 튜브의 바닥(RNA 펠렛을 포함)이50 ml 플라스틱 튜브에 놓여지고, 밤새(또는 그 이상) 4 ℃ 에서 3 ml 조직 재부유 버퍼(5 mM EDTA, 0.5 %(v/v) Sarkosyl, 5 % (v/v)2-ME)존재하에서 배양되어, RNA 펠렛의 재부유를 완성시킬 수 있게된다. 결과적인 RNA 용액은 실질적으로 25:24:1 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올로 추출되고, 이어서 24:1 클로로포름/이소아밀 알코올이 이어지며, 3 M 쏘듐 아세테이트, pH 5.2, 및 100 % 에탄올의 2.5 부피의 투입에 의해서 침전되고, 그리고 DEPC 물에 의해서 재부유된다(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry, 18:5294).
선택적으로, RNA 는 하기 단일 단계 프로토콜에 따라서 연골 조직으로부터 분리된다. 관심있는 조직은 100 g 조직당 1 ml 의 변성 용액(4 M 구아니디늄 시오설페이트, 25 mM 쏘듐 시트레이트, pH 7.0, 0.1M 2ME, 0.5%(w/v)N-라우릴사코신)에서 글라스 테프론 균질기에서 균질화에 의해서 제조된다. 균질물을 5-ml 폴리프로필렌 튜브로 이송한 후, 0.1 ml 의 2 M 쏘듐 아세테이트, pH 4, 1 ml 물-포화 페놀, 및 0.2 ml 의 49:1 클로로로름/이소아밀 알코올이 차례로 투입된다. 시료는 각 성분의 투입후 혼합되고, 그리고 모든 성분의 투입 후 0 - 4 ℃ 에서 15 분간 배양된다. 시료는 20 분동안 100,000 x g, 4 ℃ 에서 원심분리에 의해서 분리되고, 1 ml 의 100 % 이소프로판올의 투입에 의해서 침전되고, 30 분간 - 20 ℃ 에서 배양되고, 그리고 10 분간 10,000 x g, 4 ℃ 에서 원심분리에 의해서 펠렛화된다. 결과적인 RNA 펠렛은 0.3 ml 변성화 용액에서 용해되고, 마이크로퓨즈(microfuge)튜브에 이송되고, 30분동안 - 20 ℃ 에서 0.3 ml 의 100 % 이소프로판올의 투입에 의해서 침전되고, 그리고 10 분동안 10,000 x g ,4 ℃ 에서 원심분리된다. RNA 펠렛은은 70 % 에탄올에서 세척되고, 건조되며, 100 - 200 ㎕ DEPC-처리된 물 또는 DEPC-처리된 0.5 % SDS에서 재부유된다(Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal. Biochem., 162:156).
바람직하게, 연골 시료는 액체 질소하에서 미세하게 파우더화되며, 총 RNA 가 등록상표 TRIzol 시약(GIBCO/BRL)을 이용하여 추출된다.
선택적으로, RNA는 하기 프로토콜에 의해서 혈액으로부터 분리된다. 1 부 혈액에 대해 3 부 용혈 버퍼의 비로 용혈 버퍼가 혈액 시료에 투입된다(용혈 버퍼(1L) 0.6 g EDTA; 1.0 g KHCO2, (NaOH를 이용해)pH 7.4 로 조절된 8.2 g NH4Cl). 시료는 혼합되고, 그리고 반투명해질때까지 얼음에 5 - 10 분간 정치된다. 용혈된 시료가 10 분간 4 ℃ 에서 1000 rpm 으로 원심분리되고, 상청액이 뽑혀진다. 펠렛이 5 ml 용혈버퍼에 재부유되고, 다시 1000 rpm 에서 10 분간 4 ℃ 에서 원심분리된다. 펠렛화된 세포는 와류 웰과 등록상표 TRIzol(GIBCO/BRL)을 이용하여 대략 원혈액 시료에 대해 TRIzol 6 ml 의 비로 균질화된다. 시료들은 5 분간 실온에서 정치된다. RNA는 1 ml TRIzol 당 1.2 ml 클로로포름을 이용하여 추출된다. 시료는 12,000 x g 에서 5 분간 4 ℃ 에서 원심분리되고, 상층이 모집된다. 상층에, 이소프로판올이 1 ml TRIzol 당 0.5 ml 의 비로 투입된다. 시료는 - 20 ℃ 에서 밤새 또는 1 시간 동안 놓여진다. RNA 는 공지된 방법에 따라서 펠렛화되고, RNA 펠렛은 공기 건조되며, 펠렛은 DEPC 처리된 ddH2O에서 재부유된다. RNA 시료들은 75 % 에탄올에서 저장될 수 있고, 여기서 상기 시료들은 이송동안 실온에서 안정하다.
선택적으로 RNA 는 TRIzol 시약(GIBCO/BRL)을 이용하여 활액 유체로부터 분리된다.
RNA 의 순도와 일관성은 260/280 nm흡수 및 자외선 하에서 검사에 이은 아가로스 겔 전기영동에 의해서 평가된다.
cDNA 라이브러리의 구축
cDNA 라이브러리가 종래 공지된 방법에 따라서 구축된다(여기서 참고 문헌으로 도입된 상기, Ausubel, 및 Sambrook 를 예로 참조하라).
일면에서, cDNA 시료, 즉 mRNA 와 같은 RNA에 상보성인 DNA가 제조된다. cDNA 의 제조는 종래 공지된 방법이며, 절차이다.
cDNA 는 하기 방법에 따라서 제조될 수 있다. 총 세포성 RNA 가 (기술된바와 같이)분리되고, 폴리A RNA를 분리하기 위해서 올리고(dT)-셀루로즈 컬럼을 통해서 통과된다. 고정된 폴리A mRNA가 컬럼으로부터 낮은 이온 강도 버퍼와 함께 용출된다. cDNA 분자를 생산하기 위해서, 짧은 데옥시시미딘 올리고뉴클레오티드(12-20 뉴클레오티드)가 폴리A 꼬리에 혼성화되어,역전사효소, DNA합성을 위해서 주형으로 RNA를 이용하는 효소,에 대한 프라이머로서 사용된다. 선택적으로, 또는 추가적으로, mRNA 종은 cDNA 합성에 대한 프라이머로서 관심있는 mRNA에 대한 다수의 상보성 서열을 포함하는 짧은 올리고뉴클레오티드 단편을 이용하는 것에 의해서 많은 위치로부터 준비된다. 결과적인 RNA-DNA 혼성물은 종래 알려진 다양한 효소 단계 에 의해서 두 가닥 DNA 분자로 전환된다(Watson et al., 1992, Recombinant DNA, 2nd edition, Scientific American Books, New York).
cDNA 라이브러리를 구축하기 위해서, 폴리(A)+RNA 단편이 올리고-dT 셀룰로스 크로마토그래피(Pharmacia)에 의해서 분리될 수 있고, 그리고 3 - 5 ㎍ 폴리(A)+RNA가 λZAP 발현 벡터(Stratagene)에서 cDNA 벡터를 구축하기 위해서 사용된다. 선택적으로, cDNA 라이브러리가 λTriplEx2 벡터에 PCR-계 방법을 통해서 구축되며, SMART(Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript)cDNA 라이브러리 구축 키트(Clontech)를 이용한다. 제 1 가닥 cDNA 는 Xho I-올리고(dT)아탑타-프라이머로 5'-메틸 dCTP 존재하에서 합성된다. 제 2 가닥 합성 및 EcoRI 아탑타의 결찰 후, cDNA 가 Xho I 으로 소화되고, 3'말단에서 Xho I 및 5'말단에서 EcoRI 부위에 의해서 측위(flanked)된 cDNA 가 된다. 소화된 cDNA 는 Sephacryl S-500 스핀 컬럼(Stratagene)에서 사이즈-분획되며, 다음 EcoRI 및 Xho I로 선소화된 λZAP 발현 벡터내로 결찰된다. 결과적인 DNA/cDNA 콘카토머(concatomer)가 Gigapack Gold packing extract를 이용하여 팩킹되었다. 적정후, 1 차 팩킹 혼합물의 분취량들이 7 % DMSO 에 1 차 라이브러리 재고로 - 80 ℃ 에서 저장되고, 나머지는 안정한 라이브러리 재고를 설립하기 위해서 증폭되었다.
증폭된 라이브러리로부터, 파지 플라크(plaque)가 적절한 매질에 평판배양된다. 바람직하게, 파지 플라크는 200 - 500 pfu/150 mm 플레이트의 밀도로, IPTG/X-gal 을 색상 선택을 위해 구비한 Esxherichia coli XL1-blue MRF'lawn 상에 평판배양된다. 플라크는 다음 램덤하게 골라지고, 그리고 포지티브 삽입이 이하 기술된 종래 공지된 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해서 확인된다. 바람직하게, 플라크가75 ㎕ 부유 매개 버퍼( 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 1 mM Tris, pH7.5, 0.02 % 젤라틴)내로 골라진다. 파지 용출물( 5 ㎕)이 PCR 반응( 50 ㎕ 총 부피)을 위해 125 umol/L 의 각 dNTP(Pharmacia), 10 pmol 의 각 변성 T3(5'-GCCAAGCTCGAATTAACCCTCACTAAAGGG-3') 및 T7(5'-CCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCG-3')프라이머, 및 2 U 의 Taq DNA 폴리머라제(Pharmacia)와 함께 사용된다. 반응은 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elimer)[95 ℃ 에서 5 분, 이어서 30 사이클 증폭(94 ℃, 45 초; 55 ℃, 30 초; 72 ℃, 3 분) 및 최종 등온 연장(72 ℃, 3 분)]에서 사이클된다. 아가로즈 겔 전기영동이 삽입물의 존재와 순도를 측정하기 위해서 사용된다.
PCR 생성물은 다음 공지된 방법을 이용하여(상기 Ausubel et al., Sambrook et al.)DNA 서열화를 거친다. 서열화 방법은 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편, SequenaseR(US Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq 폴리머라제(Perkin Elmer, Norwalk, CT), 열안정 T7 폴리머라제(Amersham, Chicago, IL)과 같은 효소, 또는 재조합 폴리머라제와 ELONGASE Amplification System(Gibco BRL, Gaithersburg,MD)와 같은 교정 엑소뉴클리아제의 조합을 이용한다. 바람직하게, 공정은 Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno NV), Peltier Thermal Cycler(PTC200; MJ Research, Watertown, MA), ABI 377 DNA sequencers(Perkin Elmer) 및 PE Biosystems ABI prism 3700 DNA Analyzer 와 같은 기계들을 이용하여 자동화된다.
PCR 생성물은 특이적 프라이머,BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing v2.0Ready Reaction(PE Biosystems), Tris MgCl 버퍼 및 물을 써모사이클러(thermocycler) 에서 이용한 DNA서열화 반응을 거친다. 서열화 반응이 94 ℃ 에서2 분간 배양되고, 94 ℃ 30 초, 55℃ 20 초, 및 72 ℃ 1 분의 25 사이클 및 94 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분, 및 72 ℃ 5 분의 15 사이클이 이어진다. 반응은 종래 에 공지된 방법(즉, 알코올 침전 또는 에탄올 침전)을 이용하여 정제될 때까지 4 ℃ 에서 고정된다. 자동화된 서열화는 PE Biosystems ABI Prism 3700 DNA Analyzer 로 수행하는 것이 바람직하다.
PCR
한 측면에서, 발명의폴리뉴클레오티드 서열은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해서 증폭된다. PCR은 당업자에게 공지된 방법이다.
PCR 은 관심의 타겟 서열을 증폭하기 위해 열안정한, DNA-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 촉매화된 DNA 복제의 복수 사이클을 이용하여 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 신속하게 증폭하는 방법을 제공한다. PCR 은 증폭될 핵산, 증폭될 서열을 측위시키는 두가닥 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 폴리머라제, 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 버퍼 및 염의 존재를 요구한다.
PCR 은 공지의 방법이다. PCR 은 여기서 참고문헌으로 도입된 Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335에서 기술된것처럼 행해진다.
PCR 은 주형 DNA(적어도 1 fg: 보다 유용하게, 1- 1000 ng)및 적어도 25 pmol 올리고뉴클레어티드 프라이머를 이용하여 수행된다. 전형적인 반응 혼합물은 다음을 포함한다: 2 ㎕ 의 DNA, 25 pmol 의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2.5 ㎕의 10 H PCR buffer 1(Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 ㎕ 의1.25 μM dNTP, 0.15 ㎕(또는 2.5 units)의 Taq DNA 폴리머라제(Perkin Elmer, Foster City, CA) 및 25 ㎕까지 탈이온수. 미네랄 오일이 오버레이되고, 그리고 PCR 은 프로그램이 될 수 있는 온도 사이클을 이용하여 수행된다.
PCR 사이클 각 단계의 온도와 길이 및 사이클의 숫자는 효과에 있어서 엄격한 요구에 따라 조절된다. 어닐링 온도 및 시간은 프라이머가 주형에 대해 풀리는 효율 및 용인될 수 있는 미스매치의 정도 둘다에 의해서 결정된다. 프라이머 어닐닝 조건의 엄중성을 최적화하는 능력은 당업자 지식내에 있다. 30 에서 70 ℃ 사이의 어닐닝 온도가 사용된다. 주형분자의 초기 변성은 92 ℃ 에서 99 ℃ 사이에서 4 분동안에 발생하고, (94 - 99 ℃15 초에서 1 분)변성, 어닐닝(상기와같이 결정된 온도에서 1 - 2 분), 연장(72 ℃ 에서 1 분)이 20 - 40 사이클이 이어진다. 최종 연장 단계는 4 분동안 72 ℃ 에서 수행되며, 4 ℃ 부정단계(0 - 24 시간)에 의해 이어질 수 있다.
전기영동이 없이 정량적으로 PCR 생성물을 검출하는 몇몇 기법들이 본 발명에서 유용할 수 있다. 이들 기법중의 하나는 전사체-특이성 반의미 프로브으로 수행되는데, 이를 위해 TaqmanTM(Perkin Elmer, Foster City, CA)과 같은 상업적으로 이용가능한 키트가 있다. 이 프로브는 PCR 생성물(예를 들면, 유전자로부터 유래된 핵산 단편)에 특이적이며, 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 복합된 형광 리포터 프로브와 퀸처로 제조된다. 상이한 형광 마카가 상이한 리포터에 부착되고, 한 반응에서 두 생성물의 측정을 가능하게 한다. Taq DNA 폴리머라제가 활성화될 때, 그 5'-대-3' 엑소뉴클리아제 활성의 특성을 수단으로 주형에 고정된 프로브의 형과 리포터를 쪼개낸다. 퀸처의 부재하에서, 리포터는 이제 형광한다. 리포터에서의 색상 변화가 각 특이적 생성물의 양에 비례하고, 그리고 형광미터에 의해서특정되고, 그러므로, 각 컬러의 양이 측정되고, PCR 생성물이 정량화된다. PCR 반응은 96 웰플레이트에서 수행되어, 많은 개체로부터 유래된 시료들이 가공되고 동시에 측정된다. TaqmanTM시스템은 겔 전기영동을 요구하지 않는 추가적인 잇점을 가지며, 그리고 표준곡선으로 사용시 정량이 가능하게 한다.
발명에 따른 유용한 폴리뉴클레오티드 서열
발명은 프로브로서 사용되고, 마이크로배열에서 배열되며, 및/또는 골관절염의 처치를 위한 치료의 개발에 이용될 수 있는 EST 를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
다른 측면에서, 상이한 발달 단계에서 연골 유전자 발현 프로파일은 동일하다. 다른 측면에서, 본 발명은 다른 상태의 골관절염으로 진단된 골관절염 환자의 연골 유전자 발현 프로파일을 모니터하는 것이다. 제3 측면에서, 본 발명은 질병에 걸린 연골 세포의 유전자 발현 프로파일을 변형시키는 잠재적 치료제를 걸러내는 것이다. 그러므로 본 발명은 하기 발달 및 질병의 각 단계에서 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다: 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 그리고 심각한 골관절염. 발명은 또한 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염의 발달 및 질병 상태의 어떤 두개에서 디퍼렌셜하게 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 발명에 따른 유용한 폴리뉴클레오티드는 발달 및 질병단계(정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 그리고 심각한 골관절염)로부터 연골조직 시료를 분리하는 단계, cDNA 라이브러리(상기의 기재와 같이)를 제조하는 단계, 및 발현된 서열 태그(ESTs)를 생성하기 위해서 cDNA 라이브러리의대량 스케일 부분 서열화(여기서 기술)를 수행하는 단계에 의해서 제조된다. 발명에 따라서 유용한 EST는 일반적으로 50 -1000 뉴클레오티드의 범위, 바람직하게는 50 -500 뉴클레오티드 길이의 범위에서 존재한다.
발명은 폴리뉴클레오티드 서열 또는 "신규" 또는"공지와 같이 카테고리가 되는 EST 를 제공하며, "기능을 가진 공지된 서열" 및 "공지 기능이 없는 공지된 서열을 포함한다.
핵산 멤버와 프로브
한 측면에서, 발명은 타겟 핵산 서열(예를 들면 연골 핵산 시료에 존재하는)에 특이적으로 결합하는 핵산 멤버와 프로브를 제공하는 것이다.
핵산 멤버는 본 발명에 따른 배열을 포함하는 고체 지지체에 안정하게 결합된다. 핵산 멤버의 길이는 50 - 6000 뉴클레오티드, 100 - 500 뉴클레오티드, 다른 실시예에서는 500 - 1500 뉴클레오티드의 범위에서 존재한다. 핵산 멤버는 단일 또는 두가닥 일 수 있으며, 및/또는 cDNA 로부터 증폭된 PCR 단편일 수 있다.
발명은 프로브를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 또한 제공한다. 어떤 실시예에서, 프로브는 공지 방법에 따라서 표지된다. 발명에 따른 프로브는 50 - 5000 뉴클레오티드, 100 - 500 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 50 - 250 뉴클레오티드 길이이다. 프로브는 단일가닥 또는 두가닥 일수 있으며, 그리고 cDNA 로부터 증폭된 PCR 단편일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 멤버와 프로브는 연골세포 풍부 또는 연골세포-특이적 서열, 시료내 그 존재가 골관절염의 상태를 가르키거나 또는 진단, 예측하는 바람직한 서열과 같은 타겟 서열을 검출하기 위해서 사용될 수 있다.
분석되는 타겟 핵산 서열은 바람직하게 인간 연골, 혈액 또는 활액 유체로부터이며, 바람직하게는 RNA 또는 RNA 에 상응하는 핵산(즉, cDNA 또는 RNA 또는 cDNA의 증폭된 생성물)을 포함한다.
데이타 습득 및 EST 서열 분석
발명은 "신규한 서열", "신규한 발현된 서열 태그(ESTs)" 및 "기능을 가진 공지된 서열"과 "공지된 기능이 없는 공지된 서열"을 포함하는 "공지된 서열"을 포함한다.
발생된 EST서열들은, 공지된 유전자 또는 다른 ESTs에 대한 EST 매칭에 대한 추정 동등성을 결정하기 위해서, NCBI 를 통해서 "nt", "nr", "est", 및 "htg" 데이타 베이스를 포함하는 이용가능한 데이타베이스를 대해서 검색된다. 상대적인 EST 빈도 수준은 공지된 방법을 이용해서 계산될 수 있다. 공지된 유전자 매치로 ESTs의 기능적 특성들이 어떤 공지된 방법에 따라서 만들어진다. 바람직하게, 발생된 EST 서열들은 BLAST 알고리즘(8)을 이용하여 dbEST 데이타베이스 및Genbank/EMBL/DDBJ 데이타베이스와 비교된다. P=10-10의 최소치 및 뉴클레오티드 서열 동일성 ＞ 95 %, 여기서 서열 동일성은 비-연속적이거나 또는 분산되며, 공지 유전자 또는 다른 ESTs 에 대한 EST 매칭에 대한 추정의 동일성의 할당에 요구된다. EST 세트에서 대표되는 유전자의 비-중복 리스트의 구축이 National Center for Biotechnology Information(NCBI)site(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 에서 Unigene, Entrez 및 PubMed 도움으로 이루어진다. 상대적인 유전자 발현 빈도는 각 유전자에 대한 EST 복사의 수를 분석된 EST 총수에 의해서 나눔으로서 계산된다.
유전자는 공지된 방법에 따른 ESTs 로부터 확인된다. EST 서열로부터의 신규한 유전자를 확인하기 위해서, EST 는 바람직하게는 적어도 100 뉴클레오티드 길이이어야 하며, 보다 바람직하게는 주석을 위해 150 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게, EST 는 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 특성을 보여준다(즉, 추정 폴리펩티드를 엔코드할 수 있다)
인간 게놈 프로젝트의 완성때문에, 게놈 서열과 매치되는 특정 EST는 게놈 서열의 염색체 위치에 기초한 특이적 염색체상에 지도화될 수 있다. 그러나, 서열에 의해서 엔코딩된 단백질에 대해서 어떤 기능도 알려지지 않았으며, 그리고 EST가 기능적 의미에서 "신규한"것으로 고려된다. 일 측면에서, 발명은 어떤 기능도 알려지지 않은 보다 큰 공지서열의 부분인 신규한 EST 를 확인하기 위해서, EST 를 포함하는 유전자의 기능을 측정하기 위해서 사용된다(예를 들면, 유전자에 의해서 생산된 발현 생산물의 콘드로제니시스(chondrogenesis) 및 또는 연골세포에 영향을미치는 병리학에서 역할). 선택적으로, 또는 추가적으로, EST는 콘드로제니시스 및/또는 연골세포에 영향을 미치는 병리학의 진단 또는 예측 마커로서 보다 큰서열에 의해서 엔코드된 mRNA 또는 폴리펩티드를 확인하기 위해서 이용될 수 있다.
연골세포 풍부, 또는 연골세포-특이성으로서 보다 큰 서열에 상응하는 EST를 확인하고, 그 EST를 포함하는 더큰 서열의 다른 부분은 유전자 기능을 밝히기 위해서 측정에서 사용될 수 있는데, 즉 유전자에 의해서 엔코드된 폴리펩티드의 분리, 이들 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체의 생성, 폴리펩티드의 결합 파트너를 확인(수용체, 리간드, 길항제, 작동약 등등) 및/또는 태아, 성인, 정상, 및/또는 질병걸린 개체에서 골관절염에서 유전자의 발현(또는 이들의 부족) 을 검출하기 이다.
다른 측면에서, 발명은 질의가 행해지는 시간에서 서열 데이타베이스에서 어떤 공지된 서열에 "유의적 매치"를 나타내지 않는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이들 형태의 신규한 EST 서열을 포함하는 보다 긴 게놈 단편은 게놈 라이브러리를 탐사함으로서 확인될 수 있으며, 반면 보다 긴 발현된 서열은 cDNA 라이브러리에서 확인될 수 있으며, 및/또는 종래 공지된 프라리머 서열을 유도하는 EST 서열을 이용하여 폴리머라제 연장 반응(예를 들어, RACE)를 수행함으로서 확인될 수 있다. 보다 긴 단편은 특정한 염색체 상에, FISH 및 게놈 및/또는 발현된 서열 데이타베이스에서 공지 서열과 비교되는 다른 기법 및 서열에 의해서, 지도화될 수 있으며, 그리고 기능적 분석이 상기와 같이 행해질 수 있다.
발명에 따른 방법을 이용하여, cDNA 라이브러리로부터의 총 57,422 ESTs로부터, 어떤 유의하지 않은 매치가 618 서열에 대해서 발견되었다. 남은 서열은 도 5 에서 보여지는 것과 같이 특징되었다.
확인된 유전자는 이들의 추정적 기능에 따라서 카테고리화 된다. 공지된 유전자 매치를 가지는 EST 의 기능적 규정은 Hwang et al(5) 에 기술된 카테고리에 따라서 만들어질 수 있다. 각 아세포성(subcellular) 카테고리에서 유전자의 분포는 조직의 동작 상태를 가르키며, 그리고 골관절염 질병 과정에 대한 중요한 통찰력을 제공한다. 이 분석의 결과는 도 7 에서 제공되며, 여기서 상이한 인간 연골 라이브러리에서 방법에 의해서 확인된 EST 의 총수는 각 라이브러리에서 확인된 공지된 유전자의 기능성 분류에 기초되어 특성화된다.
선택적인 EST 분석 방법이 또한 이용가능하다. 예를 들면, 각 라이브러리로부터 EST는 서열 정열, 편집 및 PHRED 및 PHRAP(Ewing, et al., 1998, Genome Res. 3: 175, 여기서 도입; http://bozeman.genome.washington.edu/)과 같은 어셈블리 프로그램으로 콘티그스(contigs)내로 회합된다. 콘티그 과잉은 EST 클론 확인 번호를 이용하여 비겹침 서열 콘티그를 뭉치게 함으로서 감소되며, 이것은 단일 EST cDNA 클론에 대한 비겹침 51및 31서열 판독에 대해 통상적이다. 한 측면에서, 각 클러스터로부터 일치 서열은 비-잉여 Genbank/EMBL/DDBJ 및 dbEST 데이타베이스에 대해서 unigene, Entrez and PubMed at NCBI site의 도움으로 BLAST 알고리즘을 이요하여 비교된다.
공지된 폴리뉴클레어티드 서열 또는 EST 및 신규한 폴리뉴클레오티드 서열또는 EST
존재하는 폴리뉴클레오티드 서열 데이타베이스를 보여주는 적어도 하나의 존재하는 서열에 유의한 매치를 보여주는 EST 는(＞65 %, 그리고 바람직하게는 90 % 또는 이상, 동일성) 발명에 따라서 "공지된"서열로 규정된다. 이러한 카테고리내에서, 일부 알려진 EST 는 공지된 기능을 가지는 폴리펩티드를 엔코드하는 존재하는 서열에 대해 매치되며, 그리고 "기능을 가진 공지된 서열"로 언급된다. 다른 "알려진" ESTs 는 미지 기능의 폴리펩티드를 엔코드하는 존재하는 서열에 대해 유의한 매치를 보여주며, "미지 기능을 가진 공지 서열"로 언급된다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 연골세포 풍부 또는 연골세포-특이성인 공지 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
상기 인용된 이용가능한 데이타베이스에서 존재하는 어떤 서열에 대해서 유의한 매치를 가지지 않는 EST 서열(65 % 미만 동일성)은 신규한 EST 로서 카테고리화된다. 이 신규한 EST는 연골세포특이성으로 고려되는데, 이들은 어떤 다른 조직으로부터 유래된 EST 또는 다른 유전자에 매치되지 않기 때문이다. EST 서열로부터 신규한 유전자를 확인하기 위해서는 EST가 적어도 150 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 보다 바람직하게는 EST 는 적어도 일부의 오픈 리드 프레임, 즉 전사개시코돈과 종료 코돈 사이의 폴리뉴클레오티드를 엔코드하며, 이것은 잠재적으로 폴리펩티드 서열로 번역된다.
발명은 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염 연골에서 독특하게 발현되는 공지 및 신규 폴리뉴클레오티드서열을 제공한다. 도 6 및 13 은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 태아, 정상, 마일드 골관절염, 및 심각한 골관절염 cDNA 라이브러리에서의 데이타와 동일한, 독특한 공지된 유전자와 신규한 서열의 이름을 보여준다.
발명은 또한 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염 연골에서 상향규율(upregulate) 및 하향규율(downregulate)된 공지 및 신규한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일면으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 비-연골세포인 세포와 비교시 연골세포에서 풍부하고, 또는 정상개체에 비해서 골관절염을 가진 개체로부터의 연골세포에서 풍부하고, 또는 특정한 다른 발달 또는 질병상태에 비교하여 특정 발달 또는 질병상태로부터 연골세포에서 풍부하다.
발명은 또한 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염의 발달 및 질병상태의 어떤 둘로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
상대적인 EST 빈도는 각 유전자의 EST 복사수를 분석된 EST 총수로 나눔으로서 계산된다. 다수의 신규한 EST의 연골세포-특이성 발현은 공지의 방법으로 확인된다. 조직에서 유전자 발현에 대한 유용한 방법은 RT PCR, Northern blot, etc. 를 포함한다.
신규한 핵산 분자
본발명의 많은 신규한 핵산 분자가 마일드와 심각한 골관절염 질병상태사이에서 디퍼렌셜하게 발현되고, 그리고 그래서 골관절염 질병과정에 대한 잠재적 약물 타겟 또는 마커로서 유용하다. 발명은 또한 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염의 발달 및 질병 상태의 2 이상에서 디퍼렌셜하게 발현된 하나이상의 핵산 분자를 제공한다. 발명은 또한 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염 발달 및 질병 상태의 2 이상에서 디퍼렌셜하게 발현된 하나 이상의 신규한 클론을 제공한다.
마이크로배열
폴리뉴클레오티드 마이크로배열
어떤 연골세포 cDNA 라이브러리로부터 발생된 폴리뉴클레오티드 서열의 어떤 조합이 마이크로배열의 구축을 위해서 사용된다. 한 실시예에서, 마이크로배열은 연골세포-특이적이며, 골관절염 질병 과정에서 중요한 모든 범위의 유전자를 포함한다고 예상된다. 발명에 따른 마이크로배열은 10 - 20,000 사이의 핵산 멤버를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 적어도 5000 핵산 멤버이다. 핵산 멤버는 여기서 기술된 공지 또는 신규한 폴리뉴클레오티드 서열이거나, 또는 이들의 어떤 조합이다. 발명에 따른 마이크로배열은 다른 연골 발달 및 골관절염 질병 상태에서 특이적으로 발현된 유전자의 디퍼렌션 유전자 발현 프로파일을 확인하기 위해서 사용된다.
발명은 또한 골관절염 발달에 대한 초기 위험인자의 확인을 가능하게 하는 정상과 마일드 골관절염 환자사이에서 디퍼렌셜하게 발현되는 유전자를 포함하는 마이크로배열을 제공한다. 발명은 정상 개체와 마일드, 중간정도, 현저 또는 심각한 골관절염으로 진단된 환자사이에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 골관절염 진단용 마이크로배열을 제공한다. 그러한 배열은 또한 치료에 대한 환자의 응답을 모티터하는 예측 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게, 골관절염 진단용 배열은 10 - 20,000 핵산 멤버를 포함하고, 바람직하게는 50 - 15,000 핵산 멤버이다. 다른 실시예에서, 상기 마이크로배열은 연골세포의 동화 활성을 조절하거나 또는 정상, 태아, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염의 어떤연골세포 질병 또는 발달 단계의 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 수준을 변화(증가 또는 감소)시키는 치료제를 확인하기 위해서 사용된다.
혼성화되고, 본 발명의 마이크로배열로 분석되는 타겟 핵산 시료는 바람직하게 인간 연골, 혈액 또는 활액 유체로부터이다. 이 절차의 제한은 타겟 핵산 시료로서 사용에 유용한 총RNA의 양에 있다. 바람직하게, 적어도 하나의 1 마이크로그람의 총 RNA가 이 발명에 따른 이용에 대해서 얻어진다. 이것은 활액유체와 많은 연골 비옵시 시료에서의 RNA 의 양이 매우적으므로 유용하다.
마이크로배열의 구축
일 측면에서, 인간 연골 cDNA라이브러리로부터 생성된 cDNA 는 마이크로배열상에 배열된다. 바람직하게, 발명에 따른 마이클로배열은 연골세포 풍부 또는 연골세포-특이적 유전자를 포함하고, 그리고 골관절염 질병 과정에서 중요한 전체 유전자 스펙트럼을 포함한다.
도 6 에서 EST 빈도 분석(및 도 15 와 도 16 에서 보여지는 그것의 부분)은공지 유전자에 대한 디퍼렌셜 유전자 발현 프로파일을 보여준다. 발명에 따른 마이크로 배열은 이들 프로파일을 확인하기 위해서 사용될 수 있으며, 그리고 상이한 발달상태 및 골관절염 질병 상태사이에서 디퍼렌셜 발현 프로파일을 신규한 EST 에 대해서 보여주기 위해서 사용될 수 있다. 이들 신규한 EST 서열은 얼마나 많은 독특한 유전자가 신규한 EST 서열에 의해서 표현되는가를 측정하기 위한 클러스터 및 배열 분석에 의해서 규정될 수 있다. 이 신규한 독특한 확인된 유전자는 골관절염 질병 진행 및 치료에서 중요한 마커를 규명하는데 기초를 제공할 수 있다.
대상 방법에서, 실질적으로 고체 지지체의 표면에 안정하게 결합된 핵산 멤버의 배열은, 하나이상의 상보성 핵산 멤버가 배열상 독특한 위치에서 타겟 핵산에 특이적으로 혼성화하는 상보성 핵산 멤버/타겟 복합체의 혼성화 패턴을 생성하기에 충분한 혼성화 조건하에서 타켓 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시료와 접촉되어 있다. 혼성화하는 타겟 핵산의 확인은 배열상의 핵산 멤버의 위치를 기준하여 결정될 수 있다.
핵산 멤버는 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 및 역전사(RT)와 같은 확립된 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 이들 방법은 종래 기술분야에서 현재 공지된 것과 유사하다(PCR Strategies, Michael A. Innis(Editor), et al.(1995) and PCR: Introduction to Biotechniques Series, C. R. Newton A. Graham(1997)). 증폭된 폴리뉴클레오티드는 종래 공지된 방법에 의해서 정제된다(예를 들면, 컬럼 정제 또는 알코올 침전). 폴리뉴클레오티드는, 이것이 프라이머와 소정의 폴리뉴클레오티드 합성중 생성된 불완전 생성물이 없어지도록 분리될 때, 순수한 것으로 고려된다. 바람직하게, 정제된 폴리뉴클레오티드는 분자의 특이적 결합 활성을 방해하거나 그렇지않으면 가릴 수 있는 오염물이 없을 것이다.
발명에 따른 마이크로배열은 20 상이한 폴리뉴클레오티드/㎠ 을 초과하는 밀도에서 고체 지지체의 한 표면에 부착된 복수의 독특한 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 각각의 폴리뉴클레오티드는 비-동일한 선-선택된 영역에서 고체 지지체의 표면에 부착된다. 배열상의 각 결합된 시료들은 일반적으로 알려진 서열의, 공지된 동일성의 폴리뉴클레오티드 조성물을 포함하며, 하기에 더 자세히 기재된다. 어떤 있을 수 있는 기질이 발명에 이용될 수 있다.
한 실시예에서,고체 지지체의 표면에 부착된 폴리뉴클레오티드는 DNA 이다. 바람직한 실시예에서, 고체 지지체의 표면에 부착된 폴리뉴클레오티드는 cDNA 또는 RNA 이다. 다른 바람직한 실시예에서, 고체 지지체의 표면에 부착된 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해서 합성된 cDNA 이다. 바람직하게, 배열에서 핵산 멤버는 발명에 따라서 적어도 50 뉴클레어티드의 길이이다. 한 실시예에서, 핵산 멤버는 적어도 150 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게, 핵산 멤버는 1000 뉴클레오티드 길이 미만이다. 보다 바람직하게, 핵산 멤버는 500 뉴클레오티드 길이 미만이다. 한 실시예에서, 배열은 적어도 고체 지지체의 한표면에 부착된 적어도 10 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 배열은 고체 지지체의 한표면에 부착된 적어도 100 개의 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 배열은 고체 지지체의 한 표면에 부착된 적어도 10,000 개의 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서 배열은 고체지지체의 한 표면에적어도 15,000 개의 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
발명의 다른 배열에서, 폴리뉴클레오티드 조성물은 고체 지지체의 표면에 안정하게 결합되어 있으며, 여기서 지지체는 유연하거나 또는 단단한 고체 지지체일 수 있다. "안정하게 결합된"은 각 핵산 멤버가 혼성화와 세척 조건하에서 고체지지체에 관련하여 독특한 위치를 유지한다는 것을 의미한다. 일예로 시료들은 비-공유적으로, 또는 공유적으로 지지체 표면에 안정하게 결합되어 있다. 비-공유적 결합의 예는 비특이적 흡착, 정전기적 상호작용에 기초한 결합(예를 들면, 이온 쌍 상호작용), 수소결합 상호작용, 소수 상호작용, 지지체 표면에 공유적으로 부착된 특이적 결합쌍 멤버를 통한 특이적 고정 등등을 포함한다. 공유 결합의 예는 폴리뉴클레오티드 및 단단한 지지체의 표면에 존재하는 기능기(예를 들면, --OH)사이에 형성된 공유결합을 포함하며, 여기서 기능기는 자연적으로 발생하거나 또한 하기에서 더 자세히 기술되는 것과 같이, 연결기의 도입의 멤버로서 존재할 수 있다.
각 조성물에 존재하는 폴리뉴클레오티드의 양은 배열이 이용된 측정 중 적절한 혼성화를 제공하고, 그리고 타겟 폴리뉴클레오티드 서열의 검출하기에 충분한 양이다. 일반적으로, 배열의 고체 지지체와 안정하게 결합된 각 핵산 멤버의 양은 적어도 약 0.001 ng 이며, 바람직하게 적어도 약 0.02 ng 그리고 보다 바람직하게 적어도 0.05 ng이며, 여기서 그 양은 1000 ng 정도 높거나 또는 그 이상일 수 있으나, 그러나 20 ng 을 초과하지 않을 것이다. 여기서 핵산 멤버는 고체지지체 상에 모든 원형 디멘젼을 포함하는 스팟에서 "스팟팅"되며, "스팟"의 직경은 약 10 에서 5,000 ㎛의 범위이며, 일반적으로 약 20 에서 2,000 ㎛이고, 보다 일반적으로 약100 에서 200 ㎛ 이다.
제어 핵산 멤버는 게놈 DNA, 하우스키핑 유전자, 벡터 서열, 식물 핵산 서열, 네거티브 및 포지티브 제어 유전자, 등등에 상응하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 멤버를 포함한다. 제어 핵산 멤버는 그 기능이 특정한 관심있는 "키"유전자가 발현되었는지를 말하는 것이 아니라 유전자를 제어하거나 보정하지만, 그러나 발현의 배경 또는 기초적 수준과 같은 다른 유용한 정보를 제공한다.
다른 제어 폴리뉴클레오티드는 배열상에 스팟되고, 그리고 타겟 발현 제어 폴리뉴클레오티드 및 미스매치 제어 뉴클레오티드로 사용되어, 프로브의 지정된 타겟을 이외의 시료내 폴리뉴클레오티드에 대한 비특이적 결합 또는 상호-혼성화를 모티터한다. 미스매치 프로브는 그래서 혼성화가 특이적인지 아닌지를 가르킨다. 예를 들어, 타겟이 존재하며, 바람직하게 매치된 프로브는 미스매치된 프로브보다 일관되게 더 밝다. 추가로, 모든 제어 미스매치가 존재한다면, 미스매치 프로브가 변성을 검출하기 위해서 사용된다.
고체 기질
발명에 따른 배열은 유연하거나 또는 단단한 기질을 포함한다. 유연한 기질은 부서지지 않으면서 구부러지고, 접쳐지고, 또는 유사하게 이용될 수 있다. 본 발명의 관점에서 유연한 고체 지지체인 고체 재료의 예는 막, 예를 들면 나일론, 유연한 플라스틱 필름, 등등을 포함한다. "단단한"은 지지체가 고체이며, 그리고 쉽게 구부러지지 않으며 즉 지지체가 유연하지 않다는 것을 의미한다. 일예로, 대상 배열의 단단한 기질은, 배열이 이용되는 측정 조건하에서, 특히 고처리량 조작 조건하에서, 그 위에 존재하는 결합된 폴리뉴클레오티드에 물리적 지지체 및 구조를 제공하기에 충분하다.
기질은 생물학적, 비-생물학적, 유기적, 무기적, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 입자, 스트랜드, 침전물, 겔, 시트, 튜브, 구형, 비드, 컨테이너, 캐필러리, 패드, 슬라이스, 필름, 판, 슬라이드, 칩 등으로 존재할 수 있다. 구조는 어떤 통상의 형상, 예를 들면 디스크, 사각형, 구형, 원형등일 수 있다. 기질은 바람직하게 플레이트나 또는 플레너이며, 그러나 다양한 선택적 표면 형상을 가질 수 있다. 기질은 중합된 Langmuir Blodgett film, 기능화된 유리, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4, 변형된 실리콘, 또는 다양한 겔 중의 하나 또는 (폴리)테트라플로로에틸렌, (폴리)비닐디엔디플로라이드, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 또는 이들의 조합과 같은 폴리머이다. 다른 기질 재료는 이러한 공개사항을 검토할 때, 당업자에게 명백할 것이다.
바람직한 실시예에서, 기질은 평평한 유리 또는 단-결정(single-crystal)실리콘이다. 일부 실시예에 따르면, 기질의 표면은 소정의 형상을 제공하도록 공지된 기법을 이용하여 에칭된다. 예를 들면, 트렌치, v-홈, 메사 구조, 등등을 형성하는 방법에 의해서, 합성 영역이 충돌광의 초첨내에 더 가깝게 위치될 수 있으며, 반사형"거울" 구조를 형광 출처 등으로부터부터 광 결집을 최대화하기 위해서 제공될 수 있다.
고체 기질의 표면은 항상은 아니지만, 일반적으로 기질과 동일한 재질로 구성된다. 선택적으로, 표면은 예를 들어, 폴리머, 플라스틱, 수지, 폴리사카라이드, 실리카 또는 실리카계 재료, 탄소, 금속, 무기 글라스, 막, 또는 상기 열거죈 기질 물질중의 어떤 것과 같은 매우 다양한 물질로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 표면은 기질의 표면에 단단하게 부착된 속박된 결합 멤버의 용도로 제공될 수 있다. 바람직하게, 표면은 반응기를 포함하며, 이것은 카르복실, 아미노, 하이드록실, 등등이다. 가장 바람직하게, 표면은 광학적으로 투명하고, 표면 Si--OH 기능을 가지며, 일예로 실리카 표면에서 발견된다.
비록 링커 분자가 발명의 요구되는 요소가 아닌 것으로 이해될지라도, 기질의 표면은 바람직하게 링커 분자의 층이 제공된다. 링커 분자들은 발명의 폴리뉴클레오티드를 허용하고, 그리고 기질에서 다른 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되고, 그리고 기질에 노출된 분자와 자유롭게 상호작용을 할 수 있을 만큼 충분한 길이를 가지는 것이 바람직하다.
종종, 기질은 실리콘 또는 글라스 표면, (폴리)테트라플로로에틸렌, (폴리)비닐디엔디플로라이드, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 대전된 막, 일예로 나일론 66, 또는 니트로셀룰로즈, 또는 이들의 조합이다. 바람직한 실시예에서, 고체 지지체는 유리이다. 바람직하게, 기질의 적어도 하나의 표면은 충분히 평평하다. 바람직하게, 고체 지지체의 표면은 반응기를 포함할 것이며, 한정되지는 않지만, 카르복실, 아미노, 하이드록실, 시올, 등등을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 표면은 광학적으로 투명하다. 바람직한 실시예에서, 기질은 폴리-리신 코팅된 슬라이드 또는 감마 아미노 프로필 실란-코팅된 Corning Microarray Technology-GAPS 또는 CMT-GAP2 코팅된 슬라이드이다.
핵산 멤버가 부착될 수 있는 어떤 고체 지지체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 적절한 고체 지지체의 예는 제한되지는 않지만 유리 및 실리카겔과 같은 실리케이트, 셀룰로즈, 및 니트로셀룰로즈 종이, 나일론, 폴리스티렌, 폴리메타아크릴레이트, 라텍스, 고무, 및 플로로카본 수지 일예로 TEFLONTM를 포함한다.
고체 지지체 물질은 매우 다양한 형상으로 이용될 수 있으며, 제한되지는 않지만 슬라이드와 비드를 포함한다. 슬라이드는 몇몇 기능성 이점을 제공하며, 그래서 고체 지지체의 바람직한 형상이다. 이들의 평평한 표면 때문에, 프로브와 혼성화 시약은 글라스 슬라이드를 이용하여 최소화된다. 슬라이드는 또한 시약의 타겟 응용을 가능하게 하며, 어떤 일정한 온도에서 유지하기가 용이하고, 세척에 용이하며, 고체 지지체 상에 고정된 RNA 및/또는 DNA 의 직접적인 시각화를 가능하게 한다.
기술된 기능을 제공하는한 고체 지지체로 선택된 특정 물질이 발명에 필수적인 것은 아니다. 통상적으로, 발명을 하거나 또는 이용하는 이들은 경제적 가격, 이용가능성, 최종 생성물의 예상되는 응용 요구사항, 전체적인 제조 공정의 요구등에 기초하여 상업적으로 이용가능한 최선의 물질을 선택할 것이다.
스팟팅 방법
일면에서, 발명은 배열을 제공하며, 여기서 배열을 포함하는 각 핵산 멤버는고체 지지체상에 스팟된다.
바람직하게, 스팟팅은 하기와 같이 실시된다. 골관절염, 태아 또는 정상 연골 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론의 PCR 생성물들이(~ 40 ㎕)가 증폭을 위해서 사용된 동일한 96 웰 튜브에서 4 ㎕(1/10 부피)의 3M 쏘듐 아세테이트(pH 5.2) 및 100 ㎕(2.5 부피)의 에탄올로 침전되고, 밤새 - 20 ℃ 에서 보관된다. 이들은 다음에 3,300 rpm 으로 4 ℃ 에서 1 시간동안 원심분리된다. 수득된 펠렛들은 50 ㎕ 얼음 냉각 70 % 에탄올로 세척되었으며, 다시 30 분동안 원심분리되었다. 다음 펠렛들은 공기 건조되고 20 ㎕ 3X SSC 또는 50 % 디메틸실록사이드(DMSO)에서 밤새 재부유된다. 다음 시료들이 로보트 GMA 417 또는 427 배열기(Affymetrix,Ca)를 이용하여 폴리리신-코팅 슬라이드(Sigma Cat. No. P0425)상에 단일 또는 복수로 스팟된다.
마이크로배열에서 스팟의 경계들은 다이아몬드 스크라이버(scriber)(스팟은 후-가공후 보이지 않기때문에)로 표지될 수 있다. 배열은 약 1 분동안 따듯한 무입자 ddH2O 접시위 슬라이드를 부유함으로서 재수화되며(스팟은 약간 팽윤될 것이며, 그러나 서로 충돌하지는 않을 것이다), 3 초간 70 - 80 ℃ 전도된 가열 블럭에서 스냅-건조된다. 다음 핵산은 슬라이드(Stratagene, Stratalinker, 65 mJ-디스플레이를 650 x 100 μJ 인 "650"에 세팅)에 UV 가교되거나, 또는 배열은 혼성화전 2 - 4 시간동안 80 ℃ 에서 구워진다. 배열은 슬라이드 걸이에 놓여진다. 비워진 슬라이드 챔버가 제조되고, 하기 용액으로 채워진다: 3.0 g의 숙신엔하이드라이드(Aldrich)가 189 ml의 1-메틸-2-피롤리디논(시약의 급격한 첨가는 결정적이다)에 용해된다; 숙신 엔하이드라이드의 마지막 플레이크가 용해되자마자, - 21.0 ml 의 0.2 M 쏘듐 보레이트가 혼합되고, 용액은 슬라이드 챔버에 부어진다. 슬라이드 걸이가 급격하게 그리고 균일하게 슬라이드 챔버에 담궈지고 수초간 강하게 위 아래로 흔들어, 슬라이드가 용액에서 떠나지 않는다는 것을 확인하고, 그리고 다음 오비탈 쉐이커에서 15 - 20 분간 혼합된다. 슬라이드 걸이는 다음 서서히 95 ℃ ddH2O 에 담궈지고, 95 % 에탄올에 5 회 담궈넣는다. 슬라이드는 다음 과량의 에탄올을 종이 타월에 적하시킴으로서 공기 건조된다. 배열은 슬라이드 박스에 사용시까지 실온에서 저장된다.
많은 방법들이 발명의 핵산 멤버가 기질에 부착되도록 ( "스팟팅"으로 언급된 공정 )이용될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 예를 들어 미국 특허 제 5,807,522 호의 기법을 이용하여 부착되고, 폴리머 부착 방법을 가르치기 위해 여기서 참고문헌으로 도입되었다.
선택적으로, 스팟팅은 종래분야에서 공지된 접촉 프린트 기법을 이용하여 수행될 수 있다.
키트
발명은 본 발명의 배열을 이용한 배열의 발현을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 당해 발명에 따른 그러한 키트는 관련된 핵산 멤버를 가지는 발명의 배열과 팩킹 수단을 적어도 하나 포함할 것이다. 키트는 하기 다양한 방법에서 이용되는하나이상의 추가적인 시약을 더 포함할 수 있다: 1) 테스트 폴리뉴클레오티드을 생성하는 프라이머; 2) dNTPs 및/또는 rNTPs(혼합되거나 또는 분리된), 임의적으로 하나이상의 균일하게 표지된 dNTPs 및/또는 rNTPs(예를 들어, 바이오티닐레이트된 또는 Cy3 또는 Cy5 타겟 dNTPs); 3) 후 합성 표지 시약, 일예로 형광 염료의 화학적으로 활성인 유도체; 4) 효소, 일예로 역전사 효소, DNA 중합효소 등등; 5) 다양한 버퍼 매질, 예를 들면 혼성화, 및 세척 버퍼; 6) 표지된 프로브 정제 시약 및 성분, 스핀 컬럼 등과 같은; 및 7) 스트렙타비딘알카린 포스포타제 접합체, 화학 형광 또는 화학발광 기질 등등.
마이크로배열의 용도
발명에 따른 폴리뉴클레오티드 배열은 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 포함하는 어떤 시료에서 많은 수의 폴리뉴클레오티드를 측정할 수 있는 고처리량 기법에서 이용될 수 있다. 대상 발명의 배열은 다양한 응용분야에서의 용도를 발견하며, 유전자 발현 측정, 골관절염의 진단, 예측, 치료에 대한 환자의 응답 관측, 약물 스크리닝 등등을 포함한다.
일 면으로, 발명의 배열은 다른 응용분야에서 디퍼렌셜 유전자 발현 측정에서 사용된다. 예를 들면, 배열은 (a)질병걸린 골관절염 및 정상 조직; (b) 골괄절염의 상이한 상태를 나타내는 조직; (c) 연골 발달(예를 들면, 태아 연골);(d) 외부 또는 내부 자극에 대한 연골 세포 응답; (e) 처치에 대한 연골/연골세포 반응; (f) 연골 조직 엔지니어링; (g) 약리유전학 등등의 디퍼렌셜 발현 분석에서 유용하다. 배열은 또한 신약 발견과 연구에 대한 광범위한 발현 스크리닝에 유용하며, 일예로 특정 활성 제제의 특정세포에서의 유전자 발현 패턴에 대한 영향이며, 여기서 그러한 정보는 약물 효과 및 독성, 환경적 관측, 질병 연구 등등을 밝히기 위해서 사용된다. 예를 들어, 어떤 골관절염 시료(마일드, 중간정도, 현저 또는 심각)에서 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 고발현은, 이것은 상응하는 정상 세포에서는 관측되지 않으며, 골관절염-특이성 유전자 생성물을 가르킬 수 있다.
타겟 제조
발명에 따른 마이크로배열의 타겟은 인간 연골, 혈액 또는 활액 유체로부터 바람직하게 유래된다.
타겟 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 화학적 결합 형태를 통해서, 일반적으로 상보성 염기쌍, 통상 수소 결합 형성을 통해서 상보성 서열의 핵산 멤버 또는 폴리뉴클레오티드 프로브에 결합할 수 있다.
여기서 사용되는 것과 같이, "mRNA 전사체로부터 유도된 폴리 뉴클레오티드: 또는 "mRNA 에 상응하는 폴리뉴클레오티드"는 mRNA 전사체 또는 이들의 서브-서열이 최종적으로 주형으로 작용된 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 그래서, mRNA 로부터 역전사된 cDNA, 증폭된 DNA 로부터 전사된 RNA등은 전부 mRNA 전사체로부터 유도되거나 또는 상응하며, 그러한 유도되거나 또는 이에 상응하는 생성물의 검출은 시료내 원 전사체의 존재 및/또는 풍부를 가르키거나 또는 이에 비례한다. 그래서, 적절한 타겟 핵산 시료는 제한되지는 않지만 유전자 또는 유전자들의 mRNA전사체, mRNA 로부터 역전사된 cDNA, 유전자 또는 유전자들로부터 증폭된 DNA, 증폭된 DNA 로부터 전사된 RNA 등등을 포함한다. 여기서 사용된 폴리뉴클레오티드 타겟은바람직하게 인간 연골, 혈액 및 활액 유체로부터 유도된다. 폴리뉴클레오티드는 인간 연골, 혈액 또는 활액 mRNA 추출물로부터 종래분야에서 공지된 방법, 예를 들면, 역전사 또는 PCR 을 이용하여 합성된 한가닥 또는 두가닥 DNA, RNA, 또는 DNA-RNA 혼성일 수 있다.
가장 간단한 실시예에서, 그러한 폴리뉴클레오티드 타겟은 연골, 혈액 또는 활액 유체 시료로부터 분리된 총 mRNA 또는 mRNA에 상응하는 핵산 시료를 포함한다. 다른 실시예에서, 총 mRNA 는 예를 들어 산 글루타민-페놀-클로로포름 추출법을 이용하여 주어진 시료로부터 분리되고, 그리고 폴리A+mRNA는 올리고 dT 컬럼 크로마토그래피 또는 (dT)n 마그네틱 비드를 이용하여 분리된다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory,(1989), 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)을 참조하라. 바람직한 실시예에서, 총 RNA 는 TRIzolR시약(GIBCO/BRL, Invitrogen Life Technologies, Cat. No. 15596)을 이용하여 추출된다. RNA 의 순도와 완전성은 260/280 nm 에서 흡수 및 자외선하에서 검사가 이어지는 아가로즈 겔 전기영동에 의해서 측정된다.
어떤 실시예에서, 예를 들어 활액 유체가 사용될 때, 혼성화전 타겟 핵산 시료를 증폭하는 것이 바람직하다. 당업자는 양적 결과가 바람직하다면 무슨 증폭방법이 사용되건간에, 증폭된 폴리뉴클레오티드의 상대적 빈도에 대한 제어 또는 유지 방법을 이용하기 위해서 주의가 요구된다. "정량적" 증폭 방법은 당업자에게 공지된 방법이다. 예를 들어, 정량적 PCR은 동일한 프라이머를 이용하여 제어 서열의 공지된 양을 동시적으로 함께 증폭하는 것을 포함한다. 이 것은 PCR 반응을 보정하기 위해서 사용될 수 있는 내부 스텐다드를 제공한다. 고 밀도 배열은 증폭된 폴리뉴클레오티드의 정량용 내부 스텐다드에 특이적인 프로브를 포함할 수 있다. 정량적 PCR 에 대한 상세한 프로토콜은 PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N. Y.,(1990)에 제공된다.
다른 적절한 증폭 방법은 제한되지는 않지만 중합효소 사슬 반응(PCR)(Innis, et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N. Y.,(1990), 리가아제 사슬 반응(LCR)(Wu and Wallace, 1989, Genomics, 4:560: Landegren, et al., 1988, Science, 241:1077 and Barringer, et al., 1990, Gene, 89:117, 전사 증폭(Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173), 및 자기 지지 서열 복제(Guatelli, et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874)를 포함한다.
특히 바람직한 실시예에서, 타겟 핵산 시료 mRNA는 역전사 효소와 올리고 dT 및 단일 가닥 DNA 주형을 제공하도록 파지 T7 RNA 프로모터를 엔코딩하는 서열로 역전사된다. 제 2 DNA 가닥은 DNA 중합효소를 이용하여 중합된다. 두 가닥 cDNA 의 합성 후, T7 RNA 폴리머라제가 투입되고, RNA 가 cDNA 주형으로부터 전사된다. 각 단일 cDNA주형으로부터 연속적인 회수의 전사는 증폭된 RNA 에 이르게 된다. in vitro 전사 방법은 당업자에게 공지되어 있으며(예를 들어 상기 Sambrook 참조)그리고 이 특별한 방법은 이 방법에 따른 in vitro 증폭이 다양한 RNA 전사체의 상대적 빈도를 보존한다는 것을 보여준 Van Gelder, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1663 - 1667 에서 상세히 기술된다. 더구나, Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3010 - 3014는 in vitro 전사를 통해 2 회의 증폭을 이용하는 프로토콜을 제공하며, 원 출발 물질의 106배 증폭이상을 성취하며, 이에 의해 생물학적 시료가 제한된 경우에도 발현 관찰을 허용한다.
타겟 또는 핵산 프로브의 표지화
타겟 또는 프로브가 표지될 수 있다.
분자에 부착되거나 또는 도입된 어떤 분석적으로 검출가능한 마커가 발명에서 사용될 수 있다. 어떤 분석적으로 검출가능한 마커는 분석적으로 검출되거나 정량화되는 어떤 분자, 부분 또는 원자를 언급한다.
본 발명에서 이용에 적합한 검출가능한 라벨은 분광학, 사진화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학, 또는 화학적 수단에 의해서 검출가능한 어떤 조성물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 표지는 표지된 스트렙타비딘 접합체로 염색을 위한 비타민, 마그네틱 비드(예를 들면 DynabeadsTM), 형광 염료(예를 들면, 플루오로세인, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등등), 방사성표지(예를 들면,3H,125I, 35S,14C, 또는32P), 효소(예를 들면, 양고추냉이 과산화 효소, 알카린 포스포타제, 및 ELISA에서 통상적으로 사용되는 다른 것들), 및 콜로이드 골드, 칼라 글라스,또는 플라스틱(예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등등)비드와 같은 측색 라벨을 포함한다. 그러한 라벨의 이용을 가르치는 특허들은 미국특허 제 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,939,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241 호이며, 이들의 전체가 여기서 참고문헌으로 도입된다.
그러한 표지의 검출 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 그래서, 예를 들어, 방사성라벨은 사진 필름, 또는 신틸레이션 계수기를 통해서 검출될 수 있으며, 형광 마커는 방출된 빛을 검출하기 위한 포토검출기를 이용하여 검출될 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 효소를 기질에 제공하고, 그리고 기질에서 효소의 반응에 의해서 생산된 반응 생성물을 검출함으로서 검출되며, 측색 표지는 칼라 라벨의 단순한 시각화에 의해서 검출된다.
표지는 당업자에게 공지된 다수의 종래 방법에 의해서 도입될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시예에서, 표지는 시료 폴리뉴클레오티드의 제조시 증폭단계중 동시적으로 도입된다. 그래서, 예를 들면, 표지된 프라이머 또는 표지된 뉴클레오티드로의 중합효소 사슬반응(PCR)은 표지된 증폭 생성물을 제공할 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기와 같이, 표지된 뉴클레오티드(예를 들어 형광-표지된 UTP 및/또는 CTP)를 이용한 전사 증폭은 표지를 전사된 폴리뉴클레오티드에 도입한다.
선택적으로, 표지는 원 폴리뉴클레오티드 시료(예를 들어, mRNA, 폴리A mRNA, cDNA 등), 또는 증폭이 종료된 후 증폭생성물에 직접적으로 도입될 수 있다. 폴리튜클레오티드에 라벨을 부착하는 수단은 당업자에 공지되어 있으며, 예를 들어 절단 수선 복제, 또는 폴리뉴클레오티드의 키나아징 및 시료 폴리뉴클레오티드의표지(예를 들면 플루오로포어)에 결합하는 폴리뉴클레오티드 링커의 이어지는 부착(결찰)에 의한 말단-표지화(예를 들면 표지된 RNA로)를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 형광 변형은 시안 염료, 예를 들면, Cy3/Cy5 dUTP, Cy-3/Cy-5 dCTP(Amersham Pharmacia)또는 알렉사 염료(Khan, et al., 1998, Cancer Res. 58: 5009 - 5013)에 의한다.
바람직한 실시예에서, 비교를 위해 사용되는 두 타겟 시료가 사이한 형광 염료로 표지되고, 이들은 구분가능한 검출 신호를 발생시키고, 예를 들어, Cy5 로 표지된 정상 연골로부터 만들어진 타겟 및 Cy3 로 표지된 마일드한 골관절염 연골로부터 만들어진 시료이다. 상이하게 표지된 시료들은 동일한 마이크로배열에 동시에 혼성화된다. 바람직한 실시예에서, 표지된 타겟은 종래 공지된 방법을 이용하여 정제되며, 예를 들면, 에탄올 정제나 컬럼 정제이다.
바람직한 실시예에서, 타겟은 마이크로배열로부터 발생한 신호를 정규화하도록 마이크로 배열에서 프로브를 제어하기 위해 혼성화하는 하나이상의 제어 분자를 포함할 것이다. 바람직하게, 표지된 정규화 타겟은 상기와 같이 마이크로배열에 스팟된 제어 올리고뉴클레오티드에 완벽하게 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 혼성화 후 정규화 제어로부터 얻어진 신호는 혼성화 조건, 표지 강도, "판독" 효율 및 배열사이에서 완벽한 혼성화의 신호에서의 변이를 야기할 수 있는 다른 인자에서 변이에 대한 제어를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 배열에서 다른 모든 프로브로부터 신호(예를 들어 형과 강도)판독은 제어 프로브로부터 신호(예를 들어 형광 강도)에 의해서 나누어지고, 이에 의해 측정을 정규화한다.
바람직한 정규화 타겟은 시료내에 존재하는 다른 타겟의 평균 길이를 반영하도록 선택되지만, 그러나, 이들은 전 범위를 커버하도록 선택된다. 정규화 제어는 또한 배열내에서 다른 프로브의 (평균)기본 조성물을 반영하도록 선택될 수 있지만, 그러나, 바람직한 실시예에서, 단지 하나 또는 몇몇 정규화 프로브가 사용되고, 이들은 잘 혼성화되고(즉, 어떤 2 차적 구조를 가지지 않으며, 자가 혼성화를 하지 않도록 선택되며), 어떤 타겟 분자를 매치시키지 않도록 선택된다.
혼성화 효율에서 공간적 변이에 대해 제어하도록 혼성화 프로브는 배열내 어떤 위치에서 또는 복수위치에서 편재된다. 바람직한 실시예에서, 정규 제어는 중앙 부위 뿐만아니라 배열의 코너 또는 모서리에 위치된다.
혼성화 조건
폴리뉴클레오티드 혼성화는 변성된 프로브 또는 타겟 핵산 멤버 및 타겟 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 타겟 핵산 멤머와 그 상보적인 타겟이 상보성 염기쌍을 통해 안정한 혼성 듀플렉스를 형성할 수 있는 조건하에서 제공하는 것을 포함한다. 전형적으로 부착된 검출가능한 표지의 검출을 통해서 다음 혼성화 듀플렉스를 형성하지 않는 폴리뉴클레오티드는 검출된 혼성화된 폴리뉴클레오티드를 남기고 세척된다. 폴리뉴클레오티드는 온도를 올리거나 또는 폴리뉴클레오티드를 함유한 버퍼의 염농도를 낮추는 것에 의해서 변성되는 것으로 인식된다. 낮은 엄격한 조건하에서,(예를 들면, 낮은 온도 및/또는 고 염) 혼성 듀플렉스(예를 들면, DNA:DNA, RNA:RNA, 또는 RNA:DNA)가 풀린 서열이 완벽하게 상보적이지 않은 곳에서도 형성될 것이다. 역으로, 높은 엄격성에서(예를 들어 더높은 온도와 더 낮은 염), 성공적혼성화는 더 적은 미스매치를 요구한다.
발명은 Dig hybridization mix(Boehringer); 또는 포름아미드계 혼성화 용액을 포함하며, 상기 Ansubel et al.,상기 Sambrook et al. 에서 기술된다.
혼성화 조건을 최적화하는 방법은 종래 기술 분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Polynucleotide Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N. Y.,(1993)을 참조).
혼성화 후, 비-혼성화된 표지 또는 비표지된 폴리뉴클레오티드가 지지체 표면으로부터 제거되며, 통상적으로 세척에 의하며, 이에 의해서 기질 표면상 혼성화된 타겟 폴리뉴클레오티드의 패턴을 생성한다. 다양한 세척용액이 당업자에게 공지되어 있으며, 사용될 수 있다. 결과적인 표지된, 혼성화된 올리고 뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드는, 테스트 폴리뉴클레오티드의 특정 표지에 기초하여 선택된 특정 검출방법으로, 다양한 방법으로 시각화되거나 또는 검출될 수 있으며, 여기서 대표적인 검출수단은 신틸레이션 계수, 오토라디오그라피, 형광 특정, 색상 측정, 광 방출 측정 등이다.
형상 획득과 데이타 분석
상기와 같이, 혼성화 및 어떤 세척 단계 및/또는 이어지는 처리후, 결과적인 혼성화 패턴이 검출된다. 혼성화 패턴을 검출하거나 또는 시각화함에 있어서, 강도 또는 표지의 신호값은 검출될 뿐아니라, 계량화되며, 이에 의해 각 스팟의 혼성화로부터의 신호가 측정되고, 공지된 말단 표지된 타겟 폴리뉴클레오티드에 의해 방출된 신호에 상응하는 단위 값과 비교되어, 혼성화 패턴에서 배열에서 특정한 스팟에 혼성화된 각 말단-표지된 타겟의 복사 수의 계수나 또는 절대값을 얻게된다는 것이 의미된다.
배열에 대한 혼성화로부터 얻어진 데이타를 분석하는 방법은 당해분야에서 공지된 것이다. 예를 들어, 여기서 혼성화의 검출은 형광 표지를 포함하며, 데이타 분석은, 특이값, 즉 선결정된 통계적 분포로부터 벗어난 데이타를 제외하고, 그리고 남은 데이타로부터 테스트 폴리뉴클레오티드의 상대적인 결합친화도를 계산하면서, 모집된 데이타로부터 기질 위치의 기능으로서 형광강도를 측정하는 단계를 포함한다. 결과적인 데이타는 결합된 올리고뉴클레오티드, 및/또는 폴리뉴클레오티드 및 테스트 폴리뉴클레오티드 사이에서 결합 친화도에 따라서 변하는 각 영역에서의 강도로 이미지를 디스플레이 된다.
하기 검출 프로토콜은 비교되는 두 연골 시료의 동시 분석에서 사용되며, 여기서 각 시료는 상이한 형광 염료로 표지된다.
마이크로배열의 각 요소는 제 1 형광색에 대해서 스켄된다. 각 배열 요소의 형광 강도는 시료내 유전자의 발현수준에 비례한다. 스켄 작동은 제 2 형광 표지에 대해서 반복된다. 두 형광 강도의 비는 두 조직 시료에서 상대적인 유전자 발현의 매우 정확하고 정량적인 측정을 제공한다.
바람직한 실시예에서, 고정화된 타겟 핵산 서열의 형광 강도는 레이저 들뜸 소스(source)와 Cy3 및 Cy5 형광제에 적절한 간섭 필터를 구비한 통상의 공초점 현미경으로 취해진 이미지로부터 결정된다. 별개의 스켄이 각 형광제에 대해서 픽셀당 225 μm2해상도와 65,536 회색레벨에서 취해진다. 혼성화 영역을 확인하는 이미지 분할, 두 형광제 이미지 사이에서 강도의 정규화, 및 각 타겟에서 정규화된 평균 형광 수치의 계산들이 기술되어 있다(Khan et al., 1998, Cancer Res. 58:5009 - 5013. Chen, et al., 1997, Biomed. Optics 2:364-374). 이미지 사이의 정규화는 두개의 사이한 형광제로 표지화 및 검출에서 상이한 효율을 조절하기 위해서 사용된다. 이것은 한 세트의 배열에서 스팟된 내부 제어 유전자의 한 신호 강도 비의 수치를 조정함으로서 얻어진다.
다른 바람직한 실시예에서, 배열은 Cy3 및 Cy5 채널에서 스켄되고, 별개의 16 비트 TIFF 이미지로서 저장된다. 이미지는 배열에서 각 스팟으로부터 혼성화 강도 데이타를 포착하는 그리드 공정을 포함하는 소프트웨어를 이용하여 통합되고 분석된다. 각 스팟의 형광 강도 및 배경-공제된 혼성화 강도가 모아지고, 측정된 Cy3 에 대한 Cy5 의 평균 강도의 비가 계산된다. 선형회귀법이 정규화를 위해 사용되며, 측정된 Cy5 대 Cy3 강도의 분산 플롯이 하나의 영역을 가져야 한다고 가정한다. 비의 평균이 계산되고, 그리고 데이타를 재설계하기 위해서 사용되며, 1 에 기울기를 조정한다. 1.0 배 상- 또는 하-규정보다 큰 후-정규화 컷오프가 상이하게 발현된 유전자를 확인하기 위해서 사용된다.
검출 또는 시각화에 이어서, 혼성화 패턴은, 혼성화 패턴과 표지된 타겟 폴리뉴클레오티드 시료가 유도된 생리적 출처를 발생시키도록 배열과 접촉된 표지된 타겟 폴리뉴클레오티드 시료의 유전적 프로파일에 대한 정량적 정보를 결정하기 위해서 사용된다. "유전적 프로파일"에 의해서 시료에 존재하는 폴리뉴클레오티드의 형태, 예를 들면 이들이 상보적인 유전자의 타입, 및/또는 시료내 각 특정 폴리뉴클레오티드의 복사수에 관한 정보가 의미된다. 이 데이타로부터, 타겟 폴리뉴클레오티드 시료가 유래된 생리적 출처에 대한 정보, 일예로 타겟의 생리적 출처인 조직 또는 세포에서 발현된 유전자의 타입뿐만 아니라 각 유전자의 발현 수준을 특히 양적인 항으로 유도할 수 있다.
둘 이상의 생리적 출처로부터의 타겟 폴리뉴클레오티드를 비교하는 대상 방법을 이용할 수 있는 곳에서, 혼성화 패턴이 상이한 패턴의 차이를 확인하기 위해서 사용될 수 있다. 각각의 상이한 핵산 멤버가 공지된 유전자에 상응하는 배열이 이용되는 곳에서, 어떤 차이가 비교되는 생리적 출처에서 특별한 유전자의 디퍼렌셜한 발현에 관련된다. 그래서, 대상 방법은 디퍼렌셜 유전자 발현 측정에서 용도를 발견하며, 여기서 (a) 질병 대 정상 조직, 예를 들면, 골관절염 및 정상 조직, (b) 상이한 단계의 골관절염으로부터 유래된 조직 등등의 디퍼렌셜 발현 분석에서 대상 발명을 사용할 수 있다.
특별히 바람직한 실시예에서, 시료내 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 수준(그리고 이에 의한 발현)을 정량화하는 것이 바람직한 경우, 타겟 핵산 시료는 유전자 또는 유전자들의 mRNA 전사체의 농도, 또는 mRNA 전사체로부터 유래된 폴리뉴클레오티드의 농도가 그 유전자의 전사 수준(및 그러므로 발현 수준)에 비례하는 것이다. 유사하게, 혼성화 신호 강도가 혼성화된 폴리뉴클레오티드의 양에 비례하는 것이 바람직하다. 비례성이 상대적으로 엄격한 것이 바람직할지라도 (예를 들면, 전사율이 두배가 되면 시료 폴리뉴클레오티드 풀에서 mRNA 전사체가 두배가 되고, 혼성화 신호에서 두배가된다), 당업자는 비례성이 보다 신축적이고, 보다 비-선형적일 수 있으며 여전히 의미있는 결과를 제공한다는 것을 이해할 것이다.그래서, 예를 들면, 타겟 mRNA 의 농도에서 5 배 차이는 혼성화 강도에서 3- 에서 6-배 차이에 이르는 측정이 대부분의 목적에서 충분하다. 보다 정밀한 정량화가 요구되는 곳에서, 적절한 제어가 여기서 기술된 시료 제조 및 혼성화에서 도입된 변이에 대한 정정에 충분하다. 추가로, "표준"타겟 mRNA의 일련의 희석이 당업자에게 잘 공지된 방법에 따른 보정 곡선을 제조하기 위해서 사용된다. 물론, 전사체의 존재 또는 부존재의 단순한 검출이 바람직한 경우, 어떤 공들인 제어나 또는 보정이 필요하지 않는다.
예를 들어, 마이크로배열 핵산 멤버가 혼성화 뒤 표지되지 않으면, 이것은 그 핵산 멤버를 포함하는 유전자가 양 시료에서 발현되지 않았다는 것을 가르킨다. 만일 핵산 멤버가 단일 색상으로 표지되면, 표지된 유전자가 단지 하나의 시료에서 발현되었다는 것을 가르킨다. 양 색상을 가지는 배열을 포함하는 핵산 멤버의 표지화는 유전자에 양 시료에서 발현되었다는 것을 가르킨다. 세포당 한번 발현된 유전자조차도 검출된다(100,000 에서 1 부의 감도). 비교되는 두 시료에서 발현 강도에서 차이는 디퍼렌셜한 발현을 가르키며, 두 시료에서 강도의 비는 1.0 이 아니며, 바람직하게는 0.7 보다 작거나, 또는 1.2 보다 크며, 보다 바람직하게는 0.5 보다 작거나 또는 1.5 보다 크다.
많은 인간 유전자가 상이한 발달(태아 대 성인) 또는 질병 상태의 연골에서상이한 수준으로 발현된다. 몇몇 경우에서, 유전자는 일부 발달 또는 질병상태에서 전혀 발현되지 않으며, 다른 곳에서는 고수준이다. EST-계 접근을 이용한 상이한 연골 상태에서 연골세포 유전자 발현의 디퍼렌셜한 분석은 골관절염 발병학 및 연골 치료에서 중요한 역할을 하는 유전자를 확인하기 위해서 사용된다.이 방법의 장점은 이것이 다른 방법에서 보다 큰 스케일로 유전자 발현 정보를 제공할 수 있다는 것이다. 이 접근에 의해서 발생된 cDNA 클론은 어떤 유전자의 기능적인 연구에 더 유용하다. 이러한 타입의 게놈-계 접근은 골관절염 질병 과정의 이해에 대한 중요하고 신규한 식견을 제공하며, 신규한 진단, 예측 및 치료적 접근을 제공한다.
진단 또는 예측 시험
이 발명은 또한 골관절염을 검출하기 위한 진단 시험을 제공한다. 이 발명은 또한 치료법에 대한 환자의 응답을 관찰하는 테스트를 위한 예측 테스트를 제공한다.
발명의 방법에 따라서, 마일드, 중간정도, 현저 또는 심각한 골관절염이 환자로부터 연골 시료를 얻음으로 해서 검출된다. 선택적인 실시예에서, 혈액 또는 활액 유체 시료가 환자로부터 얻어진다. RNA(즉 RNA 또는 cDNA) 에 상응하는 핵산을 포함하는 시료가 환자 연골(또는 활액 유체 또는 혈액)시료로부터 제조된다. RNA에 상응하는 핵산을 포함하는 시료는 고체 기질과 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열에 혼성화되며, 여기서 적어도 하나의 핵산 멤버가 본 발명에 따른 "정상개체"와 비교시 마일드, 중간정도, 현저 또는 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현된다. 이 진단 테스트에 따라서, 배열의 하나이상의 핵산 멤버에 대해 RNA에 상응하는 핵산을 포함하는 시료의 혼성화가 질병을 가르킨다.
치료에 대한 환자의 반응은 발명에 따른 예측 테스트를 이용하여 관측된다. 일면으로, 발명에 따른 진단 방법은 치료전, 치료 코스 중, 및 치료후에 환자로부터 연골 시료를 얻는 것을 포함한다. 바람직하게, 환자는 시료가 취해지기 전 적어도 12 시간 동안 치료된다. 선택적인 실시예에서, 혈액 또는 활액 유체 시료가 치료전, 치료 코스 중, 및 치료후에 환자로부터 수득된다. RNA(즉 RNA 또는 cDNA) 에 상응하는 핵산을 포함하는 시료가 환자 연골 시료(또는 혈액 또는 활액 유체)로부터 제조된다. RNA 에 상응하는 핵산을 포함하는 시료는 고체 기질 및 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열에 혼성화되고, 여기서 적어도 하나의 멤버가 발명에 따라서 정상 개체와 비교시 마일드, 중간정도, 현저 또는 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 상이하게 발현된다. 치료가 관찰되는 환자의 진단 상태에 따라서 배열이 선택된다. 예측 테스트에 따라서, 배열에서 하나이상의 핵산 멤버에 대해 치료 전 및 치료후에 분리된 RNA 에 상응하는 핵산을 포함하는 시료의 디퍼렌셜한 발현은 효과적인 치료임을 가르킨다. 바람직하게, 치료되는 환자에서 유전자 발현 프로파일은 바람직하게는 보다 덜 심각한 형태의 질병을 가진 환자에서 유전자 발현 프로파일과 보다 가깝게 닮도록 변화되고, 보다 바람직하게는 정상 환자에서의 유전자 발현 프로파일과 닮는다. 유전자 발현 프로파일에서 변화의 정도는 심각성 및/또는 질병과 관련된 하나 이상의 증후군의 발생에서의 감소와 같은 다양한 치료적 말단점과 더 연관될 수 있다.
치료적 제제
발명에 따른 유용한 치료제는 연골세포의 이화 및/또는 동화 작용 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 바람직하게, 치료제는 연골세포의 동화 및/또는 이화 작용 활성을 1.0 배, 보다 바람직하게는 1.5 - 5-배, 그리고 가장 바람직하게는 5 - 100 배정도, 치료되지 않은 연골세포에 비해 증가 또는 감소한다.
한 실시예에서, 치료제는, 태아, 정상, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 및 심각한 골관절염의 연골세포 질병 또는 발달 단계의 어떤 것으로부터 유래된 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 수준을 변화(증가 또는 감소)시킨다. 바람직하게, 치료제는 태아, 정상, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 및 심각한 골관절염의 연골세포 질병 또는 발달 단계의 어떤 것으로부터 유래된 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에서 증가 또는 감소 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 수준의 변화를 야기하며, 여기서 변화는 1.0-배, 보다 바람직하기는 1.5 에서 5-배, 그리고 가장 바람직하기는 5 에서 100 배가, 후보 치료제의 부존재하에서 발현 수준 보다 크거나 또는 작다.
다른 실시예에서, 발명의 치료제는 적어도 하나의 증상을 완화시키고, 및/또는 연골 퇴화, 또는 연골 퇴화에 관련된 통증, 붓기, 감염된 관절에서 기능적 능력의 약화 및/또는 손실을 포함한다.
후보 치료제는 합성 화합물 또는 화합물의 혼합물일 수 있으며, 또는 천연 생성물(예를 들면, 식물 추출물 또는 배양 상청액)일 수 있다.
합성 또는 천연 화합물의 큰 라이브러리로부터 후보 치료제 또는 화합물이 스크린될 수 있다. 다양한 수단들이 현재 사카라이드, 펩티드, 및 핵산계 화합물의 무작위 또는 지시된 합성에 사용된다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex(Princeton, NJ), Brandon Associates(Merrimack, NH), 및 Microsource(New Milford, CT)를 포함하는 수많은 회사로부터 상업적으로 이용가능하다. 희귀한 라이브러리가 Aldrich(Milwaukee, WI)에서 이용가능하다. 조합적인 라이브러리들이 이용가능하며, 제조된다. 선택적으로 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태 천연 화합물의 라이브러리가 예를 들면, Pan Laboratories(Bothell, WA), 또는 MycoSearch(NC)로부터 이용가능하거나 또는 공지된 방법에 의해서 용이하게 생산가능하다. 추가적으로, 천연 또는 합성적으로 생산된 라이브러리 및 화합물이 통상의 화학, 물리, 및 생화학적 수단을 통해서 용이하게 변형될 수 있다.
유용한 화합물은 수많은 화학적 분류내에서 발견될 수 있다. 유용한 화합물은 유기 화합물 또는 작은 유기 화합물일 수 있다. 적은 유기 화합물은 50 에서 약 2500 달톤 미만의 분자량을 가지며, 바람직하게는 약 750 미만, 보다 바람직하게는 350 달톤 미만이다. 예시적인 분류는 헤테로사이클, 펩티드, 사카라이드, 스테로이드, 등을 포함한다. 제제의 구조적 확인은 추가적인 제제를 스크린, 확인 또는 발생하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 제제가 확인되는 경우, 이들은 다양한 방법, 일예로 비천연 아미노산, 일예로 D-아미노산, 특히 D-알라닌을 통해서 아미노 또는 카르복실 말단을 관능화, 예를 들어 아미노기에 대해서 아실화, 또는 알킬화, 그리고 카르복실기에 대해서는 에스테르화, 또는 에미디피케이션 (amidification)등등에 의해서 이들의 안정성을 향상시키기 위해서 변형될 수 있다.
발명에 따라서, 치료제는 상이한 질병 및 발달 상태로부터의 연골로부터 구축된 cDNA 라이브러리의 어떤 것으로부터 확인된 EST 서열에 상응하는 유전자 일 수 있다.
각 cDNA 라이브러리는 특정한 상태에 특이적인 다수의 EST 서열을 드러냈다. EST는 이들의 추정적 기능(표 2- 6)에 따라서 규정되고, 그리고 이들의 발현은 여기서 기술된 마이크로배열을 이용하여 확인된다. 골관절염이 이화작용과 동화작용 활성사이에서의 불균형, 즉 이화작용 활성의 증가 및/또는 동화작용 활성의 감소에 의해서 초래된 만성적 질병이기 때문에, 정상- 또는 태아- 특이적 EST가, 이화작용 활성과 동화작용 활성사이의 균형을 유지하기 위해서 연골의 정상적인 대사 기능을 유지함에 있어서 중요할 수 있다. 그러므로, 하나 이상의 ESTs에 상응하는 총길이 유전자 서열의 증가된 발현이 질병 연골에서 동화작용 활성을 회복시킬 수 있다. 변형된 유전자 발현(예를 들면, 유전자 치료, 유전자 붕괴, 반의미 치료, 등)을 포함하는 치료가 본 발명에 따라서 유용하다.
정상- 또는 태아-특이적 유전자중 하나에 상응하는 전-길이 유전자 서열이 종래 공지된 방법에서 복제된다(예를 들어, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology). 복제된 서열은 골관절염의 어떤 상태(예를 들어 마일드, 중간정도, 현저, 및 심각)질병 연골세포내로 이송된다. 질병 연골세포에서 동화작용 손상을 보완하는 정상- 또는 태아-특이적 유전자의 능력이 측정된다.
한 실시예에서, 이것은 정상- 또는 태아-특이적 유전자로 감염된 질병 연골 세포의 발현 프로파일을 시험함으로서 성취될 수 있다. 정상 또는 태아 연골세포와 더 가깝게 닮은 질병 연골세포의 발현 프로파일을 회복시키는 능력이 있는 정상- 또는 태아-특이적 유전자는 골관절염 치료에 대한 유력한 후보물질이다.
다른 실시예에서, 정상- 또는 태아-특이적 유전자로 감염된 질병 연골세포의 동화작용 활성은 Westacott et al.(1996, Semin Arthritis Rheum, 25: 254 - 72) 에 의해서 기술된 것과 같이 측정된다. 동화작용 활성을 증가시키는 정상- 또는 태아-특이적 유전자는 골관절염 치료에 유용하다.
치료제가 정의되면, 유전자 서열이 유전자 치료의 목적에 적합한 벡터내로 서브클론(subclone)된다. Murine leukemia virus(MLV)-계 레트로비랄 벡터가 유전자 치료 임상 실험에서 가장 널리 사용되는 유전자 전달체 중 하나이며, 거의 70 % 의 승인된 프로토콜에서 사용되고 있다(Ali, M. et al., 1994, Gene Ther., 1:367 - 384; Marshall, 1995, Science, 269: 1050 - 1055, 1995). 다른 유용한 벡터가 또한 공지되어 있다(예를 들어, Carter and Samulski, 2000, Int. J. Mol. Med. 6: 17 - 27;Lever et al., 1999, Biochem. Soc. Trans. 27: 841 - 7). 인간 질병의 유전자 치료에 대한 방법은 예를 들어 미국 특허 제 6,190,907; 6,187,305; 6,140,087; 및 6,129,705 호에 기록되어 있으며, 이들 전부가 여기서 참고문헌으로 도입되었다.
복용량 및 투여
발명의 치료제는 환자에게 바람직하게는 생물학적으로 친화성이 있는 용액에 또는 약물학적으로 수용가능한 운반체로, 음식물 섭취, 주입, 흡입 또는 종래의 수많은 통상의 방법들에 의해서 투입된다. 투여되는 복용량은 환자에 따라 다르다. "치료적으로 효과적인 복용량"은 예를 들면, 기능의 향상 수준에 의해서 결정된다(예를 들면, 증가 또는 감소된 연골세포 동화작용 활성, 또는 태아, 정상, 마일드 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 심각한 골관절염의 어떤 연골세포 질병 또는 발달 단계로부터 유래된 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현되는 적어도 하나의 한 폴리뉴클레오티드의 발현에서 증가 또는 감소).
발명에 따른 치료제는 단일 복용량으로 투여된다. 이 복용량은 매일, 주마다, 달마다, 해마다, 또는 치료 의사에 의해서 적절하다고 고려되는 것으로 반복될 수 있다.
약리학적 조성물
발명은 생리적으로 양립가능한 캐리어와 혼합된 발명에 다른 치료제를 포함하는 조성물을 제공한다. 여기서 사용되는 것과 같이, "생리적으로 양립가능한 캐리어"는 물, 인 완충 살린, 또는 살린 같은 생리적으로 수용가능한 희석제를 언급하며, 보조제를 더 포함할 수 있다. 불완전 Freund's 보조제, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 또는 백반과 같은 보조제들은 종래 공지된 재료들이다.
발명은 약물학적 조성물을 제공한다. 활성 성분 뿐만아니라, 이들 약물학적조성물들은 약물학적으로 사용되는 적절한 약물학적으로 수용가능한 캐리어 제조체를 포함할 수 있다.
경구 투입용 약물학적 조성물이 경구 투여에 적절한 복용량으로 종래에 공지된 약물학적으로 수용가능한 캐리어를 이용하여 포뮬레이트된다. 그러한 캐리어는 약물학적 조성물이 정제, 알약, 당과, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 서스펜션 등과 같이 환자 섭취를 위해서 포뮬레이트 되게 한다.
경구적 이용을 위한 약물학적조제는 활성 성분과 고체 부형제와의 조합을 통해서 얻어지며, 임의적으로 결과적인 혼합물을 그라인딩하는 것, 정제 또는 당 코어를 얻기 위해서 바람직하다면, 적절한 보조제들을 투입한 후, 그래뉼의 혼합물을 처리하는 것이다. 적절한 부형제는 락토오즈, 수크로즈, 마니톨 또는 솔비톨을 포함하는 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 또는 다른 식물로부터의 전분; 메틸셀룰로즈, 하이드록시프록필메틸-셀룰로즈, 또는 쏘듐 카르복시메틸 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈; 및 아라빅 및 트래거캔스를 포함하는 검; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질과 같은 탄수화물 또는 단백질 필러이다. 바람직하다면, 분해 또는 용해제가 투입될 수 있으며, 일예로 가교 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산, 또는 이들의 염, 일예로 쏘듐 알기네이트이다.
당코어에 적절한 코팅제, 일예로 농축 설탕 용액이 제공되며, 이것은 또한 아라빅 검, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴겔, 폴리에틸렌글리콜, 및/또는 티타늄 다이옥사이드, 래커용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료재료 또는 안료가 생성물 인식 또는 활성 성분의 양, 즉 복용량을 규정하기 위해서 정제 또는 당 코팅물에 투입될 수 있다.
경구적으로 사용되는 약물학적 조제물은 젤라틴으로 만들어진 푸시-핏 (push-fit) 캡슐 뿐만 아니라 젤라틴으로 만들어진 봉인된 캡슐 및 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 코팅을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충진제 또는 락토즈 또는 전분과 같은 바인더, 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활제 및 임의적으로 안정제와 혼합되는 활성성분을 포함할 수 있다. 소프트 캡슐에서, 활성 화합물은 적절한 액체, 일예로 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에서 안정제가 있거나 없이 용해되거나 또는 현탁될 수 있다.
비경구적 투여용 약물학적 포뮬레이션은 활성 성분의 수용액을 포함한다. 주사용으로, 발명의 약물학적 조성물은 수용액, 바람직하게는 행크용액(Hank's solution), 링커용액과 같은 생리적으로 조화되는 완충액 또는 생리적으로 완충된 염류용액에 포뮬레이트될 수 있다. 수용성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 물질, 일예로 쏘듐카르복시메틸 셀룰로즈, 솔비톨, 또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 추가적으로, 활성용매의 현탁액 또는 운반체는 참깨 기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 임의적으로, 현탁액은 또한 적절한 안정제 또는 고 농축 용액의 제조를 위해 화합물의 용해성을 증가시키는 제제를 함유할 수 있다.
코로 투입하기 위해서, 포뮬레이션에서 침투되는 특정 장벽에 적절한 침투제가 이용된다. 그러한 침투제는 종래 공지된 것이다.
본 발명의 약물학적 조성물은 종래 공지된 방법으로 제조될 수 있으며, 예를들면 통상의 혼합, 용핵, 그라인딩, 당의정-제조, 부양, 유화, 캡슐화, 엔트렙핑, 또는 동결건조 공정이다.
약물학적 조성물은 염으로 제공될 수 있으며, 많은 산으로 형성되며, 제한되지는 않지만 염산, 황산, 아세트산, 젓산, 주석산, 말레산, 숙신산등이다. 염은 자유 염기 형성에 상응한는 수용성 또는 다른 양성자성 용매에 보다 잘 용해되는 경향이 있다. 다른 경우, 바람직한 제조는 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1%- 2% 수크로즈, 2 %- 7 % 마니톨에서 사용전에 완충액과 혼화되는 pH 4.5 에서 5.5 범위에서 동결건조된 파우더일 수 있다.
수용가능한 캐리어에서 포뮬레이트되는 발명의 치료제를 포함하는 약물학적 조성물이 제조된 후, 이들은 적절한 용기에 놓여지고, 양, 빈도 및 투여 방법을 포함하는 정보와 함께 지시된 조건의 처리를 위해 라벨링된다.
정의된 치료제를 이용한 골관절염 치료의 효능
발명에 따른 어떤 치료제를 이용하는 치료의 효과는 의학적 일반의에 의해서 측정된다. 측정은 통증, 붓기, 감염된 관절에서 기능적 능력의 약화 또는 손실과 같은 골관절염 징후 및/또는 골관절염 진단 기준 및 Marshall(상기, 1996)에서 기술된 각색의 완화와 관련될 수 있다.
상기 공개는 일반적으로 본 발명을 기술한다. 보다 완전한 이해는 하기의 실시예를 통해서 얻어질 수 있으며, 이것은 여기에서 단지 예시를 위해서 제공되며, 발명의 영역을 한정하기 위해서 사용되는 것이 아니다.
하기 실시예는 비제한적이며, 단지 발명의 다양한 측면 및 특징의 대표일 뿐이다.
실시예 1: RNA 추출 및 태아 cDNA 라이브러리 구축
cDNA 라이브러리가 태아 연골로부터 제조되었다. ESTs 가 cDNA로부터 얻어지고, 태아 연골세포에 대한 하나이상의 유전자 발현 프로파일을 만들기 위해서 평가되었다.
인간 태아 대퇴부 연골 RNA 가 유산된 태아(8 - 12 주)의 통합된 표본으로부터 추출되었다. 시료들은 액체 질소하에서 정밀하게 파우더화되었고, 총RNA 는 TRIzolR시약(GIBCO/BRL)을 이용하여 추출되었다. RNA 의 순도와 완전성은 260/280 nm 에서의 흡수와 아가로즈 겔 전기 영동에 의해서 평가되었다. 폴리(A)+RNA 단편은 올리고-dT 셀룰로즈 크로마토그래피(Pharmacia)에 의해서 분리되었고, 3 - 5 ㎍ 폴리(A)+RNA 가 λZAP 발현 백터(Stratagene)에서 cDNA 라이브러리를 구축하기 위해서 사용되었다. 제 1 가닥 cDNA 가 5'-메틸 dCTP 의 존재하에서 Xho I-올리고(dT)아답타-프라이머로 합성되었다. 제 2 가닥 합성및 EcoRI 아답타의 결찰 후, cDNA가 Xho I 로 분류되고, 결과적으로 5'-말단에서 EcoRI 부위, 3'말단에서 Xho I 부위가 측면에 선 cDNA 가 되었다. 분류된 cDNA는 Sephacry S-500 스핀 컬럼(Stratagene)에서 크기-분획되었으며, 다음 EcoRI 및 Xho I 로 선분류된 λZAP 발현벡터내로 결찰되었다. 결과적인 DNA/cDNA 콘카토마(concatomer)가 Gigapack Gold 팩킹 추출물을 이용하여 팩킹되었다. 적정 후, 원 팩킹 혼합의 분취량이 7 %DMSO 내에 80 ℃ 에서 주요 라이브러리 재료로 저장되고, 나머지는 안정한 라이브러리 재료를 제조하기 위해서 증폭되었다.
cDNA 삽입의 큰-스케일 서열화
증폭된 λZAP 발현 라이브러리로부터, 색상 선택을 위해서 IPTG/X-gal의 Escherichia coli XL1-blue MRF's lawn 상에 파지 배지가 200 - 500 pfu/150 mm 플레이트 밀도로 플레이트되었다. 플라크가 75 ㎕ 현탁 매체 버퍼(100 mM NaCL, 10 mM MgSO4, 1 mM Tris, pH 7.5, 0.02 % 젤라틴)에 담겨졌다. 파지 용출물(5 ㎕)이 PCR 반응(50 ㎕ 총부피)을 위해서, 각 dNTP(Pharmacia)의 125 μmol/L, 각 변형된 T3(5'-GCCAAGCTCGAAATTAACCCTCACTAAAG GG-3')의 10 pmol 및 T7(5'-CCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCG-3')프라이머, 및 2 U 의 Taq DNA 폴리머라제(Pharmacia)와 함께 사용되었다. 반응은 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer)에서 사이클되었다[95 ℃ 에서 5 분간 변성되고, 30 사이클의 증폭(94 ℃, 45 초; 55 ℃, 30 초; 72 ℃, 3 분)이 이어지고, 그리고 마지막 등온 연장( 72 ℃, 3 분)]. 아가로즈 겔 전기영동은 삽입물의 존재와 순도를 측정하기 위해서 사용되었다. PCR 생성물은 특이적 프라이머, BigDyeTMTermiantor Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction(PE Biosystem), Tris MgCl 버퍼 및 물을 이용하여 써모사이클러에서 DNA 서열화 반응을 거쳤다. 서열화 반응은 94 ℃ 에서 2 분동안 배양되고, 94 ℃, 30 초; 55 ℃, 20 초; 및 70 ℃ 1 분의 25 사이클 및 94 ℃, 30 초; 및 72 ℃ 1 분 15 사이클 및 72 ℃ 5 분이 이어졌다. 반응은 종래 공지된 방법(즉, 컬럼 정제 및 알코올 침전)을 통해서 정제될 때까지 4 ℃ 에서 유지하였다. 자동화된 서열화가 PE Biosystems ABI Prism 3700 DNA Analyzer로 수행되었다.
서열은 Sequencher software(GeneCodes)를 이용하여 인공적으로 편집된다. 모든 편집된 EST 서열은 BLAST 알고리즘(8)을 이용하여 비-중복 Genebank/EMBL/DDBJ 와 dbEST 데이타베이스에 비교되었다. 최소값 P = 10-10및 뉴클레오티드 서열 동일성＞95 %가 공지된 유전자 또는 다른 ESTs에 매칭하는 ESTs 에 대한 추정적 동일성의 지정에 요구되었다. EST 에서 표현된 유전자의 비-중복 리스트의 구축은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 Unigene, Entrez 및 PubMed 의 도움으로이루어졌다. 상대적인 유전자 발현 빈도는 각 유전자에 대한 EST 카피의 수를 분석된 ESTs의 총수로 나눔으로서 계산되었다. 공지된 유전자 매치로 ESTs 의 기능적 특성화는 Hwang et al., "A Genome-Based Resource for Molecular Cardiovascular Medicine: Toward a Compendium of Cardiovasular Genes." Circulation 1997;96:4146-203)에 의해서 기술된 카테고리에 따라서 만들어졌다.
총 13,398 EST 가 인간 태아 연골 cDNA 라이브러리로부터 얻어졌다. 이들중 5,747 ESTs(41.8 %)가 공지된 유전자 서열에 매치되었고, 1,885 ESTs(13.4 %)가 다른 ESTs 에 매치되었으며, 그리고 3,053(22 %)이 미토콘드리아, 리보솜, 벡타, 및 cDNA/가상적 단백질 서열에 매치되었다. 어떤 공지된 서열과 매칭되지 않는 209 ESTs(4.7 %)가 신규한 것으로 분류되었다. 나머지는 게놈 DNA 서열(1,948 ESTs,13.8 %)및 반복 서열(586 ESTs, 4.3 %)에 매치되었다.
태아 라이브러리내 13,398 EST 서열은 이들이 나타내는 2,579 독특한 공지된 유전자들의 기능적 분류에 기초하여 특성화되었다. 하기 표는 이 분석 결과를 나타낸다.
실시예 2: RNA 추출 및 정상 성인 cDNA 라이브러리 구축
cDNA 라이브러리가 정상 성인 연골로부터 제조되었다. ESTs 가 cDNA 로부터 얻어지고, 정상 성인 연골세포에 대한 하나이상의 유전자 발현 프로파일을 만들기 위해서 특성화되었다.
cDNA 삽입물의 큰-스케일 서열화
cDNA 라이브러리가 SMART(Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript)cDNA Library Construction Kit(Clontech)를 이용하여 PCR-계 방법을 통해해서 λTripleEx2 벡터내로 구축되었다. 파지 플라크가 랜덤하게 골라지고, 포지티브 삽입물이 PCR 에 의해서 확인되었다. 아가로즈 겔 전기영동이 삽입물의 존재와 완전성을 측정하기 위해서 이용되었다. PCR 생성물은 5'벡터 특이적 전방 프라이머로 자동화된 DNA 서열화를 거치고, 그리고 ABIPRISM 377DNA 시퀀서(Perkin Elmer) 및 ABIPRISM 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems)로 서열화되었다. 모든 생성된 EST 서열은 비-중복 Genebank/EMBL/DDBJ 와 dbEST 및 GSS데이타베이스에 대해서 연구되었다. 최소값 P = 10-10및 뉴클레오티드 서열 동일성＞95 %가 공지된 유전자 또는 다른 ESTs에 대해서 ESTs 매칭에 대한 추정적 동일성의 지정에 요구되었다. 상대적인 유전자 발현 빈도는 각 유전자에 대한 EST 카피의 수를 분석된 ESTs의 총수로 나눔으로서 계산되었다.
서열은 Sequencher software(GeneCodes)를 이용하여 인공적으로 편집된다. 모든 편집된 EST 서열은 BLAST 알고리즘(8)을 이용하여 비-중복 Genebank/EMBL/DDBJ 와 dbEST 데이타베이스에 비교되었다. 최소값 P = 10-10및 뉴클레오티드 서열 동일성＞95 %가 공지된 유전자 또는 다른 ESTs에 매칭하는 ESTs 에 대한 추정적 동일성의 지정에 요구되었다. EST 에서 표현된 유전자의 비-중복 리스트의 구축은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 Unigene, Entrez 및 PubMed 의 도움으로이루어졌다. 상대적인 유전자 발현 빈도는 각 유전자에 대한 EST 카피의 수를 분석된 ESTs의 총수로 나눔으로서 계산되었다. 공지된 유전자 매치로 ESTs 의 기능적 특성화는 Hwang et al., "A Genome-Based Resource for Molecular Cardiovascular Medicine: Toward a Compendium of Cardiovasular Genes." Circulation 1997;96:4146-203)에 의해서 기술된 카테고리에 따라서 만들어졌다.
총 17,151 EST 가 정상 연골 cDNA 라이브러리로부터 얻어졌다. 이들중 6,775 ESTs(44.2 %)가 공지된 유전자에 매치되었다. 1.4 %(132ESTs)가 어떤 의미있는 매치를 보이지 않았으며, 그래서 신규한 것으로 분류되었다. 공지된/독특한 유전자의 기능적 분류에 기초한 17,151 EST 서열이 하기 표와 같이 나타났다.
실시예 3: 마일드한 골관절염 및 심각한 골관절염 연골 세포로부터 RNA 추출 및 cDNA 라이브러리 구축
cDNA 라이브러리가 마일드한 골관절염 연골과 심각한 골관절염 연골로부터 제조되었다. ESTs 가 cDNA 로부터 얻어지고, 마일드한 골관절염 연골과 심각한 골관절염 연골에 대한 하나이상의 유전자 발현 프로파일을 만들기 위해서 특성화되었다.
관절 연골은 관절경 무릎 수술 또는 전체 무릎 대체로부터 얻어졌다. 연골 시료는 매우 초기 연골 퇴화(마일드)의 영역으로부터 또는 마지막 단계 질병(심각)의 부위로부터 얻어졌다. cDNA 라이브러리는 성인 시료에 대해서 기술된 것과 같이 구축되었다(실시예 2).
cDNA 삽입물의 큰-스케일 서열화
cDNA 라이브러리가 SMART(Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript)cDNA Library Construction Kit(Clontech)를 이용하여 PCR-계 방법을 통해해서 λTripleEx2 벡터내로 구축되었다. 파지 플라크가 랜덤하게 골라지고, 포지티브 삽입물이 PCR 에 의해서 확인되었다. 아가로즈 겔 전기영동이 삽입물의 존재와 완전성을 측정하기 위해서 이용되었다. PCR 생성물은 5'벡터 특이적 전방 프라이머로 자동화된 DNA 서열화를 거치고, 그리고 ABIPRISM 377DNA 시퀀서(Perkin Elmer) 및 ABIPRISM 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems)로 서열화되었다. 모든 생성된 EST 서열은 비-중복 Genebank/EMBL/DDBJ 와 dbEST 및 GSS데이타베이스에 대해서 연구되었다. 최소값 P = 10-10및 뉴클레오티드 서열 동일성＞95 %가 공지된 유전자 또는 다른 ESTs에 대해서 ESTs 매칭에 대한 추정적 동일성의 지정에 요구되었다. 상대적인 유전자 발현 빈도는 각 유전자에 대한 EST 카피의 수를 분석된 ESTs의 총수로 나눔으로서 계산되었다.
서열은 Sequencher software(GeneCodes)를 이용하여 인공적으로 편집되었다. 모든 편집된 EST 서열은 BLAST 알고리즘(8)을 이용하여 비-중복 Genebank/EMBL/DDBJ 와 dbEST 데이타베이스에 비교되었다. 최소값 P = 10-10및 뉴클레오티드 서열 동일성＞95 %가 공지된 유전자 또는 다른 ESTs에 매칭하는 ESTs 에 대한 추정적 동일성의 지정에 요구되었다.
EST 에서 표현된 유전자의 비-중복 리스트의 구축은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 Unigene, Entrez 및 PubMed 의 도움으로 이루어졌다. 상대적인 유전자 발현 빈도는 각 유전자에 대한 EST 카피의 수를 분석된 ESTs의 총수로 나눔으로서 계산되었다.
공지된 유전자 매치로 ESTs 의 기능적 특성화는 Hwang et al(Hwang DM, Dempsey AA, Wang RX, Rezvani M, Barrans JD, Dai KS, et al. "A Genome-Based Resource for Molecular Cardiovascular Medicine: Toward a Compendium of Cardiovasular Genes." Circulation 1997;96:4146-203)에 의해서 기술된 카테고리에 따라서 만들어졌다.
총 12,651 ESTs 와 14,222 ESTs가 마일드 및 심각한 골관절염 cDNA 라이브러리로부터 각각 얻어졌다(표 5 및 표 6). 마일드 OA의 약 43 % 와 심각한 OA ESTs의 51 % 가 데이타베이스에 공지된 유전자에 매치되었다. 대략적으로, 각각의 ESTs 의 2.6 % 및 1.5 %가 어떤 의미있는 매치를 보이지 않았으며, 그래서 신규한 것으로 분류되었다.
공지된 유전자에 의해서 표현된 기능적 특성규명에 기초한 마일드한 OA 라이브러리로부터의 12,651 EST 서열과 심각한 OA 라이브러리로부터의 14,222 EST 서열의 특성규명은 하기 표와 같다.
실시예 4: 태아, 정상 마일드한 골관절염, 및 심각한 골관절염 연골에서 디퍼렌셜하게 발현된 유전자의 확인
여기서 정의된 것과 같이 정상, 마일드, 심각 및 태아 연골사이에서 디퍼렌셜하게 발현된 유전자는 상대적인 EST 빈도 분석을 통해서 확인되었다(도 6 참조). 도 6 에서 확인된 5,807 공지된 독특한 유전자가 모든 4 개 조직 타입에서 발현된 것으로 발견되었다. 가능한 서브분석(subanalysis)의 예가 도 15 및 도 16 에서 보여진다. 특별하게 표지된 디퍼렌셜한 발현을 가진 이들 유전자의 일부가 도 4 에 보여진다. 콜라겐을 나타내는 ESTs의 상대적인 빈도(도 2 및 3)와 선택된 세포외매트릭스 단백질(도 1)이 또한 분석되었다.
실시예 5: 마이크로배열 구축
발명에 따른 마이크로배열이 하기와 같이 구축되었다.
OA 연골 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론의 PCR 생성물(~40 ㎕)이 증폭을 위해서 사용된 동일한 96-웰 튜브에서 4 ㎕(1/10 부피)의 3 M 쏘듐 아세테이트(pH 5.2) 및 100 ㎕(2.5 부피)의 에탄올로 침전되고, 그리고 -20 ℃ 에서 밤새 저장되었다. 이들은 3,300 rpm으로 4 ℃ 에서 1 시간동안 원심분리되었다. 얻어진 펠렛들은 50 ㎕ 얼음냉각 70 % 에탄올로 세척되고, 다시 30 분동안 원심분리되었다. 펠렛은 다음 공기 건조되고, 50 % 디메틸설폭사이드(DMSO) 에서 또는 20 ㎕ 3X SSC에서 밤새 재현탁된다. 시료들은 다음 로보트 GMS 417 또는 427 배열기(Affymetrix, CA)를 이용하여 감마 아미노 프로필 실란(Corning CMT-GAPS 또는 CMT-GAP2, 카탈로그 No. 40003, 40004) 또는 폴리리신-코팅 슬라이드(Sigma Cat. No. P0425)상에 단독으로 또는 이중으로 정치되었다. 마이크로배열에서 DNA 스팟의 경계는 다이아몬드 스크라이버로 표시되었다. 발명은 배열을 제공하며, 여기서 10 - 20,000 PCR 생성물이 고체 지지체 상에 배열을 제조하기 위해서 스팟된다.
배열들은 슬라이드를 입자가 없는 따뜻한 ddH2O 에 대략 1분 정도 현탁시킴으로서 재수화되고(스팟은 서로 충돌하지 않게 약간 팽윤될 것이다), 그리고 3 초간 70 - 80 ℃ 의 역전된 가열블럭에서 스냅 건조된다. DNA 는 다음 슬라이드에 UV 가교되거나(Stratagene, Stratalinker, 65 mJ - 650 x 100 μJ인 "650"에 디스플레이틀 고정), 또는 80 ℃ 에서 2 에서 4 시간 구워진다. 배열은 슬라이드 걸이에 위치된다. 빈 슬라이드 챔버가 준비되고, 그리고 하기 용액으로 채워진다: 3.0 g의 숙신 엔하이드라이드(Aldrich) 가 189 ml 의 1-메틸-2-피롤리디논(시약의 급격한 첨가가 중요하다)에 용해되고; 숙신 엔하이드라이드의 마지막 박편이 용해된 직후, 21.0 ml 의 0.2 M 쏘듐 보레이트가 혼합되고, 그리고 용액이 슬라이드 챔버에 부어진다. 슬라이드 걸이가 빠르게 그리고 균일하게 슬라이드 챔버에 담궈지고, 그리고 수초간 격렬하게 상하로 흔들어, 슬라이드가 용액을 떠나지 않는다는 것을 확인한 후, 오비탈 쉐이커에 15 - 20 분간 혼합된다. 슬리이드 걸이는 다음 2 분간 95 ℃ ddH2O 에 서서히 담궈지고, 이어서 95 % 엔탄올에 5 회 담궈진다. 슬라이드는 다음에 종이타월에 과다한 에탄올을 떨어트리면서 공기 건조된다. 배열은 다음에 사용시까지 실온의 슬라이드 박스에서 건조된다.
실시예 6: 타겟 핵산 제조 및 혼성화
mRNA 로부터 형광 DNA 프로브의 제조
형광으로 표지된 타겟 핵산 시료가 발명의 배열로 분석하기 위해서 제조된다.
2 ㎍ 올리고-dT 프라이머가 총 부피 15 ㎕ 에서, 70 ℃ 에서 10 분간 가열하고 그리고 얼음에서 냉각함으로서 골관절염으로 진단되거나 또는 골관절염을 가지는 것으로 의심된 환자로부터의 연골 시료에서 분리된 2 ㎍ 의 mRNA까지 풀린다. mRNA 는 시료를 42 ℃ 에서 1.5 - 2 시간동안, 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 75 mMKCl, 3 mM MgCl2, 25 mM DTT, 25 mM 비표지된 dNTPs, 400 단위의 Superscript II(200 U/uL, Gibco BRL), 및 15 mM 의 Cy3 또는 Cy5(Amersham)의 최종 농도를 함유한 100 ㎕ 부피에서, 배양함으로서 역전사된다. RNA 는 다음에 15 ㎕ 의 0.1 N NaOH를 투입하고, 70 ℃ 에서 10 분간 배양함으로서 변성된다. 반응 혼합물은 15 ㎕ 의 0.1 N HCl 의 투입에 의해서 중화되고, 부피는 TE(10 mM Tris, 1 mM EDTA)로 500 ㎕까지 이르고, 그리고 20 ㎍ 의 Cot1 인간 DNA(Gibco-BRL)가 투입된다.
표지된 타겟 핵산 시료가 Centricon-30 micro-concentrator(Amicon)에서 원심분리에 의해서 정제된다. 두개의 상이한 타겟 핵산 시료(예를 들면, 상이한 환자로부터 유래된 두 시료)가 동일한 배열에 혼성화함으로서 분석되고 그리고 비교된다면, 각 타겟 핵산 시료는 상이한 형광 표지로 표지되고(예를 들어, Cy3 및 Cy5), 그리고 별도로 농축된다. 별개로 농축된 타겟 핵산 시료(Cy3 및 Cy5표지된)는 깨끗한 센트리콘(centricon)에서 혼화되고, 500 ㎕ TE로 세척되고, 다시 7 ㎕ 미만의 부피까지 농축된다. 1 ㎕ 의 10 μg/㎕ 폴리 A RNA(Sigma, #P9403) 및 1 ㎕ 의 10 μg/㎕ tRNA(Gibco-BRL, #15401-011) 이 투입되고, 그리고 부피는 증류수로 9.5 ㎕ 로 조절된다. 최종 타겟 핵산 제조를 위해, 2.1 ㎕ 20XSSC(1.5 M NaCl, 150 mM NaCitrate(pH 8.0))과 0.35 ㎕ 10 %SDS가 투입된다.
혼성화
표지된 핵산이 100 ℃ 에서 2 분간 가열함으로서 변성되고, 그리고 22 mm x 22mm 글라스 커버 슬립하에서 핵산 배열에 놓여지기 전에 37 ℃ 에서 20 - 30 분동안 배양된다. 혼성화는 3 XSSC 의 적은 저장조로 유지된 습도를 가진 통상의 슬라이드 챔버에서 65 ℃ 에서 14 에서 18 시간동안 수행된다. 배열은 0.1 % SDS의 2X SSC에서 2 - 5 분간 담궈서 교반함으로서 세척되고, 1 X SSC, 및 0.1 X SSC 가 이어진다. 최종적으로, 배열은 2 분간 650 RPM 으로 Microplus carrier 에서 Beckman GS-6 식탁용 원심분리기에서 2 분동안 슬라이드 걸이에서 원심분리함으로서 건조된다.
실시예 7: 신호 검출 및 데이타 발생
하나 이상의 표지된 핵산 시료의 혼성화에 이어서, 배열이 즉각 GMS Scanner 418 및 Scanalyzer software(Michael Eisen, Stanford University), 이어서 GeneSpring software(Silicon Genetics, CA)로 조사되었다. 선택적으로, GMS Scanner 428 및 Jaguar software 가 GeneSpring software analysis 에 이어서 사용될 수 있다.
만일 하나의 타겟 핵산 시료가 분석된다면, 시료는 하나의 형광 염료(예를 들어 Cy3 또는 Cy5 )로 표지된다.
실시예 6 에서 기술된 마이크로배열에 대한 혼성화 후, 마이크로배열상의 결합된 핵산 멤버에서 형광 강도가 레이져 들뜸 소스(source) 및 Cy3 또는 Cy5 형광제에 대한 적절한 간섭 필터를 구비한 통상의 공초점 현미경으로 얻어진 이미지로부터 측정된다.
마이크로배열에서 Cy3 또는 Cy5 형광 염료의 존재는 마이크로배열상에서 특이적 핵산 멤버와 타겟 핵산의 혼성화를 가르킨다. Cy3 또는 Cy5 형광 강도는 마이크로배열에서 핵산 멤버에 혼성화된 타겟 핵산의 양을 나타내며, 그리고 타겟 시료에서 특이적 핵산 멤버 서열의 발현 수준을 가르킨다.
두 타겟 핵산 시료가 분석되고, 비교될 때(예를 들며, 마일드한 골관절염 대 심각한 골관절염), 한 타겟핵산 시료(예를 들면, 마일드한 골관절염)가 형광염료 Cy3 로 표지되고, 다른 타겟 핵산 시료(예를 들어, 심각한 골관절염)는 형광 염료 Cy5 로 표지된다.
실시예 6 에서 기술된 혼성화 후, 마이크로배열내 결합된 핵산 멤버에서 형광강도는 레이져 들뜸 소스(source) 및 Cy3 또는 Cy5 형광제에 대한 적절한 간섭 필터를 구비한 통상의 공초점 현미경으로 얻어진 이미지로부터 측정된다. 별개의 스켄이 각 형광제에 대해서 해상도 픽셀당 225 ㎛2의 해상도와 65,536 회색 수준에서 얻어진다. 이것은 한 세트의 내부 제어 유전자를 거의 동일한 강도로 가져가도록 검출 감도의 인위적인 매칭, 이어서 이 세트의 유전자에 대한 최적 강도 매칭에 요구되는 나머지 스칼라의 컴퓨터 계산에 의해서 성취된다.
마이크로배열에서 Cy3 또는 Cy5 형광 염료의 존재는 마이크로배열내 특이적 핵산 멤버와 타겟 핵산의 혼성화를 가르킨다. Cy3 또는 Cy5 형광의 강도는 마이크로배열에서 핵산 멤버에 혼성화된 타겟 핵산의 양을 나타내며, 타겟 시료에서 특이적 핵산 멤버의 발현 수준을 가르킨다. 만일 배열내 핵산 멤버가 어떤 색상을 보이지 않는다면, 이것은 요소내 유전자가 양시료에서 발현되지 않았다는 것을 가르킨다. 만일 배열에서 핵산 멤버가 단일 색상을 보인다면, 이것은 표지된 유전자가 단지 그 세포 시료에서만 발현된다는 것을 가르킨다. 두 칼라가 나타나는 것은 유전자가 양 조직 시료에서 발현된다는 것을 가르킨다. 정규화 후, Cy3 또는 Cy5 형광 강도의 차이는 비교용의 두 시료에서 관련된 핵산 멤버 서열의 발현수준의 차이를 가르킨다. 1.0 보다 큰 두 시료사이의 발현강도의 차이는 디퍼렌셜한 유전자 발현을 가르키는 것으로서 이용된다.
배열이 Cy3 또는 Cy5 채널에서 스켄되고, 별개의 16-비트 TIFF 이미지로서 저장된다. 이미지는 배열에서 각 스팟으로부터 혼성화 강도를 포착하는 그리딩(gridding)공정을 포함하는 Scanalyzer software를 이용하여 분석되고, 그리고 통합된다. 형광강도 및 각 스팟의 배경-공제 혼성화 강도가 모여지고, 그리고 Cy3 또는 Cy5 의 평균 강도의 비가 계산된다. 선형 회귀 접근이 정규화를 위해서 사용되고, 측정된 Cy3 대 Cy5 강도의 산포플롯은 하나의 영역을 가져야 한다. 비의 평균이 계산되고,그리고 데이타를 재구축하기 위해서 사용되고, 기울기를 1 에 조정한다. 1.0 배 보다 큰 상- 또는 하-규제의 후-정규화 컷오프가 디퍼렌셜하게 발현된 유전자를 확인하기 위해서 사용된다.
도 14 에서 일부 서열을 포함하는 마이크로배열의 분석은 2-배보다 큰 중앙값 비를 보여주는 마일드한 골관절염에서 36 개의 후보 상향규제된 유전자와 0.2 배보다 작은 중앙값을 보여주는 47 개 후보 하향규제된 유전자에 이르게 된다(도 9 및 도 10 각각). 2.0 배보다 큰 중간값 비를 보여준 총 38 개의 상향규제된 후보 유전자와 0.2배보다 작은 중간값 비를 보여준 51 개의 하향 규제된 후보 유전자가 심각한 골관절염 라이브러리에서 또한 확인되었다.(도 11 및 12 각각) 이 실시예에서 따라서, 마이크로배열은 마일드한 골관절염으로 진단된 개체로부터 유래된 타겟핵산 시료와 심각한 골관절염으로 진단된 개체로부터 유래된 타겟핵산 시료로 혼성화되었다. 당업자에게 명백한 것과 같이, 유사한 분석이 도 13 에서 확인된 서열 또는 여기서 기술된 방법을 이용하여 도 6 에서 공개된 유전자에 상응하는 도 6 A에서 확인된 서열의 하나에 대해서 수행될 수 있다.
실시예 8: 연골세포-특이적 유전자 마이크로배열 및 진단 마이크로배열 구축
핵산 멤버의 집합이 마일드한 OA진단 마이크로배열의 구축을 위해서 실시예 5 에서 기술된 것처럼 글라스 슬라이드에 스팟된다. 핵산 멤버의 집합이 심각한 OA진단 마이크로 배열의 구축을 위해서 실시예 5 에서 기술된 것처럼 글라스 슬라이드에 스팟된다. 연골 세포 특이적 핵산 멤버의 집합이 연골세포-특이적 유전자 마이크로배열의 구축을 위해서 실시예 5 에서 기술된 것처럼 글라스 슬라이에 스팟된다. 기술된 마이크로배열상에 스팟된 핵산 멤버들이 도 6B, 6C, 6D 및 6E에서의 명칭된 것들로부터 선택된다.
실시예 9 : 진단
타겟 핵산 시료가 어떤 개체(도 6 에서 기술된 것처럼)가 연골 RNA 추출물로부터 제조되고, 핵산 멤버의 집합을 포함하는 마이크로 배열에 혼성화되며, 여기서 적어도 하나의 멤버가 여기서 정의된(실시예 6 에서 기술된 것과 같이)정상 개체로부터 분리된 연골과 비교하여, 마일드, 중간정도, 현저 또는 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현된다. 혼성화 패턴이 발생되고, 그리고 실시예 7 에서 분석된다. 예를 들어, 멤버가 정상 개체에 비교시 마일드한 골관절염 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 핵산멤버의 집합을 포함하는 마이크로배열에서 적어도 하나의 핵산 멤버에 대한 타겟 핵산 시료의 혼성화는 타겟 핵산 시료가 유래된 개체로부터의 마일드한 골관절염을 가르킨다. 정상 개체에 비교시 심각한 골관절염 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 핵산멤버의 집합을 포함하는 마이크로배열에서 적어도 하나의 핵산 멤버에 대한 타겟 핵산 시료의 혼성화는 타겟 핵산 시료가 유래된 개체로부터의 심각한 골관절염을 가르킨다.
실시예 10 치료제의 스크리닝
태아, 마일드한 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 및 심각한 골관절염의 연골세포 질병 또는 발달 단계의 하나로부터 유래된 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증가 또는 감소시키는 후보 치료제가 하기와 같은 방법으로 스크린된다.
연골세포가 "정상"개체로부터 분리되고, 그리고 후보 제제의 존재 및 부존재하에서 시간의 양을 변화시키는 것에 대해서 배양된다(즉 30 분, 1 시간, 5 시간, 24 시간, 48 시간, 및 96 시간). 체료제를 스크리닝할 때, 도 6 A 또는 도 13 에서 EST 에 상응하는 전 유전자 서열의 클론이 연골세포를 감염시키기 위해서 사용된다. 감염된 연골세포는 다양한 양의 시간동안(예를 들면, 1,2,3,5,7,10 또는 14 일) 배양된다. 배양후, 타겟 핵산 시료가 연골세포로부터 제조되고, 그리고 태아, 정상, 마일드한 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염의 적어도 2 개에서 유래된 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산 프로브에 혼성화된다. 핵산 서열이 표지되고, 예를 들어, 방사성 표지로 표지되고, 여기서 기술되고 종래 공지된 방법에 따른다. 혼성화는상기 Ausubel et al., 또는 상기 Sambrook et al.에서 기술된 것과 같이,노턴 블럿(northern blot)에 의해서 수행된다. 태아, 마일드한 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 및 심각한 골관절염의 하나로부터 RNA에 관련하여 정상으로부터 타겟핵산 시료에 대한 프로브의 디퍼렌셜한 혼성화는 여기서 정의된 바와 같이, 디퍼렌셜하게 발현된 연골세포 특이적 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 RNA의 발현 수준을 가르킨다. 후보제제의 존재하에서 배양 단계의 결과로서 프로브 서열의 발현 수준의 변화는 연골세포 특이적 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증가 또는 감소시키는 제제를 가르킨다.
실시예 11. 사후 분리된 연골 RNA의 완전성 측정
하기 비비 연골 연구가 다양한 사후 시간에서 분리된 RNA 와 깨끗하게 분리된 RNA의 질을 평가하기 위해서 수행되었다.
비비 연골의 9 개 바이알이 얻어졌고, 사용시까지 액체 질소에 저장되었다.
각 바이엘로부터 비비 연골이 계량되고, 그리고 액체 질소하에서 정밀하게 파우더화 되었다. 시료는 TRIzolR시약(0.1 g/ml TRIzolR)에서 균질화되고, 그리고 총 RNA 가 추출되었다. RNA 의 양은 OD260수치에 따라서 계산되었다. RNA 겔에서 두 날카로운 밴드의 현출이 RNA 가 양질임을 나타내었다.
RT-PCR 이 콜라겐 형II(COL2A1), B-actin 및 GAPDH 의 유전자 발현에 대해서 수행되었으며, 각 시료로부터 0.1 ㎍ 총 RNA 를 이용하였다.
RNA 겔 패턴은 RNA 가 사후 12 시간까지 변성되지 않았다는 것을 보여준다(표 7). 그러므로, 안정한 RNA 는 사후 12 시간이내 생검 시료로부터 기대되어야 한다.
콜라겐 타입 II 가 풍부하고, 정상 관절 연골에 특이적이다. 그 mRNA 수준은 #9(24 시간 사후) 를 제외한 모든 시료에서 거의 동등한다. 초기 취해진 시료들이 천연 in vivo 상태에서 더 잘 반영한다는 것을 주목해야 한다.
실시예 12 마일드 및 심각한 골관절염 연골에서 인간 연골세포 유전자 발현의 발현된 서열 태그(ESTs) 분석
인간 태아 연골로부터 얻어진 cDNA 라이브러리의 대-스케일 부분 서열화가 OA 진행에서 중요한 역할을 하는 유전자에 상응하는 발현된 서열 태그(ESTs)를 확인하기 위해서 수행될 수 있다. 인간의 정상, 마일드 및 심각한 OA 연골로부터의 cDNA 라이브러리의 대 스케일 서열화가 또한 수행되고, 그리고 세 cDNA 라이브러리로부터의 총 44,000 ESTs 이상이 분석되었다.
정상 연골이 Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Universityof Miami 의 기증자 프로그램으로부터 얻어졌다. OA 연골 시료가 매우 초기의 연골 퇴화(마일드) 또는 마지막 질병 단계(심각)의 부위로부터, 골관절경 무릎 수술 또는 전체적인 무릎 대체술중에 얻어졌다. 연골로부터 총 RNA 가 TRIzolR시약(GIBCO)을 이용하여 추출되었다. cDNA 라이브러리가 SMART(Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript)cDNA Library Construction Kit(Clontech)를 이용하여 PCR-계 방법을 통해서 λTriplEx2 벡터내로 상기와 같이 구축되었다. 파지 플라크가 랜덤하게 골라지고, 포지티브 삽입물이 PCR 에 의해서 확인되었다. 아가로즈 겔 전기영동이 삽입물의 존재와 완전성을 측정하기 위해서 이용되었다. PCR 생성물은 5'벡터 특이적 전방 프라이머로 자동화된 DNA 서열화를 거치고, 그리고 ABIPRISM 377DNA 시퀀서(Perkin Elmer) 및 ABIPRISM 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems)로 서열화되었다. 모든 생성된 EST 서열은 비-중복 Genebank/EMBL/DDBJ 와 dbEST 및 GSS데이타베이스에 대해서 연구되었다. 최소값 P = 10-10및 뉴클레오티드 서열 동일성＞95 %가 공지된 유전자 또는 다른 ESTs에 대해서 ESTs 매칭에 대한 추정적 동일성의 지정에 요구되었다. 상대적인 유전자 발현 빈도는 각 유전자에 대한 EST 카피의 수를 분석된 ESTs의 총수로 나눔으로서 계산되었다.
총 17,151 개 ESTs, 12,651 ESTs, 및 14,222 ESTs 가 정상, 마일드, 및 심각한 골관절염 cDNA 라이브러리로부터 각각 얻어졌고, 그리고 유전자 발현 프로파일화를 위해서 사용되었다. 이들 세 cDNA 라이브러리로부터의 총 ESTs 의 약 44 % 가 데이터베이스에서 공지된 유전자에 매칭되었으며, ESTs(409) 의 약 0.9 % 가공지된 서열에 의미있는 매치가 없는 결과에 이르렀으며, 그리고 그래서 신규한 것으로 지정되었다. 공지된 유전자 매치의 비중복 분석은 정상에서 2,518 독특한 유전자, 마일드에서 1,938, 그리고 심각한 OA 연골에서 2,256 의 확인에 이르렀다. 태아(22), 정상, 마일드, 및 심각한 OA 연골(23)중 디퍼렌셜하게 발현된 공지된 유전자가 도 6 에서 보여진 것과 같이 상대적인 EST 빈도 수준을 확인함으로서 확인되었다.
특정하게 현저한 디퍼렌셜한 발현의 일부 유전자가 여기에서 제공된 도 4 에서 보여진다. 히트 쇼크 프로틴 90(Heat shock protein 90(HSP90)은 마일드한 OA 에서 가장 풍부한 ESTs 매치를 가지는 유전자였다. 그 전사 수준은 태아 연골에서 낮았다. 베타-2-마이크로글로블린(B2M) 수준은 정상 연골보다 질병이 있는 연골에서 더 높았으며, 그리고 태아 연골에서 보다 질병이 있는 연골에서 유의하게 더 높았다. 마일드 및 심각한 OA 에서 그 EST 수준은 유사하였다. 골아세포 특이적 인자2(OSF-2p1)은 태아, 마일드, 및 정상 연골에 비해서 심각한 OA 에서 더 높게 발현되었다. 다른 디퍼렌셜하게 발현된 유전자는 메가카요사이트 자극 인자(MSF, 또한 표면적 영역 단백질, 또는 프로토글리칸 4로 알려진)이었다. 이것은 심각한 OA 에서보다 마일드 OA 에서 유의하게 높은 발현을 가졌다.
콜라겐을 나타내는 ESTs의 상대적인 빈도가 또한 도 3 에서 보여지는 것과 같이 분석되었다.
비콜라겐성(noncollagenous) 매트릭스는 여기서 제공된 도 1 및 4 에서 보여지는 것과 같이 데코린(DCN), 피브로넥틴(FN), 루미칸(LUM), 및 매트릭스 G1a 단백질(MGP)의 더 높은 EST 수준을 보여주었다.
실시예 13 인간 골관절염에서 메타-2 마이크로글로블린(B2M) 발현의 마이크로배열 분석
상기에서 기술된 것과 같이, 메타 2-마이크로글로블린(B2M)은 마일드 및 심각한 OA 연골에서 높은 EST 발현 수준을 가졌다. B2M은 염증성 및 악성 질병에서 높아지는 비글리코실화 폴리펩티드이다. 인간 활액 피브로블라스트에서 스트로멜리신 및 사이클로옥시제나제-2-합성을 유도하는 것이 보여진다.
골관절염의 다른 상이한 단계에서 B2M 발현이 평가되었다. 인간 OA 활액 유체(SF)가 골관절경에서 흡입 또는 전체 무릎 대체에 의해서 인간 무릎 관절에서 얻어졌다. 정상 시료가 무릎 부상이나 관절염의 병력이 없는 자원자로부터 모아졌다. 기관 배양이 하기와 같이 수행되었다: 심각한 인간 OA 연골 슬라이스가 24-웰 플레이트에서 웰당 한 슬라이스로 10 % FCS 의 DMEM(Dullbecoo's modified Eagle medium): 100 단위/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(DMEM++)에서 37 ℃ 로 5 % CO2의 가습된 대기에서 배양되었다. 배양 배지(20 마이크로리터)가 B2M 테스트에 대한 상이한 시점에서 모집되었다. 활액 유체에서 B2M 수준 및 연골 기관 배양된 배지가 B2M 효소 면역 테스트 키트(ALPCO)를 이용하여 측정되었다. 통계적 유의성이 유의하다고 고려되는 0.05 미만 P값을 가진 학생의 t-테스트에 의해서 측정되었다. 심각한 OA 를 가진 환자로부터의 연골세포의 세포배양이 하기와 같이 수행되었다. 연골세포가 콜라게나제 타입 II 소화를 통해서 심각한 OA 를 가진 환자로부터의 연골로부터 유래되었다. 세포들이 6-웰 플레이트에서 6.5 x 10000/웰(3.2 x 10000/ml)에서 뿌려지고, 그리고 72 시간 동안 10 마이크로그램/ml B2M(Sigma) 의 존재 또는 부존재로 처리되었다. 5184 연골세포-특이적 cDNA 클론을 함유하는 마이크로배열이 유전자 발현 프로파일을 위해서 사용되었다.
정상(nor), 마일드(mioa), 중간정도(mooa), 현저(maoa) 및 심각한 OA(seoa) 활액 유제에서 검출된 평균 B2M 수준이 도 17 에서 보여진다. 골관절염 활액 유체에서 B2M이 정상에서보다 유의하게 더 높다. 그러나, 어떤 유의한 차이가 상이한 골관절염 단계중에서 B2M 수준에서 발견되었다.
연골세포가 B2M 분비에 기여하는지를 측정하기 위해서, 배양된 심각한 OA 연골로부터 배지가 모집되었고 그리고 B2M 에 대해서 측정되었다. 도 18 은 B2M 의 방출이 24 시간 배양 후 검출가능하고 72 시간 연구 기간동안 계속해서 증가한다는 것을 보여준다. 72 시간에서, B2M 의 축적이 약 2.1 마이크로그램/g 연골이었다. 유사한 결과가 세번의 실험적 시행에 거쳐서 얻어졌고, 각각 상이한 기증가로부터 연골을 이용한다.
B2M 에 의해서 규제된 유전자가 상기 기술된 것과 같이, 마이크로배열을 통해서 검출되었다. 도 19 는 2 색상 형광 스켄의 블랙 및 화이트 표현을 보여준다. Cy3 표지(이것은 녹색 스팟으로 나타날 것이다)는 B2M 처리된 연골세포에서 바람직하게 발현된 유전자를 표현한다. 유전자의 확인은 배열에서 핵산 멤버의 위치에 의해서 결정되었다. B2M에 의해서 적어도 2 배 상향 또는 하향 규제된 유전자의 일부가 표 8 에서 목록화된다.
여기서 기술된 것의 변형, 변경 및 다른 이행이 발명의 사상과 영역을 벗어나지 않으면서 당업자에게 일으킬 것이다. 하기 제공된 참고문헌이 전체로서 여기서 도입된다.

Claims (57)

  1. 도 6 에서 확인된 1 - 5807 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 이들 서열 및/또는 도 13 에서 확인된 이들 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  2. 제 1 항의 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  3. 제 2 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  4. (a) 태아, (b) 정상, (c)마일드한 골관절염, (d) 중간정도 골관절염, (e) 현저한 골관절염 또는 (f) 심각한 골관절염 연골 시료의 하나 이상으로부터 분리된 하나 이상의 연골세포 풍부 또는 연골세포 특이적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  5. 도 14 에서 공개된 도 6B 에서 확인된 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  6. 도 14 에서 공개된 도 6C에서 확인된 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  7. 도 14 에서 공개된 도 6D에서 확인된 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  8. 도 14 에서 공개된 도 6E에서 확인된 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  9. 도 14 에서 공개된 도 6B, 6C, 6D, 및 6 에서 확인된 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  10. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 정상 개체로부터의 연골에 관련하여 마일드한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되고, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골이 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  11. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 정상 개체로부터의 연골에 관련하여 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되고, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골이 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  12. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 정상 개체로부터의 연골에 관련하여 현저한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되고, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골이 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  13. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 정상 개체로부터의 연골에 관련하여 중간정도 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되고, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골이 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골 조직으로부터 분리되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  14. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 태아로부터 분리된 연골에 관련하여 마일드한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  15. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 태아로부터 분리된 연골에 관련하여 중간정도 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  16. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 태아로부터 분리된 연골에 관련하여 현저한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  17. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 태아로부터 분리된 연골에 관련하여 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  18. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 태아로부터 분리된 연골에 관련하여 정상개체로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  19. 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나가 (a)태아, (b) 마일드한 골관절염 환자, (c) 중간정도 골관절염 환자, (d) 현저한 골관절염 환자, (e) 심각한 골관절염 환자, 또는 (f) 사후 14 시간 이내에서 얻어진 연골조직으로부터 분리된 정상 개체로부터 분리된 연골 출처들 중 적어도 두개로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  20. 도 9 에서 확인된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 도 9 에서 공개된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 서열을 포함하는 조성물.
  21. 도 11 에서 확인된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 도 11 에서공개된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 서열을 포함하는 조성물.
  22. 도 15 및 도 16 에서 공개된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  23. 도 6 에서 공개된 유전자에 상응하는 도 6A 에서 확인된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  24. 도 13 에서 공개된 하나 이상의 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  25. 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 연골과 비교시, 마일드한 골관절염으로 진단된 환자로부터 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 복수의 핵산 멤버; 및 고체 기질을 포함하고, 여기서 각 핵산 멤버가 배열에서 독특한 위치를 가지며 그리고 상기 고체 기질에 안정하게 결합되는 배열.
  26. 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 연골과 비교시, 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 복수의 핵산 멤버; 및 고체 기질을 포함하고, 여기서 각 핵산 멤버가 배열에서 독특한 위치를 가지며 그리고 상기 고체 기질에 안정하게 결합되는 배열.
  27. 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 연골과 비교시, 중간정도 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 복수의 핵산 멤버; 및 고체 기질을 포함하고, 여기서 각 핵산 멤버가 배열에서 독특한 위치를 가지며 그리고 상기 고체 기질에 안정하게 결합되는 배열.
  28. 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 연골과 비교시, 현저한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 복수의 핵산 멤버; 및 고체 기질을 포함하고, 여기서 각 핵산 멤버가 배열에서 독특한 위치를 가지며 그리고 상기 고체 기질에 안정하게 결합되는 배열.
  29. 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 연골과 비교시, 태아로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 복수의 핵산 멤버; 및 고체 기질을 포함하고, 여기서 각 핵산 멤버가 배열에서 독특한 위치를 가지며 그리고 상기 고체 기질에 안정하게 결합되는 배열.
  30. 적어도 하나의 멤버가 (a)태아, (b) 마일드한 골관절염 환자, (c) 중간정도 골관절염 환자, (d) 현저한 골관절염 환자, (e) 심각한 골관절염 환자, 또는 (f) 정상 개체로부터의 어떤 출처들 중 두개 이상으로부터 분리된 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되는 복수의 핵산 멤버 및 고체 기질을 포함하고, 여기서 각 핵산 멤버가배열에서 톡특한 위치를 가지며, 그리고 상기 고체 기질에 안정하게 결합되는 배열.
  31. 제 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 항에 있어서, 상기 정상 개체가 살아있는 배열.
  32. 제 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 항에 있어서, 상기 정상 개체로부터 분리된 연골이 사후 14 시간 미만의 연골 조직으로부터 분리되는 배열.
  33. 제 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32 항에 있어서, 각 핵산 멤버가 적어도 50 뉴클레오티드인 배열.
  34. 제 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 또는 33 항에 있어서, 상기 배열이 10 에서 20,000 위치를 포함하는 배열.
  35. 제 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34 항에 있어서, 하우스키핑 유전자에 의해서 엔코드된 cDNA 서열, 식물 유전자 서열, 박테리아 서열, PCR 생성물 및 벡터 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 RNA 질 제어서열 및 네거티프 및 포지티브 제어 서열을 더 포함하는 배열.
  36. 고체 기질과 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열에 대해 RNA 에 상응하는 핵산시료의 혼성화를 포함하며,
    여기서 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 분리된 연골에 비해서, 마일드한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되며, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내 연골조직으로부터 분리되며, 그리고 여기서 각 핵산 멤버가 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질에 안정하게 결합되며,
    그리고 여기서 상기 디퍼렌셜하게 발현된 핵산 멤버에 대한 상기 핵산 시료의 혼성화가 마일드한 골관절염을 가르키는,
    환자에서 마일드한 골관절염을 진단하는 방법.
  37. 고체 기질과 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열에 대해 RNA 에 상응하는 핵산시료의 혼성화를 포함하며,
    여기서 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 분리된 연골에 비해서, 중간정도 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되며, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내 연골조직으로부터 분리되며, 그리고 여기서 각 핵산 멤버가 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질에 안정하게 결합되며,
    그리고 여기서 상기 디퍼렌셜하게 발현된 핵산 멤버에 대한 상기 핵산 시료의 혼성화가 중간정도 골관절염을 가르키는,
    환자에서 중간정도 골관절염을 진단하는 방법.
  38. 고체 기질과 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열에 대해 RNA 에 상응하는 핵산시료의 혼성화를 포함하며,
    여기서 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 분리된 연골에 비해서, 현저한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되며, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 이내 연골조직으로부터 분리되며, 그리고 여기서 각 핵산 멤버가 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질에 안정하게 결합되며,
    그리고 여기서 상기 디퍼렌셜하게 발현된 핵산 멤버에 대한 상기 핵산 시료의 혼성화가 현저한 골관절염을 가르키는,
    환자에서 현저한 골관절염을 진단하는 방법.
  39. 고체 기질과 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열에 대해 RNA 에 상응하는 핵산시료의 혼성화를 포함하며,
    여기서 적어도 하나의 멤버가 정상 개체로부터 분리된 연골에 비해서, 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터의 연골에서 디퍼렌셜하게 발현되며, 여기서 상기 정상 개체로부터 분리된 연골은 사후 14 시간 미만 연골조직으로부터 분리되며, 그리고 여기서 각 핵산 멤버가 독특한 위치를 가지며, 그리고 고체 기질에 안정하게 결합되며,
    그리고 여기서 상기 디퍼렌셜하게 발현된 핵산 멤버에 대한 상기 핵산 시료의 혼성화가 심각한 골관절염을 가르키는,
    환자에서 심각한 골관절염을 진단하는 방법.
  40. 제 36, 37, 38 또는 39 항에 있어서 상기 환자로부터 RNA 를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 연골시료로부터 RNA 를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  42. 제 40 항에 있어서, 혈액 시료로부터 RNA 를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 활액 유체 시료로부터 RNA 를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
  44. 제 41, 42 및 43 항에 있어서, 상기 RNA 에 상응하는 핵산 시료를 제조하는 단계를 더 포함하는 방법.
  45. 정상 개체로부터 유래된 연골세포를 후보 제제로 배양하는 단계, 여기서 상기 연골세포는 사후 14 시간 이내의 상기 정상 개체로부터 얻어진 연골시료로부터 분리되며;
    상기 연골세포로부터 RNA 를 분리하는 단계; 및
    프로브를 상기 RNA에 혼성화하는 단계, 상기 프로브는 태아, 정상, 마일드한 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염 및 심각한 골관절염의 적어도 하나로부터 유래된 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고,
    여기서 태아, 마일드한 골관절염, 현저한 골관절염, 중간정도 골관절염, 또는 심각한 골관절염 시료의 하나 이상으로부터의 RNA 에 관련하여 상기 정상 개체로부터의 상기 RNA에 대한 상기 프로브의 디퍼렌셜한 혼성화가 디퍼렌셜하게 발현된 연골세포 특이적 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 RNA의 발현 수준을 가르키며, 그리고
    여기서 상기 후보 제제의 존재에서 상기 배양단계의 결과로서, 상기폴리뉴클레오티드 서열의 발현 수준에서 변화가 상기 연골세포 특이적 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 감소 또는 증가시키는 제제를 가르키는,
    태아, 마일드한 골관절염, 중간정도 골관절염, 현저한 골관절염, 및 심각한 골관절염의 연골세포 질병 또는 발달 단계의 하나로부터 유래된 연골세포에서 디퍼렌셜하게 발현되는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 증가 또는 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  46. a) 하나 이상의 정상 개체로부터 유래된 연골 시료로부터 연골세포를 분리하는 단계, 여기서 상기 연골 시료는 사후 14 시간 미만에서 얻어지며;
    b) 상기 연골세포로부터 mRNA 를 분리하는 단계;
    c) 상기 mRNA로부터 cDNA 를 합성하는 단계; 및
    d) cDNA 를 벡터내로 결찰하는 단계
    를 포함하는 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법.
  47. a) 하나 이상의 살아있는 정상 개체로부터 유래된 연골 시료로부터 연골세포를 분리하는 단계;
    b) 상기 연골세포로부터 mRNA 를 분리하는 단계;
    c) 상기 mRNA로부터 cDNA 를 합성하는 단계; 및
    d) cDNA 를 벡터내로 결찰하는 단계
    를 포함하는 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법.
  48. a) 마일드한 골관절염으로 진단된 하나 이상의 환자로부터 유래된 연골 시료로부터 연골세포를 분리하는 단계;
    b) 상기 연골세포로부터 mRNA 를 분리하는 단계;
    c) 상기 mRNA로부터 cDNA 를 합성하는 단계; 및
    d) cDNA 를 벡터내로 결찰하는 단계
    를 포함하는 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법.
  49. a) 중간정도 골관절염으로 진단된 하나 이상의 환자로부터 유래된 연골 시료로부터 연골세포를 분리하는 단계;
    b) 상기 연골세포로부터 mRNA 를 분리하는 단계;
    c) 상기 mRNA로부터 cDNA 를 합성하는 단계; 및
    d) cDNA 를 벡터내로 결찰하는 단계
    를 포함하는 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법.
  50. a) 현저한 골관절염으로 진단된 하나 이상의 환자로부터 유래된 연골 시료로부터 연골세포를 분리하는 단계;
    b) 상기 연골세포로부터 mRNA 를 분리하는 단계;
    c) 상기 mRNA로부터 cDNA 를 합성하는 단계; 및
    d) cDNA 를 벡터내로 결찰하는 단계
    를 포함하는 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법.
  51. a) 심각한 골관절염으로 진단된 하나 이상의 환자로부터 유래된 연골 시료로부터 연골세포를 분리하는 단계;
    b) 상기 연골세포로부터 mRNA 를 분리하는 단계;
    c) 상기 mRNA로부터 cDNA 를 합성하는 단계; 및
    d) cDNA 를 벡터내로 결찰하는 단계
    를 포함하는 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법.
  52. a) 하나 이상의 태아로부터 연골세포를 분리하는 단계;
    b) 상기 연골세포로부터 mRNA 를 분리하는 단계;
    c) 상기 mRNA로부터 cDNA 를 합성하는 단계; 및
    d) cDNA 를 벡터내로 결찰하는 단계
    를 포함하는 연골세포 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법.
  53. 복수의 선-선택된 독특한 영역을 가지는 고체 지지체상에 도14 에서 확인된 이들 서열로부터 선택된 복수의 핵산 멤버를 포함하는 배열을 제조하는 방법으로서,
    독특한 선-선택된 영역상에 개별적으로 각 핵산 멤버를 스팟팅하는 단계, 및 각 핵산 멤버를 고체 지지체 상에 안정하게 부착시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 멤버가 (a) 태아 또는 (b)마일드, (c) 중간정도, (d) 현저한, (e) 심각한 골관절염으로 진단된 환자로부터 분리된 연골, 또는 (f) 정상개체로부터 분리된 연골에서, 상기 (a) 에서 (f)출처의 어떤 다른 것으로부터 제조된 cDNA 라이브러리와 비교시, 디퍼렌셜하게 발현되는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 하나 이상의 정상 개체로부터 분리된 연골이 사후 14 시간이내 연골세포로부터 분리되는 방법.
  56. 제 54 항에 있어서, 연골이 하나 이상의 생존하는 정상 개체로부터 분리되는 방법.
  57. 제 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 항의 배열 및 이들의 팩킹 수단을 포함하는 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1141318C (zh) * 2001-02-28 2004-03-10 中国医学科学院血液学研究所 人促血液血管细胞生成素及其制造方法
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20040121311A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
ATE364690T1 (de) 2001-11-09 2007-07-15 Proteologics Inc Posh nukleinsäure, polypeptide und darauf bezogene verfahren
US20040127445A1 (en) * 2002-08-28 2004-07-01 Chondrogene Limited Beta-2 microglobulin (B2M) and B2M related gene products for the regulation of osteoarthritis pathogenesis and chondrocyte proliferation
US7452667B2 (en) * 2002-09-12 2008-11-18 Genenews, Inc. Diagnosis of mild osteoarthritis by determination of TNFAIP6 and TGFBI RNA levels
DE10243131A1 (de) * 2002-09-17 2004-04-01 Transtissue Technologies Gmbh Verfahren zur Unterscheidung von Chondrozyten, die in der Lage sind, eine extrazelluläre knorpelige Matrix auszubilden, von Chondrozyten, die diese Fähigkeit nicht besitzen, durch Bestimmung des Genexpressionsstatus
CA2508726A1 (en) 2002-12-06 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
JP2006524497A (ja) * 2003-04-18 2006-11-02 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 骨関節炎のための高処理量機能的ゲノムスクリーニング法
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
WO2005020784A2 (en) * 2003-05-23 2005-03-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Surrogate cell gene expression signatures for evaluating the physical state of a subject
AU2004263896A1 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Genenews Inc. Osteoarthritis biomarkers and uses thereof
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20120122103A1 (en) 2003-09-11 2012-05-17 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of bacteria
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
CA2555083A1 (en) * 2004-02-02 2005-08-18 Nestec S.A. Genes associated with canine osteoarthritis and related methods and compositions
US8420312B2 (en) * 2004-02-02 2013-04-16 Nestec S.A. Genes associated with canine osteoarthritis and related methods and compositions
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US20050186577A1 (en) 2004-02-20 2005-08-25 Yixin Wang Breast cancer prognostics
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
JP4810533B2 (ja) 2004-05-24 2011-11-09 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド ディジタルスレショルド化による選択的イオン濾過作用を用いた質量分光測定法
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
GB0412301D0 (en) 2004-06-02 2004-07-07 Diagenic As Product and method
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
US7713695B2 (en) * 2005-02-07 2010-05-11 Genenews, Inc. Mild osteoarthritis biomarkers and uses thereof
EP1869180B1 (en) 2005-03-03 2013-02-20 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of polyoma viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
US20100292154A1 (en) * 2005-06-17 2010-11-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Protein profile for osteoarthritis
US8224579B2 (en) * 2005-06-17 2012-07-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Method of diagnosing osteoarthritis
AU2006272776B2 (en) 2005-07-21 2012-01-19 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
ES2324435B1 (es) * 2005-10-27 2010-05-31 Fundacion Para El Estudio De La Hematologia Y Hemoterapia De Aragon (Fehha) Procedimiento y dispositivo de analisis in vitro de mrna de genes implicados en neoplasias hematologicas.
WO2008018789A2 (en) * 2006-08-08 2008-02-14 Leiden University Medical Center Methods and means for diagnosing and treatment of osteoarthritis
MX2009002063A (es) * 2006-08-25 2009-03-06 Ares Trading Sa Tratamiento de desordenes en cartilagos con factor de crecimiento de fibroblastos-18.
JP5420412B2 (ja) 2006-09-14 2014-02-19 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド 病原体の同定のための標的全ゲノム増幅方法
WO2008104002A2 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
AU2008299784B9 (en) 2007-08-02 2015-06-18 Gilead Biologics, Inc. LOX and LOXL2 inhibitors and uses thereof
EP2313531A1 (en) * 2008-06-25 2011-04-27 Source Precision Medicine, Inc. Gene expression profiling for identification, monitoring, and treatment of osteoarthritis
WO2010033625A1 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
WO2010085606A1 (en) * 2009-01-22 2010-07-29 Case Western Reserve University Protein biomarkers and therapeutic targets for osteoarthritis
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
EP2454000A4 (en) 2009-07-17 2016-08-10 Ibis Biosciences Inc SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011047307A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
JP6185553B2 (ja) * 2012-03-27 2017-08-23 キュアバック アーゲー タンパク質又はペプチドの発現を改善するための人工核酸分子
JP5963198B2 (ja) 2012-09-26 2016-08-03 国立研究開発法人科学技術振興機構 動的ネットワークバイオマーカーの検出装置、検出方法及び検出プログラム
CN105531378B (zh) * 2013-09-12 2021-04-09 拉什大学医学中心 用于表征可动关节软组织损伤后细胞修复反应的转录组学指数
KR101705353B1 (ko) * 2013-10-17 2017-02-13 경북대학교 산학협력단 ApoPep-1 펩타이드 프로브를 포함하는 골관절염 조기진단용 시약
KR101651817B1 (ko) * 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
US20190093166A1 (en) * 2016-03-04 2019-03-28 Rush University Medical Center Methods for characterizing the cellular repair response after soft tissue injury

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5539096A (en) * 1994-09-08 1996-07-23 Universite De Montreal Genes differentially expressed in metastatic and non-metastatic rat rhabdomyosarcoma cell lines
EP0705842A2 (en) * 1994-10-06 1996-04-10 Hoechst Aktiengesellschaft Regulated genes by stimulation of chondrocytes with 1L-1beta
US6124095A (en) * 1997-12-22 2000-09-26 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human nucleotide pyrophosphohydrolase-2

Also Published As

Publication number Publication date
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